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JP6873979B2 - Hppd変異体および使用方法 - Google Patents

Hppd変異体および使用方法 Download PDF

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JP6873979B2 JP2018512938A JP2018512938A JP6873979B2 JP 6873979 B2 JP6873979 B2 JP 6873979B2 JP 2018512938 A JP2018512938 A JP 2018512938A JP 2018512938 A JP2018512938 A JP 2018512938A JP 6873979 B2 JP6873979 B2 JP 6873979B2
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ニーナ、ボブスト
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Description

本発明は、植物分子生物学、具体的には、HPPD阻害型除草剤に対する耐性が改善された新規HPPDポリペプチドに関する。
4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)は、チロシン分解産物であるパラヒドロキシフェニルピルビン酸(本明細書ではHPPと略称される)を、植物におけるトコフェロールおよびプラストキノンの前駆体であるホモゲンチジン酸(本明細書ではHGAと略す)へと転換する反応を触媒する酵素である(Crouch N.P. et al. (1997), Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134:1388-1400)。トコフェロールは、膜関連の抗酸化剤として作用する。プラストキノンは、最初にPSIIとチトクロムb6/f複合体との間で電子伝達体として作用し、次にカロテノイドの生合成に関わるフィトエンデサチュラーゼに対する酸化還元補因子となる。
現在までに、NCBIデータベースに収載される様々な生物由来の1000を超える核酸配列が、HPPDドメインを有する推定上のタンパク質をコードするものとして注釈が付けられてきた。しかしながらその多くは、インビトロアッセイでも植物体への応用においてもタンパク質がHPPD酵素活性を有することは証明されておらず、また、このようなHPPDタンパク質を植物に発現させた際に、HPPD阻害型除草剤に対する耐性を獲得することも証明されていない。いくつかのHPPDタンパク質およびその一次配列は、最新技術に記載されており、具体的には、シュードモナス(Pseudomonas)(Rueetschi et al.、Eur. J. Biochem.、205、459-466、1992、国際公開第96/38567)、コルジア(Kordia)(国際公開第2011/076889号)、シネココッカス(Synechococcus)(国際公開第2011/076877号)、アシドバクテリウム(Acidobacterium)およびムシラジニバクター(Mucilaginibacter)(国際公開第2015/022634号)、ロドコッカス(Rhodococcus)(国際公開第2011/076892号)などの細菌、ブレファリスマ(Blepharisma)(国際公開第2011/076882号)などの原生生物、ピクロフィルス(Picrophilus)(国際公開第2011/076885号)などのユリ古細菌門、クラミドモナス・レインハーディ(Chlamydomonas reinhardtii)(スペイン特許第2275365号;国際公開第2011/145015号)、セネデスムス(Scenedesmus)(国際公開第2015/022634号)などの藻類、アラビドプシス(Arabidopsis)(国際公開第96/38567号、GENBANK(登録商標)AF047834)、ニンジン(国際公開第96/38567号、GENBANK(登録商標)87257)、アベナ・サティバ(Avena sativa)(国際公開第2002/046387号、国際公開第2011/068567号)、コムギ(国際公開第2002/046387号)、ブラキアリア・プラティフィラ(Brachiaria platyphylla)(国際公開第2002/046387号)、センクルス・エキナツス(Cenchrus echinatus)(国際公開第2002/046387号)、ロリウム・リジダム(Lolium rigidum)(国際公開第2002/046387号)、フェスツカ・アルンディナケア(Festuca arundinacea)(国際公開第2002/046387号)、セタリア・ファーベリ(Setaria faberi)(国際公開第2002/046387号)、エレウシネ・インデイカ(Eleusine indica)(国際公開第2002/046387号)、モロコシ(国際公開第2002/046387号、国際公開第2012/021785号)、corn(国際公開第2012/021785号)、コプティス・ジャポニカ(Coptis japonica)(国際公開第2006/132270号)、レムナ(Lemna)(国際公開第2015/022634号)などの植物、またはマウスもしくはブタなどの哺乳類、またはコクシジオイデス(Coccicoides)(GENBANK(登録商標) COITRP)などの真菌のHPPDタンパク質である。
HPPDの阻害によって光合成の脱共役および補助集光性色素の欠乏が誘導され、かつ最も重要なことには、通常はカロテノイドの作用である光防護が欠如するために、UV照射および活性酸素種によって葉緑素が破壊される(白化)(Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149)。光合成の活発な組織での白化は、成長の阻害および植物の死をもたらす。
酵素に特異的に結合して、HPPDを阻害し(以後、HPPD阻害型除草剤と呼ぶ)、かつ、HPPのHGAへの形質転換を阻害するいくつかの分子が、非常に有効な除草剤であることが証明されてきた。
現在最も多く市販されているHPPD阻害型除草剤は、以下に一覧にして示すこれらの化学族のうちの一つに属する:
1)トリケトン類、例えば、ベンゾビシクロン[3−[2−クロロ−4−メチルスルホニル)ベンゾイル]−4−(フェニルスルファニル)ビシクロ[3.2.1」オクタ−3−エン−2−オン];スルコトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]、メソトリオン[すなわち、2−[4−(メチルスルホニル)−2−ニトロベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン](本明細書ではMSTと略す);テンボトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[(2,2,2,−トリフルオロエトキシ)メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン];テフリルトリオン[すなわち、2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[[(テトラヒドロ−2−フラニル)メトキシ]メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]];ビシクロピロン[すなわち、4−ヒドロキシ−3−[[2−[(2−メトキシエトキシ)メチル]−6−(トリフルオロメチル)−3−ピリジニル]カルボニル]ビシクロ[3.2.1]オクタ−3−エン−2−オン];フェンキノトリオン[すなわち、2−[[8−クロロ−3,4−ジヒドロ−4−(4−メトキシフェニル)−3−オキソ−2−2−キノキサリニル]カルボニル]−1,3−シクロヘキサンジオン]、および国際公開第2007/088876号、国際公開第2009/016841号、国際公開第2010/089993号、国際公開第2010/116122号、国際公開第2012/002096号、国際公開第2011/31658号、国際公開第2012/136703号、特開2013−040141号公報、国際公開第2013/080484号、国際公開第2014/014904号、国際公開第2014/031971号、米国特許出願公開第2014/0106968号に記載のもの;
2)ジケトニトリル類、例えば、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−メチルスルホニル−4−トリフルオロメチルフェニル)−プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−1−[4−(メチルスルホニル)−2−トリフルオロメチルフェニル]−3−(1−メチルシクロプロピル)プロパン−1,3−ジオン;
3)イソキサゾール類、例えば、イソキサフルトール[すなわち、(5−シクロプロピル−4−イソオキサゾリル)[2−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン]。植物では、イソキサフルトール(本明細書中、IFTと略す)は、HPPD阻害剤特性を示すジケトニトリル化合物であるDKNに急速に代謝される;
4)ヒドロキシピラゾール類、例えば、ピラゾキシフェン[すなわち、2−[[4−2,4−ジクロロベンゾイル)−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]−1−フェニルエタノン];ベンゾフェナップ[すなわち、2−[[4−(2,4−ジクロロ−3−メチルベンゾイル)−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]−1−(4−メチルフェニル)エタノン];ピラゾリネート[すなわち、(2,4−ジクロロフェニル)[1,3−ジメチル−5−[[(4−メチルフェニル)スルホニル]オキシ]−1H−ピラゾール−4−イル]メタノン];ピラスルホトール[すなわち、(5−ヒドロキシ−1,3−ジメチル−1H−ピラゾール−4−イル)[2−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン];トプラメゾン[すなわち、[3−(4,5−ジヒドロ−3−イソオキサゾリル)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)フェニル](5−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)メタノン];トルピラレート[すなわち、1−[[1−エチル−4−[3−(2−メトキシエトキシ)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)ベンゾイル]−1H−ピラゾール−5−イル]オキシ]エチルメチルカルボネート];
5)国際公開第2011/035874号、および国際公開第2012/123416号、国際公開第2012/123409号、欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載の、および国際公開第2013/072300号、国際公開第2013/072402号、国際公開第2013/072450号、国際公開第2014/184014号、国際公開第2014/184019号、国際公開第2014/184058号、国際公開第2014/192936号、国際公開第2015/052152号、国際公開第2015/052178に記載のN−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、および国際公開第2012/126932号、および欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/124245号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/1053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載のN−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類;例えば、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ);2−クロロ−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(エチルスルホニル)−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド;
6)国際公開第2012/028579、および国際公開第2012/123409号、国際公開第2013/017559号、欧州特許出願公開第2562174号、国際公開第2013/064459号、国際公開第2013/064457号、国際公開第2013/087577号、国際公開第2013/104705号、国際公開第2013/124238号、国際公開第2013/124228号、国際公開第2013/124245号、国際公開第2013/164331号、国際公開第2013/164333号、国際公開第2013/174843号、国際公開第2013/037342号、国際公開第2014/053473号、国際公開第2014/086737号、国際公開第2015/007662号、国際公開第2015/007632号、国際公開第2015/007633号に記載のN−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類;例えば、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および国際公開第2013/072528号、国際公開第2013/076315号、国際公開第2013/076316号、国際公開第2013/083859号、国際公開第2013/092834号、国際公開第2013/139760号、国際公開第2013/144231号、国際公開第2014/126070号、国際公開第2014/135654号、国際公開第2014/184015号、国際公開第2014/184016号、国際公開第2014/184017号、国際公開第2014/184073号、国際公開第2014/184074号、国際公開第2014/192936号、国際公開第2015/022284号、国際公開第2015/052153号、国際公開第2015/052173号に記載のもの;
7)国際公開第2013/050421 および国際公開第2013/083774号、国際公開第2014/154828号、国際公開第2014/154882号に記載のピリダジノン誘導体;
8)国際公開第2013/054495号に記載のオキソピラジン(oxoprazine)誘導体;
9)国際公開第2013/144234号、国際公開第2015/007564号に記載のN−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類;
10)国際公開第2014/154829号に記載のトリアジノン類;ならびに
11)欧州特許出願公開第2881387号および欧州特許出願公開第2881388号に記載のピラゾロン類。
これらのHPPD阻害型除草剤は、それらが迅速に分解されるトウモロコシ(ズィー・メイス(Zea mays))、コメ(オリザ・サティバ(Oryza Sativa))、およびコムギ(トリチカム・アエスチバム(Triticum aestivum))など代謝耐性を示す作物の圃場における牧草および/または広葉雑草に対して使用することができる(Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133-142)。これらHPPD阻害型除草剤の使用範囲を拡大するため、植物、特に代謝耐性をもたないかまたは代謝耐性の低い植物に対して、農業用現地条件下で許容されるレベルの耐性を付与する幾つかの試みが為されてきた。
HPPDを介したホモゲンチジン酸の産生を回避する試みに加え(米国特許第6,812,010号)、除草剤に関して十分な量の植物内の標的酵素が産生されるように、感受性の酵素を過剰発現することも行われてきた(国際公開第96/38567号)。HPPDポリペプチドを過剰発現することで、IFTのジケトニトリル誘導体(本明細書でDKNと略す)に対するより良好な発芽前の耐性がもたらされたが、この耐性レベルは発芽後の処理に対する耐性として十分なものではなかった(Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61: 269-276)。
HPPのHGAへの形質転換を触媒する特性は保持しているが、変異前の天然HPPDポリペプチドよりもHPPD阻害剤に対する感受性の低い標的酵素を得るために、3番目のストラテジーはHPPDポリペプチドを変異させることであった。
このストラテジーは、ジケトニトリルファミリーに属する二つのHPPD阻害型除草剤(国際公開第99/24585号)である2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−メチルスルホニル−4−トリフルオロメチルフェニル)−プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−1−[4−(メチルスルホニル)−2−トリフルオロメチルフェニル]−3−(1−メチルシクロプロピル)プロパン−1,3−ジオン(欧州特許第496630号)に対して耐性のある植物の産生に首尾良く応用された。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile、および特にGly336Trp(変異アミノ酸の位置は、本発明の配列番号1に相当するシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDポリペプチドを参照して示される)は、これらのジケトニトリル除草剤による処理に対する耐性が増大に寄与する変異として同定された。
かなり最近に、タバコおよびダイズの色素体ゲノムへのシュードモナス・フルオレッセンスHPPD遺伝子の導入は、IFTの発芽後の施用に対する耐性を付与する核形質転換よりも効果的であることを示した(Dufourmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5(1):118-3)。
国際公開第2004/024928号では、発明者らが、これらの植物細胞内へのHPP前駆体の流量を増大させることにより、植物細胞におけるプレニルキノンの生合成(例えばプラストキノン類、トコフェロール類の合成)を増大させようとした。これは、プレフェナート脱水素酵素(PDH)の過剰発現により、前記前駆体の合成を「シキミ酸」経路と結び付けることによって為された。彼らは、PDH酵素をコードする遺伝子およびHPPD酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、前記植物のHPPD阻害型除草剤に対する耐性の増大を可能とすることにも注目した。
国際公開第2009/144079号では、シュードモナス・フルオレッセンスHPPDタンパク質の位置336における特異的変異を有するヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードする核酸配列、およびHPPD阻害型除草剤に対して耐性がある植物を得るためのその使用について開示されている。
国際公開第2002/046387号では、植物に由来するHPPDポリペプチドのいくつかのドメインは、様々なHPPD阻害型除草剤に対する耐性の付与に関連し得ることが同定されたが、記載されたドメイン機能の影響を裏付ける植物体におけるデータも、生化学的データも示されていなかった。
国際公開第2008/150473号では、HPPD阻害型除草剤に対する改善された耐性を得るために、二つの異なる耐性機構−変異HPPD酵素をコードする改変アビーナ・サティバ(Avena sativa)遺伝子およびCYP450トウモロコシモノオキシゲナーゼ(nsf1遺伝子)−の組み合わせが例示されていたが、両タンパク質の組み合わせに基づく相乗効果を示すデータは開示されていなかった。
さらに、例えば、アビーナ・サティバ(米国特許出願公開第2011/0173718号)またはアラビドプシス(Arabidopsis)(国際公開第2013/064964号、国際公開第2014/177999号)からの耐性HPPDをコードする遺伝子だけでなく、HST(ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ)タンパク質をコードするいくつかの植物遺伝子を組み合わせた過剰発現によるHPPD阻害型除草剤に対して耐性がある植物の産生方法について開示されている。しかしながら、いくつかの選択されたHPPD阻害型除草剤に対する耐性レベルはどちらかといえば限られたものであった。
国際公開第2011/094199号および米国特許出願公開第2011/0185444号では、HPPD阻害剤IFTに対する数百のダイズ野生型株の耐性を評価した。わずかな数株が、除草剤に対する妥当なレベルの耐性を示した。耐性に関与する想定されるQTL(量的形質遺伝子座)が同定された。ゲノムのこの領域では、ABC輸送体をコードする遺伝子が、観察されたHPPD阻害型除草剤に対する改良された耐性に寄与する主要な形質であるとして同定された。しかしながら、同定された遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、試験したHPPD阻害型除草剤に対する耐性の改善を示さなかった。
国際公開第2010/085705号および米国特許出願公開第2014/0053295号では、アビーナ・サティバHPPDポリペプチドのいくつかの変異体が開示された。いくつかの変異体(variants)は、トリケトンである「メソトリオン」に対するインビトロ耐性の改善を示したが、タバコ植物では非常にわずかな変異体しか発現されなかったことが分かった。加えて、これらの変異体を発現するタバコ植物のいずれも、野生型アビーナ・サティバHPPD遺伝子を発現するタバコ植物に比較して、MSTまたはIFTに対する耐性の改善を示さなかった。米国特許出願公開2014/0053295号では、少数のアビーナ・サティバHPPD変異体がダイズ植物で発現され、野生型アビーナ・サティバ(Avena sativa)HPPD遺伝子を発現する植物から知られているのと同様にMSTに対する良好な耐性レベルを有した。しかしながら、テンボトリオンまたはIFTなどの他の除草剤は、これらのダイズ植物においてずっと高い葉の損傷を引き起こした。
米国特許出願公開第2012/0042413号は、HPPD活性を有するが、少なくとも1つのHPPD阻害型除草剤に対して特定の非感受性も示す変異トウモロコシHPPDポリペプチドについて記載しており、HPPDポリペプチドの異なる位置における特定の組の変異を示唆し、最終的に、生化学データならびに少数のこのような変異HPPDポリペプチドを含む植物の耐性レベルについて開示している。欧州特許第2453012号では、いくつかのHPPDポリペプチド変異体について記載されているが、記載された変異体の耐性改善は、植物体において、いくつかのHPPD阻害型除草剤に対して示されなかった。
国際公開第2014/043435号には、配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン;または配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリンおよび配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてトリプトファン;または配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてセリン、配列番号1のアミノ酸位置336に対応するアミノ酸位置においてセリン、配列番号1のアミノ酸位置339に対応するアミノ酸位置においてスレオニン、および配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;または配列番号1のアミノ酸位置188に対応するアミノ酸位置においてトリプトファンおよび配列番号1のアミノ酸位置336に対応するアミノ酸位置においてトリプトファン;または配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号1のアミノ酸位置336に対応するアミノ酸位置においてセリン、および配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸;または配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号1のアミノ酸位置336に対応するアミノ酸位置においてトリプトファン、配列番号1のアミノ酸の位置339に対応するアミノ酸の位置においてアラニン、および配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてグルタミンを含んでなるアミノ酸配列からなるシュードモナス属(Pseudomonas spp.)HPPDポリペプチドをコードする組換え核酸分子について記載されている。
現在記載され、部分的に商業化されているHPPD阻害型除草剤は、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用する(Morrison (1982) Trends Biochem. Sci. 7, 102-105参照)。これらの阻害剤は緩徐に結合する(すなわち、これらは遅い会合速度を有する、kon)が、HPPDポリペプチドと共有結合せず(すなわち、これらは時間依存性阻害を起こす)、酵素とのその非常に強固な相互作用が理由で非常にゆっくりと遊離する(すなわち、これらは例外的に遅い解離速度を有する、koff)。
これらの阻害剤は非常に強固に結合するので、酵素を用いた化学量論的滴定が可能である。
遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤が桁外れに強力なHPPD阻害剤であるだけでなく、加えて、これらを雑草防除用の魅力的な農薬にする特徴を有することを次第に認識された。理想的にHPPDポリペプチド活性部位当たり1つのみの阻害剤分子が該活性を完全に阻害し、植物細胞内に遊離阻害剤分子の非存在下でさえ長期間この阻害レベルを維持するのに十分である程度まで、遅い解離速度は阻害剤有効性を向上させる。これは、作物成長地区内の望ましくない雑草を防除するため、これらの阻害剤の低施用速度に変わる。
HPPD阻害および除草力の達成が目標である場合、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤の特性は有利である。しかしながらこれらの阻害剤に対するHPPDポリペプチド耐性が発明となる場合、これらの特性は主要なデメリットである。
阻害剤の結合およびHPPDポリペプチドの阻害がさらに起こることができるので、阻害剤の酵素に対する親和性(ki)を単独で低下させるHPPDポリペプチドの変異はHPPD阻害を完全に克服せず、従って、阻害の達成レベルが植物細胞内の遊離阻害剤の非存在下でさえ長期間維持されるだろう。加えて、一部市販されているHPPD阻害型除草剤は、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)、トリアジノン類、およびピラゾロン類などの構造的に多種多様な化学分類に属する。現在記載された最新技術のHPPDポリペプチドは、構造的に多種多様なHPPD阻害型除草剤に対する耐性のむしろ狭い範囲を示す。
全ての現在記載され、一部市販のHPPD阻害型除草剤の上記動的特性が理由で、今まで、これらを生成するための多くの努力にもかかわらず、HPPD阻害型除草剤に対する完全耐性を有するHPPD阻害型除草剤耐性植物で発表されたものはない。
本発明では、HPPDポリペプチドおよび様々な化学分類に属する1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する完全耐性を示すHPPDポリペプチドを含む植物を記載する。いくつかの分類のHPPD阻害型除草剤に対する最大かつ広範な耐性を有するこのようなHPPDポリペプチドを生成するために、それぞれのHPPD阻害型除草剤に関するHPPDポリペプチドとの親和性(ki)を低減し、かつ同時に、野生型およびいくつかの変異HPPDポリペプチドが高レベルの阻害剤耐性を得ることから分かるように、遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤の解離速度(koff)の向上を保証することは重要である。
本発明では、HPPD阻害型除草剤に対する親和性を有しないかまたは著しく低い親和性しか有しない、同時に、酵素のHPPD阻害型除草剤の解離速度は、HPPD阻害型除草剤がもはや遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用しないが、この代わりに、完全に可逆的な阻害剤になる程度まで増大する、1組のHPPDポリペプチドを開発することにより、この目的を達成した。
本発明では、前述の特徴(すなわち、HPPD阻害型除草剤に対する親和性を有しないかまたは著しく低い親和性しか有しない、酵素のHPPD阻害型除草剤の解離速度向上;HPPD阻害型除草剤がもはや遅延結合性もしくは遅延強力結合性阻害剤として作用しないが、完全に可逆的な阻害剤になる)を有する新規な1組のHPPDポリペプチドを得る組成物および方法を提供する。組成物としては、HPPDポリペプチドおよびこのようなHPPDポリペプチドをコードする単離した、組換えまたはキメラ核酸分子、これらの核酸分子を含んでなるベクターおよび宿主細胞が挙げられる。組成物としては、これらのポリペプチドに対する抗体も挙げられる。ヌクレオチド配列を、微生物および植物を含む生物の形質転換および発現のためのDNAコンストラクトまたは発現カセットで使用することができる。ヌクレオチド配列は、これに限定されないが、微生物または植物を含む生物における発現のために設計された合成配列であってもよい。
組成物としては、(a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリン、ならびに、必要に応じて、配列番号3〜108のいずれかに記載のHPPDポリペプチドならびにそのフラグメントを含む配列番号1のアミノ酸位置204、213、264、268、270、310、315、330、331、338、339、340、344、345に対応する位置において1つ以上のさらなるアミノ酸置換を有するHPPDポリペプチドをコードする核酸分子を含む、除草剤耐性HPPDポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。
組成物は、本発明の核酸配列を植物、植物細胞、組織、および種子のゲノム内に導入することによる、HPPD阻害型除草剤に対して耐性がある形質転換植物、植物細胞、組織、および種子も含んでなる。配列の導入は、HPPD阻害型除草剤を植物に施用して(to be applied)、HPPD阻害剤に感受性のある雑草または他の非形質転換植物を選択的に死滅するが、形質転換された生物を死滅しないことを可能とする。加えて、配列を、1つ以上のHPPD阻害型除草剤の存在下で成長する植物細胞を選択するためのマーカーとしても使用することができる。
HPPD阻害型除草剤に対する耐性活性を有するHPPDポリペプチドの同定方法をさらに提供する。
本発明の組成物および方法は、HPPD阻害型除草剤に対する増強された耐性を有する生物の産生に有用である。これらの生物および該生物を含んでなる組成物は、農業目的に望ましい。本発明に従ったHPPDポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる植物または種子を、圃場で成長し、植物製品を得るため収穫することができる。本発明の組成物は、製品または生物中、HPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチドまたは核酸の存在を検知するためにも有用である。
例示のHPPDポリペプチドの酵素活性を決定するために本発明で使用した結合HPPD活性アッセイの単純化した模式図を示す。 結合HPPD活性アッセイにおいて実施例3に従い200μMのHPPおよび0、4または13μMの化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)を用いて観察された野生型およびノックアウトHPPDポリペプチドの生抽出サンプル中の320nmにおける吸光度(Abs320)の例示の動態変化を示す。配列番号1のアミノ酸位置162に対応するアミノ酸位置においてヒスチジンをアラニンに交換することにより、ノックアウトHPPDポリペプチドを得た。HPPDポリペプチドの活性部位における鉄原子の配位結合へのその関与が理由でこの位置の重要性は周知である(Serre et al. (1999), Structure, 7, 977-988)。 結合HPPD活性アッセイにおいて高基質濃度および0、48、240または1200μMの化合物2(2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)で観察された実施例3に従い配列番号17に相当する精製変異HPPDポリペプチドの320nmにおける吸光度(Abs320)の例示の動態変化を示す。見かけの速度定数(kapp)を、箱型時間枠(boxed timeframe)内の経時的なシグナル変化(singal change over time)(ΔAbs320/分)(delta_Abs320/min)として決定した。 競合阻害モデルに従ってフィッティングすることにより、異なる阻害剤および基質(HPP)濃度を有する配列番号17に相当する精製変異HPPDポリペプチドを用いて例示のkiの決定から得られたデータを図示する: a)実施例3に従った所与の基質濃度における0〜0.0012Mの化合物2の存在下、320nmにおける吸光度の経時的な動態変化(ΔAbs320/分); b)実施例3に従った所与の基質濃度における0〜0.0012Mの化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)の存在下、320nmにおける吸光度の経時的な動態変化(ΔAbs320/分); c)実施例3に従った所与の基質濃度における0〜0.0012MのMSTの存在下、320nmにおける吸光度の経時的な動態変化(ΔAbs320/分); d)実施例3に従った所与の基質濃度における0〜0.0012MのDKNの存在下、320nmにおける吸光度の経時的な動態変化(ΔAbs320/分)。
図3および4中に、例えば、配列番号17で示すように、表2、3、4、および5に纏めた全例示のHPPDポリペプチドを測定し、解析した。
発明の具体的説明
全てではないがいくつかの本発明の実施態様を示す添付の図面を参照して、以後、本発明をより完全に説明する。実際に、これらの発明は多くの異なる形態で具体化され得るものであり、本明細書に記載された実施態様に限定されると解釈するべきではなく;むしろこれらの実施態様は本開示が適応可能な法的要件を満たすように提供される。同様の数字は全体にわたって同様の要素を表す。
これらの発明に関係し、前述の記載および添付の図面中に示された教示の利益を享受する当業者は、本明細書に記載された本発明の多くの改変および他の実施態様を思いつくであろう。従って、本発明は開示された特定の実施態様に限定されるものではなく、改変および他の実施態様が添付のクレームの範囲内に包含されることを意図していることを理解するべきである。本明細書中、特定の用語を使用しているが、これらは限定する目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用されるものである。
概要
HPPDを介したホモゲンチジン酸の産生を迂回すること(米国特許第6,812,010号)、除草剤に関して十分である量の植物内の標的酵素を産生するように、感受性のある酵素を過剰発現すること(国際公開第96/38567号)、およびHPPのホモゲンチジン酸への転換を触媒するその特性は保持しながら、変異前の天然HPPDよりもHPPD阻害剤に対する感受性の低い標的酵素を得るためにHPPDを変異させることを含む、広範囲のHPPD阻害型除草剤に対する農学的に許容されるレベルの耐性を植物に付与するために、いくつかの試みが為されてきた。
上記いくつかのHPPD阻害型除草剤に対する耐性を示す植物の開発のために得られたこれらの成功にもかかわらず、様々な化学分類に属するより新規またはいくつかの異なるHPPD阻害型除草剤、具体的には、トリケトン類(例えば、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(例えば、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(例えば、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(例えば、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(例えば、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド)、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、トリケトン類、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類に属するHPPD阻害型除草剤に対する植物耐性を開発および/または改善する必要性がいまだにある。
