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KR102593359B1 - Adcc 및 adcp 활성의 향상된 정량화를 위한 시스템 및 제품 - Google Patents

Adcc 및 adcp 활성의 향상된 정량화를 위한 시스템 및 제품 Download PDF

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KR102593359B1
KR102593359B1 KR1020207029287A KR20207029287A KR102593359B1 KR 102593359 B1 KR102593359 B1 KR 102593359B1 KR 1020207029287 A KR1020207029287 A KR 1020207029287A KR 20207029287 A KR20207029287 A KR 20207029287A KR 102593359 B1 KR102593359 B1 KR 102593359B1
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사바 라이프 사이언스 에이비
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Abstract

본 발명은 샘플에서 항체-의존 세포-매개 세포 독성(ADCC) 또는 항체-의존 세포-매개 식세포 작용(ADCP)을 결정하기 위한 방법에서 신규한 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

ADCC 및 ADCP 활성의 향상된 정량화를 위한 시스템 및 제품
본 발명은 샘플에서 항체-의존 세포-매개 세포 독성(ADCC) 또는 항체-의존 세포-매개 식세포 작용(ADCP)을 결정하기 위한 방법에서의 신규한 세포 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포는 진단 컨텍스트(diagnostic context)에 사용될 수 있는 키트 또는 키트의 부품에 사용될 수 있다. 중요하게, 본 발명에 따른 세포는 예를 들어 항체 또는 Fc 융합 단백질에 기반한 치료의 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.
복수의 단클론 항체의 활성이 ADCC 및/또는 ADCP를 포함하는 호스트-매개 이펙터(effector) 세포 기능에 의해 부분적으로 매개된다는 것은 잘 알려져 있다. 항체는 림프구를 유발하는 종양 세포 또는 염증과 같은 표적 세포에서의 특정 항원으로 향한다. 일단 표적 세포에 결합되면, 이펙터 세포의 Fc 리셉터 모이어티(Fc receptor moiety)는 단클론 항체의 Fc 부분에 결합하여 이펙터 세포에 의한 표적 세포의 사멸에 영향을 미칠 것이다.
이러한 ADCC 또는 ADCP 과정에서 항체의 효과를 정량화하기 위해, 항체의 효과를 결정하는데 사용되는 이펙터 세포, 표적 세포 및 대조군 표적 세포가 필요하다. 종래 기술에서, 내인성 이펙터 세포, 자연 살해(NK), 인간 피험자로부터의 세포 및 인간 피험자 또는 정착된 종양 세포주로부터 표적 세포를 수확하고, 이들 표적 세포를 이러한 실험에 사용한다. 고전적인 분석에서, 표적 세포는 로딩된 크롬이어서 세포 사멸이 크롬 방출에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 인간 피험자로부터 사용된 이펙터 세포를 수확해야 하는 등 많은 단점을 가지고 있으므로 정량화를 위해 사용되는 세포에 큰 변동성(variability)이 있다. 더욱이, 이러한 방식으로 세포를 얻는 것은 어렵고 비싸다. 예를 들어, 기증자마다 상당한 차이가 있다. 또한, 이러한 고전적인 분석에서 음성 대조군의 경우, 리툭시맙(rituximab)을 위한 CD20 및 트라스투주맙(trastuzumab)을 위한 erbB2와 같은 표적 리셉터(receptor)를 발현하지 않는 세포주(cell line)를 사용한다. 따라서, 예를 들어 CD20을 발현하지 않는 T 세포주를 사용할 수 있다. 이러한 음성 대조군 표적 세포의 사용 단점은 물론 표적 세포에 대한 CD20 발현의 부재에 추가하여 세포가 많은 측면에서 다르며 좋은 대조군을 구성하지 않는다는 것이다.
또 다른 단점은 길이가 길고 분석이 지연되며 종종 밤새 배양해야 한다는 것이다. 동적 범위(dynamic range)가 제한되고 감도가 나쁘다. 동적 범위는 약물의 가장 높은 농도에서 대조군과 0(약물 샘플 없음)에 의해 달성할 수 있는 최대 신호 간의 차이이다. 감도(sensitivity)는 소량의 항체에 의해 생성된 활성이고, 즉 검출 가능한 활성을 생성하는데 필요한 항체의 양이 적을수록 분석 감도가 높아진다. 또 다른 단점은 분석이 종종 부정확하여 단일 클론 항체의 서로 다른 변이 간의 작은 차이를 검출하기 어렵다는 것이다.
이러한 표준 정량 분석에 대한 한가지 개선 사항은 Parekh 등(1)에 의해 설명되었으며 수정 및 상용화되었다(2). 이 분석에서, 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터 유전자(reporter gene)의 활성화 및 루미노미터(luminomter)에서 정량화될 수 있는 빛의 방출에 의해 면역글로부닌의 Fc 모이어티를 FcγIIIa 리셉터(CD16)에 결합하는 것에 반응하는 NFAT 반응성 리포터 유전자 구조체를 포함하는 재조합 이펙터 세포주를 개발하였다. 이러한 이펙터 세포는 동결, 해동 및 사용 포맷으로 판매된다(3). 이펙터 세포를 수확할 필요가 없지만 동결 및 해동 세포를 사용하기 때문에 훨씬 더 편리한 포맷으로 다소 더 큰 동적 범위로 훨씬 더 민감한 방식으로 정량화할 수 있는 ADCC 메커니즘의 대리 마커(surrogate marker)를 사용하므로 표준 용해 분석보다 개선된 것이다. 유사하게, ADCP 활성은 또한 NFAT 반응성 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자 및 야생형(WT) 표적 세포에 기능적으로 연결되는 FcγIIa(CD32)를 발현하는 이펙터 세포를 사용하는 유사한 방식으로 정량화될 수 있다. 이러한 ADCP 이펙터 세포주는 시판되고 있다(Promega Corporation Madison WI). 항체의 ADCP 활성을 평가하기 위해 WT 표적 세포와 함께 이들 세포를 사용하면 제한된 동적 범위 및 제한된 감도로 분석에서 나타난다.
또한, 신규한 재조합 이펙터 세포주가 최근에 설명되었고(3) WO 2018/065401에 개시되어 있는데, 여기서 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터 유전자는 이펙터 세포에서 항체의 Fc 모이어티와 FcγRIIIA 리셉터의 상호 작용 후에 활성화되는 주요 전사 인자(NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5)에 대한 결합 지점을 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터(chimeric promoter)에 의해 조절된다. 또한, WO 2018/065401에 개시된 것과 동일한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 반딧불이 루시퍼라제 리포터-유전자에 기능적으로 연결되는 CD32를 발현하는 신규한 재조합 이펙터 세포주가 본 발명에 개시된다. WO 2018/065401에 개시된 키메라 프로모터에 의해 조절되는 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD16 또는 CD32를 발현하는 재조합 이펙터 세포는 항체에 의해 인식되는 특정 항원의 일정한 높은 수준을 과발현하는 조작된 표적 세포와 함께 각각 ADCC 또는 ADCP 분석에 사용될 때, NFAT 조절되는 리포터 유전자를 발현하는 조작된 이펙터 세포주에 비해 개선된 감도 및 개선된 동적 범위를 부여한다.
WO 2017/186121은 항원 및 I형 인터페론(interferon)에 결합할 수 있는 하나 이상의 리셉터를 발현하는 면역 반응 세포 및 면역 반응 세포의 기능을 개선하는 방법에 관한 것이다. 세포는 종양이나 병원체를 사멸하는 중요한 능력을 가지고 있으며 종양 및 전염병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
Lallemand, C., 등, J. Immunol. Res., vol 2017, pp. 1-19는 리툭시맙, 트라스투주맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 아달리무맙 또는 에타너셉트에 의해 인식되는 일정한 높은 수준의 특정 항원을 과발현하는 신규한 표적 세포와 함께 FcyRIIIa 신호 전달에 관여하는 주요 전사 인자에 대한 인식 시퀀스를 통합하는 키메라 프로모터의 제어 하에 FcyRIIIa(CD16a)의 V-변이 또는 F-변이 및 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 신규한 ADCC 이펙터 세포에 관한 것으로, NFAT-조절된 리포터 유전자 및 야생형 표적 세포를 발현하는 이펙터 세포에 비해 ADCC 분석에서 향상된 감도, 특이성 및 동적 범위를 부여한다.
그럼에도 불구하고, 정량적인 ADCC 및 ADCP 분석을 더욱 개선하려는 요구가 항상 있다. 훨씬 향상된 동적 범위 및 특히 ADCP 활성의 정량화를 위한 향상된 감도를 갖는 분석을 갖는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성을 평가하기 위해 상기 세포가 사용될 때 현저하게 향상된 동적 범위 및 증가된 감도로 나타나는 하나 이상의 공동 자극 분자의 이펙터 세포 및/또는 표적 세포에서의 과발현에 관한 것이다.
본 발명은 상기 언급된 문제를 해결하고, 개선된 감도 및/또는 개선된 동적 범위를 제공하기 위해 종래 기술 분석의 이펙터 세포 및 표적 세포를 동결, 해동 및 사용에서 실질적인 향상을 제공한다. 일 양태에서, 문제는 본 발명에 따른 벡터 및 궁극적으로 세포에 포함된 조작된 폴리뉴클레오티드 시퀀스(polynucleotide sequence)의 도움으로 해결된다.
일 양태에서, 본 발명은 분석에서 개선된 감도를 제공하는, 폴리뉴클레오티드 시퀀스 벡터 및 궁극적으로 조작된 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분석에서 개선된 동적 범위를 제공하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스, 벡터 및 궁극적으로 조작된 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분석에서 개선된 감도와 동시에 분석에서 개선된 동적 범위를 제공하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스, 벡터 및 궁극적으로 조작된 세포를 제공한다.
개선된 감도는 크게 향상된 EC50 및 LLOQ(정량화의 하한)에서 나타난다. 구체적으로, 본 발명은 당업계에 공지된 기술과 비교하여 적어도 약 10배인 증가된 감도(EC50으로 측정됨) 또는 LLOQ를 위한 키트에서의 세포주 및 궁극적으로 이의 용도를 제공한다. 결과적으로, 감도 또는 LLOQ는 당업계에서 공지된 기술과 비교하여 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상 또는 약 100배 이상 증가된다. 유사하게, 본 발명은 당업계에 공지된 기술에 비해 약 10배 이상의 증가된 동적 범위를 위한 키트에서의 세포주 및 궁극적으로 이의 용도를 제공한다. 결과적으로, 동적 범위는 당업계에 공지된 기술에 비해 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상 또는 약 100배 이상이다. 당업계에 공지된 기술의 예들은 Bhavin S. Parekh, B. S., 등. mAbs, 2012, 4 (3), pp. 310-318, 또는 예를 들어 Cheng, Z. J., 등, J. Immunol. Methods, 2014, 414, pp. 69-81에서 발견될 수 있다.
