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KR20170032406A - 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포 - Google Patents

입양 세포 치료를 위한 조작된 세포 Download PDF

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Publication number
KR20170032406A
KR20170032406A KR1020177004249A KR20177004249A KR20170032406A KR 20170032406 A KR20170032406 A KR 20170032406A KR 1020177004249 A KR1020177004249 A KR 1020177004249A KR 20177004249 A KR20177004249 A KR 20177004249A KR 20170032406 A KR20170032406 A KR 20170032406A
Authority
KR
South Korea
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antigen
cell
cells
receptor
engineered
Prior art date
Application number
KR1020177004249A
Other languages
English (en)
Inventor
켄달 엠. 몰러
하이엄 아이. 레비츠키
Original Assignee
주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 filed Critical 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
Publication of KR20170032406A publication Critical patent/KR20170032406A/ko

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Abstract

NK 세포 및 T 세포를 비롯하여 입양 치료를 위한 조작된 세포가 제공된다. 또한, 조작을 위한 조성물 및 세포, 세포를 함유하는 조성물의 생산, 및 이들의 대상자로의 투여 방법도 제공된다. 몇몇 측면에서, 세포의 특성 및 방법은 특이성 및/또는 효능을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 항원, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CARs) 및 공동자극 수용체에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 복수개의 항원을 표적화하는 수용체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 예컨대 유전자 산물을 인코딩하는 유전자의 파괴에 의한, 하나 이상의 유전자 산물의 진압을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 조작된 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 인코딩하는 유전자가 파괴되어, 조적된 세포의 표적화 가능성이 감소된다.

Description

입양 세포 치료를 위한 조작된 세포{ENGINEERED CELLS FOR ADOPTIVE CELL THERAPY}
관련 출원의 상호-참조
[0001] 이 출원은 2014년 7월 15일 출원된 미국 가특허출원 No. 62/025,006에 기초한 우선권 주장 출원으로서 상기 가출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조되었다.
[0002] 본 발명은 전자 파일 형태의 서열목록과 함께 출원되었다. 서열목록은 2015년 7월 15일, 43 킬로바이트 크기의 파일로 생성되었으며, 파일명은 735042000540seqlist.txt이다. 서열목록의 전자 파일의 정보는 본 발명에 그 내용 전체가 참조 통합되었다.
기술분야
[0003] 몇몇 측면에서 본 출원은 NK 세포 및 T 세포를 비롯한, 입양 치료용의 조작된 세포(engineered cells for adoptive therapy)에 관한 것이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 이러한 세포를 조작 및 생산하기 위한 방법 및 조성물, 이러한 세포를 함유하는 조성물, 및 대상자에게 이들을 투여하는 방법에 관한 것이기도 하다. 몇몇 측면에서, 이들 세포 및 방법의 성질은 특이성 및/또는 효능을 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 이들 세포는 항원, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CARs) 및 공동자극 수용체에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 이들 세포는 복수개의 항원을 표적화하는 수용체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이들 세포들은 예컨대 유전자 산물을 인코딩하는 유전자의 파괴(disruption)에 의한, 하나 이상의 유전자 산물의 억제를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 조작된 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 인코딩하는 유전자가 파괴되어, 상기 조작된 세포의 표적화 가능성이 감소된다.
배경기술
[0004] 입양 치료용의 조작된 세포들을 생산 및 투여하기 위한 전략이 다양하게 존재한다. 예컨대, 예컨대 CAR과 같은 유전자 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역세포의 조작, 및 세포내에서 유전자 발현의 억제 또는 억압을 위한 전략을 이용할 수 있다. 이러한 세포를 이용하여 치료될 수 있는 광범위한 표적 항원 및 질환을 제공하기 위해, 예컨대 오프-표적 효과를 회피하기 위해 세포의 특이성이나 선택성을 향상시키기 위해, 그리고 예컨대 이펙터 기능의 억압을 회피하고 대상자에게 투여시 세포의 활성 및/또는 생존능을 향상시킴으로써 세포 효능을 증진하기 위해, 개선된 전략이 요구되고 있다. 본 발명에 따라 이러한 요구를 만족하는 방법, 세포, 조성물, 키트 및 시스템이 제공된다.
발명의 개요
[0005] 본 발명에 따라 조작된 세포, 예컨대 조작된 면역 또는 면역자극 세포를 비롯한 세포, 그리고 이러한 세포를 생산 및 이용하는 방법, 예컨대 입양 치료 및 예컨대 상기 세포를 함유하는 의약 조성물과 같은 조성물이 제공된다. 이러한 세포로는 예컨대 이중-항원 표적화 특징 및/또는 단독으로나 집합적으로 향상된 안전성, 특이성, 선택성 및/또는 효능을 제공하고, 및/또는 입양 세포 치료에 의한 질병 또는 항원의 보다 광범위한 표적화를 가능케 하는 한 가지 이상의 특징을 갖는 세포를 들 수 있다.
[0006] 몇몇 구체예에서, 세포들은 조작된 면역 세포로서, 상기 세포는: 표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체; 및 조작된 면역 세포내에서 표적 항원의 발현을 감소시키는 결과를 초래하는, 표적 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것이다. 몇몇 측면에서, 표적 항원은 휴지 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 양자 모두의 표면에서 발현된다. 몇몇 측면에서, 표적 항원은 예컨대 혈액암, 면역암, 백혈병, 림프종, 및/또는 골수종, 예컨대 다발골수종과 같은 암에서 세포 표면에서 발현된다.
[0007] 몇몇 측면에서, 예컨대 항원 수용체가 시그널 활성화를 유도하거나 또는 표적 항원을 발현하는 세포에 지향된 면역 반응을 일으키는 것을 유도할 경우, 그 표적 항원은 이를 테면 암과 같이, 치료하고자 하는 질병이나 병태에서 발현되는 것이지만, 또한 입양 세포 치료용으로 조작되거나 또는 적합화된 세포 상에서 정상적으로 발현되는 것이기도 하다. 몇몇 측면에서, 그 표적 항원은 범종양 항원이고, 몇몇 측면에서 조작된 세포상 또는 세포내에서 자연적으로 발현되는 항원 및/또는 활성화된 T 세포 상 또는 내에서 그의 발현이 상향조절되는 항원이다. 몇몇 측면에서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)이다. 예컨대, 표적 항원은은 hTERT 또는 서바이빈이다. 몇몇 측면에서, 표적 항원은 CD38이다. 다른 측면에서, 표적 항원은 CD33 또는 TIM-3이다. 다른 측면에서, 이것은 CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 또는 CD362이다.
[0008] 몇몇 측면에서, 예컨대 수용체가 억압 또는 억제, 예컨대, 면역억압, 시그널을 유도하는 경우, 항원은 질병이나 병태에서 발현되는 것이 아니다. 몇몇 측면에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 표적 항원 인식시 세포에 대해 억제 또는 면역억압 또는 진압 (repression) 시그널을 유도할 수 있다. 몇몇 측면에서, 항원은 암세포나 감염된 세포 표면에서 발현되지 않는 항원이거나 또는 암세포나 감염된 세포상에서 그 발현이 하향조절되는 항원이다. 이러한 항원의 예로는 MHC-클래스 I 분자를 들 수 있다..
[0009] 몇몇 구체예에서, 항원은 조작된 세포의 세포 유형에서 자연적으로 발현되는 유전자 산물이다. 몇몇 구체예에서, 조작된 면역 세포 내에서의 표적 항원의 발현은 상기 유전자 파괴 부재시의 면역 세포 발현에 비해 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95 % 감소된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 파괴는 그 유전자의 적어도 1개의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함하고; 그 유전자 내 조숙 종결 코돈의 존재를 초래하는 유전자 내 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함하며; 및/또는 그 유전자의 제1 또는 제2 엑손에서의 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함한다.
[0010] 이러한 세포 종류는 T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 줄기 세포, 예컨대 유도된 다능성 줄기세포 (iPS cell)이다.
[0011] 몇몇 구체예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 세포에 대한 활성화 시그널을 유도할 수 있다. 몇몇 측면에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 모티프를 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체이다. 몇몇 측면에서, 이것은 키메라 항원 수용체 (CAR), 예컨대 활성화 또는 자극 CAR, 억제 CAR 및/또는 공동자극 CAR이다. CAR로는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 시그널링 도메인, 예컨대 공동자극 시그널링 영역, 예컨대 CD28 또는 41BB의 시그널링 도메인을 추가로 포함하는 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 도메인을 갖는 것들을 들 수 있다. 몇몇 측면에서, CAR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 예컨대 PD-1 또는 CTLA4와 같이, 면역 체크포인트 분자의 시그널링 부분을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한다.
[0012] 몇몇 측면에서, 세포는 다른 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 공동자극 수용체, 예컨대 다른 항원과 특이적으로 결합하여 그 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는, 키메라 공동자극 수용체를 포함한다. 몇몇 측면에서, 이러한 또 다른 표적 항원과 제1 수용체에 의해 인식되는 제1 표적 항원은 구별된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 항원들 중 적어도 하나는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)으로부터 선택되고, 또 다른 것은 종양 또는 암에서 발현되는 다른 항원이며 몇몇 경우에는 특정 유형의 종양이나 암에서 발현되지만 하나 이상의 특정한 다른 유형의 암에서는 발현되지 않는다. 몇몇 측면에서, 이러한 다른 항원은 다발골수종-관련 또는 다발골수종-특이 항원, 예컨대 CD38 또는 CD138 또는 BCMA 또는 CS-1이다; 몇몇 측면에서, 이러한 다른 항원은1종 이상의 혈액암 또는 1종 이상의 고형 종양유형에서 발현된다. 몇몇 측면에서 표적 항원과 상기한 또 다른 항원은 서로 구별되고, CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 이러한 몇몇 측면에서, 세포는 치료하고자 하는 질병 또는 병태에서 발현되는 항원을 인식하여 제1의 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 약화된, 자극 또는 활성화 시그널을 유도하는 부가적인 유전자 조작된 항원 수용체를 추가로 포함한다.
[0013] 또한 상기 세포의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 세포도 제공된다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 (a) 면역 세포에 표적 항원과 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 도입하고; 및 (b) 면역 세포 내에서 표적 항원의 발현을 진압함으로써, 표적 항원의 발현이 진압된 유전자 조작된 면역 세포를 생산함으로써 수행된다. 몇몇 측면에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행되거나 또는 순서 불문하고 순차적으로 수행된다.
[0014] 몇몇 구체예에서, 단계 (b)의 진압은 표적 항원을 인코딩하는 유전자를 파괴하는 것을 포함하며, 이러한 파괴는 DNA 수준에서 유전자를 파괴하는 것으로 포함하고, 및/또는 파괴는 가역적이 아니고; 및/또는 파괴는 일시적이 아니다. 몇몇 측면에서, 파괴는 면역 세포에 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 도입하는 것을 포함한다.
[0015] 몇몇 구체예에서, 파괴는: (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클리아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드된 뉴클리아제를 도입하는 것을 포함한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 단백질 또는 RNA-가이드된 뉴클리아제는 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 그 유전자에 특이적인 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR: 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산) 을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 파괴는 그 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 및 CRISPR-Cas9 조합을 도입하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 도입은 세포에 DNA-결합 단백질, DNA-결합 뉴클레오타이드, 및/또는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 도입함으로써 수행된다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 바이러스 벡터이다.
[0016] 몇몇 구체예에서, 유전자에 대한 특이적 결합은 유전자의 엑손 내 및/또는 표적 항원의 N-말단을 인코딩하는 유전자의 일부 내에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 도입에 의해, 유전자 내 프레임쉬프트 돌연변이 및/또는 유전자의 코딩 영역 내 조기 종결코돈의 삽입이 일어난다.
[0017] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 또 다른 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 도입하는 단계 (c)를 더 포함하며, 여기서 단계 (a), (b) 및 (c)는 동시에 수행되거나 또는 순서 무관하게 순차적으로 수행된다. 이러한 방법에 의해 생산되는 세포도 제공된다.
[0018] 몇몇 구체예에서, 조작된 세포는: (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 활성화 시그널을 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 공동자극 수용체 예컨대 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체(예컨대 제1 수용체가 그의 항원에 결합된 후 특정한 이펙터 기능 또는 세포의 완전한 활성화에 필요한 것)를 포함한다. 이러한 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2의 항원은 서로 다르고, 적어도 한 가지는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 및 사이클린 (D1)으로부터 선택된다. 또 다른 제1 제2 항원은 hTERT, 서바이빈, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1) 중 어느 하나와는 다른 항원일 수 있고, 또는 또 다른 종양 항원일 수 있다.
[0019] 몇몇 구체예에서, 조작된 세포는: (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 활성화 시그널을 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 공동자극 수용체 예컨대 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체(예컨대 제1 수용체가 그의 항원에 결합된 후 특정한 이펙터 기능 또는 세포의 완전한 활성화에 필요한 것)를 포함한다. 이러한 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 서로 구별되고 CD38, CS-1, 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
[0020] 몇몇 구체예에서, 조작된 세포는 comprises (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 활성화 시그널을 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 포함하되, 여기서 상기 제1 및 제2 항원은 서로 구별되는 것이고 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
[0021] 몇몇 구체예에서, 조작된 면역 세포는 comprises (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 활성화 시그널을 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 포함하되, 여기서 상기 제1 및 제2 항원은 서로 구별되는 것이고, 여기서 상기 제1 및 제2 항원은 서로 구별되는 것이고 제1 또는 제2 항원은 CS-1이다.
[0022] 몇몇 구체예에서, 제2 항원은 다발골수종에서 발현되는 항원이다.
[0023] 몇몇 구체예에서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 서열을 포함하고, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 시그널링 도메인을 포함하고, 및/또는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자로부터의 시그널링 도메인, 예컨대 T 세포 공동자극 분자의 세포내 시그널링 도메인을 포함하지 않으며, 이러한 하나 이상의 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0024] 몇몇 측면에서, (a) 제1 항원은 CD38이고 제2 항원은CD138이다; (b)) 제1 항원은 CD38이고 제2 항원은 CS-1이다; (c) 제1 항원은 CD138이고 제2 항원은 CD38이다; (d) 제1 항원은 CD138이고 제2 항원은 CS-1이다; (e) 제1 항원은 CS-1이고 제2 항원은 CD38이거나; 또는 (f) 제1 항원은 CS-1이고 제2 항원은 CD138이다. 몇몇 경우, 세포는 제3 항원을 인식하는 제3의 유전자 조작된 항원 수용체를 더 포함한다.
[0025] 몇몇 측면에서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 적어도 10-8 M, 적어도 10-7 M, 적어도 10-6 M, 적어도 10-5 M, 10-5 M, 또는 10-4 M의 해리 상수(KD)에서 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유한다. 몇몇 측면에서, ligation of 제1의 유전자 조작된 항원 수용체의 접합(ligation) 및 제2의 유전자 조작된 항원 수용체의 접합은 상기 유전자 조작된 항원 수용체들 중 어느 하나 단독의 접합에 의해서는 유도되지 않는 응답을 세포내에서 유도한다.
[0026] 몇몇 구체예에서, 이러한 응답은 시토카인의 증식, 분비 및 세포독성 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 제1 항원을 인코딩하는 유전자 내 파괴, 및/또는 제2 항원을 인코딩하는 유전자 내 파괴를 추가로 포함하며, 여기서 상기 파괴는 예컨대 파괴된 유전자가 CD38을 인코딩하는 경우와 같은 전술한 바와 같은 파괴에 의해, 조작된 면역 세포내에서 제1 및/또는 제2 항원의 발현 감소를 초래하는 것이다.
[0027] 또한 상기 세포 및 몇몇 측면에서 담체, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물을 비롯한 조성물도 제공된다. 질병 및 병태에는 암 및 감염성 질환, 예컨대 혈액암, 백혈병, 림프종 및 다발골수종이 포함된다.
상세한 설명
I. 입양 세포 치료에 있어서 특이성 및/또는 효능을 제공하는 조성물 및 방법
[0028] 입양 세포 치료, 예컨대, 입양 면역치료를 위한 세포가 제공된다. 이러한 세포에는 면역세포들, 예컨대 T 세포 및 NK 세포가 포함되고, 일반적으로 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 조작된 TCRs 및/또는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 발현한다. 또한 예컨대 다발골수종 (MM)을 비롯한 암 치료시 입양 치료에서 있어서의 이들 세포의 용도 및 방법도 제공된다. 또한 이러한 세포의 조작, 준비 및 생산방법, 세포를 포함하는 조성물, 이를 함유하는 키트 및 장치 및 세포를 이용, 생산 및 투여하는 방법도 제공된다. 몇몇 구체예는, 항원-특이적 입양 세포 치료의 선택성, 특이성 및/또는 효능을 증강시키고, 및/또는 입양 세포 치료를 통해 표적화될 수 있는 대상 질병, 병태, 및/또는 표적 항원의 범위를확장시킨다.
[0029] 본 발명의 세포는 일반적으로 유전자 조작된 하나 이상의 핵산 또는 그의 산물을 도입함으로써 조작된다. 이러한 산물로는 조작된 T 세포 수용체 (TCRs) 및 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 활성화, 자극, 및 공동자극 CAR, 및 이들의 조합을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 비롯한 조작된 항원 수용체를 들 수 있다.
[0030] 또한 이러한 세포로는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 그 세포에 의해 발현되는 다른 조작된 항원 수용체에 의해 인식되는 하원을 인코딩ㅎ는 유전자를 비롯한 특정 유전자가 파괴된 세포를 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 진압된 유전자는 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 활성화, 억제, 또는 공동자극 CAR에 의해 표적화된 항원을 인코딩하는 유전자이다. 따라서, 예컨대 유전자 편집에 의해, 내인성 유전자의 발현 및/또는 파괴의 진압을 유발하는 핵산도 제공된다. 또한, 유전자 또는 유전자들의 발현이 감소된 세포 및 이러한 진압을 유발하기 위한 방법도 제공된다.
[0031] 몇몇 구체예에서, 예컨대, 활성화 또는 공동자극 항원 수용체, 예컨대, 활성화 CAR 또는 공동자극 CAR의 관점에서, 조작된 세포에서 발현되는 항원을 인코딩하는 유전자의 진압은 그 조작된 세포 자체가 살해 또는 억제의 표적이될 가능성을 회피시키거나 감소시킴에 따라, 세포 입양 치료시 세포의 효능, 및/또는 지속성 또는 확장성을 향상시킨다. 따라서, 몇몇 측면에서, 이러한 파괴는 조작된 세포에 의한, 조작된 세포 자체의 표적화 가능성을 회피 또는 감소시킨다.
[0032] 예컨대, 항원-특이적 세포, 예컨대 그러한 세포에 의해 발현되는 항원을 표적화하는 항원-특이적 T 세포는 당해 세포의 형제살해(fratricide killing)을 유도할 수 있다. 몇몇 경우, 서바이빈, hTERT, p53 및 활성화된 T 세포에서 발현된 단백질 항원인 기타에 대한 항원-특이적 T 세포 배양시 T 세포의 형제 살해가 관찰된다 (Turksma 등 (2013) Journal of Translational Medicine, 11:152; Leisegang 등 (2010) J Clin . Invest., 120:3869-3877; Chen 등 (2007) Cancer Biol Ther., 6:1991-1996; Theoret 등 (2008) Hum Gene Ther., 19:1219-1232). 예컨대 면역세포의 자살과 같은 형제살해의 탐지 방법으로는, 항원 수용체 (예컨대 TCR 또는 CAR 또는 기타 항원 수용체)에 의해 유전자 조작된 T 세포를 예컨대 최대 2주일간 시험관내 배양한 다음 세포 증식, 생존 및/또는 세포독성을 측정하기 위한 다양한 분석법을 이용하여 일정 기가 모니터링하는 방법을 들 수 있다. 몇몇 경우, 배양된 세포를 생존능, 세포 사멸 또는 세포자멸사를 구별하거나 또는 세포자멸사 경로를 활성화시키는데 사용되는 7-AAD 또는 기타 염색 또는 기타 시약으로 염색할 수 있다. 몇몇 예에서, 항원-특이적 면역 세포의 형제살해에 의해 유도되는 세포독성은 세포독성 분석법, 예컨대 크롬 분비를 평가하는 분석법에 의해 측정할 수 있다. 몇몇 경우, 유전자 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역세포 자체의 자살은 입양 세포 치료에서 어떤 항원-특이적 면역 세포의 사용방법을 제한할 수 있는데, 이는 이러한 세포들이 투여전 생체외에서 및/또는 투여후 생체내에서 형제살해에 의해 제거될 수 있기 때문이다. 어떤 집단 내 조작된 세포의 자살은 그러한 조작된 세포 집단 내에서 동일한 세포에 의한 단일 세포의 살해에 의한 것이거나 또는 그 집단 내에의 상호 살해하는 세포들에 의한 것일 수 있다.
[0033] 이러한 문제점이 해결된 세포 및 방법이 제공된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합된 항원을 인코딩하는 유전자의 발현이 세포에서 진압된다. 면역 세포내에서 특이 항원을 진압함으로써, 면역 세포 자체의 형제살해가 방지되거나 감소된다. 몇몇 구체예에서, 형제살해(예컨대 증식, 생존능 및/또는 세포독성 분석에 의해 평가시)는, 예컨대 그 세포가 조작된 항원 수용체를 발현하지만 그 유전자 또는 그에 의해 표적화된 항원 또는 그의 발현이 파괴되지 않은 세포 또는 세포 집단의 경우에 비해 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소된다. 몇몇 측면에서 이러한 측면은 입양 세포 치료 관점에서 향상된 특이성 및/또는 효능을 부여한다.
[0034] 이러한 항원으로는 예컨대 백혈병, 림프종, 및/또는 골수종, 예컨대 다발골수종과 같은 면역계의 암에서 발현되는 것들, 및/또는 활성화된 T 세포를 비롯하여 T 세포 및/또는 NK 세포에서 발현되는 것들을 들 수 있다. 예시적인 항원은 활성화 또는 자극된 T 세포 또는 NK 세포, 및 이의 서브세트, 특히 CAR 또는 기타 조작된 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입을 촉진하는데 사용되는 자극 조건에 의해 생산되는 활성화된 세포들 상에서 발현되는 것들이다. 예컨대, 이러한 항원들로는 휴지 T 세포 상에서 일반적으로 발현되지 않지만 그의 발현이 T 세포 활성화에 의해 유도되거나 및/또는 활성화된 T 세포 상에서 발현되는 것들을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이러한 유전자는 범종양 항원, 예컨대 hTERT, 서바이빈, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1)을 인코딩한다. 예컨대, 이 유전자는 hTERT 또는 서바이빈을 인코딩한다. 몇몇 구체예에서 유전자는 항원 CD38을 인코딩한다. 몇몇 구체예에서, 유전자는 항원 CD33 또는 TIM-3을 인코딩한다; 몇몇 구체예에서, 이것은 항원 CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 또는 CD362를 인코딩한다.
[0035] 몇몇 구체예에서, 진압은 항원을 인코딩하는 유전자의 결실에 의한 파괴, 예컨대 전체 유전자, 엑손 또는 영역의 결실, 및/또는 외래 서열에 의한 대체, 및/또는 돌연변이, 예컨대 유전자, 일반적으로 유전자의 엑손 내에서 프레임쉬프트 또는 미스센스 돌연변이에 의한 파괴를 통하여 유발된다. 몇몇 구체예에서, 파괴는 유전자 내로 조숙한 종결 코돈이 혼입되는 것을 야기함으로써, 그 항원을 발현시키지 않거나 또는 항원 수용체에 의해 인식되는 형태로 발현시키지 않는다. 파괴는 일반적으로 DNA 수준에서 행해진다. 파괴는 일반적으로 영구적이고, 비가역적이며 또는 일시적이지 않다. 다른 구체예에서, 예컨대 RNAi를 이용하는 유전자 녹다운과 같이, 일시적이거나 가역적인 진압 전략이 이용된다. 몇몇 구체예에서, 조작된 세포 상의 항원의 발현을 파괴 또는 달리 진압함으로써, 본 발명에서 제공된 방법 및 조성물은 조작된 세포 자체에 의한 조작된 세포의 살해 가능성을 회피 또는 감소시킴으로써 효능을 촉진시킨다.
[0036] 몇몇 구체예에서, 세포는 세포의 효능 증가를 위한 특징을 포함하고, 조작된 세포에서 유전자 발현의 파괴에 의해 방법이 제공된다. 몇몇 측면에서, 파괴된 유전자는 예컨대 예컨대 면역요법과 관련한 투여에 이어, 조작된 세포의 응답의 강건함을 감소시킬 수 있는 세포, 및/또는 여하한 분자에 면역억압 시그널을 전달하는 체크포인트 분자, 면역억압 분자, 예컨대 수용체를 인코딩한다.
[0037] 몇몇 구체예에서, 예컨대, 억제 CAR에 의해 인식되는 항원 관점에서, 유전자 파괴는 조작된 세포에 의해 발현되는 억제 CAR자신이, 역시 그 조작된 세포에 의해 발현된 어떤 분자에 결합할 가능성을 예방 또는 감소시킴으로써, 그 조작된 세포에 의한 시그널링 또는 표적화 면역 응답에 대한 감쇠 효과(dampening effect)를 유도한다. 이러한 항원의 예로는 정상 또는 비-표적화 또는 오프-표적 T 세포 상에서 발현되지만 (오프-표적 효과를 방지하기 위해 억제 CAR 분자가 포함됨), 예컨대 T 세포 또는 NK 세포를 유전자 조작하는데 이용되는 세포 유형에서도 발현되는 것들을 들 수 있다. 예시적인 항원은 MHC 분자, 예컨대 MHC-클래스 I 분자이며, 이들은 몇몇 경우 면역 회피, 암 또는 감염 관점에서 하향조절될 수 있으나, 일반적으로 유핵 세포 상에서 발현된다. 그 밖의 예로는 T 세포, NK 세포, 또는 세포요법을 위해 조작된 기타 세포 상에서도 발현되는 여하한 억제성 CAR 표적을 들 수 있다.
[0038] 또 다른 구체예에서 파괴된 유전자 또는 유전자들은 그 항원을 인코딩하는 것이 아닌 유전자, 예컨대, 면역억압 분자, 예컨대, 체크포인트 분자 또는 아데노신 수용체, 예컨대, A2AR를 인코딩하는 유전자이다.
[0039] 몇몇 측면에서, 파괴는 유전자 편집, 예컨대 파괴되도록 표적화된 영역에서 그 유전자와 특이적으로 결합 또는 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 이용하는 유전자 편집에 의해 수행된다. 몇몇 측면에서, 상기 단백질 또는 핵산은 예컨대 키메라 단백질 또는 융합 단백질에서 뉴클리아제에 커플링되거나 복합체를 형성한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 파괴는 DNA-표적화 단백질 및 뉴클리아제, 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 RNA-가이드된 뉴클리아제 예컨대 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-Cas 시스템, 예컨대 파괴되는 유전자에 대해 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 유도된다.
[0040] 몇몇 구체예에서, 향상된 선택성 및 특이성이, 복수개의 항원을 표적화하는 전략을 통해 달성된다. 이러한 전략은 일반적으로 서로 다른 유전자 조작된 항원 수용체 상에 존재하고 서로 다른 항원에 특이적으로 결합하는, 복수개의 항원-결합 도메인을 이용한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 세포는 두개 이상의 항원과 결합하도록 조작된다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 또는 그의 세포에 의해 표적화될 질병이나 병태에서 또는 상에서 각기 발현되는 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는, 복수개의 유전자 조작된 항원 수용체들이 세포 내로 도입된다. 이러한 특징은 몇몇 측면에서 오프-표적 효과가 일어날 가능성을 제거 또는 감소시킨다. 예컨대, 어떤 질병 또는 병태에서 발현되는 단일 항원이 비-질병성 세포 또는 정상 세포에서도 발현될 경우, 이러한 복수-표적화 접근법은 그 세포를 활성화하거나 특정한 이펙터 기능을 유도하기 위해, 복수개의 항원 수용체를 통한 결합을 요구함으로써, 목적한 세포 유형에 대한 선택성을 제공할 수 있다.
[0041] 몇몇 구체예에서, 세포는 제1 항원을 인식하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체 및, 제2 항원을 인식하는, 예컨대 공동자극 수용체와 같은 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 발현한다; 몇몇 구체예에서, 부가적인 수용체는 제3의 또는 그 이상의 항원을 인식한다. 몇몇 측면에서, 이들 항원들은 각각 이를 테면 신생물, 암, 악성종양 또는 감염성 질환과 같은 표적 세포, 질병 또는 병태에서 발현된다. 몇몇 측면에서, 이러한 항원들 중 하나 이상은 그 세포 요법에 의한 표적화하가 요구되지 않는 세포 또는 조직 또는 환경, 예컨대 정상적이거나 비-질병성 조직에서도 발현된다. 몇몇 구체예에서, 복수개의 수용체 및/또는 복수개의 항원-인식 성분들의 존재에 의해 이러한 조직, 세포 또는 환경에 대한 오프-표적 효과 가능성이 회피되거나 감소된다. 그러므로, 몇몇 측면에서, 제공된 세포 및 방법의 특징은 세포요법에 의해 표적화된 것 이외의 다른 세포, 조직 또는 환경에 대한 세포의 부적절한 활성화 또는 응답 가능성을 회피 또는 감소시킨다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 이들은 오프-표적 효과의 가능성을 회피 또는 감소시킨다.
