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KR20170109052A - 치료적 면역 세포의 효능의 향상 방법 - Google Patents

치료적 면역 세포의 효능의 향상 방법 Download PDF

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KR20170109052A
KR20170109052A KR1020177024662A KR20177024662A KR20170109052A KR 20170109052 A KR20170109052 A KR 20170109052A KR 1020177024662 A KR1020177024662 A KR 1020177024662A KR 20177024662 A KR20177024662 A KR 20177024662A KR 20170109052 A KR20170109052 A KR 20170109052A
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KR
South Korea
Prior art keywords
ser
cells
gly
engineered
thr
Prior art date
Application number
KR1020177024662A
Other languages
English (en)
Inventor
다리오 캄파나
타카히로 카미야
Original Assignee
내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56564429&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20170109052(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 filed Critical 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 제거 또는 중화를 위하여 단백질 또는 분자를 표적으로 하는 표적-결합 분자와 함께, 암세포 리간드와의 결합 시에 면역 반응을 활성화시키는 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체 - CAR)를 사용하여, 향상된 항암 면역 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 향상된 치료 효능을 갖는 조작된 면역 세포 및 그의 용도에 관한 것이다. (공개를 위하여 요약서와 동반되는 적합한 도면 부재)

Description

치료적 면역 세포의 효능의 향상 방법
면역 세포는 강력하며 특이적인 "살아있는 약물"일 수 있다. 면역 세포는 정상 조직에 위해를 가하지 않으면서, 종양 세포를 표적으로 할 가능성을 갖고; 몇몇의 임상적 관찰에 의해 그들이 주요 항암 활성을 가질 수 있음이 나타나 있다. 따라서, 동종이계 조혈모세포 이식(HSCT)을 받는 환자에서, T-세포-매개의 이식편대숙주병(GvHD)(문헌[Weiden, PL et al., N. Engl . J. Med . 1979;300(19):1068-1073]; 문헌[Appelbaum, FR Nature, 2001;411(6835):385-389]; 문헌[Porter, DL et al., N. Engl. J. Med . 1994;330(2):100-106]; 문헌[Kolb, HJ et al. Blood. 1995;86(5):2041-2050]; 문헌[Slavin, S. et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204]) 및 공여자 자연 살해(natural killer: NK) 세포 동종이계반응성(문헌[Ruggeri L, et al. Science. 2002;295(5562):2097-2100]; 문헌[Giebel S, et al. Blood. 2003;102(3):814-819]; 문헌[Cooley S, et al. Blood. 2010;116(14):2411-2419])은 백혈병 재발과 역으로 관련되어 있다. HSCT 상황 외에, 저해 신호로부터 T 세포를 방출하거나(문헌[Sharma P, et al., Nat Rev Cancer. 2011;11(11):805-812]; 문헌[Pardoll DM., Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264]), 그들을 종양 세포에 가교시키는(문헌[Topp MS, et al. J. Clin. Oncol. 2011;29(18):2493-2498]) 항체의 투여에 의해, 고형 종양 또는 백혈병 중 어느 하나가 있는 환자에서 주요 임상 반응이 생성된다. 마지막으로, 유전자-변형 자가 T 림프구의 주입에 의해, 불응성 백혈병 및 림프종이 있는 환자에서 완전하고 지속적인 관해가 유도되었다(문헌[Maude SL, et al. N Engl J Med. 2014;371(16):1507-1517]).
그럼에도 불구하고, 면역 세포 요법의 적용가능성을 넓히고, 면역 세포 요법의 효능을 향상시킴으로써 면역 세포 요법을 개선하는 것이 상당히 요구되고 있다.
본 발명은 예를 들어, 암 치료법을 위한 향상된 치료 효능을 갖는 조작된 면역 세포(engineered immune cell)에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 치료량의 조작된 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 위한, 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 유전자, 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 조작된 면역 세포의 용도를 제공한다.
다양한 실시형태에 있어서, 본 발명은 또한, 조작된 면역 세포의 생성 방법을 제공하며, 당해 방법은 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 면역 세포 내로 도입하여, 그에 의해, 조작된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 조작된 면역 세포는 숙주에서의 이식편대숙주병(GvHD)의 감소, 숙주에 의한 거부의 감소 또는 제거, 숙주에서의 생존 연장, 숙주에서의 종양에 의한 저해 감소, 숙주에서의 자가-사멸 감소, 숙주에서의 염증 캐스케이드 감소 또는 숙주에서의 천연/인공 수용체-매개의(예를 들어, CAR-매개의) 신호 전달의 지속 중 하나 이상의 결과로서 향상된 치료 효능을 지닌다.
전술한 것은 상이한 도면에 걸쳐 유사한 참조 부호가 동일한 부분을 나타내는 첨부 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시형태의 하기의 더욱 특정한 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 축적에 맞출 필요가 없으며, 대신, 본 발명의 실시형태의 예시에 따라 강조된다.
도 1a 내지 도 1b는 본 발명에 사용되는 전략의 개략적 표현이다. 도 1a는 암 세포의 CAR 매개의 사멸의 전반적 메커니즘이다. 도 1b는 CAR과 상이한 형식의 구획-지향된 scFv(국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자의 예)의 조합된 발현 및 가능한 표적의 예를 보여준다. CAR은 면역 세포 능력을 향상시킬 수 있는 다른 수용체에 의해 대체될 수 있다.
도 2는 특정 세포 구획에 그들을 국소화시키는 도메인과 함께 scFv를 함유하는 작제물의 개략도이다. 약어: β2M, β-2 마이크로글로불린; SP, 신호 펩타이드; VL, 가변 경쇄; VH, 가변 중쇄; TM, 막관통 도메인(transmembrane sequence); HA, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌. 도면에 열거되지 않은 추가의 작제물에는 막-결합(mb) myc EEKKMP, mb myc KKTN, mb myc YQRL, mb TGN38 세포질 도메인, mb myc RNIKCD, 링커(20-아미노산) mb EEKKMP, 및 신호전달 펩타이드가 존재하지 않고, CD8 막관통 도메인에 다양한 수의 아미노산이 있는 작제물의 변이체가 포함된다. 10-아미노산 링커의 뉴클레오타이드 서열은 GGTGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGTGGCTCA(서열 번호 61)이며; 아미노산 서열은 GGGGSGGGGS(서열 번호 62)이다. 20-아미노산 링커의 뉴클레오타이드 서열은 GGTGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGTGGCTCAGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGTGGCTCT(서열 번호 63)이며; 아미노산 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 41)이다. 다양한 국소화 도메인이 표제 "국소화 도메인" 하에 표기되어 있으며, 일부 예에서 표기된 바와 같은 링커를 보여준다. 작제물 "myc KDEL" 및 "PEST KDEL"은 단일의 작제물에서의 1가지 초과의 국소화 도메인의 이용을 보여준다.
도 3a 내지 도 3c는 CD3ε의 scFv 표적화에 의한 T 세포에서의 CD3/TCR의 하향조절을 보여준다. 도 3a는 녹색 형광 단백질(GFP) 만을 함유하는 레트로바이러스 벡터("모의") 또는 GFP + 표기된 바와 같은 상이한 작제물을 함유하는 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포에서의 표면 CD3ε의 발현을 보여준다. 세포 막 상의 CD3ε의 발현을 알로피코시아닌(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences))에 컨쥬게이트된 항-CD3 항체를 사용하여 형질도입 1주 후에 모의-형질도입된 세포의 발현과 비교하였다. GFP-양성 세포 상의 게이팅(gating) 후에 모든 비교를 수행하였다. 도 3b는 항-CD3/CD28 비드(라이프사이언시즈(Lifesciences))와 함께 증식되는 말초 혈액 T 림프구로 수행되는 유사한 실험을 도시한 것이다. 염색을 형질도입 1주 후에 수행하였다. 도 3c는 표기된 작제물로의 형질도입 후에 Jurkat 세포에서의 막 CD3ε의 하향조절을 예시한 유세포측정 플롯을 보여준다. 각 플롯의 상부 우측 사분면의 파선 사각형은 GFP+ CD3+ 세포를 둘러싼 것이다.
도 4는 항-CD3ε scFv-KDEL 또는 -PEST, 또는 -mb EEKKMP로의 형질도입시에 Jurkat T 세포에서의 세포막에서의 CD3ε 및 TCRαβ의 하향조절을 보여준다. 막 마커 발현을 알로피코시아닌(비디 바이오사이언스즈)에 컨쥬게이트된 항-CD3 항체 또는 피코에리트린(바이오레전드(Biolegend))에 컨쥬게이트된 항-TCRαβ를 사용하여 형질도입 1주 후에 측정하였다. "대조군"으로 표지된 선은 모의-형질도입된 세포의 표지화를 나타낸다. 수직 파선은 아이소형-일치 비-반응성 항체로 수득되는 염색의 상한을 나타낸다.
도 5는 항-scFv 및 CAR이 동시에 발현될 수 있음을 보여준다. 유세포측정 점플롯은 항-CD3 알로피코시아닌 항체 및 염소-항-마우스 Fab2 비오틴 + 피코에리트린에 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(CAR을 검출하기 위함)을 사용한 Jurkat 세포(윗줄) 또는 말초 혈액 림프구(아랫줄)의 염색을 나타낸다. 세포를 항-CD3 scFv-myc KDEL 작제물, 항-CD19-4-1BB-CD3ζ 작제물 또는 둘 모두로 형질도입하였다. GFP-양성 세포에서의 게이팅 후에, 항-CD3 scFv-myc KDEL로 형질도입된 것들은 CD3을 하향조절하였으며(좌측 열, 하부 좌측 사분면), 항-CD19-4-1BB-CD3ζ 작제물로 형질도입된 것들은 CAR을 발현하였다(중간 열, 상부 우측 사분면). 두 작제물 모두로 형질도입된 상당한 비의 세포는 CD3-음성 및 CAR-양성이었다(우측 열, 상부 좌측 사분면).
도 6은 항-CD19 CAR이 CD3/TCR 하향조절과 관계 없이, T 세포 활성화 및 탈과립을 촉발시키는 것을 예시한 것이다. Jurkat 세포를 항-CD3 scFv-myc KDEL 작제물, 항-CD19-4-1BB-CD3ζ 작제물 또는 둘 모두로 형질도입하였다. T 세포 활성화 및 탈과립을 모의-형질도입된 세포의 것과 비교하였다. 세포를 단독으로 또는 CD19+ 백혈병 세포주 OP-1과 1:1 비로 동시-배양하였다. 18시간 후에, CD69 및 CD25의 발현을 특이적인 항체(비디 바이오사이언스즈사)를 사용하여 유세포측정에 의해 시험하였으며; CD107a의 발현을 6시간 후에 시험하였다(비디 바이오사이언스즈사의 항체). OP-1 세포의 존재하에, CAR-발현 세포에서의 CD69 및 CD25 발현은 세포가 항-CD3 scFv-KDEL로 형질도입되는지 여부와 관계없이 발생하였으며; 활성화는 모의- 또는 항-CD3 scFv-myc KDEL 형질도입된 세포에서 또는 OP-1 세포의 부재하에 발생하지 않았다. CAR 자극은 CD3/TCR 하향조절에 의해 영향을 받지 않는 CD107 발현을 향상시켰다.
