KR20180043838A

KR20180043838A - Ｈｐｐｄ 변이체 및 사용 방법

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Publication number: KR20180043838A
Application number: KR1020187009716A
Authority: KR
Inventors: 마르크 린카; 파비앙 포레; 베른트 레버; 구트룬 랑게; 얀 테베; 바이네 코코; 미카엘 스트레라스; 에른스트 베버; 니콜라우스 파블로프스키; 산드라 게스케; 하이케 발벤-로스; 니나 봅스트; 크리스티나 티에스; 마누엘 두볼드
Original assignee: 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트; 바이엘 크롭사이언스 엘피
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2018-04-30
Also published as: UA126550C2; ZA201802329B; WO2017042259A1; US20180208937A1; CN108884470B; EP3347475B1; AR105984A1; HK1258349A1; EA201890696A1; AU2016319093B2; US10597674B2; BR112018004779A2; BR112018004779A8; ES2933673T3; CA2998036A1; UY36898A; AU2016319093A1; CN108884470A; JP2018534911A; EP3347475A1

Abstract

본 발명에, 다양한 화학적 부류에 속하는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 대해 완전 내성을 나타내는 HPPD 폴리펩티드 및 이를 함유하는 식물이 기재된다.
HPPD 억제 제초제에 대해 친화성이 없거나 현저히 감소된 친화성만을 갖는 동시에, HPPD 억제제가 더 이상 느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제로서 작용하지 않고 대신에 완전히 가역적인 억제제로 될 정도로 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 HPPD 억제제의 해리 속도가 증가된 한 세트의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드가 설계되었다.
특히, 다양한 화학적 부류에 속하는 HPPD 억제 제초제에 대해 내성을 부여하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 추가로, 폴리뉴클레오티드에 상응하는 아미노산 서열이 포함된다.

Description

ＨＰＰＤ 변이체 및 사용 방법

본 발명은 식물 분자 생물학, 특히 HPPD 억제 제초제에 개선된 내성을 부여하는 신규 HPPD 폴리펩티드에 관한 것이다.

4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase: HPPD)는 티로신 분해 산물인 파라 (para)-히드록시페닐피루베이트 (여기서는 HPP로 약칭함)가 토코페롤 및 플라스토퀴논의 식물 내 전구체인 호모겐티세이트 (여기서는 HGA로 약칭함)으로 변환되는 반응을 촉매화하는 효소이다 (Crouch N.P. et al. (1997), Tetrahedron 53, 20, 6993-7010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134：1388-1400). 토코페롤은 막관련 항산화제로 작용한다. 플라스토퀴논은 첫째로 PSII 및 시토크롬 b6/f 복합체 간 전자 운반체로 작용하며, 둘째로 카로테노이드의 생합성에 관여하는 파이토엔 디새튜라제 (phytoene desaturase)를 위한 산화환원 보조인자로 작용한다.

지금까지, NCBI 데이터베이스에 존재하는 다양한 유기체들로부터 1000 이상의 핵산 서열이 HPPD 도메인을 갖는 추정 단백질을 코딩하는 것으로 부연 설명되었다. 그러나, 이들의 대부분에 대하여, 상기 단백질이 시험관내 (in vitro) 분석에서 또는 식물체 내의 (in planta) 접근 방식에서 HPPD 효소 활성을 가질 수 있었던 점이나 이와 같은 HPPD 폴리펩티드가 식물 내에서 발현될 때에 HPPD 억제 제초제에 제초제 내성을 부여할 수 있는 점은 입증되지 않았다. 몇몇 HPPD 단백질 및 이들의 일차 서열, 특히 슈도모나스 (Pseudomonas) (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem. 205, 459-466, 1992, WO96/38567), 코르디아 (Kordia) (WO2011/076889), 시네초코커스 (Synechococcus) (WO2011/076877), 아시도박테리움 (Acidobacterium) 및 무실라기니박터 (Mucilaginibacter) (WO2015/022634), Rhodococcus (WO2011/076892), 로도코커스 (Rhodococcus) (WO2011/076892)와 같은 박테리아, 블레파리스마 (Blepharisma) (WO2011/076882)와 같은 원생생물, 피크로필러스 (Picrophilus) (WO2011/076885)와 같은 유리고세균 (euryarchaeota), 클라미도모나스 레인하르드티 (Chlamydomonas reinhardtii) (ES2275365; WO2011/145015), 세네데스무스 (Scenedesmus) (WO2015/022634)와 같은 조류, 아라비돕시스 (Arabidopsis) (WO96/38567, GENBANK® AF047834), 당근 (WO96/38567, GENBANK® 87257), 아베나 사티바 (Avena sativa) (WO2002/046387, WO2011/068567), 밀 (WO2002/046387), 브라키아리아 플라티필라 (Brachiaria platyphylla) (WO2002/046387), 센크러스 에키나투스 (Cenchrus echinatus) (WO2002/046387), 롤리엄 리지둠 (Lolium rigidum) (WO2002/046387), 페스투카 아룬디나세아 (Festuca arundinacea) (WO2002/046387), 세타리아 파베리 (Setaria faberi) (WO2002/046387), 엘류신 인디카 (Eleusine indica) (WO2002/046387), 수수 (WO2002/046387, WO12/021785), 옥수수 (WO12/021785), 코프티스 자포이카 (Coptis japonica) (WO2006/132270), 렘나 (Lemna) (WO2015/022634)와 같은 식물, 또는 쥐나 돼지와 같은 포유동물, 또는 콕씨코이드 (Coccicoides) (GENBANK® COITRP)와 같은 진균의 HPPD 폴리펩티드가 최근 기술 분야에 기재되었다.

HPPD의 억제는 광합성 결합 해제, 보조 집광성 색소들의 결핍을 가져오며, 가장 중요하게는, 카로테노이드에 의해 통상적으로 제공되는 광보호 결여로 인하여 UV 조사 및 활성 산소 종에 의한 클로로필의 파괴 (표백)를 가져온다 (Norris et al. (1995), Plant Cell 7：2139-2149). 광합성적으로 활성인 조직들의 표백은 성장 억제와 식물 사멸을 가져온다.

HPPD를 억제하고, HPP의 HGA로의 전환을 억제하면서 상기 효소에 특이적으로 결합하는 일부 분자 (이후 HPPD 억제 제초제로 칭해짐)는 매우 효과적인 제초제로 입증되었다.

현재, 대부분의 상업적으로 유용한 HPPD 억제 제초제는 후술하는 화학적 패밀리 중 하나에 속한다:

1) 트리케톤, 예를 들어 벤조바이시클론 [즉 3-[2-클로로-4-(메틸술포닐)벤조일]-4-(페닐술파닐)바이시클로[3.2.1]옥트-3-엔-2-온]; 술코트리온 [즉 2-[2-클로로-4-(메틸술포닐)벤조일]-1,3-시클로헥산디온], 메소트리온 [즉 2-[4-(메틸술포닐)-2-니트로벤조일]-1,3-시클로헥산디온] (본원에서 MST로 약칭됨); 템보트리온 [즉 2-[2-클로로-4-(메틸술포닐)-3-[(2,2,2,-트리플루오로에톡시)메틸]벤조일]-1,3-시클로헥산디온]; 테푸릴트리온 [즉 2-[2-클로로-4-(메틸술포닐)-3-[[(테트라히드로-2-푸라닐)메톡시]메틸]벤조일]-1,3-시클로헥산디온]]; 바이시클로피론 [즉 4-히드록시-3-[[2-[(2-메톡시에톡시)메틸]-6-(트리플루오로메틸)-3-피리디닐]카보닐]바이시클로[3.2.1]옥트-3-엔-2-온]; 펜퀴노트리온 [즉 2-[[8-클로로-3,4-디히드로-4-(4-메톡시페닐)-3-옥소-2-퀴녹살리닐]카보닐]-1,3-시클로헥산디온], 및 WO2007088876, WO2009016841, WO2010089993, WO2010116122, WO2012002096, WO201131658, WO2012136703, JP2013040141, WO2013080484, WO2014014904, WO2014031971, US20140106968에 기술된 것;

2) 디케토니트릴, 예를 들어 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-메틸술포닐-4-트리플루오로메틸페닐)-프로판-1,3-디온 및 2-시아노-1-[4-(메틸술포닐)-2-트리플루오로메틸페닐]-3-(1-메틸시클로프로필)프로판-1,3-디온;

3) 이속사졸, 예를 들어 이속사플루톨 [즉 (5-시클로프로필-4-이속사졸릴)[2-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)페닐]메타논]. 식물에서, 이속사플루톨 (본원에서 IFT로 약칭됨)은 DKN (HPPD 억제 특성을 나타내는 디케토니트릴 화합물)로 신속히 대사된다;

4) 히드록시피라졸, 예를 들어 피라족시펜 [즉 2-[[4-(2,4-디클로로벤조일)-1,3-디메틸-1H-피라졸-5-일]옥시]-1-페닐에타논]; 벤조페납 [즉 2-[[4-(2,4-디클로로-3-메틸벤조일)-1,3-디메틸-1H-피라졸-5-일]옥시]-1-(4-메틸페닐)에타논]; 피라졸리네이트 [즉 (2,4-디클로로페닐)[1,3-디메틸-5-[[(4-메틸페닐)술포닐]옥시]-1H-피라졸-4-일]메타논]; 피라술포톨 [즉 (5-히드록시-1,3-디메틸-1H-피라졸-4-일)[2-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)페닐]메타논]; 토프라메존 [즉 [3-(4,5-디히드로-3-이속사졸릴)-2-메틸-4-(메틸술포닐)페닐](5-히드록시-1-메틸-1H-피라졸-4-일)메타논]; 톨피랄레이트 [즉 1-[[1-에틸-4-[3-(2-메톡시에톡시)-2-메틸-4-(메틸술포닐)벤조일]-1H-피라졸-5-일]옥시]에틸 메틸 카보네이트];

5) WO2011035874, 및 WO2012123416, WO2012123409, EP2562174, WO2013064459, WO2013087577, WO2013124238, WO2013124228, WO2013164333, WO2013037342, WO2014053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633에 기술되고, WO2013072300, WO2013072402, WO2013072450, WO2014184014, WO2014184019, WO2014184058, WO2014192936, WO2015052152, WO2015052178에 기술된 바와 같은 N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, 및 WO2012126932, 및 EP2562174, WO2013064459, WO2013087577, WO2013124238, WO2013124228, WO2013124245, WO2013164333, WO2013037342, WO20141053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633에 기술된 바와 같은 N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드; 예를 들어 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐); 2-클로로-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드; 2-클로로-3-(에틸술포닐)-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드;

6) WO2012028579, 및 WO2012123409, WO2013017559, EP2562174, WO2013064459, WO2013064457, WO2013087577, WO2013104705, WO2013124238, WO2013124228, WO2013124245, WO2013164331, WO2013164333, WO2013174843, WO2013037342, WO2014053473, WO2014086737, WO2015007662, WO2015007632, WO2015007633에 기술된 바와 같은 N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드; 예를 들어 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 및 WO2013072528, WO2013076315, WO2013076316, WO2013083859, WO2013092834, WO2013139760, WO2013144231, WO2014126070, WO2014135654, WO2014184015, WO2014184016, WO2014184017, WO2014184073, WO2014184074, WO2014192936, WO2015022284, WO2015052153, WO2015052173에 기술된 바와 같은 것;

7) WO2013050421 및 WO2013083774, WO2014154828, WO2014154882에 기술된 바와 같은 피리다지논 유도체;

8) WO2013054495에 기술된 바와 같은 옥소프라진 유도체;

9) WO2013144234, WO2015007564에 기술된 바와 같은 N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드;

10) WO2014154829에 기술된 바와 같은 트리아지논; 및

11) EP2881387 및 EP2881388에 기술된 바와 같은 피라졸론.

이들 HPPD 억제 제초제는 잔디 및/또는 이들이 신속하게 분해되는 옥수수 (제아 메이스 (Zea mays)), 벼 (오리자 사티바 (Oryza Sativa)) 및 밀 (트리티쿰 아에스티붐 (Triticum aestivum))과 같은 대사 내성 (metabolic tolerance)을 나타내는 농작물 분야에서 광엽 잡초에 대해 사용될 수 있다 (Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133-142). 이들 HPPD 억제 제초제의 사용 범위를 확대하기 위하여, 식물, 특히 대사 내성이 없거나 대사 내성이 부족한 식물에 대해 농경 분야 조건하에서 허용 가능한 내성 수준을 부여하기 위한 몇몇 시도들이 개발되었다.

호모겐티세이트의 우회적인 HPPD-매개 생산 (US6,812,010)의 시도 외에도, 상기 제초제에 대하여 식물 내에서 충분한 양의 표적 효소를 생산하도록 민감한 효소를 과발현시키는 것이 수행되었다 (WO96/38567). HPPD 폴리펩티드의 과발현은 IFT의 디케톤니트릴 유도체 (본원에서 DKN으로 약칭됨)에 대해 보다 우수한 출현전 내성을 가져왔지만, 출현후 처리에 대한 내성을 위해서는 내성 수준이 충분하지 못하였다 (Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61：269-276).

제3의 전략은 HPP의 HGA로의 전환을 촉매화하는 그의 성질을 유지하면서 돌연변이전의 자연 (native) HPPD 폴리펩티드 보다 HPPD 억제제에 덜 민감한 표적 효소를 얻기 위하여 HPPD 폴리펩티드를 돌연변이시키는 것이었다.

이러한 전략은 디케톤니트릴 패밀리에 속하는 두 HPPD 억제 제초제인 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-메틸술포닐-4-트리플루오로메틸페닐)-프로판-1,3-디온 및 2-시아노-1-[4-(메틸술포닐)-2-트리플루오로메틸페닐]-3-(1-메틸시클로프로필) 프로판-1,3-디온 (EP496630)에 대해서 내성이 있는 식물의 생산에 대해 성공적으로 적용되었다 (WO99/24585). Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile 및 보다 상세하게는 Gly336Trp (돌연변이된 아미노산의 위치들이 본 발명의 서열 번호 1에 상응하는 야생형 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) HPPD 폴리펩티드를 참조하여 표시된다)가 이들 디케톤니트릴 제초제로의 처리에 대해 증가된 내성을 담당하는 돌연변이로서 확인되었다.

보다 최근에, 담배 및 대두의 색소체 게놈 내로의 슈도모나스 플루오레센스HPPD 유전자의 도입이 핵변환 보다 효과적인 것으로 나타났고, IFT의 출현후 적용에 대해 내성을 부여하였다 (Dufourmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5(1):118-33).

WO2004/024928에서, 발명자들은 식물의 세포 내에서 이들 식물의 세포 내로 HPP 전구체의 흐름을 증가시킴에 의해 프레닐퀴논 생합성 (예를 들면, 플라스토퀴논, 토코페롤의 합성)을 증가시키는 것을 발견하였다. 이는 상기 전구체의 합성을 프레페네이트 데히드로게나제 (PDH) 효소의 과발현에 의한 "시키메이트 (shikimate)" 경로에 연결시킴으로써 이루어졌다. 이들은 또한 PDH 효소를 인코딩하는 유전자 및 HPPD 효소를 인코딩하는 유전자를 갖는 식물의 형질전환이 HPPD 억제 제초제에 대한 상기 식물의 내성을 증가시키는 것을 가능하게 만드는 점에 대해 주목하였다.

WO2009/144079에, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) HPPD 단백질의 위치 336에서 특이적 돌연변이를 갖는 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)를 인코딩하는 핵산 서열 및 HPPD 억제 제초제에 대해 내성이 있는 식물을 수득하기 위한 이들의 사용이 개시되어 있다.

WO2002/046387에서, 식물로부터 유래되는 HPPD 폴리펩티드의 몇몇 도메인이 다양한 HPPD 억제 제초제에 대해 내성을 부여하는 것과 관련이 있을 수 있다는 것이 확인되었지만, 식물 내에서나 생화학적 데이터는 기재된 도메인 기능으로서의 영향을 확인하지 못하였다.

WO2008/150473에서, 두 상이한 내성 메카니즘 - 돌연변이 HPPD 효소를 코딩하는 변형된 아베나 사티바 (Avena sativa) 유전자 및 CYP450 옥수수 모노옥시게나제 (Maize monooxygenase) (nsf1 유전자) -의 결합이 HPPD 억제 제초제에 대한 향상된 내성을 얻기 위하여 예시되었지만, 양 단백질의 결합에 기초하는 상승적인 효과들을 입증하는 데이터는 개시되지 않았다.

또한, 예를 들면 아베나 사티바 (US2011/0173718) 또는 아라비돕시스 (Arabidopsis) (WO2013/064964, WO2014/177999)로부터 내성이 있는 HPPD를 코딩하는 유전자 뿐만 아니라 HST (호모겐티세이트 솔라네실트랜스페라제) 단백질을 코딩하는 몇몇 식물 유전자와의 조합으로 과발현에 의해 HPPD 억제 제초제에 대해 내성이 있는 식물을 생성하는 방법이 개시되었다. 그러나, 일부 선택된 HPPD 억제 제초제에 대한 내성 수준은 오히려 제한되었다.

WO2011/094199 및 2011/0185444에서, 상기 HPPD 억제 IFT에 대한 수백개의 대두 야생형 주들 (wild type lines)의 내성이 평가되었다. 매우 적은 주들이 상기 제초제에 대해 적절한 수준의 내성을 나타내었다. 상기 내성을 담당하는 추정 QTL (양적 형질 유전자좌)이 확인되었다. 이 게놈 영역에서, 관찰된 HPPD 억제 제초제에 대해 향상된 내성을 담당하는 주요 형질인 것으로 ABC 운반체를 코딩하는 유전자가 확인되었다. 그러나, 상기 확인된 유전자들을 발현시키는 형질전환 식물은 시험된 HPPD 억제 제초제에 대한 내성에서 어떠한 향상도 나타내지 못하였다.

WO 2010/085705 및 US2014/0053295에서, 아베나 사티바 HPPD 폴리펩티드의 몇가지 돌연변이가 개시되었다. WO2010/085705에서는 상기 변이체들의 일부가 트리케톤 "메소트리온"에 대해 시험관내에서 향상된 내성을 나타내었다고 입증되었지만, 매우 적은 돌연변이만이 담배 식물 내에서 발현되었다. 또한, 이들 돌연변이를 발현시키는 담배 식물의 어떤 것도 상기 야생형 아베나 사티바 HPPD 유전자를 발현하는 담배 식물과 비교하여 MST 또는 IFT에 대해 향상된 내성을 나타내지 못하였다. US2014/0053295에서, 수개의 Avena sativa HPPD 돌연변이체가 대두 식물에서 발현되었고, 야생형 Avena sativa HPPD 유전자를 발현하는 식물로부터 공지된 바와 같이 MST에 대해 우수한 내성 수준을 가졌다. 그러나, 템보트리온 또는 IFT와 같은 다른 제초제들은 이들 대두 식물에서 더 많은 잎 피해를 가져왔다.

2012/0042413에는 HPPD 활성을 가질 뿐만 아니라 적어도 하나의 HPPD 억제 제초제에 대해 특정한 비감수성을 나타내는 돌연변이 옥수수 HPPD 폴리펩티드가 기재되어 있고, HPPD 폴리펩티드의 상이한 위치에서 돌연변이의 특정한 세트가 더 제시되어 있으며, 최종적으로는 생화학적 데이터뿐만 아니라 몇몇의 이와 같은 돌연변이된 HPPD들을 포함하는 식물의 내성 수준이 개시되어 있다. EP2453012에, 다수의 HPPD 돌연변이가 기재되었지만, 식물 내에서 이들 다수의 HPPD 억제 제초제에 대한 기재된 돌연변이의 향상된 내성은 입증되지 못하였다.

WO2014/043435에, 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린을 포함하는 아미노산 서열; 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 트립토판; 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 339에 상응하는 아미노산 위치에 트레오닌, 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 또는 서열 번호 1의 아미노산 188 위치에 상응하는 아미노산 위치에 트립토판 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 트립토판; 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에서 글루탐산; 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 트립토판, 서열 번호 1의 아미노산 위치 339에 상응하는 아미노산 위치에 알라닌 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민으로 이루어진 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.) HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 기재되어 있다.

최근에 기재되고 부분적으로 상용화된 HPPD 억제 제초제는 느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제로서 작용한다 (Morrison (1982) Trends Biochem. Sci. 7, 102-105 참조). 이들 억제제는 HPPD 폴리펩티드에 느리게 결합하지만 (즉, 그들은 느린 결합 속도, kon를 갖지만) 비공유 결합하고 (즉, 그들은 시간-의존적 억제를 생성하고), 그들의 효소와의 매우 단단한 상호작용으로 인해 매우 느리게 방출된다 (즉, 그들은 예외적으로 느린 해리 속도, koff를 갖는다).

이들 억제제는 단단히 결합하여 효소와의 화학량론적 적정이 가능하다.

느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제는 매우 강력한 HPPD-억제제일 뿐만 아니라, 이들을 잡초 방제에 매력적인 농약으로 만드는 특성을 갖고 있다는 것이 점점더 많이 인식되고 있다. 느린 해리 속도는 식물 세포 내에 유리 억제제 분자의 부재하에도 이러한 억제 수준을 장기간 동안 유지하고 활성을 완전히 억제하는데 이상적으로 HPPD 폴리펩티드 활성 자리 당 단 하나의 억제제 분자만으로도 충분할 정도로 억제제 효과를 향상시킨다. 이것은 작물 성장 지역에서 원치 않는 잡초를 방제하는 데에 이들 억제제의 낮은 적용률로 해석된다.

느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제의 특성은 HPPD 억제 및 제초 활성을 달성하는 것이 목표일 때 유리하다. 그러나, 이들 특성은 이들 억제제에 내성인 HPPD 폴리펩티드를 개발할 경우에는 매우 불리하다. 억제제의 결합 및 HPPD 폴리펩티드의 억제가 여전히 일어날 수 있고, 따라서 달성된 억제 수준이 심지어 식물 세포 내에 유리 억제제의 부재하에도 장기간 동안 유지될 것이므로, 단독으로 효소에 대한 억제제의 친화도 (ki)를 감소시키는 HPPD 폴리펩티드에서의 돌연변이는 HPPD 억제를 완전히 극복하지 못한다.

또한, 부분적으로 상업적으로 이용 가능한 HPPD 억제 제초제는 트리케톤, 디케토니트릴, 이속사졸, 히드록시피라졸, N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드, N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일), 트리아지논, 및 피라졸론과 같은 구조적으로 다양한 화학적 부류에 속한다. 현재 기술된 최신 기술의 HPPD 폴리펩티드는 구조적으로 다양한 HPPD 억제 제초제에 대해 비교적 좁은 허용 범위를 나타낸다.

현재 기재된 모든, 그리고 부분적으로 상용화된 HPPD 억제 제초제의 전술한 동역학적 특성으로 인해, HPPD 억제 제초제에 대해 완전한 내성을 갖는 HPPD 억제 제초제 내성 식물은 이들을 생성하려는 많은 노력에도 불구하고 현재까지 공개된 적이 없다.

본 발명에, 다양한 화학적 부류에 속하는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 대해 완전한 내성을 보이는 HPPD 폴리펩티드 및 이를 함유하는 식물이 기재된다. HPPD 억제 제초제에 대해 최대 광범위 내성을 갖는 그러한 HPPD 폴리펩티드를 생성하기 위해서는, 각각의 HPPD 억제 제초제(들)에 관해 HPPD 폴리펩티드에 대한 친화성 (ki)를 감소시키는 동시에, 고수준의 억제 내성을 달성하기 위해 야생형 및 다수의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드로부터 공지된 바와 같은 느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제의 해리 속도 (koff)를 확보하는 것이 중요한 것으로 밝혀졌다.

본 발명에서, 이 목적은 HPPD 억제 제초제에 대해 친화성을 갖지 않거나 오직 유의하게 감소된 친화성을 갖고 동시에, HPPD 억제 제초제가 더이상 느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제로서 작용하지 않고 대신 완전히 가역적인 억제제로 될 정도로 효소의 HPPD 억제 제초제의 해리 속도가 증가된 한 세트의 HPPD 폴리펩티드를 개발함으로써 달성되었다. 본 발명에서 앞서 언급된 특징 (즉, HPPD 억제 제초제에 대해 친화성을 갖지 않거나 오직 유의하게 감소된 친화성, 효소의 HPPD 억제 제초제의 증가된 해리 속도; HPPD 억제 제초제가 더이상 느린-결합 또는 느린 밀접-결합 억제제로서 작용하지 않으나 완전히 가역적인 억제제로 됨)을 갖는 HPPD 폴리펩티드를 얻기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물은 HPPD 폴리펩티드 및 그러한 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 재조합 또는 키메라 핵산 분자, 그 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 포함한다. 조성물은 또한 그 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 미생물 및 식물을 포함하는 유기체에서 형질전환 및 발현을 위한 DNA 구축물 또는 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 미생물 또는 식물을 포함하나 그에 제한되지 않는 유기체에서의 발현을 위해 설계된 합성 서열일 수 있다.