[0042] 몇몇 측면에서, 유전자 조작된 항원 수용체 중 적어도 하나는 2종 이상의 종양에서 발현되는 범종양 항원인 표적 항원에 대해 특이적이다. 예컨대, 이러한 세포의 예로는 표적화된 항원 중 적어도 하나가 hTERT, 서바이빈, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1)인 세포를 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포 상에서 하나 이상의 다른 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 표적화된 하나 또는 다른 항원은 종양이나 암에서 발현되는 것이다.
[0043] 몇몇 측면에서, 질병 또는 병태는 다발골수종이고, 표적 세포는 다발골수종 세포이며, 및/또는 표적 항원은 다발골수종에서 발현되는 항원이다. 이러한 세포로는 복수개의 항원, 즉 이를 테면 다발골수종과 같은 질병이나 병태에서 발현되는 복수개의 항원, 예컨대 CD38, CD138 및/또는 CS-1의 조합을 표적화하는 것들을 들 수 있다. 표적화될 항원의 예시적인 조합은 CD38, CD138, 및/또는 CS-1 중 2 이상을 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포는 다발골수종에서 발현되는 2종 이상의 항원을 인식하며, 이들 중 1종 이상은 정상 또는 비-질병성 세포에서도 발현되는 것일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이들 항원은 CD38, CD138, 및 CS-1 중 2 이상을 포함한다.
[0044] 몇몇 구체예에서, 복수개의 수용체나 항원-인식 도메인들의 특이적 결합 또는 접합시에만 반응이 세포에서 유도되고, 단일 수용체 또는 도메인 단독에 의한 항원에 대한 접합이나 결합시에는 반응이 유도되지 않도록, 복수개의 항원 -인식 도메인 또는 복수개의 항원 수용체를 설계 또는 조작한다. 몇몇 측면에서, 제1 수용체는 활성화 도메인, 예컨대 CD3제타 사슬의 면역자극 도메인과 같은, ITAM-함유 모티프를 포함한다. 몇몇 측면에서, 제2 수용체는 활성화 도메인은 포함하지 않지만 공동자극 도메인은 포함하는 공동자극 수용체로서, 제1 수용체의 접합에 의해 유도된 시그널을 향상시킨다. 몇몇 측면에서, 정상 세포는 또한 활성화 수용체에 의해 인식된 항원을 발현하거나 발현할 수 있다.
[0045] 몇몇 구체예에서, 세포는 상이한 항원들을 인식하면서 하나 이상의 항원 수용체에 의해 표적화된 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴와 같은 유전자 파괴도 포함하는 복수개의 유전자 조작된 항원 수용체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 유전자 파괴는 항원 수용체(들)의 도입 전에 수행된다; 몇몇 구체예에서는, 항원 수용체(들)의 도입과 동시에 수행된다. 몇몇 측면에서, 항원 수용체(들)의 도입은 유전자 파괴, 예컨대, 상동 재조합에 의해 파괴된 유전자 위치로의 삽입에 의해 유도된다.
[0046] 또한 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 화합물 및 조성물도 제공된다. 세포 단리, 유전자 조작 및 유전자 파괴를 위한 방법도 제공된다. 핵산, 예컨대, 구조물, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 바이러스 벡터 및/또는 표적화된 유전자 파괴를 위한 인코딩 핵산 및/또는 단백질, 및 예컨대 형질도입에 의해 세포 내로 이러한 핵산을 도입하는 방법도 제공된다. 또한, 조작된 세포를 함유하는 조성물, 및 이를 테면 입양 세포 치료를 위해, 이러한 세포와 조성물을 대상자에게 투여하기 위한 방법, 키트 및 장치도 제공된다. 몇몇 측면에서, 세포는 대상자로부터 단리, 조작되어 동일한 대상자에게 투여된다. 또 다른 측면에서, 이들은 한 대상자로부터 단리, 조작된 다음 다른 대상자에게 투여된다.
A. 세포, 세포 준비 및 배양
[0047] 몇몇 구체예에서, 세포, 예컨대, 조작된 세포는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프성 장기로부터 유래하거나, 또는 면역계 세포, 예컨대 선천 또는 후천 면역 세포, 예컨대 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 비롯한 골수 또는 림프 세포이다. 그 밖의 예시적인 세포에는 줄기 세포, 예컨대, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSCs)를 비롯한 다능성 줄기 세포가 포함된다. 몇몇 측면에서, 세포는 인간 세포이다. 세포는 일반적으로 일차 세포, 예컨대 대상자로부터 직접 단리되거나 및/또는 대상자로부터 단리된 후 냉동된 것이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 T 세포 또는 기타 세포 유형의 하나 이상의 서브세트, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이의 하위집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화에 대한 잠재능, 증식, 재순환, 국소화, 및/또는 지속능, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 장기 또는 구획 내 존재여부, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화도에 의해 정의되는 하위집단을 포함한다. 치료하고자 하는 대상자와 관련하여, 세포는 동종이계(allogeneic) 및/또는 자가(autologous)일 수 있다. 이러한 방법에는 규격품 방법이 포함된다. 몇몇 측면에서, 예컨대 규격 기술의 경우, 세포는 다능성(pluripotent 및/또는 multipotent), 예컨대 줄기세포, 예컨대 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSCs)이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명에 설명된 바와 같이, 대상자로부터 세포를 분리, 준비, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 이들을 냉동보존 전후로 동일한 환자에게 재도입하는 것을 포함한다.
[0048] T 세포의 및/또는 CD4+의 및/또는 CD8+ T 세포의 서브타입 및 하위집단들에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 그의 서브타입, 예컨대 줄기세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-주입 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte: TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연발생적 및 후천조절적 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포성 헬퍼 T 세포, α/β T 세포, 및 δ/γ T 세포가 포함된다.
[0049] 몇몇 구체예에서, 1 이상의 T 세포 집단들을 표면 마커와 같은 하나 이상의 특정 마커에 대해 양성(마커+) 또는 하나 이상의 특정 마커를 높은 수준으로 발현(마커하이: markerhigh)하는 세포이거나 또는 하나 이상의 마커에 대해 음성(마커-) 또는 하나 이상의 마커를 상대적으로 낮은 수준으로 발현(마커로우: markerlow)하는 세포에 대해 농축시키거나 고갈시킨다. 몇몇 경우, 이러한 마커들은 특정한 T 세포 집단(예컨대 비-기억 세포)에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현되거나 부재하지만 특정한 다른 T 세포 집단(예컨대 기억 세포)에서는 상대적으로 더 높게 발현되거나 존재하는 마커들이다. 일 구체예에서, 세포 (예컨대 CD8+ 세포 또는 T 세포, 예컨대, CD3+ 세포)를 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나 이들을 높은 표면 수준으로 발현하는 세포에 대해 농축(즉 양성 선택)시키거나 및/또는 CD45RA에 대해 양성이거나 이를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포를 고갈(예컨대, 음성 선택)시킨다. 몇몇 구체예에서, 세포를 CD122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Rα (CD127)를 높은 수준으로 발현하거나 이들에 대해 양성인 세포에 대해 농축 또는 고갈시킨다. 몇 가지 예에서, CD8+ T 세포를 CD45RO에 대해 양성 (또는 CD45RA에 대해 음성)이고 CD62L에 대해 양성인 세포들로 농축시킨다.
[0050] 몇몇 구체예에서, CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 하위집단, 예컨대, 중심 기억 (TCM) 세포에 대해 농축된 하위집단.
[0051] 몇몇 구체예에서, 세포들은 내추럴 킬러(NK) 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포들은 단핵구, 또는 과립구, 예컨대, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기구이다.
세포 준비
[0052] 조작을 위한 세포 및 세포를 함유하는 조성물은 일반적으로 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 예컨대 대상자로부터 수득 또는 유래된 샘플로부터 단리된다. 몇몇 구체예에서, 세포 치료를 필요로 하거나 세포 요법이 적용될 특정 질병 또는 병태를 갖는 대상자로부터 세포를 분리한다. 몇몇 구체예에서 대상자는 포유동물, 예컨대 인간, 예컨대 특정 치료적 개재, 예컨대 세포가 단리, 가공 및/또는 조작될 입양 세포 치료를 필요로 하는 대상자이다.
[0053] 세포 및 세포 집단은 일반적으로 생물학적 샘플과 같은 샘플, 예컨대 특정 질병이나 병태를 갖거나 세포 치료법을 필요로 하는 또는 세포 치료법이 실시될 대상자로부터 수득 또는 유래된 샘플로부터 단리된다. 몇몇 측면에서, 대상자는 인간, 예컨대 특정 치료적 개재, 예컨대 세포가 단리, 프로세싱 및/또는 조작되는 입양세포 치료와 같은 치료적 개재를 필요로 하는 인간이다. 따라서, 몇몇 구체예에서 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 샘플에는 대상자로부터 직접 채취된 조직, 유액(fluid), 및 기타 세포 뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전자 조작 (예컨대 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척, 및/또는 인큐베이션과 같은 한 가지 이상의 프로세싱 단계의 결과 얻어지는 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 프로세싱되는 샘플 또는 생물학적 공급원으로부터 직접 얻어지는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 뇨 및 땀, 조직 및 장기 샘플 및 이들로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 들 수 있다.
[0054] 몇몇 측면에서, 세포가 유래 또는 분리되는 샘플은 혈액 또는 혈액-유래된 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플로는 전혈, 말초혈액단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장연관 림프조직, 점막연관 림프조직, 비장, 기타 림프조직, 간, 폐, 위, 소장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도, 또는 기타 장기, 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 예컨대, 입양세포 치료와 같은 세포 치료 맥락에서 샘플에는 예컨대 자가 공급원 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
[0055] 몇몇 구체예에서, 세포는 세포주, 예컨대, T 세포주로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서 세포는 이종발생(xenogeneic) 공급원, 예컨대 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
세포가공, 준비 및 비-친화성-기반 분리
[0056] 몇몇 구체예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 단리 단계를 포함한다. 몇 가지 예에서, 세포들은 예컨대 원치 않는 성분들을 제거하고, 원하는 성분들을 농축시키거나, 특정 시약에 민감한 세포들을 용해 또는 제거하기 위한 1종 이상의 시약의 존재 하에, 세척, 원심분리, 및/또는 인큐베이션된다. 몇 가지 예에서, 세포들은 밀도, 흡착 특성, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 성질에 기반하여 분리된다.
[0057] 몇 가지 예에서, 대상자의 순환 혈액으로부터 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 세포를 수득한다. 몇몇 측면에서 샘플은 림프구, 예컨대 T 세포, 단핵구, 과립구, B 그 밖에 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포, 및/또는 혈소판을 포함하며 몇몇 측면에서 적혈구 세포 및 혈소판 이외의 세포들을 함유한다.
[0058] 몇몇 구체예에서, 대상자로부터 수집된 혈액 세포들을 세척하여 예컨대 혈장 분획을 제거하고 후속 프로세싱 단계를 위하여 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣는다. 몇몇 구체예에서, 세포들을 인산완충염수(PBS)로 세척한다. 몇몇 구체예에서, 세척용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 결여한다. 몇몇 측면에서, 세척 단계는 제조사 지침에 따라 반자동화식 "병류(flow-through)" 원심분리 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)에 의해 달성된다. 몇몇 측면에서, 세척 단계는 제조사 지침에 따라 탄젠트 유동 여과(tangential flow filtration: TFF)에 의해 달성된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 예컨대 Ca++/Mg++가 없는 PBS와 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁된다. 특정 구체예에서, 혈액세포 샘플 성분들을 제거하고 세포들을 배양 배지에 직접 현탁시킨다
[0059] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 적혈구 세포의 용해 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의해 말초혈액으로부터 백혈구 세포를 준비하는 것과 같은, 밀도-기반 세포 단리방법을 포함한다.
친화성 및/또는 마커 프로파일에 기반한 분리
[0060] 몇몇 구체예에서, 단리 방법은 세포 내 하나 이상의 특이 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 발현 또는 존재여부에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 마커에 기반한 공지의 분리 방법들이 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분리는 친화성- 또는 면역친화성-기반 분리이다. 예컨대, 몇몇 측면에서 단리는 세포 발현 또는 전형적으로 세포 표면 마커와 같은 하나 이상의 마커의 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단을 분리하는 것을 포함하며, 예컨대 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션한 다음, 일반적으로 세척 단계 및, 항체 또는 결합 파트너와 결합된 세포를 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포들로부터 분리함으로써 달성된다
[0061] 이러한 분리 단계는 시약과 결합한 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포들이 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 두 가지 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 몇몇 측면에서, 음성 선택은 소망되는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 분리가 최선으로 수행되는 것인, 이종 집단 내의 세포 유형을 특이적으로 동정할 수 있는 항체가 없을 경우 특히 유용할 수 있다.
[0062] 분리에 의해 특정 마커를 발현하는 세포 특정 세포 집단 또는 세포가 반드시 100% 농축되거나 제거되는 것은 아니다. 예컨대, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 농축 또는 양성 선택은 그러한 세포의 갯수 또는 밸분율을 증가시키는 것을 가리키는 것이지 그 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 반드시 결과시키는 것은 아니다. 마찬가지로, 예컨대 마커를 발현하는 것처럼 어떤 특정한 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 갯수 또는 백분율을 감소시키는 것을 가리키는 것일 뿐 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 반드시 결과시키는 것은 아니다.
[0063] 몇 가지 예에서, 분리 단계를 복수 라운드로 수행하는데, 이 경우 어떤 한 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획을 후속적인 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계로 처리한다. 몇 가지 예에서, 음성 선택에 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수개의 항체 또는 결합 하트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써, 단일 분리 단계에 의해 복수개의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 종류에서 발현되는 복수개의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써 복수개의 세포 종류들을 동시에 양성 선택할 수 있다.
[0064] 예컨대, 몇몇 측면에서, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은, 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포와 같은 T 세포의 특별한 하위집단이 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
[0065] 예컨대, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 이용하여 양성 선택될 수 있다.
[0066] 몇몇 구체예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 몇몇 구체예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 비교적 고수준 (마커하이)으로 또는 발현되는 (마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 기타 결합제와 세포를 함께 인큐베이션함으로써 달성된다.
[0067] 몇몇 구체예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 기타 백혈구 세포, 예컨대 CD14 상에서 발현되는 마커들의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 몇몇 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 이용하여 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리한다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 나이브, 기억, 및/또는 이펙터 T 세포 하위집단 중 하나 이상을 비교적 고도로 발현하는 마커의 양성 또는 음성 선택에 의해 하위집단으로 더 분류될 수 있다.
[0068] 몇몇 구체예에서, CD8+ 세포를 나이브 중심 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중심 기억 줄기 세포에 대해, 예컨대 이들 각각의 하위집단과 연계된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 추가로 농축 또는 고갈시킨다. 몇몇 구체예에서, 효능 증가를 위해, 예컨대 투여 후 장기간 생존, 증식 및/또는 이식을 위해 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축이 수행되는데, 이는 몇몇 측면에서 이러한 하위집단들에서 특히 원기왕성하다. 참조 [Terakura등 (2012) Blood.1:72-82; Wang 등 (2012) J Immunother . 35(9):689-701]. 몇몇 구체예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 조합에 의해 효능이 추가로 향상된다.
[0069] 몇몇 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 양쪽 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 이용함으로써, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축 또는 고갈시킬 수 있다.
[0070] 몇몇 구체예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD27 및/또는 CD 127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초한다; 몇몇 측면에서, 이것은 CD45RA 및/또는 그랜자임(granzyme) B를 발현 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기반한다. 몇몇 측면에서, TCM 세포가 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택 처리되는 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포들의 음성 분획으로부터 출발하여 수행된다. 몇몇 측면에서 이러한 선택은 동시적으로 수행되며 또 다른 측면에서는 순서와 상관없이 순차적으로 수행된다. 몇몇 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 준비하는데 사용된 것과 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계를, CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하는데도 이용함으로써, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 양방 모두를 유지하여 후속 단계에서 이용할 수 있으며, 한 가지 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계를 임의로 더 실시할 수 있다.
[0071] 특정 예에서, PBMCs 샘플 또는 기타 백혈구 세포 샘플을 CD4+ 세포 선택 처리하여, 음성 분획과 양성 분획 양자 모두를 유지시킨다. 이어서 음성 분획을 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기반하여 음성 선택하고, 중심 기억 T 세포, 예컨대 CD62L 또는 CCR7에 특징적인 마커에 기초하여 양성 선택하되, 이 때 양성 선택과 음성 선택을 순서와 관계없이 수행한다.
[0072] CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단의 동정에 의해, 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구들은 표준 방법에 의해 수득가능하다. 몇몇 구체예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 몇몇 구체예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 몇몇 구체예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
[0073] 일 실시예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵돌기은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위해 세포를 분리할 수 있도록 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자성 비드 또는 상자성 비드에 결합된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 친화자성) 분리 기술에 의해 분리 또는 단리된다 (문헌 Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks 및 U. Schumacher " Humana Press Inc., Totowa, NJ에서 검토됨).
[0074] 몇몇 측면에서, 분리하고자 하는 세포의 샘플 또는 조성물은 자성 반응성 입자 또는 마이크로입자, 예컨대 상자성 비드(예컨대, (예컨대, 예컨대 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같이 자화가능하거나 또는 자성적으로 반응성인 소형 물질과 함께 인큐베이션된다. 자성적으로 반응성인 물질, 예컨대, 입자는 일반적으로 분리하고자 하는, 예컨대 양성 또는 음성 선택이 요구되는 세포 또는 세포 집단 상에 존재하는 예컨대 표면 마커와 같은 분자에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 일반적으로 직접 또는 간접적으로 결합된다.
[0075] 몇몇 구체예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 기타 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 멤버에 결합된 자성적으로 반응성인 물질을 포함한다. 이 분야에는 자성 분리방법에 사용되는 자성적으로 반응성인 많은 물질들이 알려져 있다. 적절한 자성 입자에는 Molday의 미국특허 No. 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 설명된 것들이 포함되며, 이들 문한은 본 발명에 참조 통합되었다. 그 밖의 예로는 예컨대 Owen의 미국특허 No. 4,795,698, 및 Liberti 등의 미국특허 No. 5,200,084에 설명된 콜로이드 크기의 입자를 들 수 있다.
[0076] 인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하고 자성 입자 또는 비드에 결합된 예컨대 2차 항체 또는 기타 시약이 샘플 내 세포 상에 존재할 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 그러한 조건 하에서 수행된다.
[0077] 몇몇 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자성적으로 반응성인 세포 또는 그에 결합된 자화가능한 입자들이 자석에 이끌려 비표지 세포로부터 분리된다. 양성 선택의 경우, 자석에 유인되는 세포들이 유지된다; 음성 선택의 경우, 유인되지 않는 세포(비표지 세포)가 유지된다. 몇몇 측면에서, 동일한 선택 단계 동안 양성 및 음성 선택의 조합을 수행하여, 양성 및 음성 분획을 유지하여 추가 분리 단계로 처리하거나 또는 추가 프로세싱한다.
[0078] 특정 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 일차 항체 또는 기타 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소, 또는 스트렙트아비딘에서 코팅된다. 특정 구체예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 일차 항체의 코팅을 통해 세포에 결합된다. 특정 구체예에서는 비드가 아닌 세포가 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 다음, 세포-유형 특이적인 이차 항체- 또는 기타 결합 파트너(예컨대, 스트렙트아비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구체예에서, 스트렙트아비딘-코팅된 자성 입자들은 바이오티닐화된 일차 또는 이차 항체와 연계적으로 사용된다.
[0079] 몇몇 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 방치된다; 몇몇 측면에서, 이들 입자들은 환자에 대한 투여를 위해 세포에 부착된 채로 방치된다. 몇몇 구체예에서, 자화가능한 또는 자성적으로 반응성인 입자들이 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화가능한 입자를 제거하는 방법은 공지이며 여기에는 예컨대 경쟁적 비-표지 항체의 사용, 자화가능한 입자 또는 절단가능한 링커에 컨쥬게이션된 항체의 사용, 등이 포함된다. 몇몇 구체예에서, 자화가능한 입자들은 생분해성이다.
[0080] 몇몇 구체예에서, 친화성-기반 선택은 자기-활성화 세포 소팅(MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)을 경유한다. 자기 활성화 세포 소팅(MACS) 시스템은 그에 결합된 자화된 입자들을 갖는 세포의 고순도 선택이 가능하다. 특정 구체예에서, MACS은 비표적 종 또는 표적 종이 외부 자기장 인가 후에 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포들은 그 자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종들은 용리된다. 이어서, 이 1차 용리 단계가 종결된 후, 자기장에 포획된 종들 및 용리되지 않은 종들이 용리 및 회수가능한 몇몇 방식으로 방출된다. 특정 구체예에서, 비-표적 세포가 표지되어 이질적인 세포 집단으로부터 고갈된다.
[0081] 특정 구체예에서, 본 발명 방법의 단리 또는 분리는 단리, 세포 준비, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 기기 또는 장치를 이용하여 수행된다. 몇몇 측면에서, 예컨대 실수, 사용자 핸들링 및/또는 오염을 최소화하기 위해, 밀폐 또는 멸균 환경에서 이들 단계들을 각각 수행하기 위한 시스템이 이용된다. 일례에서, 시스템은 국제특허출원, 공개번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 설명된 시스템이다..
[0082] 몇몇 구체예에서, 시스템 또는 장치는 단리, 가공, 조작 및 제형화 단계 중 하나 이상 예컨대 전부를 통합 시스템 또는 자족 시스템, 및/또는 자동화 또는 프로그램 가능한 방식으로 수행한다. 몇몇 측면에서, 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 교통하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함함으로 해서, 사용자로 하여금 프로세싱, 단리, 조작 및 제형화 단계들의 결과를 프로그램, 제어, 평가하거나 및/또는 이의 다양한 측면을 조정하도록 할 수 있다.
[0083] 몇몇 측면에서, 분리 및/또는 기타 단계는, 예컨대 폐쇄 또는 멸균 시스템 중 임상규모의 세포 자동화 분리를 위한, CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotic)을 이용하여 수행된다. 부품으로는 일체형 마이크로컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프, 다양한 핀치 밸브를 들 수 있다. 몇몇 측면에서 일체형 컴퓨터는 장비의 모든 부품들을 제어하여 시스템으로 하여금 표준화된 시퀀스로 공정을 반복 수행하게 할 수 있다. 몇몇 측면에서 자성 분리 유닛은 이동가능한 영구자석 및 선택 컬럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트를 통해 유속을 조절하고 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 흐름과 세포의 지속적인 현탁을 통제한다.
[0084] 몇몇 측면에서, CliniMACS 시스템은 멸균된 비발열성 용액에 공급되는 항체-커플링된 자화가능한 입자를 이용한다. 몇몇 구체예에서, 세포를 자성 입자로 표지한 후 세포들을 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 제조 백을 튜빙 세트에 연결한 다음 이것을 완충액을 함유하는 백과 세포 수집 백에 연결한다. 튜빙 세트는 예비-컬럼 및 분리 컬럼을 비롯하여, 미리-조립된 멸균 튜빙으로 구성되며, 1회 사용만을 염두에 둔 것이다. 분리 프로그램 개시 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동적으로 적용한다. 표지된 세포들은 컬럼 내에 유지되는 한편, 비표지 세포들은 일련의 세척 단계로부터 제거된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되지 않으며 컬럼에 유지되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되며 컬럼 내에 유지된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명에 설명된 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 자기장 제거 후 컬럼으로부터 용리되어, 세포 수집 백에 수집된다.
[0085] 특정 구체예에서, 분리 및/또는 기타 단계들은 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 이용하여 수행된다. 몇몇 측면에서 CliniMACS Prodigy 시스템에는 자동세척 및 원심분리에 의한 세포의 분획화를 허용하는 세포 가공 유닛이 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 소스 세포 산물의 거시적인 층을 알아차림으로써 최적 세포 분획화 종점을 탐지하는 온보드 카메라 및 영상인식 소프트웨어도 포함할 수 있다. 예컨대, 말초혈액을 적혈구, 백혈구 및 혈장층으로 자동 분류한다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 예컨대 세포 분화 및 성장, 항원 로딩 및 장기간 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 달성하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수도 있다. 인풋 포트는 배지의 멸균 제거 및 재보충을 가능케하며 일체형 현미경을 이용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예컨대, Klebanoff 등(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura등 (2012) Blood.1:72-82, 및 Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701 참조.
[0086] 몇몇 구체예에서, 본 발명에 설명된 세포 집단은 유세포 분석법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되는데, 이 방법에서는 복수개의 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포들이 유체 스트림을 통해 운반된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명에 설명된 세포 집단은 예비 규모(FACS)-소팅을 통하여 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 특정 구체예에서, 본 발명에 설명된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합적으로 미세전자기계 시스템(MEMS)를 사용함으로써 수집 및 농축(또는 고갈)된다. (예컨대, WO 2010/033140, Cho 등 (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin 등 (2008) J Biophoton. 1(5):355-376 참조). 두 가지 경우 모두에서, 세포는 복수개의 마커로 표지되어, 잘-정의된 T 세포 서브세트들을 고순도로 단리할 수 있다.
[0087] 몇몇 구체예에서는, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이화하기 위해 항체 또는 결합 파트너를 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지한다. 예컨대, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 1개 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포 분리를 유체 스트림에서, 예컨대, 예비 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEM) 칩을 비롯한, 형광-활성화 세포 소팅(FACS)에 의해, 유세포 검출 시스템과 조합하여 수행한다. 이러한 방법에 의해 복수 마커에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 수행할 수 있다.
냉동보존 ( Cryopreservation )
[0088] 몇몇 구체예에서, 제공된 방법은 단리, 인큐베이션, 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 냉동, 예컨대 냉동보존하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 냉동 및 후속적인 해동 단계는 세포 집단 내의 과립구 및, 어느 정도로 단핵구를 제거한다. 몇몇 구체예에서는 예컨대 혈장 및 혈소판 제거를 위해 세척 단계 후에 냉동 용액에 세포들을 현탁시킨다. 몇몇 측면에서 공지의 다양한 여하한 냉동 용액 및 파라미터가 모두 사용가능하다. 그 한 가지 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)를 함유하는 PBS 또는 그 밖의 적절한 세포 동결 배지의 사용을 포함한다. 이어서 배지로 1:1 희석하여 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 한다. 이어서 세포를 분 당 1℃의 속도로 -80℃까지 냉동시키고 액체질소 저장 탱크의 증기상에 보관한다.
[0089] 몇몇 구체예에서, 배양, 인큐베이션, 배양 및/또는 유전자 조작 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 고갈된 세포 집단 및 배양-개시 조성물을 인큐베이션 및/또는 조작하기 위한 방법이 제공된다.
[0090] 따라서, 몇몇 구체예에서, 배양-개시 조성물에서 세포 집단이 인큐베이션된다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대, 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 세포 배양 또는 재배를 위한 용기에서 수행될 수 있다.
인큐베이션 및 배양
[0091] 몇몇 구체예에서, 세포를 유전자 조작에 앞서 또는 연게하여 인큐베이션 및/또는 배양한다. 인큐베이션 단계는 배양, 재배, 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제 존재 하에 인큐베이션된다. 이러한 조건은 항원 노출을 모방하기 위해 및/또는 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체의 도입을 위한 것과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍시키기 위해, 집단 내 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하도록 설계된 조건을 포함한다.
[0092] 이러한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 물질, 예컨대 영양원, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 시토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포 활성화를 위해 고안된 기타 물질 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
[0093] 몇몇 구체예에서, 자극 조건 또는 자극제는 1 이상의 물질, 예컨대 TCR 복합체의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 포함한다. 몇몇 측면에서, 이 자극제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 시그널링 캐스케이드를 켜거나 개시한다. 이러한 자극제는 항체, 예컨대 TCR 성분 및/또는 공동자극 수용체에 특이적인 항체, 예컨대, 항-CD3, 항-CD28, 예컨대, 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 것 및/또는 1 이상의 시토카인을 포함할 수 있다. 임의로, 증식 방법은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로). 몇몇 구체예에서, 자극제는 1L-2 및/또는 IL-15를 포함하며, 예컨대, IL-2를 적어도 약 10 유닛/mL의 농도로 포함한다.
[0094] 몇몇 측면에서, 인큐베이션은 Riddell 등의 미국특허 No. 6,040,177, Klebanoff 등(2012) J Immunother . 35(9): 651-660, Terakura등 (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang 등 (2012) J Immunother . 35(9):689-701에 설명된 기술에 따라 수행된다.