도 7은 T 세포에서 발현되는 항-CD19 CAR이 CD3/TCR 하향조절과 관계없이 T 세포 증식을 야기하는 것을 보여준다. 말초 혈액 T 림프구를 항-CD3 scFv-myc KDEL 작제물 및 항-CD19-4-1BB-CD3ζ 작제물 둘 모두로 형질도입하였다. 형질도입된 T 림프구를 스트렉(Streck)(미국 네브라스카주 오마하 소재)으로 처리된 OP-1 세포와 동시-배양하여, 표기된 시간 동안 그들의 증식을 저해하였다. 항-CD19 CAR을 발현하는 CD3-양성 및 CD3-음성 T 림프구의 증식을 모의-형질도입된 T 세포의 것과 비교하였다. 각 기호는 2가지 병행 배양물의 평균 세포 계수를 보여준다. CAR T 세포는 CD3/TCR 발현과 관계없이 동일하게 잘 증식되었다.
도 8은 GFP만을 함유하는 레트로바이러스 벡터("모의") 또는 GFP + 항-CD7 scFv-myc KDEL 작제물을 함유하는 벡터로 형질도입된 말초 혈액 T 림프구의 막에서의 CD7의 발현을 보여준다. 세포막에서의 CD7의 발현을 피코에리트린(비디 바이오사이언스즈)에 컨쥬게이트된 항-CD7 항체를 사용하여 형질도입 후 1주에 모의-형질도입된 세포의 것과 비교하였다. 각 플롯의 상부 우측 사분면의 파선 사각형은 GFP+ CD7+ 세포를 둘러싼 것이다.
도 9는 β2-마이크로글로불린의 scFv 표적화에 의한 T 세포에서의 HLA 부류 I의 하향조절을 도시한 것이다. Jurkat T 세포를 항-β2M scFv-myc KDEL로 형질도입하였다. 세포막에서의 HLA-ABC의 발현을 피코에리트린(비디 바이오사이언스즈)에 컨쥬게이트된 항-HLA-ABC 항체를 사용하여 형질도입 1주 후에 모의-형질도입된 세포의 발현과 비교하였다. 아이소형-일치된 대조군 항체를 사용한 염색도 또한 나타나 있다. GFP-양성 세포에서의 게이팅 후에 분석을 수행하였다.
도 10은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/DL3의 scFv 표적화에 의한 인간 NK 세포에서의 살해 면역글로불린-유사 수용체(killer immunoglobulin-like receptor: KIR) 2DL1 및 KIR2DL2/DL3의 하향조절을 도시한 것이다. 생체 외에서 증식되고 KIR2DL1 발현에 대하여 선택된 NK 세포를 항-KIR2DL1-KIR2DL2/DL3 scFv-링커(20) AEKDEL 또는 -EEKKMP로 형질도입하였다. 세포막에서의 상응하는 KIR의 발현을 알로피코시아닌(알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 컨쥬게이트된 항-KIR2DL1 항체 또는 피코에리트린(비디 바이오사이언스즈)에 컨쥬게이트된 항-KIR2DL2/DL3 항체를 사용하여 형질도입 후 8일에 모의-형질도입된 세포의 것과 비교하였다. 아이소형-일치된 대조군 항체를 사용한 염색도 또한 나타나 있다. GFP-양성 세포에서의 게이팅 후에 분석을 수행하였다.
도 11은 scFv 표적화에 의한 인간 NK 세포에서의 NKG2A의 하향조절을 도시한 것이다. 생체 외에서 증식된 NK 세포를 항-NKG2A scFv-EEKKMP로 형질도입하였다. 세포막에서의 NKG2A의 발현을 피코에리트린(베크만 쿨터(Beckman Coulter))에 컨쥬게이트된 NKG2A 항체를 사용하여 형질도입 8일 후에 모의-형질도입된 세포의 것과 비교하였다. 아이소형-일치된 대조군 항체를 사용한 염색도 또한 나타나 있다. GFP-양성 세포에서의 게이팅 후에 분석을 수행하였다.
본 발명의 예시적인 실시형태가 아래에서 설명된다.
최근에, 면역 세포를 조절하는 분자 경로에 관한 지식의 획득은 그들의 증식 및 유전적 조작을 포함하여, 그들을 생체 외에서 조작하는 능력의 현저한 발달과 병행되어 왔다. 이제 시기 적절하게 매우 정교한 임상-등급 면역 세포 제품을 신뢰성있게 제조하는 것이 가능하다. 면역 세포의 항암 활성이 생체외 세포 조작에 의해 유도되고, 확대될 수 있는 방법의 주요 예는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) T 세포를 발생시키는 것이다(문헌[Eshhar, Z. et al., PNAS. 1993;90(2):720-724]).
CAR은 이전에 설명된 인공 다-분자 단백질이다(문헌[Geiger TL, et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939]; 문헌[Brentjens RJ, et al., NatMed. 2003;9(3):279-286]; 문헌[Cooper LJ, et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644]). CAR은 특정 표적에 결합하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 예를 들어, 본원에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,399,645호에 기재된 바와 같이, 그러한 도메인에 대한 임의의 요망되는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 약술하면, CAR은 표적에 특이적으로 결합하는 항체의 단쇄 가변 영역(single-chain variable fragment: scFv)을 함유하도록 설계될 수 있다. scFv는 막관통 및 힌지 도메인을 통하여 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR)-회합 신호전달 분자, 예를 들어, CD3ζ에 연결될 수 있다. 동족 항원으로의 scFv의 라이게이션은 신호 전달을 촉발시킨다. 따라서, CAR은 세포독성 T 림프구를 즉각적으로 암세포를 향하여 재지향시켜, 종양 세포 용해를 유발할 수 있다(문헌[Eshhar, Z. et al., PNAS. 1993;90(2):720-724]; 문헌[Geiger TL, et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939]; 문헌[Brentjens RJ, et al., NatMed . 2003;9(3):279-286]; 문헌[Cooper LJ, et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644]; 문헌[Imai C, et al., Leukemia. 2004;18:676-684]). 단독의 CD3ζ 신호전달이 T 세포를 지속적으로 활성화시키기에 충분하지 않기 때문에(문헌[Schwartz RH. Annu Rev Immunol. 2003;21:305-334]; 문헌[Zang X and Allison JP. Clin Cancer Res. 2007;13(18 Pt 1):5271-5279]), 동시-자극 분자, 예를 들어, CD28 및 4-1BB(또는 CD137)를 CAR 작제물 내로 혼입시켜, 신호 전달을 부스팅시켰다. 이러한 이중 신호전달 설계("제2 세대 CAR")는 T 세포로부터 유효한 항-종양 활성을 유도하는데 유용하다(문헌[Imai C, et al., Leukemia. 2004;18:676-684]; 문헌[Campana D, et al., Cancer J. 2014;20(2):134-140]).
4-1BB 및 CD3ζ 둘 모두를 함유하는 특정 CAR, 항-CD19 CAR은 미국 특허 제8,399,645호에 기재되어 있다. 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR을 발현하는 자가 T 세포의 주입에 의해, 만성 림프구성 백혈병(CLL)(문헌[Porter DL, et al., Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia; 2011]: 문헌[N Engl J Med. 2011; 365(8):725-733]; 문헌[Kalos M, et al., SciTranslMed. 2011;3(95):95ra73]) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL)(문헌[Grupp SA, et al., N Engl J Med. 2013;368(16):1509-1518]; 문헌[Maude SL, et al., N Engl J Med. 2014;371(16):1507-1517])이 있는 환자에서 현저한 임상 반응이 초래되었다. 이들 연구 및 상이한 신호전달 모듈을 지니는 CAR을 사용한 연구(문헌[Till BG, et al., Blood. 2012;119(17):3940-3950]; 문헌[Kochenderfer JN, et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720]; 문헌[Brentjens RJ, et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828]; 문헌[Brentjens RJ, et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138])는 이러한 기술의, 그리고 일반적으로 면역요법의 임상 잠재력의 확실한 입증을 제공한다.
본원에 기재된 방법은 천연 또는 인공 수용체, 예를 들어, CAR에 의해 재유도되는 면역 세포에서의 특정 단백질의 신속한 제거 또는 비활성화를 가능하게 하여, 이에 따라, 조작된 세포의 적용 가능성을 넓히고, 그의 기능을 유의미하게 개선시킨다. 상기 방법은 부분적으로 제거되거나 중화될 표적(예를 들어, 단백질)에 결합하는 표적-결합 분자와 함께 면역 활성화 수용체, 예를 들어, CAR(특정 표적에 결합하는 세포외 도메인(예를 들어, scFv), 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함함)을 함유하는 단일 작제물 또는 다중 작제물에 의존하며; 표적-결합 분자는 응용에 따라, 특정 세포 구획, 예를 들어, 골지 또는 소포체(endoplasmic reticulum), 프로테아좀 또는 세포막에 그것을 지향시키는 도메인(즉, 국소화 도메인)에 연결된다. 단순화를 위하여, 국소화 도메인(localizing domain: LD)에 연결된 표적-결합 분자는 본원에 때때로 "LD-연결된 표적-결합 분자"로 지칭된다.