조성물은 서열 번호 3-108 중 임의의 것에 제시된 HPPD 폴리펩티드 뿐만 아니라 그의 단편을 포함하여, (a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, (b) 서열 번호 1의 아미노산 서열 336에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 서열 337에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 및 임의로, 서열 번호 1의 아미노산 위치 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 갖는 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제초제 내성 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

조성물은 또한 본 발명의 핵산 서열을 식물, 식물 세포, 조직, 및 종자의 게놈 내로 도입하여 HPPD 억제 제초제에 대해 내성으로 된 형질전환된 식물, 식물 세포, 조직, 및 종자를 포함한다. 서열 도입은 식물에 적용되는 HPPD 억제 제초제가 HPPD 억제제 민감성 잡초 또는 기타 형질전환되지 않은 식물은 선택적으로 죽이지만, 형질전환된 유기체는 죽이지 않도록 한다. 서열은 부가적으로 하나 이상의 HPPD 억제 제초제의 존재하에 성장하는 식물 세포의 선택을 위한 마커로서 사용될 수 있다.

HPPD 억제 제초제 내성 활성을 갖는 HPPD 폴리펩티드의 식별 방법이 부가적으로 제공된다.

본 발명의 조성물 및 방법은 HPPD 억제 제초제에 대해 향상된 내성을 갖는 유기체의 생산에 유용하다. 이들 유기체 및 유기체를 포함하는 조성물은 농업 목적에 바람직하다. 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 또는 종자는 필드 (field)에서 성장되고 수확되어 식물 제품이 수득될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 제품 또는 유기체에서 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드 또는 핵산의 존재를 검출하는데 유용하다.

도 1은 예시적인 HPPD 폴리펩티드의 효소 활성을 결정하기 위해 본 발명에서 사용된 커플링된 HPPD 활성 분석의 단순화된 도식을 나타낸다.
도 2는 커플링된 HPPD 활성 분석에 있어서 실시예 3에 따라 200 μM의 HPP 및 0, 4 또는 13 μM의 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)로 관찰된 야생형 및 녹아웃 HPPD 폴리펩티드의 원 추출물 샘플에서 320 nm에서의 흡광도 (Abs320)의 예시적인 동태 변화를 나타낸다. 녹아웃 HPPD 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 위치 162에 상응하는 아미노산 위치에서 히스티딘을 알라닌으로 교환시켜 수득하였다. 이 위치는 HPPD 폴리펩티드의 활성 부위에서 철 원자의 배위 결합에 관여하기 때문에 그 중요성이 잘 알려져 있다 (Serre et al. (1999), Structure, 7, 977-988).
도 3은 커플링된 HPPD 활성 분석에 있어서 높은 기질 농도와 0, 48, 240 또는 1200 μM Cmpd. 2 (2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)로 관찰된 실시예 3에 따른 서열 번호 17에 상응하는 정제된 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 320 nm에서의 흡광도 (Abs320)의 예시적인 동태 변화를 나타낸다. 겉보기 반응 속도 상수 (k_app)는 박스화된 기간에서 경시적인 신호 변화 (delta_Abs320/min)로 결정되었다.
도 4는 경쟁적 억제 모델에 따른 피팅에 의해 상이한 억제제 및 기질 (HPP) 농도와 서열 번호 17에 상응하는 정제된 돌연변이 HPPD 폴리펩티드로 예시적인 ki를 결정한 것으로부터의 데이터를 도시한다:
a) 실시예 3에 따른, 주어진 기질 농도에서 0 - 0.0012 M의 Cmpd. 2의 존재하에 320 nm에서의 흡광도의 경시적 동태 변화 (delta_Abs320/min);
b) 실시예 3에 따른, 주어진 기질 농도에서 0 - 0.0012 M의 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)의 존재하에 320 nm에서의 흡광도의 경시적 동태 변화 (delta_Abs320/min);
c) 실시예 3에 따른, 주어진 기질 농도에서 0 - 0.0012 M의 MST의 존재하에 320 nm에서의 흡광도의 경시적 동태 변화 (delta_Abs320/min);
d) 실시예 3에 따른, 주어진 기질 농도에서 0 - 0.0012 M의 DKN의 존재하에 320 nm에서의 흡광도의 경시적 동태 변화 (delta_Abs320/min).
예를 들어 도 3 및 4에 서열 번호 17로 나타낸 바와 같이 표 2, 3, 4 및 5에 요약된 모든 예시적인 HPPD 폴리펩티드를 측정하고 분석하였다.

발명의 상세한 설명

이하, 본 발명을 본 발명의 모든 구체예들이 아니라 일부가 도시되는 첨부 도면들을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 실제로, 본 발명은 많은 다양한 형태들로 구현될 수 있으며, 본원에 제시되는 구체예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 이 구체예들은 본 발명이 적용가능한 법적 요구 사항들을 충족시키도록 제공된다. 도면들에서 동일한 요소들은 동일한 참조 부호들로 나타낸다.

당 업자라면 본 발명과 관련된 상세한 설명 및 관련된 도면들에 제시되는 교시들의 이점을 가지고 본원에 제시되는 발명의 많은 변형 및 다른 구체예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구체예들에 한정되는 것이 아니며, 변경들과 다른 구체예들도 첨부된 특허청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도되는 점이 이해될 것이다. 비록 여기서 특정 용어들이 사용되지만, 이들은 한정의 목적을 위해서가 아니라 일반적이고 서술적인 의미로만 사용된다.

개요

식물에 광범위 HPPD 억제 제초제에 대해 농경적으로 허용 가능한 수준의 내성을 부여하기 위하여, 호모겐티세이트의 우회적인 HPPD-매개 생산 (US6,812,010), 제초제에 대해 식물 내에서 충분한 양의 표적 효소를 생산하도록 민감한 효소의 과발현 (WO96/38567) 및 호모겐티세이트로의 HPP의 형질전환을 촉매화하는 성질들을 유지하면서 돌연변이 전의 자연 HPPD 보다 HPPD 억제제에 대해 덜 민감한 표적 효소를 수득하기 위해 HPPD를 돌연변이시키는 것을 포함하는 몇몇 노력들이 행해졌다.

전술한 다수의 HPPD 억제 제초제에 대해 내성을 나타내는 식물의 개발을 위해 얻어진 이들 성공에도 불구하고, 새롭거나 다양한 화학적 부류에 속하는 다수의 상이한 HPPD 억제 제초제, 특히 트리케톤 (예를 들어 벤조바이시클론, 술코트리온 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (예를 들어 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (예를 들어 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (예를 들어 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (예를 들어 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드), 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드); 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, 트리케톤, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론의 부류에 속하는 HPPD 억제 제초제에 대한 식물의 내성을 발생시키고/시키거나 향상시키는 것이 여전히 필요하다.

따라서, 본 발명은 HPPD 억제 제초제 내성을 조절하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. HPPD 억제 제초제, 예컨대 트리케톤 (예를 들어 벤조바이시클론, 술코트리온 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (예를 들어 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (예를 들어 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (예를 들어 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (예를 들어 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류 등의 것은 광범위 스펙트럼의 경제적으로 중요한 단자엽 및 쌍자엽 일년생 유해 식물에 대하여 뛰어난 제초 활성을 가진다. 상기 활성 물질은 또한 뿌리줄기, 우드 스탁 (wood stock) 또는 다른 다년생 기관들로부터 새싹을 생성하며 방제가 어려운 다년생 유해 식물에 대해 효과적으로 작용한다. 본 발명의 의미 내에서, "제초제"는 그 자체로 제초 활성 물질 또는, 예를 들어, 그의 활성을 증가시키는 제제 (상승제) 또는 그의 활성을 제한하는 제제 (완화제)와 같이 그 효능을 변경시키는 첨가제와 조합되는 물질로서 이해된다. 제초제는 약제 기술에서 통상적으로 채택되는 고체 또는 액체 보조제 또는 담체 (예를 들면, 천연 또는 재생 미네랄 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 유화제, 성장 촉진제 및 유사한 것들) 뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 제초제 및/또는 하나 이상의 농약 (예를 들면, 살충제, 살바이러스제, 살미생물제, 항원충제, 농약, 살진균제, 살박테리아제, 살선충제, 살연체동물제 등)을 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 본 발명의 HPPD 억제 제초제 내성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 유기체를 형질전환시키거나, 그렇지 않으면 이들을 포함하지 않는 유기체 내에 이러한 HPPD 억제 제초제 내성 유전자를 도입하는 단계 (예를 들면, 교배 (mating), 세포 융합 또는 도입된 본 발명의 HPPD 억제 유전자를 포함하는 유기체를 이를 포함하지 않는 유기체와 교차시키고 (crossing), 이와 같은 유전자를 포함하는 자손을 수득함에 의해)를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은, HPPD 억제 제초제에 대해 증가된 내성, 특히 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 또는 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 또는 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론의 HPPD 억제 제초제에 대해 증가된 내성을 나타내는 식물을 생성하는데 유용하다.

본 발명의 HPPD 억제 제초제 내성 유전자의 발현은 또한 "쿠마론-유도 제초제" (WO2009/090401, WO2009/090402, WO2008/071918, WO2008/009908에 기재된)에 대해 내성을 나타낼 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 HPPD 억제 제초제 내성 유전자의 어느 하나가 또한 식물 내에 발현될 수 있는데, 이것은 또한 HST 억제 제초제에 대해 내성이 있는 식물을 얻기 위해 WO2011/145015, WO2013/064987, WO2013/064964 또는 WO2010/029311에 기재된 바와 같이 키메라 호모겐티세이트 솔라네실트랜스페라제 (HST) 유전자 또는 돌연변이 HST 유전자를 발현할 수 있다. 본원에 사용되는 "쿠마론-유도 제초제" 또는 "HST 억제 제초제"는 IUPAC 명명법 하에 5H-티오피라노[4,3-b]피리딘-8-올, 5H-티오피라노[3,4-b]피리딘-8-올, 옥사티이노 [5,6-b]피리딘-4-올 및 옥사티이노[5,6-b]피리딘-4-올에 해당되는 화합물들을 포괄한다.

따라서, 본 발명의 "HPPD 억제 제초제 내성"이라는 것은 단백질을 발현시키지 않는 이와 같은 세포 또는 유기체 보다 높은 HPPD 억제 제초제의 농도에 견디거나, 상기 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 유기체 보다 긴 시간 동안 HPPD 억제 제초제의 특정 농도에 견디는 능력을 세포 또는 유기체에 부여하거나, 이러한 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 유기체로 관찰되는 것보더 피해나 성장 억제를 줄이면서 광합성, 성장 및/또는 재생을 수행하는 능력을 부여하는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 의도한다.

"HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드"는 세포 또는 유기체에 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 유기체 보다 높은 HPPD 억제 제초제의 농도에 견디거나, 상기 단백질을 발현하지 않는 이러한 세포 또는 유기체 보다 긴 시간 동안 HPPD 억제 제초제의 특정 농도에 견디는 능력을 부여하거나, 이러한 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 유기체로 관찰되는 것보더 피해나 성장 억제를 줄이면서 광합성, 성장 및/또는 재생을 수행하는 능력을 부여하는 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "폴리펩티드"는 효소, 항체 및 중간 길이 폴리펩티드 및 10 미만의 아미노산 서열 길이까지의 짧은 펩티드와 같은 단백질을 포함한다.

용어 "효소"는 본 발명에서 파라-히드록시페닐피루베이트가 호모겐티세이트로 형질전환되는 반응을 촉매화하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 이것은 자연 발생 효소뿐만 아니라 효소 변이체 및 그의 유도체를 포함한다. 그것은 또한 그러한 효소의 임의의 단편 및 삽입, 결실, 재조합 및/또는 임의의 다른 방법에 의해 조작되어 자연 발생 효소 또는 효소 변이체와 그들의 아미노산 서열이 상이한 효소를 유도하는 변이체를 포함한다. 또한 이것은 글리코실화, 감마 카복실화 및 아세틸화와 같은 번역 후 및/또는 화학적 변형을 갖는 단백질 분자, 전술한 단백질 중 하나를 포함하는 임의의 분자 복합체 또는 융합 단백질을 포함한다.

용어 "폴리펩티드 변이체" 또는 "돌연변이 폴리펩티드"는 돌연변이 유발, 바람직하게는 부위-지정 또는 무작위 돌연변이 유발에 의해 수득된 것으로 각각의 야생형 서열과 비교하여 변형된 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩티드 분자를 의미한다. "내성이 있다", "내성" 또는 "내성적"은 특정한 HPPD 억제 제초제 적용에서 생존하거나, 처리되지 않은 세포 또는 유기체와 쉽게 식별할 수 없는 방식으로 광합성, 단백질 합성 또는 호흡 및 재생과 같은 필수적인 세포 기능을 수행하는 능력, 또는 이와 같은 제초제로 처리되지 않은 (그러나, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 WO2011/100302에 기재된 방법과 같이 HPPD 억제 제초제 적용 이외의 메카니즘에 의해 잡초가 제거되었거나 방지된 경우) 식물과 비교하여 HPPD 억제 제초제로 처리된 식물에 대해 수율에서 상당하지 않은 차이 또는 심지어는 개선된 수율을 가지는 능력을 의도하는 것이다.

세포에 HPPD 억제 제초제 내성을 부여하는 것 이외에, 본 발명의 HPPD 핵산 서열은 HPPD 활성을 갖는, 즉 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)가 호모겐티세이트로 전환되는 반응을 촉매화하는 폴리펩티드를 인코딩한다. HPPD 폴리펩티드의 촉매 활성은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법으로 정의될 수 있다. WO2009/144079에는 다양한 적절한 스크리닝 방법이 기재되어 있다.

HPPD 폴리펩티드의 효소 활성은 HPP 또는 O₂기질 양의 감소를 측정하거나, 효소 반응으로부터 유래되는 임의의 산물, 즉 호모겐티세이트 또는 CO₂의 축적을 측정하는 것을 가능하게 하는 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특히, HPPD 활성은 본원에 참고로 포함되는 WO2009/144079; Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769; Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516; 또는 WO2012/021785에 기재된 방법으로 측정될 수 있다.

본 발명의 목적상, "참조 (reference)" HPPD 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 HPPD 유전자)은 본 발명의 HPPD 폴리펩티드 또는 HPPD 핵산과 비교되는 임의의 HPPD 폴리펩티드 또는 핵산이다. 본 발명의 HPPD 폴리펩티드를 설명하려는 목적으로, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 호환되게 사용된다. 이러한 참조 HPPD 폴리펩티드는 자연의 식물, 박테리아 또는 동물 HPPD일 수 있거나, 당업계에 알려진 돌연변이된 HPPD 폴리펩티드, 예컨대 국제 특허 공보 WO2009/144079에 기재된 PfP215L 및 PfG336F 돌연변이일 수 있거나, 또는 WO2014/1043435에 기재된 PfHPPDevo33, PfHPPDevo36, PfHPPDevo37, PfHPPDevo40, 또는 PfHPPDevo41 단백질일 수 있고; PfHPPDevo41은 본원에서 서열 번호 2로서 제시된다. 이와 같은 참조 HPPD는 본 발명의 HPPD 폴리펩티드 또는 핵산이 관심의 대상인 특정한 성질 (예를 들면, 향상되거나, 비슷하거나, 감소된 HPPD 억제 제초제 내성 또는 HPPD 폴리펩티드 효소 활성; 향상되거나, 비슷하거나, 감소된 숙주 세포 내의 발현; 향상되거나, 비슷하거나, 감소된 단백질 안정성 및 유사한 것들)을 가지는지를 결정하는데 사용될 수 있다.

본원의 다양한 구체예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드 (그의 단리, 재조합 및 키메라 유전자, 핵산을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물, 식물 부분, 및 종자, 핵산에 의해 인코딩되는 HPPD 폴리펩티드 및 그의 조성물뿐만 아니라 HPPD 억제 제초제에 대한 식물의 내성을 증가시키기 위한, 특히 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드), 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류)의 HPPD 억제 제초제에 대한 식물의 내성을 증가시키기 위한 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 사용 방법을 포함)는 임의의 서열 번호 3-108에 기재된 HPPD 단백질을 포함해, (a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에서 프롤린, (b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에서 히스티딘 또는 아스파르트산, 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 아미노산 위치에서 세린, 및 임의로, 서열 번호 1의 아미노산 위치 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 가진다. "에 상응하는"이란 2개 (또는 더 많은) 서열이 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 정렬될 때 서열 번호 1에서의 위치에 상대적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 의미한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 용어 "위치"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열에서 특정 단일 염기 또는 아미노산을 각각 의미한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 용어 "부위"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열에서 특정 위치 또는 영역을 각각 의미한다. 용어 "폴리뉴클레오티이드"는 조절 요소, 구조 유전자, 유전자 군, 플라스미드, 전체 게놈 및 그의 단편을 포함한, 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 임의의 길이 및 임의의 서열의 임의의 유전 물질에 상응한다.

일 구체예에서, 본 발명의 HPPD 폴리펩티드 (그를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 재조합 및 키메라 유전자, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물, 식물 부분, 및 종자를 포함함)는

(a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린,

(b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및

(c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 아미노산 위치에 세린,

을 포함하는 아미노산으로 이루어지며,

상기 HPPD 폴리펩티드는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 내성이 있다.

또 다른 구체예에서, 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 내성인 본 발명의 HPPD 폴리펩티드 (그를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 재조합 및 키메라 유전자, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물, 식물 부분, 및 종자를 포함함)는

을 포함하며,

추가로

i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 204에 상응하는 아미노산 위치에 메티오닌, 트레오닌, 세린 또는 류신; 및/또는

ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신 또는 류신; 및/또는

iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 라이신, 글루타민 또는 류신; 및/또는

iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는

v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 류신, 글루탐산, 프롤린 또는 세린; 및/또는

vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 310에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 히스티딘 또는 라이신; 및/또는

vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 메티오닌 또는 히스티딘; 및/또는

viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘, 알라닌, 페닐알라닌, 발린 또는 글리신; 및/또는

ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 331에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 히스티딘, 세린, 이소류신 또는 류신; 및/또는

x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는

xi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 339에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산, 아르기닌, 알라닌 또는 트레오닌; 및/또는

xii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글루타민, 메티오닌, 글루탐산, 글리신, 류신 또는 발린; 및/또는

xiii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민, 프롤린 또는 아르기닌; 및/또는

xiv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 아르기닌, 메티오닌, 알라닌 또는 발린;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

을 포함하며,

추가로

i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 류신 또는 라이신; 및/또는

ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 류신; 및/또는

iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는

iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산 또는 세린; 및/또는

v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 메티오닌; 및/또는

vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘; 및/또는

vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및 /또는

viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 또는 발린; 및/또는

ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 및/또는

x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 발린, 또는 메티오닌;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

을 포함하며,

추가로

i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신; 및/또는

iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신 또는 아르기닌; 및/또는

iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산; 및/또는

v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌; 및/또는

vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는

viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 발린; 및/또는

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

을 포함하며,

추가로

(i) 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신 또는 아르기닌,

(ii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산,

(iii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및

(iv) 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 발린;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

을 포함하며,

추가로

(i) 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신,

(ii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신,

(iii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산,

(iv) 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및

(v) 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 발린;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

을 포함하며,

추가로

(ii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 류신,

(iii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신,

(iv) 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산,

(v) 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린 또는 아르기닌;

(vi) 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민, 및

(vii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 메티오닌;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

(b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및

(c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 위치에 세린,

을 포함하며,

추가로

(i) 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 류신,

(ii) 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌,

(iv) 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌,

(v) 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린;

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

a. 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 및

b. 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘, 또는

c. 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 아스파르트산, 및

서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 아미노산 위치에 세린,

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

a. 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린;

b. 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 아스파르트산;

c. 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 아미노산 위치에 세린; 및

d. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘,

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

b. 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘, 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 아미노산 위치에 아스파르트산;

d. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린,

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

a. 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린

d. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 발린,

을 포함하는 아미노산으로 이루어진다.

표 1은 3개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드 변이체인 경우, 참조 야생형 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) HPPD 폴리펩티드 (서열 번호 1)와 비교하여 각각의 아미노산 위치를 요약한다. 달리 명시적으로 언급되지 않으면 관련 아미노산 위치에서의 교환은 언제나 서열 번호 1에 상응하는 참조 야생형 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) HPPD 폴리펩티드에 대한 것이다.

서열 번호 1에 상응하는 HPPD 폴리펩티드에 대한 예시적인 아미노산 교환의 개괄

서열 번호 1에 대한 아미노산 위치	예시적인 아미노산 교환
204	M, T, S, L
213	L, K
264	R, K, Q, L
268	G, S, R
270	R, L, E, P, S
310	S, H, K
315	R, M, H
330	H, A, F, V, G
331	I, H, P, S, L
335	P
336	D, H
337	S
338	V
339	E, R, A, T
340	G, R, E, V, Q, M, L
344	Q, P, R
345	V, K, M, R, A

아미노산은 본원에서 아미노산 명칭, 3 문자 약어 또는 1 문자 약어를 사용하여 언급된다. 아래에 표준 아미노산 목록을 약어와 함께 제공한다.

알라닌 A Ala

시스테인 C Cys

아스파르트산 D Asp

글루탐산 E Glu

페닐알라닌 F Phe

글리신 G Gly

히스티딘 H His

이소류신 I Ile

라이신 K Lys

류신 L Leu

메티오닌 M Met

아스파라긴 N Asn

프롤린 P Pro

글루타민 Q Gln

아르기닌 R Arg

세린 S Ser

트레오닌 T Thr

발린 V Val

트립토판 W Trp

티로신 Y Tyr

시스테인 C Cys

당업자에게는 유전 코드가 축퇴되어 복수 코돈 트리플렛이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 본원에서 제공된 아미노산 서열은 동일한 아미노산 서열을 인코딩하기 위해 상이한 코돈을 사용하는 대체 서열에 의해 생성될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드는 본원에서 서열 번호 1 로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 53%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.

본 발명에 따라 변형될 수 있는 예시적인 HPPD 서열은, 박테리아, 특히 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.) 타입, 더욱 특히는 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni) (Comamonas testosteroni) 유래 서열을 포함한다.

본 발명의 목적상, 본 발명의 HPPD 폴리펩티드는 또한 추가의 변형을 포함할 수 있으며, 이 경우에 예를 들어, 일부 아미노산 (예를 들어, 1 내지 17개의 아미노산)이 클로닝 목적을 위해 치환, 첨가 또는 결실되어, HPPD 활성, 즉 파라-히드록시페닐피루베이트를 호모겐티세이트로 전환시키는 것을 촉매화하는 특성을 보유하는 수송 펩티드 융합 등을 만들거나, 또는 추가 개선될 수 있는 임의의 HPPD 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형에 의해 추가 개선될 수 있는 HPPD 폴리펩티드는 본원에서 서열 번호 3-108 중 임의의 것으로서 제시된 슈도모나스 플루오레센스로부터 유래된 변이체 HPPD일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 내성인 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드는 본 발명에 따라 치환된 아미노산 외에는 서열 번호 1 (Pseudomonas fluorescens)과 동일하며, 즉,

각각의 HPPD 폴리펩티드는 서열 번호 1과 동일하되,

(a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 프롤린,

(b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및

(c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 세린,

을 가진다.

다른 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 내성인 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드는 본 발명에 따라 치환된 아미노산 외에는 서열 번호 1 (Pseudomonas fluorescens)과 동일하며, 즉, 각각의 HPPD 폴리펩티드는 서열 번호 1과 동일하지만, 상기 표 1에 따라 각각의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 교환을 갖되, 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 프롤린이 존재하고, 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 히스티딘 또는 아스파르트산이 존재하며, 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 세린이 존재한다.

다른 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 HPPD 억제 제초제에 내성인 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드는 본 발명에 따라 치환된 아미노산 외에는 서열 번호 1 (Pseudomonas fluorescens)과 동일하며, 즉, 각각의 HPPD 폴리펩티드는 서열 번호 1과 동일하지만, 서열 번호 7에서 19까지, 그리고 서열 번호 21에서 108까지의 라인에서 표 2 (아래)에 정의된 바와 같은 각각의 아미노산 위치(들)에서 아미노산 교환을 갖는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 (그의 단리, 재조합 및 키메라 유전자, 핵산 서열을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물, 식물 부분, 및 종자, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 및 조성물뿐만 아니라 HPPD 억제 제초제에 대한 식물의 내성을 증가시키기 위한, 특히 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨) 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제에 대한 내성을 증가시키기 위한 핵산 서열의 사용 방법을 포함)은 서열 번호 3-108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 및 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드를 인코딩하는 그의 단편 및 변이체를 인코딩한다.