본 발명은 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 벡터는 에피솜(episomal)이거나 상기 세포의 게놈(genome)에 통합될 수 있다. 세포는 임의의 기원, 특히 포유류 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 예를 들어, 주르카트(Jurkat), 몰트4(Molt4), 라지(Raji), SKBR3, NK92, KHYG-1, HEK293, DT-40 및 MSB-1과 같은 당업계에 공지된 임의의 세포주일 수 있다. 본 발명은 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성을 평가하기 위해 상기 세포가 사용될 때 향상된 동적 범위 및 증가된 감도를 초래할 하나 이상의 공동 자극 분자(co-stimulatory molecule) 세포에서의 과발현에 관한 것이다. 상기 공동 자극 분자는 항체에 의해 인식되는 특정 항원을 운반하는 표적 세포에서 내인성으로 발현되거나 과발현될 때 리간드로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서 상기 표적 세포는 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 치료 항체에 의해 인식되는 일정한 높은 수준의 특정 항원을 과발현하도록 조작되었다. 상기 공동 자극 분자는 이펙터 세포에서 내인성으로 발현되거나 과발현될 때 공동 자극 리셉터로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 이펙터 세포는 저 친화성 Fc 리셉터, FcγRIIIa(CD16A) V 또는 F 변이(variant), 또는 FcγRIIa(CD32) H 또는 R 변이 중 하나를 과발현하도록 조작되고, 이는 이전에 설명한대로 NFAT 반응성 리포터 유전자의 활성화(1,2) 또는 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터-유전자에 기능적으로 연결된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터의 활성화에 의해 표적 세포에서 발현되는 특정 항원에 결합된 항체의 Fc 모이어티의 결찰(ligation)에 반응한다.
본 발명의 또 다른 양태에서 상기 이펙터 세포는 예를 들어 고 친화성 Fc 리셉터, FcγRI(CD64) 또는 예를 들어 저 친화성 Fc 억제 리셉터 FcγRIIB1(CD32), 또는 저 친화성 Fc 억제 리셉터 FcγRIIB2(CD32), 또는 저 친화성 Fc 리셉터 FcγRIIIB(CD16b) 중 하나를 과발현하도록 조작되었고, 이는 이전에 설명된 바와 같이 NFAT 반응성 리포터 유전자의 활성화(1,2) 또는 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터 유전자에 기능적으로 연결된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터의 활성화에 의해 표적 세포에서 발현된 특정 항원에 결합된 항체의 Fc 모이어티의 결찰에 반응한다.
표적 세포에서 과발현된 공동 자극 분자는 이펙터 세포에서 내생적으로 발견되거나 과발현된 공동 자극 리셉터(들)와 상호 작용하고 리포터 유전자와 연결된 FcγIIIa or FcγII 리셉터의 현저하게 향상된 발현으로 나타나는 이펙터 세포에서 항체의 Fc 모이어티를 FcγIIIa 또는 FcγII 리셉터와 상호 작용을 강화한다. 이는 결과적으로 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 각각 FcγIIIa 리셉터 반응성 리포터 유전자를 발현하는 이펙터 세포, 또는 본 발명에 기재되거나 항체에 의해 인식되는 특정 항원에 추가하여 CD80(B7.1), CD86(B7.2) 및 CD137(4-1BB)을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 상기 표적 세포와 각각 상업적으로 이용 가능한 FcγII 반응성 리포터 유전자를 발현하는 이펙터 세포를 사용하여 ADCC 또는 ADCP 분석의 동적 범위 및 감도의 현저한 증가를 가져온다.
ICOS-L(유도성 공동-자극기 리간드)과 같은 다른 공동 자극 분자는 또한 표적 세포에서 발현되어 이펙터 세포에서 내성적으로 발현되거나 과발현되는 ICOS 리셉터와 이의 상호 작용에 따라 각각 ADCC 또는 ADCP 분석에서 리포터-유전자 발현으로 연결된 FcγIIIa 또는 FcγII 리셉터를 강화하기 위한 표적 세포에서 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 추가 실시 형태에서, CTLA-4(CD152)와 같은 면역 체크포인트 리셉터는 표적 세포에서 CD80 및 CD86의 하향 조절을 방지하기 위해 게놈 편집을 사용하는 이펙터 세포에서 특이적으로 무효화된다. 본 발명의 추가 실시 형태에서, CD3 제타 사슬 막횡단 신호 전달 분자(CD247)는 FcγRIIIa 관련 면역 리셉터 티로신 활성화 모티프(ITAM) 신호 전달 및 리포터-유전자 연결된 FcγIIIa 리셉터의 향상된 발현을 강화하기 위해 ADCC 이펙터 세포에서 과발현된다.
일 양태에서, 본 발명은 이펙터 세포로 표시될 수 있는 세포에 관한 것으로, CD28, CD137(4-1BB), CD247(T3 제타 사슬) 또는 CD278 (ICOS) 중 하나 이상이 이펙터 세포에서 구성적으로 발현되거나 과발현된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포로 표시될 수 있는 세포에 관한 것으로, CD80, CD86, CD137L 및/또는 CD278L 중 하나 이상이 표적 세포에서 구성적으로 발현되거나 과발현된다.
본 발명은 또한 키트 또는 키트의 부품에 관한 것이다. 상기 키트는 하기를 포함할 수 있다:
i) ADCC 또는 ADCP 메커니즘에서 이펙터 세포로서 작용할 수 있고 하나 이상의 공동 자극 분자가 내생적으로 발현되거나 과발현되는 본 발명에 따른 세포,
ii) 하나 이상의 공동 자극 분자의 발현이 향상되는 ADCC 또는 ADCP 메커니즘에서 표적 세포로 작용할 수 있는 본 발명에 따른 세포,
iii) 항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화(돌연변이)된 표적 세포.
상기 키트는 또한 표적 세포를 포함하고, 동일한 표적은 상기 표적이 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 과발현되도록 개선되고, 하나 이상의 공동 자극 분자의 발현이 개선된다.
상기 표적은 원칙적으로 관련 항체가 결합할 수 있는 임의의 표적일 수 있다. 일 양태에서 상기 표적은 CD20, mTNFα, erbB2, EGFR 중 하나 이상일 수 있다.
상기 키트는 또한 예를 들어, 2 이상의 바이알 등과 같은 하나 이상의 바이알을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 키트는 세포 ii)의 혼합물을 갖는 세포 i)의 혼합물을 포함하는 하나의 바이알을 포함할 수 있다. 이러한 경우 상기 키트는 두개의 바이알을 포함하고, 제2 바이알은 위에서 전술한 바와 같이 iii)의 세포를 포함한다. 따라서, 일례에서, 상기 키트는 두개의 바이알을 포함하며, 여기서 하나의 바이알은 이펙터 세포 i) 및 해당 항체가 특이적으로 강화/과발현되는 표적을 갖는 표적 세포 ii)를 포함한다. 결과적으로 제2 바이알은 표적 세포 iii)를 포함하며, 여기서 표적은 무효화되거나 표적/리셉터가 결실되거나 그렇지 않으면 비기능적일 수 있거나 문제의 항체에 결합하는 이의 능력을 임의의 수단으로 상실할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 키트의 하나의 바이알은 세포 ii)의 혼합물을 갖는 세포 i)의 혼합물을 본 발명에서 E:T 비율로 지칭되는 최적의 비율로 포함하며, 여기서 E는 상기 (이펙터 세포)의 i) 단락에서의 세포를 나타낸다. T는 상기 (표적 세포)의 iii)에서의 세포를 나타낸다. 최적의 E:T 비율은 본 발명에서 실험 부분에 추가로 설명된다.
본 발명에 따른 키트 및 방법에서, 이펙터 세포 i)와 표적 세포 ii) 사이의 관계에 대해 발견된 바와 같이, 동일한 E:T 비율이 이펙터 세포 i) 및 표적 세포 iii)에 사용된다.
도 1a는 ERBB2만을 과발현하거나 ERBB2 및 CD86을 과발현하거나 ERBB2, CD86 및 CD137L를 과발현하는 CD137 및 HEK293 표적 세포와 공동-형질 감염되거나 되지 않은 iLite® 이펙터 세포(V-변이)를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 1b는 CD3 및 CD20을 과발현하는 라지 표적 세포와 관련된 제타 막횡단 신호 전달 분자와 공동-형질 주입되거나 되지 않은 iLite® 이펙터 세포(V-변이)를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 2a는 iLite® 이펙터 세포(V- 변이) 및 CD20만을 과발현하거나 CD20과 공자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80과 CD86 모두 과발현하는 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 2b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 CD20만을 과발현하거나 CD20과 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86 모두를 과발현하는 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 3a는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 CD20와 공동 자극 분자 CD80, 또는 CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 라지 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 3b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이)와 CD20 및 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86를 과발현하는 라지 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F) 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 4a는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포 V-변이 및 CD20와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 라지 표적 세포를 사용하여 리툭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 4b는 CD28를 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 CD20와 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86을 모두 과발현하는 라지 표적 세포를 사용하여 리툭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 5a는 CD28를 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 CD20와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86를 과발현하는 라지 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 5b는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 CD20와 공동 자극 분자 CD80, 또는 CD86를 과발현하는 라지 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F-변이) 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하여 결정되는 리툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 6a는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 erbB2를 단독으로 과발현하거나 erbB2와 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 6b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 erbB2를 단독으로 과발현하거나 erbB2와 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 7a는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86를 과발현하는 HEK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 7b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86를 과발현하는 HEK 293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F -변이) 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 8a는 CD 28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 트라스투주맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 8b는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 트라스투주맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 9a는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HERK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 9b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 erbB2와 공동 자극 분자 CD86을 모두 과발현하는 HERK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F-변이) 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하여 결정되는 트라스투주맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 10a는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 EGFR 단독 또는 EGFR과 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 10b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 EGFR 단독 또는 EGFR과 공동 자극 분자 CD86 둘 모두를 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 11a는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 EGFR와 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 11b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 EGFR과 공동 자극 분자 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F-변이) 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 12a는 CD28를 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 EGFR와 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 세툭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 12b는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 EGFR와 공동 자극 분자 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 세툭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 13a는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 EGFR와 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 HERK293 표적 세포 대NFAT 반응성 이펙터 세포(V-변이) 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 13b는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 EGFR와 공동 자극 분자 CD86을 모두 과발현하는 HERK293 표적 세포 대 NFAT 반응성 이펙터 세포(F-변이) 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하여 결정되는 세툭시맙의 ADCC 활성의 비교를 도시한다.
도 14a는 iLite® 이펙터 세포(V- 변이) 및 막-결합 TNFα 단독 또는 막-결합 TNFα와 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 인플릭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 14b는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 막-결합 TNFα 단독 또는 막-결합 TNFα 및 공동 자극 분자 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 HEK293을 사용하여 결정되는 인플릭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 15a는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(V-변이) 및 막-결합 TNFα 단독 또는 막-결합 TNFα와 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 인플릭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
도 15b는 CD28을 과발현하는 iLite® 이펙터 세포(F-변이) 및 막-결합 TNFα 단독 또는 막-결합 TNFα와 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86을 발현하는 HEK293 표적 세포를 사용하여 결정되는 인플릭시맙의 ADCC 활성을 도시한다.
표 1은 CD16A의 V-변이를 발현하는 iLite® 이펙터 세포와 함께 사용되는 CD20++ 표적 세포에서 공동 자극 분자 CD80, CD86 및 CD80와 함께 CD86의 과발현의 4PL 플롯의 주요 파라미터로 표시되는 ADCC 분석에 대한 효과를 도시한다.
표 2는 CD16A의 V-변이를 발현하는 iLite® 이펙터 세포와 함께 사용되는 ERBB2++ 표적 세포에서 공동 자극 분자 CD80, CD86 및 CD80와 함께 CD86의 과발현의 4PL 플롯의 주요 파라미터로 표시되는 ADCC 분석에 대한 효과를 도시한다.
