ES2619279T3 - Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD que tiene actividad enzimática de HPPD, donde dicho polinucleótido deriva de una planta y donde dicho polipéptido de HPPD vegetal codificado por dicho polinucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con SEC ID NO: 27 y comprende la secuencia de aminoácidos G(I,V)LVD(R,K)D (SEC ID NO: 30), donde la L se sustituye por M.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La Figura 8 muestra una representación del vector binario 15764 que contiene un gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja (que codifica SEC ID NO: 14) impulsado por el potenciador TMV omega y una caja TATA.

La Figura 9 muestra una representación del vector binario 17149 para la transformación de habas de soja que confiere tolerancia a herbicidas de HPPD y a glufosinato, que contiene un casete de expresión que expresa una variante de HPPD (SEC ID NO: 26) junto con dos casetes del gen PAT.

Las Figuras 10A-10D representan la dependencia respecto al tiempo de la inhibición de un mutante de HPPD (G408A) por parte de los compuestos herbicidas B (Figs. 10A-10B) y C (Figs. 10C-10D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos dirigidos a conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD). Las composiciones incluyen secuencia de aminoácidos para polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y sus variantes y fragmentos. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención. Se proporcionan además métodos para conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. También se divulgan métodos para controlar de forma selectiva malas hierbas en un campo en un lugar de cosecha, y para el ensayo, caracterización, identificación y selección de las HPPD mutantes de la actual invención que proporcionan tolerancia a herbicidas.

En el contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (HPPD), 4-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (p-HPPD) son sinónimas.

“Herbicidas de HPPD” son herbicidas que son blanqueadores, y cuyo sitio principal de acción es HPPD. Muchos son bien conocidos y se describen aquí en otra parte y en la bibliografía (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) – The Herbicide Target”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Krämer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220; Edmunds “Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) Inhibitors : Triketones”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Krämer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 221-242). Como se usa aquí, la expresión “herbicidas de HPPD” se refiere a herbicidas que actúan directa o indirectamente para inhibir HPPD, en la que los herbicidas son blanqueadores, y en la que la inhibición de HPPD es al menos parte del modo de acción del herbicida sobre las plantas.

Como se usa aquí, las plantas que son sustancialmente “tolerantes” a un herbicida presentan, cuando se tratan con dicho herbicida, una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la mostrada por plantas similares no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen en el eje x representada gráficamente la “dosis”, y en el eje y tienen representado gráficamente el “porcentaje de exterminio o daño”, “efecto herbicida”, etc. Las plantas tolerantes necesitarán típicamente al menos dos veces tanto herbicida como las plantas similares no tolerantes, a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente “resistentes” al herbicida presentan pocas lesiones, si las presentan, necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, o, al menos, ninguna que impacte significativamente sobre el rendimiento, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo.

Como se usa aquí, “plantas similares no transgénicas” son plantas que son similares o iguales a las plantas transgénicas, pero que no contienen un transgén que confiera resistencia a herbicidas.

Como se usa aquí, el término “conferir” se refiere a proporcionar una característica o rasgo, tal como tolerancia o resistencia a herbicidas, y/u otros rasgos deseables, a una planta.

Como se describe aquí en otra parte, el término “heterólogo” significa procedente de otra fuente. En el contexto de ADN, “heterólogo” se refiere a cualquier ADN “no propio” extraño, incluyendo aquél procedente de otra planta de la misma especie. Por ejemplo, en la presente solicitud, un gen de HPPD de haba de soja que se expresó de forma transgénica nuevamente en una planta de haba de soja todavía se describiría como ADN “heterólogo”.

El artículo “un” y “una” se usan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, hasta al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos. A lo largo de la memoria descriptiva, la palabra “que comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “comprender”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas señalados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Una variedad de términos adicionales se definen o se caracterizan de otro modo aquí.

Secuencias de HPPD

imagen6

aminoácidos del polipéptido de HPPD mutante se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26.

Tabla 1. Mutaciones ejemplares de HPPD

Posición de aminoácido mutable con relación a SEC ID NO: 14

Sustitución, adición o supresión*

172

D, V, E, K o A

217

I, A, M o C

219

H o C

220

C

224

L

240

M, I o L

241

S, W, G, M, F, Y o H

244

V

253

T

254

R, S o A

255

M, H, G, F, C o I

256

R o M

257

G

258

M, I, A o K

259

I

268

V o K

269

M, F o V

271

I, M o V

272

A

280

G o K

281

Suprimir R

281-282

Insertar K, A o R entre R282 y S283

284

V, S, A, P, T, L o G

286

E

287

F

294

A o S

296

L

297

N, R, G, A, H, S, T, E o C

299

L o M

299

M, L o V

325

Q o L

326

K, S, P, D, R, N, Y o H

328

A o R

328

Eliminar P

333

K, R, D, Q o E

336

Eliminar E

339

R o L

Posición de aminoácido mutable con relación a SEC ID NO: 14

Sustitución, adición o supresión*

339

Eliminar I

357

I

358

L

358

M o A

361

K

367

M

370

V o L

371

L

372

S, P, D, R, N, Y o H

374

N

382

L

386

V o C

408

A, S o T

410

T, S, L, A, I, V, Q, H, E, G, M, C, V o T

411

I

413

I

414

G

415

A, N, G, K o Q

416

S, A o Q

420

A

*A menos que se indique de otra manera, los aminoácidos enumerados en esta columna representan las sustituciones posibles en la posición indicada.

En otra realización, las composiciones de la invención comprenden un polipéptido de HPPD mutante que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 27 (la secuencia de aminoácidos de HPPD de Avena sativa) o en el que la secuencia de 5 aminoácidos de HPPD deriva de una planta, donde el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y donde el polipéptido contiene una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos que corresponden a las posiciones de los aminoácidos enumeradas en la columna 1 de la Tabla 2, opcionalmente combinadas además con mutaciones conocidas (véase, por ejemplo, WO2009/144079). En diversas realizaciones, un aminoácido en una o más posiciones enumeradas en la columna 1 de la Tabla 2 se sustituye por cualquier otro aminoácido. En otra 10 realización, el polipéptido comprende una o más sustituciones de aminoácidos que corresponden a las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la columna 2 de la Tabla 2. En otra realización más, el polipéptido comprende una o más sustituciones que corresponden a una variante conservativa de los aminoácidos enumerados en la columna 2 de la Tabla 2. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 217 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 218 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se 15 sustituye por alanina o una sustitución conservativa de la alanina; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 241 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 242 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se sustituye por triptófano o una sustitución conservativa del triptófano; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 408 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 409 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se sustituye por alanina o una sustitución conservativa 20 de alanina. En aspectos particulares, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de HPPD mutante se selecciona

del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26.