従って、本発明は、HPPD阻害型除草剤に対する耐性を調節するための改善された組成物および方法を提供する。トリケトン類(例えば、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(例えば、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(例えば、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(例えば、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(例えば、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のものなどのHPPD阻害型除草剤は、広範囲の経済的に重要な単子葉植物および双子葉植物の有毒な一年生植物に対する極めて優れた除草剤活性を有する。活性物質は、根茎からの新芽、貯蔵木材、または他の多年生器官を産生し、かつ、制御が困難である多年生有害植物に対しても効率的に作用する。本発明の意味の範囲内で、「除草剤」は、それ自体で除草剤として活性物質であるか、または、例えば、その活性を増強する薬剤(効力増強剤)またはその活性を制限する薬剤(緩和剤)など、その有効性を変化させる添加物と組み合わせた物質として理解される。除草剤は、固体もしくは液体アジュバントまたは製剤技術において通常用いられる担体(例えば、天然または再生鉱物性物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、乳化剤、成長促進剤等)、ならびに1つ以上のさらなる除草剤および/または1つ以上の農薬(例えば殺虫剤、抗ウイルス剤、殺微生物剤、抗アメーバ剤、農薬、抗真菌剤、殺菌剤、抗線虫剤、軟体動物駆除剤等)をさらに含んでもよい。
方法は、本発明のHPPD阻害型除草剤に対する耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を用いて生物を形質転換すること、さもなければ、このようなHPPD阻害型除草剤に対する耐性遺伝子を、それを含まない生物に導入すること(例えば交配、細胞融合、または導入された本発明のHPPD阻害型除草剤に対する耐性遺伝子を含む生物を、それを含まない生物と交配して、このような遺伝子を含む子孫を得ることにより)を含む。本発明のヌクレオチド配列は、HPPD阻害型除草剤に対する耐性向上、具体的には、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、またはフェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、またはトルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤に対する耐性向上を示す植物の製造に有用である。
本発明のHPPD阻害型除草剤に対する耐性遺伝子の発現は、「クマロン誘導体除草剤」に対しても耐性をもたらし得る(国際公開第2009/090401号、国際公開第2009/090402号、国際公開第2008/071918号、国際公開第2008/009908号に記載されている)。これに関して、本発明のHPPD阻害型除草剤に対する耐性遺伝子のうちのいずれか1つを、国際公開第2011/145015号、国際公開第2013/064987号、国際公開第2013/064964号、または国際公開第2010/029311号に記載されているように、キメラホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(HST)遺伝子または変異HST遺伝子も発現する植物中で、発現することもできる。本明細書で使用するとき、「クマロン誘導体除草剤」または「HST阻害除草剤」は、5H−チオピラノ[4,3−b]ピリジン−8−オール、5H−チオピラノ[3,4−b]ピラジン−8−オール、オキサチイノ[5,6−b]ピリジン−4−オール、およびオキサチイノ[5、6−b]ピラジン−4−オールのIUPAC命名法に該当する化合物を包含する。
従って、本発明の「HPPD阻害型除草剤に対する耐性」遺伝子は、該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を示す、もしくは該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも長時間特定の濃度のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を示す能力を細胞もしくは生物に付与する、または光合成を行う、成長する、および/またはこのようなタンパク質を発現しない細胞もしくは生物より少ない観察された損傷または成長阻害で再生する能力を細胞もしくは生物に付与するポリペプチドをコードする遺伝子を表す。
「HPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチド」は、該タンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を示す、もしくは該ポリペプチドを発現しない細胞もしくは生物よりも長時間特定の濃度のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を示す能力を細胞もしくは生物に付与する、または光合成を行う、成長する、および/またはこのようなタンパク質を発現しない細胞もしくは生物より少ない観察された損傷または成長阻害で再生する能力を細胞もしくは生物に付与するポリペプチドを含んでなる。
「ポリペプチド」という語は、酵素、抗体および中鎖ポリペプチドおよび10個未満のアミノ酸配列長まで減った短鎖ペプチドなどのタンパク質を含む。
「酵素」という語は、本発明において、パラヒドロキシフェニルピルビン酸をホモゲンチジン酸へ転換する反応を触媒する任意のポリペプチドを意味する。これらとしては、天然酵素、ならびに酵素変異体およびその誘導体が挙げられる。これは、このような酵素の任意のフラグメント、および挿入、欠失、組換えおよび/またはこのアミノ酸配列において天然酵素または酵素変異体と異なる酵素をもたらす他の方法により操作した変異体も含む。これは、翻訳後修飾および/または化学修飾、例えば、グリコシル化、γ−カルボキシル化およびアセチル化したタンパク質分子、前述のタンパク質の1つを含んでなる任意の分子複合体または融合タンパク質も含む。
「ポリペプチド変異体」または「変異ポリペプチド」という語は、変異誘発、好ましくは、それぞれの野生型配列と比較して変更されたアミノ酸配列を部位特異的またはランダム変異誘発により得られた任意のポリペプチド分子を意味する。「耐性を示す」、「耐性」または「耐性の」は、特定のHPPD阻害型除草剤の施用下で生存すること、または未処理細胞または生物から容易に識別できない方法で光合成、タンパク質合成、または呼吸、および再生などの必須の細胞機能を行う能力、またはこのような除草剤で処理しない植物と比較して、HPPD阻害型除草剤で処理した植物の収穫量の有意差がないかもしくはなお改善された収穫量を有する能力(しかし、例えば、国際公開第2011/100302号(その全文を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)に記載される方法など、HPPD阻害型除草剤の施用以外の機構により、雑草を除去または抑制した場合)のいずれかを表す。
HPPD阻害型除草剤に対する耐性を細胞に付与することに加えて、本発明のHPPD核酸配列は、HPPD活性、すなわちパラヒドロキシフェニルピルビン酸(HPP)をホモゲンチジン酸へ転換する反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする。HPPDポリペプチドの触媒活性を、当技術分野において周知の様々な方法により決定してもよい。国際公開第2009/144079号および国際公開第2014/043435号は、様々な適切なスクリーニング法について記載している。
HPPDポリペプチドの酵素活性を、HPPまたはO基質の量の減少の測定、または酵素反応に由来するいずれかの生成物、すなわちホモゲンチジン酸またはCOの蓄積の測定のどちらかを可能とするいずれかの方法により測定することができる。特に、HPPD活性は、国際公開第2009/144079号;Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769;Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516;または国際公開第2012/021785号(これらは参照により本明細書に組み込まれるものとする)に記載の方法によって測定することができる。
本発明の目的のため、「参照」HPPDポリペプチド(またはこのようなポリペプチドをコードするHPPD遺伝子)は、それに対して本発明のHPPDポリペプチドまたはHPPD核酸に比較されるいずれかのHPPDポリペプチドまたは核酸である。本発明のHPPDポリペプチドを記述する目的のため、「タンパク質」および「ポリペプチド」という語を互換的に使用する。この参照HPPDポリペプチドは、天然植物、細菌、または動物HPPDであり得、または国際公開第2009/144079号に記載されたPfP215LおよびPfG336F変異体などの当業者に公知の変異HPPDポリペプチドであり得、または国際公開第2004/043435号に記載のPfHPPDevo33、PfHPPDevo36、PfHPPDevo37、PfHPPDevo40、またはPfHPPDevo41タンパク質(PfHPPDevo41は配列番号2として本願に記載している)のいずれかであり得る。このような参照HPPDポリペプチドを使用して、本発明のどのHPPDポリペプチドまたは核酸が、対象の特定の特性(例えば改善された、同等な、または減少したHPPD阻害型除草剤に対する耐性またはHPPDポリペプチド酵素活性;改善された、同等な、または減少した宿主細胞における発現;改善された、同等な、または減少したタンパク質安定性)を有するかを決定することができる。
本発明において様々な実施態様では、核酸によりコードされたHPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチド(その単離、組換えおよびキメラ遺伝子、核酸、核酸によりコードされたHPPDポリペプチドおよびその組成物を含んでなるベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子、ならびにHPPD阻害型除草剤に対する植物の耐性向上、具体的には、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤に対する耐性向上のために核酸によりコードされたポリペプチドを使用する方法を含む)は、(a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリン、ならびに、必要に応じて、配列番号3〜108のいずれかに記載のHPPDタンパク質を含む配列番号1のアミノ酸位置204、213、264、268、270、310、315、330、331、338、339、340、344、345に対応する位置において1つ以上のさらなるアミノ酸置換を有する。「対応する(corresponding to)」は、標準的な整列アルゴリズムを用いて2つの(または2つ以上の)配列を整列させた場合、配列番号1の位置と比べたヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を表す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける「位置」という語は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の特定の1つの塩基またはアミノ酸を表す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける「部位」という語は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列中の特定の位置または領域を表す。「ポリヌクレオチド」という語は、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子群、プラスミド、遺伝子全部、およびそのフラグメントを含む一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAを含んでなる任意の長さの任意の配列の任意の遺伝子材料に相当する。
1つの実施態様では、本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は:
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドは1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置204に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置310に対応するアミノ酸の位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置331に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(xi)配列番号1のアミノ酸の位置339に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
(xii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
(xiii)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
(xiv)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてロイシンまたはリジン;および/または
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン;および/または
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸;および/または
(v)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン;および/または
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置330に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン;および/または
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置338に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および/または
(viii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
(ix)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン;および/または
(x)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシンまたはアルギニン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;および
(v)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてバリン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置213に対応するアミノ酸の位置においてリジン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてグリシン、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(v)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリンまたはアルギニン;
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
(Vii)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン、
を含んでなり、
(i)配列番号1のアミノ酸の位置264に対応するアミノ酸の位置においてロイシン、
(ii)配列番号1のアミノ酸の位置268に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
(iii)配列番号1のアミノ酸の位置270に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン酸、
(iv)配列番号1のアミノ酸の位置315に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、
(v)配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてバリン;
(vi)配列番号1のアミノ酸の位置344に対応するアミノ酸の位置においてグルタミン、および
(vii)配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてメチオニン
をさらに含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、および
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または
c.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応する位置においてアスパラギン酸、および
d.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン;
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置330に対応する位置においてヒスチジン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン;
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジン、または配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
別の実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明のHPPDポリペプチド(これをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明のHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるその組換えおよびキメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子を含む)は、
a.配列番号1のアミノ酸の位置335に対応するアミノ酸の位置においてプロリン、
b.配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてヒスチジンまたは配列番号1のアミノ酸の位置336に対応するアミノ酸の位置においてアスパラギン酸;
c.配列番号1のアミノ酸の位置337に対応する位置においてセリン;および
d.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応する位置においてバリン
を含んでなるアミノ酸配列からなる。
表1に、本発明に従ったHPPDポリペプチド変異体が3個以上のアミノ酸置換を含んでなる、参照野生型シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDポリペプチド(配列番号1)と比較したそれぞれのアミノ酸位置を纏めている。特に明白に指定しない限り、関連したアミノ酸位置における交換は、配列番号1に相当する参照野生型シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDポリペプチドを常に表す。
Figure 0006873979
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、3文字の略号または1文字略号を用いて表す。下表は、その略号と共に標準アミノ酸の一覧を示す。
Figure 0006873979
遺伝コードが縮重している、すなわち、1つより多いコドントリプレットは同じアミノ酸をコードすることができることは、当業者に周知である。従って、本明細書で提供したアミノ酸配列を、同じアミノ酸配列をコードする異なるコドンを使用する代替の配列により生成することができる。
別の実施態様では、本発明に従ったHPPDポリペプチドは、配列番号1として本明細書に記載のアミノ酸配列と、少なくとも53%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%,または少なくとも99%の配列同一性を有する。
本発明に従って修飾することができる例示のHPPD配列としては、細菌由来のもの、具体的には、シュードモナス属(Pseudomonas spp.)型、より具体的には、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・テストステローニ(Pseudomonas testosteroni)(コマモナス・テストステローニ(Comamonas testosteroni))由来のものが挙げられる。
本発明の目的のために、本発明のHPPDポリペプチドはさらなる修飾を含んでもよく、例えば、クローニング目的や輸送ペプチド融合の製造などのために、いくつかのアミノ酸(例えば1〜17個のアミノ酸)を置換、付加または欠失していてもよく、これは、HPPD活性、すなわちパラヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持するか、またはさらに改善することができるHPPDポリペプチドであり得る。例えば、本明細書に記載した修飾によりさらに改良することができるHPPDポリペプチドは、本明細書において配列番号3〜108のいずれかに記載のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)由来の変異体HPPDであり得る。
好ましい実施態様では、本発明に従い、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有するHPPDポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号1(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens))と均等である、すなわち、
それぞれのHPPDポリペプチドは、配列番号1と同一であるが、
(a)配列番号1のアミノ酸の位置335においてプロリン、
(b)配列番号1のアミノ酸の位置336においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および
(c)配列番号1のアミノ酸の位置337においてセリン
を有する。
さらなる好ましい実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明に従ったHPPDポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号1(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens))と均等であり、すなわち、それぞれのHPPDポリペプチドは、配列番号1と同一であるが、上表1に従ったそれぞれのアミノ酸位置において1つ以上のアミノ酸交換を有するが、但し、プロリンは配列番号1の位置335に存在し、ヒスチジンまたはアスパラギン酸は配列番号1の位置336に存在し、セリンは配列番号1の位置337に存在する。
さらなる好ましい実施態様では、1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する本発明に従ったHPPDポリペプチドは、本発明に従って置換されるアミノ酸に加えて配列番号1(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens))と均等であり、すなわち、それぞれのHPPDポリペプチドは、配列番号1と同一であるが、行、配列番号7〜配列番号19および配列番号21〜配列番号108において、表2(下記)で定義されたそれぞれのアミノ酸位置におけるアミノ酸交換を有する。
いくつかの実施態様では、本発明のヌクレオチド配列(その単離、組換えおよびキメラ遺伝子、核酸によりコードされた核酸配列、アミノ酸配列およびその組成物を含んでなるベクター、宿主細胞、植物、植物部分、および種子、ならびにHPPD阻害型除草剤に対する植物の耐性向上、具体的には、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤に対する耐性向上のために核酸配列を使用する方法を含む)は、配列番号3〜108のいずれか1つに記載のアミノ酸配列、ならびにHPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチドをコードするそのフラグメントおよび変異体をコードする。
A.HPPD阻害剤に対する耐性の測定方法
HPPD阻害型除草剤に対する耐性を測定する任意の適切な方法を使用して、本発明のHPPDポリペプチドを評価することができる。細胞または生物が特定のHPPD阻害型除草剤の施用下で生存する能力、または未処理細胞または生物から容易に識別できないように、光合成、タンパク質合成または呼吸および再生などの必須の細胞機能を行う能力、またはHPPD阻害型除草剤で処理した植物の収穫またはさらに改善された収穫において、このような除草剤で処理していない植物と比較して、有意差を有しない能力(しかし、HPPD阻害型除草剤の用途以外の機構により雑草を除去または抑制する場合)をモニターすることにより、耐性を測定することができる。いくつかの実施態様では、それぞれのHPPDポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなる核酸で形質転換された細胞または生物の可視指標となる表現型に従って、または異なる濃度の様々なHPPD阻害型除草剤の存在下、HPPDポリペプチドのインビトロアッセイにおいて、耐性を測定することができる。用量反応、およびこれらの指標となる表現型(茶色の形成、成長阻害、白化、除草効果など)に関連する用量反応における相対的シフトを、例えばGR50(成長を50%減少させる濃度)またはMIC(最小阻止濃度)値に関して都合良く発現するが、これらの値の増加は、除草剤の異なる濃度範囲における植物の損傷、成長点の白化症状などに基づいて通常の方法で、発現したHPPDポリペプチドの固有の耐性の増強に対応する。例えばx軸にプロットされた「用量」およびy軸にプロットされた「死滅パーセンテージ」、「除草効果」、「新生緑色植物数」などの用量/反応曲線に由来するGR50値に関して、これらのデータを表すことができ、GR50値の増加は、発現したHPPDポリペプチドの固有耐性のレベル向上に対応する。除草剤を、発芽前または発芽後に、好適に施用することができる。
様々な実施態様では、本発明に従ったHPPDポリペプチド、または本発明のHPPDポリペプチドをコードする核酸または遺伝子の耐性レベルを、タバコなどの試験植物、またはダイズ、トウモロコシもしくはワタなどの作物の遺伝子組換え、再生、育種およびスプレー試験によりスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングにより得た結果と一致して、このような植物は、HPPDポリペプチドをコードするいずれかの外来遺伝子を含まない植物、またはDNA、例えば、本発明のHPPDポリペプチドをコードする核酸と同じプロモーターの制御下、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDをコードするDNAをコードする参照HPPDポリペプチドを含んでなる遺伝子を含む植物より、HPPD阻害型除草剤(例えば、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤)に対して耐性を有し、圃場施用に推奨される通常投与量の少なくとも2倍まで望ましく耐性を有し、さらにより好ましくは、圃場施用に推奨される通常投与量の最大4倍まで耐性を有する。従って、「HPPDに作用する少なくとも1つの除草剤に対する植物の耐性を増強可能」という語は、その内在的HPPDを発現するだけの植物または参照HPPDポリペプチドを発現する植物と比較して、HPPD阻害型除草剤の通常圃場用量の少なくとも1×、2×、または3×、または4×、またはそれより多くの用量に対して、本発明のHPPDを発現する植物による耐性を示す。これに関して、「HPPDに作用する除草剤」という語は、公知および/または除草剤として使用された物質に限定されず、HPPDポリペプチドの触媒活性を阻害するいずれの物質も表す。
「除草剤耐性」、「阻害剤耐性」、または「阻害剤非感受性」という語は、阻害剤/除草剤の存在下または阻害剤/除草剤暴露後にそのそれぞれの触媒反応を行う酵素の能力も意味する。酵素の除草剤耐性、すなわち、除草剤の阻害効果に抵抗するその能力を、定性的および定量的に表現することができる。定性的には、阻害剤の異なる実体または異なる分類でさえ耐える酵素は、高い耐性を有し、逆もまた同じである。定量的観点では、1つの除草剤と比較した酵素の耐性を、阻害剤の非存在下および存在下で活性比(kapp、反応速度測定)または総基質代謝回転(シグナル変化、エンドポイント測定)として算出したこの酵素の1つのサンプルで観察されたそれぞれの「残効性」または「残存代謝回転(residual turnover)」として表すことができる(Bergmeyer, H.U.: “Methods of enzymatic analysis”, 1974)。様々な実施態様では、残効性の決定のため、決定された基質変換の見かけ速度定数(kapp)を、HPP由来HPPDにより生成されたホモゲンチシン酸(HGA)が第二酵素ホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼ(HGD)により良好に吸収する分子マレイルアセト酢酸(MAA)に直接変換される結合アッセイにおいて320nmにおける吸光度の動態変化として測定し、全てのアッセイにおいて過度に同様に施用することができる。酵素活性のkcat/k比は、見かけの速度定数kappに比例し、kcat/k*[E]([E]=酵素濃度)に比例する。競合的阻害剤は、非飽和基質濃度において、kが見かけ増加して、それによりkappが逆に減少することを示す。阻害剤の存在および非存在下でのkapp双方の測定を、生でまたは精製し、それにより同じ濃度における同じ酵素サンプルの使用により行う際、酵素濃度は、残効性の計算から除かれ、kapp双方の比は阻害によるkの変化を直接示す。注目すべきは、この概念は、「競合的阻害」で相互作用する酵素/阻害剤対に当てはまり、おそらく、記載されたほとんど全てのポリペプチド変異体および阻害剤に対して正しい。酵素に対する阻害定数kiおよびそれぞれの阻害剤は、この酵素に対する阻害剤の結合活性を言い表している。耐性向上は、1.5、2、3、4、5、7、10、20、30、40、50、100、200またはそれより大きい比で与えられ、いずれかのそれぞれのHPPD阻害型除草剤の存在または非存在下参照HPPD配列と比較される。
限定はされないが、本発明のHPPDポリペプチド配列を評価するために使用することのできる特定の種類のアッセイは、比色アッセイである(例えば、米国特許第6,768,044号参照、記載されているように)。このアッセイでは、例えば、ベクターpSE420−HPPDx(HPPDxは推定HPPDポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を意味する;ベーシックベクター「pSE420」をInvitrogen社(ドイツ、カールスルーエ)から得た)またはpSE420(pSE420(RI)NX)−HPPDxの修飾バージョンを含む大腸菌(E.coli)細胞は、過剰発現されたHPPDポリペプチドが活性である場合にチロシン異化から可溶性メラニン様色素を産生する。これらのメラニン様色素を、液体培養液中、または大腸菌(E.coli)培養をLB培地型固形寒天上に適用することにより評価する。20〜30℃、16時間〜8日後、空のベクターpSE420を含む大腸菌(E.coli)培養液を接種した培養培地または寒天ウェルは培地の色の変化はなく、または、不活性HPPDをコードする遺伝子を含むベクターpSE420−HPPDxを含む大腸菌(E.coli)培養液を播種したものも培地の色の変化はないが、活性HPPDをコードするベクターpSE420−HPPDxを含む大腸菌(E.coli)培養液を接種したウェルは茶色がかっている。HPPD阻害型除草剤の存在下、この色素産生を阻害することができ、HPPD阻害型除草剤耐性HPPDポリペプチドが発現されず活性でない限り、培養液は培地の色を変化させないだろう。この活性の起源がどんなものでも、本試験はHPPD活性およびHPPD阻害型除草剤耐性を反映し、HPPD活性の同定を、すなわち定性的レベルで可能にすることが、これまでに示された(米国特許第6,768,044号)。
B.HPPD配列への変異の導入方法
本発明の核酸によりコードされた変異HPPDポリペプチドでは、上記定義したように、少なくとも3個のアミノ酸が置換されている。
上記定義の参照HPPDポリペプチドをコードする核酸配列では、前記配列において、前記コドンは文献に広く記載されており当業者に周知であり、それを置換することになるアミノ酸に対応するコドンで置換されるアミノ酸をコードするコドンを広く文献に記載され、当業者に周知である前記コドンで置換するのに適したいずれの方法によっても置換することができる。
この置換を行うため、いくつかの分子生物学的方法を使用することができる。本発明に従った変異核酸配列および対応するタンパク質の製造に有用な方法は、予め選択した1つ以上のアミノ酸をコードするコドンに対して部位特異的な変異誘発を行うことを含む。これらの部位特異的変異を得るための方法は当業者に周知であり、広く文献に記載されており(具体的には:Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, Edited by M.J. McPHERSON, IRL PRESS)、または、市販のキット(例えば、Qiagen社またはStratagene社のQUIKCHANGE(商標)lightening mutagenesis kit)を使用可能である方法である。部位特異的変異誘発後、適切なスクリーニング補助を用いてHPPD阻害剤に対する感受性の低い変異HPPDを含む細胞を選択することが有用である。これを達成するための適切なスクリーニング方法は上記に記載している。
あるいは、参照HPPDをコードするDNA配列をコンピュータシミュレーションで修飾して、本明細書で記載した1つ以上の置換を有するHPPDポリペプチドをコードし、それから新規に合成することができる。この方法は当技術分野で周知であり、文献に記載されている。変異HPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本明細書の他所に記載したように、宿主細胞内へ導入することができる。
C.単離されたポリヌクレオチド、ならびにその変異体およびフラグメント
幾つかの実施態様にでは、本発明は、単離または組換えたポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」という語は、調節エレメント、構造遺伝子、遺伝子群、プラスミド、遺伝子全部、およびそのフラグメントを含む一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAを含んでなる任意の長さの任意の配列の任意の遺伝子材料に相当する。本明細書で定義される「組換え」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド/タンパク質、またはその生物活性部分は、それらが異種宿主細胞内、またはトランスジェニック植物細胞、種子、または植物内に含まれる場合など、その起源、天然生物内にもはや存在しない。1つの実施態様では、組換えポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムDNA内の核酸(すなわち、核酸の5’および3’末端に位置する配列)を自然に隣接する配列(例えば、コードするタンパク質または制御配列)を含まない。「組換え」という語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然にあるものと異なる(例えば、化学組成または構造において)ように、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して操作したポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。別の実施態様では、「組換え」ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムDNA内に天然で存在する内部配列(すなわち、イントロン)を含まない。このようなポリヌクレオチドの典型例は、いわゆる相補DNA(cDNA)である。例えば、様々な実施態様では、単離されたHPPD阻害型除草剤に対する耐性をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNA内のポリヌクレオチドに自然に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kbよりも小さいヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の核酸分子としては、本発明のHPPDをコードするものが挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、宿主細胞(例えば、植物宿主細胞または細菌宿主細胞)内の核酸分子の発現を指示可能なプロモーターに操作可能に連結している。
