JP6873979B2 - Hppd変異体および使用方法 - Google Patents
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Description
1)トリケトン類、例えば、ベンゾビシクロン[3−[2−クロロ−4−メチルスルホニル)ベンゾイル]−4−(フェニルスルファニル)ビシクロ[3.2.1」オクタ−3−エン−2−オン];スルコトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]、メソトリオン[すなわち、2−[4−(メチルスルホニル)−2−ニトロベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン](本明細書ではMSTと略す);テンボトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[(2,2,2,−トリフルオロエトキシ)メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン];テフリルトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[[(テトラヒドロ−2−フラニル)メトキシ]メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]];ビシクロピロン[すなわち、4−ヒドロキシ−3−[[2−[(2−メトキシエトキシ)メチル]−6−(トリフルオロメチル)−3−ピリジニル]カルボニル]ビシクロ[3.2.1]オクタ−3−エン−2−オン];フェンキノトリオン[すなわち、2−[[8−クロロ−3,4−ジヒドロ−4−(4−メトキシフェニル)−3−オキソ−2−2−キノキサリニル]カルボニル]−1,3−シクロヘキサンジオン]、および国際公開第2007/088876号、国際公開第2009/016841号、国際公開第2010/089993号、国際公開第2010/116122号、国際公開第2012/002096号、国際公開第2011/31658号、国際公開第2012/136703号、特開2013−040141号公報、国際公開第2013/080484号、国際公開第2014/014904号、国際公開第2014/031971号、米国特許出願公開第2014/0106968号に記載のもの;
2)ジケトニトリル類、例えば、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−メチルスルホニル−4−トリフルオロメチルフェニル)−プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−1−[4−(メチルスルホニル)−2−トリフルオロメチルフェニル]−3−(1−メチルシクロプロピル)プロパン−1,3−ジオン;
3)イソキサゾール類、例えば、イソキサフルトール[すなわち、(5−シクロプロピル−4−イソオキサゾリル)[2−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン]。植物では、イソキサフルトール(本明細書中、IFTと略す)は、HPPD阻害剤特性を示すジケトニトリル化合物であるDKNに急速に代謝される;
4)ヒドロキシピラゾール類、例えば、ピラゾキシフェン[すなわち、2−[[4−2,4−ジクロロベンゾイル)−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]−1−フェニルエタノン];ベンゾフェナップ[すなわち、2−[[4−(2,4−ジクロロ−3−メチルベンゾイル)−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]−1−(4−メチルフェニル)エタノン];ピラゾリネート[すなわち、(2,4−ジクロロフェニル)[1,3−ジメチル−5−[[(4−メチルフェニル)スルホニル]オキシ]−1H−ピラゾール−4−イル]メタノン];ピラスルホトール[すなわち、(5−ヒドロキシ−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−4−イル)[2−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン];トプラメゾン[すなわち、[3−(4,5−ジヒドロ−3−イソオキサゾリル)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)フェニル](5−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)メタノン];トルピラレート[すなわち、1−[[1−エチル−4−[3−(2−メトキシエトキシ)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)ベンゾイル]−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]エチルメチルカルボネート];
5)国際公開第2011/035874号、および国際公開第2012/123416号、国際公開第2012/123409号、欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載の、および国際公開第2013/072300号、国際公開第2013/072402号、国際公開第2013/072450号、国際公開第2014/184014号、国際公開第2014/184019号、国際公開第2014/184058号、国際公開第2014/192936号、国際公開第2015/052152号、国際公開第2015/052178に記載のN−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、および国際公開第2012/126932号、および欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/124245号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/1053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載のN−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類;例えば、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ);2−クロロ−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(エチルスルホニル)−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド;
6)国際公開第2012/028579、および国際公開第2012/123409号、国際公開第2013/017559号、欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/064457号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/104705号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/124245号、国際公開第2013/164331号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/174843号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載のN−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類;例えば、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および国際公開第2013/072528号、国際公開第2013/076315号、国際公開第2013/076316号、国際公開第2013/083859号、国際公開第2013/092834号、国際公開第2013/139760号、国際公開第2013/144231号、国際公開第2014/126070号、国際公開第2014/135654号、国際公開第2014/184015号、国際公開第2014/184016号、国際公開第2014/184017号、国際公開第2014/184073号、国際公開第2014/184074号、国際公開第2014/192936号、国際公開第2015/022284号、国際公開第2015/052153号、国際公開第2015/052173号に記載のもの;
7)国際公開第2013/050421 および国際公開第2013/083774号、国際公開第2014/154828号、国際公開第2014/154882号に記載のピリダジノン誘導体;
8)国際公開第2013/054495号に記載のオキソピラジン(oxoprazine)誘導体;
9)国際公開第2013/144234号、国際公開第2015/007564号に記載のN−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類;
10)国際公開第2014/154829号に記載のトリアジノン類;ならびに
11)欧州特許出願公開第2881387号および欧州特許出願公開第2881388号に記載のピラゾロン類。