Tabla 2. Mutaciones de HPPD ejemplares

Posición de aminoácido (con relación a SEC ID NO: 14)

Sustitución

217

I, A, M o C

241

S, W, G, M, F, Y o H

5

10

15

20

25

30

35

Posición de aminoácido (con relación a SEC ID NO: 14)

Sustitución

254

R, S o A

255

M, H, G, F, C o I

258

M, I, A o K

269

M, F o V

271

M, I o V

284

V, S, A, P, T, L o G

297

N, R, G, S, T, E, C, A o H

325

Q o L

326

K, S, P, D, R, N, Y o H

358

M o A

408

A, S o T

411

T, S, L, A, I, Q, H, E, G, M, C, V o T

Los términos “polipéptido”, “péptido”, y “proteína” se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos de la invención se pueden producir a partir de un ácido nucleico descrito aquí, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, se puede producir una proteína truncada de la invención mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula hospedante apropiada, o, como alternativa, mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tal como digestión con proteasas y purificación.

En consecuencia, la presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y que confieren resistencia o tolerancia en plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD, y sus variantes y fragmentos. En general, la invención incluye cualquier secuencias polinucleotídica que codifique cualquiera de los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí, así como cualquier secuencias polinucleotídica que codifique polipéptidos de HPPD que tienen una o más sustituciones conservativas de aminoácidos con relación a los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los cinco grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: Alifático: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); Que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C); Básico: Arginina I, Lisina (K), Histidina (H); Ácido: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q).

En una realización, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 27 o en la que la secuencia de aminoácidos de HPPD deriva de una planta, en la que el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y en la que el polipéptido contiene una o más sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la presente. En aspectos particulares, la secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido de HPPD mutante que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13.

Como se usa aquí, “ácido nucleico” incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma mono-o bicatenaria, y, excepto que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales por cuanto se hibridan a ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a oligonucleótidos de origen natural.

Como se usan aquí, los términos “que codifica” o “codificado”, cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico específico, significa que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia nucleotídica en una proteína específica. La información mediante la cual una proteína es codificada se especifica mediante el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) con regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas que intervienen (por ejemplo, como en ADNc).

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

iónica y pH definidos. Típicamente, en “condiciones restrictivas” una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.

La Tm es la temperatura (en fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones muy restrictivas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es 0,1 NaCl 5M a 72ºC durante alrededor de un 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2X SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado muy restrictivo va precedido por un lavado menos restrictivo, para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de restricción media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1X SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja restricción para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6X SSC a 40ºC durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de un 10 a 50 nucleótidos), las condiciones restrictivas implican típicamente concentraciones de sal menores que alrededor de un 1,0 M de ion Na, típicamente alrededor de un 0,01 a 1,0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es típicamente al menos alrededor de un 30ºC. Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2X (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada, en el ensayo de hibridación particular, indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas todavía son sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Lo siguiente son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para clonar secuencias nucleotídicas que son homólogos de secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia se hibrida preferiblemente a la secuencia nucleotídica de referencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50ºC con lavado en 2X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50ºC con lavado en 1X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, todavía de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50ºC con lavado en 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50ºC con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, más preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50ºC con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC.

También se divulgan fragmentos y variantes de las secuencias nucleotídicas descritas y proteínas codificadas consiguientemente. “Fragmento” quiere decir una porción de la secuencia nucleotídica o una porción de la secuencia de aminoácidos, y por tanto proteína codificada consiguientemente. Los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden codificar fragmentos proteicos que retienen la actividad biológica de la proteína de HPPD mutante, y por tanto tienen actividad enzimática de HPPD. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o en reacciones de mutagénesis y barajado, para generar todavía más variantes de HPPD, generalmente no codifican proteínas de fragmentos que retienen actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden oscilar desde alrededor de un 20 nucleótidos, alrededor de un 50 nucleótidos, alrededor de un 100 nucleótidos, y hasta la secuencia nucleotídica de longitud completa que codifica los polipéptidos de la invención.

Un fragmento de una secuencia nucleotídica que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD mutante codificará al menos 15, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 180, 200, 250, 300, o 350 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de HPPD mutante de longitud completa. Los fragmentos en una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD.

Como se usa aquí, “secuencia de longitud completa”, en referencia a un polinucleótido específico, significa que tiene toda la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de HPPD nativa o mutada. “Secuencia nativa” quiere decir una secuencia endógena, es decir, una secuencia no manipulada mediante ingeniería, encontrada en un genoma del organismo.

De este modo, un fragmento de una secuencia nucleotídica de la invención puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación, etc., o cebador de PCR, usando métodos descritos más abajo. Una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante se puede preparar aislando una porción de una de las secuencias nucleotídicas de la invención, expresando la porción codificada de la proteína de HPPD mutante (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína de HPPD mutante. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia nucleotídica de la invención comprenden al menos 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, ó 1300

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección del sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, queriendo decir que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede ser también uno que sea de origen natural, pero se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedante, es decir, la secuencia de ADN particular del casete de expresión no se encuentra de forma natural en la célula hospedante, y se debe de haber introducido en la célula hospedante o en un ancestro de la célula hospedante mediante un suceso de transformación. La expresión de la secuencia nucleotídica en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, o de un promotor inducible, que inicia la transcripción sólo cuando la célula hospedante se expone a cierto estímulo externo particular. Adicionalmente, el promotor puede ser también específico de un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.

La presente invención engloba la transformación de plantas con casetes de expresión capaces de expresar un polinucleótido de interés, es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El casete de expresión incluirá en la dirección 5’-3’ de la transcripción una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor) y un marco de lectura abierto polinucleotídico. El casete de expresión puede comprender opcionalmente una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende un gen marcador seleccionable, para permitir la selección de transformantes estables. Los constructos de expresión de la invención pueden comprender también una secuencia líder, y/o una secuencia que permite la expresión inducible del polinucleótido de interés. Véase Guo et al. (2003) Plant J. 34:383-92 y Chen et al. (2003) Plant J. 36:731-40, para ejemplos de secuencias que permiten la expresión inducible.

Las secuencias reguladoras del constructo de expresión están enlazadas operablemente al polinucleótido de interés. Por “enlazadas operablemente” se quiere decir un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la segunda secuencia inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazadas significa que las secuencias nucleotídicas que se enlazan son contiguas.

En la práctica de la invención se puede usar cualquier promotor capaz de dirigir la expresión en la planta de interés. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo al hospedante vegetal. Los términos “heterólogo” y “exógeno”, cuando se usan aquí, se refieren a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ADN

o ARN) o un gen, se refieren a una secuencia que se origina de una fuente extraña a la célula hospedante particular, o, si procede de la misma fuente, está modificada de su forma original. De este modo, un gen heterólogo en una célula hospedante incluye un gen que es endógeno a la célula hospedante particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, mediante el uso de barajado de ADN. Los términos también incluyen múltiples copias de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. De este modo, los términos se refieren a un fragmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedante en la que el elemento no se encuentra normalmente. Los segmentos de ADN exógenos se expresan para producir polipéptidos exógenos.