[0095] 몇몇 구체예에서, T 세포는 예컨대 비-분열성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 피더 세포를 첨가함하고 (예컨대 결과적인 세포 집단이 증식시키고자 하는 초기 집단 중의 각각의 T 림프구에 대해 PBMC 피더 세포를 적어도 5, 10, 20, 또는 40배 또는 그 이상 함유하도록); 배양체를 인큐베이션 (예컨대 몇몇 T 세포들이 증식하는데 충분한 기간 동안) 함으로써 증식된다. 몇몇 측면에서, 비분열 피더 세포들은 γ선이 조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위로 PBMC에 γ선을 조사한다. 몇몇 측면에서, T 세포 집단을 첨가하기에 앞서서, 배양 배지에 피더 세포를 첨가한다.
[0096] 몇몇 구체예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도예컨대, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30도, 및 일반적으로 약 37℃를 포함한다. 필요에 따라, 인큐베이션은 피더 세포로서 비분열 EBV-형질전환된 림프모구 세포(LCL)을 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL에 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 γ선을 조사할 수 있다. 몇몇 측면에서 LCL 피더 세포가 적절한 양, 예컨대 적어도 약 10:1의 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포 비율로서 제공된다.
[0097] 몇몇 구체예에서, 나이브 또는 항원 특이적인 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 항원-특이적 T 세포, 예컨대 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 수득할 수 있다. 예컨대, 감염된 대상자로부터 T 세포를 단리하고 시험관 내에서 상기 세포를 동일한 항원으로 자극시킴으로써, 시토메갈로바이러스 항원에 대한 항원-특이적인 T 세포주 또는 클론을 생성할 수 있다.
[0098] 몇몇 측면에서, 이 방법은 조작된 세포 또는 조작되는 세포 표면 상에서의 하나 이상의 마커의 발현을 평가하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 이 방법은 예컨대 친화성-기반 검출방법, 예컨대 유세포분석에 의해 표적화하고자 하는 하나 이상의 표적 항원(예컨대 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 인식되는 항원)의 표면 발현을 평가하는 것을 포함한다. 몇몇 측면에서, 이 방법이 항원 또는 기타 마커의 표면 발현을 드러낼 경우, 항원 또는 기타 마커를 인코딩하는 유전자가 파괴되거나 예컨대 본 발명의 방법을 이용하여 그 발현이 달리 진압된다.
B. 유전자 조작된 항원 수용체
[0099] 몇몇 구체예에서, 세포는 유전자 조작을 통해, 하나 이상의 항원 수용체를 인코딩하는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 이러한 핵산의 유전자 조작된 산물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 이종, 즉 예컨대 세포가 유래되는 조작된 세포 및/또는 장기에서 일반적으로 발견되지 않는, 다른 장기 또는 세포로부터 수득된 것처럼, 그 세포로부터 수득된 세포나 샘플에서는 대개 존재하지 않는 것이다. 몇몇 구체에에서, 핵산은 복수종의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산들의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이, 자연발생적인 것이 아니다.
[0100] 유전자 조작 산물로는 유전자 조작된 항원 수용체를 들 수 있다. 이러한 항원 수용체로는 유전자 조작된 T 세포 수용체 (TCRs) 및 그의 성분, 및 관능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 활성화 수용체 및 키메라 공동자극 수용체를 비롯한 키메라 항원 수용체 (CAR)가 포함된다. 몇몇 구체예에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 함유한다. 몇몇 구체예에서, 항원은 세포의 표면에서 발현되는 단백질이다. 몇몇 구체예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예컨대 TCR과 같이, 주요조직적합 복합체(MHC) 분자 관점에서 세포 표면에서 인식되는, 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
[0101] CARs 및 재조합 TCRs을 비롯한 예시적인 항원 수용체, 및 이러한 수용체를 조작하여 세포내로 도입시키는 방법의 예는 예컨대, 국제특허출원 공개번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 U.S. 특허출원 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, U.S. 특허번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허출원번호 EP2537416,및/또는 문헌 [Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr . Opin . Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 설명되어 있다. 몇몇 측면에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 미국특허 No.: 7,446,190에 설명된 CAR, 및 국제특허출원공개 No.: WO/2014055668 A1에 설명된 것을 포함한다.
키메라 항원 수용체 ( CARs )
[0102] 몇몇 구체예에서, 조작된 항원 수용체에는 활성화 또는 자극 CARs, 공동자극 CARs (see WO2014/055668), 및/또는 억제 CARs (iCARs, 참조 Fedorov 등, Sci . Transl . Medicine, 5(215) (December, 2013)를 비롯하여 키메라 항원 수용체 (CARs)가 포함된다. CARs은 몇몇 측면에서 링커 및/또는 막투과 도메인(들)을 경유하여, 하나 이상의 세포내 시그널링 성분에 링크된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 일반적으로 포함한다. 이러한 분자는 대체로 천연 항원 수용체를 통해 어떤 시그널, 즉 공동자극 수용체와 조합하여 이러한 수용체를 통한 시그널, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 시그널을 모방 또는 근사한다.
[0103] 몇몇 구체예에서, CAR은 특정 항원(또는 마커 또는 리간드)에 대해, 예컨대, 예컨대, 암 마커와 같이 입양 치료에 의해 표적화될 특정 세포 유형 상에서 발현되는 항원, 및/또는 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예컨대 정상 세포 또는 비-질병성 세포 유형에서 발현되는 항원에 대해 특이성을 갖도록 구축된다. 따라서, CAR은 일반적으로 그의 세포외 부분에 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인 또는 일부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, CAR은 모노클로날 항체(mAb)의 가변부 중쇄(VH) 및 가변부 경쇄(VL)로부터 유래된 단쇄 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 일부 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
[0104] 본 발명에서 "항체"라는 용어는 최광의로 사용되며 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편, 항원 결합 단편인 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 가변(VH) 영역, 단일사슬 가변 단편(scFv)를 비롯하여 항체 단편, 및 단일 도메인 항체(예컨대, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편를 비롯, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포괄한다. 이 용어는 유전자 조작된 및/또는 기타 변형된 형태의 면역글로불린 형태, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이, 예컨대 이중특이 항체, 다이아바디, 트라이아바디 및 테트라바디, 탄뎀-디--scFv, 탄뎀 tri-scFv를 포괄한다. 달리 언급하지 않는 한, "항체"라는 용어는 그의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 IgG 및 그의 서브클래스인, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 비롯하여, 여하한 클래스 또는 서브클래스의 항체를 비롯, 온전한 항체 또는 전장 항체도 포괄한다.
[0105] 몇몇 구체예에서, 항원-결합 단백질, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 몇몇 구체예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원-결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv))일 수 있다. 또 다른 구체예에서 항체 중쇄 불변 영역은, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE로부터 선택되고, 특히, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택되며, 더욱 특히는, IgG1 (예컨대, 인간 IgG1)이다. 또 다른 구체예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예컨대 κ 또는 람다, 특히 κ로부터 선택된다.
[0106] 제공된 항체로서 항체 단편을 들 수 있다. "항체 단편(antibody fragment)"이라 함은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편의 비제한적인 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 중쇄 가변(VH) 영역, 단쇄 항체 분자 예컨대 scFvs 및 단일-도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이 항체를 들 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 중쇄 가변 영역또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단쇄 항체 단편, 예컨대 scFvs이다.
[0107] "가변 영역(variable 영역)" 또는 "가변 도메인(가변 도메인)"이라는 용어는 항원에 대한 항체 결합과 연관된 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 가리킨다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 호 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 CDRs을 포함한다. [예컨대, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman 및 Co., page 91 (2007) 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 뿐만 아니라, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. [예컨대, Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991) 참조]
[0108] 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다. 몇몇 구체예에서, CAR은 항원, 예컨대 암 마커 또는 표적화하고자 하는 세포 또는 질병의 세포 표면 마커, 예컨대 종양 세포 또는 암세포, 예컨대 본 발명에 설명되거나 종래기술에 공지인 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
[0109] 항체 단편은 다양한 기술에 의해 만들 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 온전한 항체의 단백질 가수분해 및 재조합 hosT 세포에 의한 생산법을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 항체는 재조합적으로-생산된 단편, 예컨대 자연발생되지 않는 배열을 포함하는 단편, 예컨대 펩타이드 링커와 같은 합성 링커에 의해 연결된 두 개 이상의 항체 영역 또는 사살을 갖는 것들, 및/또는 자연발생적인 온전한 항체의 효소 절단에 의해 제조될 수 없는 것들이다. 몇몇 측면에서, 항체 단편은 scFvs이다.
[0110] "인간화(humanized)" 항체는 모든 또는 실제로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래하고 모든 또는 실제로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화 항체는 필요에 따라 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역를 적어도 일부 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화 형태"라 함은, 친(親: parental) 비인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하는 한편, 일반적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 수행된 비인간 항체의 변이체를 가리킨다. 몇몇 구체예에서는, 예컨대 항체 특이성 또는 친화성을 복구 또는 개선시키기 위해, 인간화 항체 중의 몇몇 FR 잔기들을 비인간 항체(예컨대 CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환시킨다.
[0111] 몇몇 구체예에서, CAR은 항원, 예컨대 세포 표면에서 발현되는 온전한 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예컨대 scFv) 또는 항체를 함유한다.
[0112] 몇몇 구체예에서, CAR은 TCR-유사 항체, 예컨대 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편(예컨대 scFv), 예컨대 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면에 제시되는 종양-관련 항원을 함유한다. 몇몇 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 재조합 수용체의 일부로서, 예컨대 항원 수용체로서 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체에는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CARs)이 있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 지향된 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편은 TCR-유사 CAR이라고도 칭할 수 있다.
[0113] "주요 조직적합 복합체(Major histocompatibility 복합체)" (MHC)는 세포 머시너리에 의해 가공되는 펩타이드 항원을 비롯하여, 몇몇 경우 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 자리 또는 결합 그루브를 함유하는, 일반적으로 당단백질인 단백질을 가리킨다. 몇몇 경우, MHC 분자는 T 세포 상의 항원 수용체, 예컨대 TCRs 또는 TCR-유사 항체에 의해 인식가능한 배열로 항원을 제시하기 위해, 펩타이드와의 복합체, 즉 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시 또는 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 α 사슬, 몇몇 경우 3개의 α 도메인에 걸친 막, 및 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는 헤테로다이머이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 2개의 막투과 당단백질, α 및 β로 이루어지며, 이들 양자 모두는 일반적으로 막 전체에 뻗어있다. MHC 분자는 펩타이드와 결합하기 위한 항원 결합 자리 또는 자리들을 함유하는 MHC의 유효 부위 및 적절한 항원 수용체에 의해 인식되는데 필요한 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, MHC 클래스 I 분자는 세포질에 기원하는 펩타이드를, 세포 표면에 전달하는데, 여기에서 MHC-펩타이드 복합체는 T 세포, 예컨대 일반적으로 CD8+ T 세포(그러나 몇몇 경우에는 CD4+ T 세포)에 의해 인식된다. 몇몇 구체예에서, MHC 클래스 II 분자는 일반적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식되는 세포 표면으로, 소포 시스템에 기원하는 펩타이드를 전달한다. 일반적으로, MHC 분자는 마우스에서는 집합적으로 H-2라 명명되고, 인간에서는 인간 백혈구 항원(HLA)라 명명되는 일군의 링크된 부위들에 의해 인코딩된다. 따라서, 일반적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)로 칭해질 수도 있다.
[0114] "MHC-펩타이드 복합체" 또는 "펩타이드-MHC 복합체" 또는 이의 변형 용어는 예컨대 일반적으로, MHC 분자의 틈새(cleft) 또는 결합 그루브 내의 펩타이드의 비공유 상호작용에 의해서와 같은, 펩타이드 항원과 MHC 분자와의 복합체 또는 결합체를 가리킨다. 몇몇 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포 표면에 제시되거나 나타난다. 몇몇 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체는 항원 수용체, 예컨대 TCR, TCR-유사 CAR 또는 그의 항원-결합 부위에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
[0115] "펩타이드 항원" 또는 "펩타이드 에피토프"라는 용어는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해, MHC 분자와 결합할 수 있는 폴리펩타이드의 펩타이드를 가리킨다. 일반적으로, 이 펩타이드는 보다 긴 생물학적 분자, 예컨대 폴리펩타이드 또는 단백질의 단편으로부터 유래하거나 그에 기반한다. 몇몇 구체예에서, 펩타이드는 일반적으로 길이가 약 8 내지 약 24 아미노산이다. 몇몇 구체예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서의 인식을 위해 약 9 내지 22개 아미노산 길이를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서의 인식을 위해 약 8 내지 13개 아미노산 길이를 갖는다. 몇몇 구체예에서, MHC 분자 관점, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에서 펩타이드 인식시, 항원 수용체, 예컨대 TCR 또는 TCR-유사 CAR은 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 시토카인 생산, 세포독성 T 세포 응답 또는 기타 응답을 유도하는 활성화 시그널을 그 T 세포에 대해 생산 또는 촉발시킨다.
[0116] 몇몇 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합부는 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 면역원의 유효량으로 숙주를 면역시킴으로써 생산할 수 있다. 몇몇 경우, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 MHCdp 결합할 수 있는 항원, 예컨대 종양 항원, 예컨대 범종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 후술하는 항원의 에피토프이다. 몇몇 구체예에서는, 그 다음으로, 면역 반응을 이끌어 내기 위해, 면역원의 유효량을 투여하며, 이 때 면역원은 MHC 분자의 결합 그루브 내 펩타이드의 3차원 제시에 대한 면역 응답을 이끌어내는데 충분한 기간 동안 그의 3차원 형태를 유지하는 것이다. 이어서 숙주로부터 채집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 그루브 내의 펩타이드의 3차원 제시를 인식하는 소망되는 항원이 생산되었는지를 알아낸다. 몇몇 구체예에서, 생산된 항체들은 그 항체가 MHC 분자 단독, 관심대상 펩타이드 단독 및 MHC 복합체 및 무관한 펩타이드로부터 MHC-펩타이드 복합체를 구별할 수 있는지를 확인하도록 평가될 수 있다.
[0117]
몇몇 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합부는 항체 라이브러리 디스플레이법, 예컨대 파지 항체 라이브러리를 이용하여 생산가능하다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 Fab, scFV 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있는데, 여기서 라이브러리의 멤버들은 CDR 또는 CDRs의 하나 이상의 잔기가 돌연변이된 것이다. 이러한 방법의 예는 기술분야에 공지이다 (예컨대 US 공개출원 No. US20020150914, US2014/0294841; 및 Cohen CJ. 등 (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332 참조).
[0118] 몇몇 측면에서, 항원-특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막투과 및 세포내 신호 도메인에 링크되어 있다. 몇몇 구체예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막투과 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, CAR 내 도메인들 중 하나와 자연적으로 관련된 막투과 도메인이 사용된다. 몇몇 경우, 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호작용을 최소화하기 위해 같거나 다른 표면 막 단백질의 막투과 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 회피하기 위해, 아미노산 치환에 의해 막투과 도메인을 선택 또는 변형시킨다.
[0119] 몇몇 구체예에서 막투과 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연일 경우, 몇몇 측면에서 도메인은 어떠한 막-결합 또는 막투과 단백질로부터 유래되어도 무방하다. 막투과 영역은 T-세포 수용체의 α, β 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154(의 막투과 영역(들)을 적어도 포함함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 별법으로, 몇몇 구체예에서 막투과 도메인은 합성된 것이다. 몇몇 측면에서, 합성 막투과 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 몇몇 측면에서, 합성 막투과 도메인의 각 말단에서는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼원체 발견된다.
[0120] 몇몇 구체예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대, 예컨대 글리신 및 세린을 함유하는 것과 같은 길이가 2 내지 10 아미노산인 링커, 예컨대 글리신-세린 이원체가 존재하며 CAR의 막투과 도메인과 세포질 신호 도메인 사이에 결합을 형성한다.
[0121] CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호 성분 또는 성분들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, CAR은 예컨대 CD3 제타 사슬과 같이, T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3+ 사슬과 같은, TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서 몇몇 측면에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 세포 신호 모듈에 링크된다. 몇몇 구체예에서, 세포 신호 모듈은 CD3 막투과 도메인, CD3 세포내 신호 도메인, 및/또는 기타 CD 막투과 도메인들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16와 같은 하나 이상의 부가적인 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예컨대, 몇몇 측면에서, CAR은 CD3-제타 (CD3-ξ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 간의 키메라 분자를 포함한다.
[0122] 몇몇 구체예에서, CAR의 접합(ligation)에 의해, CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 도메인이 예컨대 당해 세포를 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 또는 응답 중 적어도 한가지를 활성화시킨다. 예컨대, 어떤 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능 예컨대 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성 예컨대 시토카인 또는 기타 인자의 분비를 유도한다. 몇몇 구체예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 신호 도메인의 절단된(truncated) 부분. 몇몇 측면에서는 예컨대 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 형질도입할 경우, 온전한 면역자극 사슬 대신 이러한 절단 부분이 사용된다. 몇몇 구체예에서, 세포내 신호 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 몇몇 경우 자연적인 맥락에서 그러한 수용체와 협동적으로 항원 수용체 인게이지먼트에 이어 신호 형질도입을 개시하는 공동-수용체, 및/또는 이러한 분자들의 여하한 유도체 또는 변이체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 합성 서열을 포함한다.
[0123] 천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 뿐만 아니라 공동자극 신호도 요구한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동-자극 시그널에 대한 성분 역시도 CAR에 포함된다. 또 다른 구체예에서 CAR은 공동자극 시그널을 생산하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 몇몇 측면에서, 부가적인 CAR은 동일 세포에서 발현되어 제2의 또는 공동자극 시그널을 생산하기 위한 성분이 제공된다. 몇몇 측면에서, 세포는 일차 시그널을 유도하기 위한 시그널링 도메인을 함유하는 제1 CAR 및 제2 항원에 결합하고 공동자극 시그널 생성을 위한 성분을 함유하는 제2 CAR을 포함한다. 예컨대, 제1 CAR은 활성화 CAR일 수 있고, 제2 CAR은 공동자극 CAR일 수 있다. 몇몇 측면에서, 두 가지 CARs 모두는 세포내 특정 이펙터 기능을 유도하기 위해 서로 접합되어야 하며, 이에 의해 표적화되는 세포 유형에 대한 특이성과 선택성이 제공될 수 있다.
[0124] T 세포 활성화는 몇몇 측면에서 세포질 신호 서열의 2 부류에 의해 매개되는데; TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들 (1차 세포질 신호 서열), 및 2차 또는 공동-자극 신호 제공을 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것들(2차 세포질 신호 서열)이 그러한 부류들이다. 몇몇 측면에서, CAR은 이러한 신호 성분의 하나 또는 두 가지 모두를 포함한다.
[0125] 몇몇 측면에서 CAR은 자극 방식 또는 억제 방식으로, TCR 복합체의 일차 활성화를 제어하는 일차 세포질 시그널링 서열을 포함한다. 자극적 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAMs이라 알려진 신호 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR ξ, FcR γ, FcR β, CD3 γ, CD3 δ, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, CAR 중의 세포질 신호 분자(들)은 세포질 신호 도메인, 그의 일부 또는 CD3 ξ로부터 유래된 서열을 함유한다.
[0126] 몇몇 구체예에서, CAR은 공동자극 수용체의 시그널링 도메인 및/또는 막투과 부분, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS를 포함하다. 몇몇 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 성분과 공동자극 성분 두 가지 모두를 포함한다; 다른 측면에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR에 의해 제공되는 반면 공동자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다.
[0127] 특정 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 (예컨대, CD3제타) 세포내 도메인에 링크된 시그널링 도메인 및 CD28 막투과 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 링크된 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
[0128] 몇몇 구체예에서, CAR은 세포질 부분에서, 활성화 도메인, 예컨대 1차 활성화 도메인과 조합된 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 그의 한 가지 예는 CD3제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함하는 수용체이다.
[0129] 몇몇 구체예에서, CAR 또는 기타 항원 수용체는 트렁케이티드 EGFR, tEGFR와 같이 세포 표면 수용체의 트렁케이티드 버젼과 같은 수용체를 발현시키기 위해, 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하기 위한 마커를 추가로 포함한다.
[0130] 몇몇 경우, CARs은 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CARs로서 칭해진다. 몇몇 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 시그널만을 제공하는 것이다; 몇몇 측면에서, 2세대 CARs은 그러한 시그널과 공동자극 시그널을 제공하는 것, 예컨대 공동자극 수용체 세포내 시그널링 도메인, 예컨대 CD28 또는 CD137을 포함하는 것이다: 몇몇 측면에서, 3세대 CAR은 몇몇 측면에서 서로다른 공동자극 수용체의 공동자극 도메인을 복수개 포함하는 것이다.
[0131] 몇몇 측면에서, CAR 또는 기타 항원 수용체는 억제 CAR (예컨대 iCAR)이고 세포에서 면역 응답, 예컨대 ITAM- 및/또는 공동자극-촉진 응답과 같은 응답을 감쇠 또는 억제하는 세포내 성분들을 포함한다. 이러한 세포내 시그널링 성분의 예로는 면역 체크포인트 분자에서 발견되는 것들을 들 수 있으며, 여기에는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR를 비롯한 2/4 아데노신 수용체가 포함된다. 몇몇 측면에서, 조작된 세포는 이러한 억제 분자로부터 유래하거나 그의 시그널링 도메인을 포함하는 억제 CAR을 포함하여, 예컨대 활성화 및/또는 공동자극 CAR에 의해 유도되는, 세포의 응답을 감쇠시키는 역할을 한다. 이러한 CARs은 예컨대, CAR과 같은 활성화 수용체에 의해 인식되는 항원 역시도 정상 세포 표면에서 발현되거나 발현될 수 있는 관점에서, 오프-표적 효과 가능성을 감소시키기 위해 이용된다. 몇몇 측면에서는 억제 수용체, 정상 세포에 특이적인 마커를 인식하는 iCAR이 도입된다. 이러한 항원 역시도 조작된 세포에서 발현되는 몇몇 측면에서, 항원은 본 발명에 제공된 유전자 편집 또는 파괴 접근법의 표적이다. 몇몇 측면에서, 이러한 파괴는 조작된 세포 자신에 의해 유도되는 조작된 세포의 응답의 감쇠를 회피시켜준다.
TCRs
[0132] 몇몇 구체예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체 (TCRs) 및/또는 자연발생적인 T 세포로부터 클로닝된 TCRs을 포함한다.
[0133] "T 세포 수용체" 또는 "TCR"이라 함은 α 및 β 가변 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ라고도 알려짐) 또는 γ 및 δ 가변 사슬 (각각 TCRγ 및 TCR δ라고도 알려짐)을 함유하는 분자를 칭하며 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 것이다. 몇몇 구체예에서, TCR은 αβ 형태이다. 일반적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 서로 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면에서 또는 가용성 형태로서 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는데 일반적인 책임이 있는 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다. 몇몇 구체예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막투과 도메인 및/또는 짧은 세포질 돌기을 함유할 수도 있다 (예컨대, Janeway 등, Immunobiology : The Immune System in Health 및 Disease, 3rd Ed., Current Biology 공개s, p. 4:33, 1997 참조). 예컨대, 몇몇 측면에서, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막투과 영역, 및 C-말단에 짧은 세포질 돌기을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, TCR은 시그널 형질도입을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관되어 있다. 달리 언급하지 않는 한, "TCR"이라는 용어는 그의 기능성 TCR 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태를 비롯하여, 온전한 또는 전장 TCR 역시도 포괄하는 것이다.
[0134] 따라서, 본 발명의 목적상, TCR이라 함은 여하한 TCR 또는 그의 기능성 단편, 예컨대 MHC 분자, 즉 MHC-펩타이드 복합체에서 결합된 특이적인 항원 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원-결합부를 모두 포괄하는 것이다. TCR의 "항원-결합부" 또는 "항원-결합 단편"은 서로 호환적으로 칭해지며, TCR의 구조 도메인의 일부를 함유하지만, 전장 TCR이 결합하는 항원(예컨대 MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 것을 가리킨다. 몇몇 경우, 항원-결합부는 일반적으로 각 사슬이 3개의 상보성 결정 영역을 함유하는 것과 같이, 특이적 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하는데 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 가변 α 사슬 및 TCR의 가변 β 사슬을 함유한다.
[0135] 몇몇 구체예에서, TCR 사슬의 가변 도메인들은 결합하여 TCR 분자의 결합 자리 형성에 의해 항원 인식 및 펩타이드 특이성을 부여하는, 면역글로불린과 유사한 상보성 결정 영역(CDRs) 또는 루프를 형성하여 펩타이드 특이성을 결정한다. 일반적으로, 면역글로불린처럼, CDRs는 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다 (예컨대, Jores 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . U.S.A . 87:9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc 등, Dev . Comp. Immunol . 27:55, 2003 참조). 몇몇 구체예에서, 비록 α 사슬의 CDRl 역시 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호반응하는 것으로 나타나는 반면, β 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호작용하지만, CDR3은 가공된 항원을 인식하는데 책임이 있는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 여겨진다. 몇몇 구체예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가로 초가변성(HV4) 영역을 함유할 수 있다.
[ 0136] 몇몇 구체예에서, TCR 사슬은 불변 도메인을 함유한다. 예컨대, 면역글로불린처럼, TCR 사슬의 세포외 부분 (예컨대, α-사슬, β-사슬)은 2개의 면역글로불린 도메인, 즉 N-말단에 가변 도메인(예컨대, Vα" 또는 Vβ; Kabat 넘버링에 기초해서 일반적으로 아미노산 1 내지 116, Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health 및 Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예컨대, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα", 일반적으로, Kaba에 기초할 때 아미노산 117 내지 259, β-사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 일반적으로, Kabat에 기초할 때 아미노산 117 내지 295)을 함유할 수 있다. 예컨대, 몇몇 경우, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인과, CDR을 함유하는 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 형성하여 2개의 사슬 간에 링크를 만드는 짧은 연결 사슬을 함유한다. 몇몇 구체예에서, TCR은 α 및 β 사슬 각각에서 부가적인 시스테인 잔기를 가질 수 있음으로 해서, TCR은 불변 도메인에 2개의 디설파이드 결합을 함유한다.
[ 0137] 몇몇 구체예에서, TCR 사슬은 막투과 도메인을 함유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 막투과 도메인은 양전하를 띤다. 몇몇 경우, TCR 사슬은 세포질 돌기(cytoplasmic tail)를 함유한다. 몇몇 경우 이 구조는 TCR로 하여금 CD3과 같은 다른 분자와 회합할 수 있게 해준다. 예컨대, 막투과 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막 내에서 단백질을 앵커링하여 CD3 시그널링 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다.
[0138] 일반적으로, CD3은 포유동물에서 3개의 다른 사슬들(γ, δ 및 ε) 및 zeta-사슬을 가질 수 있는 멀티-단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유동물에서 이 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, 및 CD3ξ 사슬의 호모다이머 한개를 함유할 수 있다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 사슬의 막투과 영역은 음전하를 띄는데, 이것은 이들 사슬로 하여금 양하전된 T 세포 수용체 사슬과 회합하도록 하는 특징이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 사슬의 세포내 돌기는 각각 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM이라 알려진 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ξ 사슬은 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAMs은 TCR 복합체의 시그널링 능력과 연관이 있다. 이들 보조 분자들은 음하전된 막투과 영역을 갖고 세포 내로 TCR로부터의 시그널을 전파하는 역할을 한다. CD3- 및 ξ-사슬은 TCR과 함께, T 세포 수용체 복합체라 알려진 것을 형성한다.
[ 0139] 몇몇 구체예에서, TCR은 2개의 사슬 α 및 β(또는 임의로 γ 및 δ)의 헤테로다이머일 수 있고 또는 단일 사슬 TCR 구조물일 수도 있다. 몇몇 구체예에서, TCR은 예컨대 디설파이드 결합 또는 디설파이드 결합들에 의해 링크된 2개의 별개 사슬들(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다.
[0140] 몇몇 구체예에서, 표적 항원(예컨대, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하여 세포 내로 도입한다. 몇몇 구체예에서, TCR을 인코딩하는 핵산을 공중 이용가능한 TCR DNA 서열을 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 증폭시킴으로써 다양한 소스로부터 수득할 수 있다. 몇몇 구체예에서, TCR은 생물학적 소스, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포 (예컨대 세포독성 T 세포), T-세포 하이브리도마 또는 기타 공중 이용가능한 소스로부터 수득가능하다. 몇몇 구체예에서, T 세포는 자연발생적인 T 세포로부터 클로닝된 T-세포 수용체 (TCRs)를 발현하도록 조작된다. 몇몇 구체예에서는 환자로부터 표적 항원(예컨대 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론이 동정, 분리되어 세포 내로 도입된다. 몇몇 구체예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자(예컨대 인간 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)에 의해 조작된 유전자조작 마우스에서 생산된 것이다. 예컨대, 종양 항원 (예컨대, Parkhurst 등 (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen 등 (2005) J Immunol . 175:5799-5808 참조.　 몇몇 구체예에서, 파지 디스플레이가 표적 항원에 대해 TCR을 분리하는데 이용된다 (예컨대, Varela-Rohena 등 (2008) Nat Med . 14:1390-1395 및 Li (2005) 　Nat Biotechnol . 23:349-354 참조). 몇몇 구체예에서, TCR 또는 그의 항원-결합부는 TCR 서열에 관한 지식에 의해 합성적으로 만들어낼 수 있다.