본원의 교시로부터 명백해질 것과 같이, 다양한 면역 활성화 수용체가 본 발명의 방법에 적합할 수 있다. 즉, 암세포 상에서 발현되는 리간드(예를 들어, 펩타이드 또는 항원)로의 결합(라이게이션)시에 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 분자를 포함하는 임의의 수용체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 면역 활성화 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있으며; CAR의 설계 및 조작 방법은 해당 분야에 알려져 있다(문헌[Geiger TL, et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939]; 문헌[Brentjens RJ, et al., NatMed. 2003;9(3):279-286]; 문헌[Cooper LJ, et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644] 참조). 또한, CAR과 유사하지만, scFv가 항체-결합 분자(예를 들어, CD16, CD64, CD32)로 대체된 항체-결합 능력이 있는 수용체가 사용될 수 있다(예를 들어, CD16-4-1BB-CD3제타 수용체 - 문헌[Kudo K, et al. Cancer Res. 2014;74(1):93-103]). 추가로, 종양 세포 HLA의 맥락에서 종양 세포상에서 발현되는 펩타이드에 결합하는 T-세포 수용체 알파 및 베타 사슬을 포함하는 T-세포 수용체도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 암세포 상에서 발현되는 리간드에 결합함으로써 면역 반응을 활성화시키는 분자를 지니는 다른 수용체, 예를 들어, 종양 세포 상에서 발현되는 NKG2D 리간드에 결합하는 NKG2D-DAP10-CD3제타 수용체도 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chang YH, et al., Cancer Res. 2013; 73(6):1777-1786] 참조). 본원에 사용되는 모든 그러한 적합한 수용체는 집합하여, "면역 활성화 수용체" 또는 "암세포 리간드에 결합 시에 면역 반응을 활성화시키는 수용체"로 지칭된다. 따라서, 암세포 리간드에 의해 활성화되는 분자를 갖는 면역 활성화 수용체는 본 발명에 따라 LD-연결된 표적-결합 분자와 함께 발현될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 인공 수용체에 의해 재지향된 면역 세포의 주입에 기초한 면역요법의 잠재적인 응용이 유의미하게 확대된다. 기재된 방법은 실행가능하며, 임상 등급 세포 가공에 용이하게 포함될 수 있다. 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 2A 펩타이드-코딩 영역 부위를 CAR 및 LD-연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 2개의 cDNA 사이에 삽입함으로써 예를 들어, CAR 및 LD-연결된 표적-결합 분자, 예를 들어, scFv-myc KDEL(또는 PEST 또는 막관통)을 포함하는 단일의 바이시스트로닉(bicistronic) 작제물을 제조할 수 있다. 1가지 초과의 표적을 결실시키기 위한 트라이시스트로닉 전달 시스템의 설계도 또한 실현가능해야 한다. 대안적으로, 2가지 유전자의 개별 형질도입이 (동시에 또는 순차적으로) 수행될 수 있다. 암세포 치료법의 맥락에서, CAR은 항체-결합 신호전달 수용체(문헌[Kudo K, et al., Cancer Res. 2014;74(1):93-103]), 특정 HLA-펩타이드 조합에 대하여 지향되는 T-세포 수용체 또는 암세포와의 접촉에 의해 활성화되는 임의의 수용체(문헌[Chang YH, et al., Cancer Res. 2013; 73(6):1777-1786])에 의해 대체될 수 있다. 동시의 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR 및 항-CD3ε scFv-KDEL을 사용한 본원에 기재된 연구의 결과에 의해, CAR의 신호전달 능력이 손상되지 않는 것이 입증된다.
본원에 시험되는 둘 모두의 항-CD3ε scFv-KDEL(및 PEST)은 CD3 및 TCR 발현을 안정적으로 하향조절한다. 잔류 CD3+ T 세포는 임상-등급 형식에서도 이용 가능한 방법인 CD3 비드를 사용하여 제거될 수 있다. CAR 신호전달에 반응하는 CD3/TCR-음성 세포를 생성하는 능력은 중요한 진전을 나타낸다. CAR T 세포를 사용한 임상 연구는 일반적으로 자가 T 세포를 사용하여 수행되어 왔다. 따라서, 세포 산물의 질은 환자마다 달라지며, 반응은 이질적이다. 동종이계 T 세포의 주입은 그것이 수여자의 조직 항원에 의한 내인성 TCR의 자극으로 인하여 잠재적으로 치사의 GvHD의 위험이 허용 가능하지 않게 높기 때문에, 현재 불가능하다. 내인성 TCR의 결여가 GvHD 능력을 제거하기 때문에, CD3/TCR의 하향조절은 동종이계 T 세포의 주입 가능성을 연다. 동종이계 산물을 최적의 세포 조성(예를 들어, 고도의 세포독성 T 세포가 풍부하고, 조절 T 세포가 고갈되는 등)으로 제조할 수 있으며, 주입되는 세포가 높은 CAR 발현 및 작용력을 갖도록 선택할 수 있었다. 더욱이, 완전 표준화 제품은 동결보존될 수 있으며, 환자 면역 세포 상태 및 그/그녀가 분리반출법 또는 과도한 채혈을 겪는 적합성과 관계없이 사용하기 위해 이용 가능하다. TCR 발현의 제거는 유전자 교정 도구, 예를 들어, 뉴클레아제를 사용하여 다루어져 왔다(문헌[Torikai H, et al. Blood, 2012;119(24):5697-5705]). 이것은 효율적인 접근법이지만, 그것이 배양 연장과 함께 수차례의 세포 선택 및 증식을 필요로 하기 때문에, 임상 환경에서 이행하는 것은 어렵다. 본원에 기재된 방법은 상당한 실현가능한 이점을 갖는다.
또한, LD-연결된 표적-결합 분자(예를 들어, scFv-myc KDEL, scFv-EEKKMP 또는 scFv-PEST, 여기서, scFv는 특정 단백질/분자를 표적으로 함)를 본 발명에 따라 사용하여, HLA 부류 I 분자를 제거하여, 동종이계 세포의 거부 가능성을 감소시킬 수 있다. 동종이계 T 세포의 주입이 CAR T 세포 요법의 장래의 목적인 한편, 동종이계 자연 살해(NK) 세포의 주입은 암이 있는 환자를 치료하기 위하여 이미 사용 중이다. NK 세포가 종양 세포감소를 야기할 가능성이 있는 이펙터:표적 비를 달성하기에 충분한 수로 지속되어야 하는 것이 NK 세포 기반의 치료법의 성공을 결정하는 주요 요인이다(문헌[Miller JS. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013;2013:247-253]). 그러나, 동종이계 세포가 주입되는 경우, 그들의 지속성이 제한된다. 환자에게 제공되는 면역억제 화학요법은 주입된 NK 세포의 일시적 이식을 가능하게 하지만, 이들은 주입 2 내지 4주 내에 거부된다(문헌[Miller JS, et al. Blood. 2005;105:3051-3057]; 문헌[Rubnitz JE, et al., J Clin Oncol. 2010;28(6):955-959]). 기관 이식과 반대로, 면역억제 약물이 NK 세포 기능도 또한 억제하기 때문에, 면역억제의 지속은 옵션이 아니다. 거부가 주로 수여자의 CD8+ T 림프구에 의한 HLA 부류 I 분자의 인식에 의해 매개되기 때문에, 주입된 NK 세포(또는 T 세포)로부터의 HLA 부류 I 분자의 제거는 거부율을 감소시키거나 철폐하고, 동종이계 세포의 생존을 연장시키고, 이에 따라, 그들의 항-종양 능력을 연장시킬 것이다.
추가로, LD-연결된 표적-결합 분자를 본 발명에 따라 사용하여 저해 수용체를 표적으로 할 수 있다. 구체적으로, 저해 신호로부터 T 세포를 방출하는 항체, 예를 들어, 항-PD1 또는 항-CTLA-4의 투여에 의해, 현저한 임상 반응이 생성된다(문헌[Sharma P, et al., Nat Rev Cancer. 2011;11(11):805-812]; 문헌[Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264]). CAR-T 세포, 특히 고형 종양에 대하여 지향된 것들은 유사한 메커니즘에 의해 저해될 수 있다. 따라서, PD1, CTLA-4, Tim3 또는 기타 저해 수용체에 대한 표적-결합 분자(예를 들어, scFv 또는 리간드)의 발현에 의해, (예를 들어, KDEL(서열 번호 4), EEKKMP(서열 번호 64) 또는 PEST 모티프 SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(서열 번호 7)에 연결된다면) 이들 분자의 발현이 방지되거나, (막관통 도메인에 연결된다면) 그들의 리간드로의 수용체의 결합이 방지되고, CAR-매개의 신호 전달이 지속될 것이다. NK 세포에서, 저해 수용체의 예는 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 및 NKG2A(문헌[Vivier E, et al., Science, 2011;331(6013):44-49])를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한, CAR-지향된 T 세포 요법에 유용한 다수의 표적의 표적화를 가능하게 한다. CAR-지향된 요법의 주요 한계 중 하나는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 항원이 부족하다는 것이다. 혈액 악성종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종의 경우에, 비-조혈 세포에서 발현되지 않는 분자는 가능한 표적일 수 있지만, 그들이 T 세포 및/또는 NK 세포에서도 발현되기 때문에, CAR 표적으로 사용될 수 없다. 면역 세포에서의 이러한 CAR의 발현은 "동족살해" 메커니즘에 의해 면역 세포 그들 자체의 사멸을 야기하여, 그들의 항암 능력을 무효화할 가능성이 있다. 표적 분자가 불리한 기능적 효과 없이 면역 세포로부터 제거될 수 있다면, 상응하는 특이성을 갖는 CAR이 발현될 수 있다. 이것은 혈액 악성종양을 표적화하기 위한 많은 새로운 기회를 연다. 가능한 표적의 예에는 다발성 골수종에서 발현되는 CD38, T 세포 백혈병 및 림프종에서 발현되는 CD7, 급성 백혈병에서 발현되는 Tim-3, 호지킨병에서 발현되는 CD30, 모든 혈액 악성종양에서 발현되는 CD45 및 CD52가 포함된다. 이들 분자는 또한, 상당한 비의 T 세포 및 NK 세포에서 발현된다.
더욱이, 활성화된 면역 세포에 의한 사이토카인의 분비가 사이토카인 방출 증후군 및 대식구 활성화 증후군을 촉발시켜, 면역 세포 요법의 심각한 유해 효과를 제시하는 것이 나타났다(문헌[Lee DW, et al., Blood. 2014;124(2):188-195]). 따라서, LD-연결된 표적-결합 분자를 본 발명에 따라 사용하여 이러한 염증 캐스케이드에 기여할 수 있는 사이토카인, 예를 들어, IL-6, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, IL-35, 인터페론(IFN)-γ, IFN-β, IFN-α, 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 전환 성장 인자(TGF)-β를 블로킹할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포에 관한 것이다.
본원에 사용되는 "조작된" 면역 세포는 천연 발생 면역 세포에 비하여 유전자 변형된 면역 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 조작된 T 세포는 그것이 유래되는 T 세포에서 천연적으로 존재하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 지닌다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자(LD-연결된 표적-결합 분자)를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR 및 국소화 도메인에 연결된 항-CD3 scFv를 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 조작된 면역 세포는 조작된 T 세포, 조작된 자연 살해(NK) 세포, 조작된 NK/T 세포, 조작된 단핵구, 조작된 대식구 또는 조작된 수지상 세포이다.