Una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) “homóloga” es una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) asociada de forma natural con una célula hospedante en la que se introduce.

La elección de los promotores a incluir depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, selectibilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial por células o tejidos. Es una materia normal para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia seleccionando y colocando apropiadamente promotores y otras regiones reguladoras con relación a esa secuencia. Los promotores que se usan para la expresión del transgén o transgenes pueden ser un promotor vegetal fuerte, un promotor vírico, o promotores quiméricos compuestos de elementos tales como: la caja TATA de cualquier gen (o cajas TATA sintéticas, basadas en el análisis del gen de la planta), opcionalmente fusionado a la región 5’ a la caja TATA de promotores vegetales (que dirigen la expresión génica en tejidos y temporalmente apropiada), opcionalmente fusionado a uno o más potenciadores (tales como el potenciador 35S, el potenciador FMV, el potenciador CMP, el potenciador de la SUBUNIDAD PEQUEÑA DE RUBISCO, el potenciador de PLASTOCYANINA).

Los promotores constitutivos ejemplares incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7, y otros promotores constitutivos descritos en el documento WO 99/43838 y en la patente U.S. nº 6.072.050; el promotor CaMV 35S central (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:27232730); el promotor de ALS (patente U.S. nº 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruta, pepitas, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, y similares.

Las plantas útiles en la presente invención incluyen plantas que son transgénicas para al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El tipo de planta seleccionada depende de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, el uso aguas abajo del material vegetal cosechado, la susceptibilidad de la especie vegetal a la transformación, y las condiciones en las que se harán crecer, se cosecharán, y/o se procesarán las plantas. Un experto reconocerá además que factores adicionales para seleccionar variedades vegetales apropiadas para uso en la presente invención incluyen elevado potencial de rendimiento, buena fortaleza del tallo, resistencia a enfermedades específicas, tolerancia a la sequía, secado rápido, y suficiente calidad de grano para permitir el almacenamiento y el envío al mercado con pérdida mínima.

Las plantas según la presente invención incluyen cualquier planta que se cultive con el fin de producir material vegetal que es buscado por el hombre o animal para el consumo oral, o para la utilización en un proceso industrial, farmacéutico, o comercial. La invención se puede aplicar a cualquiera de una variedad de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, trigo, arroz, cebada, haba de soja, algodón, sorgo, habas en general, colza/cánola, alfalfa, lino, girasol, alazor, mijo, centeno, caña de azúcar, remolacha azucarera, cacao, té, Brassica, algodón, café, batata, lino, cacahuete, clavo; vegetales tales como lechuga, tomate, cucurbitáceas, casabe, patata, zanahoria, rábano, guisante, lentejas, repollo, coliflor, brócoli, coles de Bruselas, pimientos, y piña; frutas de árboles tales como limón, manzanas, peras, melocotones, albaricoques, nueces, aguacate, plátano, y coco, y flores tales como orquídeas, claveles y rosas. Otras plantas útiles en la práctica de la invención incluyen pastos perennes, tales como pasto varilla, pastos de las praderas, pasto de la India, pasto de tallo azul gigante, y similares. Se reconoce que se pueden usar mezclas de plantas.

Además, el término “cosechas” se ha de entender también que incluye cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas (tales como, por ejemplo, inhibidores de ALS, por ejemplo primisulfurón, prosulfurón y trifloxisulfurón, inhibidores de EPSPS (5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa), inhibidores de GS (glutamina sintetasa)) como resultado de métodos convencionales de reproducción o manipulación genética mediante ingeniería. Los ejemplos de cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas mediante métodos de manipulación genética mediante ingeniería incluyen variedades de cosechas resistentes a glifosato y a glufosinato, comercialmente disponibles con los nombres comerciales ROUNDUPREADY® y LIBERTYLINK®. El método según la presente invención es especialmente adecuado para la protección de cosechas de haba de soja que también se han hecho tolerantes a glifosato y/o glufosinato, y en las que se usan herbicidas de HPPD en un programa de control de malas hierbas junto con otros de tales herbicidas (glufosinato y/o glifosato) para el control de malas hierbas.

Se contempla además que los constructos de la invención se pueden introducir en variedades vegetales que tienen propiedades mejoradas adecuadas u óptimas para un uso aguas abajo particular. Por ejemplo, la variabilidad genética de origen natural da como resultado plantas con resistencia o tolerancia a inhibidores de HPPD u otros herbicidas, y tales plantas son también útiles en los métodos de la invención. El método según la presente invención se puede optimizar además cruzando los transgenes que proporcionan un nivel de tolerancia con variedades de cultivo de haba de soja que muestran un nivel mejorado de tolerancia a inhibidores de HPPD que se encuentra en un pequeño porcentaje de líneas de haba de soja.

Transformación vegetal

Una vez que se ha clonado en un sistema de expresión un polinucleótido de HPPD mutante resistente o tolerante a herbicidas, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables, se transforma en una célula vegetal. Los casetes de expresión de receptor y diana de la invención se pueden introducir en la célula vegetal de muchas maneras reconocidas en la técnica. El término “introducir”, en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico de interés, quiere decir presentar a la planta el polinucleótido de manera que el polinucleótido gane acceso al interior de una célula de la planta. Cuando se va a introducir más de un polinucleótido, estos polinucleótidos se pueden ensamblar como parte de un único constructo nucleotídico, o como constructos nucleotídicos separados, y se pueden localizar en los mismos vectores de transformación o en diferentes vectores de transformación. En consecuencia, estos polinucleótidos se pueden introducir en la célula hospedante de interés en un suceso de transformación individual, en sucesos de transformación separados, o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de reproducción. Los métodos de la invención no dependen del método particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta, sólo que el polinucleótido o polinucleótidos ganen acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable, y métodos mediados por virus.

“Transformación transitoria”, en el contexto de un polinucleótido, quiere decir que se introduce un polinucleótido en la planta y no se integra en el genoma de la planta.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Por “introducir de forma estable” o “introducido de forma estable”, en el contexto de un polinucleótido introducido en una planta, se quiere decir que el polinucleótido introducido se incorpora de forma estable en el genoma de la planta, y de este modo la planta se transforma de forma estable con el polinucleótido.

“Transformación estable” o “transformado de forma estable” quiere decir que un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico descrito aquí, introducido en una planta, se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma, más particularmente por la progenie de múltiples generaciones sucesivas.

