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CN111500728A - 检测人ar-v7及ar基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

检测人ar-v7及ar基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN111500728A
CN111500728A CN202010400250.XA CN202010400250A CN111500728A CN 111500728 A CN111500728 A CN 111500728A CN 202010400250 A CN202010400250 A CN 202010400250A CN 111500728 A CN111500728 A CN 111500728A
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于垚垚
姚鲁帅
李涛
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Wuxi Shenrui Bio Pharmaceuticals Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种检测人AR‑V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法；该引物探针组合物包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的AR‑V7正向引物、如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的AR‑V7反向引物、如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的AR‑V7探针、如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的AR正向引物、如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的AR反向引物、如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的AR探针及内参引物探针。在本发明中，利用特异性的引物及探针分别扩增血液细胞RNA中的AR全长及AR‑V7剪接体分子，具有快速、高灵敏度、操作简便及降低中间过程样本污染及操作失误风险低等优点。

Description

检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
前列腺癌是欧美男性常见的恶性肿瘤之一，美国的前列腺癌的发病率占第一位，死亡率仅次于肺癌。在我国虽然前列腺癌的发病率低于欧美，但近年有增长趋势，据统计，2013年我国前列腺癌发病率为8.58/10万，是男性第六高发癌种，2018年前列腺癌的发病率是13.6/10万，相比2013年明显升高。前列腺癌属于雄激素依赖性肿瘤，因此目前治疗前列腺癌的主要手段是雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation thetapy，ADT)。然而经过中位数18-24 个月的治疗后，几乎所有的患者都不可逆的进展到激素抵抗阶段，即去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)。
目前阿比特龙(雄激素生物合成抑制剂)和恩杂鲁胺(AR易位和信号转导的抑制剂)对于CRPC患者具有较好的治疗效果，但有20％-40％患者经阿比特龙和恩杂鲁胺治疗后，PSA仍维持在较高水平，没有明显疗效，且多数经阿比特龙和恩杂鲁胺治疗的患者后期几乎都会发生获得性耐药。研究表明，雄激素受体剪切变异体7(AR-V7)阳性与阿比特龙/恩杂鲁胺PSA响应率及存活率呈明显的负相关。在AR-V7阳性患者中，紫杉醇烷化疗比阿比特龙和恩杂鲁胺治疗效果更为有效，而在AR-V7阴性患者中，则阿比特龙和恩杂鲁胺治疗效果更优。因此，对于AR-V7进行检测，对于医生制定CRPC 患者合理有效的治疗方案以及监控内分泌疗法(阿比特龙和恩杂鲁胺)的耐药性具有重要意义。
目前，常用AR-V7检测技术是循环肿瘤细胞(CTCs)法及外泌体法。采用CTC样本进行AR-V7检测目前还存在许多问题：(1)样本要求高，样本必须在收集数小时内进行CTC分离；(2)操作繁琐，技术要求高，实验室需配备CTC分离平台，在进行RNA提取前要先完成CTC分离，这在临床实验室难以开展；(3)检测灵敏度差，由于肿瘤的异质性，导致CTC分离只能获取部分肿瘤细胞，从而不能够全面的反应患者的疾病状态。外泌体法也需要非常专业的离心设备及非常专业的离心分离程序，这在临床实验室难以开展。同时，外泌体样品的代表性问题，外泌体分离的质量控制等问题在国际上也远远没有统一。因此，迫切需要一种样本要求低、操作简便、经济且灵敏度高的AR-V7检测方法。
发明内容
本发明的目的在于揭示一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，用以实现对人血的血液细胞RNA中的AR-V7及 AR剪接体分子进行特异性检测，并降低检测难度，提高检测灵敏度与检测结果的可靠性。
为实现上述第一个发明目的，本发明提供了一种检测人AR-V7及AR 基因表达的引物探针组合，包括：
AR-V7正向引物，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
AR-V7反向引物，具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
AR-V7探针，具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
AR正向引物，具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
