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KR20160011565A - 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20160011565A
KR20160011565A KR1020150045438A KR20150045438A KR20160011565A KR 20160011565 A KR20160011565 A KR 20160011565A KR 1020150045438 A KR1020150045438 A KR 1020150045438A KR 20150045438 A KR20150045438 A KR 20150045438A KR 20160011565 A KR20160011565 A KR 20160011565A
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주식회사 레모넥스
원철희
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Abstract

단백질 전달용 조성물 및 이를 이용한 생리활성 물질 또는 단백질의 전달 방법에 관한 것이다.

Description

생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION FOR DELIVERY OF BIOACTIVE MATERIAL OR PROTEIN AND USES THEREOF}
본원은 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.
약물전달 시스템은 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 기타 저분자 등을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 의미한다. 신약 개발에 필요한 비용과 시간을 절감해 주는 상기 기술은 최근 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국들은 지난 80년대 후반부터 제약회사 등 기업을 중심으로 신약 개발과 함께 약물전달시스템의 개발에 전력을 쏟아 왔다.
지금까지는, 바이러스 유전자, 재조합 단백질, 리포좀(liposome), 양이온성 고분자, 그리고 다양한 형태의 나노입자와 나노물질들이 동물 세포 내로의 약물전달을 위해 이용되었다. 그러나 많은 양이온성 리포좀들과 양이온성 고분자들은 임상에 적용하기에는 세포에 독성이 강하여 부적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 안정적인 핵산의 세포막 투과를 위하여 핵산의 주 사슬을 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 비싸고 오랜 시간이 걸리며 노동 집약적인 공정이 요구되므로 임상 적용에는 적합하지 않다. 의미 있는 시도로서, 양자점, 자성 입자, 또는 금 나노입자를 포함한 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약물전달 시스템(drug delivery system, DDS)이 개발된 바 있다. 예를 들어, "다공성 실리콘 입자를 이용한 영상진단 약물전달체 및 그의 제조방법(대한민국 공개특허 제2010-0117433호)" 등의 관련 연구가 있었다. 그러나, 이러한 입자들은 세포에 독성을 가지며 핵산 등의 생체 고분자의 도입에 용이하지 않은 구조를 가지며, 세포 내로의 도입 효율도 낮다는 단점이 있었다.
세포 내에서의 단백질 기능의 연구 또는 단백질의 세포내 전달을 위해서는 효율적인 단백질 전달 시스템이 필요하다. 그러나, 공통적으로 음전하를 띠는 DNA 및 RNA 등의 핵산과는 달리, 단백질은 공통된 전하를 가지지 않으며 불안정하기 때문에 쉽게 변성되는 특징이 있다. 따라서, 범용적으로 적용할 수 있는 단백질 전달 시스템이 아직까지 개발된 바 없었다. 현재 개발된 단백질 전달 시스템은 단백질의 활성 유지가 어렵고 여러 단백질에 공통적으로 적용하기 어렵기 때문에 사용에 제약이 따른다.
본원의 일 구현예는 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.
본원의 일 구현예는, 단백질을 다공성 실리카 나노입자의 기공 내로 도입하여 목적 세포 내로 전달할 수 있고, 상기 전달 과정에서 생체 내의 분해효소에 의한 상기 단백질의 분해를 억제할 수 있으며, 그 표면에 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머가 결합되어 상기 생체 고분자의 세포 내로의 도입을 촉진할 수 있거나, 특정 세포로의 도입을 선택적으로 유도할 수 있는, 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 단백질 전달용 조성물, 및 상기 단백질 전달용 조성물을 이용한 용도 (예: 약제학적으로 허용 가능한 용도) 및 단백질 전달 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 일 측면은, 평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 단백질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 다른 측면은, 평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩된 단백질을 포함하는 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 단백질 전달 방법을 제공하여 약제학적 용도로 사용할 수 있다.
본원의 또 다른 측면은, 평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 상기 작용기 또는 리간드에 결합된 생리활성 물질을 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 또 다른 측면은, 상기 본원의 일 측면에 따른 생리활성 물질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 생리활성 물질 전달 방법을 제공하여 약제학적 용도로 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 고효율의 단백질 전달용 조성물 또는 생리활성 물질 전달용 조성물이 제공될 수 있다. 본원의 일 구현예에 따른 단백질 전달용 조성물 또는 생리활성 물질 전달용 조성물은, 다공성 실리카 나노입자의 기공 내부 또는 외부에 단백질 또는 생리활성 물질을 도입할 수 있으므로, 단백질 또는 생리활성 물질을 세포 내로 도입시 외부 환경의 영향을 덜 받아 상기 단백질 또는 생리활성 물질의 구조가 안정하게 유지될 수 있어 전달의 효율이 높다. 아울러, 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면(비제한적 예로서, 상기 입자의 외부 표면)에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함함으로써, 세포 내로의 도입 효율 역시 현저하게 높아지는 효과가 있거나, 목적 세포에만 선택적으로 도입되는 효과가 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 다공성 실리카 나노입자를 포함한 용액과 상기 단백질 또는 생리활성 물질을 단순히 혼합하는 것만으로 상기 단백질 또는 생리활성 물질을 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 도입할 수 있으며, 화학적 결합, 가교결합, 또는 복잡한 정제 분리 과정을 필요로 하지 않으므로 간단하고 비용 효율적이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 실리카 나노입자는 높은 단분산 특성을 가지고 생체적합성이 뛰어나며 세포 독성을 나타내지 않으므로 질병 치료를 위하여 임상적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 표면 개질된 실리카 나노입자의 예시를 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 약물 전달용 조성물 및 이의 세포내 작용의 모식도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포의 형광 현미경 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포의 형광 현미경 이미지이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포를 염색하여 나타낸 이미지이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포를 ONPG 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포에서 단백질 분해효소의 영향을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포에서 단백질이 정상적으로 기능하는지 여부를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포에서 단백질이 정상적으로 기능하는지 여부를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 각각 본원의 일 실시예에 따른 MSNPN의 합성 및 TAMRA-표지 MSNPN의 합성을 나타낸 모식도이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 프로테아좀-MSNPN의 상호작용 및 SDS-PAGE 이미지를 나타낸 것이다.
도 12a, 도 12b, 및 도 12c는 각각 본원의 일 실시예에 따른 정제된 프로테아좀의 (a) 일차원 SDS-PAGE 및 CBB 염색, (b) suc-LLVY-AMC에 의해 시각화된 비-변성 겔 분석, 및 (c) CP 및 RP 서브유닛에 대항하는 다양한 항체를 이용한 면역블롯팅 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본원의 일 실시예에 따른 MSNPN, 프로테아좀, 및 MSNPN-프로테아좀 복합체를 사용한 suc-LLVY-AMC 가수분해 분석를 나타낸 그래프이다(RFU: 상대 형광 유닛).
도 14는 본원의 일 실시예에 따른 프로테아좀 및 프로테아좀-MSNPN의 (a) 면역블롯팅 및 (b) 이미다졸 용출 검정 결과를 나타낸 이미지이다.
도 15는 본원의 일 실시예에 따른 MSNPN 및 프로테아좀-MSNPN의 (a) 투과 전자 현미경(TEM) 이미지 및 (b) DLS(dynamic light scattering) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본원의 일 실시예에 따른 프로테아좀 및 프로테아좀-MSNPN의 인비트로 프로테아좀 분해 분석 결과를 나타낸 SDS-PAGE/IB 이미지이다.
도 17a 및 도 17b는 각각 본원의 일 실시예에 따른 TAMRA-표지된 MSNPN 또는 프로테아좀-MSNPN이 처리된 HeLa 세포의 (a) 형광 현미경 이미지 및 (b) TEM 이미지이다. 화살표는 세포질에 국부화된 MSNPN을 표시한다
도 18은 본원의 일 실시예에 따른 (a) MSNPN 및 (b) 프로테아좀-MSNPN 의 농도에 따른 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 본원의 일 실시예에 따른 프로테아좀-MSNPN의 다양한 pH 조건 하에서의 suc-LLVY-AMC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본원의 일 실시예에 따른 (a) Dox의 처리 기간, 및 (b) 처리 농도에 따른 유도가능한 타우 세포주의 결과를 나타낸 이미지이다.