HPPDを介したホモゲンチジン酸の産生を迂回すること(米国特許第6,812,010号)、除草剤に関して十分である量の植物内の標的酵素を産生するように、感受性のある酵素を過剰発現すること(国際公開第96/38567号)、およびHPPのホモゲンチジン酸への転換を触媒するその特性は保持しながら、変異前の天然HPPDよりもHPPD阻害剤に対する感受性の低い標的酵素を得るためにHPPDを変異させることを含む、広範囲のHPPD阻害型除草剤に対する農学的に許容されるレベルの耐性を植物に付与するために、いくつかの試みが為されてきた。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドは1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置204に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置310に対応するアミノ酸の位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置331に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(xi)配列番号1のアミノ酸の位置339に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
(xii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
(xiii)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
(xiv)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてロイシンまたはリジン;および/または
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン;および/または
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および
(v)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(v)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリンまたはアルギニン;
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
(Vii)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
(v)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、および
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または
c.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてアスパラギン酸、および
d.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン;
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置330に対応する位置においてヒスチジン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン;
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
それぞれのHPPDポリペプチドは、配列番号1と同一であるが、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337においてセリン
を有する。
HPPD阻害型除草剤に対する耐性を測定する任意の適切な方法を使用して、本発明のHPPDポリペプチドを評価することができる。細胞または生物が特定のHPPD阻害型除草剤の施用下で生存する能力、または未処理細胞または生物から容易に識別できないように、光合成、タンパク質合成または呼吸および再生などの必須の細胞機能を行う能力、またはHPPD阻害型除草剤で処理した植物の収穫またはさらに改善された収穫において、このような除草剤で処理していない植物と比較して、有意差を有しない能力(しかし、HPPD阻害型除草剤の用途以外の機構により雑草を除去または抑制する場合)をモニターすることにより、耐性を測定することができる。いくつかの実施態様では、それぞれのHPPDポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる核酸で形質転換された細胞または生物の可視指標となる表現型に従って、または異なる濃度の様々なHPPD阻害型除草剤の存在下、HPPDポリペプチドのインビトロアッセイにおいて、耐性を測定することができる。用量反応、およびこれらの指標となる表現型(茶色の形成、成長阻害、白化、除草効果など)に関連する用量反応における相対的シフトを、例えばGR50(成長を50%減少させる濃度)またはMIC(最小阻止濃度)値に関して都合良く発現するが、これらの値の増加は、除草剤の異なる濃度範囲における植物の損傷、成長点の白化症状などに基づいて通常の方法で、発現したHPPDポリペプチドの固有の耐性の増強に対応する。例えばx軸にプロットされた「用量」およびy軸にプロットされた「死滅パーセンテージ」、「除草効果」、「新生緑色植物数」などの用量/反応曲線に由来するGR50値に関して、これらのデータを表すことができ、GR50値の増加は、発現したHPPDポリペプチドの固有耐性のレベル向上に対応する。除草剤を、発芽前または発芽後に、好適に施用することができる。
本発明の核酸によりコードされた変異HPPDポリペプチドでは、上記定義したように、少なくとも3個のアミノ酸が置換されている。
幾つかの実施態様にでは、本発明は、単離または組換えたポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」という語は、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子群、プラスミド、遺伝子全部、およびそのフラグメントを含む一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAを含んでなる任意の長さの任意の配列の任意の遺伝子材料に相当する。本明細書で定義される「組換え」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド/タンパク質、またはその生物活性部分は、それらが異種宿主細胞内、またはトランスジェニック植物細胞、種子、または植物内に含まれる場合など、その起源、天然生物内にもはや存在しない。1つの実施態様では、組換えポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムDNA内の核酸(すなわち、核酸の5’および3’末端に位置する配列)を自然に隣接する配列(例えば、コードするタンパク質または制御配列)を含まない。「組換え」という語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然にあるものと異なる(例えば、化学組成または構造において)ように、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して操作したポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。別の実施態様では、「組換え」ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムDNA内に天然で存在する内部配列(すなわち、イントロン)を含まない。このようなポリヌクレオチドの典型例は、いわゆる相補DNA(cDNA)である。例えば、様々な実施態様では、単離されたHPPD阻害型除草剤に対する耐性をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNA内のポリヌクレオチドに自然に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kbよりも小さいヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の核酸分子としては、本発明のHPPDをコードするものが挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、宿主細胞(例えば、植物宿主細胞または細菌宿主細胞)内の核酸分子の発現を指示可能なプロモーターに操作可能に連結している。
ポリヌクレオチドの「変異体」としては、本発明のHPPDをコードするが、遺伝コードの縮重が理由で保存的に異なる配列、ならびに十分に同一である配列も挙げられる。
本発明の変異体は、HPPDポリペプチド活性およびHPPD除草剤阻害剤耐性を保持するだろう。「十分に同一」という語は、標準的なパラメーターを使用するアラインメントプログラムの1つを用いて、参照配列と比較した、少なくとも約53%、少なくとも約60%または65%の配列同一性、約70%または75%の配列同一性、約80%または85%の配列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を表す。これらの値を適切に調節して、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮して、2つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの対応する同一性を決定することができることを当業者は認識するであろう。
除草剤耐性ポリペプチドも本発明内に包含される。除草剤耐性ポリペプチドとしては、約30%、20%、10%、または5%(乾燥重量)より少ない除草剤耐性でないポリペプチド(本明細書では、「汚染(contaminating)タンパク質」とも呼ぶ)を有するポリペプチドの製剤(preparations)が挙げられる。本発明では、「除草剤耐性タンパク質」は、本明細書に開示のHPPDポリペプチドを表す。 そのフラグメント、生物活性部分、および変異体も準備して、本発明の方法を実施するために使用してもよい。