Aquellos de pericia normal en las técnicas de transformación vegetal conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación vegetal, y se pueden usar los genes pertinentes a esta invención conjuntamente con cualquiera de tales vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie diana para la transformación. Para ciertas especies diana, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibióticos o de herbicidas. Los marcadores de selección usados habitualmente en transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a canamicina y antibióticos relacionados (Messing y Vierra Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), los genes pat y bar, que confieren resistencia al herbicida glufosinato (también denominado fosfinotricina; véanse White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990) y las patentes U.S. nos 5.561.236 y 5.276.268), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), y el gen de dhfr, que confiere resistencia a metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), el gen de EPSPS, que confiere resistencia a glifosato (patentes U.S. nos 4.940.935 y 5.188.642), el gen de glifosato Nacetiltransferasa (GAT), que también confiere resistencia a glifosato (Castle et al. (2004) Science, 304:1151-1154; Pub. Sol. de patentes U.S. nos 20070004912, 20050246798, y 20050060767); y el gen de manosa-6-fosfato isomerasa, que proporciona la capacidad para metabolizar manosa (patentes U.S. nos 5.767.378 y 5.994.629). Como alternativa, y en una realización preferida, el gen de HPPD de la actual invención se usa él mismo, como el marcador seleccionable, en combinación con el uso de un herbicida de HPPD como agente de selección.

Los métodos para la regeneración de plantas también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han utilizado vectores plasmídicos Ti para el suministro de ADN extraño, así como la captación directa de ADN, liposomas, electroporación, microinyección, y microproyectiles. Además, se pueden utilizar bacterias del género Agrobacterium para transformar células vegetales. A continuación se dan descripciones de técnicas representativas para transformar plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, así como una técnica de transformación de plástidos representativa.

Muchos vectores están disponibles para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos poseen típicamente al menos una secuencia frontera de T-DNA, e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Para la construcción de vectores útiles en la transformación con Agrobacterium, véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. nº 2006/0260011.

La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens soslaya la necesidad de secuencias de T-DNA en el vector de transformación escogido, y en consecuencia se pueden utilizar vectores que carecen de estas secuencias, además de vectores tales como aquellos descritos anteriormente que contienen las secuencias de T-DNA. Las técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación vía bombardeo con partículas, captación de protoplastos (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende enormemente de la selección preferida para la especie que se transforma. Para la construcción de tales vectores, véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. nº 20060260011.

Para la expresión de una secuencia nucleotídica de la presente invención en plástidos vegetales, se usa el vector de transformación de plástidos pPH143 (el WO 97/32011, véase el Ejemplo 36). La secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, sustituyendo de ese modo la secuencia codificante de PROTOX. Este vector se usa entonces para la transformación plastídica y la selección de transformantes para resistencia a espectinomicina. Como alternativa, la secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, de forma que sustituye al gen aadH. En este caso, los transformantes se seleccionan para resistencia a inhibidores de PROTOX.

Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica, e incluyen técnicas a base de Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas sin Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o células. Esto se puede lograr mediante captación mediada por PEG o por electroporación, suministro mediado por bombardeo con partículas, o microinyección. Los ejemplos de estas técnicas se describen por Paszkowski et al. EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Potrykus et al. Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985); Reich et al. Biotechnology 4:1001-1004 (1986); y Klein et al. Nature 327:70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas se regeneran en plantas completas usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas, debido a su elevada eficiencia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación mediada por Agrobacterium implica típicamente la transferencia del vector binario que posee el ADN extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada, que puede depender del complemento de genes vir portados por la cepa hospedante de Agrobacterium en un plásmido Ti

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

transferencia Southern (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Se separa ADN celular total digerido con BamHI/EcoRI (Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346349) en geles de agarosa con 1% de Tris-borato (TBE), se transfiere a membranas de nailon (Amersham), y se sonda con secuencias de ADN cebadas al azar marcadas con 32P que corresponden a un fragmento de ADN de BamHI/HindIII de 0,7 kb procedente de pC8 que contiene una porción de la secuencia que selecciona plástidos rps7/12. Los brotes homoplásmicos se enraízan asépticamente en medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305), y se transfieren al invernadero.

Las propiedades genéticas manipuladas mediante ingeniería en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente se perpetúan mediante reproducción sexual o crecimiento vegetativo, y de este modo se pueden mantener y propagar en las plantas de la progenie. Generalmente, el mantenimiento y la propagación hacen uso de métodos agrícolas conocidos, desarrollados para satisfacer fines específicos tales como el arado, la siembra o el cosechado.

El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas y semillas transgénicas según la invención se puede hacer adicionalmente en la reproducción vegetal. Dependiendo de las propiedades deseadas, se toman diferentes medidas de reproducción. Las técnicas pertinentes son bien conocidas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, hibridación, reproducción endogámica, reproducción por retrocruzamiento, reproducción de múltiples líneas, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. De este modo, las semillas y plantas transgénicas según la invención se pueden usar para la reproducción de líneas vegetales mejoradas que, por ejemplo, incrementan la efectividad de métodos convencionales, tales como el tratamiento con herbicidas o plaguicidas, o permiten dispensarlos con dichos métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas.

Muchos métodos adecuados para la transformación que usan marcadores de selección adecuados, tales como canamicina, vectores binarios tales como procedentes de Agrobacterium, y regeneración de plantas, como, por ejemplo, procedentes de discos de hojas de tabaco, son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, igualmente una población de control vegetal se transforma con un polinucleótido que expresa la HPPD de control. Como alternativa, una planta dicotiledónea no transformada, tal como Arabidopsis o tabaco, se puede usar como un control, puesto que, en este caso, expresa su propia HPPD endógena.

Resistencia a herbicidas

La presente invención proporciona plantas, células vegetales, tejidos y semillas transgénicas que se han transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una HPPD mutante o variante de la misma que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables.