A. HPPD 억제제 내성의 측정 방법

HPPD 폴리펩티드 억제 제초제에 대한 내성을 측정하기 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명의 HPPD 서열을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 내성은 특정한 HPPD 억제 제초제 적용에서 생존하는 세포 또는 유기체의 능력, 또는 처리되지 않은 세포 또는 유기체와 쉽게 구별될 수 없는 방식으로 광합성, 단백질 합성 또는 호흡 및 재생과 같은 필수적인 세포 기능을 수행하는 능력, 또는 이와 같은 제초제로 처리되지 않은 이러한 식물과 비교하여 수율에서 상당한 차이가 없거나 심지어는 HPPD 억제 제초제로 처리된 식물에 대한 향상된 수율을 갖는 능력 (그러나 잡초가 상기 HPPD 억제 제초제 적용 이외의 메카니즘에 의해 제거되었거나 방지된 경우)을 모니터링함에 의해 측정될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 내성은 각각의 HPPD 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산으로 변형된 세포 또는 유기체의 가시적인 지표 표현형 (visible indicator phenotype)에 따라서, 또는 상이한 농도의 다양한 HPPD 억제 제초제의 존재에서 HPPD 폴리펩티드의 시험관내 분석에서 측정될 수 있다. 용량 응답 (dose responses) 및 이러한 지표 표현형 (갈색 형성, 성장 억제, 표백, 제초 효과 등)과 연관된 용량 응답에서 상대적 편이 (relative shifts)는 제초제의 상이한 농도 범위에서 식물 피해, 분열 조직의 표백 징후 등에 기초하는 통상적인 방식으로, 예를 들면, GR50 (성장의 50%의 감소를 위한 농도) 또는 발현된 HPPD 폴리펩티드의 고유 내성 증가에 상응하는 값인 MIC (최소 억제 농도) 값으로 적절히 표현된다. 이들 데이터는, 예를 들어, x-축 상에 표시된 "용량 (dose)" 및 y-축 상에 표시된 "사멸율 (percentage kill)", "제초 효과", "출현한 녹색 식물 수" 등을 갖는 용량/반응 곡선로부터 유래되는 GR50 값으로 표현될 수 있으며, 여기서 증가된 GR50 값은 발현된 HPPD의 고유 내성의 증가된 수준에 상응한다. 제초제는 출현 전 또는 출현 후에 적절하게 적용될 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 유전자의 내성 수준, 또는 본 발명의 HPPD 폴리펩티드는 담배와 같은 테스트 식물 혹은 대두, 옥수수 또는 목화와 같은 농작물의 유전자도입, 재생, 번식 및 스프레이 테스트를 통해 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝에 의해 수득된 결과에 따라서, 상기 식물은 본 발명의 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 동일한 프로모터의 조절하에, HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 어떤 외인성 유전자도 함유하지 않는 식물, 또는 참조 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA, 예를 들면, 슈도모나스 플루오레센스 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함하는 유전자를 함유하는 식물 보다 HPPD 억제 제초제 (예를 들어, 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제)에 대해 보다 나은 내성, 바람직하게는 필드의 적용을 위해 권고되는 통상적인 용량의 적어도 2배의 내성, 심지어 보다 바람직하게는 필드의 적용을 위해 권고되는 통상적인 용량의 적어도 4배까지의 내성이 있다. 이에 따라, "HPPD에 작용하는 적어도 하나의 제초제에 대한 식물의 내성을 증가시킬 수 있는"이라는 용어는 그의 내생적 HPPD 만을 발현하는 식물 또는 참조 HPPD 폴리펩티드를 발현하는 식물과 비교하여 HPPD 억제 제초제의 통상적인 필드 용량에서 본 발명의 HPPD를 적어도 1x, 2x 또는 3x 또는 4x 또는 그 이상으로 발현하는 식물에 의한 내성을 나타낸다. 이러한 관점에서, "HPPD에 작용하는 제초제"라는 용어는 제초제로 알려지고/거나 사용되는 물질에 한정되는 것은 아니며, HPPD 폴리펩티드의 촉매 활성을 억제하는 임의의 물질을 언급한다.

"제초제 내성", "억제제 내성" 또는 "억제제 비감수성"이라는 용어는 또한 억제제/제초제의 존재하에 또는 억제제/제초제의 노출 후에 각각의 촉매 반응을 수행하는 효소의 능력을 의미하기도 한다. 효소의 제초제 내성, 즉 제초제의 억제 효과에 저항하는 그의 능력은 정성적 및 정량적으로 표현될 수 있다. 정성적으로, 상이한 실체 또는 심지어는 다른 부류의 억제제를 견디는 효소는 높은 내성을 가지며 반대의 경우도 마찬가지이다. 정량적인 용어로, 하나의 제초제와 비교한 효소의 내성은 하나의 제초제의 부재 및 존재하에 활성의 비율 (k_app, 반응 속도 측정) 또는 총 기질 교체율 (시그널 변화, 종점 측정)로 계산된 이 효소의 한 샘플에서 관찰된 각각의 "잔류 활성" 또는 "잔류 교체율"로서 표현될 수 있다 (Bergmeyer, H.U.: "Methods of enzymatic analysis", 1974). 다양한 구체예에서, HPP로부터 HPPD에 의해 형성된 호모겐티세이트 (HGA)가 모든 분석에서 과량으로 균일하게 적용된 제2 효소 호모겐티세이트 디옥시게나제 (HGD)에 의해 흡수 분자 말레일아세토아세테이트 (MAA)로 직접 변환된다는 점에서, 잔류 활성의 결정을 위해, 측정된 기질 전환의 겉보기 반응 속도 상수 (k_app)는 커플링 분석에서 320 nm에서의 흡광도의 동태 변화로서 측정될 수 있다. 효소 활성의 k_cat/k_M 비는 겉보기 반응 속도 상수 k_app에 비례하며 k_cat/k_M *[E] ([E] = 효소 농도)에 비례한다. 경쟁적 억제제는 k_M의 명백한 증가를 나타내며 따라서 비포화 기질 농도에서 k_app의 역 감소를 나타낸다. 억제제의 존재 및 부재하에서의 k_app 측정은 미정제 또는 정제된 동일 효소 샘플, 따라서 동일 효소 농도를 사용하여 수행되었으므로 효소 농도는 잔류 활성의 계산으로부터 배제되고, 양 k_app의 비율은 직접적으로 억제에 의한 k_M 변화를 나타낸다. 주목할 만하게, 이 개념은 "경쟁적 억제" 방식으로 상호작용하는 효소/억제제 쌍에 적용되며, 아마도 기술된 거의 모든 폴리펩티드 변이체 및 억제제에 맞을 것이다. 각각의 억제제 및 효소에 대한 억제 상수 ki는 이 효소에 대한 억제제의 결합 강도를 기술한다. 증가한 내성이 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 또는 그 이상의 비에 대해 주어지고, 임의의 각 HPPD 억제 제초제의 존재 또는 부재하에 참조 HPPD 서열과 비교된다.

비록 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 HPPD 폴리펩티드 서열을 평가하는데 사용될 수 있는 분석의 특정 유형은 비색 분석 (설명은 예를 들어 US 6,768,044 참조)이다. 이 분석에서는, 예를 들어, 벡터 pSE420-HPPDx (HPPDx는 추정 HPPD 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자를 의미하고, 기본 벡터 "pSE420"은 Invitrogen Karlsruhe, Germany로부터 수득됨) 또는 변형된 버전의 pSE420 (pSE420(RI)NX)-HPPDx는 과발현된 HPPD 폴리펩티드가 활성일 때 티로신 대사로부터 가용성 멜라닌 유사 색소를 생성한다. 이러한 멜라닌 유사 색소는 액체 배지에서, 또는 LB-브로스 유형 고체 한천에 대장균 배양액을 적용하여 검정한다. 20-30 ℃에서 16 시간 내지 8 일 후, 공 벡터 pSE420을 함유한 대장균 배양액로 접종된 배양 배지 또는 한천 웰은 배지 색을 변경시키지 않거나, 또는 불활성 HPPD를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터 pSE420-HPPDx를 함유하는 대장균 배양액로 시딩된 것도 배지 색을 변경시키지 않는 반면, 활성 HPPD를 코딩하는 벡터 pSE420-HPPDx를 함유하는 대장균 배양액로 접종된 웰은 갈색을 띤다. HPPD 억제 제초제 내성 HPPD 폴리펩티드가 발현되고 활성화되지 않는 한, HPPD 억제 제초제의 존재하에서 이러한 색소 생성은 억제될 수 있고 배양은 배지의 색을 변화시키지 않을 것이다. 이 시험은 활성의 기원이 무엇이든지 HPPD 활성 및 HPPD 억제 제초제 내성을 반영하며, 즉 정성적 수준에서 HPPD 활성의 확인을 가능하게 한다는 것은 이미 입증되었다 (US6,768,044).

B. HPPD 서열 내로 돌연변이를 도입하는 방법

본 발명의 핵산에 의해 인코딩된 돌연변이된 HPPD 폴리펩티드에서, 적어도 3개의 아미노산이 앞서 정의한 바와 같이 대체되었다.

치환은 상기 서열에서 치환할 아미노산에 상응하는 코돈으로 치환될 아미노산을 코딩하는 코돈을 치환하기에 적합한 임의의 수단에 의해 상기 정의된 바와 같은 참조 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에서 수행될 수 있으며, 상기 코돈은 문헌에 널리 기술되어 있고 당업자에게 잘 알려져 있다.

다수의 분자생물학적 방법이 이러한 치환을 실현하는데 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 돌연변이된 핵산 서열 및 상응하는 단백질을 제조하기 위한 유용한 방법은 미리 선택된 하나 이상의 아미노산을 인코딩하는 코돈 상에서 부위 지정 돌연변이유발을 수행하는 것을 포함한다. 이러한 부위 지정 돌연변이를 달성하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 (특히, Directed Mutagenesis: A Practical Approach 1991, Edited by M.J. McPHERSON, IRL PRESS)에 널리 기재되어있거나, 상업적 키트 (예를 들면, Qiagen 또는 Stratagene으로부터의 QUIKCHANGE™ 라이트닝 (lightening) 돌연변이유발 키트)를 사용하기에 가능한 방법이다. 상기 부위 지정 돌연변이유발 후, 적절한 스크리닝의 보조를 이용하여 HPPD 억제제에 덜 민감한 돌연변이된 HPPD 폴리펩티드를 포함하는 세포를 선택하는 것이 유용하다. 이를 구현하기 위한 적절한 스크리닝 방법은 앞서 기술되었다.

선택적으로, 참조 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 본원에 언급되는 치환의 하나 이상을 갖는 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하도록 인 실리코 (in silico)로 변형될 수 있으며, 이후에 새롭게 (de novo) 합성된다. 이 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌에 기재되어 있다. 돌연변이된 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원의 다른 곳에 기재되는 바와 같이 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

C. 단리된 폴리뉴클레오티드와 이의 변이체 및 단편

일부 구체예에 있어서, 본 발명은 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 조절 요소, 구조 유전자, 유전자 군, 플라스미드, 전체 게놈 및 그의 단편을 비롯해 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 임의의 길이 및 임의의 서열의 임의의 유전 물질에 상응한다. 본원에 정의되는 바와 같은 "재조합" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드/단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 이종 숙주 세포 내에 또는 형질전환 식물 세포, 종자 혹은 식물 내에 포함되는 경우와 같이 그의 최초 고유 유기체 내에 더 이상 존재하지 않는다. 일 구체예에 있어서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드가 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 핵산의 측면에 배치되는 (즉, 상기 핵산의 5' 및 3' 말단에 배치되는 서열) 서열 (예를 들면, 단백질 인코딩 또는 조절 서열)이 없다. "재조합"이라는 용어는 자연의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대하여 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하므로, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연에서 발생되는 것과 다르다 (예를 들면, 화학 조성 또는 구조가). 다른 구체예에서, "재조합" 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드가 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 생성되는 내부 서열 (즉, 인트론)이 없다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예는 이른바 상보성 DNA (cDNA) 이다. 예를 들면, 다양한 구체예에서, 단리된 HPPD 억제 제초제 내성-인코딩 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드가 유래되는 세포의 게놈 DNA 내의 폴리뉴클레오티드 측면에 자연적으로 배치되는 뉴클레오티드 서열의 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 HPPD를 인코딩하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 숙주 세포 (예를 들어, 식물 숙주 세포 또는 박테리아 숙주 세포)에서 핵산 분자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.

본 발명은 서열 번호 3-108 중 임의의 것에 제시된 아미노산을 인코딩하는 임의의 핵산 서열의 예시적인 변이체 및 단편을 더 포괄한다. 폴리뉴클레오티드의 "단편"은 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분을 인코딩할 수 있거나, 본원의 다른 곳에서 개시되는 방법을 이용하여 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있는 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단편인 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150의 인접하는 뉴클레오티드, 의도된 용도 (예를 들면, 본원에 기재되는 HPPD 핵산)에 따라 본원에 개시되는 전장 (full-length) 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 뉴클레오티드의 숫자까지를 포함한다. "인접하는 (contiguous)" 뉴클레오티드는 서로 바로 옆에 이웃한 뉴클레오티드 잔기를 의도한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편은 일반적으로 전장 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드의 생물학적 활성, 즉 제초제-내성 활성을 유지하는 폴리펩티드 단편을 인코딩할 것이다. "제초제 내성 활성을 유지하는"은 단편이 서열 번호 3-108로 본원에 개시되는 전장 HPPD 억제 제초제 내성 단백질의 제초제 내성 활성의 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 적어도 약 300% 또는 그 이상을 가질 것임을 의도한다. 제초제 내성 활성을 측정하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예시적인 방법이 본원에 기재된다. 제한적이지 않은 예에 있어서, 본 발명의 단편은 HPPD 억제 제초제의 동일한 용량에 대해 내성이 있게 될 것이거나, HPPD 억제 제초제의 1x, 2x, 3x, 4x 또는 보다 높은 용량에 내성이 있게 될 것이거나, 단편은 상기 단편과 서열 번호 3-108 사이의 ki에 기초하여 동일하거나 보다 내성이 있게 될 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 단편은 적어도 약 150, 175, 200, 250, 300, 350개의 인접하는 아미노산 또는 본 발명의 전장 폴리펩티드 내에 존재하는 총수까지의 아미노산을 인코딩할 것이다. 비제한적 예에서, HPPD 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 단편은 서열 번호 3-108 중 임의의 것에 제시된 HPPD 단백질을 포함하여,

(a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 및 (b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 위치에 세린 및, 임의로, 서열 번호 1의 아미노산 위치 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344, 345에 상응하는 위치에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 갖는다.

본 발명은 또한 앞서 언급한 바와 같은 변이체 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 "변이체"는 또한 본 발명의 HPPD를 인코딩하지만 유전자 코드의 축퇴 (degeneracy) 때문에 보존적으로 다른 서열뿐만 아니라 충분히 동일한 것도 포함한다. 본 발명의 변이체는 HPPD 폴리펩티드 활성 및 HPPD 제초제 억제 내성을 유지할 것이다. "충분히 동일한"이라는 용어는 정렬 프로그램의 하나를 이용하고 표준 변수를 이용하여 참조 서열과 비교하여 적어도 약 53%, 적어도 약 60% 또는 65%의 서열 동일성, 약 70% 또는 75%의 서열 동일성, 약 80% 또는 85%의 서열 동일성, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 의도한다. 당업자라면 이러한 값이 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 해독 프레임 위치 결정 등을 고려하여 두 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 동일성을 판단하도록 적절하게 조절될 수 있는 점을 인지할 것이다.

박테리아 유전자는 아주 빈번히 오픈 해독 프레임의 개시에 근접하여 다중 메티오닌 개시 코돈을 소유한다. 흔히, 이러한 개시 코돈의 하나 이상에서 번역 개시는 기능 단백질의 발생을 가져올 것이다. 이러한 개시 코돈은 ATG 코돈을 포함할 수 있다. 그러나, 바실루스 종 (Bacillus sp.)과 같은 박테리아도 상기 코돈 GTG를 개시 코돈으로 인식하며, GTG 코돈에서 번역을 개시하는 단백질은 첫 번째 아미노산에서 메티오닌을 함유한다. 더욱이, 흔히 이들 코돈이 박테리아에서 자연적으로 사용되는 것은 선험적으로 결정되지 않는다. 따라서, 선택적인 메티오닌 코돈의 하나의 사용이 제초제 내성을 부여하는 변이체의 발생을 가져올 수 있는 점이 이해될 것이다. 이러한 제초제 내성 단백질은 본 발명에 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 자연적으로 생성되는 대립 형질 (allelic) 변이체는 아래에 요약된 바와 같은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술과 같은 잘 알려진 분자 생물학 기술의 사용으로 확인될 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들면 부위 지정 또는 다른 돌연변이유발 전략을 이용하여 생성되었지만, 여전히 원하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 합성적으로 유래된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

당업자라면 변화가 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 추가 돌연변이에 의해 도입될 수 있으며, 이에 따라 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변경하지 않고 인코딩된 폴레펩티드의 아미노산 서열 내에 추가 변화가 발생한다는 것을 더 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 변이체 단리된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 본 발명의 HPPD를 인코딩하는 상응하는 폴리뉴클레오티드 내로 도입함으로써 생성될 수 있으므로, 3-5, 1-7, 1-9, 1-11, 1-13, 1-15, 또는 1-17의 아미노산 치환, 첨가 및 결실, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 상기 인코딩된 폴리펩티드 내로 도입된다. 추가 돌연변이가 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발 또는 유전자 셔플링 (shuffling) 기술과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 이와 같은 변이체 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 의해 포괄된다.

변이체 폴리뉴클레오티드는 포화 돌연변이유발 또는 치환 돌연변이유발과 같이 돌연변이를 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라서 랜덤하게 도입함으로써 만들어질 수 있으며, 결과물인 돌연변이은 활성을 유지하는 돌연변이를 확인하도록 제초제 내성 활성을 부여하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.

변이체를 생성하기 위한 추가적인 방법은 본원에 개시되는 단백질 (또는 이의 라이브러리)을 발현하는 세포를 단백질 활성에 스트레스를 일으키는 특정 조건에 노출시키는 단계를 포함한다. 특정 조건은 (이에 한정되는 것은 아니지만) 온도 변화, pH 변화 및 기질 또는 억제제의 농도의 변화, 버퍼 조성물 또는 그 농도의 변화를 포함할 수 있다. 단백질 라이브러리는 단백질 발현 (예를 들면, 대장균 또는 다른 숙주에서) 시간, 또는 후속하는 단백질 추출 생성 또는 후속하는 단백질 정제 동안에 이러한 조건에 놓일 수 있다.

스트레스 조건에 노출된 단백질 라이브러리의 기능이나 효소 활성은 이어서 개선된 성질을 갖는 단백질을 확인하도록 참조 단백질과 비교될 수 있다. 이러한 활성 비교는 성장 스크린의 일부로서 또는 선택적으로는 단백질의 활성을 정량화하는 효소 분석의 일부로서 수행될 수 있다. 개선된 것으로 확인될 수 있는 성질은 HPPD 억제 제초제 내성, 동력학적 상수 (Km, Ki, k_cat를 포함)의 변화, 단백질 안정성, 단백질 열안정성 또는 단백질 온도 및 pH 최적을 포함할 수 있다.

D. 단리된 단백질과 이의 변이체 및 단편

제초제 내성 폴리펩티드도 또한 본 발명 내에 포함된다. 제초제 내성 폴리펩티드는 비-제초제 내성 폴리펩티드 (본원에서 "오염 단백질 (contaminating protein)" 로도 언급된다)를 약 30%, 20%, 10% 또는 5% (건조 중량으로) 미만으로 갖는 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 본 발명에서, "제초제 내성 단백질"은 본원에 개시되는 HPPD 폴리펩티드를 의도한다. 단편, 생물학적 활성 부분 및 이의 변이체도 제공되며, 본 발명의 방법을 실행하는데 이용될 수 있다.

"단편" 또는 "생물학적 활성 부분"은 제초제 내성 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열을 포함하고 제초제 내성 활성을 유지하는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 제초제 내성 단백질의 생물학적 활성 부분은, 예를 들면, 길이가 10, 25, 50, 100 또는 그 이상인 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다. 이와 같은 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고, 제초제 내성 활성에 대해 평가될 수 있다.

"변이체"는 예시적인 서열 번호 3-108 중 임의의 것과 적어도 약 53%, 60%, 65%, 약 70%, 75%, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 의도하는 것이며, 여기서 상기 변이체는 HPPD 폴리펩티드 활성 및 HPPD 억제 제초제 내성을 가진다. 당업자는 이러한 값이 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 해독 프레임 위치 결정 등을 고려하여 두 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 동일성을 판단하도록 적절하게 조절될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 이뤄질 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성의 변경 없이 폴리펩티드의 참조 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이며, 반면에 "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 위해 요구된다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당 기술 분야에서 정의되었다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지의 측쇄 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가지는 아미노산을 포함한다. 아미노산 치환은 기능을 보유하는 비보전 영역에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 치환은 보전된 아미노산 잔기에 대해서, 또는 보전된 모티프 (motif) 내에 잔류하는 아미노산 잔기에 대해 이루어지지 않을 수 있으며, 여기서 이와 같은 잔기는 폴리펩티드 활성을 위해 필수적이다. 그러나, 당업자라면 기능성 변이체가 보전된 잔기 내에 거울 보존되거나 보존되지 않은 변경을 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 HPPD에 대한 항체 또는 이의 변이체나 단편도 또한 포괄된다. 항체를 생산하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, Harlow and Lane (1988), Antibodies： A Laboratory Manual," , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 및 미국 특허 제4,196,265호 참조).

이에 따라, 본 발명의 일 측면은 항체, 단일-사슬 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자의 하나 이상에 특이적으로 결합하는 다른 단백질 및 이의 상동체, 융합 또는 단편에 관련된다. 특히 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 3-108에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합된다.

본 발명의 항체는 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자를 정성적으로 또는 정량적으로 검출하거나, 단백질의 해석 후 변형을 검출하는데 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 항체 또는 펩티드는 결합이 비-연관 분자의 존재에 의해 경쟁적으로 저해되지 않을 경우에 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자에 "특이적으로 결합된다"라고 언급된다.

E. 유전자 더미 (Gene stacking)

작물의 상업적 생산에서, 신뢰성 있는 농약 관리하에서 농작물의 필드로부터 원치 않는 식물 (즉, "잡초")을 제거하는 것이 바람직하다. 이상적인 처리는 전체 필드에 적용될 수 있지만 농작물에는 영향 없이 원치 않는 식물만을 제거할 수 있는 것이다. 하나의 이러한 처리 시스템은 제초에 대해 내성이 있는 농작물의 이용을 수반할 수 있으므로, 제초제가 제초제 내성 농작물의 필드에 분무되는 경우 비제초제 내성 잡초가 죽거나 심하게 피해 받지만 농작물은 잘 자랄 수 있다. 이상적으로, 이와 같은 처리 시스템은 잡초 방제가 유연성과 경제성의 가능한 최적의 결합을 제공할 수 있도록 가변적인 제초제 성질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 개개의 제초제는 필드에서 다른 지속성을 가지며, 일부 제초제는 필드에 적용된 후에 존속되고 상대적으로 긴 시간 동안 효능이 있는 반면, 다른 제초제는 다른 화합물 및/또는 비활성 화합물로 빠르게 분해된다. 이상적인 처리 시스템은 상이한 제초제의 사용을 허용할 수 있기 때문에 재배자는 특정 상황에 맞게 제초제의 선택을 조절할 수 있다.

많은 제초제 내성 농작물이 현재 상업적으로 입수 가능하지만, 많은 상업적인 제초제 및 제초제/작물 결합에 대해 제기되는 문제는 개개의 제초제가 통상적으로 보통의 잡초 종에 대해 불완전한 활성의 스펙트럼을 가진다는 것이다. 한동안 사용되었던 대부분의 개별적인 제초제에 대하여, 제초제 내성 잡초 종 및 생물형 집단이 보다 우세해졌다 (예를 들면, Tranel and Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen and Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311 참조). 하나 이상의 제초제에 대해 내성이 있는 형질전환 식물이 기재되었다 (예를 들면, W02005/012515 참조). 그러나, 작물 생산, 잡초 방제 옵션, 잔류 잡초 방제의 연장 및 작물 수율의 개선의 모든 측면에서의 개선이 계속적으로 요구되고 있다.

본 발명의 HPPD 단백질 또는 뉴클레오티드 서열은 식물 내에서 이러한 식물에 유용한 농경학적 성질을 부여하는 단백질 또는 RNA을 인코딩하는 다른 유전자와 유리하게 결합된다. 형질전환된 식물에 유용한 농경학적 성질을 부여하는 단백질 또는 RNA을 인코딩하는 유전자 중에서, 그의 화학 구조에 따라 HPPD 억제 제초제와 상이한 하나 이상의 제초제에 대해 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 및 특정 곤충에 대한 내성을 부여하는 것, 특정 질병에 대한 내성을 부여하는 것, 선충 (nematode) 또는 해충 방제 등을 제공하는 RNA를 인코딩하는 DNA가 언급될 수 있다.

이와 같은 유전자는 공개된 PCT 특허 출원 WO91/02071 및 WO95/06128과 미국 특허 제7,923,602호 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0166723호에 상세하게 기재되어 있으며, 이의 개시 사항은 전체가 본원에 참고로 포함된다.