農作物の商業的生産において、信頼のおける駆除剤管理下、作物の圃場から不要な植物(すなわち、「雑草」)を除去することが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に施用可能であるが、作物は影響されないままで不要な植物のみを除去することであろう。このような処理システムの1つは、除草剤耐性作物の圃場に除草剤を散布する場合、作物は成長し続けるが、除草剤耐性をもたない雑草は死滅するかまたは大幅に被害を受けるように、除草剤に対して耐性である作物の使用を含むだろう。理想的には、このような処理システムは、雑草防除によって柔軟性と経済性との可能な最良の組み合わせが提供され得るように、除草剤の特性を変化させることの利点を享受し得る。例えば、圃場において個別の除草剤の持続性は様々であり、幾つかの除草剤は圃場に散布された後、比較的長期間有効であるが、その他の除草剤は、他の化合物および/または無効な化合物へと迅速に分解される。理想的な処理システムにおいては、栽培者が特定の状況に応じて除草剤を選択できるように、異なる除草剤の使用が許容され得る。
除草剤耐性、ATCC PTA−11508として寄託、国際公開第11/075593号に記載);イベント43A47(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−11509として寄託、国際公開第2011/075595号に記載);イベント5307(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−9561、国際公開第2010/077816号に記載);イベントASR−368(ベントグラス、除草剤耐性、ATCC PTAー4816、米国特許出願公開第2006/162007号または国際公開第2004/053062号に記載);イベントB16(トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2003/126634号に記載);イベントBPS−CV127−9(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB No.41603として寄託、国際公開第2010/080829号に記載);イベントBLR1(アブラナ、雄性不稔性回復、NCIMB41193として寄託、国際公開第2005/074671号に記載);イベントCE43−67B(ワタ、昆虫防除、DSM ACC2724として寄託、米国特許出願公開第2009/217423号または国際公開第2006/128573号に記載);イベントCE44−69D(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2010/0024077号に記載);イベントCE44−69D(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128571号に記載);イベントCE46−02A(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128572号に記載);イベントCOT102(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2006/130175号または国際公開第2004/039986号に記載);イベントCOT202(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2007/067868号または国際公開第2005/054479号に記載);イベントCOT203(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2005/054480号に記載);イベントDAS21606−3/1606(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11028として寄託、国際公開第2012/033794号に記載)、イベントDAS40278(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC
PTA−10244として寄託、国際公開第2011/022469号に記載);イベントDAS−44406−6/pDAB8264.44.06.1(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11336として寄託、国際公開第2012/075426号に記載)、イベントDAS−14536−7/pDAB8291.45.36.2(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11335として寄託、国際公開第2012/075429号に記載)、イベントDAS−59122−7(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA11384として寄託、米国特許出願公開第2006/070139号に記載);イベントDAS−59132(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2009/100188号に記載);イベントDAS68416(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−10442として寄託、国際公開第2011/066384号または国際公開第2011/066360号に記載);イベントDP−098140−6(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC PTA−8296として寄託、米国特許出願公開第2009−137395号または国際公開第08/112019号に記載);イベントDP−
305423−1(ダイズ、品質形質、寄託なし、米国特許出願公開第2008−312082号または国際公開第2008/054747号に記載);イベントDP−32138−1(トウモロコシ、ハイブリダイゼーションシステム、ATCC PTA−9158として寄託、米国特許出願公開第2009/0210970号または国際公開第2009/103049号に記載);イベントDP−356043−5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−8287として寄託、米国特許出願公開第2010−0184079号または国際公開第2008/002872号に記載);イベントEE−1(ナス、昆虫防除、寄託なし、国際公開第07/091277号に記載);イベントFI117(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209031として寄託、米国特許出願公開第2006/059581号または国際公開第 98/044140号に記載);イベントFG72(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11041として寄託、国際公開第2011/063413号に記載)、イベントGA21(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209033として寄託、米国特許出願公開第2005/086719号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGG25(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209032として寄託、米国特許出願公開第2005/188434号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGHB119(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−8398として寄託、国際公開第2008/151780号に記載);
イベントGHB614(ワタ、除草剤耐性、ATCC PTA−6878として寄託、米国特許出願公開第2010/050282号または国際公開第2007/017186号に記載);イベントGJ11(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209030として寄託、米国特許出願公開第2005/188434号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGM RZ13(サトウダイコン、ウイルス抵抗性、NCIMB−41601として寄託、国際公開第2010/076212号に記載);イベントH7−1(サトウダイコン、除草剤耐性、NCIMB41158またはNCIMB41159として寄託、米国特許出願公開第2004/172669号または国際公開第2004/074492号に記載);イベントJOPLIN1(コムギ、耐病性、寄託なし、米国特許出願公開第2008/064032号に記載);イベントLL27(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB41658として寄託、国際公開第2006/108674または米国特許出願公開第2008/320616号に記載);イベントLL55(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB 41660として寄託、国際公開第2006/108675号または米国特許出願公開第2008/196127号に記載);イベントLLワタ25(ワタ、