En una realización, las plantas transgénicas de la invención presentan resistencia o tolerancia a la aplicación de herbicida en una cantidad desde alrededor de un 5 hasta alrededor de un 2,000 gramos por hectárea (g/ha), incluyendo, por ejemplo, alrededor de un 5 g/ha, alrededor de un 10 g/ha, alrededor de un 15 g/ha, alrededor de un 20 g/ha, alrededor de un 25 g/ha, alrededor de un 30 g/ha, alrededor de un 35 g/ha, alrededor de un 40 g/ha, alrededor de un 45 g/ha, alrededor de un 50 g/ha, alrededor de un 55 g/ha, alrededor de un 60 g/ha, alrededor de un 65 g/ha, alrededor de un 70 g/ha, alrededor de un 75 g/ha, alrededor de un 80 g/ha, alrededor de un 85 g/ha, alrededor de un 90 g/ha, alrededor de un 95 g/ha, alrededor de un 100 g/ha, alrededor de un 110 g/ha, alrededor de un 120 g/ha, alrededor de un 130 g/ha, alrededor de un 140 g/ha, alrededor de un 150 g/ha, alrededor de un 160 g/ha, alrededor de un 170 g/ha, alrededor de un 180 g/ha, alrededor de un 190 g/ha, alrededor de un 200 g/ha, alrededor de un 210 g/ha, alrededor de un 220 g/ha, alrededor de un 230 g/ha, alrededor de un 240 g/ha, alrededor de un 250 g/ha, alrededor de un 260 g/ha, alrededor de un 270 g/ha, alrededor de un 280 g/ha, alrededor de un 290 g/ha, alrededor de un 300 g/ha, alrededor de un 310 g/ha, alrededor de un 320 g/ha, alrededor de un 330 g/ha, alrededor de un 340 g/ha, alrededor de un 350 g/ha, alrededor de un 360 g/ha, alrededor de un 370 g/ha, alrededor de un 380 g/ha, alrededor de un 390 g/ha, alrededor de un 400 g/ha, alrededor de un 410 g/ha, alrededor de un 420 g/ha, alrededor de un 430 g/ha, alrededor de un 440 g/ha, alrededor de un 450 g/ha, alrededor de un 460 g/ha, alrededor de un 470 g/ha, alrededor de un 480 g/ha, alrededor de un 490 g/ha, alrededor de un 500 g/ha, alrededor de un 510 g/ha, alrededor de un 520 g/ha, alrededor de un 530 g/ha, alrededor de un 540 g/ha, alrededor de un 550 g/ha, alrededor de un 560 g/ha, alrededor de un 570 g/ha, alrededor de un 580 g/ha, alrededor de un 590 g/ha, alrededor de un 600 g/ha, alrededor de un 610 g/ha, alrededor de un 620 g/ha, alrededor de un 630 g/ha, alrededor de un 640 g/ha, alrededor de un 650 g/ha, alrededor de un 660 g/ha, alrededor de un 670 g/ha, alrededor de un 680 g/ha, alrededor de un 690 g/ha, alrededor de un 700 g/ha, alrededor de un 710 g/ha, alrededor de un 720 g/ha, alrededor de un 730 g/ha, alrededor de un 740 g/ha, alrededor de un 750 g/ha, alrededor de un 760 g/ha, alrededor de un 770 g/ha, alrededor de un 780 g/ha, alrededor de un 790 g/ha, alrededor de un 800 g/ha, alrededor de un 810 g/ha, alrededor de un 820 g/ha, alrededor de un 830 g/ha, alrededor de un 840 g/ha, alrededor de un 850 g/ha, alrededor de un 860 g/ha, alrededor de un 870 g/ha, alrededor de un 880 g/ha, alrededor de un 890 g/ha, alrededor de un 900 g/ha, alrededor de un 910 g/ha, alrededor de un 920 g/ha, alrededor de un 930 g/ha, alrededor de un 940 g/ha, alrededor de un 950 g/ha, alrededor de un 960 g/ha, alrededor de un 970 g/ha, alrededor de un 980 g/ha, alrededor de un 990 g/ha, alrededor de un 1.000, g/ha, alrededor de un 1.010 g/ha, alrededor de un 1.020 g/ha, alrededor de un 1.030 g/ha, alrededor de un 1.040 g/ha, alrededor de un 1.050 g/ha, alrededor de un 1.060 g/ha, alrededor de un 1.070 g/ha, alrededor de un 1.080 g/ha, alrededor de un 1.090 g/ha, alrededor de un 1.100 g/ha,

imagen13

imagen14

R1 y R2 son independientemente alquilo C1-C4; y los ácidos libres de los mismos; c) un compuesto de fórmula (Ic)

imagen15

5 donde R1 es hidroxi, fenilcarbonil-(alcoxi C1-C4)-o fenilcarbonil-(alcoxi C1-C4)-donde el resto de fenilo está sustituido en la posición para con halógeno o alquilo C1-C4, o fenilsulfoniloxi-o fenilsulfoniloxi-donde el resto de fenilo está sustituido en la posición para con halógeno o alquilo C1-C4;

R2 es alquilo C1-C4;

R3 es hidrógeno o alquilo C1-C4; R4 y R6 son independientemente halógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4 o 10 alquilsulfonil C1-C4-; y

R5 es hidrógeno, alquilo C1-C4, (alcoxi C1-C4)-(alcoxi C1-C4)-o un grupo

imagen16

d) un compuesto de fórmula (Id)

imagen17

15 donde R1 es hidroxi; R2 es alquilo C1-C4; R3 es hidrógeno; y R4, R5 y R6 son independientemente alquilo C1-C4; e) un compuesto de fórmula (Ie)

imagen18

20 donde R1 es ciclopropilo; R2 y R4 son independientemente halógeno, haloalquilo C1-C4 o alquilsulfonil C1-C4-; y R3 es hidrógeno; f) un compuesto de fórmula (If)

5

10

15

20

25

30

imagen19

donde R1 es ciclopropilo; R2 y R4 son independientemente halógeno, haloalquilo C1-C4 o alquilsulfonil C1-C4-; y R3 es hidrógeno; g) un compuesto de fórmula (Ig) o fórmula (Ih)

imagen20

donde:

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, (alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3) y (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C2-C3)-(alquilo C1-C3);

R5 es hidrógeno o metilo;

R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, flúor, cloro, hidroxilo y metilo;

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C6, haloalquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C3-C6, alcoxi C1-C6, cicloalcoxi C4-C7, haloalcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, alquilsulfonilo C1-C6, haloalquiltio C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, dialquilamino C2-C6, dialquilaminosulfonilo C2-C6, alquilaminosulfonilo C1-C6, (alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6)-(alquilo C1-C6), (alquenil C3-C6)-(alcoxi C2-C6), (alquinil C3-C6)(alcoxi C1-C6), (alcoxi C1-C6)carbonilo, (alquil C1-C6)carbonilo, (alquenil C1-C4)-S(O)p-R' , (alquilenoíl C1-C4)-CO2-R', (alquilenoíl C1-C4)-(CO)N-R'R', fenil, feniltio, fenilsulfinilo, fenilsulfonilo, fenoxi, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo y heteroarilo o heteroariloxi de 5 o 6 miembros, donde el heteroarilo contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre, donde el componente fenilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, halo, ciano y nitro;

X = O o S;

n = 0 o 1;

m = 0 o 1 siempre que si m = 1 entonces n = 0 y si n=1 entonces m = 0;

p = 0, 1 o 2;

R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C6;

R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alquil C1-C6)carbonil-(alquilo C1-C3), (cicloalquil C3-C6)alquenoílo, por ejemplo, ciclohexilmetilenilo, (alquinil C3-C6)alquilenoílo, por ejemplo, propargilo, (alquenil C2-C6)alquilenilo, por ejemplo, alilo, (alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6), ciano-(alquilo C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede

imagen21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4 que puede estar mono, di o trisustituido con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)-carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo y heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo o heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra y Rb juntos forman un anillo carbocíclico de 3 a 5 miembros que puede estar sustituido con alquilo C1-C4 y puede estar interrumpido por oxígeno, azufre, S(O), SO2, OC(O), NRg o por C(O); o

Ra y Rc juntos forman una cadena de alquileno C1-C3 que puede estar interrumpida por oxígeno, azufre, SO, SO2, OC(O), NRh o por C(O); siendo posible a su vez que la cadena de alquileno C1-C3 esté sustituida con alquilo C1-C4;