도 21은 본원의 일 실시예에 따른 Dox, MSNPN 및 프로테아좀-MSNPN의 유도가능한 타우 세포주 처리시 SDS-PAGE/IB 이미지 및 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 본원의 일 실시예에 따른 Dox, MSNPN 및 프로테아좀-MSNPN의 세포 처리시 (a) 외부 프로테아좀에 의한 번역 후 타우 조절을 나타낸 그래프 및 (b) MG132 처리 세포의 SDS-PAGE/IB 이미지이다.
도 23은 본원의 일 실시예에 따른 타우 면역염색 및 DAPI 카운터염색을 이용한 현미경 형광 분석 이미지이다.
도 24는 본원의 일 구현예에 따른 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자의 합성 모식도이다.
도 25는 본원의 일 실시예에 따른 단백질 전달용 조성물의 세포내 유입을 나타낸 이미지이다.
도 26은 본원의 일 실시예에 따른 단백질 전달용 조성물에 의한 RNase 전달 과 기능적 유효성에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 본원의 일 실시예에 따른 단백질 전달용 조성물에 의한 RNase 전달 및 이에 의한 종양 크기의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 28a및 28b은 본원의 일 실시예에 따른 단백질 전달용 조성물에 의한 항체 전달을 평가하기 위한 (a) 마우스 모델 및 (b) 형광 이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “생리활성 물질(bioactive agent)"은 투여된 후 수여자(동물 대상)에게 물리적으로, 생리적으로, 정신적으로, 생화학적으로, 생물학적으로, 또는 다른 신체 기능에 양성적 또는 음성적인 방식으로 영향을 줄 수 있는 어떠한 약제라도 포함하는 것을 의미한다.
예를 들어, 상기 '생리활성 물질'은 약물, 단백질, 펩타이드, miRNA, siRNA, DNA, 플라스미드(plasmid) DNA, 작은 분자(small molecules), 항체, 바이러스, 미생물, 체세포 핵, 세포소기관, 미토콘드리아, 효소, 보조영양제, 비타민, 천연물, 추출물, 또는 다른 활성 약제를 포함할 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기 생리활성 물질은 단백질, 펩타이드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 내인성리간드, 신경전달물질, 호르몬, 오타코이드(autacoid), 사이토카인(cytokine), 항바이러스제, 항암제, 항생제, 산소-강화제, 산소-함유제, 항전간제 및 항염증 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 생리활성 물질은 칼시토닌, 사이클로스포린, 인슐린, 옥시토신, 타이로신, 엔케팔린, 타이로트로핀 분비호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장호르몬, 아라키도닉산, 혈소판활성화인자(PAF), 안지오텐신, 키닌, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 스롬복세인, 에이코사노이드, 바소프레신 및 바소프레신 유사체, 카탈라제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 인터류킨, 인터페론, TGF-베타(beta), BMP, 집락 자극 인자, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 저해제 및 멜라닌세포-자극호르몬으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 생리활성 물질은 알츠하이머 길항제 또는 백신을 포함할 수 있다. 알츠하이머병을 치료하기 위한 생리활성 물질은 메만틴 염산염(memantine hydrochloride, Merz Pharmaceuticals의 Axura?), 도네페질 염산염(donepezil hydrochloride, Eisai Co. Ltd.의 Aricept?), 리바스티그민 주석산염 (rivastigmine tartrate, Novatis의 Exelon?), 갈란타민 염산염(galantamine hydrochloride, Johnson & Johnson의 Reminyl?), 또는 타크린 염산염(tacrine hydrochloride, Parke Davis의 Cognex?)을 포함할 수 있다. 생리활성 물질은 약제학적으로 유효량을 갖는 콘드로이틴 황산염, 히알루론산, 성장 인자 및 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
예를 들어, 상기 생리활성 물질은 인슐린 또는 인슐린 유사체를 포함한다. 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제, GLP-1 유사체, GLP-2, GLP-2 유사체, 디펩티딜 펩티다제 4의 저해제(DPP-4 저해제), 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide), 알비글루티드(albiglutide), 또는 타스포글루티드(taspoglutide), 알파-글루코시다제 저해제, 아밀린 유사체, 소디움-글루코스 코-트랜스포터 타입 2(SGLT2, sodium-glucose co-transporter type 2) 저해제, 벤플루오렉스(benfluorex), 및 톨레스타트(tolrestat)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 인슐린-함유 나노입자는 미량의 아연 또는 칼슘을 포함하거나, 장용피 처리된다. 일 실시예에서, 생리활성 약제는 비-인슐린 엑세나티드, 비-인슐린 프람린티드(pramlintide), 인슐린, 인슐린 유사체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 생리활성 물질은 또한 옥시토신, 바소프레신, 성선자극호르몬방출호르몬, 갑상선자극호르몬방출호르몬, 갑상선자극호르몬, 부신피질자극 호르몬, 프롤락틴, 루리베린(luliberin) 또는 황체형성 호르몬 분비 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 인자, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터페론, 가스트린, 테트라가스티린, 펜타가스트린, 유로가스트로인, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도르핀, 안지오텐신, 레닌, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 타이로시딘, 그라미시딘, 알데스테론, 하이드로콜티손, 콜티손, 에스트라디올, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토로테론, 타이록신(tyroxine), 및 이들의 합성 유사체, 변형체 및 약물학적 활성 단편, 단클론 항체 및 가용성 백신으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 성장 호르몬(GH)은 인간 또는 다른 동물에서 성장 및 세포 재생산을 자극하는 펩타이드 호르몬이다. 이것은 뇌하수체 전엽의 측면 날개부위 내에서 성장자극 세포에 의해 합성, 저장 및 분비되는 191-아미노산의 단일 사슬 폴리펩타이드 호르몬이다.
예를 들어, 상기 생리활성 물질은 세포 독성 약물, 항-바이러스 약물, 항-신생물 약물, 항-염증 약물, 항생제, 진통제 약물, CNS에서 작용하는 약물, 양성자 펌프 억제제, 안지오텐신변환효소저해제, 안지오텐신수용체길항제, 칼슘길항제, 히스타민수용체길항제, 콜레스테롤 생합성저해제, 당뇨병치료제, 알츠하이머병치료제, 면역억제제, 합성항균제, 항종양제 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 활성 약물 부분은 퓨린과 같은 항-대사물질 마스커레이드(masquerade), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드, 클로람부실(chlorambucil), 아이포스파미드(ifosfamide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈데신(vindesine), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 도세탁셀(docetaxel), 또는 파클리탁셀(paclitaxel) 을 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "단백질"은 표적 특이적인 단백질뿐 아니라 면역글로불린, 당단백질, 항체, 폴리펩타이드, 효소, 또는 펩타이드 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 대상 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드에는 헤모글로빈, 혈청 단백질, 예컨대 인자 Ⅶ, Ⅷ, 및 Ⅸ를 포함하는 혈액 인자; 면역글로불린, 사이토카인, 예컨대 인터류킨, 다시 말하면, IL-1 내지 IL-13, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 렉틴, 당 결합 단백질, 당단백질, SUMO 단백질, 바람직하게는 인터페론, 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같은 렉틴, 과립구 콜로니 자극 인자를 비롯한 콜로니 자극 인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 포스포리파제(phospholipase) 활성화 단백질(PLAP)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일반적인 생물학적 또는 치료적 대상의 다른 단백질에는 인슐린, 신혈관생성유도인자, 예컨대 VEGF, 에리스로포이에틴(erythropoietin), 식물 단백질, 예컨대 렉틴(lectin) 및 리신(ricin), 종양 괴사 인자 및 관련 단백질, 성장 인자, 예를 들어, 형질전환 성장 인자, 예를 들어, TGFα 또는 TGFβ 및 표피 성장 인자, 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포이에틴, 색소성 호르몬, 시상하부 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 융모성 생식선 자극 호르몬, 난포 자극 호르몬, 갑상샘 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성화제 등이 포함된다.단백질 부분은 면역글로불린, 당단백질, 항체, 폴리펩타이드, 효소, 펩타이드, 인터페론(INF), 인터류킨, 호르몬, 소마토메딘(somatomedin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 색소성 호르몬(pigmentary hormone), 시상하부 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴(prolactin), 융모성 생식선 자극 호르몬, 여포-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬 또는 조직 플라스미노겐 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단백질의 예들은 형광단백질, 겨자무퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 카스파아제-3, 리파아제, 포토리아제(photolyase), 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD), 보톨리눔 독소(botulinium toxin), 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘 키나아제(thyamidine kinase from herpes simplex virus, HSV-TK), 카스파아제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 우레이트 옥시다아제(urate oxidate), 베타-글루코시다아제, 베타-헥소사미니다아제(hexosaminidase), 또는 마우스(murine) 항-CD3 항체 등을 포함할 수 있다.