除草剤耐性、ATCC PTA−3343として寄託、国際公開第2003/013224または米国特許出願公開第2003/097687号に記載);イベントLLコメ06(コメ、除草剤耐性、ATCC 203353として寄託、米国特許第6,468,747号または国際公開第2000/026345号に記載);イベントLLコメ62(コメ、除草剤耐性、ATCC 203352として寄託、国際公開第2000/026345号に記載)、イベントLLコメ601(コメ、除草剤耐性、ATCC PTA−2600として寄託、米国特許出願公開第2008/2289060号または国際公開第2000/026356号に記載);イベントLY038(トウモロコシ、品質形質、ATCC PTA−5623として寄託、米国特許出願公開第2007/028322号または国際公開第2005/061720号に記載);イベントMIR162(トウモロコシ、昆虫防除、PTA−8166として寄託、米国特許出願公開第2009/300784号または国際公開第2007/142840号に記載);イベントMIR604(トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2008/167456号または国際公開第2005/103301号に記載);イベントMON15985(ワタ、昆虫防除、ATCC PTA−2516として寄託、米国特許出願公開第2004/250317号または国際公開第2002/100163号に記載);イベントMON810(トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2002/102582号に記載);イベントMON863(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC PTA−2605として寄託、国際公開第2004/011601または米国特許出願公開第2006/095986号に記載);イベントMON87427(トウモロコシ、受粉制御、ATCC PTA−7899として寄託、国際公開第2011/062904号に記載);イベントMON87460(トウモロコシ、ストレス耐性、ATCC PTA−8910として寄託、国際公開第2009/111263号または米国特許出願公開第2011/0138504号に記載);イベントMON87701(ダイズ、昆虫防除、ATCC PTA−8194として寄託、米国特許出願公開第2009/130071号または国際公開第2009/064652号に記載);イベントMON87705(ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ATCC PTA−9241として寄託、米国特許出願公開第2010/0080887号または国際公開第2010/037016号に記載);イベントMON87708(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−9670として寄託、国際公開第2011/034704号に記載);イベントMON87712(ダイズ、収穫高、PTA−10296として寄託、国際公開第2012/051199号に記載)、イベントMON87754(ダイズ、品質形質、ATCC PTA−9385として寄託、国際公開第2010/024976号に記載);イベントMON87769(ダイズ、品質形質、ATCC PTA−
8911として寄託、米国特許出願公開第2011/0067141号または国際公開第2009/102873号に記載);イベントMON88017(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−5582として寄託、米国特許出願公開第2008/028482号または国際公開第2005/059103号に記載);イベントMON88913(ワタ、除草剤耐性、ATCC PTA−4854として寄託、国際公開第2004/072235または米国特許出願公開第2006/059590号に記載);イベントMON88302(アブラナ、除草剤耐性、PTA−10955として寄託、国際公開第2011/153186号に記載)、イベントMON88701(ワタ、除草剤耐性、PTA−11754として寄託、国際公開第2012/134808号に記載)、イベントMON89034(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC PTA−7455として寄託、国際公開第07/140256または米国特許出願公開第2008/260932号に記載);イベントMON89788(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−6708として寄託、米国特許出願公開第2006/282915号または国際公開第2006/130436号に記載);イベントMS11(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−850またはPTA−2485として寄託、国際公開第2001/031042号に記載);イベントMS8(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−730として寄託、国際公開第2001/041558または米国特許出願公開第2003/188347号に記載);イベントNK603(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC PTA−2478として寄託、米国特許出願公開第2007/292854号に記載);イベントPE−7(コメ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2008/114282号に記載);イベントRF3(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−730として寄託、国際公開第2001/041558または米国特許出願公開第2003/188347号に記載);イベントRT73(アブラナ、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2002/036831号または米国特許出願公開第2008/070260号に記載);イベントSYHT0H2 / SYN−000H2−5(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11226として寄託、国際公開第2012/082548号に記載)、
イベントT227−1(サトウダイコン、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2002/44407号または米国特許出願公開第2009/265817号に記載);イベントT25(トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2001/029014号または国際公開第2001/051654号に記載);イベントT304−40(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−8171として寄託、米国特許出願公開第2010/077501号または国際公開第2008/122406号に記載);イベントT342−142(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128568号に記載);イベントTC1507(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2005/039226号または国際公開第2004/099447号に記載);イベントVIP1034(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−3925として寄託、国際公開第2003/052073号に記載)、イベント32316(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−11507として寄託、国際公開第2011/084632号に記載)、イベント4114(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−11506として寄託、国際公開第2011/084621号に記載)、イベント EE−GM3/FG72(ダイズ、除草剤耐性、ATCC 受託番号 PTA−11041号に記載)必要に応じてイベントEE−GM1/LL27またはイベントEE−GM2/LL55(国際公開第2011/063413A2号に記載)でスタック、イベントDAS−68416−4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10442、国際公開第2011/066360(A1)号に記載)、イベントDAS−68416−4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10442、
国際公開第2011/066384(A1)号に記載)、イベントDP−040416−8(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11508、国際公開第2011/075593(A1)号に記載)、イベントDP−043A47−3(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11509、国際公開第2011/075595(A1)号に記載)、イベントDP−004114−3(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11506、国際公開第2011/084621(A1)号に記載)、イベントDP−032316−8(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11507、国際公開第2011/084632A1号に記載)、イベントMON−88302−9(アブラナ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10955、国際公開第2011/153186A1号に記載)、イベントDAS−21606−3(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11028、国際公開第2012/033794(A2)号に記載)、イベントMON−87712−4(ダイズ、品質形質、ATCC受託番号PTA−10296、国際公開第2012/051199(A2)号に記載)、イベントDAS−44406−6(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11336、国際公開第2012/075426(A1)号に記載)、イベントDAS−14536−7(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11335、国際公開第2012/075429(A1)号に記載)、イベントSYN−000H2−5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11226、国際公開第2012/082548(A2)号に記載)、イベントDP−061061−7(アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、国際公開第2012/071039(A1)号に記載)、イベントDP−073496−4(アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、米国特許出願公開第2012/131692号に記載)、イベント8264.44.06.1(ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号PTA−11336、国際公開第2012/075426(A2)号に記載)、イベント8291.45.36.2(ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号PTA−11335、国際公開第2012/075429(A2)号に記載)、イベントSYHT0H2(ダイズ、ATCC受託番号PTA−11226、国際公開第2012/082548(A2)号に記載)、イベントMON88701(ワタ、