특정 실시형태에 있어서, 본원에 사용되는 "면역 활성화 수용체"는 암세포 리간드로의 결합 시에 면역 반응을 활성화시키는 수용체를 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 암세포상에서 발현되는 리간드(예를 들어, 펩타이드 또는 항원)로의 결합(라이게이션)시에 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 분자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이며; CAR의 설계 및 조작 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 다른 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 CAR과 유사하지만, scFv가 항체-결합 분자(예를 들어, CD16, CD64, CD32)로 대체된 항체-결합 수용체이다(예를 들어, CD16-4-1BB-CD3제타 수용체 - 문헌[Kudo K, et al. Cancer Res. 2014;74(1):93-103] 참조). 다양한 실시형태에 있어서, 종양 세포 HLA의 맥락에서 종양 세포상에서 발현되는 펩타이드에 결합하는 T-세포 수용체 알파 및 베타 사슬을 포함하는 T-세포 수용체도 또한 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 암세포 상에서 발현되는 리간드에 결합함으로써 면역 반응을 활성화시키는 분자를 지니는 다른 수용체, 예를 들어, 종양 세포 상에서 발현되는 NKG2D 리간드에 결합하는 NKG2D-DAP10-CD3제타 수용체(예를 들어, 문헌[Chang YH, et al., Cancer Res. 2013; 73(6):1777-1786] 참조)도 또한 사용될 수 있다. 암세포 상에서 발현되는 리간드(예를 들어, 펩타이드 또는 항원)으로의 결합(라이게이션)시에 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 이러한 모든 적합한 수용체는 집합적으로 "면역 활성화 수용체"로 지칭된다. 해당 분야의 숙련자에 의해 인식될 것과 같이, 면역 활성화 수용체는 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 함유하지 않아도 되며; 오히려, 표적 분자에 결합하는 면역 활성화 수용체의 일부가 예를 들어, 수용체-리간드 쌍에서 수용체 또는 수용체-리간드 쌍에서 리간드로부터 유래될 수 있다.
특정 양태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 비제한적으로 CD20, CD22, CD33, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD52, CD38, CS-1, TIM3, CD123, 메소텔린(mesothelin), 엽산염 수용체, HER2-neu, 상피-성장 인자 수용체 및 상피 성장 인자 수용체를 포함하는 종양 세포의 표면상에서 발현되는 분자에 결합한다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 CAR(예를 들어, 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR)이다. 특정 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 비제한적으로 CD20, CD22, CD33, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD52, CD38, CS-1, TIM3, CD123, 메소텔린, 엽산염 수용체, HER2-neu, 상피-성장 인자 수용체 및 상피 성장 인자 수용체를 포함하는 종양 세포의 표면상에서 발현되는 분자에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 종양 세포의 표면상에서 발현되는 이러한 분자에 대한 항체는 해당 분야에 알려져 있으며, 이용 가능하다. 예로써, CD3 및 CD7에 대한 항체는 구매가능하며, 해당 분야에 알려져 있다. 이러한 항체 및 그로부터 유래되는 항체의 단편(예를 들어, scFv)은 본원에 예시된 바와 같이 본 발명에서 사용될 수 있다. 추가로, 표적 단백질에 대한 항체 및 항체 단편의 생성 방법은 해당 분야에 널리 알려져 있으며, 일상적이다.
본 발명에 따른 면역 활성화 수용체(예를 들어, CAR)의 막관통 도메인은 비제한적으로 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16(예를 들어, CD16A 또는 CD16B), OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32(예를 들어, CD32A 또는 CD32B), CD64(예를 들어, CD64A, CD64B 또는 CD64C), VEGFR2, FAS 및 FGFR2B를 포함하는 단일-통과 막 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 예에서, 막 단백질은 CD8α가 아니다. 막관통 도메인은 또한 비-천연 발생 소수성 단백질 세그먼트일 수도 있다.
면역 활성화 수용체(예를 들어, CAR)의 힌지 도메인은 단백질, 예를 들어, CD8α 또는 IgG로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 CD8α 또는 비-천연 발생 펩타이드, 예를 들어, 다양한 길이의 친수성 잔기로 이루어진 폴리펩타이드 또는 n이 예를 들어, 3 내지 12의 정수인 (GGGGS)n(서열 번호 8) 폴리펩타이드의 막관통 또는 힌지 도메인의 단편일 수 있다.
면역 활성화 수용체(예를 들어, CAR)의 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcεRIγ, DAP10, DAP12 또는 면역 세포에서 활성화 신호를 전달하는 것으로 알려져 있는 기타 분자로부터 유래될 수 있다. 수용체의 적어도 하나의 동시-자극 신호전달 도메인은 동시-자극 분자, 예를 들어, 4-1BB(CD137로도 알려져 있음), CD28, CD28LL → GG 변이체, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1 또는 CD2일 수 있다. 이러한 분자는 해당 분야에서 용이하게 이용 가능하며, 공지되어 있다.
해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것처럼, 면역 활성화 수용체의 성분을 본원에 기재된 바와 같이 다수의 기능 조합을 포함하도록 조작하여, 원하는 결과를 생성할 수 있다. 예로써, 특정 CAR 항-CD19-4-1BB-CD3ζ를 사용하여, 분자에 결합하는 항체(예를 들어, 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어, scFv)를 본원에 기재된 바와 같이 상이한 분자에 결합하는 항체(예를 들어, 항-CD19 대신에 항-CD20, 항-CD33, 항-CD123 등)로 대체할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 동시-자극 분자(이러한 특정 예에서는 4-1BB)는 상이한 동시-자극 분자, 예를 들어, CD28로 달라질 수도 있다. 일부 실시형태에 있어서, 자극 분자(이러한 특정 예에서는 CD3ζ)는 다른 알려져 있는 자극 분자로 대체될 수 있다. 다양한 실시형태에 있어서, 수용체의 막관통 도메인은 또한 원하는 대로 달라질 수 있다. 이러한 면역 활성화 수용체의 설계, 생성 및 그의 기능성에 대한 시험은 해당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 유사하게, 이러한 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 핵산의 설계, 세포 내로의 전달 및 발현은 해당 분야에서 용이하게 알려져 있으며, 이용 가능하다.
본원에 사용되는 용어 "핵산"은 다수의 뉴클레오타이드 단량체(예를 들어, 리보뉴클레오타이드 단량체 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체)를 포함하는 고분자를 지칭한다. "핵산"은 예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생, 재조합 또는 합성일 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 삼중-가닥일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이중-가닥 고분자의 경우에, "핵산"은 분자의 어느 하나의 가닥 또는 두 가닥 모두를 지칭할 수 있다.
핵산과 관련하여 용어 "뉴클레오타이드 서열"은 공유 결합, 예를 들어, 인 결합(예를 들어, 포스포다이에스터, 알킬 및 아릴-포스포네이트, 포스포로싸이오에이트, 포스포로트라이에스터 결합) 및/또는 비-인 결합(예를 들어, 펩타이드 및/또는 설파메이트 결합)에 의해 연결되는 일련의 인접 뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에 있어서, 예를 들어, 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 이종 서열(예를 들어, 상이한 종 또는 세포 유형 기원의 유전자)이다.
용어 "뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 단량체"는 천연 발생 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체 및 그의 비-천연 발생 유도체 및 유사체를 지칭한다. 따라서, 뉴클레오타이드는 예를 들어, 천연 발생 염기(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 이노신, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 또는 데옥시시티딘)를 포함하는 뉴클레오타이드 및 해당 분야에 알려져 있는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것처럼, 일부 양태에 있어서, 핵산은 플라스미드 서열을 추가로 포함한다. 플라스미드 서열은 예를 들어, 프로모터 서열, 선택 마커 서열 및 유전자좌-표적화 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 유전자는 때때로 "LD-연결된 표적-결합 분자"로 지칭된다.
특정 실시형태에 있어서, 표적-결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 본원에 사용되는 "항체"는 변형되거나 조작된, 또는 인간 항체인 무손상 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 무손상 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 의미한다. 변형되거나 조작되는 항체의 예에는 키메라 항체, 인간화 항체, 다중파라토프 항체(예를 들어, 이중파라토프 항체) 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)가 있다. 항원-결합 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄 항체(예를 들어, scFv), 미니바디 및 디아바디가 포함된다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합에 의해, 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 결합된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 중쇄의 일부를 함유하여, 사슬간 이황화 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어, F(ab')2 분자를 형성할 수 있게 한다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH 2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하여, 사슬간 이황화 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되게 한다. 이에 따라, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이에서 이황화 결합에 의해 결합되는 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 결여된다.
특정 실시형태에 있어서, 표적-결합 분자는 단쇄 Fv 항체("scFv 항체")이다. scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성하게 한다. scFv의 검토를 위하여, 문헌[Pluckthun (1994) The Pharmacology Of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, PCT 공개 WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조한다. 예로써, 본원에 개시된 scFv의 VH와 VL 도메인 사이의 링커는 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 41) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 43)를 포함한다. 해당 분야의 숙련자에 의해 인식될 것과 같이, 다양한 적합한 링커를 설계하고, 해당 분야에 제공되고, 본원에 개시되는 바와 같이 최적의 기능에 대하여 시험할 수 있다.
LD-연결된 표적-결합 분자의 일부인 scFv는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 유사한 항체-유사 신호전달 수용체의 맥락에서 발생하는 scFv와 반드시 동일하지는 않다. 일부 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자의 일부인 scFv는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 유사한 항체-유사 신호전달 수용체의 맥락에서 발생하는 scFv와 동일하다.
일부 실시형태에 있어서, 표적-결합 분자(예를 들어, LD-연결된 표적-결합 분자의 맥락에서 scFv)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 서열 번호 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 또는 39 중 어느 하나 이상과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함한다.
용어 "서열 동일성"은 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 예를 들어, 디폴트 갭 가중치를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우 적어도, 예를 들어, 70%의 서열 동일성 또는 적어도 80%의 서열 동일성 또는 적어도 85%의 서열 동일성 또는 적어도 90%의 서열 동일성 또는 적어도 95%의 서열 동일성 또는 그 이상을 공유하는 것을 의미한다. 서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열(예를 들어, 모 서열)로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열에 비한 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적의 정렬을 예를 들어, 문헌[Smith & Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성에 대한 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터 구현에 의해 또는 육안의 검사(일반적으로 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 행할 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 예는 BLAST 알고리즘이며, 이는 문헌[Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다(미국 국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 접근가능하다). 전형적으로, 맞품 파라미터도 또한 사용할 수 있지만, 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하여 서열 비교를 수행할 수 있다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이(W), 10의 기대값(E) 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989)] 참조)를 사용한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체(예를 들어, scFv)는 각각 서열 번호 12 및 13; 각각 서열 번호 16 및 17; 각각 서열 번호 20 및 21; 각각 서열 번호 24 및 25; 각각 서열 번호 28 및 29; 각각 서열 번호 32 및 33; 또는 각각 서열 번호 36 및 37에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 항체(예를 들어, scFv)는 각각 서열 번호 12 및 13; 각각 서열 번호 16 및 17; 각각 서열 번호 20 및 21; 각각 서열 번호 24 및 25; 각각 서열 번호 28 및 29; 각각 서열 번호 32 및 33; 또는 각각 서열 번호 36 및 37에 기재된 VH 및 VL 서열과 각각 적어도 90%의 서열 동일성, 적어도 91%의 서열 동일성, 적어도 92%의 서열 동일성, 적어도 93%의 서열 동일성, 적어도 94%의 서열 동일성, 적어도 95%의 서열 동일성, 적어도 96%의 서열 동일성, 적어도 97%의 서열 동일성, 적어도 98%의 서열 동일성, 적어도 99%의 서열 동일성 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL 또는 VL-VH)에서 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 가능하게 하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 형성하고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어, 특허 문헌 EP 404,097호; WO 93/11161호; 및 문헌[Holliger et al., (1993) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448]에 기재되어 있다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 트라이아바디 또는 테트라바디이다. 트라이아바디 및 테트라바디의 설계 및 생성 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Todorovska et al., J. Immunol. Methods 248(1-2):47-66, 2001]을 참조한다.