이하, 본원의 구현예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 측면은, 평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 단백질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
종래 다공성 실리카 나노입자는 기공의 평균 직경이 수 nm에 불과하기 때문에 단백질과 같은 생체 고분자가 상기 기공 내부에 충분히 들어가지 못하는 단점이 있다. 그러나, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 종래 약물전달을 위한 다공성 실리카 나노입자에 비하여 기공의 평균 직경이 더욱 크게 확장되었을 뿐만 아니라, 기공의 내부 또는 외부 표면의 표면 음전하, 양전하 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드에 단백질이 흡착 또는 로딩되기 때문에 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 기공 내부 또는 외부에 포함시킬 수 있다. 또한, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 확장된 크기의 기공을 가질 뿐 아니라 상기 입자의 외면과 내면 전체에 확장된 기공이 형성되어 있으며, 상기 입자 내부 깊숙이에도 상기 확장된 기공이 형성되어 있어, 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 입자의 외면과 내면의 기공에 포함시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드는 니켈, 니켈-NTA(nitrilotriacetic acid), 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물은, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 표면에 결합된 리간드에 상기 단백질의 태그(tag)가 결합됨으로써 상기 다공성 실리카 나노입자 내에 흡착 또는 로딩된 상기 단백질을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 리간드와 단백질의 정전기적 상호작용에 의해 상기 단백질이 상기 실리카 입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 상기 단백질 전달용 조성물을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면이 음이온 및/또는 양이온을 띠도록 표면 개질한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 상기 단백질은 음이온 및/또는 양이온을 띠는 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면과 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면이 음이온 및/또는 양이온을 띠도록 표면 개질하는 것은, 흡착 또는 로딩하고자 하는 단백질의 pI 값에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물은, 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머는 상기 다공성 실리카 나노입자의 외부 표면에 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머는 상기 단백질이 흡착 또는 로딩된 상기 조성물이 표적 세포 내로 수송될 수 있도록 한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase), 포스파타아제(phosphatase) 등의 각종 효소, 각종 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 겨자무퍼옥시다아제(HRP), 카스파아제-3, 리파아제, 포토리아제(photolyase), 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD), 보톨리눔 독소(botulinium toxin), 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘 키나아제(thyamidine kinase from herpes simplex virus, HSV-TK), 카스파아제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 우레이트 옥시다아제(urate oxidate), 베타-글루코시다아제, 베타-헥소사미니다아제(hexosaminidase), 또는 마우스(murine) 항-CD3 항체 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 내인성리간드, 전신 호르몬, 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 신경전달물질, 오타코이드(autacoid), 막단백질, 세포질내 단백질, 핵내 단백질, 수용체, 효소, 혈액내 단백질, 합성단백질, 합성펩타이드, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질과 같은 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 등과 이와 같은 상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자, 신경전달물질로는 도파민, 노아드레날린, 아드레날린, 아세틸콜린, 가바, 세로토닌, 히스타민, 엔케팔린, 소마토스타틴, 또는 Substance P 등의 아민계 전달물질, 펩타이드성 전달물질 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 사이토카인 및 호르몬으로는 펩타이드성 호르몬, 아미노산성 호르몬, 스테로이드성 호르몬, 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF) 및 프로테아좀 등의 단백질 복합체, 카스파제, 리보뉴클레아제, 키나아제, 포스파타아제 등의 각종 효소, 각종 항체, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 원생동물, 미생물, 바이러스, 어류, 심해저 생물, 양서류, 파충류, 포유류, 외계동식물의 세포에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본원의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원의 다른 측면은, 평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기(리간드) 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 상기 리간드에 결합된 생리활성 물질을 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질에 특이적으로 결합하는 리간드는 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 약물, 단백질, 펩타이드, miRNA, siRNA, 효소, 보조영양제, 비타민, 천연물, 또는 추출물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질 전달용 조성물은 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 생리활성 물질 전달 방법을 제공하여 약제학적 용도로 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 본원의 도 1의 다공성 실리카 입자 또는 생리활성 물질 전달용 조성물을 이용한 질환 또는 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 또는 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 예를 들면, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 또는 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 예컨대, 본원의 일 구현예에 있어서, 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본원의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 또는 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 본원의 도 1의 다공성 실리카 입자 또는 생리활성 물질 전달용 조성물을 이용한 관련 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물(기능성 화장료 조성물)을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 유효성분 이외에 화장품 제조에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
종래 다공성 실리카 나노입자는 기공의 평균 직경이 수 nm에 불과하기 때문에 단백질과 같은 생체 고분자가 상기 기공 내부에 충분히 들어가지 못하는 단점이 있다. 그러나, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 종래 약물전달을 위한 다공성 실리카 나노입자에 비하여 기공의 평균 직경이 더욱 크게 확장되었을 뿐만 아니라, 기공의 내부 또는 외부 표면의 표면 음전하, 양전하 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드에 단백질이 흡착 또는 로딩되기 때문에 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 기공 내부 또는 외부에 포함시킬 수 있다. 또한, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 확장된 크기의 기공을 가질 뿐 아니라 상기 입자의 외면과 내면 전체에 확장된 기공이 형성되어 있으며, 상기 입자 내부 깊숙이에도 상기 확장된 기공이 형성되어 있어, 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 입자의 외면과 내면의 기공에 포함시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내부 또는 외부에 생리활성 물질 또는 단백질이 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 실리카 나노입자는 표면 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면이 음이온 및/또는 양이온을 띠도록 표면 개질한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 상기 생리활성 물질은 음이온 및/또는 양이온을 띠는 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면과 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면이 음이온 및/또는 양이온을 띠도록 표면 개질하는 것은, 흡착 또는 로딩하고자 하는 생리활성 물질의 pI 값에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 표면이 개질되어 음이온을 띠는 경우(예를 들어, 실란올, 포스페이트, 카르복실레이트 등에 의한 표면 개질의 경우) 양이온을 띠는 생기능성 물질 흡착 또는 로딩용으로 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 표면이 개질되어 양이온을 띠는 경우(예를 들어, 아민기, 양이온성 고분자 등에 의한 표면 개질의 경우) 음이온을 띠는 생기능성 물질 흡착 또는 로딩용으로 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 