ATCC受託番号PTA−11754、国際公開第2012/134808(A1)号に記載)、イベントKK179−2(アルファルファ、ATCC受託番号PTA−11833、国際公開第2013/003558(A1)号に記載)、イベントpDAB8264.42.32.1(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11993、国際公開第2013/010094(A1)号に記載)、イベントMZDT09Y(トウモロコシ、ATCC 受託番号PTA−13025、国際公開第2013/012775(A1)号に記載)、イベント4114(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11506)国際公開第2013/14901号、イベントMON87411(トウモロコシ、ATCC受託番号PTA−12669)国際公開第2013/169923号、イベントA26−5(ワタ、昆虫防除)国際公開第2013/170398号、イベントA2−6(ワタ、昆虫防除)国際公開第2013/170399号、イベント9582.816.15.1(ダイズ、昆虫防除、除草剤耐性号)、ATCC受託番号PTA−12588号)国際公開第2014/004458号、イベント33121(トウモロコシ、昆虫防除、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−13392)国際公開第2014/116854号、イベント32218(トウモロコシ昆虫防除、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−13391)国際公開第2014/116989号、イベント「SPT−7R−949D SPT−7R−1425D」(コメ、雄性不稔性)国際公開第2014/154115号、イベントMON87751(ダイズ、ATCC受託番号PYA−120166)国際公開第2014/201235号、イベント“Pp009−401 Pp009−415 Pp009−469”(芝草、ATCC受託番号PTA−120354、PTA−120353、PTA−120355)国際公開第2015/006774号、イベントBs2−X5(トマト、ATCC)国際公開第2015/017637号、イベントMON87403(トウモロコシ、穀物、収穫高、ATCC受託番号PTA−13584、国際公開第2015/053998号、イベント32218(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−13391)国際公開第2015/112182号が挙げられる。
本発明のHPPDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変し、植物細胞内での発現さを得るか、または発現を増大させてもよい。本明細書で同定するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、対象の植物内での発現のための発現カセット中に供給してもよい。「植物発現カセット」としては、組換えDNAコンストラクトを含む、すなわち、植物細胞内のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができるDNAコンストラクトが挙げられる。カセットは、5’−3’転写方向へ、対象の1つ以上のポリヌクレオチドに操作可能に連結する転写開始領域(すなわち、プロモーター、具体的には、異種プロモーター)、および/または植物内で機能する翻訳および転写終止領域(すなわち、終止領域)を含むことができる。カセットは、選択マーカー遺伝子など、生物に導入される少なくとも1つの追加のポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。あるいは、複数の発現カセットに、追加のポリヌクレオチド(複数可)を供給することができる。このような発現カセットが、制御領域の転写制御下であるポリヌクレオチド(複数可)の挿入のための複数の制限酵素部位を備える。
例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481参照。
本発明の方法は、植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入することに関わる。「導入する」は、ヌクレオチドコンストラクトが植物細胞の内部へ接近可能な様式で、該コンストラクトを植物に提示することを意図する。本発明の方法では、植物にヌクレオチドコンストラクトを導入するために特別の方法を用いることは必用とされず、ヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも一つの細胞の内部へ接近可能であることのみが必要とされる。植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は当該技術分野において公知であり、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルスを介した方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第4,459,355号、米国特許第4,536,475号、米国特許第5,464,763号、米国特許第5、177,010号、米国特許第5,187,073号、欧州特許出願公開第267,159(A1)号、欧州特許出願公開第604662(A1)号、欧州特許出願公開第672752(A1)号、米国特許第4,945,050号、米国特許第5,036,006号、米国特許第5,100,792号、米国特許第5,371,014号、米国特許第5,478,744号、米国特許第5,179,022号、米国特許第5,565,346号、米国特許第5,484,956号、米国特許第5,508,468号、米国特許第5,538,877号、米国特許第5,554,798号、米国特許第5,489,520号、米国特許第5,510,318号、米国特許第5,204,253号、米国特許第5,405,765号、欧州特許出願公開第442174(A1)号、欧州特許出願公開第486233(A1)号、欧州特許出願公開第486234(A1)号、欧州特許第出願公開539563(A1)号、欧州特許第674725(A1)号、国際公開第91/02071号、国際公開第95/06128号、国際公開第2011/095460号、国際公開第2012/006439(A2)号、国際公開第2012/006443(A2)号、国際公開第2012/015039(A1)号、国際公開第2012/019660(A1)号、国際公開第2012/021494(A1)号、国際公開第2012/064827(A1)号、国際公開第2012/075562(A1)号、国際公開第2012/077664(A1)号、国際公開第2012/083137(A1)号、国際公開第2012/084962(A1)号、国際公開第2012/092577(A1)号、国際公開第2012/109947(A1)号、国際公開第2012/129443(A2)号、国際公開第2012/138629(A2)号、国際公開第2012/139416(A1)号、国際公開第2012/149011(A1)号、国際公開第2013/014585(A1)号、国際公開第2013/025670(A1)号、国際公開第2013/033308(A2)号、国際公開第2013/066007(A1)号、国際公開第2013/077420(A1)号、国際公開第2013/090734(A1)号、国際公開第2013/149726(A1)号、国際公開第2013/180311(A1)号、国際公開第2014/029044(A1)号、国際公開第2014/029045(A1)号、国際公開第2014/062036(A1)号、国際公開第2014/065857(A1)号、国際公開第2014/100234(A1)号、国際公開第2014/100406(A1)号、国際公開第2014/123208(A1)号、国際公開第2014/143304(A1)号、国際公開第2014/144513(A2)号、国際公開第2014/157541(A1)号、国際公開第2014/200842(A2)号、国際公開第2015/051083(A1)号、国際公開第2015/077620(A1)号、国際公開第2015/085990(A1)号、国際公開第2015/099674(A1)号、国際公開第2015/118640(A1)号、国際公開第2015/119166(A1)号(これら各々は、特に、その中に記載される形質転換方法に関して、参照することにより本明細書に取り入れられるものとする)に記載された植物細胞の形質転換法および植物の再生方法を参照。
植物細胞内への異種外来DNAの導入後、形質転換または植物ゲノム内の異種遺伝子の組込みを、組込み遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の分析など様々な方法により確認する。