[0141] 몇몇 구체예에서, T-세포 클론 수득 후, TCR α 및 β 사슬을 분리하여 유전자 발현 벡터에 클로닝시킨다. 몇몇 구체예에서, TCR α 및 β 유전자를 피코르나바이러스 2A 리보좀 스킵 펩타이드를 통해 링크시켜 두 사슬 모두 공동발현되도록 한다. 몇몇 구체예에서, TCR의 유전자 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해, 또는 트랜스포존을 통해 달성된다 (예컨대, Baum 등 (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha 등 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; an Hackett 등 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683 참조).
항원
[0142] 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 표적화되는 항원에는 입양 세포 치료를 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 관점에서 발현되는 것들이 있다. 이러한 질병 병태는 혈액암, 면역계의 암, 예컨대 림프종, 백혈병, 및/또는 골수종, 예컨대 B, T, 및 골수성 백혈병, 림프종, 및 다발골수종을 비롯한, 암 및 종양 등의 증식성, 신생물질 및 악성 질환 및 장애이다.
[0143] 몇몇 구체예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 몇몇 구체예에서, 이것은 탄수화물 또는 기타 분자이다. 몇몇 구체예에서, 항원은 종상 또는 비-표적화 세포 또는 조직에 비해 질병 또는 병태, 예컨대 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 또 다른 구체예에서 항원은 정상 세포에서 발현되고 및/또는 조작된 세포에서 발현된다. 이러한 몇몇 구체예에서, 본 발명에서 제공된 바와 같은 다중-표적화 및/또는 유전자 파괴 접근법을 이용하여 특이성 및/또는 효능을 향상시킨다.
[0144] 몇몇 구체예에서, 항원은 범종양 항원이다. "범종양 항원(universal 종양 antigen)"이라는 용어는 면역원성 분자, 예컨대 단백질, 즉 일반적으로 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되고 상이한 기원의 종양에서도 발현되는 단백질을 가리킨다. 몇몇 구체예에서, 범종양 항원은 인간 암의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 범종양 항원은 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종 또는 그 이상의 상이한 종양에서 발현된다. 몇몇 경우, 범종양 항원은 비종양 세포, 예컨대 정상 세포에서 발현될 수 있지만 그 발현 수준은 종양 세포에서 발현되는 것보다 훨씬 낮다. 몇몇 경우, 범종양 항원은 비종양 세포에서 전혀 발현되지 않으며, 예컨대, 정상 세포에서 발현되지 않는다. 범종양 항원의 예로는, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)을 들 수 있다. 범종양 항원을 비롯하여 종양 항원의 펩타이드 에피토프가 기술분야에- 알려져 있으며, 몇몇 측면에서, MHC-제한된 항원 수용체, 예컨대 TCRs 또는 TCR-유사 CARs를 생성하는데 이용가능하다 (예컨대 공개된 PCT 출원 No. WO2011009173 또는 WO2012135854 및 공개된 미국출원 No. US20140065708 참조).
[0145] 예컨대, 몇몇 구체예에서, 항원은 hTERT이다. hTERT는 다양한 암에서 광범하게 발현되는 종양 항원이다. 몇몇 측면에서, hTERT는 SEQ ID NO:3 (GenBank 수탁번호 NP_937983.2)에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 함유하고 EQ ID NO:4 (GenBank 수탁번호 NM_198253.2)에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 일반적으로, hTERT는 선형 염색체의 텔로미어 말단을 유지할 수 있고, 몇몇 경우 염색체가 분해 및 엔드-투-엔드 융합하는 것을 방지하는 복합체인 인간 텔로머라제 복합체의 일부인 역전사효소이다. 몇몇 측면에서, hTERT 발현은 RNA 주형으로부터 텔로미어 합성을 초래하고 그의 발현은 텔로머라제 활성과 상관이 있을 수 있는데, 이는 이것이 상기 복합체의 속도-제한 요소이기 때문이다. 일반적으로, hTERT는 정상 세포를 포함하여 대부분의 인간 세포에서는 발현되지 않지만, 종양세포와 암세포에서는 발현되거나 상향조절된다. 예컨대, 인간 종양의 85% 초과는 hTERT를 발현한다. 따라서, 몇몇 측면에서, hTERT는 범종양 항원일 수 있다. hTERT 의 HLA-제한된 펩타이드 에피토프들이 알려져 있고(예컨대 미국특허 No. 7,718,777, 및 공개된 PCT 출원 Nos. WO2000025813 및 WO2013135553 참조), 몇몇 측면에서, hTERT에 대한 항원 수용체를 생성 또는 동정하는데 이들을 이용할 수 있다. hTERT 펩타이드 에피토프의 비제한적인 예에는 SEQ ID NOS: 7-19에 제시된 것들이 포함된다. hTERT에 대한 항원 수용체, 예컨대 TCR 또는 TCR-유사 항체들이 기술분야에서 생성되어 공지이다 (예컨대, 미국특허 No. 7,718,777 및 공개된 미국 특허출원 US20090226474 및 US20030223994; Ugel 등 (2010) Blood, 115:1374-1384 참조).
[0146] 몇몇 구체예에서, 항원은 서바이빈 (baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-함유 5, BIRC5라고도 칭함)이다. 몇몇 측면에서, 서바이빈은 SEQ ID NO:5 (GenBank 수탁번호 NP_001159)에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 함유하고 SEQ ID NO:6 (GenBank 수탁번호 NM_001168.2)에 제시된 뉴클레오타이드의 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇 경우, 예컨대 각각 GenBank 수탁번호 NP_001012270 또는 NM_001012270, 또는 각각 NP_001012271.1 또는 NM_001012271.1로 칭해지는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 함유하는 다른 전사체 이소형태들이 존재할 수 있다. 일반적으로, 서바이빈은 세포자멸사 단백질의 억제제(IAPs)의 패밀리 멤버이다. 몇몇 경우, 서바이빈은 예컨대 폐암, 결장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 흑색종 등과 같은 많은 종류의 암에서 상향조절되지만, 정상 세포 또는 조직에서는 일반적으로 발현되지 않거나 상향조절되지 않는다. 몇몇 측면에서, 암에서 서바이빈의 발현은 종양 진행의 세포자멸서 저해의 일반적 역할과 연관이 있을 수 있다. 그러므로, 몇몇 측면에서, 서바이빈은 범종양 항원일 수 있다. 서바이빈의 HLA-제한된 펩타이드 에피토프들은 공지이며 (예컨대 미국특허 No. 7,892,559 및 공개된 미국 특허출원 No. US20090004214 참조), 몇몇 경우 이러한 펩타이드 에피토프들을 이용하여 TCRs 또는 TCR-유사 CARs을 비롯한, 서바이빈에 대한 항원 수용체를 생성 또는 동정할 수 있다. 서바이빈 펩타이드 에피토프의 비제한적인 예는 SEQ ID NOS: 20-30에 제시된 것들이다. 예컨대 TCR 또는 TCR-유사 항체와 같은, 서바이빈에 대한 항원 수용체들이 기술분야에서 생성된 바 있고 공지이다(예컨대, 공개된 PCT 출원 No. WO2010075417 참조).
[0147] 몇몇 측면에서, 항원은 다발골수종, 예컨대 CD38, CD138, 및/또는 CS-1에서 발현된다. 그 밖의 에시적인 다발골수종 항원에는 CD56, TIM-3, CD33, CD123, 및/또는 CD44가 포함된다. 이러한 항원에 지향된 항체 또는 항원-결합 단편은 공지이며, 예컨대 미국특허 No. 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 출원 No. US20120189622; 및 공개된 국제 PCT 출원 Nos. WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612에 개시된 것들이 이에 포함된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예컨대 scFv)은 CAR을 생산하는데 이용될 수 있다.
[0148] 몇몇 구체예에서, 항원은 인간 CD38인 CD38 항원이다. 몇몇 측면에서, CD38은 GenBank 수탁번호: BAA18966, 예컨대, BAA18966.1, 또는 GI:1911103의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 몇몇 측면에서, 이것은 다음의 서열을 갖거나 함유한다: mancefspvs gdkpccrlsr raqlclgvsi lvlilvvvla vvvprwrqqw sgpgttkrfp etvlarcvky teihpemrhv dcqsvwdafk gafiskhpcn iteedyqplm klgtqtvpcn killwsrikd lahqftqvqr dmftledtll gyladdltwc gefntskiny qscpdwrkdc snnpvsvfwk tvsrrfaeaa cdvvhvmlng srskifdkns tfgsvevhnl qpekvqtlea wvihggreds rdlcqdptik elesiiskrn iqfsckniyr pdkflqcvkn pedssctsei (SEQ ID NO:1). 몇몇 측면에서, CD38 항원은 SEQ ID NO:2에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 항원-결합 도메인이 특이적으로 결합하는 항원 부분은 항원의 세포외 영역 내에 일반적으로 존재한다. 예컨대, SEQ ID NO:1과 관련하여, 세포외 영역은 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 43-300이다. 몇몇 구체예에서, 항원은 암세포 또는 종양 세포에서 발현되거나 상향조절되는 것일 수 있지만 면역세포 예컨대 휴지 또는 활성화된 T 세포에서 발현될 수도 있다. 예컨대, 몇몇 경우, hTERT, 서바이빈 및 기타 범종양 항원의 발현은 활성화된 T 림프구를 비롯하여 림프구 내에 존재하는 것으로 보고되었다 (예컨대, Weng 등 (1996) J Exp . Med., 183:2471-2479; Hathcock 등 (1998) J Immunol., 160:5702-5706; Liu 등 (1999) Proc . Natl Acad Sci., 96:5147-5152; Turksma 등 (2013) Journal of Translational Medicine, 11:152 참조). 마찬가지로, 몇몇 경우에서, CD38 및 다른 종양 항원들 역시 면역세포, 예컨대 T 세포에서 발현될 수도 있고, 예컨대 활성화된 T 세포에서 상향조절될 수 있다. 예컨대, 몇몇 측면에서, CD38은 공지의 T 세포 활성화 마커이다. 몇몇 구체예에서 본 발명에 제공된 바와 같이, 면역세포 예컨대 T 세포는, 발현된 유전자 조작된 항원 수용체가 면역세포 자체에서의 그의 발현 관점에서 항원과 특이적으로 결합하지 않도록, 면역세포에서 항원을 인코딩하는 유전자를 진압 또는 파괴시키도록 조작될 수 있다. 그러므로, 몇몇 측면에서, 이것은 예컨대 입양 세포 치료와 관련하여, 면역세포에서 조작된 세포의 효능을 감소시킬 수 있는, 예컨대 조작된 면역 세포가 그 자신에 결합하는 것과 같은 오프-표적 효과를 회피시킬 수 있다.
[0149] 몇몇 구체예에서, 예컨대 억제 CAR의 경우, 표적은 오프-표적 마커, 예컨대 질병 세포 또는 표적시키고자 하는 세포에서는 발현되지 않지만, 동일한 조작된 세포에서 활성화 또는 자극성 수용체에 의해 표적화되는 질병-특이 표적 역시도 발현하는 정상세포 또는 비-질병 세포에서 발현되는 항원이다. 이러한 항원의 예로는 예컨대, 이러한 분자가 하향조절되게 되지만 비표적화 세포상에서 발현된 채로 남아있는 질병이나 병태의 치료와 관련된 MHC 분자, 예컨대 MHC 클래스 I 분자를 들 수 있다.
[0150] 몇몇 구체예에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 다른 항원들을 표적화하는 항원을 함유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 다른 항원은 종양 항원 또는 암 마커이다. 제공된 면역세포 상의 항원 수용체에 의해 표적화된 다른 항원에는, 몇몇 구체예에서, 오펀(orphan) 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 테아 아세토콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, kappa 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D Ligands, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, Wilms Tumor 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 바이오티닐화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현되는 분자가 포함된다.
[0151] 몇몇 구체예에서, CAR은 병원체-특이 항원에 결합한다. 몇몇 구체예에서, CAR은 바이러스성 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV, 등), 세균성 항원, 및/또는 기생충성 항원에 특이적이다.
다중- 표적화 (Multi-표적화)
[0152] 몇몇 구체예에서, 세포 및 방법은 다중-표적화 전략, 예컨대 각기 다른 항원을 인식하고 일반적으로 각각 상이한 세포내 시그널링 성분을 인식하는, 2개 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현을 포함한다. 이러한 다중-표적화 전략은 예컨대 국제 특허 출원, 공개 No.: WO 2014055668 A1 (활성화 및 공동자극 CARs의 조합, 예컨대, 오프-표적, 예컨대 정상 세포상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질병이나 병태의 세포 상에서만 함께 존재하는 2개의 상이한 항원을 표적화시키는 것에 관하여 설명됨) 및 Fedorov 등, Sci . Transl . Medicine, 5(215) (December, 2013) (예컨대, 활성화 CAR은 정상 세포 또는 비질병 세포 및 치료하고자 하는 질병 또는 병태의 세포 양자 모두에서 발현되는 하나의 항체와 결합하고, 억제 CAR은 정상 세포 또는 치료하고자 하는 것이 아닌 세포에서만 발현되는 또 다른 항원에 결합하는 것인, 활성화 및 억제 CAR을 발현하는 세포들에 관하여 설명됨)에 설명되어 있다.
[0153] 몇몇 구체예에서, 다중-표적화 전략은 특정 질병 또는 병태와 관련된 항원이 비질병 세포에서 발현되거나 및/또는 조작된 세포 자신에서 일시적으로 (예컨대 유전자 조작과 연계하여 자극되는 경우) 또는 영구적으로 발현되는 경우 사용된다. 이러한 경우, 2개의 별개의 개별적으로 특이적인 항원 수용체의 접합이 요구됨으로써 특이성, 선택성 및/또는 효능이 증진될 수 있다.
[0154] 예컨대, 몇몇 구체예에서, 세포는 예컨대 일반적으로 제1 항원인 제1 수용체에 의해 인식되는 항원과 특이적으로 결합시, 세포에 활성화 시그널을 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 인식되는 제2 항원에 특이적으로 결합시, 면역세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는, 예컨대 키메라 공동자극 수용체와 같은 제2의 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 시그널링 성분을 포함한다. 몇몇 측면에서, 제2 수용체는 공동자극 수용체 예컨대 CD28, CD137 (4-1 BB), OX40, 및/또는 ICOS의 세포내 시그널링 도메인을 포함한다.
[0155] 몇몇 구체예에서, 제1 수용체에 의해 유도되는 활성화는 면역 응답의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM-매개된 시그널 형질도입 캐스케이드의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체(예컨대 CD4 또는 CD8 등) 근방의 분자 클러스터링, 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성화, 및/또는 예컨대 시토카인과 같은 인자의 유전자 발현 유도, 증식 및/또는 생존을 초래하는 세포에서의 단백질 발현의 시그널 형질도입 또는 변화와 연관된다.
[0156] 몇몇 구체예에서, 제1 수용체에 의해 유도되는 시그널과 조합된, 제2 수용체에 의해 유도되는 공동자극 시그널은 면역 응답, 예컨대 강건하고 지속적인 면역 응답, 예컨대 증가된 유전자 발현, 시토카인 및 기타 인자의 분비, 및 T 세포 매개된 이펙터 기능 예컨대 세포 살해 기능을 초래하는 것이다.
[0157] 몇몇 구체예에서, 제1 수용체 단독 접합이나 또는 제2 수용체 단독의 접합에 의해서는 강건한 면역 응답이 유도되지 않는다. 몇몇 측면에서, 오직 하나의 수용체가 접합되면, 그 세포가 관용화되거나(tolerized) 또는 그 항원에 비응답성이 되거나, 또는 억제되고, 및/또는 증식을 유도하지 않거나 또는 분비 인자 또는 이펙터 기능을 수행하지 않는다. 그러나 이러한 몇몇 구체예에서, 복수개의 수용체가 접합될 경우, 예컨대 제1 항원과 제2 항원을 발현하는 세포와 마주칠 시, 소망되는 응답, 예컨대 하나 이상의 시토카인의 분비, 증식, 지속, 및/또는 예컨대 표적 세포의 세포독성 살해와 같은 면역 이펙터 기능의 수행이 가리키는 바와 같이, 완전한 면역 활성화 또는 자극과 같은 소망되는 응답이 달성된다.
[0158] 몇몇 구체예에서, 예컨대 제1 및 제2 항원들과 같은 복수개의 항원이 예컨대 암세포와 같은, 표적화될 세포, 조직 또는 질병이나 병태에서 발현된다. 몇몇 측면에서, 상기 세포, 조직, 질병 또는 병태는 다발골수종 또는 다발골수종 세포이다. 하나 이상의 복수개의 항원은 일반적으로 세포 요법으로 표적화시키는 것이 요망되지 않는 세포 에컨대 정상세포 또는 비질병 세포 또는 조직, 및/또는 조작된 세포 자신에서도 발현된다. 이러한 구체예에서는, 세포의 응답을 달성하기 위해 복수개의 수용체의 접합을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
[0159] 몇몇 구체예에서, 다중-표적화 전략용 항원들의 조합에는, 항원들 중 적어도 하나가 범종양 항원, 예컨대 hTERT, 서바이빈, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1)인 조합이 포함되며, 상기 항원들 각각은 개별적으로 종양에서 발현되는 항원도 표적화하는 제2 항원과 조합되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 범종양 항원 및 제2 항원은 동일한 유형의 종양에서 항원을 표적화한다. 몇몇 구체예에서, 제2 항원은 또 다른 상이한 범종양 항원일 수 있거나 또는 그 종양 유형에 특이적인 종양 항원일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 제2 항원은 종양 항원, 예컨대 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 테아 아세토콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, kappa 경쇄, Lewis Y, L1-cell adhesion molecule, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D Ligands, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, Wilms Tumor 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 바이오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현되는 분자일 수 있다.
[0160] 몇몇 구체예에서, 다중-표적화 전략을 위한 항원들의 조합에는 다발골수종에서 발현되는 것들, 예컨대 CD38 (시클릭 ADP 리보오스 가수분해효소), CD138 (신데칸-1, 신데칸, SYN-1), 및 CS-1 (CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24)이 포함되며, 이들은 역시 다발골수종에서 발현되는 제2 항원과 개별적으로 조합된다. 몇몇 구체예에서, 복수개의 항원, 예컨대 활성화 및 공동자극 조작된 수용체에 의해 각각 인식되는 항원들은 CD38 및 CD138, CD38 및 CS-1, CD138 및 CD38, CD138 및 CS-1, CS-1 및 CD38, 및/또는 CS-1 및 CD138이다. 부가적인 다발골수종-특이 항원에는 CD20, CD40, CD56, CD74, CD200, EGFR, BCMA, 및 β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1, 및 IIA형 액티빈 수용체 (ActRIIA)이 포함된다. [Benson 및 Byrd, Journal of Clinical Oncology, June 1, 2012, 30(16): 2013-15; Tao 및 Anderson, Bone Marrow Research, Volume 2011 (2011), Article ID 924058, 14 pages; Chu 등, Leukemia (26 September 2013) 2014 Apr;28(4):917-27; Garfall 등, Discov Med . 2014 Jan;17(91):37-46 참조]. 몇몇 구체예에서, 항원은 림프성 종양, 골수종, AIDS-관련 림프종, 및/또는 이식후 림프증식성 질환에 존재하는 것들, 예컨대 CD38을 포함한다.
[0161] 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 복수개의 항원 수용체들은 비교적 친화성이 낮은 그의 항원을 인식하거나 그에 결합한다. 몇몇 측면에서, 수용체는 해리 상수 (KD)가 적어도 약 10-8 M 이상 또는 적어도 약 10-7 M 이상 또는 적어도 약 10-6 M 이상 또는 적어도 약 10-5 M 이상, 및/또는 적어도 약 10-4 M 이상인 그의 항원에 결합한다. 이러한 몇몇 구체예에서, 항원에 대한 항원 수용체의 친화도가 상대적으로 낮을 경우, 복수개의 유전자 조작된 항원 수용체들 중 오직 하나의 접합에 의해서는 완전한 응답이 달성되지 않도록 하는데 도움이 된다. 몇몇 구체예에서, CD38-표적화 수용체는 예컨대, 미국특허 출원, 공개 No.: US20120189622 A1에 설명된 바와 같은 항원 결합 도메인, 예컨대 OKT10로 표시된 항체의 항원결합부(들) 및 상기 출원 표 1에 설명된 기타 항체의 항원결합부(들), 그리고 유사 또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체들의 항원결합부(들)을 포함한다.
[0162] 몇몇 구체예에서, 이들 2개의 수용체들은 세포에 대해 활성화 시그널과 억제 시그널을 각기 유도함으로써, 수용체들 중 하나가 그의 항원과 결합하면 세포를 활성화시키거나 응답을 유도하지만, 제2의 억제 수용체가 그의 항원에 결합하면 그 응답을 억압 도는 감쇠시키는 시그널이 유도된다. 활성화 CARs 및 억제 CARs 또는 iCARs의 조합을 예로 들 수 있다. 이러한 전략은, 예컨대, 활성화 CAR이 질병 또는 병태에서 발현되지만 정상 세포에서도 발현되는 항원과 결합하고, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되지만 질병 또는 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개 항원과 결합하는 경우에 이용가능하다.
유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
[0163] 또한 유전자 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 핵산, 조성물 및 키트가 제공된다. 몇몇 측면에서, 유전자 조작은 유전자 조작된 성분 또는 도입을 위한 기타 성분, 예컨대 유전자-파괴 단백질 또는 핵산을 인코딩하는 성분을 세포에 도입하는 것을 포함한다.
[0164] 몇몇 구체예에서, 유전자 전달은 먼저 세포 성장, 예컨대 T 세포 성장을 자극, 증식 및/활성화한 다음, 활성화된 세포를 형질도입하고, 배지에서 임상 적용에 충분한 숫자로 팽창시킴으로써 달성된다.
[0165] 어떤 맥락에서, 공동자극 인자(예컨대, 림포카인 또는 시토카인)의 과발현은 대상자에게 독성적일 수 있다. 그러므로, 어떤 맥락에서, 조작된 세포는 입양 면역요법에서 투여시, 생체내 음성 선택에 민감성으로 만드는 유전자 세그먼트를 포함한다. 예컨대 몇몇 측면에서, 세포는 이들이 투여되는 환자의 생체내 조건의 변화 결과 이들이 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택가능한 표현형은 투여된 물질 예컨대 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 야기될 수있다. 음성 선택가능한 유전자에는 간시클로비어 민감성을 부여하는 I형 단순포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-I TK) 유전자 (Wigler 등, Cell II :223, I977); 세포성 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRT) 유전자, 박테리아 시토신 데아미나제 (Mullen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))가 포함된다.
[0166] 몇몇 측면에서, 세포는 시토카인 또는 기타 인자의 발현을 촉진하기 위해 추가로 조작된다. 예컨대, 항원 수용체, 예컨대, CARs과 같이 유전자 조작된 성분들을 도입하는 다양한 방법이 공지이며 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법으로는 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 트랜스포존 및 전기영동과 같이, 바이러스를 통하여, 수용체를 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 것들이 포함된다.
[ 0167] 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예컨대 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 이용하여 세포 내로 전달된다. 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 에컨대 γ-레트로바이러스 벡터를 이용하여 T 세포 내로 전달된다 (예컨대, Koste 등 (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November; 29(11): 550-557 참조).
[0168] 몇몇 구체예에서, 레트로바이러스 벡터, 예컨대, a 레트로바이러스 벡터 derived from the 쥐의 멀로니 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐의 배아줄기세포 바이러스 (MESV), 쥐의 줄기세포 바이러스(MSCV), 골수 포커스 형성 바이러스(SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)을 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐의 레트로바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 레트로바이러스는 조류 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 일반적으로 양생(amphotropic) 바이러스인데 이는, 이들이 인간을 비롯한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 발현시키고자 하는 유전자는 레트로바이러스의 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 몇 가지 예시적인 레트로바이러스가 설명된 바 있다 (예컨대, 미국특허 Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller 및 Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등 (1991) Virology 180:849-852; Burns 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie 및 Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 참조).
[0169] 렌티바이러스 형질도입 방법이 알려져 있다. 이의 예시는 예컨대 문헌 [Wang 등 (2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; Cooper 등 (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등 (2009) Methods Mol Biol . 506: 97-114; 및 Cavalieri 등 (2003) Blood.　 102(2): 497-505]에서 찾아볼 수 있다.
[0170] 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 전기영동을 통해 T 세포에 전달된다 (예컨대, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 등 (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)을 통해 T 세포 내로 전달된다 (예컨대, Manuri 등 (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 등 (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang 등 (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에 유전자 물질을 도입 및 발현시키기 위한 기타 방법으로는 칼슘 포스페이트 형질도입(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 설명됨), 원형질 융합, 양이온성 리포좀-매개된 형질도입; 텅스텐 입자-보조된 마이크로 입자 충격법(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공침전법(Brash 등, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)을 들 수 있다.
[0171] 또 다른 구체예에서, 세포, 예컨대, T 세포는 재조합 수용체를 발현하기 위해 조작되는 것이 아니라, 특정 항원 특이성을 갖는 세포의 증식을 촉진하기 위해, 예컨대 인큐베이션 단계(들) 동안, 시험관내 또는 생체외에서 배양된 종양-주입 림프구 및/또는 T 세포와 같은, 소망되는 항원에 특이적인 자연발생적인 항원 수용체를 포함한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서는 예컨대 자가 종양 주입 림프구(TIL)과 같은 종양-특이 T 세포의 단리에 의해 입양세포를 위한 세포가 생산된다. 자가 종양 주입 림프구를 이용한 인간 종양의 직접 표적화는 몇몇 경우 종양 퇴행을 매개한다 (Rosenberg SA, 등(1988) N Engl J Med . 319:1676-1680 참조).　 몇몇 구체예에서, 림프구는 절제된 종양으로부터 추출된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 림프구는 시험관내에서 증폭된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 림프구는 림포카인(예컨대, IL-2)과 함께 배양된다.　몇몇 구체예에서, 이러한 림프구는 자가 종양 세포의 특이한 용해를 매개하지만 동종이계 종양 또는 자가 정상 세포의 용해는 매개하지 않는다.
[0172] 유전자 조작된 산물을 인코딩하는 유전자 조작된 핵산을 전달하기 위한 그 밖의 접근법과 벡터는 예컨대 국제 특허출원, 공개 No.: WO2014055668, 및 미국특허 No. 7,446,190에 개시되어 있다.
[0173] 부가적인 핵산들 중에서도, 예컨대, 도입을 위한 유전자로는 예컨대 전달된 세포의 생존능 및/또는 기능을 촉진함으로써 치료 효능을 향상시키는 것들; 예컨대 생체내 생존 또는 국소화를 위해, 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전 a자마커를 제공하기 위한 유전자; 예컨대 우세한(dominant) 양성 선택가능한 마커와 음성 선택가능한 마커를 융합시켜 유도된 이중기능성 선택가능한 융합 유전자의 사용에 관하여 설명된 문헌 [Lupton S. D. 등, Mol . 및 Cell Biol ., 11:6 (1991); 및 Riddell 등, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); see also the 공개s of PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601, Lupton 등 참조]에 설명된 바와 같이 생체내 음성 선택에 민감한 세포를 만들어냄으로써, 안정성을 향상시키는 유전자를 들 수 있다. 예컨대, Riddell 등, US 특허 No. 6,040,177, 컬럼 14-17 참조.
C. 유전자 발현, 활성 또는 기능의 진압
[0174] 제공된 면역 세포들에는 유전자 조작된 항원 수용체의 항원을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능이 세포 내에서 진압된 면역 세포가 포함된다. 몇몇 경우, 관심 대상의 특정 항원은 종양이나 암과 같은 질병 또는 병태에서 발현될 수 있지만, T 세포 또는 활성화된 T 세포와 같은 면역 세포에 의해서도 발현되는 것일 수 있다. 몇몇 측면에서, 면역 세포에 의한 항원의 발현은 예컨대 입양 면역치료법 관점과 같이, 면역 세포를 그 항원에 대한 유전자 조작된 항원 수용체를 이용하여 조작하는 관점에서 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 종양이나 암과 같은 질병 또는 병태에서 표적 항원에 특이적인 유전자 조작된 항원 수용체를 함유하고, 그 항원을 인코딩하는 세포 내 내인성 유전자의 파괴 또는 진압 역시도 함유하는, 예컨대 T 세포와 같은 면역 세포가 제공된다.