Rg y Rh son cada uno, independientemente el uno del otro, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo o (alcoxi C1-C4)carbonilo;

Ri es alquilo C1-C4;

R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3; y cicloalquilo C3-C6 sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3;

R9 se selecciona del grupo que consiste en ciclopropilo, CF3 e i.-Pr;

R10 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, I, Br, SR11, S(O)R11, S(O)2R11 y CO2R11; y

R11 es alquilo C1-4;

h) un compuesto de fórmula (Ij), (Ik) o (Im)

imagen22

o una sal agronómicamente aceptable de dicho compuesto, donde:

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(haloalquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C1-C3)(haloalquilo C1-C3), (cicloalcoxi oxasustituido C4-C6)-(alquilo C1-C3), (cicloalquil oxasustituido C4-C6)-(alcoxi C1-C3)(alquilo C1-C3), (cicloalcoxi oxasustituido C4-C6)-(haloalquilo C1-C3), (cicloalquilo oxasustituido C4-C6)-(alcoxi C1-C3)(haloalquilo C1-C3), [(alcanosulfonil C1-C3)-(alquilamino C1-C3)]-(alquilo C1-C3), [(alcanosulfonilo C1-C3)(cicloalquilamino C3-C4)]-(alquilo C1-C3), (alquil C1-C6)carbonil-(alquilo C1-C3), (cicloalquil C3-C6)-(alquenoílo C2-C6), alquinilo C3-C6, alquenilo C2-C6, ciano-(alquilo C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, arilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, (heteroarilo de 5 o 6 miembros)-(alquilo C1-C3) y heterociclilo-(alquilo C1-C3), donde el heteroarilo o heterociclilo contiene de uno a tres heteroátomos cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre y donde el componente arilo, heterociclilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, (alquilo C1-C6)-S(O)p-, (haloalquilo C1-C6)-S(O)p-, ciano y nitro;

R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, cloro, fluoro y metilo;

R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, flúor, cloro, hidoxilo y metilo;

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, ciano, nitro, halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C6, haloalquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6, aril-(alquenilo C2-C6), (alquinilo C3-C6),

imagen23

imagen24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

R10 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, I, Br, SR11, S(O)R11, S(O)2R11 y CO2R11; y

R11 es alquilo C1-4.

Con relación a las estructuras (Ia)-(Im) descritas aquí:

Halógeno engloba flúor, cloro, bromo o yodo. En consecuencia lo mismo es aplicable a halógeno en el contexto de otras definiciones tales como haloalquilo o halofenilo.

Los grupos haloalquilo que tienen una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono son, por ejemplo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 2-fluoroetilo, 2cloroetilo, pentafluoroetilo, 1,1-difluoro-2,2,2-tricloroetilo, 2,2,3,3-tetrafluoroetilo y 2,2,2-tricloroetilo, heptafluoro-npropilo y perfluoro-n-hexilo.

Los radicales alquilenilo adecuados incluyen, por ejemplo, CH2, CHCH3, C(CH3)2, CH2CHCH3, CH2CH(C2H5).

Los radicales haloalquenilo adecuados incluyen grupos alquenilo sustituidos una o más veces con halógeno, donde el halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo y, especialmente, fluoro o cloro, por ejemplo, 2,2-difluoro-1-metilvinilo, 3fluoropropenilo, 3-cloropropenilo, 3-bromopropenilo, 2,3,3-trifluoropropenilo, 2,3,3-tricloropropenilo y 4,4,4trifluorobut-2-en-1-ilo. Los radicales alquenilo C2-C6 preferidos sustituidos una, dos o tres veces con halógeno son aquellos que tienen una longitud de cadena de 2 a 5 átomos de carbono. Los radicales haloalquilalquinilo adecuados incluyen, por ejemplo, grupos alquilalquinilo sustituidos una o más veces con halógeno, donde el halógeno es bromo

o yodo y, especialmente, fluoro o cloro, por ejemplo, 3-fluoropropinilo, 5-cloropent-2-in-1-ilo, 5-bromopent-2-in-1-ilo, 3,3,3-trifluoropropinilo y 4,4,4-trifluoro-but-2-in-1-ilo. Los grupos alquilalquinilo preferidos sustituidos una o más veces con halógeno son aquellos que tienen una longitud de cadena de 3 a 5 átomos de carbono.

Los grupos alcoxi tienen preferiblemente una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono. Un alcoxi es, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi o tert-butoxi o un isómero de pentiloxi o hexiloxi, preferiblemente metoxi y etoxi. Un alquilcarbonilo es preferiblemente acetilo o propionilo. Un alcoxicarbonilo es, por ejemplo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, n-butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, sec-butoxicarbonilo o tert-butoxicarbonilo, preferiblemente metoxicarbonilo, etoxicarbonilo o tertbutoxicarbonilo.

Un haloalcoxi es, por ejemplo, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, 2,2,2-trifluoroetoxi, 1,1,2,2tetrafluoroetoxi, 2-fluoroetoxi, 2-cloroetoxi, 2,2-difluoroetoxi o 2,2,2-tricloroetoxi, preferiblemente difluorometoxi, 2cloroetoxi or trifluorometoxi.

Los grupos alquiltio tienen preferiblemente una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono. Un alquiltio es, por ejemplo, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio, isobutiltio, sec-butiltio o tert-butiltio, preferiblemente metiltio o etiltio. Un alquilsulfinilo es, por ejemplo, metilsulfinilo, etilsulfinilo, propilsulfinilo, isopropilsulfinilo, n-butilsulfinilo, isobutilsulfinilo, sec-butilsulfinilo o tert-butilsulfinilo, preferiblemente metilsulfinilo o etilsulfinilo.

Un alquilsulfonilo es, por ejemplo, metilsulfonilo, etilsulfonilo, propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, n-butilsulfonilo, isobutilsulfonilo, sec-butilsulfonilo o tert-butilsulfonilo, preferiblemente metilsulfonilo o etilsulfonilo.

Un alquilamino es, por ejemplo, metilamino, etilamino, n-propilamino, isopropilamino o un isómero de butilamino. Dialquilamino es, por ejemplo, dimetilamino, metiletilamino, dietilamino, n-propilmetilamino, dibutilamino o diisopropilamino. Se da preferencia a los grupos alquilamino que tienen una longitud de cadena de 1 a 4 átomos de carbono.

Un cicloalquilamino o dicicloalquilamino es, por ejemplo, ciclohexilamino o diciclopropilamino.

Los grupos alcoxialquilo tienen preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono. Un alcoxialquilo es, por ejemplo, metoximetilo, metoxietilo, etoximetilo, etoxietilo, n-propoximetilo, n-propoxietilo, isopropoximetilo o isopropoxietilo.