本発明は、植物の形質転換方法における、マーカー遺伝子として、またはHPPD阻害剤である除草剤に対する耐性を植物に付与することを可能とするコード配列として、本発明に従ったHPPDをコードする核酸の使用、および本発明に従ったHPPDをコードする核酸配列を含んでなる植物における1つ以上のHPPD阻害剤の使用にも関する。例えば、米国特許第6,791,014号(その全文を参照することにより本明細書に取り入れられるものとする)参照。
「植物」は、植物全体、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚およびその子孫を表す。植物細胞は、分化していてもよく、分化していなくてもよい(例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉)。これに限定されないが、単子葉植物および双子葉植物を含むいずれかの植物種にポリヌクレオチドを導入するために本発明を使用してもよい。対象の植物の例としては、トウモロコシ(corn)(トウモロコシ(maize))、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属(Brassica sp.)、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ類、野菜類、観賞植物類、および針葉樹類が挙げられるが、これに限定されない。
植物の収穫高を増大させる方法を提供する。方法は、本発明のHPPDをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる植物を準備すること、または該ポリヌクレオチドを植物もしくは植物細胞内に導入すること、該植物またはその種子を圃場において成長させること、および前記植物または種子から収穫を得ることを含む。本明細書で定義されるとき、植物の「収穫高(yield)」は、植物により産生された生物量の品質および/または量を表す。「生物量」は、測定されたいずれかの植物産物を表す。生物量生産の増加は、測定された植物産物の収穫高におけるいずれかの改良である。植物収穫高の増加は、いくつかの商業的応用を有する。例えば、植物葉生物量の増加は、ヒトまたは動物消費用の葉菜の収穫高を増加し得る。加えて、葉生物量の増加は、植物由来医薬品または工業製品の生産を増加させるために利用可能である。収穫高の増加は、これに限定されないが、少なくとも1%の増加、少なくとも3%の増加、少なくとも5%の増加、少なくとも10%の増加、少なくとも20%の増加、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも100%、またはそれより多い増加を含むいずれかの統計的に有意な増加を含むことができる。
従って、本発明は、本発明に従ったHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物の収穫物において望ましくない植物の防除または植物成長を調節する方法にも関し、1つ以上のHPPD阻害型除草剤、例えば、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤を、植物(例えば、単子葉または双子葉雑草などの有害植物または望ましくない作物)、種子(例えば、穀物、種子または塊茎などの野菜栄養分体または芽を含む新芽部分)または植物が成長する地区(例えば、栽培地区)に施用する。この関連で、1つ以上のHPPD阻害型除草剤、例えば、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、
N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤からなる群から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤の有効濃度を、例えば、植え付け前(必要に応じて、土壌に取り込むことにより)、発芽前もしくは発芽後に施用することができ、作物が天然で耐性を有する、または1つ以上の他の除草剤耐性トランスジーンの発現により抵抗性を有する他の除草剤の施用と組合せてもよい。例えば、米国特許出願公開第2004/0058427号および国際公開第98/20144号参照。「有効濃度」は、HPPD阻害剤耐性植物または植物種子に有意に影響することなく、雑草または他の非形質転換植物の成長または繁殖を制御する濃度を表す。除草剤の施用が多くの異なった形態を取ることができ、種まきおよび成長過程の前および/または全体にわたって、多くの異なる時間において起こり得ることを当業者は理解する。「発芽前」施用は、植物が土壌から目に見えるほどに発芽する前に対象の範囲(例えば、圃場または栽培区域)に施用する除草剤を表す。「発芽後」施用は、植物の土壌から見えるほどに発芽した後で範囲に施用する除草剤を表す。いくつかの例では、「発芽前」および「発芽後」という語は、対象の区域における雑草に関連して使用し、いくつかの例では、これらの用語は、対象の区域内の作物に関連して使用する。雑草に関連して使用する場合、これらの用語は、対象の区域に存在するかまたは存在すると考えられる雑草の特定の種類または種に対して施用してもよい。除草剤の「植え付け前混入」は、植え付け前の土壌に化合物を混入することを含む。
単子葉類有害植物の属:エギロプス属(Aegilops)、アグロピロン属(Agropyron)、アグロスチス属(Agrostis)、アロペクルス属(Alopecurus)、アペラ属(Apera)、アベナ属(Avena)、ブラキアリア属(Brachiaria)、ブロムス属(Bromus)、ケンクルス属(Cenchrus)、コメリナ属(Commelina)、サイノドン属(Cynodon)、シペルス属(Cyperus)、ダクチロクテニウム属(Dactyloctenium)、ジギタリア属(Digitaria)、エキノクロア属(Echinochloa)、エレオカリス属(Eleocharis)、エレウシネ属(Eleusine)、エラグロスチス属(Eragrostis)、エリオクロア属(Eriochloa)、フェスツカ属(Festuca)、フィムブリスチリス属(Fimbristylis)、ヘテランテラ属(Heteranthera)、インペラタ属(Imperata)、イシャエムム属(Ischaemum)、レプトクロア属(Leptochloa)、ロリウム属(Lolium)、モノコリア属(Monochoria)、パニクム属(Panicum)、パスパルム属(Paspalum)、ファラリス属(Phalaris)、フレウム属(Phleum)、ポア属(Poa)、ロットボエリア属(Rottboellia)、サギタリア属(Sagittaria)、シルプス属(Scirpus)、セタリア属(Setaria)、ソルガム属(Sorghum)が挙げられ、
本明細書では、別の植物への本発明のHPPDヌクレオチド配列の導入方法も提供する。本発明のHPPDヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを、循環選択、戻し交配、系統育種、系統選択、集団選択、変異育種および/または高感度遺伝子マーカー選択により、第2植物に導入することができる。
本発明は、本発明のHPPD配列を含んでなる作物由来の穀物を収穫および/または製粉して商品生産物を得ることを含む商品生産物を得るための方法にも関する。これに限定されないが、動物飼料、日用品、ならびにヒトが消費する食品としての用途または組成物およびヒトが消費する目的とした日用品中での用途を目的とした植物生成物および副産物を含む物の農学的および商業的に重要な生産物および/もしく物質組成物、具体的には、このような穀物/種子から産生された(半)処理製品を含む失活種子/穀物製品であって、前記製品は、完全もしく加工種子もしく穀物、動物飼料、コーンミールもしくダイズミール、トウモロコシ粉もしくはダイズ粉、トウモロコシ、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆(生、ロースト、または枝豆として)、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、ならびに調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイルド穀物などであるかまたは含んでなる前記失活種子/穀物製品は、これらの製品および物の組成物がこのようなヌクレオチド配列を含むいずれかの植物の特徴であるとして、本明細書に記載のヌクレオチド配列および/もしくはアミノ酸配列を検出可能な量を含む場合、本発明の範囲内であるものとする。
実施例1:部位特異的変異誘発による変異HPPDポリペプチドの製造
実施例2:組換え野生型および変異HPPDポリペプチドのクローニング、発現、および精製
実施例3:改良HPPD阻害型除草剤耐性を有する変異HPPDポリペプチドを分析するHPPD酵素アッセイ
実施例4:HPPDポリペプチドにおける残基交換により媒介された改良除草剤耐性
実施例5:HPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する変異HPPDポリペプチドを試験する茶色アッセイ(Brown Color assay)
実施例6:ダイズ形質転換およびT0ダイズ植物の耐性
実施例7:綿T0植物の樹立および選択
実施例8:アグロバクテリウム媒介形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
実施例9:HPPD阻害型除草剤に対するT1ダイズ植物の耐性/圃場試験
配列番号1に相当するHPPDポリペプチドをコードする国際公開第2009/144079号に記載のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDヌクレオチド配列(配列番号109)を、当技術分野において周知の方法および国際公開第2014/043435号に記載の通りに従ってクローニングした。その後、配列番号1に相当する組換えHPPDポリペプチドをコードする野生型PfHPPDポリペプチドをコードする核酸の部位飽和変異誘発、部位特異的変異誘発および1つ以上の変異との組合せ変異体を、当技術分野において周知(および国際公開第2014/043435号に同様に記載の通り)の標準PCRベース技術を用いて行った。全設計および合成した変異クローンを、プラスミド特異的オリゴヌクレオチドを用いてDNA塩基配列決定により確認した。表2.下記、例示の変異HPPDポリペプチドを纏めている(配列番号2〜配列番号108)。