표 3은 CD16A의 V-변이를 발현하는 iLite® 이펙터 세포와 함께 사용되는 EGFR++ 표적 세포에서 공동 자극 분자 CD80, CD86 및 CD80와 함께 CD86의 과발현의 4PL 플롯의 주요 파라미터로 표시되는 ADCC 분석에 대한 효과를 도시한다.
표 4는 CD16A의 V-변이를 발현하는 iLite® 이펙터 세포와 함께 사용되는 mTNFα++ 표적 세포에서 공동 자극 분자 CD80, CD86 및 CD80와 함께 CD86의 과발현의 4PL 플롯의 주요 파라미터로 표시되는 ADCC 분석에 대한 효과를 도시한다.
이러한 특징은 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD16A를 발현하는 재조합 이펙터 세포(V 또는 F 변이), 또는 본 발명에서 설명된 바와 같이 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자와 기능적으로 연결되는 CD32를 발현하는 이펙터 세포(H 또는 R 변이), 또는 고 친화성 Fc 리셉터, FcγRI(CD64), 또는 저 친화성 Fc 억제 리셉터 FcγRIIB1(CD32), 또는 저 친화성 Fc 억제 리셉터 FcγRIIB2(CD32), 또는 WO 2018/065401에 개시된 바와 같은 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자, 또는 본 발명에 기재된 바와 같은 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자를 과발현하도록 조작되는 이펙터 세포, 또는 상업적으로 이용 가능한 바와 같은 NFAT-반응성 리포터-유전자와 기능적으로 연결되는 CD16A 또는 CD32를 기능적으로 발현하는 이펙터 세포는 CD28, CD137(4-1BB) 및 ICOS를 포함하는 하나 이상의 공동 자극 리셉터를 내인성으로 발현하거나 CD80, CD86, CD132L 또는 ICOSL을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하여, 상기 세포가 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성을 평가하기 위해 사용될 때 향상된 동적 범위 및 증가된 감도를 나타낸다.
결과적으로, 본 발명은 하향 스트림 프로모터에 기능적으로 연결되는 시스-작용 조절 시퀀스를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 NF-AT, AP1, NFkB, STAT1, STAT3 및 STAT5 중 하나 이상은 상기 시스-작용 조절 시퀀스에 결합할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5는 모두 상기 시스-작용 조절 시퀀스에 결합할 수 있다.
프로모터는 예를 들어, 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있는 효소와 같은 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리드 프레임 시퀀스(open read frame sequence)에 기능적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 70% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 75% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 80% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 85% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 상의 시퀀스 동일성 또는 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있고, 여기서 SEQ ID NO. : 1은;
GGAAGCGAAA ATGAAATTGA CTGGGACTTT CCGGAGGAAA AACTGTTTCA TACAGAAGGC GTGGATGTCC ATATTAGGAT GAGTCAGTGA CGTCAGAGCC TGATTTCCCC GAAATGATGA GCTAG이다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 인공적으로 조작된 폴리뉴클레오티드이다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 96% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 97% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나, SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체(vector construct)에 관한 것이다. 상기 벡터 구조체는 플라스미드(plasmid) 또는 바이러스 벡터(viral vector)일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있고, 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 공동 자극 분자의 발현을 위해 단백질을 인코딩할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 시퀀스를 추가로 포함할 수 있다.
따라서 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 70% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 75% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 80% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 85% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나, SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 SEQ ID NO. : 1은
GGAAGCGAAA ATGAAATTGA CTGGGACTTT CCGGAGGAAA AACTGTTTCA TACAGAAGGC GTGGATGTCC ATATTAGGAT GAGTCAGTGA CGTCAGAGCC TGATTTCCCC GAAATGATGA GCTAG이다.
일 양태에서, 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 96% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 97% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 99% 이상의 시퀀스 동일성을 가지거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 조작된 세포에 관한 것이다. 벡터는 에피솜이거나 상기 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서 세포는 제1 리포터 단백질과 다른 제2 리포터 단백질을 추가로 발현할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 세포는 재조합체일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO. : 1)를 갖는 벡터를 포함하는 세포는 이펙터 세포일 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 벡터 또는 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 70% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 75% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 80% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 85% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 이사의 시퀀스 동일성을 갖거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 SEQ ID NO. : 1은
GGAAGCGAAA ATGAAATTGA CTGGGACTTT CCGGAGGAAA AACTGTTTCA TACAGAAGGC GTGGATGTCC ATATTAGGAT GAGTCAGTGA CGTCAGAGCC TGATTTCCCC GAAATGATGA GCTAG이다.
일 양태에서, 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 90% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스을 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1과 예를 들어 약 95% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 96% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 97% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 98% 이상의 시퀀스 동일성, 예를 들어 약 99% 이상의 시퀀스 동일성을 갖거나 SEQ ID NO. : 1과 동일한 DNA 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO. : 1)를 갖는 벡터를 포함하는 세포는 이펙터 세포일 수 있고, 여기서 벡터는 본 발명에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 공동 자극 분자의 발현을 위해 단백질을 인코딩할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 시퀀스를 추가로 포함한다. 예시적이고 비-제한적인 예는 이펙터 세포(예를 들어, 세포 표면)에서 구성적으로 발현되거나 과발현될 수 있는 CD28, CD137(4-1BB), CD247(T3 제타 사슬) 또는 CD278(ICOS) 중 하나 이상이다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 세포는 예를 들어, 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있는 효소를 발현하는 유전자와 같은 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD16A를 발현할 수 있는 이펙터 세포이다.
대안으로, 본 발명에 따른 세포는 예를 들어, 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있는 효소를 발현하는 유전자와 같은 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD32를 발현할 수 있는 이펙터 세포이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 세포 이펙터 세포는 추가로 하나 이상의 공동 자극 리셉터를 내인성으로 발현하거나 과발현한다. 원칙적으로 이러한 공동 자극 리셉터는 임의의 적합한 리셉터일 수 있으며, 예를 들어 CD28, CD137(4-1BB) 및 ICOS 중 하나 이상일 수 있다. 또한, CD28, CD137(4-1BB), CD247(T3 제타 사슬) 또는 CD278(ICOS) 중 하나 이상은 이펙터 세포에서 구성적으로 발현되거나 과발현될 수 있다.
본 발명은 또한 표적 세포에 관한 것이다. 또한, 표적 세포는 항체가 특별하게 인식되는 항원을 발현한다. 본 발명의 일 양태에서, 표적 세포는 예를 들어, 하나 이상의 공동 자극 분자, 예를 들어 CD80, CD86, CD132L, CD137L 또는 ICOSL 중 하나 이상을 과발현한다. 또한, CD80, CD86, CD137L 및/또는 CD278L 중 하나 이상은 표적 세포에서 구성적으로 발현되거나 과발현될 수 있다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, CTLA-4(CD152)와 같은 면역 체크포인트 리셉터는 CD28 하향 조절 및 차례로 표적 세포에 대한 CD80 및 CD86의 과발현 효과의 부정을 방지하기 위해 게놈 편집을 사용하여 이펙터 세포에서 특히 무효화된다. 본 발명의 추가 실시 형태에서, 3개의 면역-리셉터 티로신 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 막횡단 CD3 관련된 제타 신호 전달 분자(CD247)는 ITAM 신호 전달과 관련된 FcγRIIIa 및 리포터-유전자 연결된 FcγIIIa 리셉터의 향상된 발현을 강화하기 위해 ADCC 이펙터 세포에서 과발현된다. 바람직한 실시 형태에서, 분석의 정규화(normalization)를 제공하기 위해, 재조합 이펙터 세포는 리포터 유전자 구조체에서 사용되는 것과 다른 루시퍼라제의 구성적 생산을 위한 구조체를 추가로 갖는다. 예를 들어, 리포터 유전자 구조체는 반딧불이 루시퍼라제를 생산할 때, 구성적 생산은 제2 루시퍼라제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)(4)일 수 있다. 제2 루시퍼라제의 활성과 비교하여 정규화된 제1 루시퍼라제의 활성은 이의 전체가 본 발명에 참조로 포함된 US 2011/0189658에 기재되어 있다. 분석을 수행할 때, 리포터 유전자 루시퍼라제를 측정한 다음 시약을 추가하여 특정 루시퍼라제를 퀀칭하고 따라서 다음 판독값이 구성적인 구조체에서 루시퍼라제를 판독한 다음 실시예들에서 더욱 상세히 설명될 바와 같이, 정규화 목적으로 사용될 수 있다.
임의의 루시퍼라제의 구성적 발현을 사용하는 이점은 결과가 이펙터 세포의 손실 또는 이펙터 세포의 표적 세포 사멸에 의해 영향을 받지 않으며, 결과가 혈청 기질(serum matrix) 효과에 의해 영향을 받지 않는다는 것이다. 이들 모두는 다른 (제2) 루시퍼라제의 구성적 발현의 측정을 사용하여 얻어진 정규화에 의해 보상될 수 있다. 이러한 정규화를 사용하지 않는 선행 기술 분석의 절차에서는 이러한 이점 중 어느 것도 얻을 수 없다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 표적 세포는 생체 내에서 측정되는 것과 동일한 유형의 표적 세포로부터 생성되지만 항체가 특이적인 항원이 한편으로는 무효화되거나(음성 대조군) 이의 발현이 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 다른(양성 대조군)에 대해 일정한 방식으로 향상된다. 선행 기술 분석은 양성 대조군에 대해 항체가 재조합이 아닌 특이적인 가변적인 양의 항원을 발현하는 야생형 표적 세포 및 음성 대조군에 대해 항체가 특이적인 항원을 구성적으로 발현하지 않는 자연 세포만을 사용한다. 예를 들어, CD20 분석에서 음성 대조군으로 CD20을 구성적으로 발현하지 않는 T 세포가 사용된다. 양성 대조군의 경우, 야생형 B 세포가 표적으로서 사용된다.
항체가 특이적인 항원이 무효화된 재조합 표적 세포를 사용함으로써, 하나는 T 세포가 천연 표적 세포와 매우 다르고 이러한 차이가 결과에 다소 영향을 미치기 때문에 훨씬 향상된 음성 대조군을 갖는다. 예를 들어, E:T 비율이 변경됨에 따라 표적 세포 수가 증가하기 때문에 이종 이펙터 세포(E) 표적 세포(T) 비율(E:T 비율) 곡선이 완전히 0이 되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 문제는 단클론 항체에 의해 인지되는 특정 항원을 인코딩하는 유전자가 무효화된 재조합 표적 세포를 사용함으로써 해결된다.
WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 항체가 특이적인 항원의 향상된 일정 발현을 갖는 본 발명의 재조합 표적 세포의 추가 바람직한 특징은 CD80 또는 CD86과 같은 하나 이상의 공동 자극 분자로 공동 형질 감염되어, ADCC 또는 ADCP 분석을 위해 훨씬 더 큰 동적 범위와 향상된 감도를 얻을 수 있게 한다.