"도메인 항체 단편"은 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적 기능성 면역글로불린 단편이다. 일부 예에서, 둘 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커와 함께 공유적으로 연결되어, 2가 도메인 항체 단편을 생성한다. 2가 도메인 항체 단편의 2개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 항체는 변형되거나 조작된다. 변형되거나 조작된 항체의 예에는 키메라 항체, 다중파라토프 항체(예를 들어, 이중파라토프 항체) 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)가 포함된다.
본원에 사용되는 "다중파라토프 항체"는 적어도 2개의 단일 도메인 항체를 포함하는 항체를 의미하며, 여기서, 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 항원 상의 제1 항원 결정기에 대하여 유도되며, 적어도 하나의 다른 단일 도메인 항체는 동일한 항원 상의 제2 항원 결정기에 대하여 유도된다. 따라서, 예를 들어, "이중파라토프" 항체는 항원 상의 제1 항원 결정기에 대하여 유도되는 적어도 하나의 단일 도메인 항체 및 동일한 항원 상의 제2 항원 결정기에 대하여 유도되는 적어도 하나의 추가의 단일의 도메인 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 단일 도메인 항체를 포함하는 항체를 의미하며, 여기서, 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 제1 항원에 대하여 유도되며, 적어도 하나의 다른 단일 도메인 항체는 (제1 항원과 상이한) 제2 항원에 대하여 유도된다. 따라서, 예를 들어, "이중특이적" 항체는 제1 항원에 대하여 유도된 적어도 하나의 단일 도메인 항체 및 예를 들어, 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대하여 유도된 적어도 하나의 추가의 단일 도메인 항체를 포함하는 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 항체는 단클론성 항체, 예를 들어, 쥣과 단클론성 항체이다. 단클론성 항체의 생성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다.
다양한 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자의 맥락에서 표적-결합 분자는 표적 분자에 결합하는 수용체 또는 리간드이다. 예를 들어, 상기 표적-결합 분자는 PD-1에 결합하는 리간드(예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2)일 수 있다. 따라서, 해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것처럼, 표적-결합 분자는 표적 분자에 결합하는 항체 또는 리간드/수용체일 수 있다.
LD-연결된 표적-결합 분자의 맥락에서 본원에 사용되는 "연결된"은 하나 이상의 국소화 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 바로 인접하게 프레임 내에서(예를 들어, 링커 없이) 표적-결합 분자를 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 대안적으로, 표적-결합 분자를 인코딩하는 유전자는 본원에 기재된 바와 같이 링커 서열을 통하여 하나 이상의 국소화 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 연결될 수 있다. 해당 분야에 공지되어 있는 다양한 적합한 링커를 사용하여 표적-결합 분자를 국소화 도메인에 연결할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 발생 펩타이드, 예를 들어, 다양한 길이의 친수성 잔기로 이루어진 폴리펩타이드 또는 n이 예를 들어, 3 내지 12의 정수인 (GGGGS)n(서열 번호 8) 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 링커는 예를 들어, GGGGSGGGGS(서열 번호 62)를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 링커는 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 41)를 포함한다. 다양한 실시형태에 있어서, 약 5 내지 약 100개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드 링커가 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 약 20 내지 약 40개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드 링커가 본 발명에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 25개 아미노산, 적어도 30개 아미노산, 적어도 35개 아미노산 또는 적어도 40개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드 링커가 본 발명에서 사용될 수 있다. 해당 분야의 숙련자에 의해 인식될 것처럼, 이러한 링커 서열 및 이러한 링커 서열의 변이체는 해당 분야에 공지되어 있다. 링커 서열을 포함하는 작제물의 설계 방법 및 기능의 평가 방법은 해당 분야의 숙련자에게 용이하게 이용 가능하다.
특정 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자는 면역 세포의 표면상에서 발현되는 표적에 결합한다. 일부 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자는 표적 분자의 활성 또는 기능을 저해한다. 예로써, 본원에 개시된 바와 같이, LD-연결된 표적-결합 분자는 예를 들어, CD3, CD7, CD45, hB2MG, KIR2DL1, KIR2DL2/DL3 또는 NKG2A에 결합하여, 그에 의해, 이러한 분자의 세포 표면 발현을 하향조절하도록 설계할 수 있다. 이러한 분자의 하향조절은 예를 들어, 분해 및/또는 내재화를 위한 분자의 국소화/표적화를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자는 표적을 불활성이 되게 한다(예를 들어, 표적은 더 이상 그의 동족 리간드 또는 수용체와 상호작용하고/거나 그에 결합할 수 없다).
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 향상된 치료 효능을 갖는다. 본원에 사용되는 "향상된 치료 효능"은 숙주에서의 감소된 이식편대숙주병(GvHD), 숙주에 의한 거부의 감소 또는 제거, 숙주에서의 생존 연장, 숙주에서의 종양에 의한 저해 감소, 숙주에서의 자가-사멸 감소, 숙주에서의 염증성 캐스케이드의 감소 또는 숙주에서의 CAR-매개의 신호 전달의 지속 중 하나 이상을 지칭한다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자의 맥락에서 표적-결합 분자는 CD3/T-세포 수용체(TCR) 복합체 내의 분자, 사이토카인, 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자 또는 면역 반응을 하향조절하는 수용체에 결합한다.
특정 실시형태에 있어서, CD3/TCR 복합체 내의 분자는 CD3ε, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3δ, CD3γ 또는 CD3ζ일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 분자는 CD3ε이다.
다른 실시형태에 있어서, HLA 부류 I 분자는 베타-2 마이크로글로불린, α1-마이크로글로불린, α2-마이크로글로불린 또는 α3-마이크로글로불린이다.
다른 실시형태에 있어서, 면역 반응을 하향조절하는 수용체는 예를 들어, PD-1, CTLA-4, Tim3, 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR - 예를 들어, KIR2DL1(CD158a로도 공지됨), KIR2DL2/DL3(CD158b로도 공지됨)), CD94 또는 NKG2A(CD159a로도 공지됨), 단백질 티로신 포스파타제, 예를 들어, Src 상동성 영역 2 도메인-함유 포스파타제(SHP)-1 및 SHP-2로부터 선택된다. 따라서, 이러한 수용체는 본원에 기재된 바와 같은 모이어티 LD-연결된 표적-결합 분자에 의해 표적화될 수 있다.
다양한 실시형태에 있어서, 모이어티 LD-연결된 표적-결합 분자로 표적화될 수 있는 사이토카인의 예에는 예를 들어, 인터류킨(IL)-6, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, IL-35, 인터페론(IFN)-γ, IFN-β, IFN-α, 종양 괴사 인자(TNF)-α 또는 전환 성장 인자(TGF)-β가 포함된다.
추가의 양태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자는 예를 들어, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD30, CD38, CD45, CD52 또는 CD127로부터 선택되는 분자에 결합한다.
임의의 표적 단백질에 대한 항체 및 그의 항체 단편의 생성 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 일상적이다. 더욱이, 본원에 예시된 바와 같이, 다양한 표적, 예를 들어, CD3 및 CD7에 대한 구매가능한 항체를 사용하여, LD-연결된 표적-결합 분자를 생성할 수 있다. 해당 분야에 공지되어 있는 항체 및 그로부터 유래되는 항체의 단편(예를 들어, scFv)을 본원에 예시된 바와 같이 본 발명에 사용할 수 있다.
다른 양태에 있어서, LD-연결된 표적-결합 분자의 국소화 도메인은 본원에 기재된 바와 같이 소포체(ER) 잔류 서열 KDEL(서열 번호 4) 또는 기타 ER 또는 골지 잔류 서열, 예를 들어, KKXX(서열 번호 9), KXD/E(서열 번호 10)(여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있음 - 문헌[Gao C, et al., Trends in Plant Science 19: 508-515, 2014] 참조) 및 YQRL(서열 번호 11)(문헌[Zhan J, et al., Cancer Immunol Immunother 46:55-60, 1998] 참조); 예를 들어, "PEST" 모티프 - SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(서열 번호 7)를 포함하는 프로테오좀 표적화 서열; 및/또는 표적-결합 분자를 세포막, 예를 들어, CD8α 막관통 도메인 또는 다른 단일-통과 막관통 막 단백질(예를 들어, CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16(예를 들어, CD16A 또는 CD16B), OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32(예를 들어, CD32A 또는 CD32B), CD64(예를 들어, CD64A, CD64B 또는 CD64C), VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B)에 표적화하는 서열을 포함한다. 본원에 예시된 특정 국소화 도메인(서열)의 예는 도 2에 나타나 있다. 다양한 다른 국소화 서열이 해당 분야에 공지되어 있으며, 이용 가능하다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LD-연결된 표적-결합 분자는 하나 이상의 국소화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, LD-연결된 표적-결합 분자는 함께 연결된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 국소화 도메인을 가질 수 있다. 1개 초과의 국소화 도메인이 주어진 LD-연결된 표적-결합 분자에 사용되는 경우, 각각의 국소화 도메인은 임의의 개재 링커와 함께 또는 이것 없이 연결될 수 있다. 예로써, 도 2에 나타낸 바와 같이, 국소화 도메인 CD8 TM, PEST 모티프 및 EEKKMP가 단일 LD-연결된 표적-결합 분자에 사용될 수 있다. 이러한 특정 작제물이 임의의 개재 링커 없이 국소화 도메인을 보이지만, 다양한 개재 링커가 국소화 도메인 중 일부 또는 전부 사이에 혼입될 수 있다. 다른 예는 도 2에 나타나 있다.
해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 면역 활성화 수용체 및/또는 LD-연결된 표적-결합 분자를 본원에 개시된 표적 및 본원에 개시된 표적의 변이체에 결합하도록 설계할 수 있다. 예로써, 면역 활성화 수용체 및/또는 LD-연결된 표적-결합 분자는 CD3/TCR 복합체 내의 분자 또는 그의 천연-발생 변이체 분자에 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 천연-발생 변이체는 분자의 야생형 형태와 동일한 기능을 가질 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 변이체는 분자의 야생형 형태에 비하여 변경된(예를 들어, 병태를 부여하는) 기능을 가질 수 있다.