특정 태그와 결합하는 물질 또는 리간드에 의하여 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 표면이 개질된 경우(예를 들어, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 스트렙타비딘, 또는 아비딘 등에 의한 표면 개질의 경우: 이들은 각각 his-태그, GST, MBP, 비오틴, 또는 비오틴 태그와 결합할 수 있음) 특정 태그가 포함된 생리활성 물질의 흡착 또는 로딩용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 외부 표면은 상기한 기공의 내부 표면의 개질에 사용된 물질 또는 리간드를 이용하여 개질될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 외부 표면은 세포투과성 펩타이드(세포내 전달 효율 증가), 폴리에틸렌글리콜(입자 외부표면에 비선택적인 생분자의 흡착 또는 로딩을 방지하고, 입자의 뭉침 현상 방지), 포스파티딜에틸아민, 항체, 엡타머, 또는 리간드 등에 의하여 개질될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 항체, 엡타머, 또는 리간드 등은 상기 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물이 특정 세포 또는 특정 장기에 선택적으로 전달되도록 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 실리카 나노입자는 본원의 도 1에 도시된 바와 같이, 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 또는 비오틴에 의하여 표면 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 생리활성 물질 내의 태그가 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공에 결합되어 상기 기공 내에 내에 효과적으로 담지될 수 있다. 예를 들어, 니켈 또는 니켈-NTA로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자의 니켈이 생리활성 물질의 His-태그와 비공유 상호작용하여 상기 생리활성 물질이 상기 기공 내로 흡착 또는 로딩될 수 있다. GST-태그를 갖는 생리활성 물질의 흡착 또는 로딩을 위해서는 글루타티온으로 다공성 실리카 나노입자를 표면 개질시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩된 생리활성 물질을 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물을 제공할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는, 나노입자 표면 및/또는 기공 내부를 양전하를 띠거나 음전하를 띠도록 만들 수 있으므로, 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 생리활성 물질을 모두 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내부에 부착시키는 것이 가능하다. 또한, 본원의 다공성 실리카 나노입자는 기공의 평균 직경이 크기 때문에, 크기가 큰 생리활성물질도 수용이 가능하다. 즉, 생리활성 물질의 표면 전하와 생리 활성 물질의 크기에 구애받지 않고 상기 단백질을 세포 내부로 용이하게 도입하는 것이 가능하다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 단분산(monodispersity) 특성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 단분산 특성은 분자량의 분포 범위 또는 입자 크기 범위가 매우 좁은 특성으로서, 특히 나노물질의 단분산은 나노입자의 크기와 관련하여 체계적인 약물전달시스템 설계에 있어서 필수적이다. 상기 단분산 특성은 전달용 조성물의 세포 내 흡수 및/또는 약효를 결정하는 데에 있어서 나노물질의 모양 및/또는 표면의 화학적 특성에 더하여 하나의 요소가 될 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 조절 가능한 기공, 입자 크기, 넓은 표면적, 큰 기공 부피, 표면 기능화의 용이성, 또는 세포 독성이 적거나 없어 높은 생체적합성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 자극에 반응하는 게이트 개폐시스템을 가져 조절 가능한 지효성 시스템(controlled release system)에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 기공에 개폐가 가능한 게이트를 가질 수 있으며, 외부의 자극에 의하여 상기 게이트의 개폐가 조절되므로, 상기 기공 상에 포함된 약물의 해리 여부, 시기, 또는 양 등을 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 파라핀 캡 등에 의하여 기공이 외부와 차단되어 있을 수 있으며, 일정 온도 이상, 예를 들어, 파라핀 용융 온도 이상의 자극을 받으면 상기 파라핀 캡이 용융되어 기공이 노출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 평소에는 기공 주위에 고분자가 결합되어 있어 기공 내의 약물 등이 외부로 유출되지 않지만, 효소 등의 자극이 주어지면 상기 고분자가 절단되어 상기 기공이 노출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 기능성 단백질 또는 단백질 약물은 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질이 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 포함됨으로써, 상기 단백질은 외부의 단백질 분해효소(protease), 또는 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 외부 분해효소로부터의 생분자 보호 기능은 약물 전달체 또는 기능성 고분자 전달체로서 임상적 의의가 있는 중요한 요소의 하나이다. 또한, 상기 단백질은 상기 다양한 분해효소 또는 상기 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호되기 위하여 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), O-메틸화, 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 핵산 등과 같이 노동력을 요하고 높은 비용 및 시간을 소모하는 화학적 변형을 요구하지 않으므로 제조가 용이하고 경제적이다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 그의 위치 추적을 위한 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 그 표면에 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 단백질을 흡착 또는 로딩시키는 과정은 상기 다공성 실리카 나노입자와 상기 단백질을 용액 내에서 단순히 혼합하여 흡착 또는 로딩시키는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 단백질을 흡착 또는 로딩시키는 과정은 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자와 상기 단백질을 PBS(phosphate buffered saline)가 포함된 용액 내에 혼합하여 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 과정은 화학적 결합, 가교결합, 또는 복잡한 정제 분리 과정을 필요로 하지 않으므로 간단하고 비용이 적게 들며 효율적인 모듈 방식으로 실행할 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 세포에 독성을 나타내지 않으며 생체친화적인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 추가적으로, 상기 다공성 실리카 나노입자는 약물 전달 효율 상승 및/또는 세포 내로의 도입을 위하여 추가적인 표면 처리를 필요로 하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공 내에 양전하 또는 음전하가 형성되어 있으며, 상기 단백질은 상기 양전하 또는 음전하와의 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착 또는 로딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머는 외부 물질을 세포막을 통하여 세포 내로 도입하는 것을 촉진하는 펩타이드를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 펩타이드 서열 자체로 세포 내부 도입을 촉진하는 것일 수 있고, 또는 다른 물질, 예를 들어 단백질의 도움을 받아서 세포 내부 도입을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포막에 존재하는 단백질의 도움을 받아서 외부 물질의 세포 내부로의 도입을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 세포의 세포막(plasma membrane)은 외부 물질이 세포 내로 들어오는 것을 방지하기 위해 존재한다. 그러나 약물 또는 리포터(reporter) 분자들이 세포 내에서 활성을 나타내기 위해서는 세포 내로의 도입이 효율적으로 이루어져야 한다. 따라서 짧은 가닥의 분자인 양이온성 펩타이드(cationic peptide)를 약물 전달체에 결합시킴으로써 소분자, 핵산, 항체, 및/또는 나노입자 등의 약물을 세포 내로 전달하는데 응용할 수 있다.
이러한 세포 투과성 펩타이드의 세포 도입 기전이 명확히 밝혀지지는 않았으나, 여러 가지의 기전을 통해 세포 투과가 이루어지는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 에너지 의존성 엔도시토시스(energy dependent endocytosis) 및 에너지 비의존성 직접이동(energy independent direct translocation) 등이 있다. 본원에서 사용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드는 상기 두 가지 기전 중 어떠한 기전에 의해서도 상기 다공성 실리카 나노입자를 세포 내로 도입할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드로서 사용될 수 있는 펩타이드의 종류는 하기 표 1 및 표 2에 나열되어 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
상기 나열된 세포 투과성 펩타이드의 아미노산 서열은 상기 세포 투과성 펩타이드의 활성이 유지되는 한 그 서열 일부에 변형이 가해질 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드는 MPAP, TAT, 또는 폴리아르기닌을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 MPAP는 미리스틱산(myristic acid)-ARRRRRRRC의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 상기 TAT는 RKKRRQRRR의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으며, 상기 폴리아르기닌은 RRRRRRRRR(9 개의 아르기닌)의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 단백질 약물 전달용 조성물의 모식도이다.