또한, 공동 자극 분자 CD80와 CD86 및 특정 항원은 세포가 증식함에 따라 변하지 않거나 야생형 세포의 경우와 같이 배양 조건의 함수로 변하지 않는 일정한 높은 수준으로 발현되어 향상된 분석 정밀도를 제공한다. 이를 통해 후보 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성의 미묘한 차이의 감지가 결정되게 한다. 재조합 표적 세포의 또 다른 이점은 이들이 인간 피험자로부터 표적 세포를 수확 또는 배양하거나 실험실에서 표적 세포주를 배양하는 것보다 훨씬 더 쉽게 사용하기 위해 동결, 해동 및 사용 포맷으로 제공될 수 있다는 것이다. 이러한 재조합 세포를 사용하면 정상 개체로부터 얻어지는 표적 세포 또는 시험관 내에서 배양된 세포에 본질적으로 존재하는 변동성을 피할 수 있고, 이러한 야생형 세포는 성숙 단계, 세포 주기 단계 또는 배양 조건에 따라 관심 항원의 다양한 발현을 갖기 때문이다. 재조합 양성 대조군을 사용하면 이러한 변동성이 제거된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 특징은 표준 기술을 사용하여 개별적으로 동결된 이펙터 세포의 바이알 및 표적 세포의 바이알을 포함하는 해동 및 사용 포맷이다. 해동시, 이펙터 세포와 표적 세포를 최적의 E:T 비율로 혼합되고 분석할 항체의 농도가 증가하여 다중 웰 백색면 미량정량판(microtiter plate)에서 적절한 시간 동안 배양된다. 항체 유도된 반딧불이 루시퍼라제(FL) 활성 및 구성적 레닐라 루시퍼라제(RL) 발현은 이중 루시퍼라제 기질을 사용하여 루미노미터에서 동일한 웰의 미량정량판에서 순차적으로 정량화된다. 결과는 상대 루시퍼라제 단위(RLU)로 발현되며 다음 예에 나타낸 바와 같이 4-파라메트릭 로지스틱(4PL) 플롯의 형태로 제공된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 특징은 리툭시맙과 같은 특정 단클론 항체에 대해 최적의 E:T 비율로 이펙터 세포와 표적 세포를 모두 포함하는 단일 냉동 바이알이며, 따라서 고객이 해야하는 모든 것은 원하는 농도로 약물을 추가, 배양 및 판독하는 것이다. 특정 단클론 항체에 대해 최적의 E:T 비율로 이펙터 세포 및 음성 대조군 표적 세포 모두를 포함하는 단일 냉동 바이알도 제공된다. 결과적으로, 본 발명에 따르면 E:T 비율은 약 24:1 내지 약 1:1 범위이다. 바람직하게, 비율은 예를 들어 약 24:1 내지 약 2:1, 또는 약 6:1, 또는 약 3:1, 또는 예를 들어 약 1.5:1 또는 약 1:1이다. 이러한 포맷은 특정 단클론 항체를 위한 최적의 E:T 비율 및 기타 분석 파라미터를 결정하기 위한 키트 또는 방법의 사용자의 필요성을 생략한다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, CD20에 대한 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성의 정량화를 용이하게 하기 위해, 공동 자극 분자 CD80 및/또는 CD86는 CD20을 발현하는 세포에서 과발현된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86은 WO 2018/065401에 개시된 것과 같이 일정한 높은 수준의 CD20 발현을 발현하는 표적 세포에서 과발현된다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, HER2 리셉터에 대한 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성의 정량화를 용이하게 하기 위해, 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86은 ERBB2를 발현하는 세포에서 과발현된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86은 WO 2018/065401에 개시된 것과 같은 일정한 높은 수준의 ERBB2를 발현하는 표적 세포에서 과발현된다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, EGFR 리셉터에 대한 항체의 ADCC 또는 ADCP 활성의 정량화를 용이하게 하기 위해, 공동 자극 분자 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86은 EGFR을 발현하는 세포에서 과발현된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86은 WO 2018/065401에 개시된 것과 같은 일정한 높은 수준의 EGFR을 발현하는 표적 세포에서 과발현된다.
본 발명의 추가 실시 형태에서, 인플릭시맙 또는 임의의 다른 항-TNF-α 항체 또는 예를 들어 에타너셉트(Enbrel®)와 같은 Fc 융합 단백질의 ADCC 활성의 정량화를 용이하게 하기 위해, 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86은 TNFα 길항제의 ADCC 활성의 정량화가 막 결합 TNFα를 발현하는 표적 세포를 필요로 하기 때문에 막 결합 TNFα(mTNFα)를 발현하는 WO 2018/065401에 개시된 것과 같이 표적 세포에서 과발현된다. TNFα는 초기에 막 결합되어 있지만 이후에 ADAM17(TACE) 프로테아제(protease)에 의해 절단된다. 따라서, 막 결합된 비-절단성 TNFα를 발현하는 세포주를 확립하기 위해 부위 지정된 돌연변이는 프로테아제 절단 부위를 돌연변이시키기 위해 사용되었다. 그러나 세포 표면에서 발현되는 비-절단성 TNFα는 인접 세포의 표면에 존재하는 TNFαRII 리셉터에 결합하여, 세포 사멸을 일으키고 영구적인 세포주의 확립을 어렵게 만든다. 따라서, 또는 이러한 어려움을 없애기 위해 TNFαRII 리셉터는 게놈 편집을 사용하여 무효화되고 음성 대조군에서 TNFα 발현은 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 TNFαRII 리셉터가 아닌 게놈 편집을 사용하여 무효화되었다.
일 양태에서, 본 발명은 조작된 세포에서 SEQ ID NO. : 1의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 분석에서 본 발명에 개시된 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 또는 진단 방법에서 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분석에서 향상된 동적 범위 및/또는 증가된 감도를 위해 분석에서 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 분석에서 향상된 동적 범위 및/또는 증가된 감도를 위해 분석에서 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 세포는 항체의 ADCC 및/또는 ADCP 활성을 평가하는데 사용된다.
정의
본 발명에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "무효화" 또는 "무트(muted)"는 특정 유전자를 제거하여(knock out) 궁극적으로 세포의 표현형(phenotype)을 변화시키는 것을 의미한다. 효과적으로, 이러한 용어는 유전자를 비-기능적으로 만드는 것을 포함하는 것을 의미한다. 일례로 표면 세포 리셉터의 발현을 제거하기 위해 특정 유전자를 무효화할 수 있다.
"++ 세포"와 관련하여 용어 "++"는 항원(약물 표적)이 과발현되는 표적 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 용어는 본 발명에서 "T+"와 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 발현이 리셉터 또는 예를 들어 CD20++와 같은 항체와 함께 사용될 때 CD20는 해당 세포에서 과발현됨을 의미한다. 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가없는 예로서, CD20의 경우, WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 야생형 CD20+ 라지 세포에 비해 CD20++ 표적 세포에서 발현 수준이 약 16배 증가한다.
용어 erbB2 및 ERBB2는 상호 교환 가능하며 예를 들어 트라스투주맙에 의해 인지되는 항원을 나타낸다.
"-/-세포"와 관련하여 용어 "-/-"는 항원(약물 표적)이 발현되지 않는 표적 세포를 의미하는 것으로 의도되며, 즉 관련 유전자가 논의되는 항체/리셉터의 발현을 무트되게 제거(무효화)되었다. 용어는 본 발명에서 "T-"와 상호 교환적으로 사용된다. 결과적으로, 특정 항원을 인코딩하는 유전자가 기능하지 않게 되었기 때문에 세포는 항체에 의해 인식되는 특정 항원의 검출 가능한 수준을 더 이상 발현하지 않는다. 본 발명의 맥락에서 이는 대조군 표적 세포로 볼 수 있다.
용어 "E"는 "이펙터 세포", 특히 본 발명에 따른 이펙터 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "이펙터 세포"는 자극에 능동적으로 반응하고 일부 변화에 영향을 주는(이를 유발하는) 임의의 유형의 임의의 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 예 중 하나는 종양 세포를 용해할 수 있는 강력하게 생산적인 세포 독성 이펙터 세포인 사이토카인 유도된 사멸 세포이다. 추가의 예 및 본 발명의 맥락에서 이펙터 세포는 항체의 Fc 영역에 결합하는 상기 세포의 표면에 Fc 감마 리셉터(FcγR 또는 FCGR)를 갖는 임의의 세포를 의미하는 것으로 의도되며, 항체 자체는 특별하게 표적 세포에 결합할 수 있다.
용어 "T"는 "표적 세포", 즉 특정 호르몬, 항원, 항체, 항생제, 감응형 T 세포 또는 기타 물질과 반응하는 특정 리셉터/항원을 갖는 임의의 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 이와 관련하여 용어 "(T+)"는 항원 양성 표적 세포 및 결과적으로 이의 표면에 항원을 발현하고 항체의 결합을 허용하는 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 대조적으로, 용어 "(T-)"는 항원 음성 표적 세포(대조군 표적 세포) 및 결과적으로 이의 표면에 항원을 발현하지 않아 항체와 반응할 수 없는 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 다르게 말하면, 항원 -/- 세포(또는 T-세포)는 특정 항원을 인코딩하는 유전자가 기능하지 않게 되었기 때문에 ADCC 활성에 대해 테스트 중인 항체에 의해 인식되는 특정 항원의 검출 가능한 수준을 발현하지 않는다. 구체적으로, 본 발명에 따라 사용되는 표적 세포는 일반적으로 하나의 세포 유형을 T+ 세포로 사용하고 다른 세포 유형을 T-세포로 사용하는 공지된 방법과 대조되는 동일한 유형의 세포이다. 다르게 말하면, 항원 양성 표적(T+) 세포와 정확히 동일한 세포인 상동성 대조군 표적 세포는 분석되는 항체에 의해 인식되는 특정 항원을 발현하지 않는다는 점을 제외하고는 모든면에서 동일하다. 전술한 바와 같이, 이는 예를 들어 CD20 발현 B-세포 표적 세포를 사용하여 리툭시맙 활성의 정량화를 위한 대조군 표적 세포로 자주 사용되는 T-세포(T 림프구)의 사용과 대조적이다.