[0175] 또한 이러한 유전자 진압을 유발하는 방법도 제공된다. 몇몇 구체예에서, 유전자 진압은 예컨대 녹아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이, 예컨대 이중대립유전자 프레임쉬프트 돌연변이, 유전자 전부 또는 일부, 예컨대 하나 이상의 엑손 또는 그의 일부의 결실, 및/또는 녹-인(knock-in)과 같이, 유전자의 파괴를 유발함으로써 수행된다. 이러한 파괴는 몇몇 구체예에서 유전자의 서열 또는 그의 일부에 표적화되도록 특이적으로 설계된, DNA-결합 표적화 뉴클리아제 예컨대 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클리아제 (TALENs), 및 RNA-가이드된 뉴클리아제 예컨대 CRISPR-관련 뉴클리아제 (Cas)를 포함하는 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클리아제에 의해 유발된다.
[0176] 몇몇 구체예에서, 세포내 유전자의 진압 또는 파괴 방법은 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 세포내로 도입하는 방법을 수행하기 전, 이와 동시 또는 그 후에 수행될 수 있다. 예컨대, 몇몇 경우에서, 세포내 유전자의 진압 또는 파괴 방법은 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 전에 수행된다.
진압된/파괴된 유전자 (Repressed/Disrupted genes)
[0177] 몇몇 구체예에서, 진압된 및/또는 파괴된 유전자는 조작된 세포에 대해 억제 효과를 갖거나 기여할 수 있는, 예컨대 세포에 의한 면역 응답을 억제하는 산물을 인코딩한다. 예컨대, 몇몇 경우, 진압된 및/또는 파괴된 유전자는 예컨대 T 세포와 같은 면역 세포에서 발현되거나 발현되도록 계획된 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 인식되는 항원을 인코딩한다.
[0178] 몇몇 구체예에서, 유전자는 조작된 세포, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대, CAR 상에서 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합된 표적 항원을 인코딩한다. 따라서, 몇몇 측면에서, 진압되는 유전자는 CAR 또는 다른 항원 수용체의 표적 항원을 인코딩한다. 이러한 측면은 특정 질병 또는 병태에서 발현되지만 조작된 세포 유형 또는 그의 서브세트에서, 예컨대 그 조작된 세포의 활성화시 발현되는 표적 항원의 경우 일반적으로 발생한다. 예시적인 항원은 활성화 또는 자극된 T 세포 또는 NK 세포, 및 그의 서브세트, 특히 CAR 또는 다른 조작된 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입을 촉진하는데 사용되는 자극 조건에 의해 생산되는 활성화되니 세포에서 발현되는 것들이다. 몇몇 구체예에서, 조작된 세포 상의 항원 발현을 파괴 또는 달리 진압함으로써, 본 발명에 따라 제공된 방법 및 조성물은 조작된 세포 자신에 의해 조작된 세포가 살해될 가능성을 푀히 또는 감소시킴으로써 효능이 증강된다.
[0179] 몇몇 구체예에서, 유전자는 활성화 및/또는 공동자극 CAR 표적인 항원을 인코딩한다. 몇몇 구체예에서, 유전자는 두 개 이상의 유전자 조작된 항원 수용체를 이용하는 다중-표적화 전략의 표적(여기서 수용체들 중 적어도 하나는 예컨대 T 세포 또는 활성화된 T 세포와 같은, 면역 세포 상에서 발현될 수 있거나 발현되는 항원에 대해 특이적인 것임)인 항원을 인코딩한다.
[0180] 몇몇 구체예에서, 파괴되거나 그의 발현 또는 기능이 달리 진압되는 유전자는 범종양 항원, 특히 예컨대 T 세포 또는 활성화된 T 세포와 같은 면역 세포에서 발현되거나 상향조절된 범종양 항원을 인코딩하는 것이면 어느 것이든 무방하다. 몇몇 구체예에서, 파괴되거나 진압되는 유전자는 hTERT 또는 서바이빈을 인코딩하는 유전자이다. 몇몇 경우, 파괴 또는 진압되리 수 있는 그 밖의 예시적인 유전자로는 항원 MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1)을 인코딩하는 것들을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적화된 뉴클리아제는 hTERT, 서바이빈, p53 또는 기타 범종양 항원을 인코딩하는 유전자에 표적화된다. 몇몇 측면에서, 표적화는 세포내에서 hTERT, 서바이빈, p53 또는 그 밖의 표적화된 범종양 항원의 발현을 감소 또는 철폐하는 것과 같이, 유전자를 파괴한다.
[0181] 예컨대, 몇몇 구체예에서, hTERT, 서바이빈 MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1) 및 면역 세포에서 대응하는 내인성 유전자의 파괴 또는 발현을 함유하는 것들과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유하는 면역 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다. 몇몇 측면에서, hTERT 항원에 특이적으로 결합하고 세포내 대응하는 내인성 hTERT 유전자의 파괴 또는 진압을 함유하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유하는 면역 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다. 다른 측면에서, 서바이빈 유전자에 특이적으로 결합하고 세포내 대응하는 내인성 서바이빈 유전자의 파괴 또는 진압을 함유하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유하는 면역 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다.
[0182] 특정 구체예에서, 파괴되거나 또는 그의 발현 또는 기능이 달리 진압된 유전자는 예컨대, 항-CD38 조작된 수용체, 예컨대 항-CD38 CAR를 발현하는 세포에서, CD38을 인코딩한다. 달리 예시적인 유전자들에는 항원 CD33 및 TIM-3을 인코딩하는 것들이 포함된다. Mardiros 등, Blood 122 (18) (October 31, 2013) 참조. 그 밖의 예시적인 유전자들로는 항원 CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 및 CD362를 인코딩하는 것들을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적화된 뉴클리아제는 조작된 세포 상에서 CD38 유전자에 표적화된다. 몇몇 측면에서, 표적화는 CD38 유전자를 파괴, 즉 조작된 세포 상에서 CD38의 발현을 감소 또는 철폐한다. 몇몇 측면에서, CD38 항원에 특이적으로 결합하고 세포 내에서 대응하는 내인성 CD38 유전자의 파괴 또는 진압을 함유하는 유전자 조작된 항원 수용체를 함유하는 면역 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다.
[0183] 몇몇 구체예에서, 유전자는 억제성 CAR 표적이다. 예컨대, 억제성 CAR에 결합하는 항원 관점에서, 유전자 파괴는 어떤 맥락에서 조작된 세포 자신에 의해 발현되는 분자가 그 조작된 세포의 응답에 대한 감쇠 효과를 유도할 가능성을 방지하거나 감소시킨다. 이러한 항원의 예로는 정상 또는 비-표적화 또는 오프-표적 세포에서 발현되지만 (그에 따라 억제성 CAR 분자가 오프-표적 효과를 방지하도록 포함됨), 예컨대 T 세포 또는 NK 세포와 같이, 유전자 조작에 사용되는 세포 유형에서도 발현되는 것들을 들 수 있다. 예시적인 항원으로는, 몇몇 경우 면역 회피, 암 또는 감염 관점에서 하향조절될 수 있으나, 일반적으로는 유핵 세포에서 발현되는 MHC 분자, 예컨대 MHC-클래스 I 분자를 들 수 있다. 그 밖의 예로는 T 세포, NK 세포, 또는 세포 치료를 위해 조작된 그 밖의 세포에서도 발현되는 여하한 억제성 CAR 표적을 들 수 있다.
[0184] 몇몇 구체예에서, 유전자는 조작된 세포의 활성화 또는 자극 또는 기타 이펙터 기능, 예컨대 하나 이상의 인자를 증식, 생존 분비하는 그의 능력 또는 조작된 항원 수용체를 경유한 결합에 응답하여 세포 사멸을 수행하거나 동원하는 능력을 감쇠 또는 예방하는 공동억제 분자 또는 기타 산물을 인코딩한다.
[0185] 몇몇 구체예에서, 진압된 유전자는 면역계를 억압하는 단백질을 인코딩한다. 몇몇 구체예에서, 상기 진압은 면역계에서 유전자 산물의 억압 효과를 감소시킨다. 몇몇 측면에서, 이것은 종양 세포에 대한 면역 응답을 증가시킨다. 몇몇 구체예에서, 유전자는 아데노신 수용체, 예컨대 A2AR을 인코딩한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, A2AR의 발현, 활성 및/또는 기능이 진압된다.
유전자 진압을 위한 기술
[0186] 몇몇 구체예에서, 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 진압은 그 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 몇몇 측면에서, 유전자는 그 유전자의 파괴 부재시의 발현 또는 파괴를 유발하도록 도입된 성분들의 부재시의 발현에 비해 그의 발현이 적어도 약 20, 30, 또는 40%, 일반적으로 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소되도록 파괴된다.
[0187] 몇몇 구체예에서, 유전자 파괴는 일반적으로 표적화된 방식으로, 유전자 내에서 하나 이상의 이중가닥 파단(breaks) 및/또는 하나 이상의 단일가닥 파단을 유도함으로써 수행된다. 몇몇 구체예에서, 이중가닥 또는 단일가닥 파단은 뉴클리아제, 예컨대 엔도뉴클리아제, 예컨대 유전자-표적화된 뉴클리아제에 의해 만들어진다. 몇몇 측면에서, 파단은 예컨대 엑손에서와 같이 유전자의 코딩 영역에서 유도된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 유도는 유전자의 코딩 영역의 N-말단 부분 근방, 예컨대 엑손에서 유도된다.
[0188] 몇몇 측면에서, 이중가닥 파단 또는 단일가닥 파단은 예컨대 비상동성 말단-결합(non-homologous end-joining: NHEJ) 또는 상동성-지향된 복구(homology-directed repair: HDR)를 통해 복구를 수행한다. 몇몇 측면에서, 복구 과정은 오류가 일어나기 쉬워 유전자의 파괴, 예컨대 유전자의 완전한 녹아웃을 야기할 수 있는, 예컨대 이중대립유전자 프레임쉬프트 돌연변이와 같은 프레임쉬프트 돌연변이를 초래한다. 예컨대, 몇몇 측면에서, 파괴는 결실, 돌연변이 및/또는 삽입 유도를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 파괴는 조기 종결 코돈의 존재를 초래한다. 몇몇 측면에서, 삽입, 결실, 전좌, 프레임쉬프트 돌연변이, 및/또는 조기 종결코돈의 존재는 그 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 진압을 초래한다.
[0189] 몇몇 구체예에서, 진압은 일시적 또는 가역적임으로 해서, 그 유전자의 발현이 나중에 복구된다. 또 다른 구체예에서 진압은 가역적이거나 일시적이 아닌, 예컨대 영구적인 것이다.
[0190] 몇몇 구체예에서, 유전자 진압은 안티센스 기술을 이용하여, 예컨대 RNA 간섭 (RNAi), 짧은 RNA 간섭 (siRNA), 짧은 헤파린 (shRNA)에 의해 달성되며, 및/또는 유전자를 선택적으로 업악 또는 진압하기 위해 리보자임이 이용된다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사된 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상동적인 서열을 갖는 이중가닥 RNA 분자를 이용하는 RNAi에 기초하고, 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 이용한다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사되는 mRNA의 하나의 영역과 상동적/상보적이거나, 또는 상이한 영역과 상동적/상보적인 복수개의 RNA 분자들을 포함하는 siRNA일 수 있다.
DNA- 표적화 분자 및 복합체들; 표적화된 엔도뉴클리아제들
[0191] 몇몇 구체예에서, 진압은 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는, DNA-표적화 분자, 예컨대 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산 또는 복합체, 화합물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용하여 달성된다. 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예컨대, 아연 핑거 단백질(ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성화제-유사 단백질(TAL) 또는 TAL 이펙터 (TALE) DNA-결합 도메인, 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 반복체(CRISPR) DNA-결합 도메인, 또는 메가뉴클리아제로부터의 DNA-결합 도메인을 포함한다.
[0192] 아연 핑거, TALE, 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예컨대 자연발생적인 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 헬릭스 영역의 조작(하나 이상의 아미노산을 변경)을 통해, 소정의 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작될" 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 핑거 또는 TALE)은 자연발생적인 것이 아닌 단백질이다. 합리적인 설계 기준에는 기존의 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보 중의 정보를 가공하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화 알고리듬의 적용이 포함된다. 예컨대, 미국특허 Nos. 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 U.S. 공개 No. 20110301073 참조.
[0193] 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자, 복합체, 또는 조합은 DNA-결합 분자 및 하나 이상의 부가적인 도메인, 예컨대 유전자의 진압 또는 파괴를 용이하게 해주는 이펙터 도메인을 함유한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 유전자 파괴는 DNA-결합 단백질 및 그의 이종 조절 도메인 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다. 몇몇 측면에서, 도메인은 예컨대, 전사 인자 도메인, 예컨대, 활성화제, 리프레서, 공동-활성화제, 공동-리프레서, 사일렌서, 종양유전자, DNA 복구 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형제, DNA 재배열 효소 및 이의 관련인자 및 변형제, 크로마틴 관련 단백질 및 이의 변형제, 예컨대 키나아제, 아세틸라제 및 데아세틸라제, 및 DNA 변형 효소, 에컨대 메틸트랜스퍼라제, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가아제, 키나아제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클리아제, 및 이들의 관련 인자 및 변형제를 포함한다. 예컨대, DNA-결합 도메인 및 뉴클리아제 절단 도메인과 관련하여서는 본 발명에 내용 전체가 참조 통합된 미국특허 출원 공개 Nos. 20050064474; 20060188987 및 2007/0218528 참조. 몇몇 측면에서, 부가적인 도메인은 뉴클리아제 도메인이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 유전자 파괴는 조작된 단백질, 비특이적 DNA-절단 분자 예컨대 뉴클리아제와 융합되거나 복합된 서열-특이적인 DNA-결합 도메인으로 구성된, 예컨대 뉴클리아제 및 뉴클리아제-함유 복합체 또는 융합 단백질을 이용한 유전자 또는 게놈 편집에 의해 용이하게 된다.
[0194] 몇몇 측면에서, 이들 표적화된 키메라 뉴클리아제 또는 뉴클리아제-함유 복합체들은 표적화된 이중가닥 파단 또는 단일가닥을 유도하고, 오류가 일어나기 쉬운 비상동성 말단 합류(NHEJ) 및 상동성-지향된 복구(HDR)를 포함하는 세포성 DNA-복구 메카니즘을 자극함으로써 정밀한 유전자 변형을 수행한다. 몇몇 구체예에서 뉴클리아제는 엔도뉴클리아제, 예컨대 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TALE 뉴클리아제 (TALEN), RNA-가이드된 엔도뉴클리아제 (RGEN), 예컨대 CRISPR-관련(Cas) 단백질, 또는 메가뉴클리아제이다.
[0195] 몇몇 구체예에서, 유전자 조작된 항원 수용체을 인코딩하는 도너 핵산, 예컨대, 도너 플라스미드 또는 핵산이 제공되며, DSB 도입 후에 유전자 편집 자리에 HDR이 삽입된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 유전자의 파괴 및 항원 수용체, 예컨대 CAR의 도입은 동시에 수행되며, 이에 따라 유전자는 CAR-인코딩 핵산의 녹-인(knock-in) 또는 삽입에 의해 부분적으로 파괴된다.
[0196] 몇몇 구체예에서는 도너 핵산이 제공되지 않는다. 몇몇 측면에서, DSB 삽입 후 NHEJ-매개된 복구에 의해, 예컨대 미스센스 돌연변이 또는 프레임쉬프트에 의해, 유전자를 파괴할 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이가 초래된다.
ZFPs 및 ZFNs ; TALs , TALEs , 및 TALENs
[0197] 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자는 이펙터 단백질 예컨대 엔도뉴클리아제에 융합된 DNA-결합 단백질 예컨대 하나 이상의 아연 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화제-유사 단백질 (TAL)을 포함한다. 이의 예에는 ZFNs, TALEs, 및 TALENs가 포함된다. Lloyd 등, Fronteirs in Immunology, 4(221), 1-7 (2013) 참조.
[0198] 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 아연-핑거 단백질 (ZFPs) 또는 그의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 그의 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는, 보다 큰 단백질 내 단백질 또는 도메인으로서, 결합 도메인 내 아미노사서열의 영역의 구조는 아연 이온과의 배위를 통해 안정화된다. 아연 핑거 DNA 결합단백질이라는 용어는 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
[0199] ZFP 중에는 개별 핑거들의 어셈블리에 의해 생성되는, 일반적으로 9-18 뉴클레오타이드 길이의, 특이적인 DNA 서열에 표적화하는 인공적인 ZFP 도메인인이 있다
[0200] ZFP에는 단일 핑거 도메인이 약 30 아미노산 길이이고 아연을 통해 단일 β 턴의 2개 시스테인과 배위된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하는 α 헬릭스를 함유하며, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 핑거를 갖는 것들이 포함된다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 아연 핑거 인식 헬릭스 상의 4개의 헬릭스 위치(-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 만듦으로써 변경되리 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 자연발생적인 것이 아니라, 예컨대 선택된 표적 부위에 결합되도록 조작된 것이다. 예컨대, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국특허 Nos. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국특허 공개 Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061 참조. 상기 문헌들은 그 내용 전체가 본 발명에 참조되었다.
[0201] 몇몇 측면에서, 유전자의 진압은 유전자 내 제1 표적 부위를 제1 ZFP와 접촉시켜, 유전자를 진압함으로써 수행된다. 몇몇 구체예에서, 유전자 중 표적 부위는 6개의 핑거 및 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질과 접촉됨으로써, 유전자의 발현이 억제된다.
[0202] 몇몇 구체예에서, 접촉 단계는 추가로 유전자 중 제2 표적 부위를 제2 ZFP와 접촉시키는 것을 더 포함한다. 몇몇 측면에서, 제1 및 제2 표적 부위는 인접해있다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 ZFP는 공유결합된다. 몇몇 측면에서, 제1 ZFP는 조절 도메인 또는 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 ZFP는 각각 조절 도메인을 포함하거나 또는 각각 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 구체예에서, 조절 도메인은 전사 리프레서, 전사 활성화제, 엔도뉴클리아제, 메틸 트랜스퍼라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 또는 히스톤 데아세틸라제이다.
[0203] 몇몇 구체예에서, ZFP는 프로모터에 작동적으로 연결된 ZFP 핵산에 의해 인코딩된다. 몇몇 측면에서, 이 방법은 핵산을 지질:핵산 복합체로 또는 네이키드 핵산으로서 세포에 먼저 투여하는 것을 더 포함한다. 몇몇 구체예에서, ZFP는 프로모터에 작동적으로 연결된 ZFP 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 인코딩된다. 몇몇 구체예에서, ZFP는 유도가능한 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산에 의해 인코딩된다. 몇몇 측면에서, ZFP는 약한(weak) 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산에 의해 인코딩된다.
[0204] 몇몇 구체예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 있다. 몇몇 측면에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접해 있다. 몇몇 측면에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 하류의 RNA 폴리머라제 포즈(pause) 부위에 인접해 있다.
[0205] 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합된 아연-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함하여, 아연-핑거 뉴클리아제 (ZFN)를 형성한다. 몇몇 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인) 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함하되, 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 절단 도메인은 IIS형 제한효소 엔도뉴클리아제 Fok I이다. Fok I은 일반적으로 한 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9번째 뉴클레오타이드 및 다른 가닥 상의 그의 인식부위로부터 13번재 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. [예컨대, 미국특허 Nos. 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; as well as Li 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등 (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등 (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. 참조]
[0206] 몇몇 구체예에서, ZFN은 조작된 세포에 존재하는 유전자를 표적화한다. 몇몇 측면에서, ZFN은 예컨대 유전자의 코딩 영역 내의 소정 부위에서, 이중가닥 파단(double strand break: DSB)을 효과적으로 생성한다. 표적화되는 일반적인 영역은 엑손, N-말단 영역을 인코딩하는 영역, 제1 엑손, 제2 엑손 및 프로모터 또는 인핸서 영역이다. 몇몇 구체예에서, ZFN의 일시적 발현은 조작된 세포에서 표적 유전자의 고도로 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진한다. 특히, 몇몇 구체예에서, ZFN의 전달은 50%를 상회하는 효율로, 유전자의 영구적인 파괴를 초래한다.
[0207] 유전자-특이적으로 조작된 많은 아연 핑거들이 상업적으로 구득가능하다. 예컨대, Sangamo Biosciences사 (Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)와 제휴하여 아연-핑거 구축을 위한 플랫폼(CompoZr)을 개발하였는데, 이에 따라, 연구자들은 아연-핑거 구축 및 검정을 모두 우회한채로 수천개의 단백질에 대한 아연 핑거를 특이적으로 표적화하는 것이 가능해졌다. Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. 몇몇 구체예에서, 시판되는 아연 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다. (예컨대, Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 CSTZFND, CSTZFN, CTI1-1KT, 및 PZD0020 참조).
TALEs 및 TALENs
[0208] 몇몇 구체예에서, DNA-표적화 분자는 자연발생적이거나 조작된(비자연발생적인) 전사 활성화제-유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을, 예컨대 전사 활성화제-유사 단백질 이펙터(TALE) 단백질 중에 포함한다. 예컨대, 그 내용이 본 발명에 참조된 미국특허 공개 No. 20110301073 참조.
[0209] TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/유닛을 포함하는 폴리펩타이드이다. 이 반복 도메인은 TALE을 그의 동계(cognate) 표적 DNA 서열에 결합시키는 것과 연관이 있다. 단일 "반복 유닛" ("반복체(repeat)"라고도 칭함)은 일반적으로 33-35 아미노산 길이이고, 자연발생적인 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 어느 정도 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 TALE 반복 유닛은 일반적으로 반복체의 12 및/또는 13 위치에서, Repeat Variable Diresidue (RVD)를 구성하는 1 또는 2개의 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE의 DNA 인식을 위한 천연(기본형) 코드는 12 및 13 위치에서의 HD 서열이 시토신 (C)에 대한 결합을, NG는 T에, NI는 A에, NN은 G 또는 A에, 그리고 NG는 T에 결합하는 것으로 결정되며, 비기본형(이례적) RVDs 역시도 알려져 있다. 미국특허 공개 No. 20110301073 참조. 몇몇 구체예에서, TALE은 표적 DNA 서열에 대해 특이성을 갖는 TAL 어레이를 설계함으로써 어떠한 유전자로든 표적화될 수 있다. 표적 서열일반적으로 티미딘으로 시작한다.
[0210] 몇몇 구체예에서, 분자는 DNA 결합 엔도뉴클리아제, 예컨대 TALE-뉴클리아제 (TALEN)이다. 몇몇 측면에서 TALEN은 TALE 로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 뉴클리아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 구체예에서, TALE DNA-결합 도메인은 표적 항원 및/또는 면역억압 분자를 인코딩하는 유전자 내에 표적 서열과 결합하도록 조작된 것이다. 예컨대, 몇몇 측면에서, TALE DNA-결합 도메인은 CD38 및/또는 아데노신 수용체, 예컨대 A2AR을 표적화할 수 있다.
[0211] 몇몇 구체예에서, TALEN은 유전자 내 표적 서열을 인식 및 절단한다. 몇몇 측면에서, DNA의 절단은 이중가닥 파단을 초래한다. 몇몇 측면에서 이러한 파단은 상동성 재조합 또는 비상동성 말단 합류(NHEJ) 속도를 촉진한다. 일반적으로, NHEJ는 절단 부위에서 종종 DNA 서열에 변화를 초래하는 불완전한 복구 프로세스이다. 몇몇 측면에서, 복구 메카니즘은 직접적인 재-접합을 통해 (Critchlow 및 Jackson, Trends Biochem Sci . 1998 Oct;23(10):394-8) 또는, 소위 미세상동성-매개된 말단 합류를 통한 2개의 DNA 말단의 나머지와의 재합류를 포함한다. 몇몇 구체예에서, NHEJ를 경유한 복구는 소규모 삽입 또는 결실을 야기하며 유전자를 파괴 및 그에 따라 진압하는데 이용가능하다. 몇몇 구체예에서, 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 몇몇 측면에서, 절단-유도된 돌연변이 이벤트, 즉 NHEJ 이벤트에 연속적인 돌연변이 이벤트가 일어난 세포를 기술분야에 공지인 방법에 의해 동정 및/또는 선택할 수 있다.
[0212] 몇몇 구체예에서, 유전자를 특이적으로 표적화하기 위해 TALE 반복체를 어셈블한다. (Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 18,740개의 인간 단백질-코딩 유전자를 표적화하는 TALEN의 라이브러리가 구축되었다 (Kim 등, Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)). 맞춤-설계된 TALE 어레이는 Cellectis Bioresearch사 (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals사 (Lexington, KY, USA), 및 Life Technologies사 (Grand Island, NY, USA)로부터 상업적으로 구득가능하다. 구체적으로, CD38을 표적화하는 TALEN이 시판되고 있다 (Gencopoeia, 카탈로그 번호 HTN222870-1, HTN222870-2, 및 HTN222870-3 참조, 인터넷 www.genecopoeia.com/product/search/detail.php?prt=26&cid=&key=HTN222870을 통해 이용가능). 예시적인 분자들이 예컨대 미국특허 공개 Nos. US 2014/0120622, 및 2013/0315884에 설명되어 있다.
[0213] 몇몇 구체예에서 TALENs은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 인코딩된 이식유전자(transgenes)로서 도입된다. 몇몇 측면에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터가 접수한 세포의 동정 및/또는 선택을 제공하는 선별 마커를 함유할 수 있다.
RGENs ( CRISPR / Cas 시스템)
[0214] 몇몇 구체예에서, 진압은 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 이용하여, 예컨대 RNA-가이드된 엔도뉴클리아제 (RGEN)을 경유한 파괴, 또는 다른 RNA-가이드된 이펙터 분자에 의한 다른 형태의 진압에 의해 수행된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 진압은 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-관련 (Cas) 단백질들을 이용하여 수행된다. Sander 및 Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355 참조.
[0215] 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예컨대 tracrRNA 또는 활성적인 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내인성 CRISPR 시스템 관점에서 "직접 반복체" 및 tracrRNA-가공된 부분 직접 반복체를 포괄함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 관점에서 "스페이서"라고도 칭함), 및/또는 CRISPR 위치로부터의 그 밖의 서열 및 전사체를 비롯하여, CRISPR-관련 ("Cas") 유전자를 발현하거나 그의 활성을 지시하는것과 관련된 전사체 및 기타 요소들을 집합적으로 지칭하는 것이다.
[0216] 몇몇 구체예에서, CRISPR/Cas 뉴클리아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클리아제 시스템은 서열-특이적으로 DNA에 결합하는 비코딩 RNA 분자 (가이드) RNA, 및 뉴클리아제 관능성 (예컨대, 2개의 뉴클리아제 도메인)와 함께 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)를 포함한다.
[0217] 몇몇 구체예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같이, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 생명체로부터 유래된다.
[0218] 몇몇 구체예에서, Cas 뉴클리아제 및 gRNA (표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합을 포함)는 세포 내로 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에서의 표적 부위는 상보적 염기쌍을 이용하여, 표적 부위, 예컨대 그 유전자에 Cas 뉴클리아제를 표적화한다. 몇몇 구체예에서, 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열, 일반적으로 NGG, 또는 NAG의 바로 5'에 인접한 그의 위치에 기반하여 선택된다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 대응하는 가이드 RNA의 최초 20개 뉴클레오타이드를 변형시킴으로써 소망되는 서열에 표적된다.
[0219] 몇몇 구체예에서, 전술한 바와 같이 CRISPR 시스템은 표적 부위에서 DSBs를 유도한 다음 파괴가 이어진다. 또 다른 구체예에서 "틈내기효소(nickases)"인 것으로 여겨지는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥에 틈(nick)을 내는데 이용된다. 몇몇 측면에서, 예컨대 한 쌍의 상이한 gRNAs 표적화 서열에 의해 각기 지향된, 쌍을 이룬 틈내기 효소가 특이성을 향상시키기 위해 사용되며, 이에 따라, 틈의 도입과 동시에, 5' 오버행이 도입된다. 또 다른 구체예에서 촉매적으로 불활성인 Cas9가 이종 이펙터 도메인 예컨대 전사 리프레서 또는 활성화제에 융합되어, 유전자 발현에 영향을 미친다.
[0220] 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소들에 의해 특징지어진다. 일반적으로, CRISPR 복합체의 관점에서, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 그에 대해 상보성을 r갖도록 설계된 서열을 가리키며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 상보성이 혼성화를 일으키기에 그리고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는데 충분한 경우라면, 완전한 상보성이 반드시 요구되지는 않는다.
[0221] 표적 서열은 여하한 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 몇몇 구체예에서, 표적 서열은 세포의 소기관 내에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 위치 내로의 재조합에 이용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"이라 칭해진다. 몇몇 측면에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형이라 칭해질 수도 있다. 몇몇 측면에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[0222] 일반적으로, 내인성 CRISPR 시스템 관점에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합된 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 내 또는 근방(예컨대 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 그 이상의 염기쌍 이내)의 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 절단을 초래한다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부(예컨대 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)로 구성되거나 이를 포함하는, tracr 서열 역시, 예컨대 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대해 tracr 서열의 적어도 일부를 혼성화시킴으로써, CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 몇몇 구체예에서, tracr 서열은 혼성화 및 CRISPR 복합체 형성에 참여하는 tracr 메이트 서열에 대해 충분한 상보성을 갖는다.