도 2를 참조하면, 본원의 일 구현예에 있어서 상기 다공성 실리카 나노입자는 작은 크기와 그 입자 특성 때문에 세포에 의해 흡수(endocytosis)될 수 있어 흡착 또는 로딩된 단백질 약물과 함께 세포 내로 도입될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자는 아민, 카르복시기, 포스파티딜 에틸아민 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)에 의하여 기능화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 포스파티딜 에틸아민 또는 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 포스파티딜 에틸아민 또는 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 다공성 실리카 나노입자의 뭉침이 방지되거나, 다른 생분자와의 비특이적 결합이 최소화 되거나, 또는 기공 외의 RNA 흡착 또는 로딩이 감소되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 크기는 평균 약 0.1 μm 내지 약 100 μm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 평균 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 평균 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 1 nm 내지 약 90 nm, 약 10 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 90 nm, 약 30 nm 내지 약 90 nm, 약 40 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 90 nm , 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 90 nm , 약 1 nm 내지 약 80 nm, 약 10 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 80 nm , 약 30 nm 내지 약 80 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 70 nm, 약 10 nm 내지 약 70 nm, 약 20 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 1 nm 내지 약 60 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 60 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 1 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 50 nm, 약 40 nm 내지 약 50 nm, 약 1 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm , 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 30 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 30 nm , 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 20 nm, 약 10 nm 내지 약 20 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
종래 다공성 실리카 나노입자는 기공의 평균 직경이 수 nm에 불과하기 때문에 단백질과 같은 생체 고분자가 상기 기공 내부에 충분히 들어가지 못하는 단점이 있다. 그러나, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 종래 약물전달을 위한 다공성 실리카 나노입자에 비하여 기공의 평균 직경이 더욱 크게 확장되었기 때문에 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 기공 내부에 포함시킬 수 있다. 또한, 본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는 확장된 크기의 기공을 가질 뿐 아니라 상기 입자의 외면과 내면 전체에 확장된 기공이 형성되어 있으며, 상기 입자 내부 깊숙이에도 상기 확장된 기공이 형성되어 있어, 생리활성 물질 또는 단백질을 더욱 용이하게 상기 입자의 외면과 내면의 기공에 포함시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자는, 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 단계는, 실리카 전구체로부터 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 실리카 전구체로부터 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 것은 상기 실리카 전구체를 계면활성제를 포함하는 용액과 혼합하는 것을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제를 포함한 용액은 알코올, 물, 및 수산화나트륨을 추가로 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), 또는 TMACl(tetramethylammonium chloride) 를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계는 팽창제를 이용하여 수행되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 팽창제는 트리메틸벤젠(trimethylbenzene, TMB), 또는 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 다공성 실리카 나노입자는 제조방법이 단순하여 대량 합성이 용이한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자는 실험실 기구를 이용할 경우 상기 제조 방법에 의해 1 회 합성에 적어도 약 1 g 이상을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1 -6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 트리(C1-6 알킬)벤젠은 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 또는 트리헥실벤젠을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1 -6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자와 트리(C1-6 알킬)벤젠이 포함된 혼합물을 약 80℃ 내지 약 200℃의 온도에서 가압처리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1 -6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자와 트리(C1 -6 알킬)벤젠이 포함된 혼합물을 약 80℃ 내지 약 200℃, 약 80℃ 내지 약 160℃, 약 80℃ 내지 약 120℃, 약 120℃ 내지 약 200℃, 약 160℃ 내지 약 200℃, 또는 약 120℃ 내지 약 160℃의 온도에서 가압처리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 기공을 확장시키는 단계에 의하여 약 5 nm 미만의 크기를 가지는 기공이 약 5 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm의 크기를 가지는 기공으로 확장될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물은 혈관주사용 약물, 경구투여용 약물, 경피투여용 약물 또는 패치, 국부투여용 약물, 화장품, 연고, 식품, 음료, 샴푸, 세제, 백혈병, 투석, 혈액이식, 혈관이식, 치아이식, 임플란트식립, 혈관성형술, 모발이식, 조직이식, 장기이식, 골이식, 핵이식, 세포이식, 생식세포이식, 배아이식, 동물복제, 형질전환배아의 제작, 형질전환동물 제작, 줄기세포 제작, 품질개량식물 제작, 이종간핵이식, 이종간장기이식, 유도만능줄기세포 제작, 예를 들어, 배아발생기술(microinjection, parthenogenesis, zygogenesis, nuclear transfer, blastomere transfer, blastomere fusion, IVF, ICSI 등), 세포분화유도기술, 줄기세포 치료제, 세포치료제, 호르몬제, 항체치료제, 캡슐제, 시럽, 연구용 시약, 환경오염물질 정화, 생화학 무기, 다이어트 용품, 성형술(두개악안면성형, 양악성형, 가슴성형) 등에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물은 자가면역질환(아토피, 피부가려움증, 천식, 류마티스 관절염), 고형암, 혈액암, 뇌 질환, 심혈관계 질환, 순환기계 질환, 호흡기계 질환, 소화기계 질환(위장관 질환, 역류성식도염, 소화성궤양, 위궤양), 염증성 질환, 뇌신경 질환, 만성 질환, 급성 질환, 노인성 질환, 난치성 질환, 치주 질환, 구강 질환, 두개악안면 질환, 허혈성 질환, 간 질환, 폐 질환, 피부 질환, 세균성 질환, 바이러스성 질환, 감염 질환, 골 질환(골다공증, 골절, 등), 관절염 질환, 척추 질환, 알레르기 질환, 환경성 질환, 음주 질환, 대사성 질환, 과민성 질환, 신장 질환, 갑상선 질환, 생식기 질환, 신생물성 질환, GERD, 자가면역 증상, 당뇨병, 유전적 증상, 바이러스/박테리아/기생충 감염, 기생충 증상, 신체 증상, 프리온 질환, 영양결핍증, 비타민/미네랄 결핍증, 미토콘드리아 질환, 사고, 성매개 질환, 임신 증상, 모유수유 증상, 선천적 기형, 남성/여성/영유아/소아/청소년 증상, 면역 장애, 균형 장애, 통증, 전신 장애, 혈액 증상, 혈관 증상, 신경 증상, 근육 증상, 심장 증상, 등/목/척수 증상, 눈 증상, 뇌 증상, 정신 증상, 코 증상, 입 증상, 치아 증상, 발/다리/무릎 증상, 상지 증상, 어깨 증상, 귀 증상, 폐 증상, 간 증상, 신장 증상, 담낭 증상, 췌장 증상, 소화계 증상, 전립선 증상, 남성 생식기 증상, 산과적 증상, 부인과적 증상, 갑상샘 장애, 청각 장애, 미용적 적용, 색소침착, 탈모, 발모, 제모 등에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 또 다른 측면은, 하기를 포함하는, 단백질의 전달 방법을 제공할 수 있다:
평균 기공 직경이 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자; 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩된 단백질을 포함하는 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 크기는 평균 약 0.1 μm 내지 약 100 μm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 평균 약 1 nm 이상 내지 약 100 nm 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 평균 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 1 nm 내지 약 90 nm, 약 10 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 90 nm, 약 30 nm 내지 약 90 nm, 약 40 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 90 nm , 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 90 nm , 약 1 nm 내지 약 80 nm, 약 10 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 80 nm , 약 30 nm 내지 약 80 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 70 nm, 약 10 nm 내지 약 70 nm, 약 20 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 1 nm 내지 약 60 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 60 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 