실시예
실시예 1: 공동 자극 리셉터 CD28을 과발현하는 조작된 CD16 반응성 이펙터 세포주의 확립
WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD16A의 V-변이 또는 F-변이를 발현하는 주르카트 세포(ATCC® TIB-152)는 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 공동 자극 리셉터 CD28을 인코딩하는 유전자로 형질 감염되었다. 형광 활성화 세포 분류 및 항-CD28 단클론 항체(ImmunoTools, Catalogue N° 21270280)를 FITC 염소 항-마우스 IgG(ImmunoTools, Catalogue N° 22549913)와 함께 사용하여 양성 클론을 농축시켰다. 세포는 또한 ADCC 활성화된 FL 활성이 세포 농도와 무관하게 결과를 렌더링하는 RL 활성의 구성적 발현에 비해 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라제(RL)를 인코딩하는 유전자로 형질 감염시켰다. 안정한 클론을 분리되고, WO 2018/065401에 이전에 개시된 CD20를 과발현하는 ADCC 표적 세포 및 리툭시맙의 존재에서 ADCC 활성에 대해 특성화한 다음 서브-클론되었다. 안정한 서브-클론은 분리되고 항체에 의해 특별하게 인식되는 항원을 발현하고 하기 실시예들에서 설명되는 바와 같이 CD80 및/또는 CD86을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 재조합 표적 세포와 함께 항체의 ADCC 활성을 평가하는데 사용될 때 향상된 FL 신호를 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 2: 공동 자극 리셉터 CD137(4-1BB)을 과발현하는 조작된 CD16 반응성 이펙터 세포주의 확립
WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 반딧불이 루시퍼라제(FL) 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 CD16A의 V-변이 또는 F-변이를 발현하는 주르카트 세포(ATCC® TIB-152)는 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 공동 자극 리셉터 CD137(4-1BB)을 인코딩하는 유전자로 형질 감염시켰다. 일련의 일시적 형질 감염 실험의 결과는 ERBB2를 과발현하는 HEK293 표적 세포 및 하나 이상의 공동 자극 분자와 함께 사용될 때 WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIIA 리셉터를 발현하는 주르카트 이펙터 세포에서 CD137의 발현이 트라스투주맙을 사용하는 ADCC 분석의 FL 신호를 현저하게 증가시켰음을 보여준다(도 1a). CD137 양성 클론을 인코딩하는 유전자로 WO 2018/065401에 개시된 이펙터 세포의 안정적인 형질 감염 후 형광 활성화 세포 분류 및 Alexa-488 접합된 항-CD137 단클론 항체(R & D Systems Catalog N° FAB838G)를 사용하여 농축되었다. 세포는 또한 ADCC 활성화된 FL 활성이 세포 농도와 무관하게 결과를 렌더링하는 RL 활성의 구성적 발현에 비해 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라제(RL)를 인코딩하는 유전자로 형질 감염되었다. 안정한 클론을 분리하고, WO 2018/065401에 이전에 개시된 ERBB2를 과발현하는 ADCC 표적 세포 및 트라스투주맙의 존재하에 ADCC 활성을 특성화한 다음 서브-클론되었다. 안정한 서브-클론이 분리되고, 항체에 의해 특별하게 인식되는 항원을 발현하며 하기 실시예들에서 설명되는 바와 같이 CD80 및/또는 CD86을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 재조합 표적 세포와 함께 항체의 ADCC 활성을 평가하는데 사용될 때 향상된 FL 신호를 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 제타 신호 전달 사슬을 단독으로 또는 공동 자극 리셉터 CD28과 함께 과발현하는 조작된 CD16A 반응성 이펙터 세포주의 확립
FcγRIIIA 리셉터로부터의 ITAM 신호 전달을 최적화하고 따라서 ADCC 분석의 동적 범위 및 감도를 증가시키기 위해 WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIIA 리셉터를 발현하는 주르카트 이펙터 세포 또는 실시예 1에 기재된 CD28을 과발현하는 이펙터 세포는 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 3개의 ITAM 활성화 모티프(4)를 포함하는 CD3와 관련된 막 횡단 제타 신호 전달 분자(CD247)로 형질 감염시켰다. 일련의 일시적 형질 감염 실험의 결과는 ERBB2만을 과발현하거나 CD86과 함께 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 사용될 때 WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 대한 결합 부위를 함유하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIIA 리셉터를 발현하는 주르카트 이펙터 세포에서 제타 막횡단 신호 전달 분자 단독(도 1b) 또는 CD28과 함께 과발현은 트라스투주맙을 사용하는 ADCC 분석의 FL 신호를 현저하게 증가시켰다(도 1b). FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 막횡단 제타 신호 전달 분자(CD247)로 WO 2018/065401에 개시된 이펙터 세포의 안정적인 형질 감염 후, 형광 활성화 세포 분류 및 FITC 표지 항-CD247 단클론 항체(AbCam, Catalogue N° H46-968)를 사용하여 양성 클론이 농축되었다. 세포는 또한 ADCC 활성화된 FL 활성이 세포 농도와 무관한 결과를 렌더링하는 RL 활성의 구성적 발현에 비해 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라제를 인코딩하는 유전자로 형질 감염시켰다. 안정한 클론이 분리되고, WO 2018/065401에 이전에 개시된 ERBB2를 과발현하는 ADCC 표적 세포 및 트라스투주맙의 존재하에 ADCC 활성을 특성화한 다음 서브 클론되었다. 상기 세포의 사용은 항체에 의해 특별하게 인식되는 항원을 발현하고 CD80 및/또는 CD86을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 재조합 표적 세포와 함께 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때, 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도로 나타난다.
실시예 4: 조작된 CD32 반응성 이펙터 세포주의 확립
FcγRIIA 리셉터로부터의 신호 전달을 최적화하고 따라서 ADCP 분석의 동적 범위 및 감도를 최적화하기 위해 주르카트 세포는 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 WO 2018/065401에 이전에 개시된 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5 NF-AT에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 합성 키메라 프로모터에 의해 조절되는 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA 리셉터로 형질 감염시켰다. 형광 활성화된 세포 분류 및 FITC 표지된 항-CD32 단클론 항체(AbCam, catalogue N° ab30356)를 사용하여 양성 클론이 농축되었다. 세포는 또한 ADCP 활성화된 FL 활성이 세포 농도와 무관한 결과를 렌더링하는 RL 활성의 구성적 발현에 비해 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라제(RL)를 인코딩하는 유전자로 형질 감염시켰다. 안정한 클론이 분리되고 WO 2018/065401에 이전에 개시된 CD20을 과발현하는 표적 세포 및 리툭시맙의 존재하에 ADCP 활성에 대해 특성화되었다. 항체에 의해 특별하게 인식되는 항원을 발현하고 CD80 및/또는 CD86을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 재조합 표적 세포와 함께 항체의 ADCP 활성을 평가하기 위한 상기 이펙터 세포의 사용은 다음의 실시예들에서 설명된 바와 같이 NFAT 키메라 프로모터의 제어하에 FL 리포터-유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA를 발현하는 세포에 비해 ADCP 분석에서 향상된 신호, 동적 범위 및 감도로 나타났다.
실시예 5: 세포 표면에서 일정한 높은 수준의 CD20 및 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 조작된 표적 세포주의 확립.
WO 2018/065401에 이전에 개시된 CD20의 일정한 높은 수준을 과발현하는 라지 세포(ATCC® CCL-86)를 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalogue N° E2311)을 사용하여 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두로 형질 감염시켰다. 형광 활성화된 세포 분류 및 피세리트린(phycerythrin) 표지된 항-CD80(ImmunoTools, Catalog N° 21270804) 또는 FITC 표지된 항-CD86(ImmunoTools, Catalog N° 21480863) 단클론 항체를 사용하여 양성 클론을 농축시켰다. 안정한 클론이 분리되고 WO 2018/065401에 이전에 개시된 ADCC 이펙터 세포 및 리툭시맙의 존재하에 ADCC 활성에 대해 특성화된 다음 서브 클론되었다. 적합한 서브 클론을 분리, 특성화 및 증식시켜 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 CD20++ 표적 세포주를 발생시켰다.
WO 2018/065401에 개시된 iLite® 이펙터 세포의 바이알 및 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 CD20++ 표적 세포의 바이알을 표준 기술을 사용하여 별도로 냉동시켰다. 해동시, 이펙터 세포와 표적 세포를 3:1의 E:T 비율로 혼합하고 RPMI 1640 배양 배지 + 10% 소태아 혈청(FBS)에서 리툭시맙의 농도를 증가시키고 96-웰 백색면 미세정량판(Perkin Elmer 6005181)에서 4시간 동안 배양시켰다. 그런 다음 Dual Glo(Promega 22920) 이중 루시퍼라제 기질을 사용하여 FL 활성을 결정하고 발광계(GloMax, Promega)에서 발광을 정량화하고 상대 루시퍼라제 단위(RLU)로 표현하였다. 결과는 도 2a에 도시된 바와 같이 4-파라메트릭 로지스틱(4PL) 플롯의 형태로 제공된다. 도 2a 및 표 1과 관련된 표는 iLite® 이펙터 세포 및 제공된 표적 세포에 대한 4PL 플롯의 주요 파라미터를 요약한다. 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 CD20++ 표적 세포를 WO 2018/065401에 이전에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하는데 사용했을 때 ADCC 분석의 최대 FL 신호가 CD80을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 증가됨에도 불구하고, CD20을 과발현하는 표적 세포를 단독으로 사용하는 것에 비해 동적 범위와 감도가 감소되었다. 유사하게, CD86 단독 또는 CD86과 함께 과발현은 WO 2018/065401에 이전에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 사용될 때 ADCC 분석의 동적 범위 및 감도를 감소시켰다(도 2a).
WO 2018/065401에 이전에 개시된 CD16A의 F-변이를 발현하는 이펙터 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86을 과발현하는 CD20++ 표적 세포를 사용했을 때 최대 FL 신호의 증가가 없고 감소된 동적 범위가 관찰되었다(도 2b). 또한, 분석의 감도는 크게 영향을 받지 않거나 감소하지 않았다(도 2b).
CD20을 과발현하는 라지 표적 세포에서 공동 자극 분자 CD80 및 CD86의 과발현이 CD20만을 과발현하는 라지 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위한 분석의 감도와 동적 범위를 감소시킨다는 관찰은 부모 라지 세포에서 CD80 및 CD86의 높은 내인성 발현 수준과 가장 관련이 있고(5) 발현 수준의 증가는 이펙터 세포 CD28와 표적 세포 CD80-CD86 상호 작용의 CTLA-4 조절을 가장 많이 유도한다(5).
WO 2018/065401에 이전에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 CD20 단독 또는 CD80과 함께, 또는 CD86 또는 CD80 및 CD86 둘 모두를 함께 과발현하는 상기 라지 표적 세포는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 현저하게 향상된 동적 범위 및 감도로 ADCC 분석에서 나타났다(도 3a). 그러나 최대 FL 신호는 NFAT 반응성 이펙터 세포와 야생형 라지 표적 세포에서 관찰된 것보다 낮았다(도 3a). 비록 최대 FL 신호의 증가는 없고 감소된 동적 범위 및 감소된 감도는 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86을 과발현하는 CD20++ 표적 세포가 CD20++ 표적 세포를 단독으로 사용하여 관찰되는 것에 비해 이전에 WO 2018/065401에 개시된 CD16A의 F-변이를 발현하는 이펙터 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하는데 사용되었을 때 관찰되고(도 3b), 분석의 동적 범위 및 감도는 그럼에도 불구하고 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 라지 표적을 사용하여 관찰된 것보다 우수하였다(도 3b).
CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두와 함께 CD20을 과발현하는 라지 표적 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같은 재조합 주르카트 이펙터 세포 V-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현이 ADCC 분석에서 FL 신호가 증가된 것으로 나타났다(도 4a, 표 1). ADCC 분석의 감도는 약간 감소했거나 크게 변경되지 않았으며(도 4a, 표 1), ADCC 분석의 동적 범위는 CD80 또는 CD86을 단독으로 또는 CD20 단독을 과발현하는 표적 세포에 비해 CD80과 함께 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 감소하였고, 이는 처리되지 않은 대조군 샘플과 리툭시맙으로 처리된 샘플 모두에서 FL 신호의 전체적인 증가 때문이다(도 4a, 표 1).
CD80 또는 CD86과 함께 CD20를 과발현하는 라지 표적 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 F-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 CD20만을 과발현하는 표적 세포의 사용에 비해 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호로 나타났다(도 4b). CD20만을 과발현하는 표적 세포의 사용에 비해 ADCC 분석의 감도는 영향을 받지 않거나 약간 감소되었지만(도 3b 및 4b), 처리되지 않은 대조군 샘플 및 리툭시맙으로 처리된 샘플에서의 FL 신호가 전체적으로 증가하기 때문에, ADCC 분석의 동적 범위는 CD28을 과발현하는 에픽터 세포 및 CD80 또는 CD86 중 하나를 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 감소되었다(도 3b 및 4b).