本発明は、配列番号3〜108のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするいずれかの核酸配列の例示となる変異体およびフラグメントをさらに企図している。ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、ポリペプチドの生物活性部分をコードしてもよいか、または本明細書の他所に開示した方法を使用してハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして使用することができるフラグメントであってもよい。ポリヌクレオチドのフラグメントであるポリヌクレオチドは、少なくとも約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150の隣接するヌクレオチド、または意図された使用(例えば本明細書に記載のHPPD核酸)に応じて、本明細書に開示の完全長ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの数までを含んでなる。「隣接する」ヌクレオチドとは、互いがすぐ近隣にあるヌクレオチド残基を表す。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、概して、完全長HPPD阻害型除草剤耐性タンパク質の生物活性、すなわち、除草剤耐性活性を保持するポリペプチドフラグメントをコードするだろう。「除草剤耐性活性を保持する」とは、フラグメントが、配列番号3〜108として本明細書に開示の完全長HPPD阻害型除草剤耐性タンパク質の少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、85%、90%、95%、100%、110%、125%、150%、175%、200%、250%、少なくとも約300%、またはそれを大きい除草剤耐性活性を有することを表す。 除草剤耐性活性の測定方法は、当該技術分野において周知であり、実例となる方法を本明細書に記載さしている。非限定的な例では、本発明のフラグメントは、HPPD阻害型除草剤の同用量に対して耐性であるか、またはHPPD阻害型除草剤の1×、2×、3×、4×、もしくはそれよりも多い用量に対して耐性であり、またはフラグメントは、該フラグメントと配列番号3〜108との間のkiに基づいて、同じまたはそれより耐性であるだろう。
本発明のポリペプチドの生物活性部分をコードするポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも約150、175、200、250、300、350の隣接するアミノ酸、または本発明の完全長ポリペプチドに存在するアミノ酸の総数までをコードするだろう。非限定的例では、(a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリンおよび(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリンならびに、必要に応じて、配列番号3〜108のいずれかに記載のHPPDタンパク質を含む配列番号1のアミノ酸位置204、213、264、268、270、310、315、330、331、338、339、340、344、345に対応する位置において1つ以上のさらなるアミノ酸置換を有するHPPDポリペプチドの生物活性部分をコードするポリヌクレオチドのフラグメントがある。
本発明は、上記の変異体ポリヌクレオチドも包含する。
ポリヌクレオチドの「変異体」としては、本発明のHPPDをコードするが、遺伝コードの縮重が理由で保存的に異なる配列、ならびに十分に同一である配列も挙げられる。
本発明の変異体は、HPPDポリペプチド活性およびHPPD除草剤阻害剤耐性を保持するだろう。「十分に同一」という語は、標準的なパラメーターを使用するアラインメントプログラムの1つを用いて、参照配列と比較した、少なくとも約53%、少なくとも約60%または65%の配列同一性、約70%または75%の配列同一性、約80%または85%の配列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を表す。これらの値を適切に調節して、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮して、2つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの対応する同一性を決定することができることを当業者は認識するであろう。
細菌遺伝子は、オープンリーディングフレーム開始の近傍に複数のメチオニン開始コドンを頻繁に有する。しばしば、1つ以上のこれらの開始コドンにおける翻訳開始は、機能的タンパク質の生成をもたらす。これらの開始コドンとしては、ATGコドンを挙げることができる。しかしながら、バチルス属(Bacillus sp.)などの細菌は、開始コドンとしてコドンGTGも認識し、GTGコドンにおいて翻訳を開始するタンパク質は、第一アミノ酸においてメチオニンを含む。さらに、これは、細菌においてこれらのコドンが自然に使用される決定されたアプリオリではないことも多い。従って、代替のメチオニンコドンの1つを使用することで、除草剤耐性を付与する変異体が生成する可能性がることが理解される。これらの除草剤耐性タンパク質は本発明に包含され、本発明の方法において使用してもよい。天然アレル変異体を、以下に概説するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技術の使用で同定することができる。変異体ポリヌクレオチドとしては、例えば、部位特異的または他の変異誘発ストラテジーを用いて生成したが、所望の生物活性を有するポリペプチドをなおコードする、合成的に誘導されたポリヌクレオチドも挙げられる。
当業者は、変更が本発明のポリヌクレオチドのさらなる変異により導入されることにより、該ポリペプチドの生物活性を変化させることなく、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列中にさらなる変更が得られることをさらに認識するだろう。 従って、単離された変異体ポリヌクレオチドは、3〜5、1〜7、1〜9、1〜11、1〜13、1〜15、もしくは1〜17個のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16もしくは17個のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失をコードされたポリペプチドに導入するように、本発明のHPPDをコードする対応するポリヌクレオチド中に、1つ以上の追加のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することにより作製することができる。 部位特異的変異誘発およびPCRを介した変異誘発、または遺伝子シャッフリングなどの技術標準技術により、さらなる変異を導入することができる。このような変異体ポリヌクレオチドも本発明に包含される。
変異体ポリヌクレオチドは、飽和変異誘発または置換変異誘発(permutational mutagenesis)などによるコード配列の全部または部分に沿ったランダムに変異を導入することにより製造することができ、得られた変異体を、除草剤耐性活性を付与する能力についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。
変異体を生成するさらなる方法としては、本明細書に開示するタンパク質を発現する細胞(またはそのライブラリー)を、タンパク質活性にストレスを与える特定の条件下に付することが挙げられる。特定条件としては、(これに限定されないが)温度変化、pHの変化、基質または阻害剤の濃度変化、および緩衝液組成物またはその濃度の変化を挙げることができる。タンパク質ライブラリーは、タンパク質発現の時間中(例えば、大腸菌(E.coli)または他の宿主において)、またはタンパク質抽出物の作製後、もしくはタンパク質の精製後、これらの条件に付することができる。
それから、ストレス条件に付したタンパク質ライブラリーの機能的または酵素的活性を、参照タンパク質と比較して、改善された特性を有するタンパク質を同定することができる。成長スクリーニングの一部として、あるいはタンパク質の活性を定量する酵素アッセイの一部としてこの活性比較を行うことができる。改善されたものとして同定することができる特性としては、HPPD阻害型除草剤耐性、速度定数(KM、Ki、kcatを含む)変化、タンパク質安定性、タンパク質熱安定性、またはタンパク質温度およびpH最適条件を挙げることができる。
D.単離されたタンパク質ならびにその変異体およびフラグメント
除草剤耐性ポリペプチドも本発明内に包含される。除草剤耐性ポリペプチドとしては、約30%、20%、10%、または5%(乾燥重量)より少ない除草剤耐性でないポリペプチド(本明細書では、「汚染(contaminating)タンパク質」とも呼ぶ)を有するポリペプチドの製剤(preparations)が挙げられる。本発明では、「除草剤耐性タンパク質」は、本明細書に開示のHPPDポリペプチドを表す。 そのフラグメント、生物活性部分、および変異体も準備して、本発明の方法を実施するために使用してもよい。
「フラグメント」または「生物活性部分」としては、除草剤耐性タンパク質をコードし、除草剤耐性活性を保持するアミノ酸配列の一部を含んでなるポリペプチドフラグメントが挙げられる。除草剤耐性タンパク質の生物活性部分は、例えば、10、25、50、100またはそれより多いアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。このような生物活性部分を、組換え技術により製造し、除草剤耐性活性について評価することができる。
「変異体」は、例示の配列番号3〜108のいずれかと少なくとも約53%、60%、65%、約70%、75%、約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを表し、前記変異体はHPPDポリペプチド活性およびHPPD阻害型除草剤耐性を有する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めなどを考慮して、2つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの対応する同一性を決定さするように適切に調節することができることを認識するであろう。
例えば、保存的なアミノ酸置換を、1つ以上の非必須アミノ酸残基において行ってもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく、ポリペプチドの参照配列から変更することができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において明らかにされた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。アミノ酸置換を、機能を保持する非保存領域において行ってもよい。概して、このような置換は、保存アミノ酸残基、または保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対して行われず、このような残基はポリペプチド活性に必須である。しかしながら、当業者は、機能的変異体が、保存された残基において、少数の保存または非保存の変更を有してもよいことを理解するだろう。
本発明のHPPD、またはその変異体もしくはフラグメントに対する抗体も包含される。抗体を産生するための方法は当該技術分野において公知である(例えば、Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY、米国特許第4,196,265号を参照されたい)。
従って、本発明の1つの面は、本発明の1つ以上のタンパク質もしくはペプチド分子と特異的に結合する抗体、単鎖抗原結合性分子、または他のタンパク質、およびそれらのホモログ、融合体、またはフラグメントに関する。特に好ましい実施態様では、抗体は、配列番号1〜108に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合する。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出、またはタンパク質の翻訳後修飾を検出するために使用してもよい。本明細書で使用するとき、抗体またはペプチドは、このような結合が関連しない分子の存在により競合的に阻害されない場合、本発明のタンパク質またはペプチド分子と「特異的に結合」すると言われる。
E.遺伝子スタッキング
農作物の商業的生産において、信頼のおける駆除剤管理下、作物の圃場から不要な植物(すなわち、「雑草」)を除去することが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に施用可能であるが、作物は影響されないままで不要な植物のみを除去することであろう。このような処理システムの1つは、除草剤耐性作物の圃場に除草剤を散布する場合、作物は成長し続けるが、除草剤耐性をもたない雑草は死滅するかまたは大幅に被害を受けるように、除草剤に対して耐性である作物の使用を含むだろう。理想的には、このような処理システムは、雑草防除によって柔軟性と経済性との可能な最良の組み合わせが提供され得るように、除草剤の特性を変化させることの利点を享受し得る。例えば、圃場において個別の除草剤の持続性は様々であり、幾つかの除草剤は圃場に散布された後、比較的長期間有効であるが、その他の除草剤は、他の化合物および/または無効な化合物へと迅速に分解される。理想的な処理システムにおいては、栽培者が特定の状況に応じて除草剤を選択できるように、異なる除草剤の使用が許容され得る。
いくつかの除草剤耐性作物が現在市販されているが、多くの市販の除草剤および除草剤/作物の組み合わせに生じる問題は、個々の除草剤が、通常、一般的な雑草種に対して不完全な活性スペクトルを有することである。しばらくの間使用されてきた個々の除草剤の多くに対して、除草剤抵抗性雑草種および生物型の集団はさらに蔓延してきている(例えば、Tranel and Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen and Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311参照)。1つより多い除草剤に対する耐性を有するトランスジェニック植物は記載されている(例えば、国際公開第2005/012515号参照)。しかしながら、作物生産、雑草防除オプション、残雑草防除の拡張、および収穫量向上の全手の面における改善は持続的に需要がある。
本発明のHPPDタンパク質またはヌクレオチド配列を、このような植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはRNAをコードする他の遺伝子と植物内で有利に組み合わさす。形質転換された植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の中で、その化学構造に従って、HPPD阻害型除草剤と異なる1つ以上の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質、特定の昆虫に対する耐性を付与する他のタンパク質、特定の疾病に対する耐性を付与するタンパク質をコードするDNA配列、線虫または昆虫防除等を提供するRNAをコードするDNAなどについて言及することができる。
このような遺伝子については特に、PCT特許出願の国際公開第91/02071号および国際公開第95/06128号、ならびに米国特許第7,923,602号および米国特許出願公開第2010/0166723号(これら各々はその全文を参照することにより本明細書に取り込まれるものとする)に記載されている。
形質転換された植物細胞および植物上の特定の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするDNA配列の中で、グルホシネート除草剤に対する耐性を付与する、国際公開第2009/152359号に記載されるbarもしくはPAT遺伝子またはストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)遺伝子、グリホサートおよびその塩などのEPSPSが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードする遺伝子(米国特許第4,535,060号、米国特許第4,769,061号、米国特許第5,094,945号、米国特許第4,940,835号、米国特許第5,188,642号、米国特許第4,971,908号、米国特許第5,145,783号、米国特許第5,310,667号、米国特許第5,312,910号、米国特許第5,627,061号、米国特許第5,633,435号)、グリホサート−n−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(例えば、米国特許第8,222,489号、米国特許第8,088,972号、米国特許第8,044,261号、米国特許第8,021,857号、米国特許第8,008,547号、米国特許第7,999,152号、米国特許第7,998,703号、米国特許第7,863,503号、米国特許第7,714,188号、米国特許第7,709,702号、米国特許第7,666,644号、米国特許第7,666,643号、米国特許第7,531,339号、米国特許第7,527,955号、および米国特許第7,405,074号)、またはグリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子(例えば、米国特許第5,463,175号)について言及することができる。
EPSPSが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードするDNA配列の中で、植物EPSPS、特に、トウモロコシEPSPS、具体的には、2つの変異、具体的には、アミノ酸位置102における変異およびアミノ酸位置106における変異(国際公開第2004/074443号)であって、以後二重変異トウモロコシEPSPSまたは2mEPSPSと称される米国特許出願第6566587号に記載される変異を含んでなるトウモロコシEPSPSをコードする遺伝子、またはアグロバクテリウムから単離され、米国特許第5,633,435号の配列番号2および配列番号3に記載され、CP4とも称されるEPSPSをコードする遺伝子についてさらに詳細に言及されるだろう。
EPSPSが標的である除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードするDNA配列の中で、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来のEPSPS GRG23をコードする遺伝子だけでなく、国際公開第2008/100353号に記載される変異体GRG23 ACE1、GRG23 ACE2、またはGRG23 ACE3、特に、国際公開第2008/100353号の配列番号29のGRG23(ace3)R173Kなどの変異体または変異体GRG23についてさらに詳細に言及されるだろう。
EPSPSをコードする、さらに具体的には上記の遺伝子をコードするDNA配列の場合に、これらの酵素をコードする配列は、輸送ペプチド、具体的には米国特許第5,510,471号または第5,633,448号に記載される「最適輸送ペプチド」をコードする配列より有利に始まる。
本発明の核酸配列と組み合わすことができる例示の除草剤耐性形質としては、少なくとも1つのALS(アセト乳酸合成酵素)阻害剤(国際公開第2007/024782号);変異アラビドプシス(Arabidopsis)ALS/AHAS遺伝子(米国特許第6,855,533号);代謝により2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)に対する耐性を付与する2,4−D−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子(米国特許第6,153,401号);および代謝によりジカンバ(3,6−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸)に対する耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がさらに挙げられる(米国特許出願公開2008/0119361号および米国特許出願公開2008/0120739号)。
様々な実施態様では、本発明のHPPDは、1つ以上のさらなるHPPD阻害型除草剤耐性遺伝子を含む1つ以上の除草剤耐性遺伝子、および/または1つ以上のグリホサートおよび/またはグルホシネートに耐性がある遺伝子でスタックする。1つの実施態様では、本発明のHPPDを、2mEPSPSおよびbarと組み合わす。
昆虫に対する耐性の特性に関わるタンパク質をコードするDNA配列の中で、文献に広く記載され、当業者に周知のBtタンパク質についてさらに詳細に言及されるだろう。フォトラブダス属(Photorhabdus)などの細菌から抽出したタンパク質についても言及されるだろう(国際公開第97/17432号および国際公開第98/08932号)。
昆虫に対する耐性の新規特性を付与する対象のタンパク質をコードするこのようなDNA配列の中で、文献に広く記載され、当業者に周知のBt CryまたはVIPタンパク質についてさらに詳細に言及されるだろう。これらとしては、Cry1Fタンパク質またはCry1Fタンパク質由来ハイブリッド(例えば米国特許第6,326,169号;米国特許第6,281,016号;米国特許第6,218,188号に記載されるハイブリッドCry1A−Cry1Fタンパク質、またはその毒性フラグメント)、Cry1A型タンパク質またはその毒性フラグメント、好ましくはCry1Acタンパク質またはCry1Acタンパク質由来ハイブリッド(例えば米国特許第5,880,275号に記載のハイブリッドCry1Ab−Cry1Acタンパク質)または欧州特許第451878号に記載されるCry1AbもしくはBt2タンパク質またはその殺虫性フラグメント、国際公開第2002/057664号に記載されるCry2Ae、Cry2Af、もしくはCry2Agタンパク質またはその毒性フラグメント、国際公開第2007/140256号(配列番号7)に記載されるCrylA.105タンパク質またはその毒性フラグメント、NCBI受託番ABG20428のVIP3Aa19タンパク質、NCBI受託番号ABG20429(国際公開第2007/142840号の配列番号2)のVIP3Aa20タンパク質、COT202またはCOT203ワタイベント(event)(それぞれ国際公開第2005/054479号および国際公開第2005/054480号)において産生されたVIP3Aタンパク質、国際公開第2001/47952号に記載されるCryタンパク質、Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11):5389-94および米国特許第6,291,156号に記載されるVIP3Aaタンパク質またはその毒性フラグメント、ゼノラブダス属(Xenorhabdus)(国際公開第号98/50427号に記載)、セラチア属(Serratia)(具体的には、S.エントモフィラ(S.entomophila)由来)または国際公開第98/08932号に記載されるフォトラブダス属(Photorhabdus)由来のTcタンパク質などのフォトラブダス属(Photorhabdus)の株に由来する殺虫性タンパク質(例えば、Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33)が挙げられる。上記配列のいずれかに由来するいくつかの(1〜10個、好ましくは1〜5個)アミノ酸の点で異なるこれらのタンパク質のいずれか1つのいずれかの変異体または変異体、具体的には、その毒性フラグメントの配列、または色素体輸送ペプチドなどの輸送ペプチド、または別のタンパク質もしくはペプチドとの融合する配列も、本明細書に含まれる。
様々な実施態様では、本発明のHPPD配列を、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養値、疾病抵抗性、改善された光合成、改善された繊維質、ストレス耐性、改善された再生などの望ましい形質を付与する1つ以上の遺伝子と植物内で組み合わせることができる。
同種の植物の本発明の遺伝子と組み合わせてもよい(例えば、交配または別のトランスジェニックイベンを含む植物を本発明のキメラ遺伝子で再形質転換することにより)特に有用なトランスジェニックイベントとしては、イベント531/PV−GHBK04(ワタ、昆虫防除、国際公開第2002/040677号に記載)、イベント1143−14A(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128569号に記載);イベント1143−51B(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128570号に記載);イベント1445(ワタ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2002/120964号または国際公開第2002/034946号に記載);イベント17053(コメ、除草剤耐性、PTA−9843として寄託、国際公開第2010/117737号に記載);イベント17314(コメ、除草剤耐性、PTA−9844として寄託、国際公開第2010/117735号に記載);イベント281−24−236(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−6233として寄託、国際公開第2005/103266号または米国特許出願公開第2005/216969号に記載);イベント3006−210−23(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−6233として寄託、米国特許出願公開第2007/143876号または国際公開第2005/103266号に記載);イベント3272(トウモロコシ、品質形質、PTA−9972として寄託、国際公開第2006/098952号または米国特許出願第2006/230473号に記載);イベント33391(コムギ、除草剤耐性、PTA−2347として寄託、国際公開第2002/027004号に記載)、イベント40416(トウモロコシ、昆虫防除−
除草剤耐性、ATCC PTA−11508として寄託、国際公開第11/075593号に記載);イベント43A47(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−11509として寄託、国際公開第2011/075595号に記載);イベント5307(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−9561、国際公開第2010/077816号に記載);イベントASR−368(ベントグラス、除草剤耐性、ATCC PTAー4816、米国特許出願公開第2006/162007号または国際公開第2004/053062号に記載);イベントB16(トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2003/126634号に記載);イベントBPS−CV127−9(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB No.41603として寄託、国際公開第2010/080829号に記載);イベントBLR1(アブラナ、雄性不稔性回復、NCIMB41193として寄託、国際公開第2005/074671号に記載);イベントCE43−67B(ワタ、昆虫防除、DSM ACC2724として寄託、米国特許出願公開第2009/217423号または国際公開第2006/128573号に記載);イベントCE44−69D(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2010/0024077号に記載);イベントCE44−69D(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128571号に記載);イベントCE46−02A(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128572号に記載);イベントCOT102(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2006/130175号または国際公開第2004/039986号に記載);イベントCOT202(ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2007/067868号または国際公開第2005/054479号に記載);イベントCOT203(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2005/054480号に記載);イベントDAS21606−3/1606(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11028として寄託、国際公開第2012/033794号に記載)、イベントDAS40278(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC
PTA−10244として寄託、国際公開第2011/022469号に記載);イベントDAS−44406−6/pDAB8264.44.06.1(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11336として寄託、国際公開第2012/075426号に記載)、イベントDAS−14536−7/pDAB8291.45.36.2(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11335として寄託、国際公開第2012/075429号に記載)、イベントDAS−59122−7(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA11384として寄託、米国特許出願公開第2006/070139号に記載);イベントDAS−59132(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2009/100188号に記載);イベントDAS68416(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−10442として寄託、国際公開第2011/066384号または国際公開第2011/066360号に記載);イベントDP−098140−6(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC PTA−8296として寄託、米国特許出願公開第2009−137395号または国際公開第08/112019号に記載);イベントDP−
305423−1(ダイズ、品質形質、寄託なし、米国特許出願公開第2008−312082号または国際公開第2008/054747号に記載);イベントDP−32138−1(トウモロコシ、ハイブリダイゼーションシステム、ATCC PTA−9158として寄託、米国特許出願公開第2009/0210970号または国際公開第2009/103049号に記載);イベントDP−356043−5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−8287として寄託、米国特許出願公開第2010−0184079号または国際公開第2008/002872号に記載);イベントEE−1(ナス、昆虫防除、寄託なし、国際公開第07/091277号に記載);イベントFI117(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209031として寄託、米国特許出願公開第2006/059581号または国際公開第 98/044140号に記載);イベントFG72(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11041として寄託、国際公開第2011/063413号に記載)、イベントGA21(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209033として寄託、米国特許出願公開第2005/086719号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGG25(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209032として寄託、米国特許出願公開第2005/188434号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGHB119(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−8398として寄託、国際公開第2008/151780号に記載);
イベントGHB614(ワタ、除草剤耐性、ATCC PTA−6878として寄託、米国特許出願公開第2010/050282号または国際公開第2007/017186号に記載);イベントGJ11(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC 209030として寄託、米国特許出願公開第2005/188434号または国際公開第98/044140号に記載);イベントGM RZ13(サトウダイコン、ウイルス抵抗性、NCIMB−41601として寄託、国際公開第2010/076212号に記載);イベントH7−1(サトウダイコン、除草剤耐性、NCIMB41158またはNCIMB41159として寄託、米国特許出願公開第2004/172669号または国際公開第2004/074492号に記載);イベントJOPLIN1(コムギ、耐病性、寄託なし、米国特許出願公開第2008/064032号に記載);イベントLL27(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB41658として寄託、国際公開第2006/108674または米国特許出願公開第2008/320616号に記載);イベントLL55(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB 41660として寄託、国際公開第2006/108675号または米国特許出願公開第2008/196127号に記載);イベントLLワタ25(ワタ、
除草剤耐性、ATCC PTA−3343として寄託、国際公開第2003/013224または米国特許出願公開第2003/097687号に記載);イベントLLコメ06(コメ、除草剤耐性、ATCC 203353として寄託、米国特許第6,468,747号または国際公開第2000/026345号に記載);イベントLLコメ62(コメ、除草剤耐性、ATCC 203352として寄託、国際公開第2000/026345号に記載)、イベントLLコメ601(コメ、除草剤耐性、ATCC PTA−2600として寄託、米国特許出願公開第2008/2289060号または国際公開第2000/026356号に記載);イベントLY038(トウモロコシ、品質形質、ATCC PTA−5623として寄託、米国特許出願公開第2007/028322号または国際公開第2005/061720号に記載);イベントMIR162(トウモロコシ、昆虫防除、PTA−8166として寄託、米国特許出願公開第2009/300784号または国際公開第2007/142840号に記載);イベントMIR604(トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2008/167456号または国際公開第2005/103301号に記載);イベントMON15985(ワタ、昆虫防除、ATCC PTA−2516として寄託、米国特許出願公開第2004/250317号または国際公開第2002/100163号に記載);イベントMON810(トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願公開第2002/102582号に記載);イベントMON863(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC PTA−2605として寄託、国際公開第2004/011601または米国特許出願公開第2006/095986号に記載);イベントMON87427(トウモロコシ、受粉制御、ATCC PTA−7899として寄託、国際公開第2011/062904号に記載);イベントMON87460(トウモロコシ、ストレス耐性、ATCC PTA−8910として寄託、国際公開第2009/111263号または米国特許出願公開第2011/0138504号に記載);イベントMON87701(ダイズ、昆虫防除、ATCC PTA−8194として寄託、米国特許出願公開第2009/130071号または国際公開第2009/064652号に記載);イベントMON87705(ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ATCC PTA−9241として寄託、米国特許出願公開第2010/0080887号または国際公開第2010/037016号に記載);イベントMON87708(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−9670として寄託、国際公開第2011/034704号に記載);イベントMON87712(ダイズ、収穫高、PTA−10296として寄託、国際公開第2012/051199号に記載)、イベントMON87754(ダイズ、品質形質、ATCC PTA−9385として寄託、国際公開第2010/024976号に記載);イベントMON87769(ダイズ、品質形質、ATCC PTA−