AR反向引物，具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
AR探针，具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
GAPDH正向引物，具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
GAPDH反向引物，具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
GAPDH探针，具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
基于相同发明思想，本发明还揭示了一种检测人AR-V7及AR基因表达的试剂盒，包括：如前述发明创造所揭示的引物探针组合物，DNA聚合酶， dNTPs，反应缓冲液，含有阳性质控品的阳性对照组，含有阴性质控品的阴性对照组。
作为本发明的进一步改进，所述试剂盒使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品检测人AR-V7及AR。
作为本发明的进一步改进，所述检测样品为人外周全血或者使用人外周全血离心获得的血细胞。
作为本发明的进一步改进，
所述阳性质控品为AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA或者从已知 AR-V7阳性的人细胞株提取的RNA；
所述阴性质控品为不包含AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA、从已知 AR-V7阴性的人细胞株提取的RNA、缓冲液或者RNase-Free ddH2O。
作为本发明的进一步改进，所述AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的3’端标均记有荧光淬灭基团，所述AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的5’端均标记有荧光报告基团。
作为本发明的进一步改进，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、 BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA 中的任意一种。
最后，本发明还揭示了一种对人AR-V7及AR基因表达的检测方法，使用如前述任一项发明创造所揭示的检测人AR-V7及AR基因表达的试剂盒，使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品进行检测。
作为本发明的进一步改进，所述qRT-PCR或dPCR在执行扩增程序中加入UNG酶的预反应步骤。
作为本发明的进一步改进，所述检测方法还包括样品预扩增步骤，所述样品预扩增步骤与加入UNG酶的预反应步骤同步进行或分别进行。
作为本发明的进一步改进，所述AR-V7正向引物、AR-V7反向引物、 AR-V7探针的检测目标区域相同或基本相同；AR正向引物、AR反向引物、 AR探针、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物及GAPDH探针的检测目标区域相同或部分相同或完全不同。
作为本发明的进一步改进，检测方法获得的检测结果用于临床肿瘤的辅助诊断或用药指导。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
在本发明中，利用特异性的引物及探针分别扩增血液细胞RNA中的AR 全长及AR-V7剪接体分子，计算AR-V7占比，本发明具有样本易获取、运输储存方便、保存时间长的特点，检测方法及试剂盒具有无创、快速、高灵敏度、操作简便、实验周期短及降低中间过程样本污染及操作失误风险低等诸多优点，不仅能够对晚期前列腺癌患者提供用药指导意见，还能够对耐药情况进行反复监控。
同时，由于部分前列腺癌AR低表达或不表达，没有内参基因就无法区分AR信号低或缺失是样品量的问题还是肿瘤细胞AR表达量的问题，前者需要重新送样检测，后者则是由于生物学本身的问题，重新送样AR信号依然低或缺失。
同时，本检测试剂盒及检测方法是基于外周血细胞中存在的CTC，当样品中没有收集到CTC或数量极低时，AR-V7及或AR的扩增信号也可能极低或缺失。内参基因扩增正常可以排除样本量不足及样品中CTC极少或缺失的问题，从而确保在这些客观情况下依然能得到客观的检测结果。通过本发明，克服了CTC及外泌体分离的技术平台的不普及性及技术难度，直接采用外周血血细胞的RNA作为反应模板，直接采用qRT-PCR或dPCR进行扩增，在临床实验室简单易行。
最后，在本申请中同时引入内参引物探针，确保在检测样品AR低表达或不表达以及及检测样品中CTC极少或缺失的情况下依然能得到客观的检测结果。
附图说明
图1为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测中阳性质控品的扩增曲线；
图2为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测中阴性质控品的扩增曲线；
图3为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测临床样本中 AR-V7及AR的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
申请人首先对本申请中所涉及的主要技术术语予以解释。qRT-PCR(逆转录定量PCR)，是一种应用广泛的研究基因表达模式的方法，尤其是在样品量少或者非常珍贵的时候。qRT-PCR主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等。dPCR(数字PCR)，其检测结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值 (Ct)，不受扩增效率的影响，具有很好的准确度和重现性，并且可以实现绝对定量分析。数字PCR能够直接读出DNA分子的个数，是对起始样品核酸分子的绝对定量。
实施例一：