Los grupos alquiltioalquilo tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. Un alquiltioalquilo es, por ejemplo, metiltiometilo, metiltioetilo, etiltiometilo, etiltioetilo, n-propiltiometilo, n-propiltioetilo, isopropiltiometilo, isopropiltioetilo, butiltiometilo, butiltioetilo o butiltiobutilo.

Los grupos cicloalquilo tienen preferentemente de 3 a 6 átomos de carbono anulares y pueden estar sustituidos con uno o más grupos metilo; preferiblemente no están sustituidos, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.

El fenilo, incluido el fenilo como parte de un sustituyente tal como fenoxi, bencilo, benciloxi, benzoílo, feniltio, fenilalquilo, fenoxialquilo o tosilo, puede estar en una forma mono o polisustituida, en cuyo caso los sustituyentes podrán estar, según se desee, en la posición o posiciones orto, meta y/o para.

El heterociclilo incluye, por ejemplo, morfolinilo y tetrahidrofurilo.

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

disociación, koff) se determinaron por métodos conocidos en la técnica y esencialmente como se describe en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568 y en la Publicación de Solicitud de Patente PCT nº WO 02/46387).

Por ejemplo, las velocidades de asociación se midieron, a tiempo cero, añadiendo 60 pmoles de HPPD a 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25ºC que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 g/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) y un exceso (300 pmoles) de 14C-inhibidor en un volumen de ensayo total de 425 l, y, a diversos puntos de tiempo (0-180 s), extinguiendo la reacción de unión del radiomarcador mediante adición y mezclamiento rápido de 100 l de estructura A “fría” 1 mM. Las muestras de proteína extinguidas a diferentes tiempos se intercambiaron entonces en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatografía rápida a través de una columna NAP5 G25 Sephadex (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a las fracciones proteicas se cuantificó en un líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Los datos se ajustaron según el esquema más abajo, a fin de derivar el valor de la constante de velocidad aparente de segundo orden, k2, que gobierna la velocidad de asociación de la enzima y el inhibidor radiomarcado. Se usó un intervalo de concentraciones de enzima y de inhibidor. Opcionalmente, la constante de velocidad se puede obtener a partir de experimentos similares en los que la enzima (a 0,05-0,2 M de sitios de unión) y, en este caso, inhibidor sin marcar (a 0,5 a 2 M) se hacen reaccionar durante un intervalo de tiempos cortos (0-60 s) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25ºC que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 g/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO), y entonces se extinguió mediante dilución rápida en disolución de ensayo que contiene 100-200 M de HPP para el ensayo inmediato mediante cuantificación por HPLC/UV de la formación de homogentisato después de 30-40 s (es decir, un tiempo suficientemente corto de manera que la disociación y asociación del inhibidor no se produce significativamente en la escala de tiempo del ensayo) como se describe anteriormente. Otros métodos ejemplares se describen en la Publicación de Solicitud de Patente PCT nº WO 02/46387.

Las velocidades de disociación (k1 en el esquema más abajo) se obtuvieron a partir de estudios de velocidad de intercambio, en los que el inhibidor de ensayo, I, o su pareja de intercambio, J, se radiomarcaron, y los datos se ajustaron según el esquema más abajo. Como se señala en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568, las preparaciones de HPPD parecen típicamente contener un 15-30% de una fracción que se intercambia más rápidamente (unión más débil) de sitios de unión al inhibidor. Esta puede ser una forma ligeramente dañada de la enzima (mantiene la actividad catalítica y puede que tenga una Km para el sustrato más elevada) y, excepto cuando las velocidades de disociación son tan elevadas que las fracciones que se intercambian de manera rápida y lenta son indistinguibles, las velocidades de disociación se refieren siempre al comportamiento de la fracción principal que se intercambia de manera más lenta, que representa el 70-85% de la masa de los sitios de unión al inhibidor de HPPD presentes en los extractos ensayados.

E + I

K2 K1 EI

K3

E + J

K4 EJ

Las velocidades de disociación se determinaron preincubando, por ejemplo, 200 pmoles de sitios de unión a HPPD (determinados como se describe anteriormente mediante titulación de los sitios activos en una reacción de 3 min. con la estructura A) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25ºC que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 g/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) que contiene 1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25ºC en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, se inició la reacción de intercambio con adición de 100 l de 1 mM de estructura A “fría” con mezclamiento a conciencia, e, inmediatamente, se extrajeron 150 l y se cargaron en una columna NAP5, la proteína se intercambió en 50 mM de tampón de 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatografía rápida (< 2 min.) a través de una columna NAP5 G25 Sephadex (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a proteína se midió mediante líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Se retiraron alícuotas adicionales y se midieron de la misma manera a diversos tiempos durante minutos u horas según se requiere, a fin de determinar la cinética de intercambio.

En una variante del método útil para distinguir mejor entre velocidades de disociación que fueron relativamente rápidas (por ejemplo, en las que t ½ < 15 min. a 25ºC), la temperatura del experimento se redujo desde 25ºC hasta la temperatura del hielo. En este caso, las velocidades de disociación se determinaron preincubando 200 pmoles de HPPD en tampón de reacción (50 mM de BTP pH 7, 25 mM de ascorbato de Na, 4 g/ml de catalasa bovina, y 10% de glicerol) que contiene 1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25ºC en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, la vasija de reacción se transfirió a hielo. Después de otros 10 minutos a temperatura del hielo, se inició la reacción de intercambio mediante adición de 100 l de 1 mM de Estructura A, con mezclamiento a

imagen29

imagen30

O

imagen31O

O

imagen32O O

imagen33

imagen34

imagen35N

F F

F

Velocidad de disociación k1 (media) = 7,04 E -05 s-1 a 25ºC (Los experimentos individuales dieron k1 = 7,80 E -05,

9,17 E -05, 4,5 E -05, 6 E -05, 7 E -05 y 7,80 E -05 según se estimó mediante el método radioquímico indirecto. Velocidad de asociación k2 7,50 E + 03 s-1 M-1 a 25ºC según se estimó mediante el método radioquímico directo, está muy de acuerdo con los estimados a partir del método a base de actividad enzimática de 7,50 E + 03 s-1 M-1 , 7,80 E + 03 s-1 M-1, 7,60 E + 03 s-1 M-1, 7,20 E + 03 s-1 M-1 y 1,0 E + 04 s-1 M-1 a 25ºC.

Basándose en el método radioquímico, el estimado de Kd = 9,4 E – 09 M. Por lo tanto, el estimado de la relación Kd/ Km es entonces= 0,0017. Estructura D (14C a 1,036GBq/mmol)

SO2Me

imagen36

ON

10 Velocidad de disociación k1 = 3,96 E -05 s-1 a 25ºC según se determina usando el método radioquímico directo

(mediciones individuales de 4,17 E -05 s-1 y 3,75 E -05 s-1).

Velocidad de asociación k2 = 3,20 E + 04 M-1 s-1 a 25ºC según se determina mediante el método radioquímico

directo. Esto está bastante de acuerdo con los estimados procedentes del método a base de actividad para una 15 velocidad de disociación de 3,20 E + 04 M-1 s-1 y 5,7 E + 04 M-1 s-1 .