8911として寄託、米国特許出願公開第2011/0067141号または国際公開第2009/102873号に記載);イベントMON88017(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−5582として寄託、米国特許出願公開第2008/028482号または国際公開第2005/059103号に記載);イベントMON88913(ワタ、除草剤耐性、ATCC PTA−4854として寄託、国際公開第2004/072235または米国特許出願公開第2006/059590号に記載);イベントMON88302(アブラナ、除草剤耐性、PTA−10955として寄託、国際公開第2011/153186号に記載)、イベントMON88701(ワタ、除草剤耐性、PTA−11754として寄託、国際公開第2012/134808号に記載)、イベントMON89034(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC PTA−7455として寄託、国際公開第07/140256または米国特許出願公開第2008/260932号に記載);イベントMON89788(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA−6708として寄託、米国特許出願公開第2006/282915号または国際公開第2006/130436号に記載);イベントMS11(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−850またはPTA−2485として寄託、国際公開第2001/031042号に記載);イベントMS8(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−730として寄託、国際公開第2001/041558または米国特許出願公開第2003/188347号に記載);イベントNK603(トウモロコシ、除草剤耐性、ATCC PTA−2478として寄託、米国特許出願公開第2007/292854号に記載);イベントPE−7(コメ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2008/114282号に記載);イベントRF3(アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ATCC PTA−730として寄託、国際公開第2001/041558または米国特許出願公開第2003/188347号に記載);イベントRT73(アブラナ、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2002/036831号または米国特許出願公開第2008/070260号に記載);イベントSYHT0H2 / SYN−000H2−5(ダイズ、除草剤耐性、PTA−11226として寄託、国際公開第2012/082548号に記載)、
イベントT227−1(サトウダイコン、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第2002/44407号または米国特許出願公開第2009/265817号に記載);イベントT25(トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2001/029014号または国際公開第2001/051654号に記載);イベントT304−40(ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−8171として寄託、米国特許出願公開第2010/077501号または国際公開第2008/122406号に記載);イベントT342−142(ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第2006/128568号に記載);イベントTC1507(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願公開第2005/039226号または国際公開第2004/099447号に記載);イベントVIP1034(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ATCC PTA−3925として寄託、国際公開第2003/052073号に記載)、イベント32316(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−11507として寄託、国際公開第2011/084632号に記載)、イベント4114(トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、PTA−11506として寄託、国際公開第2011/084621号に記載)、イベント EE−GM3/FG72(ダイズ、除草剤耐性、ATCC 受託番号 PTA−11041号に記載)必要に応じてイベントEE−GM1/LL27またはイベントEE−GM2/LL55(国際公開第2011/063413A2号に記載)でスタック、イベントDAS−68416−4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10442、国際公開第2011/066360(A1)号に記載)、イベントDAS−68416−4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10442、
国際公開第2011/066384(A1)号に記載)、イベントDP−040416−8(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11508、国際公開第2011/075593(A1)号に記載)、イベントDP−043A47−3(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11509、国際公開第2011/075595(A1)号に記載)、イベントDP−004114−3(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11506、国際公開第2011/084621(A1)号に記載)、イベントDP−032316−8(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11507、国際公開第2011/084632A1号に記載)、イベントMON−88302−9(アブラナ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−10955、国際公開第2011/153186A1号に記載)、イベントDAS−21606−3(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11028、国際公開第2012/033794(A2)号に記載)、イベントMON−87712−4(ダイズ、品質形質、ATCC受託番号PTA−10296、国際公開第2012/051199(A2)号に記載)、イベントDAS−44406−6(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11336、国際公開第2012/075426(A1)号に記載)、イベントDAS−14536−7(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11335、国際公開第2012/075429(A1)号に記載)、イベントSYN−000H2−5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11226、国際公開第2012/082548(A2)号に記載)、イベントDP−061061−7(アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、国際公開第2012/071039(A1)号に記載)、イベントDP−073496−4(アブラナ、除草剤耐性、受託番号該当なし、米国特許出願公開第2012/131692号に記載)、イベント8264.44.06.1(ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号PTA−11336、国際公開第2012/075426(A2)号に記載)、イベント8291.45.36.2(ダイズ、スタック除草剤耐性、受託番号PTA−11335、国際公開第2012/075429(A2)号に記載)、イベントSYHT0H2(ダイズ、ATCC受託番号PTA−11226、国際公開第2012/082548(A2)号に記載)、イベントMON88701(ワタ、
ATCC受託番号PTA−11754、国際公開第2012/134808(A1)号に記載)、イベントKK179−2(アルファルファ、ATCC受託番号PTA−11833、国際公開第2013/003558(A1)号に記載)、イベントpDAB8264.42.32.1(ダイズ、スタック除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−11993、国際公開第2013/010094(A1)号に記載)、イベントMZDT09Y(トウモロコシ、ATCC 受託番号PTA−13025、国際公開第2013/012775(A1)号に記載)、イベント4114(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−11506)国際公開第2013/14901号、イベントMON87411(トウモロコシ、ATCC受託番号PTA−12669)国際公開第2013/169923号、イベントA26−5(ワタ、昆虫防除)国際公開第2013/170398号、イベントA2−6(ワタ、昆虫防除)国際公開第2013/170399号、イベント9582.816.15.1(ダイズ、昆虫防除、除草剤耐性号)、ATCC受託番号PTA−12588号)国際公開第2014/004458号、イベント33121(トウモロコシ、昆虫防除、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−13392)国際公開第2014/116854号、イベント32218(トウモロコシ昆虫防除、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA−13391)国際公開第2014/116989号、イベント「SPT−7R−949D SPT−7R−1425D」(コメ、雄性不稔性)国際公開第2014/154115号、イベントMON87751(ダイズ、ATCC受託番号PYA−120166)国際公開第2014/201235号、イベント“Pp009−401 Pp009−415 Pp009−469”(芝草、ATCC受託番号PTA−120354、PTA−120353、PTA−120355)国際公開第2015/006774号、イベントBs2−X5(トマト、ATCC)国際公開第2015/017637号、イベントMON87403(トウモロコシ、穀物、収穫高、ATCC受託番号PTA−13584、国際公開第2015/053998号、イベント32218(トウモロコシ、昆虫防除、ATCC受託番号PTA−13391)国際公開第2015/112182号が挙げられる。
F.ポリヌクレオチドコンストラクト
本発明のHPPDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変し、植物細胞内での発現さを得るか、または発現を増大させてもよい。本明細書で同定するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、対象の植物内での発現のための発現カセット中に供給してもよい。「植物発現カセット」としては、組換えDNAコンストラクトを含む、すなわち、植物細胞内のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができるDNAコンストラクトが挙げられる。カセットは、5’−3’転写方向へ、対象の1つ以上のポリヌクレオチドに操作可能に連結する転写開始領域(すなわち、プロモーター、具体的には、異種プロモーター)、および/または植物内で機能する翻訳および転写終止領域(すなわち、終止領域)を含むことができる。カセットは、選択マーカー遺伝子など、生物に導入される少なくとも1つの追加のポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。あるいは、複数の発現カセットに、追加のポリヌクレオチド(複数可)を供給することができる。このような発現カセットが、制御領域の転写制御下であるポリヌクレオチド(複数可)の挿入のための複数の制限酵素部位を備える。
さらなる実施態様では、本発明は、植物発現可能プロモーターに操作可能に連結する本発明の異種核酸ならびに必要に応じて転写終止およびポリアデニル化領域を含んでなるコード配列を含んでなるキメラ遺伝子に関する。「異種」は、概して、細胞に内在しないかまたはそれが存在する天然のゲノムの位置に内在せず、かつ感染、トランスフェクション、微量注入法、エレクトロポレーション、顕微鏡投影法などによって細胞に加えられたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを表す。「操作可能に連結」は、二つのポリヌクレオチド間の機能連関を表す。例えば、プロモーターがDNA配列と操作可能に連結する場合、プロモーター配列はDNA配列の転写を開始および介在する。操作可能に連結したポリヌクレオチドは、連続しても連続していなくてもよく、2つのポリペプチドコード領域の連結を表すために使用する場合、該ポリペプチドは同じリーディングフレームにおいて発現すると認識される。
プロモーターは、選択された植物細胞、植物部分、または植物において転写活性を示す任意のポリヌクレオチド配列であってよい。プロモーターは、植物宿主および/または本発明のDNA配列に対して、天然もしくは類似、または外来性もしくは異種性であってよい。プロモーターが植物宿主に対して「天然」または「類似」である場合、プロモーターを導入する天然植物内に該プロモーターが見出されることを表す。プロモーターが本発明のDNA配列に対して「外来性」または「異種性」である場合、該プロモーターは、操作可能に連結された本発明のDNA配列のための自然または天然のプロモーターではないことを表す。プロモーターは誘導性または恒常的であってよい。プロモーターは、天然でもよく、様々な天然プロモーターの一部からなってもよく、または部分的もしくは完全に合成されてもよい。プロモーターの設計ガイダンスは、Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361のものなど、プロモーター構造の研究により提供されている。転写開始に関連するプロモーターの配置も最適化してもよい。例えば、Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764参照。植物における用途に適した多くのプロモーターが当技術分野において周知である。
例えば、植物の適切な構成的プロモーターとしては:ピーナッツ萎黄病線条カリモウイルス(PCISV)プロモーター(米国特許第5,850,019号);カリフラワー・モザイク・ウイルス(CaMV)由来の35Sプロモーター(Odell et al. (1985) Nature 313:810-812);Kay et al. (1987) Science 236: 1299-1302に記載の35Sプロモーター;クロレラウイルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子(米国特許第5,563,328号)およびfigwortモザイクウイルス(FMV)由来完全長転写プロモーター(米国特許第5,378,619号)のプロモーター;コメアクチンなどの遺伝子由来プロモーター(McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 and U.S. Patent 5,641,876);ユビキチン(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689)およびGrefen et al.(2010) Plant J, 64:355-365;pEMU(Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588);MAS(Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730および米国特許第5,510,474号);トウモロコシH3ヒストン(Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 and Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300);ブラシカ・ナプス(Brassica napus)ALS3(国際公開第97/41228号);植物リブロース−ビスカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)小サブユニット遺伝子;サーコウイルス(オーストラリア特許第689311号)またはキャッサバベインモザイクウィルス(CsVMV、米国特許第7,053,205号);ならびに様々なアグロバクテリウム遺伝子(米国特許第4,771,002号;同第5,102,796号;同第5,182,200号;および同第5,428,147号)などの植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
植物用途に適した誘導性プロモーターとしては、銅に反応するACE1系由来プロモーター(Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571)、ベンゼンスルホンアミド除草剤の緩和剤に反応するトウモロコシIn2遺伝子のプロモーター(Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237およびGatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38)、およびTn10由来Tet抑制因子のプロモーター(Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237)が挙げられる。植物における用途の別の誘導性プロモーターは、植物が通常反応しない誘導薬剤に反応するものである。この種の例示の誘導性プロモーターは、その転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導されるステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター(Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421)またはエストラジオールにより活性化されるエストロゲン受容体系誘導性植物発現系における用途のキメラ転写活性化因子であるXVEの最近の応用である(Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273)。植物における用途の他の誘導性プロモーターは、欧州特許第332104号、PCT国際公開第93/21334号、およびPCT国際公開第97/06269号(その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。他のプロモーターの一部からなるプロモーター、および部分的または完全な合成プロモーターも使用することができる。例えば、このようなプロモーターの植物における用途について記載している、Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676およびPCT国際公開第95/14098号参照。
本発明の1つの実施態様では、種子特異的プロモーター(Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296)、特に、ナピンプロモーター(欧州特許出願公開第255378(A1)号)、ファゼオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニン(helianthinin)プロモーター(国際公開第92/17580号)、アルブミンプロモーター(国際公開第98/45460号)、オレオシンプロモーター(国際公開第98/45461号)、SAT1プロモーターまたはSAT3プロモーター(PCT米国特許出願公開第98/06978号)などの植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列を使用して本発明のHPPDタンパク質を発現することができる。
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、HMG−CoA還元酵素(HMG)、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤(PI)、PR1ファミリー遺伝子、ノパリン合成酵素(nos)およびvspBプロモーター(米国特許第5,670,349号、表3)、HMG2プロモーター(米国特許第5,670,349号)、リンゴベータガラクトシダーゼ(ABG1)プロモーターおよびリンゴアミノシクロプロパンカルボン酸合成酵素(ACC合成酵素)プロモーター(国際公開第98/45445号)から有利に選択される誘導性プロモーターも使用してもよい。継続的使用を含み、本発明のコンストラクトにおいて複数のプロモーターを使用することができる。
プロモーターは、1つ以上のエンハンサーエレメントを含んでよく、またはこれを含むように改変されてもよい。いくつかの実施態様では、プロモーターは複数のエンハンサーエレメントを含んでもよい。エンハンサーエレメントを含むプロモーターは、これを含まないプロモーターに比較してより高いレベルの転写を提供する。植物における用途に適したエンハンサーエレメントとしては、PC1SVエンハンサーエレメント(米国特許第5,850,019号)、CaMV 35Sエンハンサーエレメント(米国特許第5,106,739号および同第5,164,316号)、およびFMVエンハンサーエレメント(Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156)、国際公開第87/07644号に記載されたタバコモザイクウイルス(TMV)、または例えばCarrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597に記載されるタバコエッチウイルス(TEV)の翻訳活性化因子、またはトウモロコシのadh1イントロンもしくはコメアクチンのイントロン1などのイントロンが挙げられる。PCT国際公開第96/23898号、国際公開第2012/021794号、国際公開第2012/021797号、国際公開第2011/084370号、および国際公開第2011/028914号も参照。
このようなコンストラクトは、しばしば、5’および3’非翻訳領域を含むことができる。このようなコンストラクトは、対象のペプチドの、葉緑体(または他の色素体)、小胞体、もしくはゴルジ体などの特定の細胞内構造への、同時翻訳、または翻訳後輸送を促進するか、または分泌される、「シグナル配列」または「リーダー配列」を含んでもよい。例えば、コンストラクトを操作して、ペプチドの小胞体への転移を促進するシグナルペプチドを含むことができる。「シグナル配列」は、同時翻訳または細胞膜を横断する翻訳後ペプチド輸送をもたらすことが知られているか、またはもたらすと考えられている配列を表す。真核生物では、これは、通常、いくつかの得られたグリコシル化されたゴルジ体への分泌に関与する。「リーダー配列」は、翻訳する場合、ペプチド鎖を細胞内の細胞小器官へ同時翻訳輸送開始させるために十分なアミノ酸配列をもたらすいずれかの配列を表す。従って、これとしては、小胞体への通過、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどの通過による輸送および/またはグリコシル化を標的とするリーダー配列が挙げられる。イントロンのmRNAプロセシングが発現に必要であるようなイントロンを含むように、植物発現カセットを操作することも好適であり得る。
「3’非翻訳領域」は、コード配列の下流に位置するポリヌクレオチドを表す。mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸の付加経路に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナル配列および制御シグナルをコードする他の配列は、3’非翻訳領域である。「5’非翻訳領域」は、コード配列の上流に位置するポリヌクレオチドを表す。
他の上流または下流の非翻訳エレメントとしては、エンハンサーが挙げられる。 エンハンサーは、プロモーター領域の発現の増大に作用するポリヌクレオチドである。エンハンサーは当技術分野において周知であり、SV40エンハンサー領域および35Sエンハンサーエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
終止領域は、転写開始領域を含む天然であってもよく、本発明の配列を含む天然であってもよく、別の源に由来してもよい。便利な終止領域は、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終止領域など、A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)のTi−プラスミドから得られる。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639;、および欧州特許出願第0633317(A1)号も参照。
本発明の1つの面では、合成DNA配列を、本発明のポリペプチドなどの所与のポリペプチドのために設計する。細胞内での合成DNA配列のオープンリーディングフレームの発現は、本発明のポリペプチドの産生をもたらす。合成DNA配列は、単に必要のない制限エンドヌクレアーゼ部位を除去するため、DNAクローニングストラテジーを促進するため、任意の可能性あるコドンバイアスを変更または除去するため、GC内容物を変更または改善するため、代替のリーディングフレームを除去または変更するため、および/またはイントロン/エクソンスプライシング認識部位、ポリアデニル化部位、シャイン・ダルガノ配列、必要のないプロモーターエレメントおよび天然DNA配列に存在し得る同様のものを変更または除去するために有用であり得る。合成DNA配列は、イントロン配列の導入、葉緑体輸送ペプチド、アポプラスト/液胞標的ペプチドなどの細胞小器官標的配列にタンパク質融合として発現されたDNA配列、または小胞体内の得られたペプチドを保持するペプチド配列の創造など、DNA配列に他の改良の導入するために利用してもよい。合成遺伝子を、発現改良のために宿主細胞優先的コドンを用いて合成することもでき、または宿主優先的コドンの利用頻度においてコドンを用いて合成してもよい。例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11;米国特許第6,320,100号、同第6,075,185号;同第5,380,831号;および同第5,436,391号、米国特許出願公開第2004/0005600号および同第2001/0003849号、ならびにMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498(参照することにより本明細書に組み入れられる)参照。
1つの実施態様では、対象のポリヌクレオチドは、葉緑体に対し発現を標的とする。このように、対象のポリヌクレオチドを葉緑体に直接挿入しない場合、発現カセットは、対象のヌクレオチドを葉緑体へ配向するため、輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むだろう。このような輸送ペプチドは当技術分野において公知である。
例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481参照。
葉緑体を標的とする対象のポリヌクレオチドを、葉緑体における発現が植物の核とこの細胞小器官との間でのコドン利用の差の主要因になるように最適化してもよい。このように、対象のポリヌクレオチドを、葉緑体優先的コドンを用いて合成してもよい。例えば、米国特許第5,380,831号(参照することにより本明細書に組み入れられる)参照。
この植物発現カセットを、植物形質転換ベクター中へ挿入することができる。「形質転換ベクター」は、細胞の形質転換を可能にするDNA分子を表す。このような分子は、1つ以上の発現カセットからなってもよく、かつ、1つより多いベクターDNA分子中に組織化してもよい。例えば、バイナリーベクターは、2つの隣接しないDNAベクターを利用して、植物細胞の形質転換に対して全ての必須のシスおよびトランス作用機能をコードする植物形質転換ベクターである(Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)。「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移動のために設計されたポリヌクレオチドコンストラクトを表す。「発現ベクター」は、外来細胞内に異種性のDNA配列またはフラグメントを取込み、組み込み、および発現する能力を有するベクターを表す。
植物形質転換ベクターは、植物形質転換を行うための1つ以上のDNAベクターを含んでなる。例えば、1つより多い連隣接するDNAセグメントを含んでなる植物形質転換ベクターを利用することは、当技術分野において一般的な方法である。これらのベクターは、当技術分野において、バイナリーベクターと呼ぶことが多い。バイナリーベクターと同様にヘルパープラスミドを含むベクターも、効率的形質転換を達成するために必要なDNAセグメントの大きさおよび複雑さが極めて大きい場合、アグロバクテリウムを介した形質転換のために最も頻繁に使用されており、別々のDNA分子上に機能を分別することが有利である。バイナリーベクターは、T−DNA移動に必要なシス作用配列(左境界および右境界など)を含むプラスミドベクター、植物細胞内で発現可能なように操作された選択マーカー、および「対象のポリヌクレオチド」(トランスジェニック植物の生成が望まれる植物細胞において発現可能なように操作されたポリヌクレオチド)を通常含む。このプラスミドベクターには、細菌複製に必要な配列も存在する。シス作用配列を、植物細胞内への効率的な移動およびその中での発現を可能とするように配置する。例えば、選択マーカー配列および対象の配列は、左境界と右境界との間に配置する。第2のプラスミドベクターには、しばしば、アグロバクテリウムから植物細胞へのT−DNA移行を仲介するトランス作用因子が含まれる。当技術分野において理解されているように、このプラスミドは、しばしば、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、ならびに境界配列における切断によるDNA転移およびvir媒介DNA転移を可能にする毒性因子(Vir遺伝子)を含む(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science,5:446-451)。いくつかの型のアグロバクテリウム株(例えばLBA4404、GV3101、EHA101、EHA105など)を、植物の形質転換のために使用することができる。第2のプラスミドベクターは、顕微鏡投影法、微量注入法、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法によって植物内にポリヌクレオチドを導入するのに必要ではない。
G.植物の形質転換
本発明の方法は、植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入することに関わる。「導入する」は、ヌクレオチドコンストラクトが植物細胞の内部へ接近可能な様式で、該コンストラクトを植物に提示することを意図する。本発明の方法では、植物にヌクレオチドコンストラクトを導入するために特別の方法を用いることは必用とされず、ヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも一つの細胞の内部へ接近可能であることのみが必要とされる。植物内へヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は当該技術分野において公知であり、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルスを介した方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第4,459,355号、米国特許第4,536,475号、米国特許第5,464,763号、米国特許第5、177,010号、米国特許第5,187,073号、欧州特許出願公開第267,159(A1)号、欧州特許出願公開第604662(A1)号、欧州特許出願公開第672752(A1)号、米国特許第4,945,050号、米国特許第5,036,006号、米国特許第5,100,792号、米国特許第5,371,014号、米国特許第5,478,744号、米国特許第5,179,022号、米国特許第5,565,346号、米国特許第5,484,956号、米国特許第5,508,468号、米国特許第5,538,877号、米国特許第5,554,798号、米国特許第5,489,520号、米国特許第5,510,318号、米国特許第5,204,253号、米国特許第5,405,765号、欧州特許出願公開第442174(A1)号、欧州特許出願公開第486233(A1)号、欧州特許出願公開第486234(A1)号、欧州特許第出願公開539563(A1)号、欧州特許第674725(A1)号、国際公開第91/02071号、国際公開第95/06128号、国際公開第2011/095460号、国際公開第2012/006439(A2)号、国際公開第2012/006443(A2)号、国際公開第2012/015039(A1)号、国際公開第2012/019660(A1)号、国際公開第2012/021494(A1)号、国際公開第2012/064827(A1)号、国際公開第2012/075562(A1)号、国際公開第2012/077664(A1)号、国際公開第2012/083137(A1)号、国際公開第2012/084962(A1)号、国際公開第2012/092577(A1)号、国際公開第2012/109947(A1)号、国際公開第2012/129443(A2)号、国際公開第2012/138629(A2)号、国際公開第2012/139416(A1)号、国際公開第2012/149011(A1)号、国際公開第2013/014585(A1)号、国際公開第2013/025670(A1)号、国際公開第2013/033308(A2)号、国際公開第2013/066007(A1)号、国際公開第2013/077420(A1)号、国際公開第2013/090734(A1)号、国際公開第2013/149726(A1)号、国際公開第2013/180311(A1)号、国際公開第2014/029044(A1)号、国際公開第2014/029045(A1)号、国際公開第2014/062036(A1)号、国際公開第2014/065857(A1)号、国際公開第2014/100234(A1)号、国際公開第2014/100406(A1)号、国際公開第2014/123208(A1)号、国際公開第2014/143304(A1)号、国際公開第2014/144513(A2)号、国際公開第2014/157541(A1)号、国際公開第2014/200842(A2)号、国際公開第2015/051083(A1)号、国際公開第2015/077620(A1)号、国際公開第2015/085990(A1)号、国際公開第2015/099674(A1)号、国際公開第2015/118640(A1)号、国際公開第2015/119166(A1)号(これら各々は、特に、その中に記載される形質転換方法に関して、参照することにより本明細書に取り入れられるものとする)に記載された植物細胞の形質転換法および植物の再生方法を参照。