형질전환된 식물 세포 및 식물에 특정 제초제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 중에서, 바 (bar) 혹은 PAT 유전자 또는 WO2009/152359에 기재된 글루포시네이트 제초제에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 유전자, 글리포세이트 및 이의 염과 같은 표적으로서 EPSPS를 갖는 제초제에 대한 내성을 부여하는 적합한 EPSPS를 인코딩하는 유전자 (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435), 글리포세이트-n-아세틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자 (예를 들면, US 8,222,489, US 8,088,972, US 8,044,261, US 8,021,857, US 8,008,547, US 7,999,152, US 7,998,703, US 7,863,503, US 7,714,188, US 7,709,702, US 7,666,644, US 7,666,643, US 7,531,339, US 7,527,955, 및 US 7,405,074), 또는 글리포세이트 옥시도리덕타제를 인코딩하는 유전자 (예를 들면, US 5,463,175)가 언급될 수 있다.

표적으로서 EPSPS를 갖는 제초제에 대한 내성을 부여하는 적합한 EPSPS를 인코딩하는 DNA 서열 중에서, 식물 EPSPS, 특히 옥수수 EPSPS, 특히 두 돌연변이를 포함하는 옥수수 EPSPS, 특히 US 6,566,587에 기재되고 이하에서 이중 돌연변이 옥수수 EPSPS 또는 2mEPSPS로 호칭되는 아미노산 위치 102에서의 돌연변이 및 아미노산 위치 106에서의 돌연변이 (WO 2004/074443)를 인코딩하는 유전자, 또는 CP4로도 호칭되는 미국 특허 제5,633,435호의 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 기재되는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 으로부터 단리된 EPSPS를 인코딩하는 유전자가 보다 구체적으로 언급된다.

표적으로서 EPSPS를 갖는 제초제에 대한 내성을 부여하는 적합한 EPSPS를 인코딩하는 DNA 서열 중에서, 아르토박테르 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis)로부터의 EPSPS GRG23 뿐만 아니라 돌연변이 GRG23 ACE1, GRG23 ACE2 또는 GRG23 ACE3, 특히 WO2008/100353에 기재된 바와 같은 GRG23의 돌연변이 또는 변이체, 예컨대 WO2008/100353에서 서열 번호 29의 GRG23(ace3)R173K를 인코딩하는 유전자가 보다 상세하게 언급될 것이다.

EPSPS를 인코딩하며, 보다 상세하게는 상기 유전자를 인코딩하는 DNA 서열의 경우, 이러한 효소를 인코딩하는 서열은 유리하게는 수송 펩티드, 특히 미국 특허 제5,510,471호 또는 미국 특허 제5,633,448호에 기재된 "최적화된 수송 펩티드"를 인코딩하는 서열에 의해 선행된다.

본 발명의 핵산 서열과 결합될 수 있는 예시적인 제초제 내성 형질은 적어도 하나의 ALS (아세토락테이트 신타제) 억제제 (WO 2007/024782); 돌연변이된 아라비돕시스 (Arabidopsis) ALS/AHAS 유전자 (미국 특허 제6,855,533호); 대사화에 의해 2,4-D (2,4-디클로로페녹시아세트산)에 대한 내성을 부여하는 2,4-D-모노옥시게나제를 인코딩하는 유전자 (미국 특허 제6,153,401호); 및 대사화에 의해 디캄바 (3,6-디클로로-2-메톡시벤조산)에 대한 내성을 부여하는 디캄바 모노옥시게나제를 인코딩하는 유전자 (미국 특허 출원 공개 제2008/0119361호 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0120739호)를 더 포함한다.

다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD는 하나 이상의 추가적인 HPPD 억제 제초제 내성의 유전자 및/또는 글리포세이트 및/또는 글루포시네이트에 대한 내성이 있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 하나 이상의 제초제 내성의 유전자로 더미화된다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD는 2mEPSPS 및 바 (bar)와 결합된다.

곤충에 대한 내성의 성질과 관련되는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 중에서, 문헌에 널리 기재되어 있고 당업자에게 잘 알려진 Bt 단백질이 보다 상세하게 언급된다. 또한, 포토하브두스 (Photorhabdus)와 같은 박테리아로부터 추출된 단백질 (WO 97/17432 및 WO 98/08932)이 언급된다.

곤충에 대한 새로운 성질의 내성을 부여하는 관심의 대상인 단백질을 인코딩하는 이와 같은 DNA 서열 중에서, 문헌에 널리 기재되어 있고 당업자에게 잘 알려진 Bt Cry 또는 VIP 단백질이 보다 상세하게 언급될 것이다. 이는 Cry1F 단백질 또는 Cry1F 단백질로부터 유래되는 하이브리드 (예를 들면, US 6,326,169; US 6,281,016; 및 US 6,218,188에 기재된 하이브리드 Cry1A-Cry1F 단백질 또는 이의 독성 단편), Cry1A-형 단백질 또는 이의 독성 단편, 바람직하게는 Cry1Ac 단백질 또는 Cry1Ac 단백질로부터 유래되는 하이브리드 (예를 들면, US 5,880,275에 기재된 하이브리드 Cry1Ab-Cry1Ac 단백질) 또는 EP451878에 기재된 바와 같은 Cry1Ab 또는 Bt2 단백질 또는 이의 살충 단편, WO2002/057664에 기재된 바와 같은 Cry2Ae, Cry2Af 또는 Cry2Ag 단백질 또는 이의 독성 단편, WO2007/140256에 기재된 Cry1A.105 단백질 (서열 번호 7) 또는 이의 독성 단편, NCBI 기탁 (accession) ABG20428의 VIP3Aa19 단백질, NCBI 기탁 ABG20429의 VIP3Aa20 단백질 (WO2007/142840에서 서열 번호 2), COT202 또는 COT203 목화 이벤트 (events)에서 생산되는 VIP3A 단백질 (각각 WO2005/054479 및 WO2005/054480), WO2001/47952에 기재된 바와 같은 Cry 단백질, Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci USA, 28;93 (11) 5389-94 및 US 6,291,156호에 기재된 바와 같은 VIP3Aa 단백질 또는 이의 독성 부분, 제노하브두스 (Xenorhabdus)로부터의 살충 단백질 (WO98/50427에 기재된 바와 같이), WO98/08932에 기재된 바와 같은 포토하브두스 (Photorhabdus) 유래 Tc-단백질과 같은 세라티아 (Serratia) (특히 세라티아 엔토필라 (S. entomophila) 유래) 또는 포토하브두스 (Photorhabdus) 종 균주 (예를 들면, Waterfield et al. (2001), Appl Environ Microbiol. 67 (11)：5017-24; Ffrench-Constant and Bowen (2000), Cell Mol Life Sci. 57 (5):828-33)를 포함한다. 또한, 상기 서열 중 임의의 것, 특히 이의 독성 단편의 서열과 일부 (1-10, 바람직하게는, 1-5) 아미노산이 다르거나, 색소체 수송 펩티드와 같은 수송 펩티드에 융합되는 이러한 단백질 중 어느 하나 또는 다른 단백질 또는 펩티드의 임의의 변이체 또는 돌연변이가 본원에 포함된다.

다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD 서열은 식물 내에서 제초제 내성, 곤충 내성, 가뭄 내성, 선충 방제, 물 이용 효율, 질소 이용 효율, 개선된 영양가, 질병 저항, 향상된 광합성, 개선된 섬유질, 스트레스 내성, 개선된 재생성 등과 같은 바람직한 형질을 부여하는 하나 이상의 유전자와 결합될 수 있다.

동일한 종의 식물 내에서 본 발명의 유전자와 결합될 수 있는 특히 유용한 형질전환 이벤트 (예를 들면, 교차에 의하거나 본 발명의 키메라 유전자와 다른 형질전환 이벤트를 포함하는 식물의 재형질전환에 의해)는 Event 531/PV-GHBK04 (목화, 곤충 방제, WO2002/040677에 기재됨), Event 1143-14A (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2006/128569에 기재됨); Event 1143-51B (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2006/128570에 기재됨); Event 1445 (목화, 제초제 내성, 기탁되지 않음, US-A 2002-120964 또는 WO2002/034946에 기재됨; Event 17053 (벼, 제초제 내성, PTA-9843로 기탁, WO2010/117737에 기재됨); Event 17314 (벼, 제초제 내성, PTA-9844로 기탁, WO2010/117735에 기재됨); Event 281-24-236 (목화, 곤충 방제 - 제초제 내성, PTA-6233로 기탁, WO2005/103266 또는 US-A 2005-216969에 기재됨); Event 3006-210-23 (목화, 곤충 방제 - 제초제 내성, PTA-6233로 기탁, US-A 2007-143876 또는 WO2005/103266에 기재됨); Event 3272 (옥수수, 품질 형질, PTA-9972로 기탁, WO2006/098952 또는 US-A 2006-230473에 기재됨); Event 33391 (밀, 제초제 내성, PTA-2347로 기탁, WO2002/027004에 기재됨), Event 40416 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-11508로 기탁, WO 11/075593에 기재됨); Event 43A47 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-11509로 기탁, WO2011/075595에 기재됨); Event 5307 (옥수수, 곤충 방제, ATCC PTA-9561로 기탁, WO2010/077816에 기재됨); Event ASR-368 (벤트 그라스, 제초제 내성, ATCC PTA-4816으로 기탁, US-A 2006-162007 또는 WO2004/053062에 기재됨); Event B16 (옥수수, 제초제 내성, 기탁되지 않음, US-A 2003-126634에 기재됨); Event BPS-CV127-9 (대두, 제초제 내성, NCIMB No. 41603으로 기탁, WO2010/080829에 기재됨); Event BLR1 (유채, 웅성 불임성 복원, NCIMB 41193으로 기탁, WO2005/074671에 기재됨); Event CE43-67B (목화, 곤충 방제, DSM ACC2724로 기탁, US-A 2009-217423 또는 WO2006/128573에 기재됨); Event CE44-69D (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, US-A 2010-0024077에 기재됨); Event CE44-69D (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2006/128571에 기재됨); Event CE46-02A (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2006/128572에 기재됨); Event COT102 (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, US-A 2006-130175 또는 WO2004/039986에 기재됨); Event COT202 (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, US-A 2007-067868 또는 WO2005/054479에 기재됨); Event COT203 (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2005/054480에 기재됨); Event DAS21606-3/1606 (대두, 제초제 내성, PTA-11028로 기탁, WO2012/033794에 기재됨),　 Event DAS40278 (옥수수, 제초제 내성, ATCC PTA-10244로 기탁, WO2011/022469에 기재됨); Event DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1 (대두, 제초제 내성, PTA-11336으로 기탁, WO2012/075426에 기재됨),　 Event DAS-14536-7 /pDAB8291.45.36.2 (대두, 제초제 내성, PTA-11335로 기탁, WO2012/075429에 기재됨), Event DAS-59122-7 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA 11384로 기탁, US-A 2006-070139에 기재됨); Event DAS-59132 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, 기탁되지 않음, WO2009/100188에 기재됨); Event DAS68416 (대두, 제초제 내성, ATCC PTA-10442로 기탁, WO2011/066384 또는 WO2011/066360에 기재됨); Event DP-098140-6 (옥수수, 제초제 내성, ATCC PTA-8296으로 기탁, US-A 2009-137395 또는 WO 08/112019에 기재됨); Event DP-305423-1 (대두, 품질 형질, 기탁되지 않음, US-A 2008-312082 또는 WO2008/054747에 기재됨); Event DP-32138-1 (옥수수, 혼성화 시스템, ATCC PTA-9158로 기탁, US-A 2009-0210970 또는 WO2009/103049에 기재됨); Event DP-356043-5 (대두, 제초제 내성, ATCC PTA-8287로 기탁, US-A 2010-0184079 또는 WO2008/002872에 기재됨); Event EE-1 (가지, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO 07/091277에 기재됨); Event FI117 (옥수수, 제초제 내성, ATCC 209031로 기탁, US-A 2006-059581 또는 WO 98/044140에 기재됨); Event FG72 (대두, 제초제 내성, PTA-11041로 기탁, WO2011/063413에 기재됨), Event GA21 (옥수수, 제초제 내성, ATCC 209033으로 기탁, US-A 2005-086719 또는 WO 98/044140에 기재됨); Event GG25 (옥수수, 제초제 내성, ATCC 209032로 기탁, US-A 2005-188434 또는 WO 98/044140에 기재됨); Event GHB119 (목화, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-8398로 기탁, WO2008/151780에 기재됨); Event GHB614 (목화, 제초제 내성, ATCC PTA-6878로 기탁, US-A 2010-050282 또는 WO2007/017186에 기재됨); Event GJ11 (옥수수, 제초제 내성, ATCC 209030으로 기탁, US-A 2005-188434 또는 WO98/044140에 기재됨); Event GM RZ13 (사탕무, 바이러스 저항성, NCIMB-41601로 기탁, WO2010/076212에 기재됨); Event H7-1 (사탕무, 제초제 내성, NCIMB 41158 또는 NCIMB 41159로 기탁, US-A 2004-172669 또는 WO 2004/074492에 기재됨); Event JOPLIN1 (밀, 질병 내성, 기탁되지 않음, US-A 2008-064032에 기재됨); Event LL27 (대두, 제초제 내성, NCIMB41658로 기탁, WO2006/108674 또는 US-A 2008-320616에 기재됨); Event LL55 (대두, 제초제 내성, NCIMB 41660으로 기탁, WO 2006/108675 또는 US-A 2008-196127에 기재됨); Event LLcotton25 (목화, 제초제 내성, ATCC PTA-3343으로 기탁, WO2003/013224 또는 US-A 2003-097687에 기재됨); Event LLRICE06 (벼, 제초제 내성, ATCC 203353으로 기탁, US 6,468,747 또는 WO2000/026345에 기재됨); Event LLRice62 (벼, 제초제 내성, ATCC 203352로 기탁, WO2000/026345에 기재됨), Event LLRICE601 (벼, 제초제 내성, ATCC PTA-2600으로 기탁, US-A 2008-2289060 또는 WO2000/026356에 기재됨); Event LY038 (옥수수, 품질 형질, ATCC PTA-5623으로 기탁, US-A 2007-028322 또는 WO2005/061720에 기재됨); Event MIR162 (옥수수, 곤충 방제, PTA-8166으로 기탁, US-A 2009-300784 또는 WO2007/142840에 기재됨); Event MIR604 (옥수수, 곤충 방제, 기탁되지 않음, US-A 2008-167456 또는 WO2005/103301에 기재됨); Event MON15985 (목화, 곤충 방제, ATCC PTA-2516으로 기탁, US-A 2004-250317 또는 WO2002/100163에 기재됨); Event MON810 (옥수수, 곤충 방제, 기탁되지 않음, US-A 2002-102582에 기재됨); Event MON863 (옥수수, 곤충 방제, ATCC PTA-2605로 기탁, WO2004/011601 또는 US-A 2006-095986에 기재됨); Event MON87427 (옥수수, 수분 조절, ATCC PTA-7899로 기탁, WO2011/062904에 기재됨); Event MON87460 (옥수수, 스트레스 저항성, ATCC PTA-8910으로 기탁, WO2009/111263 또는 US-A 2011-0138504에 기재됨); Event MON87701 (대두, 곤충 방제, ATCC PTA-8194로 기탁, US-A 2009-130071 또는 WO2009/064652에 기재됨); Event MON87705 (대두, 품질 형질 - 제초제 내성, ATCC PTA-9241로 기탁, US-A 2010-0080887 또는 WO2010/037016에 기재됨); Event MON87708 (대두, 제초제 내성, ATCC PTA-9670으로 기탁, WO2011/034704에 기재됨); Event MON87712 (대두, 수율, PTA-10296으로 기탁, WO2012/051199에 기재됨), Event MON87754 (대두, 품질 형질, ATCC PTA-9385로 기탁, WO2010/024976에 기재됨); Event MON87769 (대두, 품질 형질, ATCC PTA-8911로 기탁, US-A 2011-0067141 또는 WO2009/102873에 기재됨); Event MON88017 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-5582로 기탁, US-A 2008-028482 또는 WO2005/059103에 기재됨); Event MON88913 (목화, 제초제 내성, ATCC PTA-4854로 기탁, WO2004/072235 또는 US-A 2006-059590에 기재됨); Event MON88302 (유채, 제초제 내성, PTA-10955로 기탁, WO2011/153186에 기재됨), Event MON88701 (목화, 제초제 내성, PTA-11754로 기탁, WO2012/134808에 기재됨), Event MON89034 (옥수수, 곤충 방제, ATCC PTA-7455로 기탁, WO 07/140256 또는 US-A 2008-260932에 기재됨); Event MON89788 (대두, 제초제 내성, ATCC PTA-6708로 기탁, US-A 2006-282915 또는 WO2006/130436에 기재됨); Event MS11 (유채, 수분 조절 - 제초제 내성, ATCC PTA-850 또는 PTA-2485로 기탁, WO2001/031042에 기재됨); Event MS8 (유채, 수분 조절 - 제초제 내성, ATCC PTA-730으로 기탁, WO2001/041558 또는 US-A 2003-188347에 기재됨); Event NK603 (옥수수, 제초제 내성, ATCC PTA-2478로 기탁, US-A 2007-292854에 기재됨); Event PE-7 (벼, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2008/114282에 기재됨); Event RF3 (유채, 수분 조절 - 제초제 내성, ATCC PTA-730으로 기탁, WO2001/041558 또는 US-A 2003-188347에 기재됨); Event RT73 (유채, 제초제 내성, 기탁되지 않음, WO2002/036831 또는 US-A 2008-070260에 기재됨); Event SYHT0H2/SYN-000H2-5 (대두, 제초제 내성, PTA-11226으로 기탁, WO2012/082548에 기재됨), Event T227-1 (사탕무, 제초제 내성, 기탁되지 않음, WO2002/44407 또는 US-A 2009-265817에 기재됨); Event T25 (옥수수, 제초제 내성, 기탁되지 않음, US-A 2001-029014 또는 WO2001/051654에 기재됨); Event T304-40 (목화, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-8171로 기탁, US-A 2010-077501 또는 WO2008/122406에 기재됨); Event T342-142 (목화, 곤충 방제, 기탁되지 않음, WO2006/128568에 기재됨); Event TC1507 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, 기탁되지 않음, US-A 2005-039226 또는 WO2004/099447에 기재됨); Event VIP1034 (옥수수, 곤충 방제 - 제초제 내성, ATCC PTA-3925로 기탁, WO2003/052073에 기재됨), Event 32316 (옥수수, 곤충 방제-제초제 내성, PTA-11507로 기탁, WO2011/084632에 기재됨), Event 4114 (옥수수, 곤충 방제-제초제 내성, PTA-11506으로 기탁, WO2011/084621에 기재됨), 임의로 EE-GM1/LL27 또는 event EE-GM2/LL55로 더미화된 event　 EE-GM3/FG72 (대두, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-11041) (WO2011/063413A2), event　 DAS-68416-4 (대두, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-10442, WO2011/066360A1), event DAS-68416-4 (대두, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-10442, WO2011/066384A1), event DP-040416-8 (옥수수, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-11508, WO2011/075593A1), event　 DP-043A47-3 (옥수수, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-11509, WO2011/075595A1), event　 DP-004114-3 (옥수수, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-11506, WO2011/084621A1), event　 DP-032316-8 (옥수수, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-11507, WO2011/084632A1), event　 MON-88302-9 (유채, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-10955, WO2011/153186A1), event DAS-21606-3 (대두, 제초제 내성, ATCC Accession No. PTA-11028, WO2012/033794A2), event MON-87712-4 (대두, 품질 형질, ATCC 수탁 번호. PTA-10296, WO2012/051199A2), event DAS-44406-6 (대두, 스택 제초제 내성, ATCC 수탁 번호. PTA-11336, WO2012/075426A1), event DAS-14536-7 (대두, 스택 제초제 내성, ATCC 수탁 번호. PTA-11335, WO2012/075429A1), event　 SYN-000H2-5 (대두, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호. PTA-11226, WO2012/082548A2), event　 DP-061061-7 (유채, 제초제 내성, 수탁 번호 입수불가, WO2012071039A1), event DP-073496-4 (유채, 제초제 내성, 수탁 번호 입수불가, US2012131692), event 8264.44.06.1 (대두, 스택 제초제 내성, 수탁 번호 PTA-11336, WO2012075426A2), event 8291.45.36.2 (대두, 스택 제초제 내성, 수탁 번호. PTA-11335, WO2012075429A2), event SYHT0H2 (대두, ATCC 수탁 번호. PTA-11226, WO2012/082548A2), event MON88701 (목화, ATCC 수탁 번호 PTA-11754, WO2012/134808A1), event KK179-2 (알팔라, ATCC 수탁 번호 PTA-11833, WO2013/003558A1), event pDAB8264.42.32.1 (대두, 스택 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-11993, WO2013/010094A1), event MZDT09Y (옥수수, ATCC 수탁 번호 PTA-13025, WO2013/012775A1), event 4114 (메이즈, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-11506) WO201314901, event MON87411 (메이즈, ATCC 수탁 번호 PTA-12669) WO2013169923, event A26-5 (목화, 곤충 방제) WO2013170398, event A2-6 (목화, 곤충 방제) WO2013170399, event 9582.816.15.1 (대두, 곤충 방제, 제초제 내성), ATCC 수탁 번호 PTA-12588) WO2014004458, event 33121 (메이즈, 곤충 방제, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-13392) WO2014116854, event 32218 (메이즈 곤충 방제, 제초제 내성, ATCC 수탁 번호 PTA-13391) WO2014116989, event "SPT-7R-949D SPT-7R-1425D" (벼 웅성 불임성) WO2014154115, event MON87751 (대두, ATCC 수탁 번호. PYA-120166) WO2014201235, event "Pp009-401 Pp009-415 Pp009-469" (터프그라스, ATCC 수탁 번호 PTA-120354, PTA-120353, PTA-120355) WO2015006774, event Bs2-X5 (토마토, ATCC) WO2015017637, event MON87403 (메이즈, 낟알 수율, ATCC 수탁 번호 PTA-13584 WO2015053998, event 32218 (메이즈, 곤충 방제, ATCC 수탁 번호 PTA-13391) WO2015112182을 포함한다.

F. 폴리뉴클레오티드 작제물

본 발명의 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물 세포에서 발현을 얻거나 향상시키도록 변형될 수 있다. 본원에서 확인되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심의 대상인 식물 내의 발현을 위해 발현 카세트 내에 제공될 수 있다. "식물 발현 카세트"는 식물 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 가져올 수 있는 재조합 DNA 작제물을 포함하여 DNA 작제물을 포함한다. 상기 카세트는 식물 내 전사의 5'-3' 방향으로 관심의 대상인 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 (operably-linked) 전사 개시 영역 (즉, 프로모터, 특히 이종 프로모터) 및/또는 번역과 전사 종료 영역 (즉, 종료 영역) 기능을 포함할 수 있다. 상기 카세트는 선별가능한 마커 유전자와 같이 유기체 내로 도입되는 적어도 하나의 추가적인 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 함유할 수 있다. 선택적으로, 추가적인 폴리뉴클레오티드(들)는 다중 발현 카세트 상에 제공될 수 있다. 이와 같은 발현 카세트에는 조절 영역의 전사 조절하에서 상기 폴리뉴클레오티드(들)의 삽입을 위한 복수의 제한 부위가 제공된다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 식물 발현성 프로모터 및 임의로는 전사 종료와 폴리아데닐화 영역에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 이종 핵산을 포함하는 코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이다. "이종"은 일반적으로 세포에 대해 내생이 아니거나, 이가 존재하는 자연 게놈 내의 위치에 대해 내생이 아니며, 감염, 트랜스펙션, 미세주입, 전기천공, 미세투영 등에 의해 상기 세포에 첨가된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 언급한다. "작동 가능하게 연결된"은 두 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적 결합을 의도하는 것이다. 예를 들면, 프로모터가 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 경우, 프로모터 서열은 상기 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드가 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수 있고, 두 폴리펩티드 코딩 영역의 결합에 참조로 사용되는 경우에, 상기 폴리펩티드는 동일한 해독 프레임 내에서 발현된다는 것이 인식될 것이다.

프로모터는 선택된 식물 세포, 식물 부분 또는 식물 내에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 프로모터는 식물 숙주 및/또는 본 발명의 DNA 서열에 대해 자연적일 수 있거나 유사할 수 있거나, 외래 또는 이종일 수 있다. 프로모터가 식물 숙주에 대해 "자연적" 또는 "유사한" 경우, 이는 상기 프로모터가 프로모터가 도입되는 자연 식물 내에서 발견되는 것으로 의도된다. 프로모터가 본 발명의 DNA 서열에 대해 "외래" 또는 "이종"일 경우, 프로모터가 작동 가능하게 연결된 본 발명의 DNA 서열에 대해 자연의 또는 자연적으로 생성된 것이 아닌 것으로 의도된다. 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 이는 자연적으로 생성될 수 있거나, 다양한 자연적으로 생성되는 프로모터의 부분으로 구성될 수 있거나, 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 프로모터의 설계에 대한 지침은 Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361의 경우와 같이 프로모터 구조의 연구에 의해 제공된다. 또한, 전사 개시에 대한 프로모터의 위치가 최적화될 수 있다. 예를 들면, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764를 참조하기 바란다. 식물에 사용하기에 적합한 많은 프로모터가 당업계에 알려져 있다.