[0223] 표적 서열의 경우처럼, 몇몇 구체예에서, 완전한 상보성이 반드시 요구되지는 않는다. 몇몇 구체예에서, tracr 서열은 최적 정렬시 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 추진하는 하나 이상의 벡터가 세포에 도입됨으로 해서, CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시한다. 예컨대, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열, 및 tracr 서열은 각각, 별개 벡터들 상의 개별적인 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 별법으로, 같거나 다른 조절 요소들로부터 발현된 2개 이상의 요소들을, 단일 벡터에서, 제1 벡터에는 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 여하한 성분들을 제공하는 하나 이상의 부가적인 벡터와 조합시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 단일 벡터에서 조합되는 CRISPR 시스템 요소들은 어떠한 적절한 방향이든 배열될 수 있다. 예컨대 하나의 요소를 제2 요소의 5' ("상류") 또는 3' ("하류")에 위치시킬 수 있다. 한 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일 또는 반대 가닥에 위치할 수 있고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 단일 프로모터는 가이드 서열, tracr 메이트 서열 (임의로 가이드 서열에 작동적으로 연결됨), 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 매립된 tracr 서열 (예컨대 각각 다른 인트론 내에, 적어도 하나의 인트론 내에 2개 이상, 또는 단일 인트론 내에 모두) 중 하나 이상 및 CRISPR 효소를 인코딩하는 전사체의 발현을 추진한다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되어 그로부터 발현된다.
[0224] 몇몇 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대 제한효소 엔도뉴클리아제 인식 서열 ("클로닝 부위"라고도 칭해짐)을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 삽입 부위 (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 몇몇 구체예에서, 벡터는 tracr 메이트 서열의 상류, 및 임의로 tracr 메이트 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열의 하류에 삽입 부위를 포함함으로 해서, 그 삽입 부위 내로 가이드 서열의 삽입 및 발현시 가이드 서열이 진핵세포에서 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시한다. 몇몇 구체예에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위들을 포함하되, 이들 각각의 삽입 부위는 2개의 tracr 메이트 서열들 사이에 위치함으로 해서, 각 부위에 가이드 서열이 삽입될 수 있다. 이러한 배열에서, 2개 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열, 2 이상의 상이한 가이드 서열, 또는 이들의 조합의 2개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 복수개의 상이한 가이드 서열이 이용될 경우, 단일 발현 구조물을 이용하여 세포내 복수개의 상이한, 대응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화할 수 있다. 예컨대, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 그 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터들이 제공되어, 필요에 따라 세포에 전달될 수 있다.
[0225] 몇몇 구체예에서, 벡터는 예컨대 a Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csn1 및 Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체, 또는 그의 변형된 버젼을 들 수 있다. 이들 효소들은 공지이다; 예컨대, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열이 SwissProt 데이터베이스에서 수탁번호 Q99ZW2로 알려져 있다. 몇몇 구체예에서, 변형되지 않은 CRISPR 효소는 예컨대 Cas9와 같이 DNA 절단 활성을 갖는다. 몇몇 구체예에서 CRISPR 효소는 Cas9이고, S. 피오게네스 또는 S. 뉴모니에로부터의 Cas9일 수 있다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소는 표적 서열 위치, 예컨대 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 절단을 지시한다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 최초 또는 마지막 뉴클레오타이드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내에서 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 절단을 지시한다. 몇몇 구체예에서, 벡터는 대응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 인코딩하며 이에 따라, 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단하는 능력이 결여된다. 예컨대, S. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인 중 아스파테이트로부터 알라닌으로의 치환(D10A)은 두 가닥 모두를 절단하는 뉴클리아제로부터의 Cas9를 틈내기효소(nickase: 단일 가닥을 절단함)로 전환시킨다. 몇몇 구체예에서, Cas9 틈내기효소를, DNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 각기 표적화하는 2개의 가이드 서열들과 같은 가이드 서열(들)과 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 조합은 두 가닥 모두에 틈을 내줄 수 있어, NHEJ를 유도하는데 이용된다.
[0226] 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 예컨대 진핵세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 진핵세포는 특정 생물, 예컨대 비제한적인 예로서 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 비롯한 포유동물의 것이거나 그로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 그 이상의 코돈)을 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되면서 천연 아미노산 서열을 유지하는 코돈으로 대체시킴으로써 관심 대상인 숙주 세포에서 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 가리킨다. 다양한 종들이 특정 아미노산의 소정의 코돈에 대해 특정한 바이아스(bias)를 나타낸다. 코돈 바이아스(생물간 코돈 쓰임새의 차이)는 종종 메신저RNA (mRNA)의 번역 효율과 연관이 있고, 이는 다시 다른 무엇보다도, 번역되는 코돈의 성질 및 특정한 전달 RNA (tRNA) 분자의 이용능에 의존하는 것으로 믿어진다. 세포내에서 선택된 tRNAs의 우위는 일반적으로 펩타이드 합성시 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 코돈 최적화에 기반해서 주어진 생물에서 최적 유전자 발현을 위해 유전자를 재단할 수 있다. 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 그 이상의 코돈, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용된 코돈에 대응한다.
[0227] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하여 CRISPR 복합체의 표적 서열에 대한 서열-특이적 결합을 지시하는데 충분한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 상보성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열이면 어느 폴리뉴클레오타이드 서열이든 무방하다. 몇몇 구체예에서, 가이드 서열과 그의 대응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는, 적절한 정렬 알고리듬을 이용하여 최적 정렬된 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 그 이상이다.
[0228] Optimal alignment may be determined with the use of any suitable algorithm for aligning 서열s, non-limiting example of which include the Smith-Waterman algorithm, the Needleman-Wunsch algorithm, algorithms based on the Burrows-Wheeler Transform (예컨대 the Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (available at soap.genomics.org.cn), 및 Maq (available at maq.sourceforge.net). 몇몇 구체예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드이다. 몇몇 구체예에서, 가이드 서열의 길이는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 또는 그 이하의 뉴클레오타이드이다. CRISPR 복합체를 표적 서열에 서열-특이적으로 결합시키는 것을 지시하는 가이드 서열의 능력은 적절한 분석법에 의해 평가 가능하다. 예컨대, 테스트될 가이드 서열을 비롯하여, CRISPR 복합체를 형성하는데 충분한 CRISPR 시스템의 성분들이, 예컨대 CRISPR 서열의 성분들을 인코딩하는 벡터로 형질감염한 후, 예컨대 전술한 Surveyor 분석법에 의해, 표적 서열 내 우선적 절단을 평가함으로써, 대응하는 표적 서열을 갖는 세포에 제공될 수 있다. 마찬가지로, 표적 서열, 테스트하고자 하는 가이드 서열을 포함하여 CRISPR 복합체의 성분 및 테스트 가이드 서열과는 다른 컨트롤 가이드 서열을 제공하고, 테스트 가이드 서열과 컨트롤 가이드 서열 반응 간의 표적 서열에서의 결합 또는 절단률을 비교함으로써, 표적 뉴클레오타이드 서열의 절단을 평가할 수 있다.
[0229] 가이드 서열은 여하한 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내 서열이다. 예시적인 표적 서열에는 그 표적 게놈 내에서 유니크한 것들이 포함된다. 몇몇 구체예에서, 가이드 서열은 가이드 서열내 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 모종의 적절한 폴리뉴클레오타이드 폴딩 알고리듬에 의해 결정될 수 있다.
[0230] 일반적으로, tracr 메이트 서열은 tracr 서열에 대해 다음 중 하나 이상을 촉진하는데 충분한 상보성을 갖는 서열이면 어느 것이든 무방하다: (1) 대응하는 tracr 서열을 함유하는 세포내에서 tracr 메이트 서열에 의해 플랭킹된 가이드 서열의 절제; 및 (2) tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 표적 서열에서의 형성. 일반적으로, 상보성 정도는 tracr 메이트 서열와 tracr 서열의 2개 서열 중 길이가 짧은 서열을 따라, 이들 서열의 최적 정렬과 연관된다.
[0231] 최적 정렬은 적절한 정렬 알고리듬에 의해 결정될 수 있고, 예컨대 tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 내에서 예컨대 자가-상보성과 같은 2아 구조를 추가로 설명해줄 수 있다. 몇몇 구체예에서, tracr 서열과 tracr 메이트 서열 간의 상보성 정도는 최적 정렬시 이들 두 개 서열 중 짧은 길이에 대해 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 그 이상이다. 몇몇 구체예에서, tracr 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 몇몇 구체예에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 단일 전사체에 함유되어, 이들 두 가지 사이의 혼성화에 의해 예컨대 헤어핀과 같은 2차 구조를 갖는 전사체가 생성된다. 몇몇 측면에서, 헤어핀 구조에 사용되기 위한 루프 형성 서열은 4개 뉴클레오타이드 길이이고, 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 이보다 길거나 짧은 루프 서열들도 대체 서열이 그러하듯 이용가능하다. 몇몇 구체예에서, 서열은 삼중 뉴클레오타이드(예컨대, AAA), 및 부가적인 뉴클레오타이드 (예컨대 C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예에는 CAAA 및 AAAG가 포함된다. 몇몇 구체예에서, 전사체 또는 전사된 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 2개 또는 그 이상의 헤어핀을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 전사체는 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 전사체는 최대 5개의 헤어핀을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 단일 전사체는 추가로 전사 종결 서열, 예컨대 polyT 서열, 예컨대 6개의 T 뉴클레오타이드를 갖는다.
[0232] 몇몇 구체예에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(CRISPR 효소에 더해 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다, CRISPR 효소 융합 단백질은 여하한 부가적인 단백질 서열, 및 필요에 따라 여하한 2개의 도메인 사이에 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 다른 활성들 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 진압 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 들 수 있다. 리포터 유전자의 비제한적인 예로는, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광(CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 들 수 있다. CRISPR 효소는 DNA 분자 또는 기타 세포 분자, 비제한적인 예로서 말토스 결합 단백질 (MBP), S-tag, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체, 및 단순포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합체에 결합하는 단백질 또는 단백질 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CR ISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 부가적인 도메인들이 본 발명에 참조 통합된 US20110059502에 설명되어 있다. 몇몇 구체예에서, 태그된 CRISPR 효소를 이용하여 표적 서열의 위치를 동정한다.
[0233] 몇몇 구체예에서, 가이드 서열과 조합된 (그리고 필요에 따라 복합된) CRISPR 효소를 세포에 전달한다. 예컨대, CRISPR/Cas9 기술을 이용하여, 조작된 세포에서 표적 항원의 유전자 발현을 녹-다운시킬 수 있다. 예시적인 한 가지 방법에서, Cas9 뉴클리아제 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 mRNA에 의해 인코딩된 것, 예컨대 pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang 등 (2014) Science, 3:343-80-4; 또는 뉴클리아제 또는 틈내기효소 렌티바이러스 벡터, Applied Biological Materials (ABM; Canada) Cat. No. K002, K003, K005 또는 K006로서 이용가능함) 및 표적 항원 유전자에 특이적인 가이드 RNA를, 예컨대 렌티바이러스 전달 벡터 또는 기타 여러가지 공지 전달법 또는 세포에로의 전달용 비히클, 예컨대 Cas9 분자 및 가이드 RNA를 전달하기 위한 여러가지 공지 방법 또는 비히클을 이용하여 세포 내로 도입시킨다. 비특이적 또는 공벡터 컨트롤 T 세포 역시도 생성된다. 세포내 유전자 파괴를 평가하기 위한 몇몇 공지 분석법을 이용하여, 유전자의 녹아웃 정도(예컨대 전달 24 내지 72 시간 후)를 평가한다.
[0234] 범종양 항원의 녹아웃을 위한 시판되는 키트, gRNA 벡터 및 도너 벡터, 예컨대 MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1) 중 어느 하나 이상이 예컨대, Origene사 (Rockville, MD), GenScript사 (Atlanta, GA), Applied Biological Materials사 (ABM; Richmond, British Colombia), BioCat사 (Heidelberg, Germany) 또는 기타 업체로부터 구득가. 예컨대, CRISPR를 경유한 hTERT의 녹아웃을 위한 시판되는 키트에는, 예컨대 ABM사로부터 각기 구입가능한, 카탈로그 번호 K0009801, K0009802, K009803 및/또는 K0009804가 포함된다. CRISPR를 경유한 서바이빈의 녹아웃을 위한 시판되는 키트에는 예컨대 Origene사로부터 입수가능한 카탈로그 넘버 KN205935 및 ABMtkfhqnxj 각각 입수가능한 예컨대 카탈로그 번호 K0184401, K0184402, K0184403, K0184404가 포함된다. CRISPR를 경유한 Her2/neu의 녹아웃용 시판 키트에는 예컨대 Origene으로부터의 KN212583이 포함된다. CRISPR을 경유한 Cyp1B1의 녹아웃용 시판 키트에는 예컨대 BioCat사로부터 구득가능한 KN204074-OR이 포함된다. CRISPR을 경유한 WT1의 녹아웃용 시판 키트에는 예컨대 Origine사의 KN220079가 포함된다.
[0235] CRISPR을 경유한 CD38의 녹아웃용 시판 키트, gRNA 벡터 및 도너 벡터는 예컨대 OriGene사로붙어 구득가능하다. www.origene.com/CRISPR-CAS9/Product.aspx?SKU=KN203179; 카탈로그 번호 KN203179G1, KN203179G2, KN203179D 참조.
[0236] 몇몇 측면에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 진핵 세포에서 변형된다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 CRISPR 복합체로 하여금 표적 폴리뉴클레오타이드와 결합하도록 하여 상기 표적 폴리뉴클레오타이드의 절단을 유발함으로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 것을 포함하며, 여기서, CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 내 표적 서열과 혼성화하는 가이드 서열과 복합된 CRISPR 효소 복합체를 포함하고, 여기서 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열과 연결되어, 이번에는 tracr 서열에 혼성화한다.
[0237] 몇몇 측면에서, 이 방법은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 변형시키는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 CRISPR 복합체를 폴리뉴클레오타이드와 결합하는 것을 허용함으로서 상기 결합에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드의 증가 또는 감소된 발현을 초래하도록 하는 것을 포함하며; 여기서 CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오타이드 내에서 표적 서열과 혼성화하는 가이드 서열과 복합된 CRISPR 효소를 포함하되, 여기서 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고 이번에는 tracr 서열과 혼성화하게 된다.
분자 및 복합체들을 파괴하는 유전자를 인코딩하는 핵산의 전달
[0238] 몇몇 측면에서, DNA-표적화 분자, 복합체, 또는 조합을 인코딩하는 핵산을 세포에 투여 또는 도입한다. 핵산은 일반적으로 발현된 벡터, 예컨대 바이러스 발현 벡터의 형태로 투여된다. 몇몇 측면에서, 발현 벡터는 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, DNA 플라스미드 발현 벡터, 또는 AAV 발현 벡터이다. 몇몇 측면에서, 예컨대 DNA-표적화 분자와 같이, 파괴 분자 또는 복합체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달한다. 몇몇 측면에서, 이러한 전달은 하나 이상의 벡터, 하나 이상의 그의 전사체 및/또는 그로부터 전사된 하나 이상의 단백질의 전달에 의하고, 세포에 전달된다.
[0239] 몇몇 구체예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 세포내로의 도입 결과로서 세포에서 현장(in situ) 합성된다. 몇몇 측면에서, 폴리펩타이드는 세포 외부에서 생산된 다음 세포에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 구조물을 동물 세포 내로 도입하는 방법은 공지이며, 이의 비제한적인 예로는 폴리뉴클레오타이드 구조물을 세포의 게놈 내로 통합시키는 안정한 형질전환 방법, 폴리뉴클레오타이드 구조물이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 일시적인 형질전환 방법, 및 바이러스 매개 방법을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 재조합 바이러스 벡터(예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예컨대, 몇몇 측면에서, 일시적인 형질전환 방법은 마이크로인젝션, 전기영동 또는 입자 충격을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 세포 내에서의 발현을 고려하여, 벡터, 보다 구체적으로 플라스미드 또는 바이러스에 포함시킬 수 있다.
[0240] 몇몇 구체예에서, 바이러스 및 비-바이러스에 기반한 유전자 전달 방법을 이용하여 포유동물 세포 또는 표적 조직에서 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법은 CRISPR, ZFP, ZFN, TALE, 및/또는 TALEN 시스템의 성분들을 인코딩하는 핵산을 배양 중의 세포 또는 숙주 생물 내로 투여하는데 이용될 수 있다. 비-바이러스 벡터의 전달 시스템에는 DNA 플라스미드, RNA (예컨대 본문에 설명된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는 세포에 전달된 후 에피좀 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 유전자 치료법에 대하여는 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology 및 Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada 등, in Current Topics in Microbiology 및 Immunology Doerfler 및 Bohm (eds) (1995); 및 Yu 등, Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 검토할 수 있다.
[0241] 핵산의 비-바이러스 전달 방법에는 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로인젝션, 바이오리스틱스, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 폴리케이션 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA의 물질-증강 흡수가 포함된다. 리포펙션에 관해서는 예컨대 미국특허 Nos. 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355)에 기재되어 있고, 피로펙션 시약은 시판되고 있다 (예컨대, Transfectam™ 및 Lipofectin"). 폴리뉴클레오타이드의 효과적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온 및 중성 지질에는 Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024의 것들이 포함된다. 전달은 세포에 (예컨대 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직에 (예컨대 생체내 투여) 행할 수 있다.
[0242] 몇몇 구체예에서, 전달은 핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템을 이용한다. 몇몇 측면에서 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있고(생체내) 또는 이들은 시험관내 또는 생체외에서 세포를 처리하는데 이용된 다음 환자에게 투여된다. 몇몇 구체예에서 바이러스계 시스템에는 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순포진 바이러스 벡터가 포함된다.
[0243] 몇몇 측면에서, 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하기 위한 마커 역할을 하는 유전자 산물을 인코딩하기 위해, 비제한적인 예로서 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광(CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 들 수 있는 리포터 유전자를 세포에 도입할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자는 벡터를 통해 세포에 도입할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 유전자 산물은 루시페라제이다. 또 다른 구체예에서, 유전자 산물의 발현이 감소된다.
II. 조성물, 제형, 키트 , 장치, 방법 및 용도
[0244] 또한 세포, 세포 집단 및 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 조성물로는 의약 조성물 및 예컨대 입양 세포 치료를 위한 투여를 위한 제형이 포함된다. 또한 대상자, 예컨대 환자에게 세포 및 조성물을 투여하는 치료방법도 제공된다.
[0245] 예컨대 입양 세포 치료와 같은 치료 방법 및 용도를 포함하여, 세포의 용도 및 방법도 제공된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 방법은 질병, 병태, 또는 질환에 걸릴 위험이 있거나 걸린 것으로 의심되는 대상자, 조직 또는 세포에, 본 발명의 세포 또는 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 암 및 기타 질병, 병태 및 장애를 치료한다. 몇몇 구체예에서, 세포, 집단 및 조성물은 입양 세포 치료, 예컨대 입양 T 세포 치료를 통해, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 병태를 갖는 대상자에게 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포 또는 조성물은 대상자, 예컨대 질병 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상자에게 투여된다. 몇몇 측면에서, 이러한 방법은 예컨대 조작된 세포에 의해 인식된 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 경감시킴으로써, 질병이나 병태의 한 가지 이상의 증상을 예컨대 완화시키는 것과 같이 치료한다.
[0246] 입양세포 치료를 위한 세포의 투여 방법은 공지이며 제공된 방법 및 조성물과 연계하여 이용될 수 있다. 예컨대, 입양 T 세포 치료방법은 Gruenberg 등의 미국 특허출원 공개 No. 2003/0170238; Rosenberg의 미국특허 No. 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 설명되어 있다. 예컨대, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol . 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338 참조.
[0247] 몇몇 구체예에서, 세포 치료, 예컨대, 입양 T 세포 치료와 같은 입앙 세포 치료는 자가 전달에 의해 수행되는데, 이 방식에서는 세포가 세포 치료를 받을 대상자로부터 단리 및/또는 달리 제조되거나, 또는 샘플이 유래하는 대상자로부터 제조된다. 따라서, 몇몇 측면에서, 치료를 필요로 하는 예컨대 환자와 같은 대상자로부터 세포가 유래되고 상기 세포는 단리 및 프로세싱 후에 동일한 대상자에게 투여된다.
[0248] 몇몇 구체예에서, 세포 치료, 예컨대, 입양 T 세포 치료와 같은 입양 세포 치료는 동종이계 전달에 의해 수행되는데, 이 방식에서는 세포가 세포 치료를 받거나 궁극적으로 받게될 대상자가 아닌 다른 대상자, 예컨대 1차 대상자로부터 단리 및/또는 제조된다. 이러한 구체예에서, 세포는 상이한 대상자, 예컨대 동일한 종의 2차 대상자에게 투여된다. 몇몇 구체예에서, 1차 및 2차 대상자들은 유전적으로 동일하다. 몇몇 구체예에서, 1차 및 2차 대상자는 유전적으로 유사하다. 몇몇 구체예에서, 2차 대상자는 1차 대상자와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 발현한다.
[0249] 몇몇 구체예에서, 세포, 세포 집단, 또는 조성물이 투여되는 대상자 예컨대 환자는 포유동물, 전형적으로는 인간과 같은 영장류이다. 몇몇 구체예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상자는 남성 또는 여성일 수 있고 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상자를 비롯하여 연령 불문일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 대상자는 설치류와 같은 비영장류 포유동물이다. 몇몇 예에서, 환자 또는 대상자는 질병, 입양 세포 치료, 및/또는 예컨대 시토카인 분비 증후군(CRS)와 같은 독성 결과를 평가하기 위한, 검증된 동물 모델이다.
[0250] 이러한 방법에 사용되기 위한 의약 조성물도 제공된다.
[0251] 질병, 병태, 및 장애로는 종양, 예컨대 고체 종양, 혈액학적 종양 및 흑색종, 및 감염성 질환, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예컨대 HIV, HCV, HBV, CMV 감염, 및 기생충 질환을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 그 밖의 증식성 질환이다. 이러한 질환의 비제한적인 예로는 면역계의 암, 백혈병, 림프종, 예컨대, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), ALL, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발골수종, 난치성 소포 림프종, 외투세포 림프종, 무통형(indolent) B 세포 림프종, B 세포 종양, 결장, 폐, 간, 유방, 전립선, 난소, 피부(흑색종 포함)의 암, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 경추 암종, 결장직장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활막 육종, 및/또는 중피종을 들 수 있다. 일 구체예에서, 질병 또는 병태는 다발골수종이거나 이와 연관되어 있다.
[0252] 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 병태이며, 예컨대 비제한적인 예로서 바이러스 레트로바이러스, 박테리아 및 원생동물 감염, 면역결핍증, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스를 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 자가면역 또는 염증성 질환 또는 병태, 예컨대 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염(RA), I형 당뇨벙, 전신홍반루프스 (SLE), 염증성 잘징환, 건선, 공피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브씨 병, 크론시 병, 다발경화증, 천식, 및또는 이식과 관련된 질환 또는 병태이다.
[0253] 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 유전자 조작된 항원 수용체는 질병 또는 장애와 관련된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 몇몇 경우, 2 이상의 유전자 조작된 항원 수용체가 질병 또는 장애와 연관된 2 이상의 상이한 항원들에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 질병 또는 장애와 연관된 적어도 1종의 항원은 범종양 항원이다. 예컨대, 몇몇 경우 항원은 hTERT, 서바이빈, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, 리빈, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 또는 사이클린 (D1)이다. 예컨대, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈이다. 몇몇 구체예에서, 질병 또는 장애와 연관된 적어도 1종의 항원은 골수종 항원이다. 예컨대 몇몇 경우에서, 골수종 항원은 CD38, CD138, CS-1, CD56, TIM-3, CD33, CD123 또는 CD44이다. 예컨대, 골수종 항원은 CD38이다.
[0254] 몇몇 구체예에서, 질병 또는 장애와 연관된 1종 이상의 항원은 고아 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면항원, 항-엽산염 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-α2, kdr, κ 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D Ligands, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3 및/또는 바이오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현되는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항원에는 단백질, 탄수화물 및 기타 분자가 포함된다.
[0255] 몇몇 구체예에서, 세포 및 세포 집단은 조성물, 예컨대 의약 조성물의 형태로 대상자에게 투여된다. 몇몇 구체예에서, 의약 조성물은 다른 약학적 활성물질 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등을 부가적으로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 염, 예컨대 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여된다. 약학적으로 허용가능한 적절한 산 부가염에는 무기산, 예컨대 염산, 히드로브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산, 그리고 유기산, 에컨대 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴설폰산, 예컨대 p-톨루엔설폰산이 포함된다.
[0256] 몇몇 측면에서, 의약 조성물 중의 담체의 선택은 부분적으로는 특정 조작된 CAR 또는 TCR, 벡터, 또는 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포, 그리고 CAR을 발현하는 숙주 세포 또는 벡터를 투여하는데 사용되는 특정 방법에 따라 결정된다. 따라서, 적당한 제형이 다양하게 존재한다. 예컨대, 의약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제로는 예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 들 수 있다. 몇몇 측면에서는 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다.
[0257] 이에 더해, 몇몇 측면에서는 완충제가 조성물에 포함된다. 적절한 완충제의 예로는 구연산, 구연산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 기타 다양한 산 및 염으르 들 수 있다. 몇몇 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여가능한 의약 조성물의 제조 방법은 공지이다. 예시적인 방법이 예컨대 문헌[Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1 , 2005)]에 상세히 설명되어 있다.
[0258] 특정 구체예에서, 본문에 설명된 세포 집단을 포함하는 의약 조성물은 시클로덱스트린 봉입 복합체(inclusion compex)와 같은 봉입 복합체 또는 리포좀으로서 제형화된다. 리포좀은 숙주 세포(예컨대, T-세포 또는 NK 세포)를 특정 조직에 표적화시키는 기능을 할 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법이 다수 알려져 있으며, 예컨대 문헌 [Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), 및 미국특허 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369]에 설명되어 있다.
[0259] 몇몇 측면에서, 의약 조성물은 시간-방출형, 지연 방출 또는 서방형 전달 시스템을 이용할 수 있음으로 해서, 치료하고자 하는 부위의 감작화가 충분한 시간을 두고, 및 사전에 일어나도록 조성물이 전달된다. 이러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 회피시킬 수 있으므로, 대상자와 의사의 편의성을 제고해준다.
[0260] 몇몇 구체예에서, 의약 조성물은 세포를 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 포함한다. 몇몇 구체예에서 치료 또는 예방적 효능은 치료 대상자에 대한 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 병태에 따라 수일 또는 그 이상 반복 투여를 위해, 질병 증상의 소망되는 억제가 일어날 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투여법도 유용할 수 있으며 찾아볼 수 있다. 소망되는 투여량은 조성물의 단일 볼러스(bolus) 투여, 조성물의 복수회 볼러스 투여 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
[0261] 특정 구체예에서, 세포는 대상자에게 약 100만 내지 1천억 세포, 예컨대, 백만 내지 500억 세포 (예컨대 약 5백만 세포, 약 2천5백만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포, 또는 전술한 수치들 간의 여하한 범위), 예컨대 약 천만 내지 약 1천억 세포 (예컨대, 약 2천만 세포, 약 3천만 세포, 약 4천만 세포, 약 6천만 세포, 약 7천만 세포, 약 8천만 세포, 약 9천만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포 또는 전술한 수치들 간의 여하한 범위), 및 몇몇 경우 약 1억 세포 내지 약 500억 세포 (예컨대 약 1억 2천만 세포, 약 2억 5천만 세포, 약 3억 5천만 세포, 약 4억 5천만 세포, 약 6억 5천만 세포, 약 8억 세포, 약 9억 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포) 또는 전술한 수치 범위 사이의 모든 값의 범위로 투여된다.
[0262] 몇몇 구체예에서 세포 및 조성물은 표준 기술, 제형 및/또는 장치를 이용하여 투여된다. 조성물의 보관 및 투여를 위한 제형 및 장치, 예컨대 시린지 및 바이알이 제공된다. 투여는 동종 또는 이종일 수 있다. 예컨대, 한 대상자로부터 면역응답 세포 또는 전구세포(progenitors)를 수득하여 이를 동일 또는 상이한, 호환가능한 대상자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 말초혈액에서 유래하는 면역응답 세포 또는 그의 자손(예컨대 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소화된 주사를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물(예컨대 유전자 변형된 면역응답 세포를 함유하는 의약 조성물)을 투여하는 경우, 일반적으로 주사가능한 단위 투여 제형(용액, 현탁액, 에멀젼)으로서 제제화된다.
[0263] 몇몇 구체예에서 세포 집단 및 조성물은 표준 투여 기술, 예컨대 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협강내(buccal), 설하 또는 좌제 투여 경로로 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 비경구 투여된다. 본 발명에서 "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내 및 복강내 투여를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상자에게 투여된다.