概して、植物の形質転換方法は、異種DNAを標的植物細胞(例えば、未熟または成熟胚、懸濁培養液、未分化カルス、プロトプラストなど)内へ転移し、次いで、最大閾値濃度の適切な選択を行って(選択マーカー遺伝子に従って)、非形質転換細胞集団の群から形質転換植物細胞を回収することを含む。外植体を、通常、同培地の新鮮な補給に移動し、ルーチン的に培養する。その後、形質転換細胞を、最大閾値濃度の選択薬剤を加えた再生培地上に移配置した後、新芽へと分化させる。それから、根付いた新芽または小植物を回収するために、新芽を選択的発根培地に移動する。それから、トランスジェニック小植物は、成熟植物へ成長し、稔性種子を産生する(例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750)。外植体を、通常、同培地の新鮮な補給に移動し、ルーチン的に培養する。トランスジェニック植物を生成するための技術および方法についての一般的記述は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239およびBommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120に見出される。形質転換材料は多くの細胞を含むので;対象の標的カルスもしくは組織または細胞群のいずれかの一部に、形質転換および非形質転換細胞の両方が存在する。非形質転換細胞を死滅させ、かつ形質転換細胞の増殖を可能にする能力は、結果として形質転換植物培養をもたらす。しばしば、非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の継続的生成の制限となる。分子的および生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノム内に組み込まれた対象の異種遺伝子の存在を確認することができる。
トランスジェニック植物の生成を、これに限定されないが、アグロバクテリウムによる植物細胞内への異種DNAの導入(アグロバクテリウム媒介形質転換)、植物細胞への粒子に付着した異種外来DNAの照射、および様々な他の非粒子性の直接法(例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120)を含む、DNAを転移させるためのいくつかの方法の1つにより行ってもよい。
葉緑体の形質転換方法は、当技術分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606参照。方法は、選択マーカーを含むDNAの粒子銃送達および相同組換えによる色素体ゲノムへのDNAの標的化に依存する。加えて、色素体形質転換を、核コード化され色素体を標的としたRNAポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレント色素体由来トランスジーンのトランス活性化により行うことができる。このようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305で報告された。
形質転換された細胞を、従来法に従って植物へと成長させてもよい。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84参照。それから、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株あるいは異なる株と授粉し、所望の表現型の特性を、恒常的発現を有するハイブリッドを同定してもよい。2世代以上を成長させて、所望の表現型特性の発現を安定的に維持し、遺伝によって受け継がせてから、所望の表現型特性の発現を保証するために収穫された種子を得たことを保証してもよい。このように、本発明は、本発明のヌクレオチドコンストラクト、例えば、そのゲノム内に安定的に取り込んだ本発明の発現カセットを有する形質転換種子(「トランスジェニック種子」とも呼ぶ)を提供する。様々な実施態様では、少なくとも1つの抗真菌剤および/または少なくとも1つの殺虫剤、少なくとも1の除草剤、および/または少なくとも1の緩和剤、またはそのいずれかの組合せで、種子を被覆することができる。
H.植物形質転換の評価
植物細胞内への異種外来DNAの導入後、形質転換または植物ゲノム内の異種遺伝子の組込みを、組込み遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の分析など様々な方法により確認する。
PCR分析は、土壌に移植する前の早期段階で、形質転換細胞、組織または新芽を組込み遺伝子の存在について迅速にスクリーニングする方法である(Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY))。対象の遺伝子またはアグロバクテリウムベクターのバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRを行う。
植物形質転換を、ゲノムDNAのサザンブロット解析により確認してもよい(上記のSambrookおよびRussell(2001))。概して、形質転換体から全DNAを抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲル中で分画し、ニトロセルロースまたはナイロン膜に転移する。それから、膜または「ブロット」を、例えば、標準的技術(上記のSambrookおよびRussell,2001)に従って、放射標識した32P標的DNAフラグメントで探索して、植物ゲノム内の導入遺伝子の組込みを確認することができる。
ノーザンブロット解析では、形質転換体の特定の組織からRNAを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルにて分画し、当技術分野においてルーチン的に用いられる標準的手順に従ってナイロンフィルター上にブロットする(上記のSambrookおよびRussell(2001))。それから、当技術分野において公知の方法により、フィルターを放射性プローブとハイブリダイズすることにより、本発明のヌクレオチド配列によりコードされたRNAの発現を試験する(上記のSambrookおよびRussell(2001)。RNAを、当技術分野で公知の逆転写酵素PCRを用いて検出および/または定量化することもできる(例えば、Green and Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY)。
除草剤耐性タンパク質に存在する1つ以上のエピトープと結合する抗体を用いた標準的手順(上記のSambrookおよびRussell(2001))により、トランスジェニック植物に対してウェスタンブロット法、ELISA法、ラテラルフロー試験、および生化学アッセイなどを行い、除草剤耐性遺伝子によりコードされたタンパク質の存在を決定してもよい。
本発明の1つの面では、本明細書に記載されたHPPD遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。
I.形質転換に対するマーカーとしての使用
本発明は、植物の形質転換方法における、マーカー遺伝子として、またはHPPD阻害剤である除草剤に対する耐性を植物に付与することを可能とするコード配列として、本発明に従ったHPPDをコードする核酸の使用、および本発明に従ったHPPDをコードする核酸配列を含んでなる植物における1つ以上のHPPD阻害剤の使用にも関する。例えば、米国特許第6,791,014号(その全文を参照することにより本明細書に取り入れられるものとする)参照。
この実施態様では、コンピテントな植物細胞内に、形質転換工程前に前記細胞を退色するように、HPPD阻害剤を導入することができる。それから、退色したコンピテントな細胞を、選択マーカーとしてHPPD阻害剤に対する耐性用遺伝子で形質転換し、前記選択マーカーをゲノム内に組込んだ形質転換細胞は緑化し、それらを選択可能とした。このような方法により、形質転換細胞を選択するために必要な時間が短縮することが可能となる。
従って、本発明の1つの実施態様は、選択マーカーとしてHPPD阻害剤に対する耐性遺伝子と共に植物細胞内に異種遺伝子を導入することにより、前記植物細胞を形質転換する方法からなり、該方法は、適切な培地中で異種遺伝子を受けることのできるコンピテント植物細胞を調製および培養すること、およびコンピテント植物細胞の適切な培養培地中に適切な量のHPPD阻害剤を導入することを含む。それから、コンピテント細胞を異種遺伝子および選択マーカーで形質転換し、異種遺伝子を含んでなる形質転換細胞を適切な培地中で成長させて、それから形質転換体を選択する。それから、形質転換細胞は、稔性形質転換植物へ再生することができる。
J.植物および植物部分
「植物」は、植物全体、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚およびその子孫を表す。植物細胞は、分化していてもよく、分化していなくてもよい(例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉)。これに限定されないが、単子葉植物および双子葉植物を含むいずれかの植物種にポリヌクレオチドを導入するために本発明を使用してもよい。対象の植物の例としては、トウモロコシ(corn)(トウモロコシ(maize))、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属(Brassica sp.)、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ類、野菜類、観賞植物類、および針葉樹類が挙げられるが、これに限定されない。
野菜類としては、トマト、レタス、サヤマメ、ライマメ、エンドウマメ、ならびにキュウリ、カンタロープ、およびマスクメロンなどのククミス属(genus Curcumis)のメンバーが挙げられるが、これに限定されない。観賞植物類としては、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられるが、これに限定されない。作物類も興味深く、例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなどが挙げられる。
本発明は、これに限定されないが、トウモロコシ、コメ、オオムギ、カラスムギ類、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココナツ、およびデーツを含む単子葉植物ファミリーの任意のメンバーに好適である。
K.植物の収穫高を増大させる方法
植物の収穫高を増大させる方法を提供する。方法は、本発明のHPPDをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる植物を準備すること、または該ポリヌクレオチドを植物もしくは植物細胞内に導入すること、該植物またはその種子を圃場において成長させること、および前記植物または種子から収穫を得ることを含む。本明細書で定義されるとき、植物の「収穫高(yield)」は、植物により産生された生物量の品質および/または量を表す。「生物量」は、測定されたいずれかの植物産物を表す。生物量生産の増加は、測定された植物産物の収穫高におけるいずれかの改良である。植物収穫高の増加は、いくつかの商業的応用を有する。例えば、植物葉生物量の増加は、ヒトまたは動物消費用の葉菜の収穫高を増加し得る。加えて、葉生物量の増加は、植物由来医薬品または工業製品の生産を増加させるために利用可能である。収穫高の増加は、これに限定されないが、少なくとも1%の増加、少なくとも3%の増加、少なくとも5%の増加、少なくとも10%の増加、少なくとも20%の増加、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも100%、またはそれより多い増加を含むいずれかの統計的に有意な増加を含むことができる。
特定の方法では、本発明のHPPD配列を含んでなる植物を、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤からなる群から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤などのHPPD阻害型除草剤の有効濃度で処理し、除草剤の施用により植物収穫高を向上させる。
植物または植物部分に除草剤耐性を付与する方法も提供する。このような方法では、本発明のHPPDをコードするヌクレオチド配列を植物内に導入し、ポリヌクレオチドの発現がHPPD阻害型除草剤耐性をもたらす。この方法により生産した植物を、除草剤(トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤からなる群から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤など)の有効濃度で処理することができ、除草剤に対する耐性増強を示す。本願における除草剤の「有効濃度」は、除草剤に対する天然の耐性でも、与えられた耐性でもない植物または植物部分の成長を遅延または停止するために十分な量である。
L.耕作地における雑草の防除方法
従って、本発明は、本発明に従ったHPPDポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物の収穫物において望ましくない植物の防除または植物成長を調節する方法にも関し、1つ以上のHPPD阻害型除草剤、例えば、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤を、植物(例えば、単子葉または双子葉雑草などの有害植物または望ましくない作物)、種子(例えば、穀物、種子または塊茎などの野菜栄養分体または芽を含む新芽部分)または植物が成長する地区(例えば、栽培地区)に施用する。この関連で、1つ以上のHPPD阻害型除草剤、例えば、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、
N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤からなる群から選択される1つ以上のHPPD阻害型除草剤の有効濃度を、例えば、植え付け前(必要に応じて、土壌に取り込むことにより)、発芽前もしくは発芽後に施用することができ、作物が天然で耐性を有する、または1つ以上の他の除草剤耐性トランスジーンの発現により抵抗性を有する他の除草剤の施用と組合せてもよい。例えば、米国特許出願公開第2004/0058427号および国際公開第98/20144号参照。「有効濃度」は、HPPD阻害剤耐性植物または植物種子に有意に影響することなく、雑草または他の非形質転換植物の成長または繁殖を制御する濃度を表す。除草剤の施用が多くの異なった形態を取ることができ、種まきおよび成長過程の前および/または全体にわたって、多くの異なる時間において起こり得ることを当業者は理解する。「発芽前」施用は、植物が土壌から目に見えるほどに発芽する前に対象の範囲(例えば、圃場または栽培区域)に施用する除草剤を表す。「発芽後」施用は、植物の土壌から見えるほどに発芽した後で範囲に施用する除草剤を表す。いくつかの例では、「発芽前」および「発芽後」という語は、対象の区域における雑草に関連して使用し、いくつかの例では、これらの用語は、対象の区域内の作物に関連して使用する。雑草に関連して使用する場合、これらの用語は、対象の区域に存在するかまたは存在すると考えられる雑草の特定の種類または種に対して施用してもよい。除草剤の「植え付け前混入」は、植え付け前の土壌に化合物を混入することを含む。
従って、本発明は、本発明のHPPDポリペプチドを含んでなる植物またはその種子を圃場に植え付けること、および前記植物または前記植物の周囲の区域に、1つ以上のHPPD阻害型除草剤の有効濃度を施用することを含む圃場における雑草の防除方法を含む。
本発明の1つの実施態様では、本発明のHPPDヌクレオチド配列を含む植物(例えば、ダイズ、ワタ、トウモロコシ、またはコムギ植物など)を植え付けた圃場を、植物を植え付けるか、または種子をまく前に、イソキサフルトール(IFT)などのHPPD阻害型除草剤で処理することができ、これは、HPPD阻害型除草剤により死滅した雑草をきれいにし、耕作しないことを可能とし、次いで、この同じ前処理圃場にあとで植物の植え付けまたは種まきを行う(HPPD阻害型除草剤を用いた焼き払いの応用)。IFTの残効性は、早期成長段階において発芽および成長する植物を雑草との競合から保護もするだろう。一旦、植物が特定の大きさになり、雑草が再び現れるならば、グルホシネートもしくはグリホサート、またはHPPD阻害型除草剤、またはHPPD阻害型除草剤とグリホサートなどの別の除草剤との混合物を、このような植物が前記除草剤に対する耐性を有する場合、発芽後除草剤として植物の先端に施用することができる。
本発明の別の実施態様では、本発明のHPPDヌクレオチド配列を含む種子を播種した圃場を、植物の発芽前だが種子を播種した後に、IFTなどのHPPD阻害型除草剤で処理することができる(圃場は、種まきの前に他の手段、典型的には、プラウイング、チセルプラウイング、または苗床準備などの従来の耕作を用いて雑草の無い状態にすることができる)が、発芽および成長する植物が雑草と競合しない(HPPD阻害型除草剤の発芽前施用)ように、残効性は、除草剤により死滅した雑草の圃場を維持するだろう。一旦、植物が特定の大きさになり、雑草が再び現れるならば、グルホシネートもしくはグリホサート、またはHPPD阻害型除草剤、またはHPPD阻害型除草剤とグリホサートなどの別の除草剤との混合物を、このような植物が前記除草剤に対する耐性を有する場合、発芽後除草剤として植物の先端に施用することができる。
本発明の別の実施態様では、本発明のHPPDヌクレオチド配列を含む植物を、まかれた種子から発芽した植物の先端にHPPD阻害型除草剤で処理することができ、これは、(例えば、スプレータンク混合して)一緒に施用することができるHPPD阻害型除草剤により死滅した雑草の圃場をきれいにし、このような植物がこのような除草剤に対して耐性である場合、次いでまたは先行して、植物の先端に発芽後除草剤としてグリホサートまたはグルホシネートで処理する(HPPD阻害型除草剤(グリホサートと併用または単独)の発芽後施用)。
HPPD阻害型除草剤で防除することができる単子葉類および双子葉類の雑草の個々の代表例としては:
単子葉類有害植物の属:エギロプス属(Aegilops)、アグロピロン属(Agropyron)、アグロスチス属(Agrostis)、アロペクルス属(Alopecurus)、アペラ属(Apera)、アベナ属(Avena)、ブラキアリア属(Brachiaria)、ブロムス属(Bromus)、ケンクルス属(Cenchrus)、コメリナ属(Commelina)、サイノドン属(Cynodon)、シペルス属(Cyperus)、ダクチロクテニウム属(Dactyloctenium)、ジギタリア属(Digitaria)、エキノクロア属(Echinochloa)、エレオカリス属(Eleocharis)、エレウシネ属(Eleusine)、エラグロスチス属(Eragrostis)、エリオクロア属(Eriochloa)、フェスツカ属(Festuca)、フィムブリスチリス属(Fimbristylis)、ヘテランテラ属(Heteranthera)、インペラタ属(Imperata)、イシャエムム属(Ischaemum)、レプトクロア属(Leptochloa)、ロリウム属(Lolium)、モノコリア属(Monochoria)、パニクム属(Panicum)、パスパルム属(Paspalum)、ファラリス属(Phalaris)、フレウム属(Phleum)、ポア属(Poa)、ロットボエリア属(Rottboellia)、サギタリア属(Sagittaria)、シルプス属(Scirpus)、セタリア属(Setaria)、ソルガム属(Sorghum)が挙げられ、
双子葉類雑草の属:アブチロン属(Abutilon)、アマランサス属(Amaranthus)、アンブローシア属(Ambrosia)、アノダ属(Anoda)、アンテミス属(Anthemis)、アファネス属(Aphanes)、アルテミシア属(Artemisia)、アトリプレックス属(Atriplex)、ベリス属(Bellis)、ビデンス属(Bidens)、カプセラ属(Capsella)、カルドゥウス属(Carduus)、カシア属(Cassia)、ケンタウレア属(Centaurea)、ケノポディウム属(Chenopodium)、シルシウム属(Cirsium)、コンボルブルス属(Convolvulus)、ダチュラ属(Datura)、デスモジウム属(Desmodium)、エメックス属(Emex)、エリシマム属(Erysimum)、ユーフォルビア属(Euphorbia)、ガレオプシス属(Galeopsis)、ガリンソガ属(Galinsoga)、ガリウム属(Galium)、ハイビスカス属(Hibiscus)、イポメア属(Ipomoea)、コキア属(Kochia)、ラミウム属(Lamium)、レピジウム属(Lepidium)、リンデルニア属(Lindernia)、マトリカリア属(Matricaria)、メンタ属(Mentha)、メルクリアリス属(Mercurialis)、ムルゴ属(Mullugo)、ミオソチス属(Myosotis)、パパベル属(Papaver)、ファルビチス属(Pharbitis)、プランタゴ属(Plantago)、ポリゴナム属(Polygonum)、ポーチュラカ属(Portulaca)、ラナンキュラス属(Ranunculus)、ラファヌス属(Raphanus)、ロリッパ属(Rorippa)、ロタラ属(Rotala)、ルメックス属(Rumex)、サルソラ属(Salsola)、セネキオ属(Senecio)、セスバニア属(Sesbania)、シダ属(Sida)、シナピス属(Sinapis)、ソラヌム属(Solanum)、ソンクス属(Sonchus)、スフェノクレア属(Sphenoclea)、ステラリア属(Stellaria)、タラキサクム属(Taraxacum)、タラスピ属(Thlaspi)、トリフォリウム属(Trifolium)、ウルチカ属(Urtica)、ベロニカ属(Veronica)、ビオラ属(Viola)、キサンチウム属(Xanthium)が挙げられる。
これに限定されないが、トリケトン類(好ましくは、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン)、ジケトニトリル類、イソキサゾール類(好ましくは、イソキサフルトール)、ヒドロキシピラゾール類(好ましくは、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート)、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類(好ましくは、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物2」とも呼ぶ)、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類(好ましくは、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド;2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド(以後、「化合物1」とも呼ぶ);2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン(oxoprazine)誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類の分類のHPPD阻害型除草剤を含む本発明において有用なHPPD阻害型除草剤を、一般的な生物学的および/または物理化学的パラメーターに応じて、様々な方法で配合することができる。可能な処方物の例は:水和剤(WP)、水溶剤(SP)、水溶性濃縮剤、乳剤(EC)、水中油エマルションおよび油中水エマルションなどのエマルション(EW)、スプレー溶液、懸濁濃縮剤(SC)、油または水ベースの分散剤、油混和性溶液、カプセル懸濁液(CS)、粉剤(DP)、種子粉衣産製品、全面散布用途および土壌用の粒剤、微粒剤の形態の粒剤(GR)、スプレー粒剤、被覆粒剤および吸着粒剤、水分散性粒剤(WG)、水溶性粒剤(SG)、ULV製剤、マイクロカプセル、およびワックスである。
これら個々の型の処方は、原則的には公知であり、例えば、Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. Londonに記載されている。
不活性材料、界面活性剤、溶媒、およびさらなる添加剤などの必要な配合助剤も公知であり、例えば、Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, "Introduction to Clay Colloid Chemistry"; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide"; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's "Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schoenfeldt, "Grenzflaechenaktive Aethylenoxidaddukte" [Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Kuechler, "Chemische Technologie" [Chemical technology], Volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986に記載されている。
これらの処方物に基づき、例えば成分調合済み混合物またはタンク混合物の形態で、例えば、殺虫剤、ダニ駆除剤、除草剤、抗真菌剤などの他の殺虫作用物質と、および緩和剤、肥料および/または成長制御因子との組合せを製造することも可能である。
M.別の植物への本発明の遺伝子の導入方法
本明細書では、別の植物への本発明のHPPDヌクレオチド配列の導入方法も提供する。本発明のHPPDヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを、循環選択、戻し交配、系統育種、系統選択、集団選択、変異育種および/または高感度遺伝子マーカー選択により、第2植物に導入することができる。
従って、1つの実施態様では、本発明の方法は、本発明のHPPDヌクレオチド配列を含んでなる第1植物を第2植物と交配して、F1子孫植物を産出すること、およびHPPD阻害型除草剤に対する耐性があるかまたは本発明のHPPDヌクレオチド配列を含んでなるF1子孫植物を選択することを含む。方法は、選択した子孫植物を、本発明のHPPDヌクレオチド配列を含んでなる第1植物と交配して、戻し交配子孫植物を産出すること、およびHPPD阻害型除草剤に対する耐性があるかまたは本発明のHPPDヌクレオチド配列を含んでなる戻し交配子孫植物を選択することをさらに含んでもよい。HPPD阻害型除草剤耐性を評価する方法を、本明細書の他所に記載する。方法は、これらの工程を1回以上連続的に反復して、HPPD阻害型除草剤に対して耐性があるかまたは本発明のHPPDヌクレオチド配列を含んでなる選択された第2またはそれを超える戻し交配子孫植物を産出することをさらに含んでもよい。
本発明の方法では、所望の表現型のための植物の選択を含むいずれかの繁殖方法を使用することができる。いくつかの実施態様では、F1植物は自家受粉して分離F2世代を産出してもよい。それから、形質が同型接合かまたは育種集団内部で固定されるまで、各世代(F3、F4、F5など)において、所望の表現型(例えば、HPPD阻害型除草剤耐性)を示す個々の植物を選択してもよい。
第2植物は、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養値、疾病抵抗性、改善された光合成、改善された繊維質、ストレス耐性、改善された再生などの望ましい形質を有する植物であり得る。第2植物は、本明細書の他所に記載するようにエリートイベントであってもよい。
様々な実施態様では、植物部分(植物全体、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、繁殖体、胚など)を、得られた交配体から収穫し、下流の用途(例えば、食品、食餌、生物燃料、油、小麦粉、穀粉など)のために繁殖あるいは収集することができる。
N.植物生成物を得る方法
本発明は、本発明のHPPD配列を含んでなる作物由来の穀物を収穫および/または製粉して商品生産物を得ることを含む商品生産物を得るための方法にも関する。これに限定されないが、動物飼料、日用品、ならびにヒトが消費する食品としての用途または組成物およびヒトが消費する目的とした日用品中での用途を目的とした植物生成物および副産物を含む物の農学的および商業的に重要な生産物および/もしく物質組成物、具体的には、このような穀物/種子から産生された(半)処理製品を含む失活種子/穀物製品であって、前記製品は、完全もしく加工種子もしく穀物、動物飼料、コーンミールもしくダイズミール、トウモロコシ粉もしくはダイズ粉、トウモロコシ、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆(生、ロースト、または枝豆として)、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、ならびに調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイルド穀物などであるかまたは含んでなる前記失活種子/穀物製品は、これらの製品および物の組成物がこのようなヌクレオチド配列を含むいずれかの植物の特徴であるとして、本明細書に記載のヌクレオチド配列および/もしくはアミノ酸配列を検出可能な量を含む場合、本発明の範囲内であるものとする。
以下の実施例を例証の目的で提供するが、限定を目的とするものではない。
概要
実施例1:部位特異的変異誘発による変異HPPDポリペプチドの製造
実施例2:組換え野生型および変異HPPDポリペプチドのクローニング、発現、および精製
実施例3:改良HPPD阻害型除草剤耐性を有する変異HPPDポリペプチドを分析するHPPD酵素アッセイ
実施例4:HPPDポリペプチドにおける残基交換により媒介された改良除草剤耐性
実施例5:HPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する変異HPPDポリペプチドを試験する茶色アッセイ(Brown Color assay)
実施例6:ダイズ形質転換およびT0ダイズ植物の耐性
実施例7:綿T0植物の樹立および選択
実施例8:アグロバクテリウム媒介形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
実施例9:HPPD阻害型除草剤に対するT1ダイズ植物の耐性/圃場試験
実施例1.部位特異的変異誘発による変異HPPDポリペプチドの製造
配列番号1に相当するHPPDポリペプチドをコードする国際公開第2009/144079号に記載のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDヌクレオチド配列(配列番号109)を、当技術分野において周知の方法および国際公開第2014/043435号に記載の通りに従ってクローニングした。その後、配列番号1に相当する組換えHPPDポリペプチドをコードする野生型PfHPPDポリペプチドをコードする核酸の部位飽和変異誘発、部位特異的変異誘発および1つ以上の変異との組合せ変異体を、当技術分野において周知(および国際公開第2014/043435号に同様に記載の通り)の標準PCRベース技術を用いて行った。全設計および合成した変異クローンを、プラスミド特異的オリゴヌクレオチドを用いてDNA塩基配列決定により確認した。表2.下記、例示の変異HPPDポリペプチドを纏めている(配列番号2〜配列番号108)。
Figure 0006873979
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明確にするため、配列番号2〜配列番号108のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号1に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異HPPDポリペプチドにおける交換のみ強調している。ここで示した変異HPPDポリペプチドは、例証の目的のための例であって、限定することを目的としていない。
実施例2:組換え野生型および変異HPPDポリペプチドのクローニング、発現、および精製
組換えHPPDポリペプチドをコードする野生型および変異HPPDの配列をコードする全ての得られた核酸を、当技術分野において周知の方法を用いてクローニングし、産生して精製した(Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY)。配列をコードする全ての得られた核酸を、国際公開第2014/043435号に記載のように、N末端Hisタグと融合したpSE420(RI)NX(アミノ酸配列M1−A2−H3−H4−H5−H6−H7−H8−をコードする)にクローニングし、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)株BL21(DE3)(New England Biolabs社、ドイツ、フランクフルト)内で発現した。明確にするため、本発明における配列番号2〜配列番号108に相当する、表1〜5および表7中の変異HPPDポリペプチドからのそれぞれのアミノ酸交換を含む全ての一覧した位置は、配列番号1に相当するN末端Hisタグのない天然野生型HPPDアミノ酸配列を表す。
精製したHPPDポリペプチドサンプル作成のため、140rpmの50ml振盪フラスコ内の100μg/mlのアンピシリンを含有する5mlのLB培地において37℃、3時間、細胞を増殖した。発現培養液用接種材料としてこのスターター培養液1mlを使用した。120rpmの500ml振盪フラスコ内の100μg/mlのアンピシリンおよび150mMのヘペス(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット)を含有する100mlのLB培地において37℃、約3時間、細胞を増殖した。約0.6のOD600において、IPTG(Roth社、ドイツ、カールスルーエ)を、0.4mMの濃度まで添加した。37℃、60分間さらなる増殖の後、温度を28℃に降下させて、140rpmでさらに18時間増殖を続けた。4℃において、50mlのFalconチューブ内で30分間、3200gの遠心分離により、細胞を収穫して、細胞ペレットを−80℃で貯蔵した。細胞を溶解し、ヒスチジンタグをしたタンパク質を、収穫高増大するための次の適応を含む使用したNi−NTA Fast Start Kit(Qiagen社、ドイツ、ヒルデン)の製造者プロトコルに従って精製した:50mlの培養液からの細胞を4mlに溶解し、ライセート上澄みを18000g、15分間遠心分離することにより生成した。カラム中のマトリックス量を、NiNTA Superflow(Qiagen社、ドイツ、ヒルデン)各々の1mlを添加することにより増加し、20mMトリス(pH7.6)中に広範に再緩衝化した。ライセート上澄み液を適用し、4℃、1時間のインキュベートによりHisタグをつけたタンパク質をNi−NTAマトリックスと結合した。
得られたタンパク質サンプルを、Zeba(商標)スピン型脱塩カラム(Spin Desalting Columns)、7K MWCO、10mL(Thermo Fisher Scientific社、米国、ウォルサム)の使用により、20mMトリス、20%グリセロール(pH7.8)(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)中に再緩衝化し、Abs280(NANODROP 8000、Thermo Fisher Scientific社、米国、ウォルサム)およびSDS−PAGEによりタンパク質濃度および純度について分析した。精製タンパク質の濃度は、約90%の推定純度により、概して、0.6〜4.6mg/mlの範囲であった。
阻害アッセイの残効性決定のためのマイクロタイタープレート(MTP)中の粗HPPDポリペプチド抽出物作成のため、標準96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社、米国、ウォルサム)中、1%グルコース(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット)および100μg/mlのアンピシリンを含有する40または150μlのLB培地中で、37℃の湿度インキュベーター内において約18時間インキュベートして、細胞を増殖した。
このスターター培養液30μlを、96ウェルプレート(2mlディープウェル;HJ Bioanalytik社、ドイツ、エルケレンツ)内の発現培養液用接種材料として100μg/mlのアンピシリンおよび150mMのヘペス(MMerk社、ドイツ、ダルムシュタット)を含有するLB培地600μlに添加した。プレートをアルミ箔により密封し、750rpmのプレート振盪機で37℃、5時間細胞をインキュベートした。1mMの最終濃度においてIPTGの添加しより発現を誘発した後、750rpmのプレート振盪機上で30℃、約18時間さらに密閉インキュベートした。
上澄みを捨てながら、4℃、2500g、15分間の遠心分離により、細胞を収穫した。細胞ペレットを−80℃で貯蔵し、4℃および1000rpmで30分間、再懸濁した細胞をインキュベートすることにより1:25000希釈BNase(登録商標)(Qiagen社、ドイツ、ヒルデン)と一緒に、140mMトリス(pH7.8)中の1xBugBuster(登録商標)(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット)250μl中に溶解した。4℃、2500gで15分間、遠心分離によりライセートを清澄化し、その後の4組の試験のため、上澄み150μlを標準96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社、米国、ウォルサム)中に移した。