예를 들어, 식물에 사용하기에 적합한 구성적 프로모터는, 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 땅콩 황백화 줄무니 칼리모바이러스 (PClSV) 프로모터 (미국 특허 제5,850,019호); 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); Kay et al. (1987) Science 236: 1299-1302에 기술된 35S 프로모터; 클로렐라 바이러스 매틸트랜스페라제 유전자의 프로모터 (미국 특허 제5,563,328호) 및 현삼 모자이크 바이러스 (FMV)로부터의 전장 전사 프로모터 (미국 특허 제5,378,619호); 벼 액틴과 같은 유전자로부터의 프로모터 (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 및 미국 특허 제5,641,876호); 유비퀴틴 (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 및 Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) 및 Grefen et al.(2010) Plant J, 64:355-365; pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730 및 미국 특허 제5,510,474호); 옥수수 H3 히스톤 (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 및 Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300); 브라시카 나푸스 (Brassica napus) ALS3 (PCT 특허 출원 WO97/41228); 식물 리불로오스-비스카르복실라제/옥시게나제 (RuBisCO) 작은 서브유닛 유전자; 써코바이러스 (AU 689 311) 또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) (미국 특허 제7,053,205호); 및 다양한 아그로박테리움 유전자의 프로모터 (미국 특허 제4,771,002호; 미국 특허 제5,102,796호; 미국 특허 제5,182,200호; 및 미국 특허 제5,428,147호 참조)을 포함한다.

식물에 사용하기에 적합한 유도성 프로모터는, 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터 (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수 In2 유전자의 프로모터 (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 및 Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); 및 Tn10으로부터의 Tet 리프레서의 프로모터 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237)를 포함한다. 식물 내의 사용을 위한 다른 유도성 프로모터는 식물이 정상적으로 반응하지 않는 유도제에 반응하는 것이다. 이러한 유형의 예시적인 유도성 프로모터는 그 전사 활성이 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도되는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421) 또는 에스트라디올 (estradiol)에 의해 활성화되는 에스트로겐 수용체 기반의 유도성 식물 발현 시스템에 사용하기 위한 키메라 전사 활성제인 XVE의 최근 적용 (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273)이다. 식물 내에 사용을 위한 다른 유도성 프로모터는 그 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 EP 332104, PCT WO 93/21334 및 PCT WO 97/06269에 기재되어 있다. 다른 프로모터의 일부로 구성된 프로모터 및 부분적으로 또는 전체적으로 합성인 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들면, 식물에 사용하기 위한 이러한 프로모터가 기재된 Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 및 PCT WO 95/14098을 참조하기 바란다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 종자에 대해 특이적인 프로모터 (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), 특히 나핀 프로모터 (EP 255 378 A1), 파세올린 프로모터, 글루테닌 프로모터, 헬리안티닌 프로모터 (WO92/17580), 알부민 프로모터 (WO98/45460), 올레오신 프로모터 (WO98/45461), SAT1 프로모터 또는 SAT3 프로모터 (PCT/US98/06978)와 같이 식물의 특정한 영역이나 조직에 대해 특이적인 프로모터 서열이 본 발명의 HPPD 단백질을 발현시키도록 사용될 수 있다.

페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), HMG-CoA 리덕타제 (HMG), 키티나제, 글루카나제, 프로테이나제 억제제 (PI), PR1 패밀리 유전자, 노팔린 신타제 (nos) 및 vspB 프로모터 (US 5 670 349, 표 3), HMG2 프로모터 (US 5 670 349), 사과 베타-글락토시다제 (ABG1) 프로모터 및 사과 아미노시클로프로판 카르복실레이트 신타제 (ACC 신타제) 프로모터 (WO98/45445)로부터 유리하게 선택되는 유도성 프로모터의 사용도 이루어질 수 있다. 다중 프로모터는 연속적인 것을 포함하여 본 발명의 작제물 내에 사용될 수 있다.

프로모터는 하나 이상의 인핸서 요소를 포함할 수 있거나, 포함하도록 변경될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 프로모터는 복수의 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 인핸서 요소를 포함하는 프로모터는 이를 포함하지 않는 프로모터과 비교하여 보다 높은 전사 수준을 제공한다. 식물에 사용하기에 적합한 인핸서 요소는, PClSV 인핸서 요소 (미국 특허 제5,850,019호), CaMV 35S 인핸서 요소 (미국 특허 제5,106,739호 및 미국 특허 제5,164,316호) 및 FMV 인핸서 요소 (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156); 출원 WO87/07644에 기재된 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 또는 Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597에 기재된 담배 식각 바이러스 (TEV)의 전사 활성제, 또는 예를 들면, 옥수수의 adh1 인트론 또는 벼 액틴의 인트론 1과 같은 인트론을 포함한다. 또한, PCT WO96/23898, WO2012/021794, WO2012/021797, WO2011/084370, 및 WO2011/028914를 참조하기 바란다.

흔히, 이와 같은 작제물은 5' 및 3'의 번역되지 않은 영역을 포함할 수 있다. 이와 같은 작제물은 엽록체 (또는 다른 색소체), 소포체 또는 골지체와 같은 특정한 세포간 구조에 대한 관심의 대상인 펩티드의 공번역 또는 번역후 운반을 촉진하거나 분비되도록 "단일 서열" 또는 "리더 서열"을 포함할 수 있다. 예를 들면, 작제물은 소포체에 대한 펩티드의 수송을 용이하게 하기 위해 단일 펩티드를 포함하도록 조작될 수 있다. "단일 서열"은 세포막을 통한 공번역 또는 번역후 펩티드 운반을 가져오는 것으로 알려지거나 추정되는 서열을 의도한다. 진핵 생물에 있어서, 이는 전형적으로 일부 결과적인 글리코실화와 함께 골지체로의 분비를 수반한다. "리더 서열"이란, 번역될 때, 세포 아래 세포 소기관에 대한 펩티드 사슬의 공번역 운반을 촉발시키기에 충분한 아미노산 서열로 되는 임의의 서열로 의도된다. 따라서, 이는 소포체, 액포에 대한 통로, 엽록체를 포함하는 색소체, 미토콘드리아 및 유사한 것 내로의 통로에 의한 리더 서열을 표적으로 하는 운반 및/또는 글리코실화를 포함한다. 또한, 식물 발현 카세트가 인트론을 포함하도록 조작하여, 상기 인트론의 mRNA 처리가 발현을 위해 요구되는 것이 바람직할 수 있다.

"3'의 번역되지 않은 영역"이란 코딩 서열의 하류에 위치하는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 폴리아데닐화 단일 서열 및 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙 첨가에 영향을 미치는 조절 신호을 인코딩하는 다른 서열은 3'의 번역되지 않은 영역이다. "5'의 번역되지 않은 영역"이란 코딩 서열의 상류에 위치하는 폴리뉴클레오티드를 의도한다.

다른 상류 또는 하류의 번역되지 않은 요소는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 프로모터 영역의 발현을 증가시키도록 작용하는 폴리뉴클레오티드이다. 인핸서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만, SV40 인핸서 영역 및 35S 인핸서 요소를 포함한다.

종료 영역은 전사 개시 영역과 함께 고유적일 수 있거나, 본 발명의 서열과 함께 고유적일 수 있거나, 다른 소스로부터 유래될 수 있다. 적정한 종료 영역은 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종료 영역과 같이 아그로 투메파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti-플라스미드로부터 이용가능하다. 또한, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639; 및 유럽 특허 출원 EP 0 633 317 A1을 참조하기 바란다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 합성 DNA 서열은 본 발명의 폴리펩티드와 같이 정해진 폴리펩티드를 위해 설계된다. 세포에서 상기 합성 DNA 서열의 오픈 해독 프레임의 발현은 본 발명의 폴리펩티드의 생산으로 이어진다. 합성 DNA 서열은 원치 않는 제한 엔도뉴클라제 부위를 간단히 제거하고, DNA 클로닝 계획을 용이하게 하고, 임의의 잠재적인 코돈 편향을 변경 또는 제거하고, GC 함량을 변경 또는 향상시키고, 선택적인 해독 프레임을 제거 또는 변경시키고 및/또는 인트론/엑손 스플이스 인식 부위, 폴리아데닐화 부위, 샤인-델그라노 (Shine-Delgarno) 서열, 자연 DNA 서열 내에 존재할 수 있는 윈치 않는 프로모터 요소 및 유사한 것을 변경 또는 제거하는데 유용할 수 있다. 또한, 인트론 서열의 도입, 엽록체 수송 펩티드, 아포플라스트/액포를 표적으로 하는 펩티드 또는 소포체 내의 결과물인 펩티드의 유지를 가져오는 펩티드 서열과 같은 세포 소기관을 표적으로 하는 서열에 대한 단백질 융합으로서 발현되는 DNA 서열의 생성과 같이 DNA 서열에 다른 개선을 도입하는데 합성 DNA 서열을 활용할 수 있는 것이 가능하다. 합성 유전자는 또한 향상된 발현을 위해 숙주 세포 적합 코돈을 이용하여 합성될 수 있거나, 숙주 세포 적합 코돈 사용 빈도에서의 코돈을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함되는 Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11; 미국 특허 제6,320,100호; 6,075,185호; 5,380,831호; 및 5,436,391호, 미국 특허 출원 공개 제20040005600호 및 20010003849호, 및 Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498를 참고하기 바란다.

일 구체예에 있어서, 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 엽록체에 표적화된다. 이러한 방식에 있어서, 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드가 상기 엽록체 내로 직접적으로 삽입되지 않을 경우, 발현 카세트는 관심의 대상인 뉴클레오티드를 엽록체로 이끌도록 수송 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함할 것이다. 이와 같은 수송 펩티드는 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; 및 Shah et al. (1986) Science 233:478-481을 참조하기 바란다.

엽록체에 대해 표적화된 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드는 식물핵과 세포 소기관 사이의 코돈 사용의 차이를 설명하도록 엽록체 내 발현에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드는 엽록체 적합 코돈을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,380,831호를 참고하기 바란다.

이러한 식물 발현 카세트는 식물 형질전환 벡터 내로 삽입될 수 있다. "형질전환 벡터"란 세포의 형질전환을 가능하게 하는 DNA 분자를 의도한다. 이와 같은 분자는 하나 이상의 발현 카세트로 구성될 수 있고, 하나 이상의 벡터 DNA 분자 내로 체계화될 수 있다. 예를 들어, 바이너리 벡터는 식물 세포의 형질전환을 위해 필요한 모든 시스 (cis)- 및 트랜스 (trans)- 작용 기능을 인코딩하도록 두 인접하지 않는 DNA 벡터를 활용하는 식물 형질전환 벡터이다 (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "벡터"는 상이한 숙주 세포 사이에서 운반을 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 작제물을 언급한다. "발현 벡터"는 외래 세포에서 이종 DNA 서열 또는 단편을 도입하고, 통합하며 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 언급한다.

식물 형질전환 벡터는 식물 형질전환을 구현하기 위하여 하나 이상의 DNA 벡터를 포함한다. 예를 들어, 복수의 인접하는 DNA 분절을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 활용하는 것은 당업계에서 통상적인 수행이다. 이러한 벡터는 흔히 당업계에서 바이너리 벡터로 언급된다. 바이너리 벡터뿐만 아니라 헬퍼 플라스미드 (helper plasmid)를 갖는 벡터가 아그로박테리움-매개 형질전환을 위해 가장 흔히 사용되고, 여기서 효율적인 형질전환을 구현하기 위해 요구되는 DNA 분절의 크기와 복잡성은 상당히 크고, 별도의 DNA 분자 상으로 기능을 분리시키는 것이 유리하다. 바이너리 벡터는 전형적으로 T-DNA 전달을 위해 요구되는 시스-작용 서열을 함유하는 플라스미드 벡터 (좌측 경계 및 우측 경계와 같은), 식물 세포에서 발현을 가능하게 하도록 조작된 선별 마커, 및 "관심의 대상인 폴리뉴클레오티드" (형질전환 식물의 발생이 요구되는 식물 세포에서 발현을 가능하게 하도록 조작된 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 또한, 이러한 플라스미드 벡터 상에는 박테리아 복제를 위해 요구되는 서열이 존재한다. 시스-작용 서열은 식물 세포 내로의 효과적인 전달과 그 내부에서의 발현을 가능하게 하는 방식으로 정렬된다. 예를 들면, 선별 마커 서열 및 관심의 대상인 서열은 상기 좌측 및 우측 경계 사이에 위치한다. 흔히 제2의 플라스미드 벡터는 아그로박테리움으로부터 식물 세포 내로의 T-DNA 전달을 매개하는 트랜스-작용 인자를 포함한다. 이러한 플라스미드는 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이 흔히 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염 및 경계 서열에서의 절단 및 vir-매개 DNA 전달에 의해 DNA의 전달을 가능하게 하는 독성 기능 (Vir 유전자)을 포함한다 (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). 다수 유형의 아그로박테리움 균주 (예를 들면, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 등)가 식물 형질전환을 위해 이용될 수 있다. 상기 제2의 플라스미드 벡터가 미세투영, 미세주입, 전기천공, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 다른 방법에 의해 식물 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 필수적인 것은 아니다.

G. 식물 형질전환

본 발명의 방법은 뉴클레오티드 작제물을 식물 내로 도입하는 단계를 포함한다. "도입하는 (introducing)"은 작제물이 식물 세포의 내부에 대한 접근을 획득하는 방식으로 식물에 뉴클레오티드 작제물을 부여하는 것을 의도한다. 본 발명의 방법은 뉴클레오티드 작제물을 식물 내로 도입하기 위해 특정한 방법이 이용되는 것을 요구하지는 않으며, 식물의 적어도 하나의 세포 내부에 대해 뉴클레오티드 작제물의 접근만을 요구한다. 식물 내로 뉴클레오티드 작제물을 도입하기 위한 방법은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 안정적인 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스-매개 방법을 포함하여 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 각각 본원에 참고로 포함되는 US　4,459,355, US　4,536,475, US　5,464,763, US　5,177,010, US　5,187,073, EP　267,159 A1, EP　604　662 A1, EP　672　752 A1, US　4,945,050, US　5,036,006, US　5,100,792, US　5,371,014, US　5,478,744, US　5,179,022, US　5,565,346, US　5,484,956, US　5,508,468, US　5,538,877, US　5,554,798, US　5,489,520, US　5,510,318, US　5,204,253, US　5,405,765, EP　442　174 A1, EP　486　233 A1, EP　486　234 A1, EP　539　563 A1, EP　674　725 A1, WO91/02071, WO95/06128, WO2011/095460, WO2012006439A2, WO2012006443A2, WO2012015039A1, WO2012019660A1, WO2012021494A1, WO2012064827A1, WO2012075562A1, WO2012077664A1, WO2012083137A1, WO2012084962A1, WO2012092577A1, WO2012109947A1, WO2012129443A2, WO2012138629A2, WO2012139416A1, WO2012149011A1, WO2013014585A1, WO2013025670A1, WO2013033308A2, WO2013066007A1, WO2013077420A1, WO2013090734A1, WO2013149726A1, WO2013180311A1, WO2014029044A1, WO2014029045A1, WO2014062036A1, WO2014065857A1, WO2014100234A1, WO2014100406A1, WO2014123208A1, WO2014143304A1, WO2014144513A2, WO2014157541A1, WO2014200842A2, WO2015051083A1, WO2015077620A1, WO2015085990A1, WO2015099674A1, WO2015118640A1, WO2015119166A1에 기재된 식물 세포를 형질전환시키고 식물을 재생시키는 방법을, 특히 본원에 기재되는 형질전환 방법에 대하여 참조하기 바란다.

일반적으로, 식물 형질전환 방법은 이종 DNA를 표적 식물 세포 (예를 들면, 미숙하거나 성숙한 배아, 현탁 배양, 분화되지 않은 캘러스 (캘러스), 프로토플라스트 등) 내로 전달하고, 형질전환되지 않은 세포 매스 집단으로부터 형질전환된 식물 세포를 회복시키기에 적절한 선택을 최대 한계 수준 (선별 마커 유전자에 따라)으로 적용하는 단계를 수반한다. 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 신선한 공급물로 이송되고 일상적으로 배양된다. 이후에, 형질전환된 세포는 선택 제제의 최대 한계 수준으로 보충된 재생 배지 상에 배치된 후에 새싹으로 분화된다. 상기 새싹은 이후에 뿌리내린 새싹 또는 소식물체 (plantlet)의 회수를 위해 선택적인 발근 (rooting) 배지로 이송된다. 형질전환 소식물체는 이후에 성숙한 식물로 성장하며, 생식력 있는 종자를 생산한다 (예를 들어 Hiei et al. (1994) Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 신선한 공급물로 이송되고 일상적으로 배양된다. 형질전환 식물을 생성하기 위한 기술과 방법의 일반적인 기재는 Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 및 Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120에서 찾을 수 있다. 형질전환된 물질은 많은 세포를 포함하기 때문에, 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포 모두가 처리되는 표적 캘러스 또는 조직이나 세포 집단의 임의의 단편에 존재한다. 형질전환되지 않은 세포를 죽이고 형질전환된 세포를 증식시키는 능력은 형질전환된 식물 배양으로 이어진다. 흔히, 형질전환되지 않은 세포를 제거하는 능력은 형질전환된 식물 세포의 신속한 회복 및 형질전환 식물의 성공적인 생성에 대한 제한이다. 분자 및 생화학적 방법이 형질전환 식물의 게놈 내 관심의 대상인 통합된 이종 유전자의 존재를 확인하는데 이용될 수 있다.

형질전환 식물의 생성은, 이에 한정되는 것은 아니지만, DNA의 전달을 위해 아그로박테리움에 의한 식물 세포 내로의 이종 DNA의 도입 (아그로박테리움-매개 형질전환), 입자에 부착된 이종 외래 DNA로의 식물 세포의 충격 및 다양한 다른 비입자 직접-매개 방법을 포함하는 여러 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어 Hiei et al. (1994) Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120).

엽록체의 형질전환을 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606을 참조하기 바란다. 상기 방법은 선별 마커를 함유하는 DNA의 입자 건 (particle gun) 전달 및 동종 재조합을 통한 색소체 게놈에 대한 DNA의 표적화에 의존한다. 또한, 색소체 형질전환은 핵-인코딩된 색소체 지향 RNA 폴리머라제의 조직 적합 발현에 의한 침묵 색소체-매개 이식유전자의 전사활성화에 의해 구현될 수 있다. 이와 같은 시스템은 McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305에 보고되어 있다.

형질전환된 식물 세포는 종래 방식에 따라 식물로 성장될 수 있다. 예를 들면, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84를 참조하기 바란다. 이러한 식물은 이후에 성장될 수 있고, 동일한 형질전환 균주 또는 다른 균주로 수분될 수 있으며, 원하는 표현형 특성의 구성적 발현을 갖는 결과물인 하이브리드가 확인된다. 2 이상의 산물이 원하는 표현형 특성의 발현이 안정적으로 유지되고 유전되는 것을 보장하도록 성장될 수 있으며, 이후에 원하는 표현형 특성의 발현을 보장하도록 수확된 종자가 얻어졌다. 이러한 방식으로, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 작제물, 예를 들면, 이의 게놈 내로 안정적으로 도입된 본 발명의 발현 카세트를 갖는 형질전환된 종자 ("트랜스제닉 종자" 라고도 언급됨)를 제공한다. 다양한 구체예에 있어서, 종자는 적어도 하나의 살진균제 및/또는 적어도 하나의 살충제, 적어도 하나의 제초제 및/또는 적어도 하나의 완화제 또는 이의 임의의 조합으로 코팅될 수 있다.

H. 식물 형질전환의 평가

식물 세포 내로의 이종 외래 DNA의 도입에 이어서, 식물 게놈 내의 이종 유전자의 형질전환 또는 통합이 통합된 유전자와 연관되는 핵산, 단백질 및 대사물의 분석과 같은 다양한 방법으로 확인된다.

PCR 분석은 토양 내로의 이식 전에 초기 단계에서 도입된 유전자의 존재에 대해 형질전환된 세포, 조직 또는 새싹을 스크린하는 신속한 방법이다 (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). PCR은 관심의 대상인 유전자 또는 아그로박테리움 벡터 배경 등에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 수행된다.

식물 형질전환은 게놈 DNA의 서던 블롯 (Southern blot) 분석에 의해 확인될 수 있다 (앞서 언급한 Sambrook and Russell (2001)). 일반적으로, 전체 DNA는 형질전환체로부터 추출되고, 적절한 제한 효소로 소화되며, 아가로스 겔 내에서 분획화되고 니트로셀룰로오스 또는 나일론 멤브레인으로 이송된다. 상기 멤브레인 또는 "블롯 (blot)"은 이후에 표준 기술에 따라 식물 게놈 내의 도입된 유전자의 통합을 확인하도록, 예를 들면, 방사성 원소 표시된 ³²P 표적 DNA 단편으로 프로브될 수 있다 (앞서 언급한 Sambrook and Russell (2001)).

노던 (Northern) 분석에 있어서, RNA는 형질전환체의 특정 조직으로부터 단리되고, 포름알데히드 아가로스 겔 내에서 분획화되며, 당업계에서 일상적으로 이용되는 표준 절차에 따라 나일론 필터 상에 블롯된다 (앞서 언급한 Sambrook and Russell (2001)). 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RNA의 발현은 이후에 필터를 당업계에 알려진 방법에 의해 유도된 방사성 프로브에 혼성화시킴으로써 검사된다 (앞서 언급한 Sambrook 및 Russell (2001)). RNA는 또한 당업계에 알려진 바와 같은 역전사효소 PCR (예를 들어, Green and Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY)을 사용하여 검출 및/또는 정량화될 수 있다.

웨스턴 블롯 (Western blot), ELISA, 측면 유동 (lateral flow) 시험 및 생화학적 분석 등이 제초제 내성 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 결합되는 항체를 이용하여 표준 절차에 의해 제초제 내성 유전자로 인코딩된 단백질의 존재를 판단하도록 형질전환 식물에 대해 수행될 수 있다 (앞서 언급한 Sambrook and Russell (2001)).

본 발명의 일 측면에 있어서, 본원에 기재된 HPPD 유전자는 박테리아 또는 식물 세포의 형질전환에 접근하기 위한 마커로서 유용하다.

I. 형질전환에 대한 마커로서의 사용

본 발명은 또한, 식물을 형질 변환시키기 위한 방법에서, 마커 유전자로서 또는 HPPD 억제제인 제초제에 대해 식물에 내성을 부여하는 것을 가능하게 하는 코딩 서열로서 본 발명에 따른 HPPD를 인코딩하는 핵산의 용도 및 본 발명에 따른 HPPD를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물에 대한 하나 이상의 HPPD 억제제(들)의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,791,014호를 참고하기 바란다.

이러한 구체예에 있어서, HPPD 억제제는 상기 형질전환 단계 전에 상기 세포를 표백하기 위해 수용성 (competent) 식물 세포의 배지 내로 도입될 수 있다. 표백된 수용성 세포는 이후에 선별 마커로서 HPPD 억제제에 대해 내성이 있는 유전자로 형질전환되며, 이의 게놈 내로 통합된 상기 선별 마커를 갖는 상기 형질전환된 세포는 녹색으로 되어, 이를 선택하는 것이 가능할 수 있다. 이와 같은 프로세스는 형질전환된 세포를 선택하기 위해 필요한 시간을 감소시키는 것을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명의 일 구체예는 선별 마커로서 HPPD 억제제에 대해 내성이 있는 유전자를 가지는 식물 세포 내로 이종 유전자를 도입함으로써 식물 세포를 형질전환시키기 위한 방법으로 구성되며, 여기서 방법은 적절한 배지 내에 이종 유전자를 수용할 수 있는 수용성 식물 세포를 제조하고 배양하는 단계 및 적절한 양의 HPPD 억제제를 수용성 식물 세포의 적절한 배지 내로 도입하는 단계를 포함한다. 수용성 세포는 이후에 이종 유전자 및 선별 마커로 형질전환되며, 상기 이종 유전자를 포함하는 형질전환된 세포는 적절한 배지 및 그로부터 선택된 형질전환체에서 성장된다. 형질전환된 세포는 이후에 생식력이 있는 형질전환된 식물로 재생될 수 있다.

J. 식물 및 식물 부분

"식물"은 전체 식물, 식물 기관 (예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체 (propagules), 배아 및 동일한 것의 자손을 의도한다. 식물 세포는 분화되거나 분화되지 않은 (예를 들면, 캘러스, 현탁 배양 세포, 프로토플라스트 (protoplasts), 잎 세포, 뿌리 세포, 체관부 세포, 화분 (pollen))일 수 있다. 본 발명은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단자엽성 (monocots) 및 쌍자엽성 (dicots)을 포함하는 임의의 식물 종 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 위해 이용될 수 있다. 관심의 대상인 식물의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 옥수수, 수수 (메이즈), 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물 (crucifers), 후추, 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리 및 유채, 브라시카 종 (Brassica sp.), 알팔파, 호밀, 기장, 홍화, 땅콩, 고구마, 카사바, 커피, 코코넛, 파인사과, 감귤 나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 야채, 관상용 식물 (ornamentals) 및 침엽수 (conifers)를 포함한다.