CD20을 단독으로, 또는 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두와 함께 과발현하는 라지 표적 세포와 함께 리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 V-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 라지 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 향상된 동적 범위 및 현저하게 향상된 감도로 ADCC 분석에서 나타났다(도 3a). 그러나 최대 FL 신호는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 라지 표적 세포에서 관찰된 것보다 낮았다(도 3a).
리툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 CD20을 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 과발현하는 라지 표적 세포와 함께 실시예 1에 기술된 바와 같이 CD16A의 F-변이를 발현하고 CD28을 과발현하는 주르카트 이펙터 세포의 사용은 CD16A의 F-변이 및 야생형 라지 표적 세포를 발현하는 NFAT 반응성 이펙터 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 동적 범위 및 감도가 증가한 것으로 ADCC 분석에서 나타났다(도 3b). 대조적으로, 분석의 최대 FL 신호는 CD16A의 F-변이 및 야생형 라지 표적 세포를 발현하는 NFAT 반응성 이펙터 세포를 사용할 때 더 컸다(도 5b).
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 상기 이펙터 세포 및 CD20만을 과발현하는 표적 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 재조합 라지 표적 세포와 함께 리툭시맙의 ADCP 활성을 평가하는데 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 NFAT 키메라 프로모터 및 야생형 라지 표적 세포의 제어하에 FL 리포터 유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA를 발현하는 이펙터 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 CD20을 과발현하는 재조합 라지 표적 세포와 함께 리툭시맙의 ADCP 활성을 평가하기 위해 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 6: 세포 표면에서 높은 일정한 수준의 erbB2 및 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 조작된 표적 세포주의 확립.
WO 2018/065401에 이전에 개시된 일정한 고수준의 erbB2를 과발현하는 HEK293 세포(ATCC® CRL 1573)를 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalogue N° E2311)을 사용하여 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86 또는 CD80 및 CD86 둘 모두로 형질 감염시켰다. 형광 활성화된 세포 분류 및 피세리트린 표지된 항-CD80(ImmunoTools, Catalog N° 21270804) 또는 FITC 표지된 항-CD86(ImmunoTools, Catalog N° 21480863) 단클론 항체를 사용하여 양성 클론을 농축시켰다. 안정한 클론이 분리되고 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC 이펙터 세포 및 트라스투주맙의 존재하에 ADCC 활성에 대해 특성화한 다음 서브 클론시켰다. 적합한 서브 클론을 분리, 특성화 및 증식시켜 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 erbB2++ 표적 세포주를 발생시켰다.
WO 2018/065401에 개시된 iLite® 이펙터 세포의 바이알 및 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 erbB2++ 표적 세포의 바이알을 표준 기술을 사용하여 별도로 냉동시켰다. 해동시, 이펙터 세포와 표적 세포를 4:1의 E:T 비율로 혼합하고 RPMI 1640 배양 배지 + 10% 소태아 혈청(FBS)에서 증가하는 농도의 트라스투주맙 존재하에 96 웰 백색면 미세정량판(Perkin Elmer 6005181)에서 6시간 동안 배양하였다. 그런 다음 Dual Glo(Promega 22920) 이중 루시퍼라제 기질을 사용하여 FL 활성을 결정하고 발광계(GloMax, Promega)에서 발광을 정량화하며 상대 루시퍼라제 단위(RLU)로 표현하였다. 결과는 도 6 내지 9에 도시된 바와 같이 4-파라메트릭 로지스틱(4PL) 플롯의 형태로 제공된다. 도면과 표 2와 관련된 표는 iLite® 이펙터 세포 및 erbB2++ 표적 세포에 대한 4PL 플롯의 주요 파라미터를 개략적으로 설명한다.
erbB2를 과발현하는 상기 세포가 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하는데 사용되었을 때 ADCC 분석의 최대 FL 신호 및 동적 범위의 증가는 erbB2 및 CD86을 모두 과발현하는 표적 세포를 사용하여 가장 두드러졌다(도 6a). 증가된 FL 신호 및 동적 범위는 또한 erbB2 단독을 과발현하는 세포에 비해 erbB2 및 CD80 또는 erbB2 및 CD80 및 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 관찰되었다(도 a, 표 1). 공동 자극 분자 CD80, CD86, CD80 및 CD86의 과발현은 또한 분석의 감도를 증가시켰다. 감도의 가장 큰 증가는 erbB2 및 CD86을 과발현하는 표적 세포에 뒤이어 erbB2 및 CD80을 발현하는 표적 세포를 사용하여 관찰되었으며, erbB2 및 CD80 및 CD86을 모두 과발현하는 표적 세포를 사용하여 감도의 약간 증가만이 관찰되었다(도 6a, 표 2).
erbB2 및 CD80, 또는 erbB2 및 CD86을 모두 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 CD16A의 F-변이를 발현하는 주르카트 이펙터 세포는 현저하게 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 ADCC 분석에서 나타났다(도 6b). ADCC 분석의 감도는 erbB2 및 CD80을 모두 과발현하는 표적 세포를 사용하여 증가되었지만 erbB2 및 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 감소되었다(도 6b).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 erbB2를 단독으로 또는 CD80 또는 CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 과발현하는 상기 HEK293 표적 세포는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 현저하게 향상된 동적 범위 및 감도로 ADCC 분석에서 나타났다(도 7a). 최대 FL 신호는 또한 erbB2, 및 CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 표적 세포가 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가할 때 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 라지 표적 세포에서 관찰된 것에 비해 증가하였다(도 7a).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC F-변이 이펙터 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 erbB2를 단독으로 또는 CD80 또는 CD86과 함께 과발현하는 HEK293 표적 세포의 사용은 CD16A의 F-변이를 발현하는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 현저하게 향상된 FL 신호 및 동적 범위로 나타났다(도 7b). ADCC 분석의 감도는 또한 erbB2와 CD80 모두를 과발현하는 표적 세포를 사용하여 증가되었지만 erbB2와 CD86 모두를 발현하는 표적 세포를 사용하는 경우에는 증가하지 않았다(도 7b).
CD80, CD86, 또는 CD86과 함께 CD80과 함께 erbB2를 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 V-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 CD28의 과발현하는 주르카트 이펙터 세포 및 erbB2를 단독으로 과발현하는 표적 세포의 사용에 비해 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호, 동적 범위 및 감도로 나타났다(도 8a, 표 2).
CD86과 함께 erbB2를 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 F-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 나타났지만 감도는 감소되었다(도 8b).
CD86과 함께 erbB2를 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 V-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 도 9a에 도시된 바와 같이 CD16A의 V-변이를 발현하는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하는 ADCC에 비해 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호, 동적 범위 및 감도로 나타났다.
CD86과 함께 erbB2를 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 F-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 나타났지만, CD16A의 F-변이를 발현하는 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포를 사용하는 ADCC에 비해 감도가 감소되었다(도 9b).
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 상기 이펙터 세포 및 erbB2만을 과발현하는 표적 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두와 함께 erbB2를 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCP 활성을 평가하는데 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 NFAT 키메라 프로모터 및 야생형 SK-BR-3 표적 세포의 제어하에 FL 리포터-유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA를 발현하는 이펙터 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두와 함께 erbB2를 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 트라스투주맙의 ADCP 활성을 평가하는데 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 7: 세포 표면에서 높은 일정한 수준의 EGFR 및 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 조작된 표적 세포주의 확립.
WO 2018/065401에 이전에 개시된 일정한 높은 수준의 EGFR을 과발현하는 HEK293 세포(ATCC® CRL 1573)를 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalogue N° E2311)을 사용하여 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두로 형질 감염시켰다. 형광 활성화된 세포 분류 및 피세리트린 표지된 항-CD80(ImmunoTools, Catalog N° 21270804) 또는 FITC 표지된 항-CD86(ImmunoTools, Catalog N° 21480863) 단클론 항체를 사용하여 양성 클론을 농축시켰다. 안정한 클론은 분리되고, 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC 이펙터 세포 및 세툭시맙의 존재하에 ADCC 활성에 대해 특성화한 다음 서브 클론되었다. 적합한 서브 클론을 분리, 특성화 및 증식시켜 CD80, CD86, 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 EGFR++ 표적 세포주를 발생시켰다. WO 2018/065401에 개시된 iLite® 이펙터 세포의 바이알 및 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 EGFR++ 표적 세포의 바이알을 표준 기술을 사용하여 개별적으로 냉동시켰다. 해동시, 이펙터 세포와 표적 세포를 4:1의 E:T 비율로 혼합하고 RPMI 1640 배양 배지 + 10% 소태아 혈청(FBS)에서 증가하는 농도의 세툭시맙의 존재하에 96 웰 백색면 미세정량판(Perkin Elmer 6005181)에서 6시간 동안 배양시켰다. 그런 다음 Dual Glo(Promega 22920) 이중 루시퍼라제 기질을 사용하여 FL 활성을 결정되었고 발광계(GloMax, Promega)에서 발광을 정량화하며 상대 루시퍼라제 단위(RLU)로 표현되었다. 결과는 도 10 내지 13에 도시된 바와 같이 4-파라메트릭 로지스틱(4PL) 플롯의 형태로 제공된다. 도면과 표 3과 관련된 표는 iLite® 이펙터 세포 및 EGFR++ 표적 세포에 대한 4PL 플롯의 주요 파라미터를 개략적으로 설명한다.
상기 표적 세포가 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용되었을 때 ADCC 분석의 최대 FL 신호 및 동적 범위는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 표적 세포를 사용하여 가장 두드러졌다. 증가된 FL 신호 및 동적 범위는 또한 EGFR만을 과발현하는 세포에 비해 CD80 또는 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 관찰되었다(도 10a, 표 3). 공동 자극 분자 CD80 또는 CD86의 과발현은 또한 분석의 감도를 증가시키는 반면 CD80 및 CD86의 과발현은 분석의 감도를 감소시켰다(도 10a, 표 3).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 CD16A의 F-변이를 발현하는 ADCC 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 EGFR 및 CD86 모두를 과발현하는 표적 세포의 사용은 EGFR을 과발현하는 표적 세포의 사용에 비해 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 ADCC 분석에서 나타났지만, 분석 감도는 크게 변하지 않았다(도 10b).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포의 사용은 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 현저하게 향상된 동적 범위 및 향상된 감도로 나타났다. 대조적으로, NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포에서 관찰된 최대 FL 신호는 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포 및 EGFR와 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 표적 세포로 관찰된 것보다 컸다(도 11a, 표 3).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 CD16A의 F-변이를 발현하는 ADCC 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포의 사용은 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 감도가 향상되지만 동적 범위는 변하지 않았다. 대조적으로, NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포로 관찰되는 최대 FL 신호는 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포 및 EGFR와 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 표적 세포로 관찰된 것보다 컸다(도 11b).
CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD16A의 V-변이를 발현하고 공동 자극 리셉터 CD28을 과발현하는 재조합 주르카트 이펙터 세포의 사용은 WO 2018/065401에 개시된 바와 같이 내인성 수준의 CD28을 발현하는 주르카트 이펙터 세포 및 EGFR만을 과발현하는 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 현저하게 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 나타났다(도 11a 및 12a, 표 3). ADCC 분석의 감도는 CD80 또는 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 CD28의 내인성 수준을 발현하는 이펙터 세포의 사용에 비해 증가하였지만 CD86과 함께 EGFR 및 CD80을 모두 과발현하는 표적 세포를 사용할 때는 미미하게만 증가하였다(도 12a, 표 3).
CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD16A의 F-변이를 발현하고 공동 자극 리셉터 CD28을 과발현하는 주르카트 이펙터 세포의 사용은 EGFR만을 과발현하는 표적 세포에 비해 ADCC 분석에서 증가된 FL 신호, 증가된 동적 범위 및 증가된 감도로 나타났다(도 10b 및 12b).
실시예 1에 기재된 바와 같이 공동 자극 리셉터 CD28을 과발현하는 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포의 사용은 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 향상된 동적 범위로 나타났다. 분석의 감도는 또한 EGFR과 CD80, CD86, 또는 CD80과 CD86을 모두 과발현하는 표적 세포를 사용하여 증가되었다(도 13a). 대조적으로, NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포에서 관찰된 최대 FL 신호는 EGFR 및 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 ADCC V-변이 이펙터 세포에서 관찰 된 것보다 더 컸다(도 13a, 표 3).
실시예 1에 기재된 바와 같이 CD16A의 F-변이를 발현하고 CD28을 과발현하는 ADCC 이펙터 세포와 함께 세툭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 HEK293 표적 세포의 사용은 NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포를 사용하는 ADCC 분석에 비해 ADCC 분석에서 감도가 증가했지만 동적 범위는 변하지 않았다. 대조적으로, NFAT 반응성 이펙터 세포 및 야생형 A431 표적 세포로 관찰된 최대 FL 신호는 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD28을 과발현하는 ADCC F-변이 이펙터 세포 및 EGFR 및 CD86을 과발현하는 표적 세포에서 관찰된 것보다 더 컸다(도 11b).
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 상기 이펙터 세포 및 EGFR만을 과발현하는 표적 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 세툭시맙의 ADCP 활성을 평가하기 위해 사용될 때 개선된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 3에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 NFAT 키메라 프로모터 및 야생형 A431 표적 세포의 제어하에 FL 리포터-유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA를 발현하는 이펙터 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 EGFR을 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 세툭시맙의 ADCP 활성을 평가하는 데 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 8: 세포 표면에서 높은 일정한 수준의 mTNFα 및 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 조작된 표적 세포주의 확립.
이전에 WO 2018/065401에 개시된 막 결합 비절단성 TNFα(mTNFα)의 일정한 고수준을 과발현하는 HEK293 세포(ATCC® CRL 1573)는 FuGENE HD 형질 감염 시약(Promega Catalog N° E2311)을 사용하여 공동 자극 분자 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두로 형질 감염되었다. 형광 활성화된 세포 분류 및 피세리트린 표지된 항-CD80(ImmunoTools, Catalog N° 21270804) 또는 FITC 표지된 항-CD86(ImmunoTools, Catalog N° 21480863) 단클론 항체를 사용하여 양성 클론을 농축시켰다. 안정한 클론이 분리되고, 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC 이펙터 세포 및 인플릭시맙의 존재하에 ADCC 활성에 대해 특성화한 다음 서브 클론되었다. 적합한 서브 클론을 분리, 특성화 및 증식시켜 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86 모두를 과발현하는 mTNFα 표적 세포주를 발생시켰다. WO 2018/065401에 개시된 iLite® 이펙터 세포의 바이알 및 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 과발현하는 mTNFα++ 표적 세포의 바이알은 표준 기술을 사용하여 별도로 냉동되었다. 해동시, 이펙터 세포와 표적 세포를 6:1의 E:T 비율로 혼합하고 RPMI 1640 배양 배지 + 10% 소태아 혈청(FBS)에서 증가하는 농도의 인플릭시맙의 존재하에 96 웰 백색면 미량정량판(Perkin Elmer 6005181)에서 6시간 동안 배양하였다. 그런 다음 Dual Glo 이중 루시퍼라제 기질을 사용하여 FL 활성을 결정하고 발광계에서 발광을 정량화하고 상대 루시퍼라제 단위(RLU)로 표현하였다. 결과는 도 6 내지 9에 도시된 바와 같이 4-파라메트릭 로지스틱(4PL) 플롯의 형태로 제공된다. 도면 및 표 4와 관련된 표는 iLite® 이펙터 세포 및 mTNFα++ 표적 세포 대한 4PL 플롯의 주요 파라미터를 개략적으로 설명한다.
상기 표적 세포가 이전에 WO 2018/065401에 개시된 ADCC V-변이 이펙터 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용되었을 때 ADCC 분석의 최대 FL 신호 및 동적 범위는 CD80 및 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 가장 두드러졌다. 증가된 FL 신호 및 동적 범위는 또한 mTNFα만을 과발현하는 세포에 비해 CD80 또는 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 관찰되었다(도 14a, 표 4). 공동 자극 분자 CD80의 과발현은 또한 분석의 감도를 증가시켰지만 CD86 또는 CD80 및 CD86의 과발현은 함께 증가시키지 않았다(도 14a, 표 4).
이전에 WO 2018/065401에 개시된 CD16A의 F-변이를 발현하는 ADCC 이펙터 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 mTNFα를 발현하고 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현하는 표적 세포의 사용은 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 가장 두드러지는 증가된 FL 신호 및 동적 범위로 ADCC 분석에서 나타났다(도 14b). 증가된 FL 신호 및 동적 범위는 또한 mTNFα만을 과발현하는 세포에 비해 CD80을 과발현하는 표적 세포를 사용하여 관찰되었다(도 14b). 공동 자극 분자 CD80의 과발현은 분석의 감도를 약간 감소시켰다. 감도의 감소는 mTNFα와 CD86 모두를 과발현하는 표적 세포에서 더 두드러졌다(도 14b).
CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 mTNFα를 발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 주르카트 이펙터 세포 V-변이에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 공자극 분자 CD80을 과발현하는 표적 세포의 경우 ADCC 분석에서 FL 신호가 증가하고 감도가 약간 증가한 것으로 나타나는 반면, 분석 감도는 CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 mTNFα를 과발현하는 표적 세포를 사용하여 감소되었다(도 17a, 표 4). ADCC 분석의 동적 범위는 mTNFα 및 CD80 모두 발현하는 표적 세포를 사용하여 크게 영향을 받지 않았거나, CD80, CD86 또는 CD86과 함께 CD80을 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 CD82의 내인성 수준을 발현하는 이펙터 세포의 사용에 비해 mTNFα 및 CD86 또는 mTNFα 및 CD80와 CD86 모두 발현하는 표적 세포를 사용하여 감소되었으며, 이는 처리되지 않은 대조군 샘플과 인플릭시맙으로 처리된 샘플 모두에서 FL 신호의 전반적인 증가 때문이다(도 17, 표 4).
CD80 또는 CD86과 함께 mTNFα를 발현하는 HEK293 표적 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCC 활성을 평가하기 위해 사용될 때 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD16A의 F-변이를 발현하는 재조합 주르카트 이펙터 세포에서 공동 자극 리셉터 CD28의 과발현은 ADCC 분석에서 mTNFα만을 발현하는 표적 세포의 사용에 비해 증가되는 것으로 나타났다(도 17b). 대조적으로, 분석의 감도는 크게 영향을 받지 않았고 ADCC 분석의 동적 범위는 CD86을 과발현하는 표적 세포를 사용할 때 CD28의 내인성 수준을 발현하는 이펙터 세포의 사용에 비해 감소하였고, 이는 처리되지 않은 대조군 샘플과 인플릭시맙으로 처리된 샘플 모두에서 FL 신호의 전체적인 증가 때문이다(도 17b).
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 상기 효과기 세포 및 mTNFα 단독을 과발현하는 표적 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 mTNFα를 발현하고 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86을 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCP 활성을 평가하기 위해 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
실시예 4에 기재된 CD32A의 H-131 변이를 발현하는 이펙터 세포는 NFAT 키메라 프로모터 및 mTNFα 표적 세포의 제어하에 FL 리포터-유전자에 기능적으로 연결되는 FcγRIIA를 발현하는 이펙터 세포를 사용하는 ADCP 분석에 비해 CD80, CD86 또는 CD80 및 CD86과 함께 mTNFα를 과발현하는 재조합 HEK293 표적 세포와 함께 인플릭시맙의 ADCP 활성을 평가하기 위해 사용될 때 향상된 FL 신호, 동적 범위 및 감도를 발현하였다.
특정 구현예들에서, 본 발명은 또한 하기 항목에 관한 것이다:
항목:
1. NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 의해 활성화되는 재조합 리포터 유전자 또는 구조체를 갖는 이펙터 세포.
2. 항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화되는 재조합 표적 세포.
3. 항체가 특이적인 표적의 발현이 향상되는 재조합 표적 세포.
4. NF-AT, AP1, NFkB, CREB 및 STAT5에 의해 활성화되는 재조합 리포터 유전자 분석 또는 구조체를 갖는 이펙터 세포;
항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화된 재조합 표적 세포(종속 청구항, CD20, mTNFα, erbB2(SKBR3 및 HEK293), EGFR)
; 및
항체가 특이적인 표적의 발현이 향상된 재조합 표적 세포(종속 청구항, CD20, mTNFα, erbB2(SKBR3 및 HEK293), EGFR)를 포함하는 키트.
특별한 실시 형태에서, 본 발명은 또한 하기 항목에 관한 것이다:
항목:
1. NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 의해 활성화되는 재조합 리포터 유전자 또는 구조체를 갖는 이펙터 세포.
2. 항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화되는 재조합 표적 세포.
3. 항체가 특이적인 표적의 발현이 향상된 재조합 표적 세포.
4. SEQ ID NO. : 1에 기재된 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 NF-AT, AP1, NFkB 및 STAT5에 결합하는 조절 시퀀스.
5. NF-AT, AP1, NFkB, CREB 및 STAT5에 의해 활성화되는 재조합 리포터 유전자 분석 또는 구조체를 갖는 이펙터 세포;
항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화된 재조합 표적 세포(종속 청구항, CD20, mTNFα, erbB2(SKBR3 및 HEK293), EGFR)
; 및
항체가 특이적인 표적의 발현이 향상된 재조합 표적 세포(종속 청구항, CD20, mTNFα, erbB2(SKBR3 및 HEK293), EGFR)를 포함하는 키트.
또한, 추가의 특정 실시 형태에서 본 발명은 또한 하기의 노트에 관한 것이다:
노트:
1. CD28을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
2. CD137을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
3. CD247을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
4. CD80을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
5. CD86을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
6. CD137L을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 구조체.
7. 폴리뉴클레오티드 SEQ ID. NO. : 1을 포함하는 벡터 구조체.
8. 항목 1 내지 7에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터임.
9. 항목 1 내지 7 중 하나에 따른 벡터를 하나 이상 포함하는 세포.
10. 항목 9에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 세포.
11. 노트 1 내지 8에 있어서, 상기 벡터는 에피솜이거나 상기 세포의 게놈에 통합된 세포.
12. 노트 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 제1 리포터 단백질과 상이한 제2 리포터 단백질을 추가로 발현하는 세포.
13. 노트 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 주르카트, 몰트4, 라지, SKBR3, NK92, KHYG-1, HEK293 세포들 DT-40 또는 MSB-1인 세포.
13. i) 노트 9-13 중 어느 하나에 따른 세포;
ii) 항체가 특이적인 내인성 표적이 무효화(돌연변이)된 세포
; 및
iii) 항체가 특이적인 표적의 발현이 향상된 세포를 포함하는 키트.