1 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 50 nm, 약 40 nm 내지 약 50 nm, 약 1 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm , 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 30 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 30 nm , 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 20 nm, 약 10 nm 내지 약 20 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, 카스파제, 리보뉴클레아제, 키나아제, 포스파타아제 등의 각종 효소, 각종 항체, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 전신 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질과 같은 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 등과 이와 같은 상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자, 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF)와 같은 사이토카인 및 호르몬, 및 프로테아좀 등의 단백질 복합체, 카스파제, 리보뉴클레아제, 키나아제, 포스파타아제 등의 각종 효소, 각종 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자는 그의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자는 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘으로 표면 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질 내의 태그가 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공에 결합되어 상기 기공 내에 내에 효과적으로 담지될 수 있다. 예를 들어, 니켈 또는 니켈-NTA로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자의 니켈이 단백질의 His-태그와 비공유 상호작용하여 상기 단백질이 상기 기공 내로 흡착 또는 로딩될 수 있다. GST-태그를 갖는 단백질의 흡착 또는 로딩을 위해서는 글루타티온으로 다공성 실리카 나노입자를 표면 개질시킬 수 있으며, MBP-태그를 갖는 단백질의 흡착 또는 로딩을 위해서는 덱스트린으로 다공성 실리카 나노입자를 표면 개질시킬 수 있고, 비오틴-태그를 갖는 단백질의 흡착 또는 로딩을 위해서는 스트렙타비딘으로 다공성 실리카 나노입자를 표면 개질시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 나노입자는, 나노입자 표면 및/또는 기공 내부를 양전하를 띠거나 음전하를 띠도록 만들 수 있으므로, 양전하를 띠는 단백질과 음전하를 띠는 단백질을 모두 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내부에 부착시키는 것이 가능하다. 또한, 본원의 다공성 실리카 나노입자는 기공의 평균 직경이 크기 때문에, 크기가 큰 단백질도 수용이 가능하다. 즉, 단백질의 표면 전하와 단백질의 크기에 구애받지 않고 상기 단백질을 세포 내부로 용이하게 도입하는 것이 가능하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질 또는 단백질 등을 포함하는 약물 전달용 조성물이 목적 세포 내로 도입되는 것은 세포의 흡수작용에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다(도 2). 예를 들어, 상기 약물 전달용 조성물은 세포질 내 또는 핵 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 목적 세포는 상기 세포는 원핵 동물 또는 진핵 동물 유래의 세포일 수 있으며, 예를 들어 포유류 세포일 수 있고, 예를 들어 인간 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 암세포, 장기의 조직 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 암세포, 골세포, 위세포, 장세포, 폐세포, 간세포, 뇌세포, 혈관 세포, 면역 세포, 적혈구, 백혈구, 또는 림프구 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 약물은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, 카스파제, 리보뉴클레아제, 키나아제, 포스파타아제 등의 각종 효소, 각종 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 단백질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 단백질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 혈관 내 투여에 의하면 순환계를 통하여 몸 전체에 단백질을 전달하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경구투여에 의하면 주로 소화계로의 단백질 전달이 용이해질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 경피투여에 의하면, 피부를 통하여 단백질을 전달하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경피투여의 목적이 되는 질병에는 아토피, 탈모, 색소침착, 또는 피부병 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 주사에 의한 국부투여는 눈, 피부, 점막, 또는 국부적인 종양 조직과 같은 국소적이고 국부적 조직에의 적용이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 국부투여시 높은 생물학적 적용 가능성, 목적 조직에의 접근성, 및/또는 전신 적용시 일반적으로 수반되는 부작용을 줄일 수 있다. 예를 들어, 상기 국부 투여의 목적이 되는 질병에는 시력 감퇴, 아토피성 피부염, 헌팅턴병, 만성 통증, 또는 다형교아증 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1: 기공 확장된 다공성 실리카 나노입자( mesoporous silica nanoparticle, MSN)의 합성
세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 3.94 g과 1 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액 2.28 mL를 메탄올과 물의 혼합 용액 800 g (메탄올:물=0.4:0.6, w/w)에 용해시켰다. 다음으로 상기 수득된 용액을 격렬하게 교반하면서 테트라메톡시실란(tetramethoxysilane, TMOS) 1.3 mL를 대기 조건에서 상기 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 8 시간 동안 교반한 뒤 밤새 숙성시켰다. 그 결과 수득된 백색 침전물을 원심분리하여 남아있는 계면활성제를 제거하여 정제하였으며, 에탄올과 물을 각각 이용하여 5 회씩 세척하였다. 상기와 같이 제조된 다공성 실리카 나노입자를 20 mL의 에탄올에 현탁시키고, 4 mL의 염산을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액을 밤새 환류시켜 백색 분말을 수득하였다. 상기 생성된 백색 분말을 필터로 걸러 분리하고 에탄올로 세척하여 2 nm의 기공 크기를 가지는 다공성 실리카 나노입자를 수득하였다.
확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자를 준비하기 위하여, 상기 제조예에 의하여 제조된 다공성 실리카 나노입자를 에탄올에서 30 분간 초음파 처리하여 분산시키고, 물과 트리메틸벤젠(trimethylbenzene; TMB)을 첨가하였다(1:1 혼합비(v/v)로 총 20 mL). 이후 상기 혼합물을 가압처리기(autoclave)에 넣고 160℃에서 48 시간 동안 유지하였다. 이로써 생성된 백색 분말은 에탄올과 물을 이용하여 5 회씩 세척하였다. 이후, 상기와 같이 제조된 다공성 실리카 나노입자를 2 M 에탄올성 HCl에 현탁시킨 후 120℃에서 20 시간 동안 가압기에서 가열하여 유기 계면활성제(CTAB)를 제거하였다. 그런 다음, 수득된 혼합물을 여과하여 에탄올 및 물로 10 회씩 세척하여 기공이 확장된 MSN(도 11a 및 도 11b의 1)을 수득하였다.
제조예 2: Ni - NTA 로 개질된 실리카 나노입자( MSNPN )
상기 제조예 1에서와 같이 제조된 기공이 확장된 MSN 100 mg을 10 mL의 톨루엔에 현탁시키고 아민 기능화를 위하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 1 mL을 첨가하였다. 상기 현탁액을 밤새 환류시킨 후, 필터를 이용하여 여과하고, 잔여물을 에탄올로 10 회 세척하여 아민에 의해 기능화된 MSN(도 10a 및 도 10b의 2)을 수득하였다. 상기 아민-기능화된 MSN 30 mg을 실온에서 밤새 100 mg의 DMSO 중의 3, 3'-디티오디프로피온산 디 (N-하이드록시숙신이미드 에스테르)[3, 3′-dithiodipropionic acid di (N-hydroxysuccinimide ester), DTSP]와 반응시켰다. 반응 혼합물을 DMSO로 3 회 세척한 후 10 mL의 DMSO 중의 Nα,Nα-비스(카르복시메틸)-L-리신 하이드레이트(아미노부틸 NTA, 65 mg)를 첨가하였다. 이 반응을 실온에서 24 시간 동안 진행하였다. 그런 다음, 에탄올 및 물로 10 회씩 세척하여 NTA-개질된 MSN를 수득하였다. Ni2 +를 NTA-개질된 MSN에 통합시키기 위해, 상기 나노입자를 1 M의 수성 NiSO4에 분산시킨 후 실온에서 24 시간 동안 교반하고 에탄올 및 물로 5 회씩 세척하였다. 결과적으로 생성된 분말(MSNPN) (도 10a 의 3)을 진공 하에서 건조하고 누클레아제가 없는 물에 분산시켰다. 상기 현탁액을 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
제조예 3: 형광물질 결합된 실리카 나노입자
제조예 2에서와 같이 제조된 아민-기능화된 MSN(도 10a 및 도 10b의 2) 30 mg을 DMSO 1 mL에 현탁시키고 2.5 mg/mL 농도로 DMSO에 포함된 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 에스테르에 의해 활성화된 카로복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine, TAMRA-NHS) 용액 10 μL을 현탁액에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반한 후 원심분리하여 분말(도 10b의 4) 형태의 TAMRA-결합된 MSN을 얻었다. 상기 제조예 2에서와 같은 공정으로 상기 TAMRA-결합된 MSN에 Ni-NTA를 도입하여 TAMRA-결합된 MSNPN(도 10b의 5)를 수득하였다.
실시예 1: 기공 확장된 MSN의 표면 특성 분석
MSN의 표면적, 기공 크기, 및 기공 부피의 물리적 특성 분석을 위하여 질소 흡착 또는 로딩 실험이 진행되었다. 질소 흡착 또는 로딩 등온선은 NOVA 흡착 장치에 의하여 측정되었다.
표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 크기의 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다. 결과는 하기 표 3과 같다.
Figure pat00003
니켈 모이어티(moiety)를 가진 신규한 다공성 실리카 나노입자(MSNPN)는 기공 확장 전략을 사용하여 25 nm 내지 30 nm의 기공 크기를 갖도록 합성함으로써 프로테아좀의 His 태그와 비공유 상호작용을 통해 프로테아좀 완전효소 분자를 숨길 수 있다(도 11). MSNPN의 상대적으로 넓은 표면적(388 m2/g) 및 기공 부피(1.47 mL/g)는 또한 이들의 본래의 형태에 프로테아좀을 흡착 또는 로딩 및 전달하는데 유리하다.