首先，本申请公开了一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物，包括：
AR-V7正向引物，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
AR-V7反向引物，具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
AR-V7探针，具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
AR正向引物，具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
AR反向引物，具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
AR探针，具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
GAPDH正向引物，具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
GAPDH反向引物，具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
GAPDH探针，具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
其中，AR-V7探针，AR探针，GAPDH探针的3’端标均记有荧光淬灭基团，所述AR-V7探针，AR探针，GAPDH探针的5’端均标记有荧光报告基团。具体的，该荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、 BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、 TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。在本实施例中，通过引入GAPDH正向引物、GAPDH反向引物及GAPDH探针作为内参引物探针，解决了由于部分前列腺癌样品中AR低表达或不表达的技术问题。
在本实施例中，基于AR-V7正向引物、AR-V7反向引物、AR-FL正向引物、AR-FL反向引物、AR-V7探针及AR-FL探针，具有引物扩增效率高、扩增序列长度较短，可以避免由于RNA碎片化导致的长片段不易扩增的问题，可避免使用CTC分离平台，具有样本易获取、运输储存方便、保存时间长的特点，并能够对人血液细胞RNA中的AR全长及AR-V7剪接体分子进行精确且特异性检测，其检测结果对临床肿瘤的辅助诊断或者用药指导具有准确的临床参考价值。本实施例所指临床肿瘤至少包括前列腺癌。
实施例二：
基于实施例一所揭示的一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物，本实施例还揭示了一种检测人AR-V7及AR基因表达的试剂盒，该试剂盒包括：如实施例一所揭示的引物探针组合物，DNA聚合酶，dNTPs，反应缓冲液，含有阳性质控品的阳性对照组，含有阴性质控品的阴性对照组。
试剂盒使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品检测人AR-V7及AR。
检测样品为人外周全血或者使用人外周全血离心获得的血细胞。
阳性质控品为AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA或者从已知AR-V7 阳性的人细胞株提取的RNA；所述阴性质控品为不包含AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA、从已知AR-V7阴性的人细胞株提取的RNA、缓冲液或者 RNase-Free ddH2O。
AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的3’端标均记有荧光淬灭基团，所述AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的5’端均标记有荧光报告基团。具体的，在本实施例中，该荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、 BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；该荧光报告基团选自FAM、 HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。在本实施例中，AR-V7正向引物及AR-V7反向引物按比例混合，AR-FL 正向引物与AR-FL反向引物按比例混合，GAPDH正向引物及GAPDH反向引物按比例混合。
实施例三：
基于实施例一及实施例二所揭示的技术方案，本实施例还揭示了一种对人AR-V7及AR基因表达的检测方法，使用如实施例二所述的检测人AR-V7 及AR基因表达的试剂盒，使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品进行检测；且所述qRT-PCR或者dPCR在执行扩增程序中加入UNG酶的预反应步骤。在本实施例中，加入UNG酶的预反应步骤的作用是为了防止PCR产物污染反应体系。同时，在本实施例中，检测方法还包括样品预扩增步骤，所述样品预扩增步骤与加入UNG酶的预反应步骤(即，位于同一反应管)或分别进行(即，位于两个不同的反应管)，且彼此效果均相似。
本实施例所揭示的检测方法所使用的试剂盒中的引物及探针的检测目标区域相同或者基本相同(序列重叠70％以上即可)，引物和/或探针的核苷酸序列可部分或者全部变换。下文对该检测方法予以详细阐述。
保存于PAXgene Blood RNA Tube(BD，762165)待检全血样本(共8 例样本)、PAXgene Blood RNA Kit(BD，762174)、阳性质控品、阴性质控品。阳性质控品为AR-V7和AR-FL等比例混合，浓度为1ng/μL假病毒RNA，阴性质控品为AR-V7阴性细胞系PC3的50ng/μL的RNA。