야채는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 토마토, 상추, 그린 빈 (green beans), 리마 빈 (lima beans), 완두콩 및 오이, 칸탈루프 (cantaloupe) 및 머스크 멜론 (musk melon)과 같은 쿠르쿠미스 (Curcumis) 속의 야채를 포함한다. 관상용 식물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아잘레아 (azalea), 수국 (hydrangea), 하비스쿠스 (hibiscus), 장미, 튤립, 수선화, 페튜니아 (petunias), 카네이션, 포인세티아 (poinsettia) 및 국화 (chrysanthemum)를 포함한다. 예를 들면, 옥수수, 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물, 후추, 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 유채 등을 포함하는 농작물 또한 관심의 대상이다.

본 발명은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 옥수수, 벼, 보리, 오트, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인사과, 참마, 양파, 바나나, 코코넛 및 대추를 포함하는 단자엽 식물류의 임의의 구성원에 적합하다.

K. 식물 수율을 증가시키기 위한 방법

식물 수율을 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은, 본 발명의 HPPD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이를 식물 또는 식물 세포 내로 도입한 식물을 제공하는 단계, 필드에서 식물 또는 이의 종자를 성장시키는 단계, 및 상기 식물 또는 종자로부터 수확물을 생산하는 단계를 포함한다. 본원에 사용되는 식물의 "수율"이란 상기 식물에 의해 생산되는 바이오매스의 질 및/또는 양을 언급한다. "바이오매스 (biomass)"는 임의의 측정된 식물 산물을 의도한다. 바이오매스 생산의 증가는 측정된 식물 산물의 수율의 임의의 개선이다. 식물 수율을 증가시키는 것은 다수의 상업적인 응용성을 가진다. 예를 들면, 식물 잎 바이오매스를 증가시키는 것은 사람이나 동물 소비를 위한 잎줄기 야채의 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 잎 바이오매스를 증가시키는 것은 식물 유래의 약학적 또는 산업적 산물의 생산을 증가시키는데 이용될 수 있다. 수율의 증가는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 적어도 1%의 증가, 적어도 3%의 증가, 적어도 5%의 증가, 적어도 10%의 증가, 적어도 20%의 증가, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 포함하는 임의의 통계적으로 유의적인 증가를 포함할 수 있다.

특정 방법에 있어서, 본 발명의 HPPD 서열을 포함하는 식물은 유효 농도의 HPPD 억제 제초제, 예컨대 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)로 처리되며, 여기서 상기 제초제 적용은 향상된 식물 수율을 가져온다.

식물 또는 식물 부분에 제초제 내성을 부여하기 위한 방법도 제공된다. 이러한 방법에서, 본 발명의 HPPD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 식물 내로 도입되며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 발현이 HPPD 억제 제초제 내성을 가져온다. 이러한 방법 통해 생산된 식물은 유효 농도의 제초제 (예컨대 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들))로 처리될 수 있으며, 상기 제초제에 대해 증가된 내성을 나타낼 수 있다. 본 출원에서 제초제의 "유효 농도"는 상기 제초제에 대한 자연적 내성이 없거나 제공된 내성이 없는 식물 또는 식물 부분의 성장을 늦추거나 정지시키기에 충분한 양이다.

L. 필드에서 잡초를 방제하기 위한 방법

따라서 본 발명은 또한 원치 않는 식물을 방제하거나, 본 발명에 따른 HPPD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물의 경작에서 식물의 성장을 조절하기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 HPPD 억제 제초제, 예를 들면, 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류로부터 선택되는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제가 식물 (예를 들면, 단자엽 또는 쌍자엽 잡초와 같은 유해 식물이나 원치 않는 농작물), 종자 (예를 들면, 낟알, 종자 또는 싹을 갖는 새싹 부분이나 괴경 (tuber)과 같은 식물 번식체)에 또는 식물이 성장되는 지역 (예를 들면, 경작되는 지역)에 적용된다. 이와 관련하여, 유효 농도의 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들), 예를 들면, 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제가, 예를 들면, 예비 식재 (적합하다면 토양으로의 도입에 의해), 출현 전이나 출현 후에 적용될 수 있고, 작물이 자연 내성을 갖거나, 하나 이상의 다른 제초제 내성 이식유전자의 발현을 통해 내성으로 된 다른 제초제의 적용과 조합될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 제2004/0058427호 및 PCT 출원 공개 WO 98/20144를 참조하기 바란다. "유효 농도"는 HPPD 억제제-내성 식물 또는 식물 종자에 중대한 영향을 미치지 않고 잡초나 다른 형질전환되지 않은 식물의 성장 또는 분포를 제어하는 농도를 의도한다. 당업자라면 제초제의 적용이 많은 다른 형태를 취할 수 있고, 상기 종자 식재 및 성장 과정 이전의 많은 다른 시간에서 및/또는 전체적으로 일어날 수 있는 것이 이해될 것이다. "출현 전" 적용은 토양으로부터 식물이 가시적으로 발아하기 전에 관심 대상 지역 (예를 들면, 재배 필드나 지역)에 적용되는 제초제에 대해 언급된다. "출현 후" 적용은 토양으로부터 식물이 가시적으로 발아한 후 지역에 적용되는 제초제에 대해 언급된다. 일부 예에서, "출현 전" 및 "출현 후" 라는 용어는 관심 대상 지역 내의 잡초에 대해 사용되며, 일부 예에서 이러한 용어는 관심 대상 지역 내의 농작물에 대해 사용된다. 잡초에 사용되는 경우, 이러한 용어는 관심 대상 지역에 존재하거나 존재하는 것으로 여겨지는 특정한 유형의 잡초 또는 잡초의 종에 적용될 수 있다. 제초제의 "예비 식재 도입 (pre-plant incorporation)"은 식재 이전에 토양 내로의 화합물의 도입을 수반한다.

이에 따라, 본 발명은 본 발명의 HPPD 폴리펩티드를 포함하는 식물 또는 이의 종자를 필드에 식재하는 단계 및 상기 식물 또는 상기 식물을 둘러싼 지역에 유효 농도의 하나 이상의 HPPD 억제 제초제를 적용하는 단계를 포함하는, 필드내 잡초의 방제 방법을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물 (예를 들면, 대두, 목화, 옥수수 또는 밀 식물과 같은)로 식재된 필드는 식물의 식재 또는 종자 파종 전에 이속사플루톨 (IFT)과 같은 HPPD 억제 제초제로 처리될 수 있으며, 이는 필드 잡초가 상기 HPPD 억제 제초제에 의해 사멸되어 필드가 깨끗해 짐으로써 무경간 (no-till) 농법을 가능케 하고 이후 동일한 사전 처리 필드에 식물을 식재하거나 파종하는 것이 가능하다 (HPPD 억제 제초제를 사용한 소멸 적용). IFT의 잔류 활성도 또한 초기 성장 단계에서 잡초에 의해 발아되고 성장되는 식물을 경쟁으로부터 보호할 것이다. 식물이 특정한 크기를 갖고 잡초가 재출현하려는 경향이 있으면, 글루포시네이트나 글리포세이트 혹은 HPPD 억제 제초제나 글리포세이트와 같은 다른 제초제와 HPPD 억제 제초제의 혼합물은 이러한 식물이 상기 제초제에 대해 내성이 있는 때에 상기 식물의 상부에 출현 후 제초제로서 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 종자가 파종된 필드가 식물 츨현 전이지만 종자가 파종된 후에 IFT와 같은 HPPD 억제 제초제로 처리될 수 있으며 (상기 필드는 파종 이전에 다른 수단, 통상적으로 경운, 쟁기 경운 또는 파종상 (seed bed) 제조와 같은 종래의 기경 (tillage) 수행을 이용하여 잡초가 제거될 수 있다), 이 경우 잔류 활성이 상기 제초제로 사멸시켜 잡초가 없는 필드를 유지할 것이므로 발아되고 성장하는 식물은 잡초와의 경쟁이 없게 된다 (HPPD 억제 제초제의 출현 전 적용). 식물이 특정한 크기를 갖고 잡초가 다시 출현하려는 경향이 있으면, 글루포시네이트나 글리포세이트 혹은 HPPD 억제 제초제나 글리포세이트와 같은 다른 제초제와 HPPD 억제 제초제의 혼합물이 이러한 식물이 상기 제초제에 대해 내성이 있는 때에 상기 식물의 상부에 출현 후 제초제로서 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물은 파종된 종자로부터 발아된 식물의 상부 상에서 HPPD 억제 제초제로 처리될 수 있고, 이는 상기 HPPD 억제 제초제로 사멸시켜 잡초를 필드에서 제거하며, 이러한 적용은 함께 수행될 수 있고 (예를 들면, 분사 탱크 혼합으로), 이와 같은 식물이 상기 제초제에 대해 내성이 있는 때에 상기 식물의 상부 상에 출현 후 제초제로서 글리포세이트 또는 글루포시네이트로의 처리에 후속하거나 선행한다 (HPPD 억제 제초제 (글리포세이트를 가지거나 없는)의 출현 후 적용).

HPPD 억제 제초제로 방제될 수 있는 단자엽 및 쌍자엽 잡초의 개별적인 대표적인 예는 다음을 포함한다:

다음 속의 단자엽 유해 식물: 아에길로프 (Aegilops), 아그로피론 (Agropyron), 아그로스티스 (Agrostis), 알로페쿠루스 (Alopecurus), 아페라 (Apera), 아베나 (Avena), 브라키아리아 (Brachiaria), 브로무스 (Bromus), 센크루스 (Cenchrus), 코멜리나 (Commelina), 시노돈 (Cynodon), 시페루스 (Cyperus), 닥틸록테니움 (Dactyloctenium), 디기타리아 (Digitaria), 에키노클로아 (Echinochloa), 엘레오카리스 (Eleocharis), 엘류신 (Eleusine), 에라그로스티스 (Eragrostis), 에리오클로아 (Eriochloa), 페스투카 (Festuca), 핌브리스틸리스 (Fimbristylis), 헤테란세라 (Heteranthera), 임페라타 (Imperata), 이스카에뭄 (Ischaemum), 렙토클로아 (Leptochloa), 롤리움 (Lolium), 모노코리아 (Monochoria), 파니쿰 (Panicum), 파스팔룸 (Paspalum), 팔라리스 (Phalaris), 팔레움 (Phleum), 포아 (Poa), 롯보엘리아 (Rottboellia), 사기타리아 (Sagittaria), 스키르푸스 (Scirpus), 세타리아 (Setaria) 및 소르굼 (Sorghum);

다음 속의 쌍자엽 잡초: 아부틸론 (Abutilon), 아마란투스 (Amaranthus), 암브로시아 (Ambrosia), 아노다 (Anoda), 안테미스 (Anthemis), 아파네스 (Aphanes), 아르테미시아 (Artemisia), 아크리플렉스 (Atriplex), 벨리스 (Bellis), 비덴스 (Bidens), 캅셀라 (Capsella), 카르두스 (Carduus), 카시아 (Cassia), 센타우레아 (Centaurea), 체노포디움 (Chenopodium), 키르시움 (Cirsium), 콘볼불루스 (Convolvulus), 다투라 (Datura), 데스모디움 (Desmodium), 에멕스 (Emex), 에리시뭄 (Erysimum), 유포르비아 (Euphorbia), 갈레옵시스 (Galeopsis), 갈린소가 (Galinsoga), 갈리움 (Galium), 히비스쿠스 (Hibiscus), 이포모에아 (Ipomoea), 코치아 (Kochia), 라미움 (Lamium), 레피디움 (Lepidium), 린데르니아 (Lindernia), 마트리카리아 (Matricaria), 멘타 (Mentha), 메르쿠리알리스 (Mercurialis), 물루고 (Mullugo), 미오소티스 (Myosotis), 파파베르 (Papaver), 파르비티스 (Pharbitis), 플란타고 (Plantago), 폴리고눔 (Polygonum), 포르툴라카 (Portulaca), 라눈쿨루스 (Ranunculus), 라파누스 (Raphanus), 로립파 (Rorippa), 로탈라 (Rotala), 루멕스 (Rumex), 살솔라 (Salsola), 세네시오 (Senecio), 세스바니아 (Sesbania), 시다 (Sida), 시나피스 (Sinapis), 솔라눔 (Solanum), 손쿠스 (Sonchus), 스페노클레아 (Sphenoclea), 스텔라리아 (Stellaria), 타락사쿰 (Taraxacum), 탈라스피 (Thlaspi), 트리폴리움 (Trifolium), 유르티카 (Urtica), 베로니카 (Veronica), 비올라 (Viola) 및 산티움 (Xanthium).

이에 한정되는 것은 아니지만, 트리케톤 (바람직하게는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온), 디케토니트릴, 이속사졸 (바람직하게는 이속사플루톨), 히드록시피라졸 (바람직하게는 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트), N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드 (바람직하게는 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 2"로도 칭해짐), N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 (바람직하게는 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드; 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (이후 "Cmpd. 1"로도 칭해짐); 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론 부류의 HPPD 억제 제초제를 포함하여, 본 발명에 유용한 HPPD 억제 제초제는 우세한 생물학적 및/또는 물리화학적 변수에 따라 다양한 방식으로 제형될 수 있다. 가능한 제형의 예는, 수화제 (WP), 수용성 분말 (SP), 수용성 농축물, 유화성 (emulsifiable) 농축물 (EC), 수중유 및 유중수 에멀션과 같은 에멀션 (EW), 분사 가능한 용액, 현탁 농축물 (SC), 오일- 또는 수계의 분산제, 오일 혼합성 용액, 캡슐 현탁 (CS), 더스트 (DP), 종자분의 (seed-dressing) 제품, 토양 상 및 브로드캐스팅에 의한 적용을 위한 과립, 미립자의 형태인 과립 (GR), 분사 과립, 코팅된 과립 및 흡착 과립, 수분산성 과립 (WG), 수용성 과립 (SG), ULV 제형, 마이크로캡슐 및 왁스이다.

세 개별적인 유형의 제형이 대체적으로 알려져 있고, 예를 들면, Winnacker Kuchler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. London에 기재되어 있다.

비활성 물질, 계면활성제, 용매 및 다른 첨가제와 같은 필요한 제형 보조제 또한 알려져 있고, 예를 들면, Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schoenfeldt, "Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte" [Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986에 기재되어 있다.

이러한 제형에 기초하여, 예를 들면 즉석 혼합 또는 탱크 혼합의 형태로, 살충제, 살비제, 제초제, 살진균제 등과 같은 다른 농약상 활성 물질 및 완화제, 비료 및/또는 성장 조절제와 조합하여 제조하는 것도 가능하다.

M. 본 발명의 유전자를 다른 식물 내로 도입하는 방법

또한, 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 다른 식물 내로 도입하는 방법이 본원에 제공된다. 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편은 반복 선택, 여교배 (backcrossing), 계통 육종 (pedigree breeding), 계통 (line) 선별, 집단 선별 (mass selection), 돌연변이 육종 및/또는 유전자 마커 증강 선택 (genetic marker enhanced selection)에 의해 제2 식물 내로 도입될 수 있다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 F1 자손 식물을 생산하도록 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 식물을 제2 식물과 교배시키는 단계 및 HPPD 억제 제초제에 대해 내성이 있거나 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 F1 자손 식물을 선별하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 역교배 (backcross) 자손 식물을 생산하도록 상기 선별된 자손 식물을 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 제1 식물과 교배시키는 단계 및 HPPD 억제 제초제에 대해 내성이 있거나 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 여교배 자손 식물을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. HPPD 억제 제초제 내성을 평가하기 위한 방법은 본원의 다른 곳에서 제공된다. 상기 방법은 HPPD 억제 제초제에 대해 내성이 있거나 본 발명의 HPPD 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선별된 제2 또는 보다 고차의 여교배 자손 식물을 생산하도록 이러한 단계를 1회 이상 연속하여 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다.

원하는 표현형을 위해 식물의 선별을 수반하는 임의의 육종 방법이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, F1 식물은 격리되는 F2 세대를 생산하도록 자가-수분될 수 있다. 개개의 식물은 이후에 상기 형질이 동종접합성이거나 육종 집단 내에 고정될 때까지 각 세대 (F3, F4, F5 등)에서 상기 원하는 표현형 (예를 들면, HPPD 억제 제초제 내성)을 나타내도록 선별될 수 있다.

제2 식물은 제초제 내성, 곤충 내성, 가뭄 내성, 선충 방제, 물 이용 효율, 질소 이용 효율, 개선된 영양가, 질병 저항, 향상된 광합성, 개선된 섬유질, 스트레스 내성, 개선된 재생 등과 같은 원하는 형질을 갖는 식물일 수 있다. 제2 식물은 본원의 다른 곳에서 기술되는 바와 같이 엘리트 사건일 수 있다.

다양한 구체예에서, 식물 부분 (전체 식물, 식물 기관 (예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배아 등)이 결과 교배로부터 수확될 수 있고 다운스트림 사용 (예컨대 음식, 사료, 바이오연료, 오일, 가루, 식사 등)을 위해 증식도거나 수집될 수 있다.

N. 식물 산물을 수득하는 방법

본 발명은 또한 상품성 산물 (commodity product)을 얻기 위하여 본 발명의 HPPD 서열을 포함하는 작물로부터 곡물을 수확하고 및/또는 분쇄하는 단계를 포함하는, 상품성 산물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 농경적으로 및 상업적으로 중요한 제품 및/또는 물질의 조성물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 동물 사료, 상품 및 사람이 소비하기 위한 음식으로서 사용되도록 의도되거나, 또는 사람의 소비를 위해 의도된 조성물과 상품에서의 사용을 위해 의도된 식물 산물과 부산물, 특히 이러한 곡물/종자로부터 생산된 (반-) 가공 제품을 포함하는 실활 종자/곡물 제품을 포함하며, 여기서 상기 산물은 전체 또는 가공 종자 또는 곡물, 동물 사료, 옥수수 또는 콩 미일 (meal), 옥수수나 콩 (soy) 가루, 옥수수, 옥수수 전분, 대두 미일, 콩 가루, 플레이크 (flakes), 콩 단백질 농축물, 콩 단백질 단리물, 조직화된 콩 단백질 농축물, 화장품, 모발 관리 제품, 콩 너트 버터, 낫또 (natto), 템페 (tempeh), 가수분해된 콩 단백질, 휩핑 토핑 (whipped topping), 쇼트닝 (shortening), 레시틴 (lecithin), 식용 전 대두 (날것, 볶은 것 또는 에다마메 (edamame)로), 콩 요구르트, 콩 치즈, 두부 (tofu), 유부 (yuba)이거나 이를 포함할 뿐만 아니라, 조리, 도정, 찐, 구운 또는 데친 곡물 등도 이러한 산물 및 물질의 조성물이 상기 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 식물에 대해 진단된 본원에 기재된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 검출 가능한 양으로 함유한다면 본 발명의 범주에 속하는 것으로 의도된다.

다음 실험예는 제한을 위해서가 아니라 예시를 위하여 제공된다.

실험예

개요

실시예 1: 부위 지정 돌연변이유발에 의한 돌연변이화 HPPD 폴리펩티드의 생성

실시예 2: 재조합 야생형 및 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 클로닝, 발현 및 정제

실시예 3: 개선된 HPPD 억제 제초제 내성을 갖는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 분석하기 위한 HPPD 효소 분석

실시예 4: HPPD 폴리펩티드 내의 잔기 교환에 의해 매개되는 제초제 내성의 개선

실시예 5: HPPD 억제 제초제에 내성인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 시험하기 위한 갈색 색상 분석

실시예 6: T0 대두 식물의 대두 형질 전환 및 내성

실시예 7: 목화 T0 공장 확립 및 선별

실시예 8: 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 옥수수 식물 세포의 형질 전환

실시예 9: T1 대두 식물의 HPPD 억제 제초제에 대한 내성/필드 시행

실시예 1. 부위 지정 돌연변이유발에 의한 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 생성

서열 번호 1에 상응하는 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 WO2009/144079에 기재된 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) HPPD 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 109)을 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, WO2014/043435에 기술된 바와 같이 클로닝하였다. 서열 번호 1에 상응하는 재조합 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 야생형 PfHPPD 폴리펩티드의 서열 인코딩 핵산의 하나 이상의 돌연변이와 후속 부위 포화 돌연변이유발, 부위 지정 돌연변이유발 및 조합 변이를 당업계에 잘 알려진 표준 PCR-기반 기술 (WO2014/043435에 마찬가지로 기재됨)을 사용하여 수행하였다. 설계 및 합성된 모든 돌연변이 클론을 플라스미드 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 하기 표 2는 예시적인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (서열 번호 2 - 서열 번호 108)를 요약한 것이다.

명확하게 하기 위해, 서열 번호 2 내지 서열 번호 108의 각 아미노산 위치에서의 빈 셀은 서열 번호 1에 상응하는 아미노산과 동일하게 정의되며, 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에서 교환만을 표시하였다. 여기에 나타낸 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 제한의 의도가 아닌 설명의 예이다.

실시예 2: 재조합 야생형 및 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 클로닝 , 발현 및 정제

재조합 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 야생형 및 돌연변이 HPPD의 서열을 인코딩하는 생성된 모든 핵산을 당업계에 공지된 방법 (Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY)을 사용하여 클로닝하고, 생성하고, 정제하였다. 생성된 모든 서열 인코딩 핵산을 WO2014/043435에 기술된 바와 같이 N-말단 His-태그 (아미노산 서열 M1-A2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-을 인코딩하는)로 융합된 pSE420(R1)NX로 클로닝하고, 대장균 균주 BL21 (DE3) (New Engl and Biolabs, Frankfurt, Germany)에서 발현시켰다. 명확하게 하기 위해, 본 발명에서 서열 번호 2 내지 서열 번호 108에 상응하는 표 1 내지 표 5 및 표 7의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드로부터 각각의 아미노산 치환을 가지는 기술된 모든 위치는 서열 번호 1에 상응하는 N-말단 His-태그가 없는 본래의 야생형 HPPD 아미노산 서열을 가리킨다.

정제된 HPPD 폴리펩티드 샘플의 생성을 위해, 세포를 140 rpm의 50 ml 진탕 플라스크 내 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 5 ml LB 배지에서 3 시간동안 37 ℃에서 증식시켰다. 이 시동기 배양액 1 ml를 발현 배양을 위한 접종물로 사용하였다. 세포를 120 rpm 500 ml 진탕 플라스크 내 100 μg/ml 암피실린 및 150 mM Hepes (Merck, Darmstadt, Germany)를 함유한 100 ml LB 배지에서 약 3 시간동안 37 ℃에서 증식시켰다. 약 0.6의 OD600에서, IPTG (Roth, Karlsruhe, Germany)를 0.4 mM의 농도로 첨가하였다. 37 ℃에서 60 분간 더 증식시킨 후, 온도를 28 ℃로 낮추고 140 rpm에서 18 시간 더 계속 증식시켰다. 세포를 50 ml 팔콘 튜브 (Falcon tube)에서 30 분동안 4 ℃, 3200 g으로 원심분리하여 수확하고, 세포 펠릿을 -80 ℃에서 보관하였다. 세포를 용해시키고, his-태그 단백질을 사용된 Ni-NTA 패스트 스타트 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)의 제조자 프로토콜에 따라 수율 증가를 위해 다음과 같이 개작하여 정제하였다: 50 ml 배양액으로부터의 세포를 4 ml 용해시키고, 18000 g에서 15 분동안 원심분리하여 용해물 상등액을 생성하였다. NiNTA Superflow (Qiagen, Hilden, Germany)를 각각 1 ml씩 첨가하여 컬럼 내 매트릭스 양을 증가시키고, 20 mM 트리스 (pH 7.6) (Merck, Darmstadt, Germany)로 광범위하게 재완충시켰다. 용해물 상등액을 적용하고 His-태그 단백질을 4 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션하여 Ni-NTA 매트릭스에 결합시켰다.

생성된 단백질 샘플을 Zeba™ 스핀 탈염 칼럼, 7K MWCO, 10 mL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 20 mM Tris, 20% 글리세롤 (pH 7.8) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 재완충시키고, Abs280 (NANODROP 8000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 및 SDS-PAGE로 단백질 농도 및 순도를 분석하였다. 정제된 단백질의 농도는 일반적으로 추정 순도 약 90%로 0.6 - 4.6 mg/ml의 범위였다.

억제 분석에서 잔류 활성의 측정을 위한 마이크로 역가 플레이트 (MTP)에서 조 HPPD 폴리펩티드 추출물의 생성을 위해, 세포를 37 ℃의 가습 배양기에서 약 18 시간동안 인큐베이션한 표준 96 웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 내 1% 글루코스 (Merck, Darmstadt, Germany) 및 100 μg/ml 암피실린을 함유한 40 또는 150 ㎕ LB 배지에서 증식시켰다.