組換えHPPDポリペプチドをコードする野生型および変異HPPDの配列をコードする全ての得られた核酸を、当技術分野において周知の方法を用いてクローニングし、産生して精製した(Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY)。配列をコードする全ての得られた核酸を、国際公開第2014/043435号に記載のように、N末端Hisタグと融合したpSE420(RI)NX(アミノ酸配列M1−A2−H3−H4−H5−H6−H7−H8−をコードする)にクローニングし、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)株BL21(DE3)(New England Biolabs社、ドイツ、フランクフルト)内で発現した。明確にするため、本発明における配列番号2〜配列番号108に相当する、表1〜5および表7中の変異HPPDポリペプチドからのそれぞれのアミノ酸交換を含む全ての一覧した位置は、配列番号1に相当するN末端Hisタグのない天然野生型HPPDアミノ酸配列を表す。
HPPDポリペプチドの活性を、結合HPPD活性アッセイを用いてHPPD阻害剤の非存在または存在下において決定した(図1)。
変異HPPDポリペプチドの耐性をHPPD阻害型除草剤の異なる利用可能な化学分類(トリケトン類、イソキサゾール類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、またはN−(テトラゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類)に対して決定する場合、本発明の新規実施態様のいくつかは、参照野生型HPPD(配列番号1)と比較して有意に改良されているだけでなく、実施例として本発明の配列番号2を有する従来技術の変異HPPDポリペプチド(例えば、国際公開第2014/043435号に開示されているものの様な)より予想外に良好であることが明らかになった。
配列番号8に相当する変異HPPDポリペプチドから始まって、アミノ酸330(配列番号12参照)のさらなる変化は、さらに改良されたHPPD阻害剤耐性を示す(表3参照)。
実施例3に従って、化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、化合物2(2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、およびメソトリオン(MST)の濃度を増加して、初期反応速度を測定することにより、データを得た。概して、HPPの6つの異なる濃度(0〜1350μM)およびそれぞれの阻害剤の4つの異なる濃度を適用した(図4参照)。阻害剤濃度をそれぞれのHPPDポリペプチド/阻害剤対のために選定して動的データを生成した、すなわち、より低い耐性を有する変異体をより低い阻害剤濃度の範囲で分析し、1200μM以下の濃度を最大耐性を有する変異体用に使用した。GraphPad Prism(Windows用バージョン6.00、GraphPad Software社、米国、カリフォルニア州ラホヤ)を競合的阻害モードに従った制限を適用してデータ解析および速度定数のフィッティングのために使用した。明らかな異常値が出現した場合、または非常に高い基質濃度で得られた活性が競合的阻害モードを基礎とする数学に従わなかった場合、それぞれの値をフィッティングから除外した。
変異HPPDポリペプチドを、茶色アッセイを用いて分析した(国際公開第2014/043435号)。本発明に従った変異HPPDポリペプチドを発現する細菌細胞を、LB寒天、発現ベクターpSE420(RI)NX用選択剤(国際公開第2014/043435号)、5mMチロシン(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、42mMのコハク酸塩(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、および6つの異なる濃度のHPPD阻害型除草剤化合物1(0〜500μM)を含有する固形培地上にスポッティングすることによりHPPD阻害剤耐性について96ウェルフォーマットで評価した。
本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)は、250μMの化合物1において、わずかな茶色色素沈着のみ呈し、500μMの化合物1において茶色色素沈着は見られず、細胞内で発現されたHPPDポリペプチドが完全に阻害することを例証した。 比較すると、配列番号31、32、96、および特に配列番号104を有する表6に示したいくつかの変異HPPDポリペプチドは、25、50、100、250、およびさらに500μMの化合物1の存在下、より強い茶色の発色を示す。
基本的にPaz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206に記載の方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換ダイズ半種子外植体を用いる記載の方法など当技術分野において周知の方法を使用することにより、ダイズの形質転換を行った。選択マーカーとしてHPPD阻害型除草剤「テンボトリオン」を使用することにより、形質転換体を同定した。若芽の出現を観察し、HPPD阻害型除草剤テンボトリオンに対する耐性の指標として記録した。耐性トランスジェニック新芽は、HPPD阻害型除草剤テンボトリオンで処理していない野生型ダイズ新芽と同等の正常な緑化を示したが、同量のHPPD阻害型除草剤テンボトリオンで処理した野生型ダイズ新芽は完全に白化した。これは、それぞれのHPPDポリペプチドの存在が、テンボトリオンなどのHPPD阻害型除草剤に対する耐性を可能とすることを示した。
配列番号32、配列番号96、および配列番号31に相当する変異HPPDポリペプチドを有するT0ダイズイベントの90%より多くは、50%未満の葉の損傷を有し、従って、本発明の配列番号2に相当する83%の割合の従来技術のHPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)T0集団より良好である。加えて、配列番号32に相当する変異HPPDポリペプチドを有するT0ダイズイベントの約72%は、10%未満の葉の損傷を示し、これは、また、本発明の配列番号2に相当する従来技術のHPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)を過剰発現するT0ダイズイベント集団(54%)と比較して改良を示している。
当技術分野において周知の方法、特に好ましくは、国際公開第00/71733号に記載のものにおける方法を使用することにより、ワタ形質転換を行う。再生植物を温室に移動する。順応期間後、十分に成長した植物に、HPPD阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した100または200gAI/haに相当するテンボトリオンを散布する。散布後7日目に、HPPD阻害型除草剤での処理による症状を評価し、同条件下で同処理をした野生型ワタ植物に観察された症状と比較する。
トウモロコシ植物およびトウモロコシ形質転換における安定な発現のための植物発現カセットの構築は当技術分野において周知であり、この特定の例では、国際公開第2014/043435号および国際公開第2008/100353号に方法は記載されており使用した。本願における変異HPPDポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、EPSPSタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列でスタックして、EPSPSを標的とする除草剤に対する耐性を付与する。EPSPS遺伝子を単離し、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)(国際公開第2008/100353号)から変異し、輸送ペプチド配列とインフレームで結合して翻訳されたタンパク質の転座を葉緑体に導いた。それぞれ、EPSPS遺伝子のクローンの上流および下流である、ユビキタスプロモーター(サトウキビ由来ユビキチン4プロモーター、米国特許第6,638,766号)、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス由来35S転写終結配列で、安定な発現が達成する。
本発明のHPPD阻害剤耐性ポリペプチドを単独、またはグリホサートに対する耐性を付与する遺伝子および/またはグルホシネートに対する耐性を付与するかまたは本発明のHPPD阻害剤耐性ポリペプチドのみを含む「植物発現カセット」を有する遺伝子と共に発現するダイズ植物を、異なるHPPD阻害型除草剤化学分類に対する耐性について試験した。ELISAタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在について、トランスジェニック植物をルーチン的に分析した(項目DおよびHの詳細説明参照)。選択培地で回収し、検出可能HPPDトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみを再生し、温室に移動し、温室においてT0ダイズイベントのHPPD阻害型除草剤耐性分析のためにV2〜V4成長段階で使用した(実施例6)。HPPD阻害型除草剤を含む化学配合物に硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した。散布後5〜21日目に除草剤耐性評価を行った。