首先，全血样本的采集：按照PAXgene Blood RNA Tube(BD，762165) 血液样本采集要求进行人血液样本采集。按照PAXgene Blood RNA Kit(BD， 762174)全血样本RNA提取Protocol进行样本RNA提取，最终30μL洗脱液进行洗脱。
按试剂盒说明进行样本RNA提取，最终30μL洗脱液进行洗脱。反应体系主要成分是
Figure BDA0002489126280000081
II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(诺唯赞， Q222-CN)，样品预扩增步骤所涉及的反转录及预扩增体系如下表一所示：
试剂 使用量(μl)
2×One Step U+Mix 15.0
One Step U+Enzyme Mix 1.5
AR-V7正向引物 0.5
AR-V7反向引物 0.5
AR-FL正向引物 0.5
AR-FL反向引物 0.5
GAPDH正向引物 0.5
GAPDH反向引物 0.5
Total 19.5
表一
分装预混液及上机预扩增步骤：取PCR管，分别向每孔中加入19.5ul 预混液和10.5ul RNA模板(样本孔位置做好记录)，振荡混匀瞬离。将样品管放入普通PCR仪中，运行以下表二所示出的样品预扩增程序。
Figure BDA0002489126280000082
Figure BDA0002489126280000091
表二
根据待测样品的数量(n)，按照下表配制qPCR预混液MIX(n+5)(其中阴性质控品、阳性质控品*2、RNase-Free ddH2O)，振荡混匀，瞬离备用。 qPCR反应预混液体系参如下表三及表四所示。
AR/AR-V7反应管执行qPCR扩增程序中的反应预混液体系如下表三所示：
试剂 使用量(μl)
10×PCR Buffer(反应缓冲液) 2.0
dNTPs(10mM) 1.0
Mgcl<sub>2</sub>(50mM) 1.6
Taq polymerase(10U/ul) 0.2
AR-V7正向引物 0.4
AR-V7反向引物 0.4
AR-V7探针 0.4
AR-FL正向引物 0.4
AR-FL反向引物 0.4
AR-FL探针 0.3
ddH<sub>2</sub>O 8.9
预扩增产物 4.0
Total 20.0
表三
内参管(包含GAPDH正向引物、GAPDH反向引物及GAPDH探针) 执行qPCR扩增程序中的反应预混液体系如下表四所示：
试剂 使用量(μl)
10×Buffer(反应缓冲液) 2.0
dNTPs(10mM) 1.0
Mgcl<sub>2</sub>(50mM) 1.6
Taq polymerase(10U/ul) 0.2
GAPDH正向引物 0.4
GAPDH反向引物 0.4
GAPDH探针 0.4
ddH<sub>2</sub>O 10
预扩增产物 4.0
Total 20.0
表四
表三及表四中的预扩增产物为预混液和RNA模板在前述预扩增程序所得到的产物。
分装预混液：取一个96孔板，分别向每孔中加入16ul预混液和4ul模板(样本孔位置做好记录)，封好管盖，振荡混匀瞬离。
设置qPCR扩增仪(型号ABI 7500)实时荧光定量PCR仪参数：95℃5min， (95℃10s，60℃45s)45cycles，体系为20ul，AR-V7+AR-FL位点FAM通道和VIC通道，GAPDH位点VIC通道，将样品放入PCR扩增仪中，选择好样品所摆放的位置，保存至指定的文件夹，即可开始运行程序进行PCR 扩增反应。qPCR运行参数详见下表五所示。
Figure BDA0002489126280000101
Figure BDA0002489126280000111
表五
利用上述反应体系对8对样本进行检测，能够准确检出2例阳性样本， 6例阴性样本)，具体的判读如下解释：
阴性质控品的中的AR-FL有明显的扩增曲线，且符合下表给出的参数范围；阳性质控品AR-V7和AR-FL均有明显的扩增曲线，且符合下表给出的参数范围。满足上述所有条件，证明本次实验有效。
检测结果对扩增血液RNA中的AR-V7和AR-FL这两种剪接体分子进行准确且高效的特异性检测，且qRT-PCR反应程序的扩增曲线中是否被判定为AR-V7和AR-FL的检测判定标准如下表六所示。
检测结果 AR-V7的Ct AR-FL的Ct
有效的阳性对照组 Ct≤38 Ct≤34
有效的阴性对照组 Ct无判读(无扩增曲线) Ct≤34
表六：检测判定标准
图1为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测中阳性质控品的扩增曲线；参图1所示，AR-V7的扩增曲线的Ct约为27.5(即Ct≤38)，AR-FL 的Ct约为26.5(即Ct≤34)，符合对应的判读标准，说明整个检测过程是正确，结果是可信的。
图2为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测中阴性质控品的扩增曲线；参图2所示，AR-FL的扩增曲线的Ct约为14.8(即Ct≤34)，且 AR-V7无典型性扩增曲线或无Ct值，说明该检测方法使用实施例二所揭示的试剂盒能够对AR-FL进行有效地特异性检测。
图3为使用本发明所揭示的检测方法使用qRT-PCR检测临床样本中 AR-V7及AR的扩增曲线；参图3所示，AR-FL的扩增曲线的Ct约为14.8 (即Ct≤34)，且AR-V7的扩增曲线的Ct约为22.2(即Ct≤38)，说明AR-FL 及AR-V7均有明显的扩增曲线，提示AR-V7检测阳性。
本实施例与实施例一和/或实施例二中相同的技术方案，参上文所述，在此不再赘述。
综上所述，本发明所揭示的引物探针组合物、试剂盒以及基于该试剂盒的检测方法，实现了对人外周全血或者使用人外周全血离心获得的血细胞执行AR-V7及AR全长检测。试验结果表明，本发明中的引物探针组合物具有良好的特异性，完全不存在非特异性扩增，且能够良好地适应临床样本的快速、高效检测。在本发明中，利用特异性的引物及探针分别扩增血液细胞 RNA中的AR全长及AR-V7剪接体分子，具有快速、高灵敏度、操作简便以及降低中间过程样本污染及操作失误风险低等诸多优点。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 无锡市申瑞生物制品有限公司