이 시동기 배양액 30 ㎕를 96 웰 플레이트 (2 ml 깊이 웰; HJ Bioanalytik, Erkelenz, Germany)에서 발현 배양을 위한 접종물로서 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 150 mM Hepes (Merck, Darmstadt, Germany)를 함유한 600 ㎕ LB 배지에 첨가하였다. 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하고, 세포를 750 rpm의 플레이트 진탕기 상에서 37 ℃에서 5 시간동안 인큐베이션하였다. 최종 농도 1 mM로 IPTG를 첨가한 다음 750 rpm의 플레이트 진탕기 상에서 30 ℃에서 약 18 시간동안 추가로 밀봉 인큐베이션하여 발현을 유도하였다.

세포를 4 ℃에서 2500 g으로 15 분동안 원심분리하여 수거하고, 상등액을 버렸다. 세포 펠릿을 -80 ℃에서 보관하고, 재현탁된 세포를 4 ℃에서 1000 rpm으로 30 분동안 인큐베이션하여 1:25000 희석 BNase® (Qiagen, Hilden, Germany)와 함께 140 mM 트리스 (pH 7.8) 중 250 ㎕ 1x BugBuster® (Merck, Darmstadt, Germany)에 용해시켰다. 용해물을 4 ℃에서 2500 g으로 15 분동안 원심분리하여 정화시키고, 150 ㎕의 상등액을 표준 96 웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)로 옮겨 사중으로 후속 시험을 실시하였다.

실시예 3: 개선된 HPPD 억제 제초제 내성을 갖는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 분석하기 위한 HPPD 효소 분석

커플링된 HPPD 활성 분석을 사용하여 HPPD 억제제의 부재 또는 존재하에서 HPPD 폴리펩티드의 활성을 측정하였다 (도 1).

HPP로부터 HPPD에 의해 형성된 호모겐티세이트 (HGA)가 모든 분석에서 과량으로 균일하게 적용된 제2 효소 호모겐티세이트 디옥시게나제 (HGD)에 의해 흡수 분자 말레일아세토아세테이트 (MAA)로 직접 전환된다는 점에서, 잔류 활성의 결정을 위해, 측정된 기질 전환의 겉보기 반응 속도 상수 (k_app)를 결합 분석에서 320 nm에서의 흡광도의 동태 변화로서 측정하였다 (도 1 참조). 측정은 플레이트 판독기 (Tecan infinite M1000 또는 M1000PRO, Tecan, Maennedorf, Switzerland)에 의해 384 마이크로 역가 플레이트 (Greiner Bio-on GmbH, Frickenhausen, Germany)에서 수행하였다. 효소 활성의 k_cat/k_M 비는 겉보기 반응 속도 상수 k_app에 비례하며 k_cat/k_M *[E] ([E] = 효소 농도)에 비례한다. 경쟁적 억제제는 k_M의 명백한 증가를 나타내며 따라서 비포화 기질 농도에서 k_app의 역 감소를 나타낸다. 억제제의 존재 및 부재하에서의 k_app 측정은 미정제 또는 정제된 동일 효소 샘플, 따라서 동일 효소 농도를 사용하여 수행되었으므로 효소 농도는 잔류 활성의 계산으로부터 배제되고, 양 k_app의 비율은 직접 억제로 의한 k_M 변화를 나타낸다. 주목할 만하게, 이 개념은 "경쟁적 억제" 방식으로 상호작용하는 효소/억제제 쌍에 적용되며, 아마도 본원에 기술된 거의 모든 폴리펩티드 변이체 및 억제제에 맞을 것이지만, 비가역적으로 억제되는 야생형 폴리펩티드에 대해서는 맞지 않을 것이다 (비교를 위해 WO2014/043435, 도 2 및 도 3 참조). 결과적으로, "경쟁적 억제"라고 언급되는 야생형 HPPD 폴리펩티드의 잔류 활성 및 ki 값은 정확하게 계산될 수 없지만, 그렇더라도 설명을 목적으로 비가역적 억제가 일어나기 전에 신호의 초기 변화로 계산된 야생형 HPPD 폴리펩티드에 대한 비확립 값을 표 3에 나타내었다.

원 HPPD 폴리펩티드 샘플에서 잔류 활성의 결정을 위해 사용된 분석 용액은 200 mM 인산나트륨 (Merck, Darmstadt, Germany, pH 7.0), 5 mM MgCl₂ (Merck, Darmstadt, Germany), 20 mM 아스코베이트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 1 mM DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 0.1% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 40 μM FeSO₄ (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 약 8 mg/ml의 정제된 HGD 및 DMSO 중 1M 스톡 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)으로부터의 저 또는 고농도 기질 HPP (100 또는 400 μM)로 구성되었고, 얼음 상에서 20 분동안 평형화되었다. 모든 HPPD 폴리펩티드 샘플에 대해 두 분석을 사중으로 수행하였으며, 이에 따라 5 ㎕의 HPPD 폴리펩티드 샘플을 먼저 참조 및 억제 분석에 있어 각각 5 ㎕의 완충액 (1x BugBuster^®; Merck, Darmstadt, Germany) (140 mM 트리스, pH 7.8 중에서 1:25,000으로 희석한 BNase^®사용, Qiagen, Hilden, Germany)과 함께) 또는 DMSO 중 0.1M 스톡 용액으로부터 동일한 완충액에서 희석된 5 ㎕ 억제제 (HPPD 폴리펩티드/억제제 샘플에서 15, 50 및 60 μM을 생성하는 30, 100 또는 120 μM)와 혼합하고, 이어 10 ㎕ 분석 용액과 혼합하였다. 320 nm에서의 흡광도 변화를 30 분동안 1 분 간격으로 추적하였다. 운동 반응의 초기 단계에, 일반적으로 측정 첫 5 내지 10 분동안 경시 신호 기울기로 k_app 값을 계산하였다 (도 3 참조). 또한, 계산된 잔류 활성에 따라, 30 분의 시간틀에서 총 전환율, 즉 절대 신호 변화를 교체율의 척도로 모니터링하고, 억제제 존재하의 신호 변화를 억제제 부재하의 참조 샘플의 신호 변화로 나누어 잔류 교체율을 계산하였다.

ki 값의 결정에 사용된 분석 용액은 시험된 네 가지 억제제 농도 각각에 대해 6 가지 상이한 농도 (0 - 1350 μM)의 HPP 기질을 포함하는 동일한 방식으로 구성되었다. 억제제를 140 mM 트리스, 0.05% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)로 희석하고, 동적 데이터를 생성하기 위해 각각의 HPPD 폴리펩티드/억제제 쌍에 대해 채택된 농도로 적용하였다 (도 4a-d); 일반적으로, HPPD 폴리펩티드/억제제 샘플에서 이들의 농도는 0 내지 0.0012M 범위였다.

실시예 4: HPPD 폴리펩티드의 잔기 교환에 의해 이뤄지는 제초제 내성의 개선

돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 내성을 이용가능한 상이한 화학 부류의 HPPD 억제 제초제 (트리케톤, 이속사졸, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드, 또는 N-(테트라졸-5-일)-아릴카복사미드)에 대해 결정되었을 때, 본 발명의 일부 새로운 구체예는, 본 발명의 서열 번호 2를 예로 들어 참조 야생형 HPPD (서열 번호 1)에 비해 현저하게 개선되었을 뿐만 아니라 예기치 않게 (예를 들어, WO2014/043435에 개시된 것과 같은) 선행 돌연변이 HPPD 폴리펩티드의 것보다 우수하다는 것이 명백해졌다.

표 3에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)는 위치 335, 336, 339 및 340에서 잔기 교환을 함유한다. 334 (E => P), 336 (G => D/H), 337 (N => S)을 포함하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에 기초하여, 위치 264, 268, 270, 330, 340 및/또는 345에서 추가의 잔기 교환 도입은 다양한 화학적 부류에 속하는 다중 적용된 HPPD 억제제에 관해서 상당히 향상된 내성을 보이는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 생성하였다 (표 3).

따라서, 본 발명자들은 335 (글루탐산 => 프롤린), 336 (글리신 => 아스파르트산/히스티딘), 337 (아스파라긴 => 세린)에서 조합 잔기 교환이 있고, 임의로 위치 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338, 339, 340, 344 및/또는 345에서 교환을 추가로 포함하는 새로운 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 생성하여 평가하였고 (표 3, 4 및 5), 개선된 잔류 활성, 더 높은 잔류 교체율, 더 높은 ki 값 및 이에 따라 유의적으로 높은 제초제 내성을 나타내었다. 시험한 HPPD 억제 제초제에 따라, 본 분석에 사용된 HPPD 폴리펩티드에 관한 개선 수준은 서열 번호 2와 비교하여 1.5 배에서 최대 110 배까지의 수준으로 차이날 수 있다 (표 4).

상이한 HPPD 억제 제초제 화학 부류에 대한 경시적 억제 분석에 따라 서열 번호 1에 상응하는 야생형 HPPD 폴리펩티드의 느리고 단단한 결합 억제제 특성과 대조적으로, HPPD 억제 제초제는 새로운 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에 대해 가역적인 억제제인 것으로 나타났다 (도 2 및 3 참조). 이들 거동은 농작물에서 다양한 HPPD 억제 제초제에 대한 내성에 관해 더 좋고 다양한 가능성을 제공한다.

HPPD 억제 제초제의 존재하에 높은 잔류 활성과 관련하여 표 1에, 명시된 위치 및 잔기 변화가 본 발명의 서열 번호 1에 상응하는 HPPD 폴리펩티드의 아미노산 위치에 대해 표시되어 있고 중요한 것으로 나타났다.

(a) Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드), (b) Cmpd. 2 (2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드), (c) 메소트리온 (MST), 및 (d) 디케토니트릴 (DKN)의 존재 및 부재하에서 k_app 및 신호 총 변화를 각각 측정하여 실시예 3에 따라 잔류 활성 및 잔류 교체율을 결정하였다. 각각의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에 대해, HPPD 억제 제초제 부재하에서의 k_app 및 신호 총 변화를 제초제 존재하에서의 k_app 및 신호 총 변화의 정규화에 사용하였다. 각각의 표 3a), 3b), 3c) 및 3d)에 요약된 결과의 "%-값"은 5% 평균 표준 편차를 갖는 두 독립 실험의 평균치이다. 15 μM 농도의 Cmpd. 1 및 Cmpd. 2 및 60 μM 농도의 다른 2종 제초제 (DKN, MST)를 사용하여 높은 기질 농도에서 반응을 수행하였다. 명확하게 하기 위해, 서열 번호 2 내지 서열 번호 108에서 각 아미노산 위치에서의 빈 셀은 서열 번호 1에 상응하는 아미노산과 동일하게 정의되며, HPPD 폴리펩티드 변이체에서 교환만을 표시하였다. 약어 "n.i."는 주어진 조건하에서 억제가 관찰되지 않았음을 의미하며, 즉 억제제 존재하에서 k_app 또는 신호 총 변화는 억제제 부재하의 대응 값에 비해 감소하지 않았다.

서열 번호 1에 따른 HPPD 폴리펩티드에 비해 위치 335, 336, 337, 340 및 345에서 아미노산 교환을 갖는 서열 번호 10 및 서열 번호 24에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 시험한 다양한 HPPD 억제제의 존재하에서 잔류 활성 및 잔류 교체율과 관련하여 유의적인 개선을 나타내었다 (표 3a-d). 도시된 서열 번호 10의 제초제 내성은 4종의 도시된 모든 상이한 제초제 부류에 걸쳐서 야생형 HPPD 폴리펩티드 (서열 번호 1) 뿐만 아니라, 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술의 (WO2014/043435) 돌연변이에 비해 개선된 것으로 나타났다.

개시된 아미노산 위치 268 및 270에서 잔기 교환을 갖는 변이체에서 HPPD 억제제 내성의 추가 개선이 명백하다.

서열 번호 24부터 시작하여 서열 번호 31은 명시된 위치 268 및 270에서만 다르다. 이러한 변화는 HPPD 억제제 Cmpd. 1 및 MST의 존재하에서 잔류 교체율을 현저히 증가시키고 (표 3a 및 3c), Cmpd. 2 (표 3b) 및 DKN (표 3d)의 존재하에서 높은 잔류 교체율을 유지하고 이미 이루었다. 이들 결과는 또한 HPPD 폴리펩티드 (서열 번호 1) 및 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)와 비교하여 서열 번호 31의 유의적으로 향상된 ki 값(표 4)으로 입증된다.

서열 번호 8에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드로부터 시작하여, 아미노산 330의 추가 변화 (서열 번호 12 참조)는 HPPD 억제제 내성이 더욱 개선됨을 보여준다 (표 3 참조).

서열 번호 12에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드로부터 시작하여, 아미노산 위치 264의 추가 변화 (서열 번호 18 참조)는 Cmpd. 1 및 Cmpd. 2에 대한 HPPD 억제제 내성이 더욱 유의적으로 개선되었음을 보여준다 (표 3a, 3b 참조).

서열 번호 10에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 상단의 네 위치 264, 268, 270, 330에서 상기 언급한 모든 교환을 도입하여 서열 번호 19에 이르면, Cmpd. 1에 대해 68% 및 79%의 잔류 활성 및 교체율과 함께 표 3a에 모든 명시된 폴리펩티드에서 가장 강한 내성이 검출되었으며, 이는 개시된 아미노산 위치에서 조합 잔기 교환의 중요성을 입증하는 것이다. 또한, 서열 번호 19에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 서열 번호 2와 비교하여 Cmpd. 1 및 Cmpd. 2에 대해 개선된 ki 값을 가졌다 (표 4).

데이터는 실시예 3에 따라서 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드), Cmpd. 2 (2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드), 및 메소트리온 (MST)의 농도를 증가시키면서 초기 반응 속도를 측정하여 얻어졌다. 일반적으로, 6개의 상이한 농도의 HPP 기질 (0 내지 1350 μM) 및 4개의 상이한 농도의 각각의 억제제가 적용되었다 (도 4 참조). 억제제 농도는 동적 데이터를 생성하기 위해 각각의 HPPD 폴리펩티드/억제제 쌍에 대해 채택되었으며, 즉, 보다 낮은 내성을 갖는 변이체는 더 낮은 억제제 농도 범위에서 분석되었고, 최대 내성을 갖는 변이체에 대해 최대 1200 μM의 농도가 사용되었다. GraphPad Prism (Windows용 버전 6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA)을 데이터 분석 및 경쟁 억제 모드에 따른 제한을 적용하는 반응 속도 상수의 피팅에 사용하였다. 명백한 특이 치가 발생하거나, 매우 높은 기질 농도에서 얻어진 활성이 경쟁 저해 모드의 근간을 이루는 수학적 계산을 따르지 않았다면, 각각의 값은 피팅으로부터 배제되었다.

이미 유의적으로 개선된 두 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 서열 번호 17 및 서열 번호 19를 기초로 생성된 체계적 변이체의 일부 결과가 표 5에 개략적으로 제시되어 있다.

서열 번호 17 및 서열 번호 19는 두 아미노산 위치에서 상이하고, 서열 번호 17은 서열 번호 2에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드와 비교하여 Cmpd. 1에 대해 약 20 배, 서열 번호 19는 약 30 배 증가된 ki를 나타낸다 (표 4 참조).

서열 번호 17에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 위치 268, 270, 335, 336, 337, 340, 및 345에서 잔기 교환을 가지며, 29% 잔류 활성을 나타내고, 기질 교체율은 50 μM Cmpd. 1의 존재하에 46% 밖에 감소되지 않는다. 위치 268, 270, 340, 345에서 (서열 번호 1에 따른) 각각의 야생형 잔기로의 잔기 복귀는 각각 19%, 24%, 17% 및 20% 잔류 활성에 대한 내성 저하로 수행되며 (표 5; 각각 서열 번호 71, 서열 번호 63, 서열 번호 81, 서열 번호 88), 이들 위치 및 돌연변이의 유리한 특성을 강조한다. 따라서, 각각의 야생형 잔기 이소류신에 대한 서열 번호 19의 위치 345에서 잔기 발린의 복귀는 67%에서 57%로의 잔류 활성 저하로 수행된다 (표 5; 서열 번호 93).

한편, 위치 204, 213, 264, 310, 315, 330, 331, 338, 339 또는 344에서 서열 번호 17에 추가의 단일 잔기 교환을 도입하면, 예를 들어 A204M (서열 번호 40), R213L (서열 번호 44), M264K (서열 번호 67), Q310K (서열 번호 65), T315R (서열 번호 45), D330V (서열 번호 38), D331I (서열 번호 49), F338V (서열 번호 53), K339E (서열 번호 55) 및 S344P (서열 번호 58)에서와 같이, 적어도 하나의 변이체에서 모든 위치에 대해 38%를 초과한 추가의 현저히 증가된 잔류 활성을 일으켰다.

요약하면, HPPD 폴리펩티드에서 돌연변이 335 (글루탐산 (E) => 프롤린 (P)), 336 (글리신 (G) => 아스파르트산 (D)/히스티딘 (H)), 및 337 (아스파라긴 (N) => 세린 (S)) 이상의 추가의 특이적인 잔기 교환은 제초제 내성의 개선을 제공하고 HPPD 억제 제초제에 대한 내성 향상을 부여하는 명시된 위치 204, 213, 264, 268, 270, 310, 315, 330, 331, 338의 추가적인 중요성을 입증한다 (표 5). 마지막으로, 표 4 (예를 들어, 서열 번호 99, 100, 105 및 107)에서 입증된 바와 같이, 이들 명시된 위치들의 조합은 상이한 HPPD 억제제 부류에 걸쳐 ki 개선을 유도하였으며, 즉 야생형 HPPD 폴리펩티드 (서열 번호 1) 및 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)와 비교하여 Cmpd. 1에 대해 100 배 초과, Cmpd. 2에 대해 최대 90 배까지, 동시에 메소트리온 (MST)에 비해 최대 약 7 배까지의 개선을 보였다

명확하게 하기 위해, 서열 번호 2 내지 서열 번호 108의 각 아미노산 위치에서의 빈 셀은 서열 번호 1에 상응하는 아미노산과 동일하게 정의되며, 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에서 교환만을 표시하였다.

낮은 기질 농도에서 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드) (50 μM)의 존재 및 부재하에 k_app 및 신호 총 변화를 각각 측정하여 실시예 3에 따라 잔류 활성 및 잔류 교체율을 결정하였다. 각각의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드에 대해, HPPD 억제 제초제 부재하에서의 k_app 및 신호 총 변화를 PPD 억제 제초제 존재하에서의 k_app 및 신호 총 변화의 정규화에 사용하였으며, 생성된 "%-값"을 요약하였다.

실시예 5: HPPD 억제 제초제에 내성인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 시험하기 위한 갈색 색상 분석

돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 갈색 색상 분석을 사용하여 분석하였다 (WO2014/043435). LB-한천, 발현 벡터 pSE420(RI)NX (WO2014/043435)용 선택 배지, 5 mM 티로신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 42 mM 숙시네이트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 및 6가지 상이한 농도의 HPPD 억제 제초제 Cmpd. 1 (0 - 500 μM)을 함유하는 고체 배지에 본 발명에 따른 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 발현하는 박테리아 세포를 스포팅함으로써 96 웰 포맷으로 상기 세포의 HPPD 억제제 내성을 검정하였다.

길색 색상 분석에서, 각각의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 중 하나를 발현하는 대장균 (E. coli) 세포의 하룻밤 배양액을 1의 OD600으로 희석하고, 10 ㎕ 추출물을 0, 25, 50, 100, 250, 또는 500 μM의 Cmpd. 1을 함유하는 플레이트상에 삼중으로 스폿팅하였다. 플레이트를 기공 테이프로 덮고, 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 24 시간 후, 세포를 실온에서 암소에 보관하고, 7 일 후에 갈색 색소 형성을 육안으로 기록하였다. HPPD 억제 제초제의 존재 시 이 색소 형성은 억제되고 HPPD 억제 제초제 내성 HPPD 폴리펩티드가 발현되고 활성화되지 않는 한 한천 플레이트의 색은 변하지 않을 것이다. 등급 "+++"는 LB 한천 플레이트에서 억제제 부재하에 각각의 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 중 하나를 발현하는 대장균 세포에서 볼 수 있는 것으로 암갈색 색상을 의미한다. "++" 및 "+"는 각각 중간 및 밝은 갈색 색상을 나타내고, "0"은 LB 한천 플레이트에서 갈색 색상 현상이 검출되지 않았음을 의미한다.

표 6에 요약된 예시적인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 본 발명에서 서열 번호 1에 상응하는 HPPD 폴리펩티드와 비교하여 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드에 대해 향상된 내성을 나타내었다. 이미 25 μM Cmpd. 1의 농도에서, HPPD 폴리펩티드를 발현하는 대장균 세포 (서열 번호 1에 상응)는 어떤 갈색 색소화도 일으키지 않으며, 몇몇 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 암색 내지 중간 갈색 색소화를 나타낸다.

본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)는 250 μM Cmpd. 1에서 약간의 갈색 색소화만을 전개하였고, 500 μM의 Cmpd. 1에서 그의 갈색 색소화를 잃었으며, 이는 세포에서 발현된 HPPD 폴리펩티드의 완전한 억제를 설명한다. 이에 비해, 서열 번호 31, 32, 96 및 특히 서열 번호 104를 갖는 표 6에 나타낸 몇몇 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 25, 50, 100, 250 및 심지어 500 μM의 Cmpd. 1의 존재하에서 더 강한 갈색 색상을 나타낸다.

추가 실험에서, 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 비색 갈색 색상 분석 (예를 들어, US6,768,044에 기재된 바와 같이)의 원리를 이용하여 분석하였다. 본 발명에 따른 HPPD 폴리펩티드를 발현하는 박테리아 세포를 96 웰 플레이트 포맷 (Nunc® 96 DeepWell™ 플레이트, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에서 개선된 HPPD 억제 제초제 내성을 갖는 HPPD 폴리펩티드에 대해 검정하였다.

대장균을 발현 벡터 pSE420(RI)NX (WO2014/043435)용 선별 시약 및 5 mM 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 함유하는 액체 LB 배지 (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany)에서 HPPD 억제 제초제, 예를 들어 Cmpd. 1 (1000 μM)의 존재 또는 부재하에 중식시켰다. 본 발명에 따른 각각의 HPPD 폴리펩티드 중 하나를 발현하는 대장균 배양액의 하룻밤 배양액을 최종 부피 500 μL에서 0.3-0.5의 OD600으로 조정하고, 30 ℃에서 인큐베이션하였다. Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)의 존재 및 부재하에 갈색 색상 형성 (BCF)을 측정하여 잔류 갈색 색상 형성을 결정하였다. 이에 따라서, 96 시간 후 배양액을 원심분리하고, 배양 상등액을 사용하여 440 nm에서 가용성 갈색 색소 형성의 광학 밀도 (OD_440nm)를 측정하였다.

표 7에 요약된 예시적인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드는 본 발명에서 서열 번호 1에 상응하는 HPPD 폴리펩티드 및 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)와 비교하여 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드에 대해 향상된 내성을 나타내었다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 상응하는 두 HPPD 폴리펩티드는 모두 HPPD 억제제의 존재하에서 실질적인 갈색 색소화를 나타내지 않았다. 몇몇 돌연변이 HPPD 단백질은 중간 내지 암 갈색의 색소화를 보였다. 각각의 표 7에 요약된 결과의 "%-값"은 5% 평균 표준 편차를 갖는 적어도 두 독립 실험의 평균치이다.

실시예 6: 대두 형질전환 및 TO 대두 식물의 내성

당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 본질적으로 Paz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206에 기재된 방법을 사용하는 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환 대두 반-종자 외식편을 사용하여 기술된 방법에 의해 대두 형질전환을 수행하였다. HPPD 억제 제초제인 "템보트리온"을 선별 마커로서 사용하여 형질전환체를 식별했다. 녹색 새싹의 외관을 관찰하고, HPPD 억제 제초제인 템보트리온에 대한 내성 지표로서 기록하였다. 내성이 있는 트랜스제닉 새싹은 HPPD 억제 제초제인 템보트리온으로 처리되지 않은 야생형 대두 새싹과 비슷한 정상적인 녹색화를 보였지만, 반면에 동일한 양의 HPPD 억제 제초제인 템보트리온으로 처리된 야생형 대두 새싹은 완전히 표백되었다. 이는 각각의 HPPD 폴리펩티드의 존재가 템보트리온과 같은 HPPD 억제제 제초제에 대한 내성을 가능하게 해준다는 것을 시사했다.

내성이 있는 녹색 새싹을 발근 (rooting) 배지로 옮기거나 접목했다. 뿌리를 내린 묘목을 기후순응 기간 후에 온실로 옮겼다. 그 후 이식유전자를 함유하는 식물에 HPPD 억제 제초제, 예를 들어 메소트리온을 300-600 g AI/ha의 적용율로, 또는 황산암모늄 메틸 에스테르 유채씨유를 보충한 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)을 150g-300g AI/ha의 적용율로 분무하였다. 적용하고 5-10 일 후에, 제초제의 적용으로 인한 증상을 평가하고, 동일한 조건하의 야생형 식물에서 관찰된 증상과 비교하였다.