해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 도 2에 나타낸 LD-연결된 표적-결합 분자 작제물의 다양한 성분은 조합이 기능성 LD-연결된 표적-결합 분자를 생성하는 한, 상이한 조합으로(예를 들어, 상이한 링커, 상이한 국소화 서열, 상이한 scFv 등을 함유하도록) 대체될 수 있다. 특정 작제물에 대한 기능의 평가 방법은 본원에 개시된 바와 같이, 해당 분야의 숙련자의 범주 내이다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 치료량의 조작된 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 위한, 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자(예를 들어, scFv)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 치료량의 조작된 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 위한, 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment: scFv)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 치료량의 조작된 면역 세포를 자가면역 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애의 치료를 위한, 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자(예를 들어, scFv)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한, 치료량의 조작된 면역 세포를 감염성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료를 위한, 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자(예를 들어, scFv)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포의 용도에 관한 것이다.
다양한 실시형태에 있어서, 면역 활성화 수용체는 CAR(예를 들어, 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR)이다.
다른 실시형태에 있어서, 국소화 도메인에 연결된 단쇄 가변 단편(scFv)은 도 2에 나타낸 임의의 하나 이상의 작제물로부터 선택된다.
일부 양태에 있어서, 조작된 면역 세포는 대상체 내로의 주입에 의해 투여된다. 면역 세포(예를 들어, 동종이계 또는 자가 면역 세포)의 주입 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 충분한 수의 세포를 수여자에게 투여하여, 질환의 증상을 개선시킨다. 전형적으로, 107 내지 1010개 세포의 투여량, 예를 들어, 109개 세포의 투여량을 단일 환경에서 주입한다. 주입을 단일의 109개 세포 용량으로서 또는 몇몇의 109개 세포 투여량으로 분할하여 투여한다. 주입 빈도는 요망된다면 또는 표기된다면, 3 내지 30일마다 또는 심지어 더 긴 간격으로 이루어질 수 있다. 주입량은 일반적으로 용인되는 대로, 또는 질환 증상이 개선될 때까지 대상체마다 적어도 1회의 주입, 바람직하게는 적어도 3회의 주입이다. 세포를 50 내지 250 ㎖/시간의 속도로 정맥내 주입할 수 있다. 다른 적합한 투여 방식에는 동맥내 주입, 종양 내로의 직접 주사 및/또는 수술 후의 종양 층의 관류, 인공 스캐폴드 내의 종양 부위에서의 이식, 척수강내 투여 및 안구내 투여가 포함된다. 이러한 전달 방식에 대한 본 발명의 조정 방법은 해당 분야의 숙련자에게 용이하게 이용 가능하다.
특정 양태에 있어서, 치료할 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양이다. 혈액 악성종양의 예에는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 척수형성이상증, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 및 비호지킨 림프종이 포함된다. 고형 종양의 예에는 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소암, 췌장암, 간세포 암종, 신경모세포종, 횡문근육종, 뇌 종양이 포함된다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 면역 세포 내로 도입하여, 그에 의해, 조작된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함하는 본 발명의 조작된 면역 세포의 생성 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 생체 외에서 면역 세포 내로 도입된다. 다른 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 생체 내에서 면역 세포 내로 도입된다.
일부 실시형태에 있어서, "면역 세포"는 예를 들어, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK/T 세포, 단핵구, 대식구 또는 수지상 세포를 포함한다.
도입될 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 본원에 기재된 면역 활성화 수용체 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자(예를 들어, scFv)를 함유하는 단일 바이시스트로닉 작제물일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 단일의 바이시스트로닉 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 면역 활성화 수용체(예를 들어, CAR) 및 표적-결합 분자(예를 들어, scFv)를 인코딩하는 2개의 cDNA 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 2A 펩타이드-코딩 영역 부위를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 1개 초과의 표적을 결실시키기 위한 트라이시스트로닉 전달 시스템의 설계도 또한 실현가능하여야 한다. 대안적으로, 개별 작제물(예를 들어, CAR 및 LD-연결된 표적-결합 분자)의 (동시의 또는 순차적) 개별 형질도입이 수행될 수 있다. 외인성 핵산의 도입 방법은 본원에 예시되어 있으며, 해당 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용되는 단수 표현은, 명백하게 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
실시예
방법
마우스 항-인간 CD3 하이브리도마로부터의 scFv의 클로닝
항-인간 CD3 단클론성 항체(IgG2a 아이소형; 미국 뉴욕주 셜리 소재의 크레아티브 디아그노스틱스(Creative Diagnostics))를 분비하는 PLU4 하이브리도마 세포를 20% 우태아혈청(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 및 항생제가 있는 IMDM 플러스(plus) GlutaMAX 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))에서 배양하였다. 전체 RNA를 TRIzol 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 추출하고, cDNA를 M-MLV 역전사효소(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega)) 및 올리고(dT)15 프라이머(프로메가)에 의해 합성하였다. IgG 라이브러리 프라이머 세트 마우스 바이오게노믹스(BioGenomics)(미국 매사추세츠주 살렘 소재의 유에스 바이올로지컬(US Biological))를 사용하여, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역을 증폭시키고; PCR 산물을 시퀀싱을 위하여 TOPO TA 클로닝 키트 내로 클로닝하였다(라이프 테크놀로지즈). VH 및 VL 유전자를 중첩 연장-PCR에 의하여 스플라이싱을 사용하여 (Gly4Ser)4를 인코딩하는 유연성 링커 서열에 의해 scFv 내로 어셈블시켰다. CD8α의 신호 펩타이드 도메인을 건강한 공여자로부터의 인간 활성화 T 세포로부터 유래되는 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 서브클로닝하고, VL 단편의 5' 말단에 연결하였다. Myc 태그(EQKLISEEDL; 서열 번호 1)를 센스 프라이머: 5'-ATATATGAATTCGGCTTCCACCATGGCCTTACCAGTGACC-3'(서열 번호 2) 및 역방향 프라이머: 5'-CAGATCTTCTTCAGAAATAAGTTTTTGTTCGGCTGAGGAGACTGTGAGAG-3'(서열 번호 3)을 사용하는 PCR에 의해 VH의 C-말단에 부가하였다. 또한, Myc 태그 후에 KDEL(서열 번호 4) 코딩 서열을 센스 프라이머: 5'-ATATATGAATTCGGCTTCCACCATGGCCTTACCAGTGACC-3'(서열 번호 5) 및 역방향 프라이머: 5'-TATATACTCGAGTTACAACTCGTCCTTCAGATCTTCTTCAGAAATAAG-3'(서열 번호 6)에 의해 생성하였다. CD8 신호 펩타이드, 인간 CD3에 대한 scFv, Myc 태그 및 KDEL(서열 번호 4) 서열로 이루어진 합성된 유전자를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다. myc-KDEL이 다른 서열에 의해 대체된 작제물도 또한 도 2에 열거된 바와 같이 제조하였다.
마우스 오르니틴 데카복실라제의 아미노산 422 내지 461에 상응하는 "PEST"의 서열 - SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(서열 번호 7) 모티프를 GenBank(수탁 번호 NM_013614.2)로부터 수득하였다. 코돈 최적화 및 유전자 합성을 진스크립트(GenScript)(미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 행하고, PCR에 의해 VH의 3' 말단 내로 서브클로닝하였다. 작제물을 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다.
인간 CD7에 대한 scFv의 클로닝
쥣과 TH69(항-CD7) 항체로부터 유래되는 서열 scFv를 문헌(Peipp et al., Cancer Res 2002 (62): 2848-2855)으로부터 수득하였다. 코돈 최적화 후에, CD8 신호 펩타이드, 인간 CD7에 대한 scFv, Myc 태그 및 KDEL(서열 번호 4) 서열로 이루어진 합성된 유전자를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다. myc-KDEL을 다른 서열로 대체한 작제물도 또한 도 2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
인간 베타-2 마이크로글로불린(hB2MG)에 대한 scFv의 클로닝
쥣과 BBM.1(항-hB2MG) IgG2b 항체로부터 유래된 서열 scFv를 문헌(Grovender, E.A. et al., Kidney Int. 2004;65(1):310-322)으로부터 수득하였다. 코돈 최적화 후에, CD8 신호 펩타이드, 인간 B2MG에 대한 scFv, Myc 태그 및 KDEL(서열 번호 4) 서열로 이루어진 합성된 유전자를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다.
인간 KIR2DL1 및 KIR2DL2/DL3에 대한 scFv의 클로닝
인간 단클론성 항체 I-7F9(항-KIR2DL1, KIR2DL2 및 KIR2DL3)의 아미노산 서열은 모레타(Moretta) 등에 의한 공개된 국제 특허 출원 WO2006003179 A2호로부터 유래되었다. 코돈 최적화 후에, 가변 경쇄(VL) 영역 및 가변 중쇄(VH) 영역을 링커 서열로 연결시킴으로써 scFv의 서열을 설계하였다. CD8 신호 펩타이드, 인간 KIR(KIR2DL1, KIR2DL2 및 KIR2DL3)에 대한 scFv, CD8 힌지 및 막관통 도메인, 및 KKMP 서열로 이루어진 합성된 유전자를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다. KKMP를 다른 서열로 대체한 작제물도 또한 도 2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
인간 NKG2A에 대한 scFv의 클로닝
쥣과 항체 Z199(항-NKG2A)의 서열은 스피(Spee) 등(EP2247619 A1호)에 의한 공개된 특허로부터 유래되었다. 코돈 최적화 후에, 가변 경쇄(VL) 영역 및 가변 중쇄(VH) 영역을 링커 서열로 연결시킴으로써 scFv의 서열을 설계하였다. CD8 신호 펩타이드, 인간 NKG2A에 대한 scFv, CD8 힌지 및 막관통, 및 KKMP 서열로 이루어진 합성된 유전자를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 내로 서브클로닝하였다. KKMP를 다른 서열로 대체한 작제물도 또한 도 2에 열거된 바와 같이 제조하였다. 본원에 생성된 scFv에 대한 서열 정보는 표 1에 나타나 있다. 도 2에 도시된 다양한 성분에 대한 서열 정보는 표 2에 나타나 있다.
항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR
이러한 CAR을 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(문헌[Imai, C. et al., Leukemia. 2004;18:676-684]; 문헌[Imai, C. et al., Blood. 2005;106:376-383]).
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
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유전자 형질도입, 세포 증식, 유세포 분석 및 기능 연구
이들을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Kudo, K et al., Cancer Res. 2014;74(1):93-103]).