제조예 4: 표면이 음이온을 띠는 MSN
제조예 1에서와 같이 제조된 기공 확장된 다공성 실리카 나노입자를 물 및 에탄올을 이용하여 수 회 세척함으로써 표면이 음이온을 띠는 다공성 실리카 나노입자를 수득하였다.
제조예 5: 표면이 양이온을 띠는 MSN
제조예 1에서와 같이 제조된 다공성 실리카 나노입자를 톨루엔에 현탁시키고 아민 기능화를 위하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 1 mL을 첨가하였다. 세척 후, 양이온을 띠는 다공성 실리카 나노입자를 수득하였다.
실시예 2: 기공 내에 단백질을 포함하는 다공성 실리카 나노입자의 세포내 도입 실험
본 실시예에서는, 제조예 4 또는 제조예 5에서와 같이 제조된, 표면이 음이온을 띠는 및/또는 표면이 양이온을 띠는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 단백질을 흡착 또는 로딩시키고, 상기 다공성 실리카 입자를 세포 내로 도입함으로써 상기 단백질을 세포 내로 도입하였다. 구체적으로, 1 x PBS 조건 하에서 형광(FITC) 표시된 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 단백질과 다공성 실리카 나노입자를 1:10의 중량비로 혼합한 후, 이를 실온에서 30 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 혼합물을 세포 배양액에 혼합하여 처리함으로써 상기 단백질이 흡착 또는 로딩된 상기 다공성 실리카 나노입자를 세포 내로 도입하였다. 상기 처리 시간을 다양화하며 관찰한 후, 처리가 완료된 세포는 세포 배양액을 새로 갈아주었다. 도 3에는 형광 표시된 소 혈청 알부민을 포함하는 다공성 실리카 나노입자를 처리한 세포의 형광 현미경 이미지가 처리 시간별로 나타나 있다.
다음으로, 형광 표시된 IgG 단백질을 동일한 방법으로 다공성 실리카 나노입자의 기공에 흡착 또는 로딩시키고, 이를 세포 내로 도입하였다. 도입된 세포의 형광 현미경 이미지는 도 4에 나타나 있다.
도 3 및 도 4에 나타난 바에 따르면, 형광 표시된 BSA 및 IgG가 효율적으로 세포 내에 도입되었음을 확인할 수 있다.
실시예 3: β- 갈락토시데이즈의 세포내 도입 및 단백질 분해효소의 영향 분석
본 실시예에서는, β-갈락토시데이즈(pI = 4.88)를 양이온을 띠는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩시켜 세포 내에 도입하고, 세포 내 도입 효율 및 단백질 분해효소의 영향을 분석하였다.
먼저, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 다양한 농도의 β-갈락토시데이즈를 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩시키고, 4 시간 동안 세포에 처리한 후, 새로운 배지로 교체해 주었다. 이후 4 시간 동안 인큐베이션 한 후, 세포를 고정하고 X-gal을 처리한 후 현미경으로 관찰하였다.
도 5는 상기 X-gal 염색한 세포를 현미경으로 관찰한 이미지이며, 최상단으로부터 아래로 각각 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 및 20 nM의 β-갈락토시데이즈를 흡착 또는 로딩시킨 다공성 실리카 나노입자가 도입된 세포의 이미지이다. 도 6에 나타난 바에 따르면, β-갈락토시데이즈의 농도에 의존적으로 X-gal 염색 효율이 증가하였으므로, 상기 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩된 β-갈락토시데이즈가 정상적으로 세포 내로 도입되었다는 것을 확인하였다.
다음으로, β-갈락토시데이즈 단독, 다공성 실리카 나노입자 단독, 및 β-갈락토시데이즈가 흡착 또는 로딩된 다공성 실리카 나노입자를 각각 세포에 4 시간 동안 처리한 후, 새로운 배지로 교체하고 다시 4 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 세포에 ONPG(onitrophenyl-a-D-galactopyranoside)를 처리하고, 각각의 흡광도를 측정하여 그래프로 나타내었다 (도 6 참조). 도 6에 나타난 바에 따르면, β-갈락토시데이즈 단독 또는 다공성 실리카 나노입자 단독을 처리한 세포의 경우 ONPG 분석에서 흡광이 나타나지 않았으나, β-갈락토시데이즈가 흡착 또는 로딩된 다공성 실리카 나노입자를 처리한 세포에서는 β-갈락토시데이즈에 의해 생성되는 니트로페놀(nitrophenol)의 흡광이 관찰되었다. 또한, β-갈락토시데이즈의 농도에 의존적으로 흡광도가 증가하였다. 따라서, β-갈락토시데이즈가 흡착 또는 로딩된 다공성 실리카 나노입자가 정상적으로 세포에 도입되었고, β-갈락토시데이즈 단독으로는 세포 내에 도입될 수 없으며, 나타난 흡광도가 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩되어 세포 내로 도입된 β-갈락토시데이즈에 의하여 나타났다는 것이 확인되었다.
다음으로, 기공이 확장된 본원의 다공성 실리카 나노입자(Ex-MSNP) 및 기공이 확장되지 않은, 평균 2 nm의 기공 크기를 가지는 다공성 나노입자(NE-MSNP) 각각에 β-갈락토시데이즈를 흡착 또는 로딩시키고, 이들과 β-갈락토시데이즈 단독을 각각 키모트립신(chymotrypsin) 처리(37℃에서 12 시간)한 후, ONPG 분석하였다 (도 7 참조). 도 7에 나타난 바에 따르면, 기공이 확장되지 않은 다공성 실리카 나노입자에 β-갈락토시데이즈를 흡착 또는 로딩시킨 경우 상기 키모트립신에 의하여 β-갈락토시데이즈가 분해되었으나, 기공이 확장된 본원의 다공성 실리카 나노입자에 β-갈락토시데이즈를 흡착 또는 로딩시킨 경우에는 상기 β-갈락토시데이즈가 상기 키모트립신으로부터 보호되어 정상적으로 흡광을 나타내었다. 따라서, 본원의 다공성 실리카 나노입자의 기공에 흡착 또는 로딩된 물질은 외부 환경으로 보호되어 안정적으로 세포 내로 도입될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 세포 내로 도입된 단백질의 기능 분석
본 실시예에서는, 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩되어 세포 내로 도입된 단백질이 정상적으로 기능하는지 여부를 분석하여 나타낸 그래프이다. 단백질의 도입을 위하여 사용된 세포주는 HeLa 세포 및 MDA-MB-231 세포를 사용하였다.
먼저, 상기 기재된 실시예 2에 따라 HRP(horseradish peroxidase) 단백질을 양이온을 띠는 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩시킨 후, 이를 세포 배양액과 함께 HeLa 및 MDA-MB-231 세포에 4 시간 동안 처리하였다. 이후, PBS를 이용하여 상기 세포를 2 회 세척하고, IAA(indole acetic acid)를 처리하였다. 이어서, 독성테스트를 수행하여, 각각의 세포주에 HRP-IAA 조합이 미치는 영향을 조사하였다. 도 8의 그래프에 따르면, HRP 단백질 단독 또는 다공성 실리카 나노입자 단독으로 처리한 세포에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나, HRP 단백질이 흡착 또는 로딩된 다공성 실리카 나노입자를 처리한 세포의 경우 HRP 단백질의 활성에 의하여 효소반응이 일어나 IAA를 활성종(reactive species)으로 변환시킴으로써 세포 독성이 나타나 세포 생존률이 저하됨을 확인하였다.
다음으로, 상기 기재된 실시예 2에 따라 다양한 농도의 RNase 단백질을 표면이 음이온을 띄는 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩시킨 후, 이를 세포 배양액과 함께 세포에 처리하고, 독성테스트를 수행하였다. 그 결과, 다공성 실리카 나노입자에 흡착 또는 로딩된 RNase 단백질의 농도에 의존적으로 세포 독성이 나타나는 것을 확인하였다 (도 9 참조).