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のため例証および実施例を用いて少し詳しく記載したが、特定の変更および修飾が添付の請求の範囲内で実施してもよいことは明らかであろう。
Claims (31)
- (a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリンを含んでなるアミノ酸配列からなる4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)ポリペプチドをコードする組換え核酸分子であって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、
前記コードされたHPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換え核酸分子。 - 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
i.配列番号1のアミノ酸位置204に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置310に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置331に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
xi.配列番号1のアミノ酸位置339に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
xii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
xiii.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
xiv.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項1に記載の組換え核酸分子。 - 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項1に記載の組換え核酸分子。 - 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項1に記載の組換え核酸分子。 - そのヌクレオチド配列が、植物内で発現するように設計された合成配列である、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子。
- そのヌクレオチド配列が、植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を誘導可能なプロモーターに操作可能に連結している、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子。
- 前記HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、ピラゾロン類からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子。
- 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項7に記載の組換え核酸分子。
- 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
- 細菌宿主細胞である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物。
- 前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群より選択される、請求項12に記載の植物。
- 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック種子。
- HPPDポリペプチドを含んでなる組換えポリペプチドであって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記HPPDポリペプチドが(a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリンを含んでなり、
前記HPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換えポリペプチド。 - 前記HPPDポリペプチドが、
i.配列番号1のアミノ酸位置204に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置310に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置331に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
xi.配列番号1のアミノ酸位置339に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
xii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
xiii.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
xiv.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項15に記載の組換えポリペプチド。 - 前記HPPDポリペプチドが、
i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項15に記載の組換えポリペプチド。 - 前記HPPDポリペプチドが:
i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジン;および/または
ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸;および/または
v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン;および/または
vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
viii.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
請求項15に記載の組換えポリペプチド。 - HPPDポリペプチドを含んでなる組換えポリペプチドであって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記HPPDポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン、配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリン、配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてバリン、および配列番号1のアミノ酸位置345に対応するアミノ酸位置においてバリンを含んでなり、
前記HPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換えポリペプチド。 - HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項15〜19のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
- 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項20に記載の組換えポリペプチド。
- HPPD阻害型除草剤に耐性活性を有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸分子を発現する条件下で、請求項9に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
- そのゲノム内に安定に組み込まれたDNAコンストラクトを有し、前記コンストラクトが請求項1、2、3、または4のいずれかに記載の組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、植物。
- 前記植物が、植物細胞、植物組織、および植物種子からなる群から選択される、請求項23に記載の植物。
- 前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群から選択される、請求項23に記載の植物。
- そのゲノム内に安定に組み込まれたDNAコンストラクトを有し、前記DNAコンストラクトが請求項1、2、3、または4のいずれかに記載の組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、請求項23に記載の植物のトランスジェニック種子。
- 請求項23に記載の植物またはその種子を圃場に植え付けること、および前記圃場に有効濃度のHPPD阻害型除草剤を施用することを含む、圃場の雑草の防除方法。
- 前記HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を植物に付与するための、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子を含んでなる組成物。
- 請求項1〜4のいずれかの組換え核酸分子、または請求項15〜19のいずれかに記載の組換えポリペプチドを含んでなる、商品生産物であって、前記生産物が、完全または加工した種子または穀物、動物飼料、コーンミールまたはダイズミール、トウモロコシ粉またはダイズ粉、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、および、調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイル穀物からなる群から選択される、前記生産物。
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