결과
scFv 작제물의 생성
기술의 개략도는 도 1에 약술되어 있다. 생성된 저해성 작제물의 개략적 표현은 도 2에 나타나 있다. 항체-생성 하이브리도마 세포주로부터 또는 상응하는 공개된 서열로부터 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 면역글로불린 사슬 영역을 인코딩하는 cDNA를 클로닝함으로써 scFv 부분이 유래될 수 있다. VL 및 VH를 표준 기술에 따라 짧은 펩타이드 서열("링커")로 연결시켜, 완전한 scFv를 제조한다. 발현되기 위하여, scFv는 N-말단에서 신호 펩타이드에 연결되며; 예비 실험에서 확인된 바와 같이, 신호 펩타이드는 scFv가 발현되는데 필요하다. scFv + 신호 펩타이드를 함유하는 단백질은 일반적으로 세포의 환경 내로 방출된다. 예를 들어, 예비 실험(미도시)에서, Jurkat T 세포에서 항-CD3ε scFv + 신호 펩타이드가 세포의 배양 상청액에서 검출되었다. scFv를 특정 구획에 지향시키고, 그의 분비를 방지함으로써, 다른 세포에 대한 가능한 효과가 방지된다. 그를 소포체(ER)에 지향시키기 위하여, KDEL(서열 번호 4) 모티프(ER에 단백질 보유)를 사용하였다(문헌[Strebe N. et al., J Immunol Methods. 2009;341(1-2):30-40]). 표적화된 단백질의 분해를 촉진시키기 위하여, 본 발명자들은 그를 프로테아좀-표적화 PEST 모티프에 연결시켰다(문헌[Joshi, S.N. et al., MAbs. 2012;4(6):686-693]). scFv를 CD8α 또는 다른 막관통 단백질의 막관통 도메인 및 힌지에 연결시킴으로써 scFv는 세포막에 지향될 수 있다.
항-CD19-BB-ζ CAR을 발현하는 T 림프구에서의 T-세포 수용체의 하향조절
제안된 전략이 CAR을 발현하고, 하나 이상의 마커가 결여된 면역 세포를 생성하기 위하여 적용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, T-세포 수용체(TCR) 발현을 항-CD19 CAR T-세포에서 하향조절하였다.
세포막에서 발현되기 위하여, CD3/TCR 복합체는 모든 그의 성분(TCRα, TCRβ, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ)의 어셈블리를 필요로 한다. 하나의 성분의 결여는 CD3/TCR 발현과, 그에 따라 항원 인식을 막는다. 예비 연구에서, 항-CD3ε 하이브리도마(미국 뉴욕주 셜리 소재의 크리에이티브 디아그노스틱스로부터 구매)로부터 scFv를 클로닝하고, 도 2에 나타낸 바와 같이 KDEL(서열 번호 4), PEST, CD8α 막관통 도메인 또는 다른 것들을 함유하는 작제물을 생성하였다.
본원에 개시된 작제물을 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하는 쥣과 줄기 세포 바이러스(MSCV) 레트로바이러스 벡터를 사용하여 CD3/TCR+ Jurkat 세포주에 형질도입하였다. 형질도입 이후 GFP+ 세포의 백분율은 모든 실험에서 90% 초과였다. 도 3a는 유세포측정에 의해 측정시, GFP+ 세포 중에서 항-CD3ε 항체를 사용한 염색의 결과를 보여준다. CD3ε의 항체 염색은 열거된 작제물로 형질도입된 세포에서 다양한 정도로 감소되었다. 인간 말초 혈액 T 림프구를 사용하여 CD3ε의 유사한 하향조절을 수득하였다(도 3b). 도 3c는 단독의 GFP를 함유하는 벡터로 형질도입된 세포와 비교하여 상이한 유전자 작제물로의 형질도입 후의 GFP-양성 Jurkat 세포에서의 CD3ε 발현의 예시적인 유세포측정 점 플롯을 보여준다. CD3의 하향조절은 Jurkat 세포의 성장 또는 CD2, CD4, CD8, CD45, CD25, CD69를 포함하는 시험되는 모든 다른 세포 마커의 발현에 영향을 미치지 않았다. CD3 발현의 저해는 3개월 넘게 지속되었다. 항-CD3 자성 비드(Dynal, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 라이프 테크놀로지즈)를 사용한 CD3+ T 세포 고갈에 의해 CD3-음성 세포의 추가의 농축을 달성할 수 있었다.
Jurkat 세포 또는 인간 말초 혈액 T 림프구의 항-TCRαβ 항체를 사용한 염색에 의해, CD3ε 발현의 하향조절이 TCRαβ 발현의 하향조절과 관련이 있는 것으로 나타났다(도 4).
다음으로, 항-CD3 scFv-myc KDEL이 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR과 동시에 발현될 수 있는지를 결정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이것은 항-CD19 CAR을 발현하면서 CD3 발현이 결여된 T 세포를 초래하였다. 또한, TCR이 이들 세포에 부재하였다(미도시).
CAR이 CD3/TCR이 하향조절된 Jurkat 세포에서 신호전달될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현을 시험하였으며, 용해성 과립의 외포작용을 CD19+ 백혈병 세포주 OP-1과 동시-배양된 Jurkat 세포에서 CD107a 발현에 의해 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이 항-CD3 scFv-myc KDEL 작제물을 사용한 CD3/TCR의 하향조절은 Jurkat 세포를 활성화시키는 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR의 능력을 약화시키지 않았다. CAR 신호전달에 대한 CD3/TCR 결실의 영향을 추가로 조사하기 위하여, CAR을 발현하는 CD3-음성 T 림프구가 그의 라이게이션에 의해 자극될 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 항-CD19 CAR을 발현하는 T 림프구와 CD19+ 백혈병 세포의 동시-배양은 CD3이 하향조절되는지 또는 그렇지 않은지와 관계 없이, T 세포 증식을 야기하였으며, 이는 CD3/TCR 하향조절이 CAR 증식 자극을 약화시키지 않았음을 나타낸다.
따라서, CD3/TCR은 CAR에 의해 유도되는 T 세포 활성화, 탈과립화 및 증식에 영향을 미치지 않고, 항-CD3 scFv-myc KDEL 작제물을 사용하여 CAR-T 세포에서 효율적으로 하향조절될 수 있다.
CD7의 하향조절
CD3/TCR 발현을 성공적으로 조절하는 전략을 다른 표면 분자에 적용할 수 있는지 여부를 결정하였다. 이러한 목적을 위하여, CD7 발현을 조절하였다. scFv 서열은 페이프(Peipp) 등에 의해 공개된 서열(문헌[Cancer Res 2002 (62): 2848-2855])로부터 유래되었으며, 이는 도 2에 예시된 바와 같이 CD8 신호 펩타이드 및 myc-KDEL 서열에 연결되었다. MSCV 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 항-CD7-myc KDEL 작제물을 피코에리트린(비디 바이오사이언스)에 컨쥬게이트된 항-CD7 항체에 의해 검출시, 높은 CD7 발현을 갖는 말초 혈액 림프구에 형질도입하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 작제물로 형질도입된 T 림프구에서 CD7은 사실상 철폐되었다.
HLA-부류 I의 하향조절
그 다음, 상기 전략을 적용하여, 다른 표면 분자, HLA-부류 I을 하향조절시켰다.
HLA 부류 I은 다형성 α 사슬 및 β2-마이크로글로불린으로 지칭되는 비-다형성 사슬로 이루어진다. 후자의 서브유닛의 낙-다운은 HLA(마우스에서 MHC) 부류 I 발현의 철폐를 초래한다(문헌[Koller, BH et al., Science. 1990;248(4960):1227-1230]). β2-마이크로글로불린과 반응하는 scFv를 사용하여 면역 세포에서 HLA 부류 I의 발현을 억제하였다.
scFv 서열은 글로벤더(Grovender) 등(문헌[Kidney Int. 2004;65(1):310-322])에 의해 공개된 서열로부터 유래되었으며, 이는 도 2에 예시된 바와 같이 CD8 신호 펩타이드 및 myc KDEL 서열에 연결되었다. MSCV 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 항-β2M-myc KDEL 작제물을 피코에리트린(비디 파민젠)에 컨쥬게이트된 항-HLA-ABC 항체에 의해 검출시, 높은 HLA 부류 I의 발현을 갖는 Jurkat 세포에 형질도입시켰다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 작제물로 형질도입된 Jurkat 세포는 상당한 HLA-ABC 발현의 하향조절을 가졌다. 세포는 그들의 형태 및 성장 능력을 유지하였다.
NK 세포에서의 저해성 수용체의 하향조절
상기 약술된 전략을 다른 면역 세포에서 발현되는 표면 분자에도 적용될지를 결정하기 위하여, 저해성 수용체 KIR2DL1, KIR2DL2/DL3 및 NKG2A의 기능의 하향조절을 NK 세포에서 시험하였다.
KIR 수용체를 하향조절하기 위하여, KIR2DL1 및 KIR2DL2/DL3과 반응하는 scFv를 사용하여, NK 세포에서 그들의 발현을 억제하였다. scFv 서열은 모레타(Moretta) 등(특허 WO2006003179 A2호)에 의해 공개된 서열로부터 유래되었으며, 이는 도 2에 예시된 바와 같이 CD8 신호 펩타이드 및 ER 보유 서열에 연결되었다. MSCV 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 작제물을 인간 말초 혈액으로부터 증식된 NK 세포에 형질도입하고, KIR2DL1 발현에 대하여 선택하였다. 이들 세포는 알로피코시아닌(알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 컨쥬게이트된 항-KIR2DL1 항체에 의해 검출시 높은 KIR2DL1 발현 및 또한, 피코에리트린(비디 바이오사이언스)에 컨쥬게이트된 항-KIR2DL2/DL3 항체에 의해 검출시 높은 KIR2DL2/DL3 발현을 가졌다. 도 10은 표적화된 KIR의 상당한 하향 조절과 함께, scFv-링커(20) AEKEDL 및 scFv-EEKKMP로 수득되는 결과를 보여준다.
NKG2A를 하향조절하기 위하여, NKG2A와 반응하는 scFv를 사용하여, NK 세포에서 그의 발현을 억제하였다. 스피(Spee) 등에 의해 공개된 유럽 특허 출원 EP2247619 A1호로부터 유래되는 scFv 서열은 도 2에 예시된 바와 같이 CD8 신호 펩타이드 및 ER 보유 서열에 연결되었다. MSCV 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 작제물을 피코에리트린(베크만 쿨터)에 컨쥬게이트된 항-NKG2A 항체에 의해 검출시 높은 NKG2A 발현을 갖는 인간 말초 혈액으로부터 증식된 NK 세포에 형질도입시켰다. 도 11은 scFv-EEKKMP로 수득되는 상당한 NKG2A의 하향조절을 보여준다.
모든 특허, 공개된 출원 및 본원에 열거된 참조문헌의 교시는 그들 전문이 참조로 포함된다.