実施例3:改良HPPD阻害型除草剤耐性を有する変異HPPDポリペプチドを分析するHPPD酵素アッセイ
HPPDポリペプチドの活性を、結合HPPD活性アッセイを用いてHPPD阻害剤の非存在または存在下において決定した(図1)。
残効性の決定のため、決定された基質変換の見かけ速度定数(kapp)を、HPP由来HPPDにより生成されたホモゲンチシン酸(HGA)が第二酵素ホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼ(HGD)により良好に吸収する分子マレイルアセト酢酸(MAA)に直接変換される結合アッセイにおいて320nmにおける吸光度の動態変化として測定し、全てのアッセイにおいて過度に同様に適用した(図1参照)。プレートリーダー(Tecan infinite M1000またはM1000PRO、Tecan社、スイス、メンネドルフ)により、384マイクロタイタープレート(Greiner Bio−One GmbH、ドイツ、フリッケンハウゼン)で測定を行った。酵素活性のkcat/k比は、見かけの速度定数kappに比例し、kcat/k*[E]([E]=酵素濃度)に比例する。競合的阻害剤は、非飽和基質濃度において、kが見かけ増加して、それによりkappが逆に減少することを示す。阻害剤の存在および非存在下でのkapp双方の測定を、粗または精製し、それにより同じ濃度における同じ酵素サンプルの使用により行った際、酵素濃度は、残効性の計算から除かれ、kapp双方の比は阻害によるkの変化を直接示す。注目すべき、この概念は、「競合的阻害」で相互作用する酵素/阻害剤対に当てはまり、おそらく、本明細書に記載されたほとんど全てのポリペプチド変異体および阻害剤に対して正しいが、非可逆的に阻害される野生型ポリペプチドに関しては確実にそうではない(比較のため、国際公開第2014/043435号、図2および3参照)。結果として、「競合的阻害」を表す野生型HPPDポリペプチドの残効性およびki値を、正しく算出することができず、それにもかかわらず、例証の目的のため、野生型HPPDポリペプチドについて表3に実測でない値を示すが、これは非可逆的阻害が起こる前に初期シグナル変化により算出している。
生HPPDポリペプチドサンプルにおいて残効性決定のために使用したアッセイ溶液は、200mMリン酸ナトリウム(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット、pH7.0)、5mM MgCl(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット)、20mMアスコルビン酸塩(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、1mM DTT(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、0.1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、40μM FeSO(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、約8mg/ml精製HGDおよびDMSO(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)中の1M原液からの低濃度または高濃度の基質HPP(100または400μM)からなり、氷上で20分間、平衡化した。全HPPDポリペプチドサンプルについて、4組の2つのアッセイを行ったが、それにより、HPPDポリペプチドサンプル5μlを、それぞれ、参照および阻害アッセイにおいて緩衝液5μl(1xBugBuster(登録商標)(Merk社、ドイツ、ダルムシュタット);140mMのトリス、pH7.8、1:25000希釈BNase(登録商標);Qiagen社、ドイツ、ヒルデン))またはDMSO中0.1M原液から同じ緩衝液で希釈した阻害剤5μl(30、100または120μMは、HPPDポリペプチド/阻害剤サンプルの15、50および60μMを得る)と最初に混合し、次いで、アッセイ溶液10μlと混合した。30分間に1分の間隔で320nmにおける吸光度変化を追跡した。動態反応の初期段階、通常、測定の最初5〜10分間においてシグナルの経時的な勾配としてkapp値を算出した(図3比較)。加えておよび算出した残効性に従って、全変換、すなわち、30分の時間枠におけるシグナルの絶対変化を、代謝回転の測度としてモニターし、残存代謝回転を、阻害剤の存在下におけるシグナル変化を阻害剤なしの参照サンプルにおけるシグナル変化で割ることにより算出した。
ki値決定のために使用したアッセイ溶液は、同様に、試験した4つの阻害剤濃度の各々についてHPP基質の6つの異なる濃度(0〜1350μM)を含有して成る。阻害剤を140mMトリス、0.05%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)中に希釈し、それぞれのHPPDポリペプチド/阻害剤対に対して選択した濃度で適用して動的データを生成した(図4a〜d);概して、それらのHPPDポリペプチド/阻害剤サンプル濃度は、0〜0.0012Mの範囲であった。
実施例4:HPPDポリペプチドにおける残基交換により媒介された改良除草剤耐性
変異HPPDポリペプチドの耐性をHPPD阻害型除草剤の異なる利用可能な化学分類(トリケトン類、イソキサゾール類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、またはN−(テトラゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類)に対して決定する場合、本発明の新規実施態様のいくつかは、参照野生型HPPD(配列番号1)と比較して有意に改良されているだけでなく、実施例として本発明の配列番号2を有する従来技術の変異HPPDポリペプチド(例えば、国際公開第2014/043435号に開示されているものの様な)より予想外に良好であることが明らかになった。
表3の概要として、本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)は、位置335、336、339および340において残基交換を含む。
335(E=>P)、336(G=>D/H)、337(N=>S)を含んでなる変異HPPDポリペプチドに基づいて、位置264、268、270、330、340および/または345におけるさらなる残基交換の導入は、様々な化学分類に属する複数の施用されたHPPD阻害剤に関して、強力に改良された耐性を示す変異HPPDポリペプチド(表3)を生成した。
従って、本発明者らは、残効性改良、より高い残存代謝回転、より高いki値およびそれによる有意に高い除草剤耐性を示す、位置335(グルタミン酸=>プロリン)、336(グリシン=>アスパラギン酸/ヒスチジン)、337(アスパラギン=>セリン)における組合せの残基交換および、必要に応じて、位置204、213、264、268、270、310、315、330、331、338、339、340、344および/または345(表3、4および5)における交換をさらに含んでなる組合せの残基交換により新規変異HPPDポリペプチドを生成し評価した。試験したHPPD阻害型除草剤に依存して、配列番号2と比較して、1.5〜110倍のレベルで、このようなアッセイで使用したHPPDポリペプチドに関して、改良レベルは異なり得る(表4)。
異なるHPPD阻害型除草剤化学分類に対する時間経過の分析は、配列番号1に相当する野生型HPPDポリペプチド遅く強固な結合阻害剤特性と対照的に、HPPD阻害型除草剤は、新規変異HPPDポリペプチドに対して可逆的阻害剤であるように思われることを明らかにした(図2および3参照)。これらの挙動は、様々なHPPD阻害型除草剤に対する作物の耐性のためのより良好で用途の広い可能性を提供する。
HPPD阻害型除草剤の存在下の高い残効性のため、本発明の配列番号1に相当するHPPDポリペプチドのアミノ酸位置に対して、表1中に強調した、開示した位置および残基交換が重要であることが示されている。
表3:多種多様な化学分類に属する異なるHPPD阻害型除草剤に対する変異HPPDポリペプチドの耐性
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(a)化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、(b)化合物2(2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、(c)メソトリオン(MST)、および(d)ジケトニトリル(DKN)の存在下および非存在下において、それぞれ、kappおよび総シグナル変化の測定により、残効性および残存代謝回転を実施例3に従って決定した。各変異HPPDポリペプチドについて、HPPD阻害型除草剤なしでのkappおよび総シグナル変化は、除草剤の存在下におけるkappおよび総シグナル変化の正規化に役立った。それぞれの表3a)、3b)、3c)、および3d)中の纏めて得られた「%値」は、5%の平均標準偏差を有する2つの独立した実験の平均である。15μMの濃度の化合物1および化合物2ならびに60μMの濃度の他の2つの除草剤(DKN、MST)を含む高基質濃度で反応を行った。明確にするため、配列番号2〜配列番号108のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号1に相当するアミノ酸と同一として定義し、HPPDポリペプチド変異体における交換のみ強調している。略語「n.i.」は、所与の濃度において阻害が観察されなかった、すなわち、阻害剤の存在下においてkappおよび総シグナル変化が阻害剤の非存在下における対応する値と比較して減少しないことを意味する。
配列番号1に従ったHPPDポリペプチドに関して位置335、336、337、340、および345におけるアミノ酸交換を含む配列番号10および配列番号24に相当する変異HPPDポリペプチドは、試験した様々なHPPD阻害剤の存在下残効性および残存代謝回転に関して有意な改良を示す(表3a〜d)。表した配列番号10の除草剤耐性は、4つ全ての異なる除草剤分類にわたって、改良対野生型HPPDポリペプチド(配列番号1)だけでなく対本発明の配列番号2に相当する従来技術(国際公開第2014/043435号)変異HPPDポリペプチドを示す。
HPPD阻害剤耐性のさらなる改良は、開示したアミノ酸位置268および270における残基交換を有する変異体によく表れている。
配列番号24から始まって、配列番号31は、言及した位置268および270においてのみ異なる。これらの変化は、HPPD阻害剤化合物1およびMST(表3aおよび3c)の存在下において残存代謝回転を有意に増加させ、化合物2(表3b)およびDKN(表3d)の存在下において既に達成した高い残存代謝回転を保持する。これらの結果は、HPPDポリペプチド(配列番号1)、および本発明における配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)と比較して、配列番号31の有意に改良されたki値によっても見られる。
配列番号8に相当する変異HPPDポリペプチドから始まって、アミノ酸330(配列番号12参照)のさらなる変化は、さらに改良されたHPPD阻害剤耐性を示す(表3参照)。
配列番号12に相当する変異HPPDポリペプチドから始まって、アミノ酸位置264(配列番号18参照)のさらなる変化は、化合物1および化合物2に対するさらに有意に改良されたHPPD阻害剤耐性を示す(表3a、3b参照)。
結果として配列番号19に導く配列番号10に相当する変異HPPDポリペプチドの先端上の4つの位置264、268、270、330に全ての前述の交換を導入して、化合物1に対する68%および79%の残効性および残存代謝回転を有する表3a中の全ての示したポリペプチドの最強の耐性を検出し、開示したアミノ酸位置における組合せの残基交換の重要性を示した。配列番号2と比較した化合物1および化合物2に対する改良されたki値を有する配列番号19に相当する変異HPPDポリペプチド。
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明確にするため、配列番号2〜配列番号108のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号1に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異HPPDポリペプチドにおける交換のみ強調している。ここで示した変異HPPDポリペプチドは、例証の目的のための例であって、限定することを目的としていない。
実施例3に従って、化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、化合物2(2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)、およびメソトリオン(MST)の濃度を増加して、初期反応速度を測定することにより、データを得た。概して、HPPの6つの異なる濃度(0〜1350μM)およびそれぞれの阻害剤の4つの異なる濃度を適用した(図4参照)。阻害剤濃度をそれぞれのHPPDポリペプチド/阻害剤対のために選定して動的データを生成した、すなわち、より低い耐性を有する変異体をより低い阻害剤濃度の範囲で分析し、1200μM以下の濃度を最大耐性を有する変異体用に使用した。GraphPad Prism(Windows用バージョン6.00、GraphPad Software社、米国、カリフォルニア州ラホヤ)を競合的阻害モードに従った制限を適用してデータ解析および速度定数のフィッティングのために使用した。明らかな異常値が出現した場合、または非常に高い基質濃度で得られた活性が競合的阻害モードを基礎とする数学に従わなかった場合、それぞれの値をフィッティングから除外した。
既に有意に改良された2つの変異HPPDポリペプチド配列番号17および配列番号19に基づいて生成された系統的変異体のいくつかの結果を表5中に概要を示している。
配列番号17および配列番号19は2つのアミノ酸位置において異なり、配列番号2に相当する変異HPPDポリペプチドと比較して、化合物1に対して配列番号17は約20倍、配列番号19は約30倍増加したkiを示す(表4参照)。
配列番号17に相当する変異HPPDポリペプチドは、位置268、270、335、336、337、340、および345において残基交換を有し、29%の残効性を示し、基質代謝回転は50μMの化合物1の存在下46%のみ減少する。位置268、270、340、345の残基のそれぞれ野生型残基(配列番号1に従った)への復帰変異は、これらの位置および変異の有利な特性を際立たせながら、それぞれ(表5;それぞれ、配列番号71、配列番号63、配列番号81、配列番号88)、19%、24%、17%、および20%の残効性への耐性低下を伴う。
従って、配列番号19の位置345における残基バリンのそれぞれの野生型残基イソロイシンへの復帰変異は、残効性が67%から57%へ低下を伴う(表5;配列番号93)。
一方、位置204、213、264、310、315、330、331、338、339または344における配列番号17へのさらなる1つの残基交換の導入は、結果として、少なくとも1つの変異体の全位置に38%より大きい残効性のさらなる有意な増加をもたらした、例えば、A204M(配列番号40)、R213L(配列番号44)、M264K(配列番号67)、Q310K(配列番号65)、T315R(配列番号45)、D330V(配列番号38)、D331I(配列番号49)、F338V(配列番号53)、K339E(配列番号55)およびS344P(配列番号58)。
要約すれば、HPPDポリペプチドにおいて変異335(グルタミン酸(E)=>プロリン(P))、336(グリシン(G)=>アスパラギン酸(D)/ヒスチジン(H))、および337(アスパラギン(N)=>セリン(S))を超えた特定のさらなる残基交換は、除草剤耐性の改良をもたらし、HPPD阻害型除草剤に対する耐性の改良を付与する開示した位置204、213、264、268、270、310、315、330、331、338、339、340、344、345のさらなる重要性を示す(表5)。最終的に、これらの開示した位置の組合せは、野生型HPPDポリペプチド(配列番号1)および本発明の配列番号2に相当する従来技術変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)と比較して、表4(例えば、配列番号99、100、105、および107)に示すように、異なるHPPD阻害剤分類にわたってki改良をもたらし、化合物1に対して100倍より大きく、化合物2に対して90倍以下、同時に、メソトリオン(MST)に対して約7倍以下の改良をもたらす。
Figure 0006873979
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明確にするため、配列番号2〜配列番号108のそれぞれのアミノ酸位置における空セルは、配列番号1に相当するアミノ酸と同一として定義し、変異HPPDポリペプチドにおける交換のみ強調している。低基質濃度における化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)(50μM)の存在下および非存在下において、それぞれ、kappおよび総シグナル変化の測定により、残効性および残存代謝回転を実施例3に従って決定した。各変異HPPDポリペプチドについて、HPPD阻害型除草剤なしでのkappおよび総シグナル変化は、除草剤の存在下におけるkappおよび総シグナル変化の正規化に役立ち、得られた%値を纏める。
実施例5:HPPD阻害型除草剤に対する耐性を有する変異HPPDポリペプチドを試験する茶色アッセイ(Brown Color assay)
変異HPPDポリペプチドを、茶色アッセイを用いて分析した(国際公開第2014/043435号)。本発明に従った変異HPPDポリペプチドを発現する細菌細胞を、LB寒天、発現ベクターpSE420(RI)NX用選択剤(国際公開第2014/043435号)、5mMチロシン(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、42mMのコハク酸塩(Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)、および6つの異なる濃度のHPPD阻害型除草剤化合物1(0〜500μM)を含有する固形培地上にスポッティングすることによりHPPD阻害剤耐性について96ウェルフォーマットで評価した。
茶色アッセイでは、それぞれの変異HPPDポリペプチドの1つを発現する大腸菌(E.coli)細胞の一夜培養液を、1および10μl抽出物のOD600まで希釈し、0、25、50、100、250、または500μMの化合物1を含有するプレート上に3回繰り返しスポットした。プレートを微孔性テープで被覆し、30℃でインキュベートした。24時間後、室温、暗所で細胞を保持し、7日後、茶色色素形成を目視で採点した。HPPD阻害型除草剤の存在下、HPPD阻害型除草剤耐性HPPDポリペプチドが発現されて活性でない限り、この色素形成は阻害され、寒天プレートの色は変化しない。採点「+++」は、LB寒天プレート中阻害剤なしでそれぞれの変異HPPDポリペプチドの1つを発現する大腸菌(E.coli)細胞で見られるように焦げ茶色化を意味する。「++」および「+」は、それぞれ、中程度および淡い茶色色素沈着をスコア化し、「0」はLB寒天プレートに茶色色素沈着の発色が検出されなかったことを意味する。
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表6に纏めた例示の変異HPPDポリペプチドは、本発明の配列番号1に相当するHPPDポリペプチドと比較して、化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)に対する改良された耐性を示した。既に、25μMの化合物1の濃度において、HPPDポリペプチド(配列番号1に相当する)を発現する大腸菌(E.coli)細胞は、茶色色素沈着を生じず、いくつかの変異HPPDポリペプチドは暗〜中程度の茶色色素沈着を示す。
本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)は、250μMの化合物1において、わずかな茶色色素沈着のみ呈し、500μMの化合物1において茶色色素沈着は見られず、細胞内で発現されたHPPDポリペプチドが完全に阻害することを例証した。 比較すると、配列番号31、32、96、および特に配列番号104を有する表6に示したいくつかの変異HPPDポリペプチドは、25、50、100、250、およびさらに500μMの化合物1の存在下、より強い茶色の発色を示す。
追加の実験では、変異HPPDポリペプチドを、比色茶色アッセイの原理を用いて分析した(例えば、米国特許第6,768,044号に記載されているように)。改良されたHPPD阻害型除草剤耐性を有するHPPDポリペプチドについて96ウェルプレートフォーマット(Nunc(登録商標) 96 DeepWell(商標)プレート、Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)中で、本発明に従ったHPPDポリペプチドを発現する細菌細胞を評価した。
HPPD阻害型除草剤、例えば、化合物1(1000μM)、の存在下または非存在下(in the presence of absence of the HPPD inhibitor herbicide)、発現ベクターpSE420(RI)NX(国際公開第2014/043435号)用選択剤および5mMのパラヒドロキシフェニルピルビン酸塩(HPP;Sigma−Aldrich社、米国、セントルイス)を含有する液体LB培地(Carl Roth GmbH+Co.KG、ドイツ、カールスルーエ)中で、大腸菌(E.coli)細胞を増殖した。
本発明に従ったそれぞれのHPPDポリペプチドの1つを発現する大腸菌(E.coli)培養液の一夜培養液を、500μLの最終体積中0.3〜0.5のOD600に調製した。化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)の存在下および非存在下、茶色の生成(BCF)を測定することにより、残りの茶色の生成を決定した。
従って、96時間後、培養液を遠心分離し、培養液の上澄み液を使用して、440nmにおける可溶性茶色色素生成の光学密度(OD440nm)を測定した。
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表7に纏めた例示の変異HPPDポリペプチドは、本発明の配列番号1に相当するHPPDポリペプチドおよび配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)と比較して、化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)に対する改良された耐性を示した。配列番号1および配列番号2に相当する両方のHPPDポリペプチドは、HPPD阻害剤の存在下、実質的に茶色色素沈着を生じなかった。いくつかの変異HPPDポリペプチドは、中程度〜焦げ茶色色素沈着を示した。それぞれの表7中に纏めた得られた%値は、5%の平均標準偏差を有する少なくとも2つの独立した実験の平均値である。
実施例6:ダイズ形質転換およびT0ダイズ植物の耐性
基本的にPaz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206に記載の方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換ダイズ半種子外植体を用いる記載の方法など当技術分野において周知の方法を使用することにより、ダイズの形質転換を行った。選択マーカーとしてHPPD阻害型除草剤「テンボトリオン」を使用することにより、形質転換体を同定した。若芽の出現を観察し、HPPD阻害型除草剤テンボトリオンに対する耐性の指標として記録した。耐性トランスジェニック新芽は、HPPD阻害型除草剤テンボトリオンで処理していない野生型ダイズ新芽と同等の正常な緑化を示したが、同量のHPPD阻害型除草剤テンボトリオンで処理した野生型ダイズ新芽は完全に白化した。これは、それぞれのHPPDポリペプチドの存在が、テンボトリオンなどのHPPD阻害型除草剤に対する耐性を可能とすることを示した。
耐性若芽を、発根培地に移動するかまたは移植した。根付いた小植物を、順応期間後に温室へ移動した。それから、トランスジーンを含む植物を、HPPD阻害型除草剤、例えば、300〜600g AI/haの速度でメソトリオンを、または150g〜300gAI(グラム有効成分)/ha(ヘクタール)の速度で硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)を散布した。散布後5〜10日目に、除草剤の施用による症状を評価し、同条件下で野生型植物に観察される症状と比較した。
例えば、本発明のHPPD阻害剤耐性HPPDポリペプチドを含む、「植物発現カセット」を有するT0ダイズ植物を、化合物1の耐性に対して試験した。
トランスジェニック植物での温室試験前に(Prior greenhouse trials with the transgenic plants)、ダイズ形質転換物を、ELISAタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在についてルーチン的に分析した(項目DおよびHの詳細説明参照)。選択培地で回収し、検出可能HPPDトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみ、除草剤耐性分析に使用した。各散布前に、DeVries Tracker Sprayerを較正した。化合物1用に使用した化学配合物に硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した。ヘクタール当たり300グラムAI(300gAI/ha)と同じ濃度で散布試験を行った。散布後5日目に耐性を評価した。同じ除草剤配合物を散布した野生型ダイズ植物を全部白化し、先端の2つの三葉の葉が95%より多くの葉の損傷を示した。「1」の採点は、わずかな耐性を有する植物に与えたが、すなわち、先端の2つの三葉の葉は有意な白化を示し、50〜95%の葉の損傷を有して回復の症状をほとんど示さない。「2」の採点は、中程度の耐性を示す植物に割り当てたが、すなわち、先端の3つの三葉の葉の葉面積の10〜49%が除草剤処理に対する耐性の有意な量を示す。「3」の採点は、良好な耐性を示す植物に割り当てたが、すなわち、先端の3つの三葉の葉の葉面積の10%未満が黄化または非常にわずかな白化のみ示す。結果を表8に纏める。
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表8中の結果は、独立したダイズT0イベントが、HPPD阻害型除草剤、化合物1で処理した野生型ダイズコントロール植物とも比較して、300gAI/haの割合でHPPD阻害型除草剤化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)に対して耐性を有することを示している。
配列番号32、配列番号96、および配列番号31に相当する変異HPPDポリペプチドを有するT0ダイズイベントの90%より多くは、50%未満の葉の損傷を有し、従って、本発明の配列番号2に相当する83%の割合の従来技術のHPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)T0集団より良好である。加えて、配列番号32に相当する変異HPPDポリペプチドを有するT0ダイズイベントの約72%は、10%未満の葉の損傷を示し、これは、また、本発明の配列番号2に相当する従来技術のHPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)を過剰発現するT0ダイズイベント集団(54%)と比較して改良を示している。
追加の温室試験では、例示の変異HPPDポリペプチドを含むコンストラクト当たりの21〜91の独立したT0ダイズイベントに、300グラムAI/haの割合で、硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加したHPPD阻害型除草剤化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)を散布した。散布後5日目、HPPD阻害型除草剤が理由である葉の損傷面積を、0(損傷なし)〜100(完全に白化)の基準で採点する。これらの条件下、野生型植物は完全に白化したが、これらの損傷採点は95〜100の範囲であった。
表9は、例示の変異HPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチド(配列番号)に対するパーセンタイル値として、HPPD阻害型除草剤損傷採点データ分布を示す。パーセンタイル値は、集団内の個々の植物から損傷スコアのランクを正規化する。25番目のパーセンタイル値は、所与の集団内の25%のダイズイベントがより低く、75%がより高い損傷スコアを有した場合の損傷スコアである。メディアンは、50番目のパーセンタイル値である。半分は、値がより高い損傷スコアであり;半分はより低い損傷スコアである。75番目および90番目のパーセンタイル値は、75%および90%のダイズイベントが、それぞれ、より低い損傷イベントを有した場合の損傷スコアである。75番目および25番目のパーセンタイル値間の差を、四分位範囲と呼び、集団内の散布を定量化するマーカーである。全てのコンストラクトは、ダイズゲノム内に1つの単一カセット挿入のみ有した。
表9中、最小〜最大スコアの75番目パーセンタイル値に従って損傷スコアに基づいて、コンストラクトをランク付けした。全ての例示のHPPDポリペプチド変異体は、全パーセンタイル値解析において、本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)より良好である。本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)の採点を、表9の最下行に一覧にしている。
Figure 0006873979
実施例7:綿T0植物の樹立および選択
当技術分野において周知の方法、特に好ましくは、国際公開第00/71733号に記載のものにおける方法を使用することにより、ワタ形質転換を行う。再生植物を温室に移動する。順応期間後、十分に成長した植物に、HPPD阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した100または200gAI/haに相当するテンボトリオンを散布する。散布後7日目に、HPPD阻害型除草剤での処理による症状を評価し、同条件下で同処理をした野生型ワタ植物に観察された症状と比較する。
実施例8:アグロバクテリウム媒介形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
トウモロコシ植物およびトウモロコシ形質転換における安定な発現のための植物発現カセットの構築は当技術分野において周知であり、この特定の例では、国際公開第2014/043435号および国際公開第2008/100353号に方法は記載されており使用した。本願における変異HPPDポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、EPSPSタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列でスタックして、EPSPSを標的とする除草剤に対する耐性を付与する。EPSPS遺伝子を単離し、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)(国際公開第2008/100353号)から変異し、輸送ペプチド配列とインフレームで結合して翻訳されたタンパク質の転座を葉緑体に導いた。それぞれ、EPSPS遺伝子のクローンの上流および下流である、ユビキタスプロモーター(サトウキビ由来ユビキチン4プロモーター、米国特許第6,638,766号)、およびカリフラワー・モザイク・ウイルス由来35S転写終結配列で、安定な発現が達成する。
対応する変異HPPDポリペプチドを、EPSPS遺伝子発現カセットで記載したのと同じプロモーター、葉緑体輸送ペプチド、および転写終結配列でクローンするだろう。両方の遺伝子をコードする配列は、トウモロコシ発現に最適化されたコドンである。トウモロコシ形質転換のため、受粉後8〜12日目に穂を最適な状態で収穫する。穂から胚を分離し、これらの胚は、大きさ0.8〜1.5mmが、形質転換に用いるために好ましい。胚盤側を上にして、胚を適切なインキュベーション培地上にまき、暗所において25℃で一夜インキュベートする。
しかしながら本来、胚を一夜インキュベートする必要はない。Tiプラスミド介在転移のため、約5〜10分間、本発明のヌクレオチド配列を有する適切なベクターを含むアグロバクテリウム株と胚を接触させてから、共培養培地上にまいて約3日間培養する(暗所で25℃)。共培養後、外植体を、約5日間、回復期間培地に移動する(暗所で25℃)。使用する特定の選択方法の性質および特性に従って、外植体を選択培地中で最長8週間グリホサートと一緒にインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟した体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟用培地に移動する。それから、得られた成熟体細胞胚を低光量下に置き、当技術分野において公知の再生方法を開始する。得られた新芽を、発根培地上で根付かせて、得られた植物を苗床ポットに移動して、トランスジェニック植物として繁殖させる。ELISAタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在について植物をルーチン的に分析する。選択培地で回収し、検出可能HPPDトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみ、除草剤耐性分析に使用する。
実施例9.HPPD阻害型除草剤に対するT1ダイズ植物の耐性/圃場試験
本発明のHPPD阻害剤耐性ポリペプチドを単独、またはグリホサートに対する耐性を付与する遺伝子および/またはグルホシネートに対する耐性を付与するかまたは本発明のHPPD阻害剤耐性ポリペプチドのみを含む「植物発現カセット」を有する遺伝子と共に発現するダイズ植物を、異なるHPPD阻害型除草剤化学分類に対する耐性について試験した。ELISAタンパク質検出法を用いてトランスジーンの発現および存在について、トランスジェニック植物をルーチン的に分析した(項目DおよびHの詳細説明参照)。選択培地で回収し、検出可能HPPDトランスジーンタンパク質発現を有する植物のみを再生し、温室に移動し、温室においてT0ダイズイベントのHPPD阻害型除草剤耐性分析のためにV2〜V4成長段階で使用した(実施例6)。HPPD阻害型除草剤を含む化学配合物に硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを添加した。散布後5〜21日目に除草剤耐性評価を行った。
最良の独立したT0ダイズイベントを自家受粉してT1ダイズ種子を産生した。
圃場試験では、後生的T1ダイズ種子を植えて、V2〜V4成長段階においてイソキサフルトール210g/haかあるいは化合物1(2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド)150g/haで処理し(表10)、HPPD阻害型除草剤施用後8日葉の損傷を採点した。全ての野生型ダイズ植物またはHPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチドを含まない分離されたT1ダイズ植物に、同じ除草剤配合物を散布し、全部白化したが、散布後8日目100%の葉損傷を示した。
表10では、良好な耐性を示す、すなわち、全葉面積の15%以下の損傷を示すダイズイベントの発生頻度を纏めている。
ここに一覧した全ての例示のHPPD阻害型除草剤耐性ポリペプチド変異体は、15%以下の葉損傷を含み良好な耐性を有する集団においてより高い発生頻度を有し、従って、本発明の配列番号2に相当する従来技術の変異HPPDポリペプチド(国際公開第2014/043435号)より良好であった。
表10.イソキサフルトール210g/ha(表10a)または化合物1の150g/ha(表10b)のいずれかで処理した異なるHPPDポリペプチド変異体を発現する成長段階V2〜V4において例示のトランスジェニックT1ダイズイベントからの葉面積損傷の圃場試験評価。
Figure 0006873979
Figure 0006873979
本明細書で言及したすべての出版物および特許出願は、本発明に関係する当業者の技術水準を示すものである。すべての出版物および特許出願は、あたかも個々の出版物または特許出願各々が、具体的かつ個別に参照することにより組み入れられるよう指示されたのと同じ程度まで、参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のため例証および実施例を用いて少し詳しく記載したが、特定の変更および修飾が添付の請求の範囲内で実施してもよいことは明らかであろう。