Basado en los métodos radioquímicos, el estimado de Kd = 1,23 E -9 M.

El estimado de la relación Kd/Km = 0,00023.

Estructura E

imagen37

20 Velocidad de disociación k1 = 4,17 E -05 s-1 a 25ºC según se determina mediante el método radioquímico indirecto (mediciones individuales de 5,50 E -05 s-1 y 2,85 E -05 s-1).

imagen38

imagen39

5

10

15

20

25

30

Los datos de SEC ID NO: 18-21 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a isoleucina (I) en la secuencia de aminoácidos SQIQTY proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más lentos de kon) con relación a, por ejemplo, las Estructuras A y B.

Los datos de SEC ID NO: 22 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos ESGLN proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, las Estructuras B y C.

Los datos de SEC ID NO: 23 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a alanina (A) en la secuencia de aminoácidos EFAEF proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, la Estructura A.

Los datos de SEC ID NOs: 24 y 25 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos G(I,V)LVDRD proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (mediante valores más rápidos de koff y/o valores más lentos de kon) con relación a, por ejemplo, la Estructura A, la Estructura B, la Estructura C y la Estructura D.

Los datos de SEC ID NO: 26 de HPPD indicaron que la combinación de ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos ESGLN con ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos G(I,V)LVDRD proporcionaron mejoras aún más significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD (y sobre y superiores al efecto de cualquiera de los cambios solos) en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, la Estructura B.

Nuevamente, tal como se describió para el Ejemplo 1, se determinaron los valores de kcat y Km para varias HPPD de la invención expresadas en extractos y los valores se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Valores de Km y kcat de varias HPPD

Variante de HPPD

Km µM kcat s-1 kcat/Km µM-1s-1

SEC ID NO: 14

5,38 6,46 1,2

SEC ID NO: 18

35,98 17,94 0,50

SEC ID NO: 21

5,98 5,47 0,91

SEC ID NO: 22

12,43 5,79 0,46

SEC ID NO: 24

4,74 4,35 0,92

SEC ID NO: 26

10,58 4,05 0,38

Varias de las variantes de HPPD tuvieron valores de Km bajos similares a SEC ID NO: 14 de HPPD y valores superiores de Ki/Km con relación a los diversos herbicidas de HPPD y, por lo tanto, la sobreexpresión en plantas se espera que proporcione una mayor tolerancia a herbicidas respecto a estos herbicidas. Por ejemplo, SEC ID NO: 24 de HPPD fue dos veces más resistente a mesotriona que SEC ID NO: 14 de HPPD ya que mostró una relación de Ki/Km de 0,0047 en comparación con 0,0021.

Además, todas las secuencias anteriores, así como también las colecciones de variantes mutadas en las mismas posiciones de amino que mostraron niveles alterados y mejorados de tolerancia a herbicidas son útiles para ser incluidas en procesos de mutagénesis y barajado con el fin de generar aún más HPPD mutadas y barajadas útiles como transgenes para conferir tolerancia a herbicidas. Por ejemplo, los mutantes divulgados en la Tabla 5 son útiles para generar un polipéptido mutante de HPPD tolerante a herbicidas y para su inclusión en reacciones de recombinación para generar más HPPD.

Tabla 5. Ejemplos de mutaciones útiles en polipéptidos de HPPD tolerantes a herbicidas

Mutación

Región de aminoácidos de SEC ID NO:14

K411L

GGFGKGNFS

K411T

GGFGKGNFS

K411S

GGFGKGNFS

K411M

GGFGKGNFS

K411A

GGFGKGNFS

K411E

GGFGKGNFS

K411V

GGFGKGNFS

M325L

GFEFMAPPQ

L271I

VLLPLNEPV

Mutación

Región de aminoácidos de SEC ID NO:14

L271M

VLLPLNEPV

L271V

VLLPLNEPV

G408A

GGCGGFGKG

G408S

GGCGGFGKG

G408T

GGCGGFGKG

V258M

GLNSVVLAN

V258I

GLNSVVLAN

V258A

GLNSVVLAN

V258K

GLNSVVLAN

V217I

RFDHVVGNV

V217A

RFDHVVGNV

V217M

RFDHVVGNV

V217C

RFDHVVGNV

L271I

VLLPLNEPV

L271M

VLLPLNEPV

L271V

VLLPLNEPV

A326S

FEFMAPPQA

A326K

FEFMAPPQA

A326P

FEFMAPPQA

A326D

FEFMAPPQA

A326R

FEFMAPPQA

A326N

FEFMAPPQA

A326Y

FEFMAPPQA

A326H

FEFMAPPQA

I370V

VLLQIFTKP

Y287F

QIQTYLEYH

G254S

TTESGLNSV

G254A

TTESGLNSV

E416Q

GNFSELFKS

I339L

GVRRIAGDV

L269M

EAVLLPLNE

L269F

EAVLLPLNE

S420A

ELFKSIEDY

I372S

LQIFTKPVG

Y172V

EVELYGDVV

I299M

GVQHIALAS

Como otro ejemplo, los mutantes divulgados en la Tabla 6 también son útiles para generar un polipéptido mutante de HPPD tolerante a herbicidas y para su inclusión en reacciones de recombinación para generar más HPPD.

Tabla 6. Ejemplos de mutaciones útiles en polipéptidos de HPPD tolerantes a herbicidas

Mutación

Región de aminoácidos de SEC ID NO:14

K411L

GGFGKGNFS

K411T

GGFGKGNFS

K411S

GGFGKGNFS

K411M

GGFGKGNFS

K411A

GGFGKGNFS

K411E

GGFGKGNFS

K411V

GGFGKGNFS

M325L

GFEFMAPPQ

L271I

VLLPLNEPV

L271M

VLLPLNEPV

L271V

VLLPLNEPV

G408A

GGCGGFGKG

G408S

GGCGGFGKG

G408T

GGCGGFGKG

V258M

GLNSVVLAN

V258I

GLNSVVLAN

V258A

GLNSVVLAN

V258K

GLNSVVLAN

V217I

RFDHVVGNV

V217A

RFDHVVGNV

V217M

RFDHVVGNV

V217C

RFDHVVGNV

L271I

VLLPLNEPV

L271M

VLLPLNEPV

L271V

VLLPLNEPV

A326S

FEFMAPPQA

A326K

FEFMAPPQA

A326P

FEFMAPPQA

A326D

FEFMAPPQA

A326R

FEFMAPPQA

A326N

FEFMAPPQA

A326Y

FEFMAPPQA

A326H

FEFMAPPQA

I370V

VLLQIFTKP

Y287F

QIQTYLEYH

G254S

TTESGLNSV

G254A

TTESGLNSV

E416Q

GNFSELFKS

I339L

GVRRIAGDV

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

Claims (1)

1. imagen1