본 발명이 특히 본 발명의 예시적인 실시형태를 참조하여 나타나고 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고, 형태 및 상세사항의 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있음이 해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore <120> METHODS FOR ENHANCING EFFICACY OF THERAPEUTIC IMMUNE CELLS <130> 4459.1116-002 <140> PCT/SG2016/050063 <141> 2016-02-05 <150> US 62/112,765 <151> 2015-02-06 <150> US 62/130,970 <151> 2015-03-10 <160> 64 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc tag <400> 1 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 2 atatatgaat tcggcttcca ccatggcctt accagtgacc 40 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 cagatcttct tcagaaataa gtttttgttc ggctgaggag actgtgagag 50 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KDEL coding sequence <400> 4 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 5 atatatgaat tcggcttcca ccatggcctt accagtgacc 40 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light region for scFv targeting CD45 <400> 27 gacattgtgc tgacccagtc ccctgcttca ctggcagtga gcctgggaca gagggcaacc 60 atcagctgcc gagcctctaa gagtgtctca acaagcggat actcctatct gcactggtac 120 cagcagaagc caggacagcc acctaaactg ctgatctatc tggcttccaa cctggaatct 180 ggagtgcctg cacgcttctc cggatctgga agtggaaccg actttacact gaatattcac 240 ccagtcgagg aagaggatgc cgctacctac tattgccagc acagccggga gctgcccttc 300 acatttggca gcgggactaa gctggagatc aag 333 <210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy region for scFv targeting B2MG <400> 28 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Pro Ser Gly Phe Asn Val Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Lys Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Gly Asp Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Phe Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light region for scFv targeting B2MG <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Leu Lys Ile Arg Thr Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Lys Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 100 105 110 <210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy region for scFv targeting B2MG <400> 30 gaggtgcagc tgcagcagag cggagcagaa ctggtgaaac ctggagccag cgtcaagctg 60 tcctgtactc catctggctt caacgtgaag gacacataca ttcactgggt caagcagcgg 120 cccaaacagg gactggagtg gatcggcaga attgacccat ccgacggcga tatcaagtat 180 gatcccaaat tccaggggaa ggctactatt accgcagata ccagctccaa cacagtgagt 240 ctgcagctgt ctagtctgac tagcgaagac accgccgtct actattgtgc tagatggttt 300 ggcgattacg gggccatgaa ttattggggg cagggaacca gcgtcaccgt gtccagc 357 <210> 31 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light region for scFv targeting B2MG <400> 31 gatattcaga tgacccagtc ccctgcatca cagagcgcct ccctgggcga gtcagtgacc 60 atcacatgcc tggctagcca gacaattggc acttggctgg catggtacca gcagaagccc 120 ggcaaatccc ctcagctgct gatctatgca gctacctctc tggcagacgg agtgcccagt 180 aggttctctg ggagtggatc aggcaccaag ttttctctga aaattcgcac actgcaggct 240 gaggatttcg tctcctacta ttgccagcag ctgtactcta aaccttatac atttggcggg 300 ggaactaagc tggaaatcaa acgagcagac 330 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy region for scFv targeting NKG2A <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 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180 ttctctggca gcggctccgg cacatcttac agcctgacca tctctagcat ggaggccgag 240 gacgccgcca cctactattg ccagcagtgg tccggcaatc catatacatt tggcggcggc 300 accaagctgg agatcaagag g 321 <210> 36 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy region for scFv targeting KIR2DL1 and 2/3 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light region for scFv targeting KIR2DL1 and 2/3 <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 38 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy region for scFv targeting KIR2DL1 and 2/3 <400> 38 caggtccagc tggtgcagtc tggagctgaa gtgaagaaac cagggagctc cgtcaaggtg 60 tcatgcaaag caagcggcgg gactttctcc ttttatgcaa tctcttgggt gagacaggca 120 cctggacagg gactggagtg gatgggaggc ttcatcccaa tttttggagc cgctaactat 180 gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc acagctgatg agtctactag taccgcatac 240 atggaactgt ctagtctgag gagcgacgat accgccgtgt actattgtgc tcgcattcca 300 tcaggcagct actattacga ctatgatatg gacgtgtggg gccaggggac cacagtcacc 360 gtgagcagc 369 <210> 39 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light region for scFv targeting KIR2DL1 and 2/3 <400> 39 gagatcgtgc tgacccagtc tcctgtcaca ctgagtctgt caccagggga acgggctaca 60 ctgtcttgca gagcaagcca gtccgtgagc tcctacctgg cctggtatca gcagaagcca 120 ggccaggctc ccaggctgct gatctacgat gcaagcaaca gggccactgg gattcccgcc 180 cgcttctctg gcagtgggtc aggaaccgac tttactctga ccatttctag tctggagcct 240 gaagatttcg ccgtgtacta ttgccagcag cgatccaatt ggatgtatac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acggaca 327 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 signal peptide <400> 40 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy-variable light linker <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 42 <211> 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CD8 signal peptide <400> 46 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcga 60 cca 63 <210> 47 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 signal peptide <400> 47 atggctctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcga 60 cct 63 <210> 48 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 signal peptide <400> 48 atggccctgc ccgtcaccgc cctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcaaga 60 ccc 63 <210> 49 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 signal peptide <400> 49 atggctctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgcccgc 60 cca 63 <210> 50 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge and transmembrane <400> 50 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 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heavy-variable light linker <400> 56 ggaggaggag gatctggagg aggaggcagc ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctct 60 <210> 57 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge and transmembrane <400> 57 aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60 cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120 gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 180 cttctcctgt cactggttat caccctttac 210 <210> 58 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge and transmembrane <400> 58 accactacac ctgcaccaag gcctcccaca cccgctccca ctatcgcttc ccagccactg 60 tccctgaggc ccgaggcctg caggccagca gctggcggag ccgtgcatac tagggggctg 120 gacttcgctt gcgacatcta catctgggcc ccactggcag ggacatgcgg agtcctgctg 180 ctgtccctgg tcatcacact ttac 204 <210> 59 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge and transmembrane <400> 59 actaccacac cagctccaag accacctacc cctgcaccaa caattgctag tcagccactg 60 tcactgagac cagaagcatg taggcctgca gctggaggag ctgtgcacac cagaggcctg 120 gactttgcct gcgatatcta catttgggct cctctggcag gaacctgtgg cgtgctgctg 180 ctgtctctgg tcatcacact ttac 204 <210> 60 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge and transmembrane <400> 60 aagccaacca caacccctgc accaaggcca cctacaccag cacctaccat cgcaagccag 60 ccactgtccc tgaggccaga ggcatgtagg cctgcagcag gaggcgccgt gcacacacgc 120 ggcctggact ttgcctgcga tatctacatc tgggcaccac tggcaggaac ctgtggcgtg 180 ctgctgctga gcctggtgat taccctgtat 210 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy-variable light linker <400> 61 ggtggtggcg gcagtggtgg cggtggctca 30 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy-variable light linker <400> 62 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy-variable light linker <400> 63 ggtggtggcg gcagtggtgg cggtggctca ggcggtggtg gctccggtgg cggtggctct 60 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy-variable light linker <400> 64 Glu Glu Lys Lys Met Pro 1 5

Claims (22)

  1. 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조작된 면역 세포(engineered immune cell).
  2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포가 조작된 T 세포, 조작된 자연 살해(natural killer: NK) 세포, 조작된 NK/T 세포, 조작된 단핵구, 조작된 대식구 또는 조작된 수지상 세포인, 조작된 면역 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수용체가 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)인, 조작된 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CAR이 항-CD19-4-1BB-CD3ζ CAR인, 조작된 면역 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적-결합 분자가 항체인, 조작된 면역 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체가 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment: scFv)인, 조작된 면역 세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 CD3/T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR) 복합체 내의 인자, 사이토카인, 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자 또는 면역 반응을 하향조절하는 수용체에 결합하는, 조작된 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CD3/TCR 복합체 내의 인자가 CD3ε, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3δ, CD3γ 또는 CD3ζ인, 조작된 면역 세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 HLA 부류 I 분자가 β2-마이크로글로불린, α1-마이크로글로불린, α2-마이크로글로불린 또는 α3-마이크로글로불린인, 조작된 면역 세포.
  10. 제7항에 있어서, 상기 면역 반응을 하향조절하는 수용체가 세포 예정사 단백질(programmed cell death protein) 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-회합 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4: CTLA-4), T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3: Tim3), 살해 면역글로불린-유사 수용체(killer immunoglobulin-like receptor: KIR), CD94, NKG2A 또는 단백질 티로신 포스파타제로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  11. 제7항에 있어서, 상기 사이토카인이 인터류킨(IL)-6, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, IL-35, 인터페론(IFN)-γ, IFN-β, IFN-α, 종양 괴사 인자(TNF)-α 또는 전환 성장 인자(TGF)-β인, 조작된 면역 세포.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적-결합 분자가 CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD30, CD38, CD45, CD52 또는 CD127에 결합하는, 조작된 면역 세포.
  13. 제7항에 있어서, 상기 국소화 도메인이 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 또는 골지 보유 서열; 프로테오좀 국소화 서열; CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B로부터 유래되는 막관통 도메인 서열(transmembrane domain sequence)을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ER 또는 골지 보유 서열이 아미노산 서열 KDEL(서열 번호 4), KKXX(서열 번호 9), KXD/E(서열 번호 10) 또는 YQRL(서열 번호 11)을 포함하며, X가 임의의 아미노산인, 조작된 면역 세포.
  15. 제13항에 있어서, 상기 프로테아좀 국소화 서열이 PEST 모티프를 포함하는, 조작된 면역 세포.
  16. 제1항에 있어서, 상기 면역 활성화 수용체가 비-천연 발생 분자인, 조작된 면역 세포.
  17. 제1항에 있어서, 상기 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자가 비-천연 발생 분자인, 조작된 면역 세포.
  18. 암의 치료를 위한 제1항의 조작된 면역 세포의 용도로서, 치료량의 상기 조작된 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 조작된 면역 세포의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포가 정맥내 주입, 동맥내 주입, 종양 내로의 직접 주사 및/또는 수술 후의 종양 층의 관류, 인공 스캐폴드 내의 종양 부위에서의 이식, 척수강내 투여 및 안구내 투여에 의해 상기 대상체에게 투여되는, 조작된 면역 세포의 용도.
  20. 제18항에 있어서, 상기 암이 고형 종양 또는 혈액 악성종양인, 조작된 면역 세포의 용도.
  21. 제1항의 조작된 면역 세포의 생성 방법으로서, 면역 활성화 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 국소화 도메인에 연결된 표적-결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 면역 세포 내로 도입함으로써, 조작된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 조작된 면역 세포의 생성 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포가 생체 외에서 생성되는, 조작된 면역 세포의 생성 방법.
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