Claims (31)

  1. (a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリンを含んでなるアミノ酸配列からなる4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)ポリペプチドをコードする組換え核酸分子であって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、
    前記コードされたHPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換え核酸分子。
  2. 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
    i.配列番号1のアミノ酸位置204に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置310に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置331に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    xi.配列番号1のアミノ酸位置339に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
    xii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
    xiii.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
    xiv.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
    をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項1に記載の組換え核酸分子。
  3. 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
    i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
    をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項1に記載の組換え核酸分子。
  4. 前記コードされたHPPDポリペプチドが、
    i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸の位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸の位置においてリジン、バリン、またはメチオニン
    をさらに含んでなるアミノ酸配列からなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項1に記載の組換え核酸分子。
  5. そのヌクレオチド配列が、植物内で発現するように設計された合成配列である、請求項1〜のいずれかに記載の組換え核酸分子。
  6. そのヌクレオチド配列が、植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を誘導可能なプロモーターに操作可能に連結している、請求項1〜のいずれかに記載の組換え核酸分子。
  7. 前記HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、ピラゾロン類からなる群から選択される、請求項1〜のいずれかに記載の組換え核酸分子。
  8. 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項に記載の組換え核酸分子。
  9. 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
  10. 細菌宿主細胞である、請求項に記載の宿主細胞。
  11. 植物細胞である、請求項に記載の宿主細胞。
  12. 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物。
  13. 前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群より選択される、請求項12に記載の植物。
  14. 請求項1、2、3または4に記載の組換え核酸分子を含んでなるトランスジェニック種子。
  15. HPPDポリペプチドを含んでなる組換えポリペプチドであって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記HPPDポリペプチドが(a)配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、(b)配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、および(c)配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリンを含んでなり、
    前記HPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換えポリペプチド。
  16. 前記HPPDポリペプチドが、
    i.配列番号1のアミノ酸位置204に対応するアミノ酸位置においてメチオニン、スレオニン、セリン、またはロイシン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、リジン、グルタミン、またはロイシン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、ロイシン、グルタミン酸、プロリンまたはセリン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置310に対応するアミノ酸位置においてセリン、ヒスチジン、またはリジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、メチオニンまたはヒスチジン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、またはグリシン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置331に対応するアミノ酸位置においてプロリン、ヒスチジン、セリン、イソロイシン、またはロイシン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    xi.配列番号1のアミノ酸位置339に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、アルギニン、アラニン、またはスレオニン;および/または
    xii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、またはバリン;および/または
    xiii.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン、プロリン、またはアルギニン;および/または
    xiv.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、またはバリン、
    をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項15に記載の組換えポリペプチド。
  17. 前記HPPDポリペプチドが、
    i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてロイシンまたはリジン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、グリシン、またはセリン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸またはセリン;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはメチオニン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
    をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項15に記載の組換えポリペプチド。
  18. 前記HPPDポリペプチドが:
    i.配列番号1のアミノ酸位置213に対応するアミノ酸位置においてリジン;および/または
    ii.配列番号1のアミノ酸位置264に対応するアミノ酸位置においてアルギニンまたはロイシン;および/または
    iii.配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン;および/または
    iv.配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸;および/または
    v.配列番号1のアミノ酸位置315に対応するアミノ酸位置においてアルギニン;および/または
    vi.配列番号1のアミノ酸位置330に対応するアミノ酸位置においてヒスチジン;および/または
    vii.配列番号1のアミノ酸位置338に対応するアミノ酸位置においてバリン;および/または
    viii.配列番号1のアミノ酸の位置340に対応するアミノ酸位置においてアルギニン、またはバリン;および/または
    ix.配列番号1のアミノ酸位置344に対応するアミノ酸位置においてグルタミン;および/または
    x.配列番号1のアミノ酸の位置345に対応するアミノ酸位置においてリジン、バリン、またはメチオニン、
    をさらに含んでなり、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対して耐性を有する、
    請求項15に記載の組換えポリペプチド。
  19. HPPDポリペプチドを含んでなる組換えポリペプチドであって、前記HPPDポリペプチドが1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を有し、前記HPPDポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置268に対応するアミノ酸位置においてグリシンまたはアルギニン、配列番号1のアミノ酸位置270に対応するアミノ酸位置においてグルタミン酸、配列番号1のアミノ酸位置335に対応するアミノ酸位置においてプロリン、配列番号1のアミノ酸位置336に対応する位置においてヒスチジンまたはアスパラギン酸、配列番号1のアミノ酸位置337に対応する位置においてセリン、配列番号1のアミノ酸位置340に対応するアミノ酸位置においてバリン、および配列番号1のアミノ酸位置345に対応するアミノ酸位置においてバリンを含んでなり、
    前記HPPDポリペプチドが、配列番号1に示されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、組換えポリペプチド。
  20. HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項1519のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
  21. 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項20に記載の組換えポリペプチド。
  22. HPPD阻害型除草剤に耐性活性を有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸分子を発現する条件下で、請求項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  23. そのゲノム内に安定に組み込まれたDNAコンストラクトを有し、前記コンストラクトが請求項1、2、3、または4のいずれかに記載の組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、植物。
  24. 前記植物が、植物細胞、植物組織、および植物種子からなる群から選択される、請求項23に記載の植物。
  25. 前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナからなる群から選択される、請求項23に記載の植物。
  26. そのゲノム内に安定に組み込まれたDNAコンストラクトを有し、前記DNAコンストラクトが請求項1、2、3、または4のいずれかに記載の組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる、請求項23に記載の植物のトランスジェニック種子。
  27. 請求項23に記載の植物またはその種子を圃場に植え付けること、および前記圃場に有効濃度のHPPD阻害型除草剤を施用することを含む、圃場の雑草の防除方法。
  28. 前記HPPD阻害型除草剤が、トリケトン類、ジケトニトリル類、イソキサゾール類、ヒドロキシピラゾール類、N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類、N−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ベンズアミド類、N−(テトラゾール−5−イル)−またはN−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体、オキソピラジン誘導体、N−(トリアゾール−2−イル)アリールカルボキサミド類、トリアジノン類、およびピラゾロン類からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
  29. 前記HPPD阻害型除草剤が、ベンゾビシクロン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、テフリルトリオン、ビシクロピロン、フェンキノトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、トプラメゾン、トルピラレート、2−メチル−N−(5−メチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)−3−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、2−クロロ−3−エトキシ−4−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、4−(ジフルオロメチル)−2−メトキシ−3−(メチルスルホニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)ベンズアミド、2−クロロ−3−(メチルスルファニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミド、および2−(メトキシメチル)−3−(メチルスルフィニル)−N−(1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)−4−(トリフルオロメチル)ベンズアミドからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
  30. 1つ以上のHPPD阻害型除草剤に対する耐性を植物に付与するための、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子を含んでなる組成物。
  31. 請求項1〜4のいずれかの組換え核酸分子、または請求項1519のいずれかに記載の組換えポリペプチドを含んでなる、商品生産物であって、前記生産物が、完全または加工した種子または穀物、動物飼料、コーンミールまたはダイズミール、トウモロコシ粉またはダイズ粉、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、トッピング済クリーム、ショートニング、レシチン、食用全大豆、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、および、調理、精白、蒸した、焼いた、またはパーボイル穀物からなる群から選択される、前記生産物。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3055389A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
BR112019018056A2 (pt) * 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
US11371056B2 (en) * 2017-03-07 2022-06-28 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
CN107794263B (zh) * 2017-09-30 2019-10-11 河北大学 一种提高黑色素产率的基因及其应用
MX2020012704A (es) * 2018-05-25 2021-04-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plantas que contienen el evento elite ee-gm4, y metodos y kits para identificar dicho evento en muestras biologicas, y tratamiento de estas.
MX2020012702A (es) * 2018-05-25 2021-04-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plantas que contienen el evento elite ee-gm5 y metodos y kits para identificar dicho evento en muestras biologicas, y tratamiento de estas.
CN116064430B (zh) * 2021-09-14 2023-08-11 山东舜丰生物科技有限公司 突变的hppd多肽及其应用
WO2023114849A2 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Colorado State University Research Foundation Cyp72a219 genes conferring herbicide tolerance
WO2024138014A1 (en) * 2022-12-22 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024160989A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants
WO2024218220A1 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants

Family Cites Families (275)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5102796A (en) 1983-04-15 1992-04-07 Lubrizol Genetics, Inc. Plant structural gene expression
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
BR8600161A (pt) 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
US5182200A (en) 1985-04-22 1993-01-26 Lubrizol Genetics, Inc. T-dna promoters
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
DK175922B1 (da) 1985-08-07 2005-07-04 Monsanto Technology Llc Glyphosat-resistente planter
GB8613481D0 (en) 1986-06-04 1986-07-09 Diatech Ltd Translation of mrna
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
DE3629890A1 (de) 1986-08-29 1988-03-10 Schering Ag Mikroorganismen und plasmide fuer die 2,4-dichlorphenoxyessigsaeure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und staemme
US5164316A (en) 1987-01-13 1992-11-17 The University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
US5145783A (en) 1987-05-26 1992-09-08 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
BR9007159A (pt) 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
DK0426641T3 (da) 1989-10-31 2000-10-23 Monsanto Co Promotor til transgene planter
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
DE69132939T2 (de) 1990-06-25 2002-11-14 Monsanto Technology Llc Glyphosattolerante pflanzen
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
GB9101659D0 (en) 1991-01-25 1991-03-06 Rhone Poulenc Agriculture Compositions of matter
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
IL101508A0 (en) 1991-04-08 1992-12-30 Rhone Poulenc Agrochimie Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin
US5563328A (en) 1992-08-19 1996-10-08 Board Of Regents, University Of Nebraska-Lincoln Promoters from chlorella virus genes providing for expression of genes in prokaryotic and eukaryotic hosts
US6291156B1 (en) 1997-04-03 2001-09-18 Syngenta Participations Ag Plant pest control
FR2706909B1 (ja) 1993-06-25 1995-09-29 Rhone Poulenc Agrochimie
US5670349A (en) 1993-08-02 1997-09-23 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. HMG2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures
JP3347736B2 (ja) 1993-11-19 2002-11-20 バイオテクノロジー・リサーチ・アンド・デイベロツプメント・コーポレイシヨン 植物中で遺伝子を発現させるためのキメラ調節領域及び遺伝子カセット
AU689311B2 (en) 1994-08-30 1998-03-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plant transcription regulators from circovirus
DK0815257T3 (da) 1995-01-31 2002-04-22 Bioimage As Fremgangsmåde til karakterisering af biologisk aktive stoffer
ATE342968T1 (de) 1995-04-20 2006-11-15 Basf Ag Auf basis ihrer struktur entworfene herbizid resistente produkte
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
SK93197A3 (en) 1995-11-06 1998-05-06 Wisconsin Alumni Res Found Insecticidal protein toxins from photorhabdus
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
CA2258565C (en) 1996-06-20 2011-11-22 The Scripps Research Institute Cassava vein mosaic virus promoters and uses thereof
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
CA2263819A1 (en) 1996-08-29 1998-03-05 Dow Agrosciences Llc Insecticidal protein toxins from photorhabdus
IL129707A0 (en) 1996-11-07 2000-02-29 Zeneca Ltd Herbicide resistant plants
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
CA2272843C (en) 1996-11-20 2009-11-10 Ecogen, Inc. Broad-spectrum delta-endotoxins
ES2289776T3 (es) 1997-04-03 2008-02-01 Dekalb Genetics Corporation Utilizacion de lineas de maiz resistentes al glifosato.
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5959175A (en) 1997-04-09 1999-09-28 Thomas; Terry L. Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
NZ500741A (en) 1997-04-09 2001-06-29 Ministry Of Agriculture And Fo Inducible plant promoters selected from apple beta-galactosidase (ABG1) or 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACC synthase)
ES2286850T3 (es) 1997-05-05 2007-12-01 Dow Agrosciences Llc Toxinas proteicas insecticidas de xenorhabdus.
FR2770854B1 (fr) 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
US6245968B1 (en) * 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
FR2772787B1 (fr) * 1997-12-24 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Promoteur h3c4 de mais associe au premier intron de l'actine de riz, gene chimere le comprenant et plante transformee
FR2772789B1 (fr) 1997-12-24 2000-11-24 Rhone Poulenc Agrochimie Procede de preparation enzymatique d'homogentisate
US6706948B1 (en) 1998-03-19 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Sugarcane UBI9 gene promoter and methods of use thereof
US6333449B1 (en) 1998-11-03 2001-12-25 Plant Genetic Systems, N.V. Glufosinate tolerant rice
WO2000026356A1 (en) 1998-11-03 2000-05-11 Aventis Cropscience N. V. Glufosinate tolerant rice
EP1183377B1 (en) 1999-05-19 2007-06-20 Bayer BioScience N.V. Improved method for agrobacterium mediated transformation of cotton
US6509516B1 (en) 1999-10-29 2003-01-21 Plant Genetic Systems N.V. Male-sterile brassica plants and methods for producing same
US6506963B1 (en) 1999-12-08 2003-01-14 Plant Genetic Systems, N.V. Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same
WO2001047952A2 (en) 1999-12-28 2001-07-05 Bayer Cropscience N.V. Insecticidal proteins from bacillus thuringiensis
US6395485B1 (en) 2000-01-11 2002-05-28 Aventis Cropscience N.V. Methods and kits for identifying elite event GAT-ZM1 in biological samples
US6768044B1 (en) 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
BR122013026754B1 (pt) 2000-06-22 2018-02-27 Monsanto Company Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato
US6713259B2 (en) 2000-09-13 2004-03-30 Monsanto Technology Llc Corn event MON810 and compositions and methods for detection thereof
WO2002027004A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof
AU1536302A (en) 2000-10-25 2002-05-06 Monsanto Technology Llc Cotton event pv-ghgt07(1445) and compositions and methods for detection thereof
AU2002230899B2 (en) 2000-10-30 2006-11-09 Monsanto Technology Llc Canola event PV-BNGT04(RT73) and compositions and methods for detection thereof
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
WO2002040677A2 (en) 2000-11-20 2002-05-23 Monsanto Technology Llc Cotton event pv-ghbk04 (531) and compositions and methods for detection thereof
WO2002044407A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Ses Europe N.V. Glyphosate resistant transgenic sugar beet characterised by a specific transgene insertion (t227-1), methods and primers for the detection of said insertion
BRPI0116018B1 (pt) 2000-12-07 2018-02-27 Syngenta Limited Polinucleotídeo, métodos para fornecer uma planta que seja tolerante aos herbicidas inibidores da hppd e para controlar seletivamente ervas daninhas em um local compreendendo plantas de safra e ervas daninhas
AU2002252974B2 (en) 2001-01-09 2006-12-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
EG26529A (en) 2001-06-11 2014-01-27 مونسانتو تكنولوجى ل ل سى Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera
US6818807B2 (en) 2001-08-06 2004-11-16 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants having event EE-GH1
WO2003052073A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Syngenta Participations Ag Novel corn event
US7705216B2 (en) 2002-07-29 2010-04-27 Monsanto Technology Llc Corn event PV-ZMIR13 (MON863) plants and compositions and methods for detection thereof
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
GB0225129D0 (en) 2002-10-29 2002-12-11 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
CA2508032C (en) 2002-12-05 2014-09-16 Monsanto Technology Llc Bentgrass event asr-368 and compositions and methods for detection thereof
CN103088017B (zh) 2003-02-12 2016-04-13 孟山都技术有限公司 棉花事件mon 88913及其组合物和检测方法
CA2516221C (en) 2003-02-18 2014-05-13 Monsanto Technology Llc Glyphosate resistant class i 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps)
PT1597373E (pt) 2003-02-20 2012-09-27 Kws Saat Ag Beterraba açucareira tolerante a glifosato
US7335816B2 (en) 2003-02-28 2008-02-26 Kws Saat Ag Glyphosate tolerant sugar beet
CA2521284C (en) 2003-04-29 2014-07-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
MXPA05011795A (es) 2003-05-02 2006-02-17 Dow Agrosciences Llc Evidencia de maiz tc1507 y metodos para deteccion del mismo.