<120> 检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtccatct tgtcgtcttc g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caattgccaa cccggaattt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctcccagag tcatcctgct tcata 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcccacat cctgctcaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtgaactga tgcagctctc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actccgtgca gcctattgcg a 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgatgcttt tcctagatta ttctctgatt 30
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcagccttg acggtgc 17
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagggctgct tttaactctg gtaaagtgg 29

Claims (12)

1.一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合，其特征在于，包括：
AR-V7正向引物，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
AR-V7反向引物，具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
AR-V7探针，具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
AR正向引物，具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
AR反向引物，具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
AR探针，具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
GAPDH正向引物，具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
GAPDH反向引物，具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
GAPDH探针，具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
2.一种检测人AR-V7及AR基因表达的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的引物探针组合物，DNA聚合酶，dNTPs，反应缓冲液，含有阳性质控品的阳性对照组，含有阴性质控品的阴性对照组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品检测人AR-V7及AR。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测样品为人外周全血或者使用人外周全血离心获得的血细胞。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述阳性质控品为AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA或者从已知AR-V7阳性的人细胞株提取的RNA；
所述阴性质控品为不包含AR-V7目标扩增区域的假病毒RNA、从已知AR-V7阴性的人细胞株提取的RNA、缓冲液或者RNase-Free ddH2O。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的3’端标均记有荧光淬灭基团，所述AR-V7探针、AR探针及GAPDH探针的5’端均标记有荧光报告基团。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。
8.一种对人AR-V7及AR基因表达的检测方法，其特征在于，使用如权利要求2至7中任一项所述的检测人AR-V7及AR基因表达的试剂盒，使用qRT-PCR或者dPCR对检测样品进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述qRT-PCR或dPCR在执行扩增程序中加入UNG酶的预反应步骤。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括样品预扩增步骤，所述样品预扩增步骤与加入UNG酶的预反应步骤同步进行或分别进行。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述AR-V7正向引物、AR-V7反向引物、AR-V7探针的检测目标区域相同或基本相同；AR正向引物、AR反向引物、AR探针、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物及GAPDH探针的检测目标区域相同或部分相同或完全不同。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的检测方法，其特征在于，检测方法获得的检测结果用于临床肿瘤的辅助诊断或用药指导。
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