[0264] 몇몇 구체예에서, 세포들의 조성물이 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 몇몇 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물에 비해 제조하기가 더 쉽다. 이에 더해, 액상 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 간편하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 장기간 접촉을 제공하기 위해 적절한 점도 범위를 갖도록 제제화될 수 있다. 액상 및 점성 조성물은 예컨대 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
[0265] 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 용매에 유전자 조작된 물질을 혼입시킴으로써 주사가능한 멸균 용액을 제조할 수 있다. 조성물은 동결건조될 수도 있다. 투여 경로 및 소망되는 제제에 따라 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등을 함유할 수 있다. 몇몇 측면에서 적절한 제제를 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
[0266] 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성과 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 이용함으로써 주사가능한 의약 형태를 장기간 흡수시킬 수 있다.
[0267] 몇몇 구체예에서 세포는 1종 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개재와 함께 동시에 또는 순서 무관하게 순차적으로 공동 투여된다. 어떤 맥락에서, 세포는 그 세포 집단이 1종 이상의 부가적인 치료제의 효과를 증강시키도록 또는 부가적인 치료제가 세포 집단의 치료 효과를 증강시키도록, 상기 부가적인 치료와 시기적으로 충분히 가까운 시간 내에 공동 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 1종 이상의 부가적인 치료제의 투여 전에 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 1종 이상의 부가적인 치료제의 투여 후에 투여된다.
[0268] 세포를 포유동물(예컨대 인간)에게 투여 후, 몇몇 측면에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성을 몇 가지 공지 방법에 의해 측정한다. 평가 파라미터에는 조작되거나 천연의 T 세포 또는 기타 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합이 포함된다 (영상화에 의해 생체내에서 또는 ELISA 또는 유세포분석법에 의해 생체외에서). 특정 구체예에서, 표적 세포를 파괴하는 조작된 세포의 능력은 기술분야의 적절한 공지 방법, 예컨대 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 설명된 세포독성 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포의 생물학적 활성은 특정한 시토카인, 예컨대 CD 107a, IFNγ, IL-2, 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 몇몇 측면에서 생물학적 활성은 임상 결과, 예컨대 종양 부담 또는 로드의 감소를 평가함으로써 측정된다.
[0269] 특정 구체예에서, 조작된 세포는 그의 치료 또는 예방적 효능이 증가되도록, 여러 방식으로 변형된다. 예컨대, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 표적화 부분에 컨쥬게이션될 수 있다. 화합물, 예컨대 CAR 또는 TCR을 표적화 부분에 컨쥬게이션시키는 것은 기술 분야에 공지이다. 예컨대, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국특허 5,087,616 참조.
III. 정의
[0270] 본 발명에서 유전자 발현의 "진압(repression)"은 진압이 부재하는 유전자 산물의 발현 수준에 비해, 세포내, 대상자의 유전자에 의해 인코딩된 1종 이상의 유전자 산물의 발현이 제거 또는 감소되는 것을 가리킨다. 유전자 산물의 예에는 유전자에 의해 인코딩된 mRNA 및 단백질 산물이 포함된다. 몇몇 경우 진압은 일시적 또는 가역적이고 다른 경우에는 영구적이다. 트렁케이티드 또는 비-트렁케이티드 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고, 몇몇 경우, 진압은 기능성 또는 전장 단백질 또는 mRNA의 진압이다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 유전자 활성 또는 기능은 발현과 반대로, 진압된다. 유전자 진압은 일반적으로 인공적인 방법, 즉 화합물, 분자, 복합체 또는 조성물의 부가 혹은 도입, 및/또는 핵산의 파괴 또는 예컨대 DNA 수준에서, 연관된 유전자의 파괴에 유도된다. 유전자 진압을 위한 예시적인 방법에는 유전자 침묵화, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예컨대 유전자 편집이 포함된다. 이의 예로는 일반적으로 일시적인 발현 감소를 야기하는 안티센스 기술, 예컨대 RNAi, siRNA, shRNA, 및/또는 리보자임, 뿐만 아니라, 예컨대 파단 및/또는 동종 재조합 유도에 의해, 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 야기하는 유전자 편집 기술을 들 수 있다.
[0271] 본 발명에서, 유전자의 "파괴(disruption)"라 함은 DNA 수준에서 유전자 서열의 변화를 가리킨다. 이의 예에는 삽입, 돌연변이 및 결실이 포함된다. 파괴는 일반적으로 그 유전자에 의해 인코딩된 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 진압 및/또는 완전한 부재를 야기한다. 이러한 유전자 파괴의 예로는 유전자 전체의 결실을 포함하여, 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임쉬프트 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹-인 및 녹-아웃을 들 수 있다. 이러한 파괴는 예컨대 하나 이상의 엑손과 같은 코딩 영역에서 발생하여, 전장 산물, 기능성 산물 또는 종결 코돈의 삽입과 같은 여하한 산물의 생산 불능을 초래할 수 있다. 이러한 파괴는 또한 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 미치는 기타 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있음으로 해서, 그 유전자의 전사가 방지된다. 유전자 파괴에는 동종 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 비롯한 유전자 표적화가 포함된다.
[0272] 본 발명에서, 단수 형태인 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수 개념을 포함한다. 예컨대, "a" 또는 "an"은 "적어도 1개" 또는 "1개 이상"을 의미한다.
[0273] 본 명세서 전반에 걸쳐, 청구 대상 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로서 표현되었다. 이러한 범위 포맷의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것일 뿐 청구대상 발명의 범위를 경직적으로 한정하려는 것은 아니다. 따라서, 범위 설명은 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라 그 범위 내에 속하는 개별적인 수치 값도 구체적으로 기재한 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 어떤 값의 범위가 제공된 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에 개재된 각각의 값들 및 명시된 범위 내의 달리 명시 또는 개재된 모든 값들 역시 청구대상발명에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 그 작은 범위에 독립적으로 포함되는 것일 수 있고, 또한 청구대상발명의 범위 내에 포괄되는 것이다. 명시된 범위가 이러한 한계의 일방 또는 양방 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 일방 또는 양방 모두를 제외한 범위 역시도 본 발명에 포괄된다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
[0274] 본 명세서에서 "약"이라는 용어는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 가리키는 것이다. 어떤 값 또는 파라미터에 대해 "약"이라는 표현이 사용될 경우 바로 그 값 또는 파라미터 자체에 지향된 구체예 역시도 포함(및 설명)하는 것이다.
[0275] 본 발명에서, 대상자는 살아있는 생명체, 이를테면 인간 및 기타 포유동물을 포함한다. 포유동물의 비제한적인 예로는 인간, 및 비인간 동물, 예컨대 농장동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물을 들 수 있다.
[0276] 본 발명에서, 조성물은 세포를 비롯하여 생성물, 물질 또는 화합물의 2 이상의 혼합물을 가리킨다. 이것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 조합일 수 있다.
[0277] 본 발명에서, "치료", "치료하다" 및 "치료하는" 이라는 용어는 질병이나 병태 또는 장애 또는 그와 관련된 증상, 유해 효과 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적 경감 또는 감소를 가리킨다. 특정 구체예에서, 그 효과는 치료적이며 이에 따라 질병이나 병태 또는 그에 기인한 유해 증상이 부분적으로 또는 완전히 치유된다.
[0278] 본 발명에서, 어떤 화합물 또는 조성물 또는 조합의 "치료적 유효량"이라 함은 이를테면 질병, 병태, 또는 장애의 치료와 같은 소망되는 치료적 결과를 달성하거나 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 달성하는 것을 가리키는데 효과적인 양을 가리킨다. 치료적 유효량은 대상자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 투여되는 세포 집단들에 따라 달라질 수 있다.
[0279] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성(positive)"라는 설명은 그 세포 상 또는 세포 내에 전형적으로는 표면 마커와 같은 특정 마커가 검출가능하게 존재함을 가리킨다. 표면 마커라는 용어는, 예컨대 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색하는 것에 의한, 유세포분석법에 의해 검출되는 표면 발현의 존재를 가리키는 것으로, 여기서 상기 염색은 이소형-맷칭된 대조군을 이용한 것을 제외하고는 동일 조건에서 동일한 공정 수행시 검출되는 염색 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서, 및/또는 그 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포의 수준과 실질적으로 동일한 수준에서, 및/또는 그 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포의 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포분석법에 의해 검출가능하다.
[0280] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성(negative)"라는 설명은 그 세포 상 또는 세포 내에 전형적으로는 표면 마커와 같은 특정 마커의 실질적으로 검출가능한 존재가 부재함을 가리킨다. 표면 마커라는 용어는, 예컨대 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색하는 것에 의한, 유세포분석법에 의해 검출되는 표면 발현의 부재를 가리키는 것으로, 여기서 상기 염색은 이소형-맷칭된 대조군을 이용한 것을 제외하고는 동일 조건에서 동일한 공정 수행시 검출되는 염색 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서, 및/또는 그 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포의 수준과 실질적으로 더 낮은 수준에서, 및/또는 그 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포의 수준과 비교시 실질적으로 유사한 수준에서는 유세포분석법에 의해서 검출되지 아니한다.
[0281] 몇몇 구체예에서, 하나 또는 마커의 발현 감소는 평균 형광 강도의 1 log10 손실을 가리키거나 및/또는 레퍼런스 세포 집단과 비교할 때 그 마커를 나타내는 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 및 상기 20%와 100% 사이의 여하한 값 만큼의 세포 백분율 감소를 가리키는 것이다. 몇몇 구체예에서, 하나 또는 마커에 대해 양성인 세포 집단은 레퍼런스 세포 집단에 비해, 그 마커를 나타내는 세포의 적어도 약 50% 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 백분율 및 상기 50%와 100% 사이의 여하한 %을 가리키는 것이다.
[0282] 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술용어, 해설 및 기타 기술 과학 용어는 본원발명이 속한 기술분야에서 통상의 기술자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우, 명확성과 참조의 간편성을 위해 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들을 본문에 정의하였는데, 본 명세서에 이러한 정의가 포함되었다 해서 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과의 실질적인 차이가 있는 것으로 상정될 필요는 없다.
[0283] 특허문헌, 과학논문 및 데이터베이스를 비롯하여 본 출원에서 참조된 모든 간행물은 그 각각의 간행물이 개별적으로 참조된 것과 같이, 동일한 정도로 모든 목적상, 그 내용 전체가 본 출원에 참조 통합된다. 만일 본 발명에서 제시된 정의가 본 발명에 참조 병합된 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 간행물에 제시된 것과 반대되거나 불일치할 경우, 본 발명에서 제시된 정의가, 참조를 위해 언급된 문헌 상의 정의보다 우선한다.
[0284] 본 명세서에서 사용된 섹션의 제목은 오직 조직적 목적을 위한 것일 뿐 설명된 내용을 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
IV. 예시적인 구체예
[0285] 특히 다음의 구체예가 제공된다:
1. 조작된 면역 세포로서:
표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체; 및
조작된 면역 세포에서 표적 항원의 발현 감소를 초래하는, 표적 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴
를 포함하는 조작된 면역 세포.
2. 구체예 1에 있어서, 표적 항원은 표면에서 발현되는 항원이거나 또는 휴지 T 세포, 활성화된 T 세포, 또는 양자 모두에 의한 것인 조작된 면역 세포.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 표적 항원은 암의 세포 표면에서 발현되는 것인 조작된 면역 세포.
4. 구체예 3에 있어서, 암은 혈액암, 면역암, 백혈병, 림프종, 및/또는 골수종인 것인 조작된 면역 세포.
5. 구체예 4에 있어서, 표적 항원은 다발골수종에서 발현되는 것인 조작된 면역 세포.
6. 구체예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 CD38인 것인 조작된 면역 세포.
7. 구체예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 CD33 또는 TIM-3이거나 또는 표적 항원은 CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 또는 CD362인 것인 조작된 면역 세포.
8. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 표적 항원은 암에서 발현되는 세포내 단백질 항원인 것인 조작된 면역 세포.
9. 구체예 8에 있어서, 표적 항원은 범종양 항원인 것인 조작된 면역 세포.
10. 구체예 9에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 조작된 면역 세포.
11. 구체예 9 또는 구체예 10에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 조작된 면역 세포.
12. 구체예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 세포.
13. 구체예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
14. 구체예 13에 있어서:
CAR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 세포.
15. 구체예 1-7에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
16. 구체예 1-2 및 8-11 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 세포.
17. 구체예 1-2 및 8-11 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 주요 조직적합 복합체 (MHC) 분자의 관점에서 표적 항원의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 TCR-유사 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
18. 구체예 1-17 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 세포에 대하여 활성화 시그널을 유도할 수 있는 것인 세포.
19. 구체예 18에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 모티프를 갖는 세포내 도메인을 포함하는 것인 세포.
20. 구체예 19에 있어서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 세포.
21. 구체예 18-20 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 수용체는 CAR 또는 TCR-유사 CAR이고 공동자극 시그널링 영역을 추가로 포함하는 것인 세포.
22. 구체예 21에 있어서, 공동자극 시그널링 영역은 CD28의 시그널링 도메인을 포함하는 것인 세포.
23. 구체예 1-22 중 어느 하나에 있어서, 다른 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인, 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 더 포함하는 것인 세포.
24. 구체예 23에 있어서, 표적 항원 및 상기 또 다른 항원은 서로 다르고, 각기 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인 세포.
25. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 표적 항원 인식시 세포에 대한 억제 또는 면역억압 또는 진압 시그널을 유도할 수 있는 것인 세포.
26. 구체예 25에 있어서, 항원은 암세포 또는 감염된 세포의 표면에서 발현되지 않거나 또는 그의 발현이 암세포 또는 감염된 세포에서 하향조절되는 항원인 세포.
27. 구체예 25 또는 구체예 26에 있어서, 항원은 MHC-클래스 I 분자인 것인 세포.
28. 구체예 25-27 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 세포.
29. 구체예 25-27 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
30. 구체예 29에 있어서, CAR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 면역 체크포인트 분자의 시그널링 부분을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 세포.
31. 구체예 30에 있어서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1 또는 CTLA4인 것인 세포.
32. 구체예 25-31 중 어느 하나에 있어서, 세포는 치료하고자 하는 질병 또는 병태에서 발현되는 항원을 인식하고, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 감쇠되는 자극 또는 활성화 시그널을 유도하는 부가적인 유전자 조작된 항원 수용체를 더 포함하는 것인 세포.
33. 구체예 1-32 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 조작된 세포의 세포 유형에서 자연적으로 발현되는 유전자 산물인 것인 세포.
34. 구체예 1-33 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포 중의 표적 항원의 발현은 상기 유전자 파괴 부재시의 면역 세포에서의 발현에 비해 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소되는 것인 세포.
35. 구체예 1-34 중 어느 하나에 있어서, 파괴는 유전자의 적어도 하나의 엑소의 적어도 일부의 제거를 포함하는 것인 세포.
36. 구체예 1-35 중 어느 하나에 있어서:
파괴는 유전자 내 조숙한 종결 코돈의 존재를 초래하는, 유전자 내 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함하고; 및/또는
파괴는 유전자의 제1 또는 제2 엑손 내 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함하는 것인 세포.
37. 구체예 1-36 중 어느 하나에 있어서, 면역세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것인 세포.
38. 구체예 37에 있어서, 면역세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것인 세포.
39. 구체예 1-38 중 어느 하나에 있어서, 세포는 유도된 다능성 줄기세포 (iPS 세포)인 것인 세포.
40. 구체예 1-39 중 어느 하나에 따른 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물
41. 질병 또는 병태를 갖는 대상자에게 구체예 1-39 중 어느 하나에 따른 세포 또는 구체예 40의 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
42. 구체예 41에 있어서, 질병 또는 병태는 다발골수종인 것인 방법.
43. 구체예 41 또는 42에 있어서, 상기 투여는 대상자에 있어서 질병 또는 병태의 한 가지 이상의 증상을 완화시키는 것인 방법.
44. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서:
(a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포에 도입하는 단계; 및
(b) 면역 세포에서 표적 항원의 발현의 진압을 유발함으로써, 상기 표적 항원의 발현이 진압된, 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 단계
를 포함하되,
상기 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 무관하게 순차적으로 수행되는 것인 방법.
45. 구체예 44에 있어서, (b) 단계의 유발은 표적 항원을 인코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하는 것인 방법.
46. 구체예 45에 있어서:
파괴는 유전자를 DNA 수준에서 파괴시키는 것을 포함하고 및/또는
파괴는 가역적인 것이 아니며; 및/또는
파괴는 일시적이지 않은 것인 방법.
47. 구체예 45 또는 46에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
48. 구체예 47에 있어서, 파괴는: (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클리아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드된 뉴클리아제를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
49. 구체예 48에 있어서, DNA-표적화 단백질 또는 RNA-가이드된 뉴클리아제는 유전자에 특이적인 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산 (CRISPR)을 포함하는 것인 방법.
50. 구체예 47-49 중 어느 하나에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 및 CRISPR-Cas9 조합의 도입을 포함하는 것인 방법.
51. 구체예 47-50 중 어느 하나에 있어서, 도입은 DNA-결합 단백질, DNA-결합 뉴클레오타이드, 및/또는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입함으로써 수행되는 것인 방법.
52. 구체예 51에 있어서, 핵산은 바이러스 벡터인 것인 방법.
53. 구체예 47-52 중 어느 하나에 있어서, 유전자에 대한 특이적 결합은 유전자의 엑손 내 및/또는 표적 항원의 N-말단을 인코딩하는 유전자의 부분 내에 존재하는 것인 방법.
54. 구체예 47-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입에 의해 유전자 내 프레임쉬프트 돌연변이 및/또는 유전자의 코딩 영역 내의 조기 종결 코돈의 삽입이 유발되는 것인 방법.
55. 구체예 44-54 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 면역 세포에서 자연 발생되는 유전자 산물 및/또는 그의 발현이 상기 유전자 조작된 항원 수용체의 상기 도입에 의해 유도되는 유전자 산물인 것인 방법.
56. 구체예 44-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 진압은 상기 진압 부재시 상기 방법에 의해 생산되는 조작된 세포에 비해, 조작된 면역 세포에서의 표적 항원의 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%까지 감소시키는 것인 방법.
57. 구체예 44-56 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 것인 방법.
58. 구체예 57에 있어서, 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것인 방법.
59. 구체예 44-58 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 표지 T 세포, 활성화된 T 세포, 또는 양자 모두에 의해 발현되는 항원인 것인 방법.
60. 구체예 44-59 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 다발골수종에서 발현되는 것인 방법.
61. 구체예 44-60 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 CD38인 것인 방법.
62. 구체예 44-59 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 암에서 발현되는 세포내 단백질 항원인 것인 방법.
63. 구체예 62에 있어서, 표적 항원은 범종양 항원인 것인 방법.
64. 구체예 63에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 방법.
65. 구체예 63 또는 구체예 64에 있어서, 범종양 항원은s hTERT 또는 서바이빈인 것인 방법.
66. 구체예 44-65 중 어느 하나에 있어서, 방법에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포는 구체예 1-39 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는 것인 방법.
67. 구체예 44-66 중 어느 하나에 있어서, 추가로:
(c) 다른 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계
를 더 포함하되, 단계 (a), (b) 및 (c)는 동시에 또는 순서와 무관하게 순차적으로 수행되는 것인 방법.
68. 구체예 67에 있어서, 유전자 조작된 세포는 구체예 25-32 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는 것인 방법.
69. 구체예 44-68 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)에서의 도입은 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산의 도입에 의해 수행되는 것인 방법.
70. 구체예 69에 있어서, 핵산은 바이러스 벡터인 것인 방법.
71. 구체예 44-70 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)이거나 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 방법.
72. 구체예 44-71 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
73. 구체예 44-72 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 생산되는 세포.
74. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38, CS-1, 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인, 조작된 면역 세포.
75. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인, 조작된 면역 세포.
76. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 제1 또는 제2 항원은 CS-1인 것인, 조작된 면역 세포.
77. 구체예 76에 있어서, 제2 항원은 다발골수종에서 발현되는 항원인 것인 조작된 면역 세포.
78. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 제1 항원 또는 제2 항원 중 적어도 하나는 범종양 항원인 것인, 조작된 면역 세포.
79. 구체예 78에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 조작된 면역 세포.
80. 구체예 78 또는 구체예 79에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 조작된 면역 세포.
81. 구체예 78-80 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 또는 제2 항원 중 다른 하나는 종양에서 발현되는 항원인 것인 조작된 면역 세포.
82. 구체예 74-81 중 어느 하나에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 서열을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
83. 구체예 82에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
84. 구체예 82 또는 구체예 83에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자로부터의 시그널링 도메인을 포함하지 않는 것인 조작된 면역 세포.
85. 구체예 74-84 중 어느 하나에 있어서, 공동자극 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 시그널링 도메인를 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
86. 구체예 85에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된 분자를 하나 이상 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
87. 구체예 74, 77 및 82-86 중 어느 하나에 있어서:
(a) 제1 항원은 CD38이고 제2 항원은 CD138;
(b)) 제1 항원은 CD38이고 제2 항원은 CS-1;
(c) 제1 항원은 CD138이고 제2 항원은 CD38;
(d) 제1 항원은 CD138이고 제2 항원은 CS-1;
(e) 제1 항원은 CS-1이고 제2 항원은 CD38;
(6) 제1 항원은 CS-1이고 제2 항원은 CD138인 것인, 조작된 면역 세포.
88. 구체예 74-87 중 어느 하나에 있어서, 제3 항원을 인식하는 제3의 유전자 조작된 항원 수용체를 더 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
89. 구체예 74-88 중 어느 하나에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 적어도 10-8 M, 적어도 10-7 M, 적어도 10-6 M, 적어도 10-5 M, 10-5 M, 또는 10-4 M의 해리 상수 (KD)에서 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 것인 조작된 면역 세포.
90. 구체예 74-89 중 어느 하나에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체의 접합 및 제2의 유전자 조작된 항원 수용체의 접합은 상기 유전자 조작된 항원 수용체 중 어느 하나 단독의 접합에 의해서는 유도되지 않는 응답을 세포에서 유도하는 것인, 조작된 면역 세포.
91. 구체예 90에 있어서, 상기 응답은 증식, 시토카인의 분비 및 세포독성 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조작된 면역 세포.
92. 구체예 74-91 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원을 인코딩하는 유전자, 및/또는 제2 항원을 인코딩하는 유전자에 파괴를 추가로 포함하되, 상기 파괴는 조작된 면역 세포에서 제1 및/또는 제2 항원의 발현 감소를 초래하는 것인 조작된 면역 세포.
93. 구체예 92에 있어서, 파괴된 유전자는 CD38을 인코딩하는 것인 조작된 면역 세포.
94. 구체예 92에 있어서, 파괴된 유전자는 범종양 항원을 인코딩하는 것인 조작된 면역 세포.
95. 구체예 92-94 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포 중 제1 및/또는 제2 항원의 발현은, 상기 유전자 파괴가 부재하는 면역 세포에서의 발현에 비해 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소되는 것인 조작된 면역 세포.
96. 구체예 92-95 중 어느 하나에 있어서:
파괴는 유전자의 적어도 엑손 부분의 결실을 포함하고;
파괴는 유전자 내 조기 종결 코돈의 존재를 초래하는, 유전자 내 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함하고; 및/또는
파괴는 유전자의 제1 또는 제2 엑손 내에 결실, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
97. 구체예 74-96 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것인 조작된 면역 세포.
98. 구체예 97에 있어서, 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이거나, 또는 iPS 세포인 것인, 조작된 면역 세포.
99. 구체예 74-98 중 어느 하나에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인, 조작된 면역 세포.
100. 구체예 99에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인, 조작된 면역 세포.
101. 구체예 74-100 중 어느 하나에 기재된 조작된 면역 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
102. 질병 또는 병태를 갖는 대상자에게 구체예 74-100 중 어느 하나에 기재된 조작된 면역 세포 또는 구체예 101의 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
103. 구체예 102에 있어서, 질병 또는 병태는 다발골수종인 것인 방법.
104. 구체예 102 또는 103에 있어서, 상기 투여는 대상자에서 질병 또는 병태의 한 가지 이상의 증상을 완화시키는 것인 방법.
105. 구체예 41-43 및 102-104 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체 또는 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
106. 구체예 105에 있어서, 질병 또는 병태는 암인 것인 방법.
107. 대상자에 있어서 질병 도는 병태를 치료하는데 사용되기 위한, 구체예 1-39 및 54-100 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는 의약 조성물 또는 구체예 40 또는 구체예 101의 의약 조성물.
108. 구체예 1-30 및 54-100 중 어느 하나의 세포 또는 구체예 40 또는 구체예 101의 세포를 포함하는 조성물의, 대상자에 있어서 질병 또는 병태를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 용도.
109. 유전자 조작된 항원 수용체 또는 수용체들이 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 구체예 107의 조성물 또는 구체예 108의 용도.
110. 질병 또는 병태는 암인 것인, 구체예 107-109 중 어느 하나의 조성물 또는 용도.
111. 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38, CS-1, 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되며, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
112. 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되며, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
113. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 제1 또는 제2 항원은 CS1-1이며 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
114. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 적어도 제1항원 또는 제2 항원은 범종양 항원이며 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
115. 구체예 114에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 방법.
116. 구체예 114 또는 구체예 115에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 방법.
117. 구체예 113-116 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 항원 중 다른 하나는 종양에서 발현되는 항원인 것인 방법.
118. 구체예 113-117 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)에서의 상기 도입 및/또는 단계 (b)에서의 상기 도입은 제1 및/또는 제2의 유전자 조작된 항원 수용체(들)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 면역 세포 내로 도입함으로써 수행되는 것인 방법.
119. 구체예 118에 있어서, 핵산(들)은 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
120. 구체예 113-119 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포에서 제1 및/또는 제2 항원의 발현의 진압을 유발하는 단계 (c)를 더 포함하는 방법.
121. 구체예 113-120 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포는 구체예 74-100 중 어느 하나의 세포를 포함하는 것인 방법.
122. 구체예 85에 있어서, 단계 (c)에서의 유발은 제1 또는 제2 항원을 인코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하는 것인 방법.
123. 구체예 122에 있어서:
파괴는 DNA 수준에서 유전자를 파괴하는 것을 포함하고 및/또는
파괴는 가역적인 것이 아니며; 및/또는
파괴는 일시적이지 않은 것인 방법.
124. 구체예 122 또는 123에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
125. 구체예 124에 있어서, DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산은: (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클리아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드된 뉴클리아제를 포함하는 것인 방법.
126. 구체예 125에 있어서, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산은 유전자에 특이적인 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산 (CRISPR)을 포함하는 것인 방법.
127. 구체예 124-126 중 어느 하나에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 및 CRISPR-Cas9 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
128. 구체예 124-127 중 어느 하나에 있어서, 도입은 DNA-결합 단백질, DNA-결합 뉴클레오타이드, 및/또는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입함으로써 수행되는 것인 방법.
129. 구체예 128에 있어서, 핵산은 바이러스 벡터인 것인 방법.
130. 구체예 124-129 중 어느 하나에 있어서, 유전자에 대한 특이적 결합은 유전자의 엑손 내 및/또는 표적 항원의 N-말단을 인코딩하는 유전자의 일부분 내에 존재하는 것인 방법.
131. 구체예 124-130 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입에 의해 유전자 내 프레임쉬프트 돌연변이 및/또는 유전자의 코딩 영역 내의 조기 종결 코돈의 삽입이 유발되는 것인 방법.
132. 구체예 111-131 중 어느 하나에 있어서, 상기 진압은 진압 부재시의 방법에 의해 생산되는 조작된 세포에 비해, 조작된 면역 세포 중의 표적 항원의 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소시키는 것인 방법..
133. 구체예 111-132 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 세포.
134. 청구항 1-39 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 파괴는 표적 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
135. 청구항 1-39 또는 청구항 134 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체를 발현하지만 유전자 파괴는 없는 세포에 비해, 세포가 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이하의 형제살해를 나타내는 것인 조작된 면역 세포.
136. 청구항 135에 있어서, 형제살해는 세포 생존능, 증식 또는 세포독성을 측정하는 방법에 의해 평가되는 것인 조작된 면역 세포.
V. 실시예
[0286] 다음의 실시예들은 오로지 설명 목적을 위해 포함되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 포함된 것이 아니다.
실시예 1: 내인성 hTERT 진압의 존재 또는 부재시 hTERT에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 조작된 T-세포의 세포독성 활성 평가
[0287] T 세포내 특정 힝원의 진압 및/또는 유전자 파괴 또는 녹아웃에 이어 상기 T 세포 내 또는 T 세포 상에서 발현되는 특정 항원에 특이적인 조작된 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 평가하기 위한 예시적인 연구를 수행한다. 이 예시적인 연구는 범종양 단백질 항원, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)의 발현을 파괴함으로써 수행된다. 또 다른 연구에서, 다른 관심 대상 항원 표적(이러한 항원을 인식하는 유전자 조작된 항원 수용체를 발현하는 세포에서), 예컨대 다른 범 단백질 항원(예컨대 서바이빈) 및/또는 T 세포 및/또는 활성화된 T 세포에서 자연적으로 발생되는 것(예컨대 CD38)을 비롯한 다른 관심 대상 항원을 파괴시킴으로써 유사한 방법을 수행한다.