예를 들어, 본 발명의 HPPD 억제 내성 HPPD 폴리펩티드를 포함하는 "식물 발현 카세트"를 갖는 T0 대두 식물을 Cmpd. 1에 대한 내성에 대해 시험하였다.

트랜스제닉 식물에 대한 온실 시행에 앞서, 대두 형질전환체를 ELISA 단백질 검출 방법 (항목 D 및 H 아래의 상세한 설명을 참조)을 사용하여 이식유전자의 발현 및 존재에 관해 일상적으로 분석했다. 선별 배지에서 회수되고 검출가능한 HPPD 이식유전자 단백질 발현을 갖는 식물만을 제초제 내성 분석에 사용했다. DeVries Tracker Sprayer를 각각의 분무에 앞서 보정했다. Cmpd. 1에 사용된 화학적 제형은 황산암모늄 및 메틸화된 유채씨유 (Actirob)로 보충되었다. 분무 시험을 1 헥타르 당 300 그램 AI (300 g AI/ha)와 동등한 농도로 수행하였다. 분무하고 5 일 후에 내성을 평가하였다. 동일한 제초제 제형을 분무한 야생형 대두 식물은 완전히 표백되었고 상단의 두 삼출엽에서 95%를 초과한 잎 피해를 나타냈다. 등급 "1"은 약간의 내성을 갖는, 즉, 상단의 두 삼출엽이 상당한 표백화를 나타내고 50-95%의 잎 피해로 회복 징후를 약간 보이는 식물에 부여되었다. 등급 "2"는 증등도의 내성을 보이는, 즉, 상단의 세 삼출엽 잎 면적의 10-49%가 제초제 처리에 대해 상당량의 내성을 보이는 식물에 부여되었다. 등급 "3"은 우수한 내성을 보이는, 즉, 상단의 세 삼출엽 잎 면적의 10% 미만이 백화 또는 매우 약간의 표백을 보이는 식물에 부여되었다. 결과가 표 8에 요약되었다.

Cmpd. 1을 300 g AI/ha의 비율로 적용하고 5 일 후에 트랜스제닉 대두 T0 이벤트로부터의 잎 면적 피해 평가

다음의 HPPD 폴리펩티드를 발현하는 대두 이벤트	제초제 내성 등급				처리된 이벤트 총 수	"2 & 3" 등급 이벤트 백분율
다음의 HPPD 폴리펩티드를 발현하는 대두 이벤트	0	1	2	3	처리된 이벤트 총 수	"2 & 3" 등급 이벤트 백분율
서열 번호 2	5	10	26	49	90	83.3%
서열 번호 32	1	0	10	28	39	97.4%
서열 번호 96	0	5	43	34	82	93.9%
서열 번호 31	4	1	21	30	56	91.1%

표 8의 결과는 독립적인 대두 T0 이벤트의 상당 부분이 HPPD 억제 제초제 Cmpd. 1로 처리된 야생형 대두 대조 식물과 비교하여 300 g AI/ha 비율의 HPVD 억제 제초제인 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)에 내성이 있음을 보여준다.

서열 번호 32, 서열 번호 96 및 서열 번호 31에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 갖는 T0 대두 이벤트의 90% 이상이 50% 미만의 잎 피해를 가지며, 따라서 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 83% 비율을 가지는 선행 기술의 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435) T0 집단보다 우수하다. 또한, 서열 번호 32에 상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 가지는 T0 대두 이벤트의 약 72%는 10% 미만의 잎 피해를 나타내며, 이 또한 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 종래 기술의 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)를 과발현하는 T0 대두 이벤트 집단 (54%)과 비교하여 개선을 나타낸다.

추가적인 온실 시행에서, 예시적인 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 함유하는 작제물 당 21 내지 94개의 독립적인 T0 대두 이벤트에 황산암모늄 및 메틸 에스테르 유채씨유가 보충된 HPPD 억제제 제초제 Cmpd.1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)를 300 g AI/ha의 비율로 첨가하였다. 적용 5일 후, HPPD 억제 제초제로 인한 잎 피해 면적을 0 (피해 없음) 내지 100 (완전 표백)의 등급으로 기록하였다. 이러한 조건에서 야생형 식물은 완전히 표백되었으며 그의 피해 점수는 95-100 범위에 있었다.

표 9는 예시적인 돌연변이 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드들 (서열 번호들)에 대한 백분위로서의 HPPD 억제 제초제 피해 점수 데이터 분포를 나타낸다. 백분위로 집단에서 개별 식물로부터의 피해 점수 순위를 정규화한다. 25번째 백분위 값은 주어진 집단에서 대두 이벤트의 25%가 피해 점수가 더 낮고 75%가 더 높은 피해 점수이다. 중간은 50번째 백분위이다. 이 값의 절반은 피해 점수가 더 높았고; 절반은 피해 점수가 더 낮았다. 75번째와 90번째 백분위 값은 대두 이벤트의 75% 및 90%가 각각 더 낮은 피해 점수를 가지는 피해 점수이다. 75번째 백분위와 25번째 백분위의 차이를 사분 범위 (interquartile range)라고 하며 집단에서 분산을 정량화하기 위한 표지이다. 모든 작제물은 대두 게놈에 단 하나의 카세트 삽입을 가졌다.

표 9에서 작제물들은 75번째 백분위에 따른 피해 점수를 기준으로 최저에서 최고 점수로 순위가 매겨졌다. 모든 예시적인 HPPD 폴리펩티드 변이체는 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435) 보다 모든 백분위 분석에서 더 우수하다. 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 기술 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435)의 점수는 표 9의 하단에 나열되어 있다.

Cmpd. 1을 300g AI/ha의 비율로 적용하고 5 일 후 백분위에 의한 트랜스제닉 대두 T0 이벤트로부터의 잎 면적 피해 평가

다음의 폴리펩티드를 발현하는 T0 대두 이벤트	분무된 독립 이벤트의 총 수	25번째	중간값	75번째	사분 범위	90번째
서열 번호 9	21	10.0	10.0	15.0	5.0	19.0
서열 번호 30	57	10.0	15.0	15.0	5.0	25.0
서열 번호 22	50	10.0	10.0	15.0	5.0	34.5
서열 번호 101	75	5.0	10.0	15.0	10.0	49.0
서열 번호 105	58	5.0	10.0	15.0	10.0	70.0
서열 번호 8	70	10.0	10.0	16.3	6.3	38.5
서열 번호 24	56	10.0	10.0	20.0	10.0	35.0
서열 번호 102	92	8.0	10.0	20.0	12.0	45.0
서열 번호 54	44	10.0	10.0	20.0	10.0	62.5
서열 번호 56	33	10.0	15.0	20.0	10.0	65.0
서열 번호 43	27	10.0	15.0	20.0	10.0	67.0
서열 번호 34	44	10.0	15.0	20.0	10.0	70.0
서열 번호 5	55	10.0	15.0	20.0	10.0	72.0
서열 번호 104	94	5.0	15.0	20.0	15.0	72.5
서열 번호 42	59	10.0	15.0	20.0	10.0	75.0
서열 번호 44	54	10.0	15.0	21.3	11.3	70.0
서열 번호 21	59	10.0	15.0	25.0	15.0	35.0
서열 번호 45	74	5.0	15.0	26.3	21.3	67.5
서열 번호 2	75	15.0	20.0	45.0	30.0	87.0

실시예 7: 목화 T0 식물 확립 및 선별

목화 형질전환을 당업계에 잘 알려진 방법, 특히 PCT 특허 공개 WO 00/71733에 기재된 바람직한 방법을 사용하여 수행하였다. 재생된 식물을 온실로 옮겼다. 기후순응 기간 후에, 충분히 성장한 식물에 HPPD 억제 제초제를, 예를 들어 황산암모늄 및 메틸 에스테르 유채씨유를 보충한 템보트리온으로서 100 또는 200 g AI/ha에 상당하게 분무하였다. 분무 적용 7일 후에, HPPD 억제 제초제 처리에 의한 증상을 평가하고, 동일한 조건하에서 동일하게 처리된 야생형 목화 식물에서 관찰된 증상과 비교하였다.

실시예 8: 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 옥수수 식물 세포의 형질전환

옥수수 식물에서의 안정적인 발현 및 옥수수 형질전환을 위한 식물 발현 카세트의 작제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 특정 실시예에서 방법은 W02014/043435 및 WO2008/100353로부터 기재된 것이 사용되었다. 이 출원에서 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 EPSPS를 표적으로 삼는, 제초제에 대한 내성을 부여하는 EPSPS 단백질 변이체를 인코딩하는 DNA 서열로 스택킹된다. EPSPS 유전자를 아트로박테르 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis) (WO2008/100353)로부터 단리하여 돌연변이화하고, 번역된 단백질의 엽록체로의 전좌를 유도하는 수송 펩티드 서열과 인-프레임 (in-frame)으로 연결시켰다. 안정적 발현을 각각 유비퀴터스 프로모터 (사탕수수로부터의 유비퀴틴 4 프로모터, 미국 특허 6,638,766), 및 EPSPS 유전자의 상류 및 하류에서 클로닝된, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (Cauliflower Mosaic Virus)로부터의 35S 종결 서열로 달성하였다.

상응하는 돌연변이 HPPD 폴리펩티드를 EPSPS 유전자 발현 카세트에 대해 기재된 것과 동일한 프로모터, 엽록체 수송 펩티드, 및 종결 서열로 클로닝하였다. 두 유전자에 대한 코딩 서열은 옥수수 발현에 최적화된 코돈이다. 옥수수 형질전환을 위해 수분 8-12일 후에 이삭을 수집하는 것이 가장 좋다. 이삭으로부터 배아 (embryo)를 단리하는데, 0.8-1.5 mm 크기의 배아가 형질전환에 사용하기에 바람직하다. 배아를 적합한 인큐베이션 배지 위에 배반 쪽이 위로 오게 하여 플레이팅하고, 25 ℃에서 밤새 암소에서 인큐베이션하였다.

그러나, 배아를 밤새 인큐베이션하는 것 자체가 필수적이지는 않다. 배아를 Ti 플라스미드 매개 전달을 위한 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 갖는 적절한 벡터를 함유하는 아그로박테리움 균주와 약 5-10 분동안 접촉시킨 다음, 공동배양 배지 위에 약 3일 동안 플레이팅하였다 (25 ℃ 암소에서). 공동배양 후에, 외식편을 회수 기간 배지로 약 5일 동안 옮겼다 (25 ℃ 암소에서). 외식편을 글리포세이트 함유 선별 배지에서 이용된 특정의 선별 특성 및 특징에 따라 8주 이하 동안 인큐베이션하였다. 선별 기간 후에, 생성된 캘러스 (callus)를 성숙한 부정 배아의 형성이 관찰될 때까지 배아 성숙 배지로 옮겼다. 그 후 생성된 성숙한 부정 배아를 약한 빛 아래 두고, 재생 과정을 당업계에 알려진 바와 같이 개시하였다. 발생된 새싹이 발근 배지에서 뿌리를 내리게 놔두고, 발생한 식물을 묘포 포트 (nursery pot)로 옮겨 트랜스제닉 식물로서 번식시켰다. 식물을 ELISA 단백질 검출 방법을 사용하여 이식유전자의 발현 및 존재에 대해 일상적으로 분석하였다. 선별 배지에서 회수되고 검출가능한 HPPD 이식유전자 단백질 발현을 갖는 식물만을 제초제 내성 분석에 사용하였다.

실시예 9. T1 대두 식물의 HPPD 억제 제초제에 대한 내성 /필드 시행

본 발명의 HPPD 억제제 내성 폴리펩티드를 발현하는 대두 식물을 단독으로, 또는 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 유전자 및/또는 글루포시네이트에 대한 내성을 부여하거나 본 발명의 HPPD 억제제 내성 폴리펩티드만을 포함하는 "식물 발현 카세트"를 갖는 유전자와 함께, 상이한 HPPD 억제 제초제 화학 부류에 대한 내성에 대해 시험하였다. 트랜스제닉 식물을 ELISA 단백질 검출 방법을 사용하여 이식유전자의 발현 및 존재에 대해 일상적으로 분석하였다 (D 및 H 항목에 대한 상세한 설명 참조). 선별 배지에서 회수하고 검출가능한 HPPD 이식유전자 단백질 발현을 갖는 식물 만을 재생하여 온실로 옮기고, 온실에서 T0 대두 이벤트의 HPPD 억제 제초제 내성 분석을 위해 V2-V4 성장 단계에서 사용하였다 (실시예 6). HPPD 억제 제초제를 가진 화학 제형에 황산암모늄 및 메틸 에스테르 유채씨유를 보충하였다. 제초제 내성 평가는 분무 후 5 내지 21일에 실시되었다.

우량 독립 T0 대두 이벤트를 자가수분시켜 T1 대두 종자를 생산하였다. 필드 시행에서, 진행 T1 대두 종자를 심고, 성장 단계 V2-V4 (표 10)에서 210 g/ha의 이속사플루톨 또는 150 g/ha의 Cmpd. 1 (2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드)로 처리한 후, HPPD 억제 제초제 적용 후 8일째에 잎 피해를 기록하였다. 동일한 제초제 제형으로 분무된 모든 야생형 대두 식물 또는 HPPD 억제제 내성 폴리펩티드가 없는 분리된 T1 대두 식물은 적용 후 8일째 완전히 표백되었고, 100% 잎 피해를 나타내었다.

표 10에, 양호한 내성, 즉 총 잎 면적에서 15% 이하의 피해를 보이는 대두의 빈도가 요약되어 있다.

본원에 기재된 모든 예시적인 HPPD 억제 제초제 내성 폴리펩티드 변이체는 집단에서 15% 이하의 잎 피해로 양호한 내성을 갖는 빈도가 더 높고 따라서 본 발명에서 서열 번호 2에 상응하는 선행 돌연변이 HPPD 폴리펩티드 (WO2014/043435) 보다 더 우수하였다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허 출원이 참고로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참고로 인용된다.

전술한 발명이 예시와 명확한 이해를 목적으로 일부 상세히 설명되었지만, 특정한 변경 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있음은 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience AG <120> HPPD VARIANTS AND METHOD OF USE <130> BCS151036 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD; Pseudomonas fluorescens) <222> (1)..(358) <400> 1 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 10 15 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu 20 25 30 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His 35 40 45 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly 65 70 75 80 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu 85 90 95 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 110 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile 115 120 125 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr 130 135 140 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala 165 170 175 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp 180 185 190 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro 195 200 205 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala 210 215 220 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240 His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu 245 250 255 Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr 260 265 270 Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp 290 295 300 Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val 305 310 315 320 Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly 325 330 335 Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg 340 345 350 Gly Val Leu Thr Ala Asp 355 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant HPPD polypeptide <400> 2 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 10 15 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu 20 25 30 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His 35 40 45 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly 65 70 75 80 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu 85 90 95 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 110 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile 115 120 125 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr 130 135 140 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala 165 170 175 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp 180 185 190 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro 195 200 205 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala 210 215 220 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240 His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu 245 250 255 Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr 260 265 270 Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp 290 295 300 Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val 305 310 315 320 Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Pro Trp 325 330 335 Asn Phe Ala Gln Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg 340 345 350 Gly Val Leu Thr Ala Asp 355 <210> 3 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant HPPD polypeptide <400> 3 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 10 15 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu 20 25 30 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His 35 40 45 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly 65 70 75 80 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu 85 90 95 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 110 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile 115 120 125 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr 130 135 140 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala 165 170 175 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp 180 185 190 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro 195 200 205 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala 210 215 220 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu 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Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly 65 70 75 80 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu 85 90 95 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 110 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile 115 120 125 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr 130 135 140 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala 165 170 175 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp 180 185 190 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro 195 200 205 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala 210 215 220 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240 His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu 245 250 255 Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr 260 265 270 Glu Met Leu Glu Gly Arg 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atggcgttcc gcgtgaagga ctcgcaaaag gcctacaacc gcgccctgga actcggcgcc 300 cagccgatcc atattgacac cgggccgatg gaattgaacc tgccggcgat caagggcatc 360 ggcggcgcgc cgttgtacct gatcgaccgt ttcggcgaag gcagctcgat ctacgacatc 420 gacttcgtgt acctcgaagg tgtggagcgc aatccggtcg gtgcaggtct caaagtcatc 480 gaccacctga cccacaacgt ctatcgcggc cgcatggtct actgggccaa cttctacgag 540 aaattgttca acttccgtga agcgcgttac ttcgatatca agggcgagta caccggcctg 600 acttccaagg ccatgagtgc gccggacggc atgatccgca tcccgctgaa cgaagagtcg 660 tccaagggcg cggggcagat cgaagagttc ctgatgcagt tcaacggcga aggcatccag 720 cacgtggcgt tcctcaccga cgacctggtc aagacctggg acgcgttgaa gaaaatcggc 780 atgcgcttca tgaccgcgcc gccagacact tattacgaaa tgctcgaagg ccgcctgcct 840 gaccacggcg agccggtgga tcaactgcag gcacgcggta tcctgctgga cggatcttcc 900 gtggaaggcg acaaacgcct gctgctgcag atcttctcgg aaaccctgat gggcccggtg 960 ttcttcgaat tcatccagcg caagggcgac gatgggtttg gcgaggggaa cttcaaggcg 1020 ctgttcgagt ccatcgaacg tgaccaggtg cgtcgtggtg tattgaccgc cgat 1074

Claims

(a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, (b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 위치에 세린을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고, 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 인코딩된 HPPD 폴리펩티드는
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 204에 상응하는 아미노산 위치에 메티오닌, 트레오닌, 세린 또는 류신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 라이신, 글루타민 또는 류신; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 류신, 글루탐산, 프롤린 또는 세린; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 310에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 히스티딘 또는 라이신; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 메티오닌 또는 히스티딘; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘, 알라닌, 페닐알라닌, 발린 또는 글리신; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 331에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 히스티딘, 세린, 이소류신 또는 류신; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
xi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 339에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산, 아르기닌, 알라닌 또는 트레오닌; 및/또는
xii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글루타민, 메티오닌, 글루탐산, 글리신, 류신 또는 발린; 및/또는
xiii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민, 프롤린 또는 아르기닌; 및/또는
xiv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 아르기닌, 메티오닌, 알라닌 또는 발린;
을 추가로 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 HPPD 단백질은 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 인코딩된 HPPD 단백질은
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 류신 또는 라이신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산 또는 세린; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 메티오닌; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 또는 발린; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 발린, 또는 메티오닌;
을 추가로 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 HPPD 단백질은 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 인코딩된 HPPD 단백질은
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신 또는 아르기닌; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 발린; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 발린, 또는 메티오닌;
을 추가로 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 HPPD 단백질은 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 핵산 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 HPPD 단백질은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 53% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 뉴클레오티드 서열이 식물에서 발현되도록 설계된 합성 서열인, 재조합 핵산 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 뉴클레오티드 서열이 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 재조합 핵산 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제는 트리케톤, 디케토니트릴, 이속사졸, 히드록시피라졸, N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드, N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 피라졸론으로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
제8항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온, 이속사플루톨, 디케토니트릴, 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트, 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 및 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
제10항에 있어서, 박테리아 숙주 세포인, 숙주 세포.
제10항에 있어서, 식물 세포인, 숙주 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물.
제13항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물, 후추, 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채로 구성된 군으로부터 선택되는, 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자.
하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있고, (a) 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, (b) 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 위치에 세린을 포함하는 HPPD 폴리펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 상기 HPPD 단백질은
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 204에 상응하는 아미노산 위치에 메티오닌, 트레오닌, 세린 또는 류신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 라이신, 글루타민 또는 류신; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 류신, 글루탐산, 프롤린 또는 세린; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 310에 상응하는 아미노산 위치에 세린, 히스티딘 또는 라이신; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 메티오닌 또는 히스티딘; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 또는 글리신; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 331에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 히스티딘, 세린, 이소류신 또는 류신; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
xi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 339에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산, 아르기닌, 알라닌 또는 트레오닌; 및/또는
xii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글루타민, 메티오닌, 글루탐산, 글리신, 류신 또는 발린; 및/또는
xiii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민, 프롤린 또는 아르기닌; 및/또는
xiv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 아르기닌, 메티오닌, 알라닌 또는 발린;
를 추가로 포함하고,
상기 HPPD 폴리펩티드는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 상기 HPPD 단백질은
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 류신 또는 라이신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 글리신 또는 세린; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산 또는 세린; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 메티오닌; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌, 또는 발린; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 발린, 또는 메티오닌;
를 추가로 포함하고,
상기 HPPD 폴리펩티드는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 상기 HPPD 단백질은
i. 서열 번호 1의 아미노산 위치 213에 상응하는 아미노산 위치에 라이신; 및/또는
ii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 264에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 류신; 및/또는
iii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신 또는 아르기닌; 및/또는
iv. 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산; 및/또는
v. 서열 번호 1의 아미노산 위치 315에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌; 및/또는
vi. 서열 번호 1의 아미노산 위치 330에 상응하는 아미노산 위치에 히스티딘; 및/또는
vii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 338에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및/또는
viii. 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 아르기닌 또는 발린; 및/또는
ix. 서열 번호 1의 아미노산 위치 344에 상응하는 아미노산 위치에 글루타민; 및/또는
x. 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 라이신, 발린, 또는 메티오닌;
을 추가로 포함하고,
상기 HPPD 폴리펩티드는 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있는,
재조합 폴리펩티드.
하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있고, 서열 번호 1의 아미노산 위치 268에 상응하는 아미노산 위치에 글리신 또는 아르기닌, 서열 번호 1의 아미노산 위치 270에 상응하는 아미노산 위치에 글루탐산, 서열 번호 1의 아미노산 위치 335에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 336에 상응하는 위치에 히스티딘 또는 아스파르트산, 서열 번호 1의 아미노산 위치 337에 상응하는 위치에 세린, 서열 번호 1의 아미노산 위치 340에 상응하는 아미노산 위치에 발린; 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 345에 상응하는 아미노산 위치에 발린을 포함하는 HPPD 단백질을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPPD 단백질은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 53% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제는 트리케톤, 디케토니트릴, 이속사졸, 히드록시피라졸, N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드, N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론으로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
제22항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제는 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온, 이속사플루톨, 디케토니트릴 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트, 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 발현되는 조건하에 제10항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, HPPD 억제 제초제 내성 활성을 갖는 폴리펩티드의 생성 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 작제물이 그의 게놈에 안정적으로 도입된 식물.
제25항에 있어서, 식물 세포, 식물 조직, 및 식물 종자로 구성된 군으로부터 선택되는, 식물.
제25항에 있어서, 옥수수, 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물, 후추, 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채로 구성된 군으로부터 선택되는, 식물.
제25항에 있어서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 작제물이 그의 게놈에 안정적으로 도입된 트랜스제닉 종자.
제25항의 식물 또는 그의 종자를 필드에 심고, 상기 필드에 유효 농도의 HPPD 억제 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 필드 (field)에서 잡초를 방제하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제가 트리케톤, 디케토니트릴, 이속사졸, 히드록시피라졸, N-(1,2,5-옥사디아졸-3-일)벤즈아미드, N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤즈아미드, N-(테트라졸-5-일)- 또는 N-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드, 피리다지논 유도체, 옥소프라진 유도체, N-(트리아졸-2-일)아릴카복사미드, 트리아지논, 및 피라졸론으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 HPPD 억제 제초제가 벤조바이시클론, 술코트리온, 메소트리온, 템보트리온, 테푸릴트리온, 바이시클로피론, 펜퀴노트리온, 이속사플루톨, 디케토니트릴 피라족시펜, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라술포톨, 토프라메존, 톨피랄레이트, 2-메틸-N-(5-메틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-3-(메틸술포닐)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 2-클로로-3-에톡시-4-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 4-(디플루오로메틸)-2-메톡시-3-(메틸술포닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)벤즈아미드, 2-클로로-3-(메틸술파닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 2-(메톡시메틸)-3-(메틸술피닐)-N-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
식물을 하나 이상의 HPPD 억제 제초제(들)에 내성이 있도록 만들기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산의 용도.
전 (whole) 또는 가공 (processed) 종자 또는 곡류, 동물 사료, 옥수수 또는 대두 미일 (meal), 옥수수 또는 대두분, 옥수수 전분, 대두 미일, 대두분, 플레이크, 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 분리물, 조직화 대두 단백질 농축물, 화장품, 모발 관리 제품, 대두 너트 버터, 낫또, 템페, 가수분해된 대두 단백질, 휩핑 토핑 (whipped topping), 쇼트닝, 레시틴, 식용 전 대두, 대두 요구르트, 대두 치즈, 두부, 유부, 및 조리, 정미, 찐, 구운 또는 데친 곡물로 구성된 군으로부터 선택되는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 상품성 산물.