ES2275365B1 (es) 2003-07-25 2008-04-16 Universidad De Cordoba Molecula de adn que codifica una p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de chlamydomonas y sus aplicaciones.
WO2005054480A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Syngenta Participations Ag Insect resistant cotton plants and methods of detecting the same
US7521550B2 (en) 2003-12-01 2009-04-21 Syngenta Participations Ag Insect resistant cotton plants and methods of detecting the same
US7157281B2 (en) 2003-12-11 2007-01-02 Monsanto Technology Llc High lysine maize compositions and event LY038 maize plants
JP4903051B2 (ja) 2003-12-15 2012-03-21 モンサント テクノロジー エルエルシー トウモロコシ植物mon88017および組成物ならびにその検出方法
GB0402106D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Syngenta Participations Ag Improved fertility restoration for ogura cytoplasmic male sterile brassica and method
AU2005235963B2 (en) 2004-03-25 2009-09-24 Syngenta Participations Ag Corn event MIR604
CN101027396B (zh) 2004-03-26 2011-08-03 美国陶氏益农公司 Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定
US7405074B2 (en) 2004-04-29 2008-07-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
ES2432749T3 (es) 2004-09-29 2013-12-05 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Evento DAS-59122-7 de maíz y métodos para su detección
EP1868426B1 (en) 2005-03-16 2018-02-21 Syngenta Participations AG Corn event 3272 and methods of detection thereof
EP1869187B1 (en) 2005-04-08 2012-06-13 Bayer CropScience NV Elite event a2704-12 and methods and kits for identifying such event in biological samples
WO2006108675A2 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Bayer Bioscience N.V. Elite event a5547-127 and methods and kits for identifying such event in biological samples
PT1885176T (pt) 2005-05-27 2016-11-28 Monsanto Technology Llc Evento mon89788 de soja e métodos para a sua deteção
WO2006128568A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag T342-142, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128572A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce46-02a insecticidal cotton
WO2006128569A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-14a, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128573A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce43- 67b, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128570A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-51b insecticidal cotton
MX2007014832A (es) 2005-06-02 2008-02-15 Syngenta Participations Ag Algodon transgenico insecticida ce44-69d que expresa cry1ab.
WO2006132270A1 (ja) 2005-06-10 2006-12-14 Kyoto University 除草剤抵抗性遺伝子
AU2006278778B2 (en) 2005-08-08 2011-12-01 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same
EA201000757A1 (ru) 2005-08-24 2010-12-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы борьбы с сорными растениями на возделываемой посевной площади
WO2011066360A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Detection of aad-12 soybean event 416
EP1982978B1 (en) 2006-02-02 2014-08-27 Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. Pyridone derivative and herbicide
JP5164862B2 (ja) 2006-02-10 2013-03-21 マハラシュートラ ハイブリッド シーズ カンパニー リミテッド(マヒコ) Ee−1イベントを含むトランスジェニックナス(solanummelongena)
PL2021476T3 (pl) 2006-05-26 2014-12-31 Monsanto Technology Llc Roślina kukurydzy i nasienie odpowiadające zdarzeniu transgenicznemu MON89034 oraz sposoby ich wykrywania i zastosowanie
CA2759093C (en) 2006-06-03 2016-08-02 Nykoll Long Corn event mir162
US7851670B2 (en) 2006-06-06 2010-12-14 Monsanto Technology Llc Method for selection of transformed cells
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
US7951995B2 (en) 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
GB0614471D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Syngenta Ltd Herbicidal Compounds
US7928295B2 (en) 2006-08-24 2011-04-19 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same
US20080064032A1 (en) 2006-09-13 2008-03-13 Syngenta Participations Ag Polynucleotides and uses thereof
US7928296B2 (en) 2006-10-30 2011-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US7897846B2 (en) 2006-10-30 2011-03-01 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
BRPI0716347B8 (pt) 2006-10-31 2022-12-06 Du Pont Polinuleotídeo isolado, métodos para identificar se uma amostra biológica compreende um polinucleotídeo, para detectar a presença de um polinucleotídeo, para detectar a presença de uma sequência, para selecionar sementes e para produzir um vegetal tolerante ao inibidor de als, pares de primers de dna e construção de um dna de expressão
CN103484481B (zh) 2006-11-29 2016-11-02 埃塞尼克斯公司 改良的grg23 epsp合酶:组合物和使用方法
GB0624760D0 (en) 2006-12-12 2007-01-17 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2008114282A2 (en) 2007-03-19 2008-09-25 Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited Transgenic rice (oryza sativa) comprising pe-7 event and method of detection thereof
CN103710312B (zh) 2007-04-05 2016-06-01 拜尔作物科学公司 抗虫棉花植物及其鉴定方法
AR066787A1 (es) 2007-05-30 2009-09-09 Syngenta Participations Ag Genes del citocromo p450 que confieren resistencia a los herbicidas
AU2008261312B2 (en) 2007-06-11 2013-09-05 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect resistant cotton plants comprising elite event EE-GH6 and methods for identifying same
JP5291624B2 (ja) 2007-08-01 2013-09-18 クミアイ化学工業株式会社 オキソピラジン誘導体及び除草剤
WO2009064652A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87701 and methods for detection thereof
GB0800856D0 (en) 2008-01-17 2008-02-27 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB0800855D0 (en) 2008-01-17 2008-02-27 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2009100188A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Dow Agrosciences Llc Methods for detection of corn event das-59132
EP2245169A2 (en) 2008-02-14 2010-11-03 Pioneer Hi-Bred International Inc. Plant genomic dna flanking spt event and methods for identifying spt event
US8692076B2 (en) 2008-02-15 2014-04-08 Monsanto Technology Llc Soybean plant and seed corresponding to transgenic event MON87769 and methods for detection thereof
AR070495A1 (es) 2008-02-29 2010-04-07 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon87460 y composiciones y metodos para detectarlo
CA2724670C (en) 2008-04-14 2017-01-31 Bayer Bioscience N.V. New mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, dna sequence and isolation of plants which are tolerant to hppd inhibitor herbicides
US20110195845A1 (en) 2008-06-11 2011-08-11 Dow Agrosciences Llc Constructs for Expressing Herbicide Tolerance Genes, Related Plants, and Related Trait Combinations
US9078406B2 (en) 2008-08-29 2015-07-14 Monsanto Technology Llc Soybean plant and seed corresponding to transgenic event MON87754 and methods for detection thereof
GB0816880D0 (en) 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
CN102164476A (zh) 2008-09-29 2011-08-24 孟山都技术公司 大豆转基因事件mon87705及其检测方法
MX345872B (es) 2008-12-16 2017-02-21 Syngenta Participations Ag Evento 5307 del maiz.
CA2747676A1 (en) 2008-12-19 2010-07-08 Syngenta Participations Ag Transgenic sugar beet event gm rz13
BRPI1006074A2 (pt) 2009-01-07 2017-03-21 Basf Agrochemical Products Bv método para controlar ervas daninhas, molécula de ácido nucleico, planta de soja, par isolado de iniciadores de ácidos nucleicos, kit para a identificação de um evento 127 da molécula de ácido nucleico, métodos para identificar um evento 127 na planta de soja, para identificar uma planta de soja tendo um evento 127 da molécula de ácido nucleico, para aumentar o rendimento em uma planta de soja, para a reprodução de uma planta de soja resistente ao herbicida inibidor de ahas, para detectar a presença de um evento 127 da molécula de ácido nucleico em uma amostra biológica, para o cultivo de uma planta de soja, para detectar um evento 127 do polipeptídeo de uma amostra, semente e dispositivo para uso na detenção de moléculas biológicas
ES2619279T3 (es) 2009-01-22 2017-06-26 Syngenta Participations Ag. Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes y métodos de uso
US9175305B2 (en) 2009-01-22 2015-11-03 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
JP5511693B2 (ja) 2009-02-03 2014-06-04 クミアイ化学工業株式会社 縮合環化した2−ピリドン誘導体及び除草剤
KR101818775B1 (ko) 2009-03-30 2018-01-15 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법
KR101813722B1 (ko) 2009-03-30 2017-12-29 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 벼의 17314 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법
CN102369203B (zh) 2009-04-06 2014-08-20 辛根塔有限公司 除草化合物
AU2010326672A1 (en) 2009-07-10 2011-08-04 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CA3038144C (en) 2009-08-19 2023-03-14 Yunxing Cory Cui Aad-1 event das-40278-9, related transgenic corn lines, and event-specific identification thereof
BR112012008106A2 (pt) 2009-09-04 2019-08-20 Syngenta Participations Ag agrupamento de elementos ativadores translacionais para aumentar a expressão de polipeptídeos em plantas
EP2475654B1 (en) 2009-09-09 2016-12-28 E. I. du Pont de Nemours and Company Herbicidal pyrimidone derivatives
PT2478000T (pt) 2009-09-17 2018-07-17 Monsanto Technology Llc Evento transgénico mon 87708 de soja e métodos de sua utilização
JP5728480B2 (ja) 2009-09-25 2015-06-03 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングBayer Intellectual Property GmbH N−(1,2,5−オキサジアゾール−3−イル)ベンズアミド類および除草剤としてのそれの使用
GB201117019D0 (en) 2011-10-04 2011-11-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
US8676753B2 (en) 2009-10-26 2014-03-18 Amazon Technologies, Inc. Monitoring of replicated data instances
BR112012012404B1 (pt) 2009-11-23 2019-03-06 Monsanto Technology Llc "molécula de dna reconbinante de amplicon, sonda de dna, par de moléculas de dna mètodo para detectar a presença de uma molècula de dna e kit de detecçao de dna".
RU2639520C2 (ru) 2009-11-23 2017-12-21 Байер Кропсайенс Н.В. Растения сои, устойчивой к гербицидам, и способы их идентификации
UA109644C2 (uk) 2009-11-24 2015-09-25 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ЗИГОТНОСТІ ПОДІЇ У РОСЛИНИ СОЇ, ЩО ВКЛЮЧАЄ AAD-12-ПОДІЮ pDAB4468-0416 У СОЇ
US8581046B2 (en) 2010-11-24 2013-11-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event DP-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US8575434B2 (en) 2009-12-17 2013-11-05 Pioneer Hi Bred International Inc Maize event DP-004114-3 and methods for detection thereof
WO2011084632A1 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event dp-032316-8 and methods for detection thereof
US20110154525A1 (en) 2009-12-17 2011-06-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event DP-040416-8 and methods for detection thereof
US20110154526A1 (en) 2009-12-17 2011-06-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event DP-043A47-3 and methods for detection thereof
WO2011076882A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
BR112012015706A2 (pt) 2009-12-23 2015-09-01 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd
CA2785126C (en) 2009-12-23 2019-07-02 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
EP2516635B1 (en) 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
AU2010334815B2 (en) 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
WO2011084370A1 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Syngenta Participations Ag Constitutive synthetic plant promoters and methods of use
CA2788198C (en) 2010-01-26 2021-01-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Hppd-inhibitor herbicide tolerance
WO2011100302A1 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Bayer Cropscience Lp Method of improving plant yield of soybeans by treatment with herbicides
EA201291165A1 (ru) 2010-05-04 2013-05-30 Басф Се Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам
KR101941297B1 (ko) 2010-06-04 2019-01-22 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 유전자 이식 브라씨카의 사건 mon 88302 및 이것의 사용방법
JP5347072B2 (ja) 2010-06-29 2013-11-20 クミアイ化学工業株式会社 6−アシル−1,2,4−トリアジン−3,5−ジオン誘導体及び除草剤
AU2011289286B2 (en) 2010-08-13 2015-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast
KR101796483B1 (ko) 2010-09-01 2017-11-10 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 N-(테트라졸-5-일)- 및 n-(트리아졸-5-일)아릴카복사미드 및 제초제로서의 그의 용도
US8785728B2 (en) 2010-09-08 2014-07-22 Dow Agrosciences, Llc. AAD-12 event 1606 and related transgenic soybean lines
CA2814532C (en) 2010-10-12 2021-07-27 Monsanto Technology Llc Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87712 and methods for detection thereof
ES2588991T3 (es) 2010-11-10 2016-11-08 Bayer Cropscience Ag Variantes de HPPD y procedimientos de uso
WO2012071039A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Pioner Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
CN107529548B (zh) 2010-12-03 2021-05-04 陶氏益农公司 叠加的除草剂耐受性事件8264.44.06.1、相关转基因大豆系、及其检测
US9540656B2 (en) 2010-12-03 2017-01-10 Dow Agrosciences Llc Stacked herbicide tolerance event 8291.45.36.2, related transgenic soybean lines, and detection thereof
TWI667347B (zh) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 大豆品種syht0h2及偵測其之組合物及方法
EP2686316B1 (de) 2011-03-15 2015-04-22 Bayer Intellectual Property GmbH N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)pyridincarboxamide und ihre verwendung als herbizide
HUE024562T2 (en) 2011-03-15 2016-02-29 Bayer Ip Gmbh N- (1,2,5-Oxadiazol-3-yl) -, N- (tetrazol-5-yl) - and N- (triazol-5-yl) -bicycloalkylcarboxamides and their use as herbicides
KR101872239B1 (ko) 2011-03-22 2018-06-28 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 N-(1,3,4-옥사디아졸-2-일)아릴카복사미드 및 제초제로서의 그의 용도
AP2013007130A0 (en) 2011-03-30 2013-09-30 Monsanto Technologies Llc Cotton transgenic event MON 88701 and methods of use thereof
GB201106062D0 (en) 2011-04-08 2011-05-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
BR112013033652A2 (pt) 2011-06-30 2017-01-24 Forage Genetics International Llc planta e semente de alfafa correspondentes ao evento transgênico kk 179-2 e métodos para detecção do mesmo
UA114716C2 (uk) 2011-07-13 2017-07-25 Дау Аґросаєнсиз Елелсі Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів
WO2013012643A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Polynucleotides encoding trehalose-6-phosphate phosphatase and methods of use thereof
JP2013027481A (ja) 2011-07-27 2013-02-07 Fujifilm Corp 光音響撮像システムおよび装置並びにそれらに使用されるプローブユニット
BR112014002191B1 (pt) 2011-08-03 2018-07-17 Bayer Ip Gmbh Amidas de ácido n-(tetrazol-5-il)- ou n-(triazol-5-il) arilcarboxílico, seu uso, composição herbicida, e processo para combate de plantas indesejadas
JP2013040141A (ja) 2011-08-18 2013-02-28 Kumiai Chemical Industry Co Ltd 5−アシルピリミジン−2,4−ジオン誘導体及び除草剤
EP2562174A1 (de) 2011-08-24 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Herbizid wirksame 6-Oxo-1,6-dihydropyrimidin-5-carboxamide und 2-Oxo-1,2-dihydropyridin-3-carboxamide
EP2756204A1 (de) 2011-09-16 2014-07-23 Schaeffler Technologies GmbH & Co. KG Geber- oder nehmerzylinder und wegmesseinrichtung
KR102015314B1 (ko) 2011-10-14 2019-08-28 구미아이 가가쿠 고교 가부시키가이샤 제초제 조성물
EA201490884A1 (ru) 2011-11-02 2014-09-30 Басф Се Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам
EP2773764A4 (en) 2011-11-02 2015-11-11 Basf Se PLANTS WITH INCREASED TOLERANCE TO HERBICIDES
EP2589598A1 (de) 2011-11-03 2013-05-08 Bayer CropScience AG 5-Phenylsubstituierte N-(Tetrazol-5-yl)- und N-(Triazol-5-yl)arylcarbonsäureamide und ihre Verwendung als Herbizide
US8957096B2 (en) 2011-11-03 2015-02-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Herbicidally active oxime-ether-substituted benzoylamides
KR20140098134A (ko) 2011-11-14 2014-08-07 바스프 에스이 치환 1,2,5-옥사디아졸 화합물 및 제초제로서 이의 용도
BR112014011622A2 (pt) 2011-11-16 2017-05-09 Basf Se composto, composição, uso de um composto e método para o controle de vegetação indesejada
CA2854100A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides iii
JP6270480B2 (ja) 2011-11-30 2018-01-31 エフ エム シー コーポレーションFmc Corporation 除草剤組成物
GB201121317D0 (en) 2011-12-09 2012-01-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
UA116532C2 (uk) 2011-12-13 2018-04-10 Байєр Інтеллектуал Проперті Гмбх Аміди n-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)-, n-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)- або n-(тетразол-5-іл)арилкарбоксильної кислоти й застосування їх як гербіцидів
HUE035672T2 (en) 2011-12-21 2018-05-28 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
US9107414B2 (en) 2012-01-11 2015-08-18 Bayer Cropscience Ag Tetrazol-5-yl- and triazol-5-yl-aryl compounds and use thereof as herbicides
WO2013124228A1 (de) 2012-02-21 2013-08-29 Bayer Intellectual Property Gmbh Herbizid wirksame 3 - ( sulfin- /sulfonimidoyl) - benzamide
JP2015508769A (ja) 2012-02-21 2015-03-23 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 除草活性を有する4−ニトロ−置換n−(テトラゾール−5−イル)アリールカルボン酸アミド類、4−ニトロ−置換n−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボン酸アミド類及び4−ニトロ−置換n−(1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)アリールカルボン酸アミド類
WO2013124238A1 (de) 2012-02-21 2013-08-29 Bayer Intellectual Property Gmbh Herbizid wirksame sulfinylaminobenzamide
AR090376A1 (es) 2012-03-20 2014-11-05 Syngenta Ltd Compuestos herbicidas
GB201205657D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB201205654D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
BR112014026789B1 (pt) 2012-04-27 2019-10-22 Basf Se compostos n-(tetrazol-5-il) e n-(triazol-5-il)aril carboxamidas, composição, uso de um composto e método para controlar vegetação indesejada
US20150111750A1 (en) 2012-04-27 2015-04-23 Basf Se Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)hetarylcarboxamide compounds and their use as herbicides
JP2015519314A (ja) 2012-04-27 2015-07-09 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se 置換型n−(テトラゾール−5−イル)−およびn−(トリアゾール−5−イル)ピリジン−3−イル−カルボキサミド化合物ならびに除草剤としてのそれらの使用
JP2015519315A (ja) 2012-04-27 2015-07-09 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se 置換型n−(テトラゾール−5−イル)−およびn−(トリアゾール−5−イル)アリールカルボキサミド化合物ならびに除草剤としてのそれらの使用
CN104271564B (zh) 2012-05-03 2016-08-24 拜尔农作物科学股份公司 6-吡啶酮-2-氨基甲酰基唑类及它们作为除草剂的用途
IN2014DN08150A (ja) 2012-05-03 2015-05-01 Bayer Cropscience Ag
AR090981A1 (es) 2012-05-08 2014-12-17 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon 87411
IN2014MN02540A (ja) 2012-05-16 2015-07-24 Biocentury Transgene China Co
WO2013170399A1 (zh) 2012-05-16 2013-11-21 创世纪转基因技术有限公司 棉花植物事件a2-6以及用于其检测的引物和方法
WO2013174843A1 (de) 2012-05-24 2013-11-28 Bayer Cropscience Ag N-(tetrazol-5-yl)- und n-(triazol-5-yl)arylcarbonsäurethioamide und ihre verwendung als herbizide
CN112273114B (zh) 2012-06-25 2023-02-28 美国陶氏益农公司 昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件pDAB9582.816.15.1
WO2014014904A1 (en) 2012-07-20 2014-01-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Substituted cycloalkyl 1,2,4-triazine-3,5-diones as herbicides
WO2014031971A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicidal pyridazinones
EP2895601A1 (en) * 2012-09-14 2015-07-22 Bayer Cropscience LP Hppd variants and methods of use
CN104822674B (zh) 2012-10-04 2017-04-12 拜耳农作物科学股份公司 1,2,4‑三嗪‑3,5‑二酮‑6‑甲酰胺及其作为除草剂的用途
US20140106968A1 (en) 2012-10-15 2014-04-17 E I Du Pont De Nemours And Company Substituted 1,2,4-triazine-3,5-diones as herbicides
WO2014086737A1 (de) 2012-12-06 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Kondensierte 2-pyridon-3-carboxamide und ihre verwendung als herbizide
BR112015017788A2 (pt) 2013-01-25 2017-08-22 Pioneer Hi Bred Int Construto de dna, método para produzir uma planta, método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico, par de iniciadores de polinucleotídio, evento de milho, método de detecção da presença do dna e kit para detectar ácidos nucleicos
US20150361447A1 (en) 2013-01-25 2015-12-17 Pioneer Hi-Breed International, Inc. Maize event dp-032218-9 and methods for detection thereof
US20150361446A1 (en) 2013-01-25 2015-12-17 Pioneer-Hi-Bred International and E.I. Dupont De Nemours & Company Maize event dp-033121-3 and methods for detection thereof
JP2016094344A (ja) 2013-02-15 2016-05-26 石原産業株式会社 トリアジノンカルボキサミド系化合物又はその塩
GB201304238D0 (en) 2013-03-08 2013-04-24 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CN104067944B (zh) 2013-03-25 2019-03-26 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 水稻育性调控构建体及其转化事件和应用
GB201305753D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Syngenta Ltd Herbicidal Compounds
GB201305750D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Syngenta Ltd Herbicidal Compounds
GB201305759D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Syngenta Ltd Herbicidal Compounds
EP2992103A4 (en) 2013-04-30 2017-01-11 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2014184014A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184017A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)pyridin-3-yl-carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184058A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
WO2014184074A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)hetarylcarboxamide compounds and their use as herbicides
EP2997016B1 (en) 2013-05-15 2017-10-04 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184015A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
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WO2014184073A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
AU2014271662B2 (en) 2013-05-31 2018-03-01 Nissan Chemical Corporation Heterocyclic amide compound
CA2914941A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event mon87751 and methods for detection and use thereof
WO2015006774A2 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Oms Investments, Inc. Plants comprising events pp009-401, pp009-415, and pp009-469, compositions, sequences, and methods for detection thereof
WO2015007632A1 (de) 2013-07-16 2015-01-22 Bayer Cropscience Ag Uracil-5-carboxamide und ihre verwendung als herbizide
WO2015007633A1 (de) 2013-07-16 2015-01-22 Bayer Cropscience Ag 6-azinon-2-carbonyl-derivate und ihre verwendung als herbizide
WO2015007662A1 (de) 2013-07-16 2015-01-22 Bayer Cropscience Ag Azin-2-on-3-carboxamide und ihre verwendung als herbizide
WO2015007564A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Basf Se Substituted n-(1,2,4-triazol-3-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
US9580726B2 (en) 2013-07-31 2017-02-28 The Regents Of The University Of California Tomato plants comprising transgenic event Bs2-X5
US10619138B2 (en) 2013-08-12 2020-04-14 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
GB201314602D0 (en) 2013-08-15 2013-10-02 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
BR112016007566A2 (pt) 2013-10-09 2017-09-12 Monsanto Technology Llc evento de milho transgênico mon87403 e métodos para a detecção do mesmo
BR112016006527A2 (pt) 2013-10-10 2017-08-01 Basf Se composto, composição, utilização de um composto e método para o controle da vegetação
US9902704B2 (en) 2013-10-10 2018-02-27 Basf Se Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
WO2015052178A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
WO2015052173A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides
EP3073828A2 (en) * 2013-11-28 2016-10-05 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Use of 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-n-(1-methyl-1h-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide or its salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides
EP2881387A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
EP2881388A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity

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