[0288] 암에 걸린 대상자의 경우에서처럼, HLA-A*0201 대립유전자를 발현하는 대상자로부터의 인간 성분채집(apheresis) 산물의 샘플로부터 면역친화성-기반 선택에 의해 T 세포를 분리한다. 얻어진 세포를, 예컨대 37℃에서 72 시간 동안, IL-2 (100 IU/mL)의 존재 하에 항-CD3/항-CD28 시약을 이용하여 활성화시킨다.
[0289] CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 활성화된 T 세포에서 hTERT의 유전자 발현을 녹-다운시킨다. 예시적인 한 방법에서, Cas9 뉴클리아제 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 mRNA에 의해 인코딩된 것, 예컨대 pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang 등 (2014) Science, 3:343-80-4; 또는 뉴클리아제 또는 틈내기효소 렌티바이러스 벡터, Applied Biological Materials (ABM; Canada) Cat. No. K002, K003, K005 또는 K006로서 이용가능함) 및 hTERT 가이드 RNA (gRNA, 예컨대 ABM으로부터 입수가능한 예시적인 gRNA 벡터, Cat. No. K0009811)를예컨대 렌티바이러스 전달 벡터 또는 기타 여러가지 공지 전달법 또는 세포에로의 전달용 비히클, 예컨대 Cas9 분자 및 가이드 RNA를 전달하기 위한 여러가지 공지 방법 또는 비히클을 이용하여 세포 내로 도입시킨다. 비특이적 또는 공벡터 컨트롤 T 세포 역시도 생성된다. 세포내 유전자 파괴를 평가하기 위한 몇몇 공지 분석법을 이용하여, hTERT의 녹아웃 정도(예컨대 전달 24 내지 72 시간 후)를 평가한다.
[0290] CRISPR/Cas9 시스템을 형질도입으로부터 24 내지 96 시간 이내에, SEQ ID NOS: 7, 8 또는 10-14에 제시된 여하한 펩타이드에 특이적인 항체 결합 분자를 비롯하여, 예컨대 미국특허 No. 7,718,777에 설명된 바와 같은, HLA-A*0201 관점에서 hTERT-유래된 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는, hTERT 항원 수용체, 예컨대 T 세포 수용체 (TCR) 또는 항-hTERT 키메라 TCR-유사 항체 또는 그의 결합 단편(예컨대 scFv)를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 공벡터를 이용하여 세포(hTERT 녹-다운 및 대조군 세포)를 형질도입시킨다. 따라서, 다음과 같이 총 4개 그룹의 세포가 생성된다: 1) hTERT 녹아웃 (유전자 조작된 수용체 없음); 2) hTERT 녹아웃/유전자 조작된 hTERT-항원 수용체; 3) hTERT 야생형 T 세포/유전자 조작된 hTERT-항원 수용체; 및 hTERT 야생형 (유전자 쥬작된 수용체 없음) (대조군).
[0291] 도입 후, 예컨대 세포가 팽창하도록 일반적으로 37℃에서 세포들을 추가 배양하였다. 세포증식분석법, 크롬 분비 분석법, IFN-γ, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대한 ELISPOT 분석법 및/또는 세포 생존능에 대한 분석법, 예컨대 CellTiter-Glo
Figure pct00001
(CTG)-분석법 또는 세포의 증식, 생존능 및/또는 세포독성을 측정하는 다른 분석법을 수행함으로써 각 그룹의 배양체 내 세포의 항원-유도된 세포독성 및/또는 활성화를 평가한다. 세포의 세포독성을 생성된 세포의 다른 그룹의 것과 비교한다. 세포독성 또는 활성화 또는 기타 기능에 대한 양성 대조군으로서, hTERT를 발현하고 및/또는 세포에 의해 인식되는 그로부터 유래된 펩타이드를 제시하는 것으로 알려진 세포들을, 포함시켜, 평가된 조작된 세포의 hTERT-특이적 기능(들)을 확인한다.
[0292] 부가적인 연구에서, 다양한 병태 그룹의 세포들을 동물 대상자에게 투여하고 이들의 경시적인 지속성을 비교하여, 이러한 세포에 의한 자살에 미치는 녹아웃 효과 및 시간 경과에 따른 이러한 세포의 지속성 및 예컨대 종양 세포와 같은 표적 항원을 발현하는 표적화 세포에서의 효능을 평가한다.
[0293] 필요에 따라, 배양체 중 자살 잠재능을 회피시키거나 감소시키는 것으로 밝혀진, 전술한 바와 같은 동종 hTERT 녹아웃/ hTERT-항원 특이적 T 세포를 예컨대, 1 x 107 세포 내지 5 x 1010 세포의 투여량으로 대상자에게 투여하여, 암을 치료한다.
[0294] 본 발명은 본 명세서에 개시된 구체예 범위로 한정되지 않으며, 이들 구체예는 본 발명의 개별 측면을 단일 규명하기 위한 것으로, 이들 중 어느 것이든 본 발명의 범위 내에서 기능적으로 동등하다. 전술한 것에 더해, 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형이 가능함은 전술한 설명과 교시 내용으로부터 통상의 기술자에 자명할 것이며, 본 발명의 범위에 마찬가지로 속하는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 기타 구체예는 본 발명의 진정한 범위 및 정신을 일탈함이 없이 실시될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. MOHLER, Kendall M. LEVITSKY, Hyam I. <120> ENGINEERED CELLS FOR ADOPTIVE CELL THERAPY <130> 735042000540 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/025,006 <151> 2014-07-15 <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD38; GenBank: BAA18966 <400> 1 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 <210> 2 <211> 1494 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (108)...(1010) <223> CD38; GenBank NM_001775.2 <400> 2 agtgaaacag aaggggaggt gcagtttcag aacccagcca gcctctctct tgctgcctag 60 cctcctgccg gcctcatctt cgcccagcca accccgcctg gagccct atg gcc aac 116 Met Ala Asn 1 tgc gag ttc agc ccg gtg tcc ggg gac aaa ccc tgc tgc cgg ctc tct 164 Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys Arg Leu Ser 5 10 15 agg aga gcc caa ctc tgt ctt ggc gtc agt atc ctg gtc ctg atc ctc 212 Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val Leu Ile Leu 20 25 30 35 gtc gtg gtg ctc gcg gtg gtc gtc ccg agg tgg cgc cag cag tgg agc 260 Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser 40 45 50 ggt ccg ggc acc acc aag cgc ttt ccc gag acc gtc ctg gcg cga tgc 308 Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys 55 60 65 gtc aag tac act gaa att cat cct gag atg aga cat gta gac tgc caa 356 Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln 70 75 80 agt gta tgg gat gct ttc aag ggt gca ttt att tca aaa cat cct tgc 404 Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys 85 90 95 aac att act gaa gaa gac tat cag cca cta atg aag ttg gga act cag 452 Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln 100 105 110 115 acc gta cct tgc aac aag att ctt ctt tgg agc aga ata aaa gat ctg 500 Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu 120 125 130 gcc cat cag ttc aca cag gtc cag cgg gac atg ttc acc ctg gag gac 548 Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp 135 140 145 acg ctg cta ggc tac ctt gct gat gac ctc aca tgg tgt ggt gaa ttc 596 Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe 150 155 160 aac act tcc aaa ata aac tat caa tct tgc cca gac tgg aga aag gac 644 Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp 165 170 175 tgc agc aac aac cct gtt tca gta ttc tgg aaa acg gtt tcc cgc agg 692 Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg 180 185 190 195 ttt gca gaa gct gcc tgt gat gtg gtc cat gtg atg ctc aat gga tcc 740 Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser 200 205 210 cgc agt aaa atc ttt gac aaa aac agc act ttt ggg agt gtg gaa gtc 788 Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val 215 220 225 cat aat ttg caa cca gag aag gtt cag aca cta gag gcc tgg gtg ata 836 His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile 230 235 240 cat ggt gga aga gaa gat tcc aga gac tta tgc cag gat ccc acc ata 884 His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile 245 250 255 aaa gag ctg gaa tcg att ata agc aaa agg aat att caa ttt tcc tgc 932 Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys 260 265 270 275 aag aat atc tac aga cct gac aag ttt ctt cag tgt gtg aaa aat cct 980 Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro 280 285 290 gag gat tca tct tgc aca tct gag atc tga gccagtcgct gtggttgttt 1030 Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 295 300 tagctccttg actccttgtg gtttatgtca tcatacatga ctcagcatac ctgctggtgc 1090 agagctgaag attttggagg gtcctccaca ataaggtcaa tgccagagac ggaagccttt 1150 ttccccaaag tcttaaaata acttatatca tcagcatacc tttattgtga tctatcaata 1210 gtcaagaaaa attattgtat aagattagaa tgaaaattgt atgttaagtt acttcacttt 1270 aattctcatg tgatcctttt atgttattta tatattggta acatcctttc tattgaaaaa 1330 tcaccacacc aaacctctct tattagaaca ggcaagtgaa gaaaagtgaa tgctcaagtt 1390 tttcagaaag cattacattt ccaaatgaat gaccttgttg catgatgtat ttttgtaccc 1450 ttcctacaga tagtcaaacc ataaacttca tggtcatggg taaa 1494 <210> 3 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Telomerase reverse transcriptase (hTERT); GenBank NP_937983.2 <400> 3 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130 <210> 4 <211> 4018 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (59)...(3457) <223> telomerase reverse transcriptase (hTERT), GenBank NM_198253.2 <400> 4 caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcg 58 atg ccg cgc gct ccc cgc tgc cga gcc gtg cgc tcc ctg ctg cgc agc 106 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 cac tac cgc gag gtg ctg ccg ctg gcc acg ttc gtg cgg cgc ctg ggg 154 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac ccg gcg gct ttc cgc 202 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 gcg ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg ccg 250 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 ccc ccc gcc gcc ccc tcc ttc cgc cag gtg tcc tgc ctg aag gag ctg 298 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg 346 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 ctg gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gcc cgc ggg ggc ccc ccc 394 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 gag gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg acc 442 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ctg cgc cgc gtg 490 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg 538 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac 586 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 cag ctc ggc gct gcc act cag gcc cgg ccc ccg cca cac gct agt gga 634 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg 682 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc 730 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt 778 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg 826 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg 874 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg 922 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac 970 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct 1018 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc 1066 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 gac aag gag cag ctg cgg ccc tcc ttc cta ctc agc tct ctg agg ccc 1114 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc 1162 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag 1210 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac 1258 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga 1306 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag 1354 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg 1402 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc 1450 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc 1498 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc 1546 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg 1594 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 agc gtg cgg gac tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt 1642 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc 1690 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tct ttc 1738 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 ttt tat gtc acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctc ttt ttc tac 1786 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac 1834 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag 1882 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc 1930 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg 1978 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tcg 2026 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 agg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gcg cgg cgc 2074 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 ccc ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac agg 2122 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct 2170 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 gag ctg tac ttt gtc aag gtg gat gtg acg ggc gcg tac gac acc atc 2218 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag 2266 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat 2314 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac 2362 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc 2410 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat gag 2458 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac 2506 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggg atc ccg 2554 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc gac 2602 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc ctg 2650 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 cgt ttg gtg gat gat ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg 2698 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 aaa acc ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc 2746 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 gtg gtg aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag 2794 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 gcc ctg ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc 2842 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 ccc tgg tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc 2890 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 gac tac tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc 2938 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 aac cgc ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg 2986 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 gtc ttg cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac 3034 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 agc ctc cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag 3082 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 gcg tac agg ttt cac gca tgt gtg ctg cag ctc cca ttt cat cag caa 3130 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 gtt tgg aag aac ccc aca ttt ttc ctg cgc gtc atc tct gac acg gcc 3178 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 tcc ctc tgc tac tcc atc ctg aaa gcc aag aac gca ggg atg tcg ctg 3226 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 ggg gcc aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag gcc gtg cag tgg 3274 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 ctg tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act cga cac cgt gtc acc 3322 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca gcc cag acg cag ctg agt 3370 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act gcc ctg gag gcc gca gcc aac 3418 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag acc atc ctg gac tga tggccacccg 3467 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130 cccacagcca ggccgagagc agacaccagc agccctgtca cgccgggctc tacgtcccag 3527 ggagggaggg gcggcccaca cccaggcccg caccgctggg agtctgaggc ctgagtgagt 3587 gtttggccga ggcctgcatg tccggctgaa ggctgagtgt ccggctgagg cctgagcgag 3647 tgtccagcca agggctgagt gtccagcaca cctgccgtct tcacttcccc acaggctggc 3707 gctcggctcc accccagggc cagcttttcc tcaccaggag cccggcttcc actccccaca 3767 taggaatagt ccatccccag attcgccatt gttcacccct cgccctgccc tcctttgcct 3827 tccaccccca ccatccaggt ggagaccctg agaaggaccc tgggagctct gggaatttgg 3887 agtgaccaaa ggtgtgccct gtacacaggc gaggaccctg cacctggatg ggggtccctg 3947 tgggtcaaat tggggggagg tgctgtggga gtaaaatact gaatatatga gtttttcagt 4007 tttgaaaaaa a 4018 <210> 5 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BIRC5 (survivin) GenBank NP_001159 <400> 5 Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 1 5 10 15 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 20 25 30 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 35 40 45 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His 65 70 75 80 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu 85 90 95 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 100 105 110 Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 115 120 125 Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140 <210> 6 <211> 2655 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (122)...(550) <223> BIRC5 (survivin) GenBank NM_001168.2 <400> 6 cccagaaggc cgcggggggt ggaccgccta agagggcgtg cgctcccgac atgccccgcg 60 gcgcgccatt aaccgccaga tttgaatcgc gggacccgtt ggcagaggtg gcggcggcgg 120 c atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac 169 Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 1 5 10 15 cac cgc atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc 217 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 20 25 30 tgc acc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act 265 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 35 40 45 gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg 313 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 50 55 60 gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat 361 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His 65 70 75 80 tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta 409 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu 85 90 95 acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa 457 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 100 105 110 att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg 505 Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 115 120 125 gag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg gct gcc atg gat tga 550 Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140 ggcctctggc cggagctgcc tggtcccaga gtggctgcac cacttccagg gtttattccc 610 tggtgccacc agccttcctg tgggcccctt agcaatgtct taggaaagga gatcaacatt 670 ttcaaattag atgtttcaac tgtgctcttg ttttgtcttg aaagtggcac cagaggtgct 730 tctgcctgtg cagcgggtgc tgctggtaac agtggctgct tctctctctc tctctctttt 790 ttgggggctc atttttgctg ttttgattcc cgggcttacc aggtgagaag tgagggagga 850 agaaggcagt gtcccttttg ctagagctga cagctttgtt cgcgtgggca gagccttcca 910 cagtgaatgt gtctggacct catgttgttg aggctgtcac agtcctgagt gtggacttgg 970 caggtgcctg ttgaatctga gctgcaggtt ccttatctgt cacacctgtg cctcctcaga 1030 ggacagtttt tttgttgttg tgtttttttg tttttttttt tttggtagat gcatgacttg 1090 tgtgtgatga gagaatggag acagagtccc tggctcctct actgtttaac aacatggctt 1150 tcttattttg tttgaattgt taattcacag aatagcacaa actacaatta aaactaagca 1210 caaagccatt ctaagtcatt ggggaaacgg ggtgaacttc aggtggatga ggagacagaa 1270 tagagtgata ggaagcgtct ggcagatact ccttttgcca ctgctgtgtg attagacagg 1330 cccagtgagc cgcggggcac atgctggccg ctcctccctc agaaaaaggc agtggcctaa 1390 atccttttta aatgacttgg ctcgatgctg tgggggactg gctgggctgc tgcaggccgt 1450 gtgtctgtca gcccaacctt cacatctgtc acgttctcca cacgggggag agacgcagtc 1510 cgcccaggtc cccgctttct ttggaggcag cagctcccgc agggctgaag tctggcgtaa 1570 gatgatggat ttgattcgcc ctcctccctg tcatagagct gcagggtgga ttgttacagc 1630 ttcgctggaa acctctggag gtcatctcgg ctgttcctga gaaataaaaa gcctgtcatt 1690 tcaaacactg ctgtggaccc tactgggttt ttaaaatatt gtcagttttt catcgtcgtc 1750 cctagcctgc caacagccat ctgcccagac agccgcagtg aggatgagcg tcctggcaga 1810 gacgcagttg tctctgggcg cttgccagag ccacgaaccc cagacctgtt tgtatcatcc 1870 gggctccttc cgggcagaaa caactgaaaa tgcacttcag acccacttat ttctgccaca 1930 tctgagtcgg cctgagatag acttttccct ctaaactggg agaatatcac agtggttttt 1990 gttagcagaa aatgcactcc agcctctgta ctcatctaag ctgcttattt ttgatatttg 2050 tgtcagtctg taaatggata cttcacttta ataactgttg cttagtaatt ggctttgtag 2110 agaagctgga aaaaaatggt tttgtcttca actcctttgc atgccaggcg gtgatgtgga 2170 tctcggcttc tgtgagcctg tgctgtgggc agggctgagc tggagccgcc cctctcagcc 2230 cgcctgccac ggcctttcct taaaggccat ccttaaaacc agaccctcat ggctaccagc 2290 acctgaaagc ttcctcgaca tctgttaata aagccgtagg cccttgtcta agtgcaaccg 2350 cctagacttt ctttcagata catgtccaca tgtccatttt tcaggttctc taagttggag 2410 tggagtctgg gaagggttgt gaatgaggct tctgggctat gggtgaggtt ccaatggcag 2470 gttagagccc ctcgggccaa ctgccatcct ggaaagtaga gacagcagtg cccgctgccc 2530 agaagagacc agcaagccaa actggagccc ccattgcagg ctgtcgccat gtggaaagag 2590 taactcacaa ttgccaataa agtctcatgt ggttttatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2650 aaaaa 2655 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT peptide T540 HLA-A 0201 <400> 7 Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT peptide peptide T865 HLA-A 0201 <400> 8 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT325-333 HLA-A 0101 <400> 9 Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT615-624 HLA-A 0201 <400> 10 Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT674-683 HLA-A 0201 <400> 11 Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT540-548 HLA-A 0201 <400> 12 Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT653-661 HLA-A 0201 <400> 13 Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT988-997 HLA-A 0201 <400> 14 Tyr Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT973-981 HLA-A 0301 <400> 15 Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT324-332 HLA-A 2402 <400> 16 Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT461-469 HLA-A 2402 <400> 17 Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT4-13 HLA-B 0702 <400> 18 Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> hTERT68-77 HLA-B 0702 <400> 19 Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin38-46 (mod) HLA-A 01:01 <400> 20 Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Tyr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 47-56 (mod) HLA-A 01:01 <400> 21 Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 95-104 HLA-A 02:01 <400> 22 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 96-104 (mod) HLA-A 02:01 <400> 23 Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 5-14 HLA-A 02:01 <400> 24 Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 18-27 (modK) HLA- A 03:01 <400> 25 Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 56-62 HLA-A 11:01 <400> 26 Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 80-88 HLA- A 24:02 <400> 27 Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 20-28 HLA- A 24:02 <400> 28 Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 6-14 HLA- B 07:02 <400> 29 Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <223> Survivin 51-59 HLA- B 35:01 <400> 30 Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Tyr 1 5

Claims (90)

  1. 조작된 면역 세포로서:
    표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체; 및
    조작된 면역 세포 내 표적 항원의 발현의 감소를 초래하는 유전자 파괴
    를 포함하는 조작된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 파괴는 표적 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 항원은 휴지 T 세포, 활성화된 T 세포, 또는 양자 모두에 의해 발현되는 항원이고 및/또는 조작된 세포의 세포 유형에서 자연적으로 발현되는 유전자 산물인 것인 조작된 면역 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서:
    표적 항원은 암의 세포 표면에서 발현되고; 또는
    표적 항원은 암의 세포 또는 조직 상 또는 내에서 발현되는 것인 조작된 면역 세포.
  5. 제4항에 있어서, 암은 혈액암, 면역암, 백혈병, 림프종, 및/또는 골수종인 것인 조작된 면역 세포.
  6. 제5항에 있어서, 표적 항원은 다발골수종에서 발현되는 것인 조작된 면역 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 CD38인 것인 조작된 면역 세포.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 CD33 또는 TIM-3이거나 또는 표적 항원은 CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 또는 CD362인 것인 조작된 면역 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조작된 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 암에서 발현되는 세포내 폴리펩타이드인 것인 조작된 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 범종양 항원인 것인 조작된 면역 세포.
  12. 제11항에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 조작된 면역 세포.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 조작된 면역 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 세포
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 주요 조직적합 복합체(MHC) 분자 관점에서 표적 항원의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체 는 조작된 면역 세포에 활성화 시그널을 유도시킬 수 있는 것인 세포.
  17. 제16있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 모티프을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 것인 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 세포.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 수용체는 CAR이고 공동자극 시그널링 영역을 더 포함하는 것인 세포.
  20. 제19항에 있어서, 공동자극 시그널링 영역은 CD28의 시그널링 도메인을 포함하는 것인 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 또 다른 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 대해 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인, 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 더 포함하는 것인 세포.
  22. 제21항에 있어서, 표적 항원 및 상기 또 다른 항원은 서로 다르고, CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인 세포.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 표적 황원 인식 시 세포에 억제 또는 면역억압 또는 진압 시그널을 유도할 수 있는 것인 세포.
  24. 제23항에 있어서, 항원은 암세포 또는 감염된 세포의 표면에서 발현되지 않거나 또는 그의 발현이 암세포 또는 감염된 세포에서 하향조절되는 항원인 것인 세포
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 항원은 MHC-클래스 I 분자인 것인 세포.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 세포.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 세포.
  28. 제27항에 있어서, CAR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 면역 체크포인트 분자의 시그널링 부분을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 세포.
  29. 제28항에 있어서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1 또는 CTLA4인 것인 세포.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체이고, 표적 항원은 제1 표적 항원이며, 및 면역 세포는 치료하고자 하는 질병 또는 병태에서 발현되고 자극 또는 활성화 시그널을 유도하는 항원을 인식하는 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 추가로 포함하되 상기 자극 또는 활성화 시그널은 제1의 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 유도된 억제 또는 면역억압 또는 진압 시그널에 의해 유도되는 시그널에 의해 감쇠되는 것인 세포.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 표적 항원은 조작된 세포의 세포 유형에서 자연적으로 발생되고 및/또는 상기 세포 유형의 활성화시 자연적으로 상향조절되는 유전자 산물인 것인 세포.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조작된 면역 세포 중 표적 항원의 발현은 상기 파괴가 부재하는 면역 세포에서의 발현에 비해 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소되는 것인 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것인 세포.
  34. 제33항에 있어서, 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것인 세포.
  35. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서:
    (a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포에 도입하는 단계; 및
    (b) 면역 세포에서 표적 항원의 발현의 진압을 유발함으로써, 상기 표적 항원의 발현이 진압된, 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 단계
    를 포함하되,
    상기 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 무관하게 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 (b)의 유발은 표적 항원을 인코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서:
    파괴는 유전자를 DNA 수준에서 파괴시키는 것을 포함하고 및/또는
    파괴는 가역적인 것이 아니며; 및/또는
    파괴는 일시적이지 않은 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 파괴는: (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클리아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드된 뉴클리아제를 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, DNA-표적화 단백질 또는 RNA-가이드된 뉴클리아제는 유전자에 특이적인 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 클러스터형의 규칙적으로 공간배열된 짧은 팔린드롬 핵산 (CRISPR)을 포함하는 것인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 및 CRISPR-Cas9 조합의 도입을 포함하는 것인 방법.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 면역 세포에서 자연 발생되는 유전자 산물 및/또는 그의 발현이 상기 유전자 조작된 항원 수용체의 상기 도입에 의해 유도되는 유전자 산물인 것인 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 진압은 상기 진압 부재시 상기 방법에 의해 생산되는 조작된 세포에 비해, 조작된 면역 세포에서의 표적 항원의 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%까지 감소시키는 것인 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것인 방법.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 휴지 T 세포, 활성화된 T 세포, 또는 양자 모두에 의해 발현되는 항원인 것인 방법.
  47. 제35항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 다발골수종에서 발현되는 것인 방법.
  48. 제35항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 CD38인 것인 방법.
  49. 제35항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 암에서 발현되는 세포내 단배질 항원인 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 표적 항원은 범종양 항원인 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 방법.
  53. 제35항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가로:
    (c) 다른 항원에 특이적으로 결합하고 세포에 공동자극 시그널을 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계
    를 더 포함하되, 단계 (a), (b) 및 (c)는 동시에 또는 순서와 무관하게 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  54. 제35항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 방법.
  55. 제35항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
  56. 제35항 내지 제56항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 생산되는 세포.
  57. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
    (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
    를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인, 조작된 면역 세포.
  58. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 활성화 시그널을 세포에 유도할 수 있는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체; 및
    (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하고, 공동자극 시그널을 세포에 유도할 수 있는 키메라 공동자극 수용체인 제2의 유전자 조작된 항원 수용체
    를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 제1 항원 또는 제2 항원 중 적어도 하나는 범종양 항원인 것인, 조작된 면역 세포.
  59. 제58항에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 조작된 면역 세포.
  60. 제59항에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 조작된 면역 세포.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 또는 제2 항원 주우 다른 하나는 종양에서 발현된 항원인 것인 조작된 면역 세포.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 ITAM-함유 서열을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  63. 제62항에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 CD3제타 (CD3ξ) 사슬의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자으로부터의 시그널링 도메인을 포함하지 않는 것인 조작된 면역 세포.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 공동자극 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  66. 제65항에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된 분자를 하나 이상 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  67. 제57항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 항원을 인코딩하는 유전자, 및/또는 제2 항원을 인코딩하는 유전자에 파괴를 추가로 포함하되, 상기 파괴는 조작된 면역 세포에서 제1 및/또는 제2 항원의 발현 감소를 초래하는 것인 조작된 면역 세포.
  68. 제67항에 있어서, 조작된 면역 세포 중 제1 및/또는 제2 항원의 발현은, 상기 유전자 파괴가 부재하는 면역 세포에서의 발현에 비해 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소되는 것인 조작된 면역 세포.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 것인 조작된 면역 세포.
  70. 제69항에 있어서, 면역 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것인 조작된 면역 세포.
  71. 제57항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 기능성 비-TCR 항원 인식 수용체인 것인 조작된 면역 세포.
  72. 제71항에 있어서, 제1의 유전자 조작된 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조작된 면역 세포.
  73. 제1항 내지 제32항 및 제57항 내지 제72항 중 어느 하나의 항에 기재된 조작된 면역 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
  74. 질병 또는 병태를 갖는 대상자에게 제1항 내지 제33항 및 제57항 내지 제72항 중 어느 하나의 항에 기재된 세포 또는 제73항에 기재된 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
  75. 제74항에 있어서, 유전자 조작된 항원 수용체 또는 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 질병 또는 병태는 암인 것인 방법.
  77. 대상자에 있어서 질병 또는 병태를 치료하기 위한, 제1항 내지 제33항 및 제57항 내지 제72항 중 어느 하나의 항의 조작된 면역 세포를 포함하는 의약 조성물 또는 제73항의 의약 조성물의 용도.
  78. 대상자에 있어서 질병 또는 병태를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제33항 및 제57항 내지 제72항 중 어느 하나의 항의 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물 또는 제73항의 조성물의 용도.
  79. 유전자 조작된 항원 수용체 또는 수용체가 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 제77항의 조성물 E는 제78gd의 용도.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 질병 또는 병태는 암인 것인 조성물 또는 용도.
  81. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
    (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
    (b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 상기 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 CD38 및 CD138로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되며, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  82. 유전자 조작된 면역 세포의 생산 방법으로서, 이 방법은:
    (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
    (b) 키메라 공동자극 수용체이고 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 제2의 유전자 조작된 항원 수용체를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하여, 조작된 면역 세포를 생산하되, 제1 항원과 제2 항원은 서로 다르고 적어도 제1항원 또는 제2 항원은 범종양 항원이며 단계 (a) 및 (b)는 동시에 또는 순서와 관계없이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 범종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈, 마우스 더블미닛 2 동종체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, Wilms' 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, α태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이 막항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (D1)인 것인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 범종양 항원은 hTERT 또는 서바이빈인 것인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 또는 제2 항원의 다른 하나는 종양에서 발현되는 항원인 것인 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 세포에서 제1 및/또는 제2 항원의 발현 억제를 유발하는 단계 (c)를 추가로 포함하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 파괴는 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클리아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클리아제 (TALEN), 또는 및 CRISPR-Cas9 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 진압은 진압 부재시의 방법에 의해 생산되는 조작된 세포에 비해, 조작된 면역 세포 중의 표적 항원의 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소시키는 것인 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 생산된 세포.
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