14. 노트 14에 있어서, ii)에서의 표적 세포에서 무효화된 표적은 CD20, mTNFα, erbB2, EGFR 중 하나 이상을 포함하는 키트.
15. 노트 15에 있어서, iii)에서의 표적 세포에서 향상된 표적은 CD20, mTNFα, erbB2, EGFR 중 하나 이상을 포함하는 키트.
16. 노트 14-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 키트는 2개의 바이알을 포함하는 키트.
17. 노트 14-16 중 어느 하나에 있어서, i) 및 iii)에서의 세포는 하나의 동일한 바이알에 최적의 E:T 비율로 존재하는 키트.
18. 노트 14-16 중 어느 하나에 있어서, i)에서의 세포와 iii)에서의 표적 세포 사이의 비율(E:T 비율)은 약 24:1 내지 약 2:1, 예를 들어 약 6:1, 약 3:1 또는 약 1.5:1인 키트.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단락에 관한 것이다:
1. 하나 이상의 공동 자극 분자를 인코딩하는 벡터 구조체를 포함하는 세포.
2. 단락 1에 있어서, 상기 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1에서 제시된 뉴클레오티드 시퀀스의 약 70% 이상의 시퀀스 동일성을 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 세포.
3. 단락 1에 있어서, 상기 벡터 구조체는 공동 자극 분자 CD28을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 세포.
4. 단락 1에 있어서, 상기 벡터 구조체는 공동 자극 분자 CD137(4-1BB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 세포.
5. 단락 1에 있어서, 상기 벡터 구조체는 공동 자극 분자 CD247 (T3 제타 사슬)을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 포함한다.
6. 단락 1에 따른 세포에서, 상기 벡터 구조체는 공동 자극 분자 CD278 (ICOS)을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 포함한다.
7. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 공동 자극 분자는 CD28, CD137L(4-1BB) 및 ICOS 중 하나 이상으로부터 선택되는 리셉터인 세포.
8. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공동 자극 분자는 세포에서 구성적으로(constitutively) 발현되거나 과발현되는 세포.
9. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 CD16A 또는 CD32를 추가로 발현하는 세포.
10. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, CTLA-4(CD152)는 구체적으로 무효화되는 세포.
11. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 1차 세포 또는 세포주인 세포.
12. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 예를 들어, 주르카트, 몰트4, 라지, SKBR3, NK92, KHYG-1, HEK293 세포들 DT-40 또는 MSB-1와 같은 동물 세포주인 세포.
13. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 에피솜이거나 상기 세포의 게놈에 통합된 것인 세포.
14. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 제1 리포터 단백질을 추가로 발현하는 세포.
15. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 리포터 단백질은 예를 들어 루시퍼라제 또는 형광 단백질과 같은 효소인 세포.
16. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 제1 리포터 단백질과 상이한 제2 리포터 단백질을 추가로 발현하는 세포.
17. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 항체 또는 Fc 융합 단백질에 의해 인식되는 항원을 추가로 발현하는 세포.
18. 선행 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 항체 또는 Fc 융합 단백질에 의해 인식되는 항원을 추가로 과발현하는 세포.
19. i) 항체의 Fc 영역에 결합하고 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현할 수 있거나 단락 1-18 중 어느 하나에 따라 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현할 수 있는 이펙터 세포(E);
ii) 상기 항체가 특이적인 내인성 표적/항원이 무효화(돌연변이)되어 표적/항원이 세포에 의해 발현되지 않거나 비-기능적 형태로 발현되는 표적 세포(T-); 및
iii) 상기 항체가 특이적인 표적의 발현이 CD80, CD86, CD137L 및 (CD278L) ICOSL을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자와 함께 향상되거나 과발현되는 표적 세포(T+)를 포함하는 키트.
20. 단락 19에 있어서, ii)에서의 세포 및 iii)에서의 세포는 ii)에서의 세포가 분석되는 항체 또는 약물에 의해 인식되는 특정 항원을 발현하지 않는 것을 제외하고 모든 측면에서 정확히 동일한 세포인 키트.
21. 단락 19-20 중 어느 하나에 있어서, 표적/항원은 CD20, mTNFα, erbB2, EGFR 중 하나 이상인 키트.
22. 단락 19-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 키트는 2개의 바이알을 포함하고, i) 및 iii)에서의 세포는 최적의 E:T 비율로 하나의 동일한 바이알에 존재하는 키트.
23. 단락 19-22 중 어느 하나에 있어서, i)에서의 이펙터 세포와 iii)에서의 표적 세포 사이의 비율(E:T 비율)은 약 24:1 내지 약 2:1의 범위 또는 약 6:1, 또는 약 3:1, 또는 약 1.5:1 범위인 키트.
24. 치료용 항체들의 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC) 활성을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은;
a) 항체를 포함하는 얻어진 샘플을 단락 19에 따른 이펙터 세포 i) 및 표적 세포 iii)와 접촉시키는 단계,
b) 약물 표적이 무효화된, 단락 19 ii)에 따른 세포들 ii) 및 이펙터 세포들 i)의 존재하에 얻어진 신호를 단락 1-18 중 어느 하나에 따른 이펙터 세포들 i) 및 단락 19iii)에 따른 표적 세포들 iii)의 존재하에서 얻어진 신호에서 빼는(subtracting) 단계,
c) a) 및 b)에서 측정된 신호 관계를 기반으로 ADCC 활성을 결정하는 단계를 포함함.
25. 치료용 항체들의 항체-의존성 세포-매개 식세포 작용(ADCP) 활성을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은;
a) 항체를 함유하는 얻어진 샘플을, 이펙터 세포들 i) 및 단락 19iii)에 따라 표적 세포들 iii)과 접촉시키는 단계,
b) 약물 표적이 무효화된, 단락 19 ii)에 따른 세포들 ii) 및 이펙터 세포들 i)의 존재하에 얻어진 신호를 단락 1-18 중 어느 하나에 따른 이펙터 세포들 i) 및 단락 19iii)에 따른 표적 세포들 iii)의 존재하에 얻어진 신호에서 빼는 단계,
c) a) 및 b)에서 측정된 신호 관계를 기반으로 ADCP 활성을 결정하는 단계를 포함함.
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Claims (25)

  1. 하나 이상의 공동 자극 분자를 인코딩하는 벡터 구조체를 포함하는 세포로서, 상기 벡터 구조체는 SEQ ID NO. : 1에 제시된 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 상기 벡터 구조체는 공동 자극 분자 CD28, 공동 자극 분자 CD137(4-1BB), 공동 자극 분자 CD247(T3 제타 사슬), 공동 자극 분자 CD278(ICOS)로부터 선택되는 하나 이상을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 공동 자극 분자는 상기 세포에서 구성적으로(constitutively) 발현되거나 과발현되는 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 CD16A 또는 CD32를 추가로 발현하는 세포.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, CTLA-4(CD152)는 특이적으로 돌연변이되어 CTLA-4 (CD152)가 발현되지 않거나 또는 CTLA-4 (CD152) 가 비-기능적 형태로 발현되는 세포.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 일차 세포 또는 세포주인 세포.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 주르카트, 몰트4, 라지, SKBR3, NK92, KHYG-1, HEK293 세포들, DT-40, 및 MSB-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 동물 세포주인 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터는 에피솜이거나 상기 세포의 게놈에 통합되는 세포.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 제1 리포터 단백질을 추가로 발현하는 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 리포터 단백질은 루시퍼라제 또는 형광 단백질인 세포.
  10. 제8항에 있어서, 상기 세포는 상기 제1 리포터 단백질과 상이한 제2 리포터 단백질을 추가로 발현하는 세포.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 Fc 융합 단백질 또는 항체의 Fc 영역에 의해 인식되는 항원을 추가로 발현하거나 과발현하는 세포.
  12. i) 항체의 Fc 영역에 결합하고 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하거나 하나 이상의 공동 자극 분자를 과발현할 수 있는 이펙터 세포 (E)이고, 이때 상기 이펙터 세포 (E)는 제1항 또는 제2항에 따른 세포인, 이펙터 세포(E);
    ii) 상기 항체가 특이적인 내인성 항원이 무효화되어 상기 내인성 항원이 발현되지 않거나 또는 상기 내인성 항원이 비-기능적 형태로 발현되는 표적 세포(T-); 및
    iii) 상기 항체가 특이적인 표적의 발현이 CD80, CD86, CD137L 및 (CD278L)ICOSL을 포함하는 하나 이상의 공동 자극 분자와 함께 향상되거나 과발현되는 표적 세포 (T+)
    를 포함하는 키트.
  13. 제12항에 있어서, ii)의 상기 세포 및 상기 세포 iii)은 ii)의 상기 세포가, 분석되는 상기 항체 또는 약물에 의해 인식되는 특정 항원을 발현하지 않는 것을 제외하고 모든 측면에서 정확히 동일한 세포인 키트.
  14. 제12항에 있어서, 상기 내인성 항원은 CD20, mTNFα, erbB2, EGFR 중 하나 이상인 키트.
  15. 제12항에 있어서, 상기 키트는 두개의 바이알을 포함하고, i) 및 iii)의 상기 세포들은 하나의 동일한 바이알에 최적의 E:T 비율로 존재하며, 상기 i)의 이펙터 세포와 상기 iii)의 표적 세포 간의 비율(E:T 비율)은 24:1 내지 2:1, 또는 6:1, 또는 3:1, 또는 1.5:1 범위인 키트.
  16. 치료용 항체들의 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC) 활성을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 항체를 함유하는 얻어진 샘플을 제12항 i)에 따른 이펙터 세포(E) 및 제12항 iii)에 따른 표적 세포들 (T+)과 접촉시키는 단계,
    b) 약물 표적이 무효화되어 상기 약물 표적이 발현되지 않거나 또는 상기 약물 표적이 비-기능적 형태로 발현되는, 제12항 ii)에 따른 표적 세포들 (T-) 및 제12항 i)에 따른 이펙터 세포들 (E)의 존재하에 얻어진 신호를 제12항 i)에 따른 이펙터 세포들 (E) 및 제12항 iii)에 따른 표적 세포들 (T+)의 존재 하에 얻어진 신호에서 빼는 단계,
    c) a) 및 b)에서 측정된 신호 관계를 기반으로 ADCC 활성을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 치료용 항체들의 항체-의존 세포-매개 식세포 작용(ADCP) 활성을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 항체를 함유하는 얻어진 샘플을 제12항 i)에 따른 이펙터 세포들 (E) 및 제12항 iii)에 따른 표적 세포들 (T+)과 접촉시키는 단계,
    b) 약물 표적이 무효화되어 상기 약물 표적이 발현되지 않거나 또는 상기 약물 표적이 비-기능적 형태로 발현되는, 제12항 ii)에 따른 표적 세포들 (T-) 및 제12항 i)에 따른 이펙터 세포들 (E)의 존재하에 얻어진 신호를 제12항 i)에 따른 이펙터 세포들 (E) 및 제12항 iii)에 따른 표적 세포들 (T+)의 존재 하에 얻어진 신호에서 빼는 단계,
    c) a) 및 b)에서 측정된 신호 관계를 기반으로 ADCP 활성를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 따른 세포를 포함하는 생물학적 분석을 위한 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 따른 세포를 포함하는 진단을 위한 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 따른 세포를 포함하는 분석에서 향상된 동적 범위 및/또는 증가된 감도를 위한 분석을 위한 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 항체의 ADCC 및/또는 ADCP 활성을 평가하는데 사용되는, 분석을 위한 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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