제조예 6: 프로테아좀 -다공성 실리카 나노입자 복합체의 제조
다양한 몰비로, 정제된 프로테아좀 및 제조예 2에서와 같이 제조한 MSNPN을 PBS에 현탁한 후 실온에서 2 시간 동안 200 rpm으로 수평적으로 진탕하였다. 결과적으로 생성된 프로테아좀-MSNPN 복합체를 3000 rpm에서 원심분리하여 3 회 세척하였다. 상기 복합체를 세포내 전달을 위해 배양 배지에 재현탁시켰다.
제조예 7: 26S 인간 프로테아좀의 친화성 정제
인간 프로테아좀을 HTBH-태그된 β4 서브유닛을 갖는 안정한 HEK293T 세포주로부터 친화성 정제하였다. 상기 세포를 프로테아제 억제제, 5 mM ATP, 및 1 mM DTT를 함유하는 용해 버퍼(50 mM NaH2PO4, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM MgCl2, 0.5% NP-40) 내에 Dounce tissue grinders(Wheaton)를 사용하여 균질화하였다. 용해물을 10,000 × g 에서 원심분리하고 맑은 상층액을 스트렙타비딘 아가로스 수지(Millipore)와 함께 4℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 상기 수지 비드를 TEV 프로테아제-함유 용출 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤, 및 1 mM ATP) 내에서 인큐베이션시켰다. 상기 정제 조건들 하에서 프로테아좀 상에서 내인성 Usp14가 발견되었다(도 12). His-태그된 β4 서브유닛으로 친화-정제된 인간 프로테아좀은 SDS-PAGE/쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue, CBB) 염색에 의해 분석되었다(도 12a).
활성 인간 26S 프로테아좀은 His- 및 비오틴-태그된 β4 서브유닛 모두를 안정되게 발현시키는 HEK293-유도된 세포 라인으로부터 효과적으로 친화성-정제되었다(도 12). 통상적인 방법에 의해 정제된 프로테아좀과 달리, 이들 프로테아좀은 현저한 양의 USP14, RP 상에 느슨하게 결합된 탈유비퀸틴화 효소 및 내부 프로테아좀 억제제를 가졌다.
실시예 5: 투과 전자 현미경( TEM )
TEM 이미지는 120 kV에서 LIBRA 120 EF-TEM (Carl Zeiss, Germany)에 의해 수득되었다. 각 MSN 현탁액을 Formvar-코팅된 구리 그리드 상에 위치시키고 증발된 탄소 필름(Electron Microscopy Sciences, PA, USA)으로 안정화시켰다. 상기 그리드를 관찰 전에 수 시간 동안 실온에서 건조시켰다. MSNPN 및 프로테아좀-흡착 또는 로딩된 MSNPN의 TEM 이미지 비교를 위해, 각 샘플을 상기 그리드 상에 위치시키고 0.5% 우라닐 아세테이트로 염색하였다.
실시예 6: MSNPN 상에서의 프로테아좀 활성 측정
MSNPN 상에 흡착 또는 로딩된 프로테아좀의 활성을 측정하기 위해, PBS 내에서 4℃에서 30 분 동안 12 μg의 나노입자 용액(10 mg/mL)과 2.4 μg의 프로테아좀을 인큐베이션하여 프로테아좀-MSNPN 복합체를 제조하였다. 그런 다음, 검정 버퍼(50 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mg/mL 알부민, 1 mM 신선한 ATP, 1 mM 신선한 DTT)로 100 μL의 최종 부피가 되도록 희석하였다. 그런 다음, 검정 버퍼 중의 10 μg의 프로테아좀 및 프로테아좀-MSNPN을 검정 버퍼 중의 형광성 기질 suc-LLVY-AMC를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하였다. AMC(ex 355/em 460)의 형광이 결과적으로 측정되었다.
프로테아좀-다공성 실리카 나노입자 복합체는 결합되지 않은 프로테아좀과 비슷한 단백질 분해 활성을 가졌으며, 이는 이들이 MSNPN 기공에 결합되어 있더라도, 작은 펩타이트-기반 리포터(reporter) 기질에 전적으로 접근 가능할 수 있음을 제안하는 것이다(도 13).
실시예 7: 프로테아좀 -다공성 실리카 나노입자 복합체의 분석
실시예 6에서와 같이 프로테아좀-다공성 실리카 나노입자 복합체를 제조하되, 프로테아좀을 다공성 실리카 나노입자와 함께 배양하였다. 그런 다음, 배양 샘플들을 스핀-다운시키고 펠렛 분획은 SDS-PAGE 및 면역블롯팅(immunoblotting, IB)으로 분석하였다. 비교를 위해, 프로테아좀-MSNPN 복합체와 동일량의 프로테아좀을 단독으로 투입하였다.
프로테아좀-MSNPN 복합로부터의 정제된 프로테아좀의 분리를 이미다졸(0.5 M)의 존재 하에서 짧은 원심분리 후 면역블롯팅하여 평가하였다. 다양한 질량비로 MSNPN에 정제된 프로테아좀을 결합시키고 이 혼합물들을 원심분리하였다(1,000 × g에서 5 분). 상청액 내의 결합되지 않은 프로테아좀은 폐기하고 펠렛을 2% β-머캅토에탄올을 함유하는 2 × SDS 시료 버퍼와 혼합하거나 0.5 M 이미다졸과 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 면역블롯팅은 항-His 항체를 사용하여 실시하였다.
다양한 질량비로 정제된 프로테아좀은 MSNPN으로 쉽게 흡착 또는 로딩되었고, 이는 1:50의 질량비(프로테아좀/나노입자)로, 또는 ~37 프로테아좀 완전효소가 단일 나노입자에 하전되었을 때 포화되는 것으로 나타났다(도 14의 (a)). 프로테아좀-MSNPN 복합체 형성은, 단순 흡수 또는 정전기적 결합 대신에, 비공유 His-니켈 상호작용에 의해 주로 매개되었다. 0.5 M의 이미다졸과 인큐베이션하였을 때, MSNPN에 결합된 상기 프로테아좀은 과잉 이미다졸에 의해 상청액에 효과적으로 방출되었다(도 14의 (b)).
MSNPN 및 프로테아좀-흡착 또는 로딩된 MSNP의 제타-전위 및 유체역학적 크기를 Zetasizer NanoS(Malvern instruments, UK)를 사용하여 DLS(dynamic light scattering) 분석으로 측정하였다. 나노입자의 표면 제타-전위는, 프로테아좀 흡착 또는 로딩 후에, -12.60 mV 내지 -6.38 mV로 순조롭게 증가되었으며, 이는 입자들 사이에서 감소된 정전기적 반발 및 프로테아좀과 MSNPN 사이에서 안정적인 복합체 형성을 나타내는 것이다(하기 표 4). 비록 복합체 크기 및 기공 크기가 약간 감소된 것으로 나타났지만, 나노입자의 현미경 특성은 프로테아좀 하전의 전, 후가 비슷했다(도 15의 (a), (b) 및 하기 표 5). 따라서, 정제된 프로테아좀은 비공유 상호작용을 통해 신규한 다공성 실리카 나노입자 상에 효과적으로 흡착 또는 로딩되었다.
Figure pat00004
Figure pat00005
실시예 8: suc - LLVY - AMC 가수분해 분석
프로테아좀, 다공성 실리카 나노입자 및 프로테아좀-다공성 실리카 나노입자 복합체를 suc-LLVY-AMC 가수분해 분석을 통해 측정하였다.
실시예 9: in vitro 프로테아좀의 분해
프로테아좀-MSNPN 복합체에 의한 분해를 시험하기 위해 보다 생리적으로 관련 있는 프로테아좀 기질인 폴리유비퀴틴화된 Sic1PY(Ub-Sic1)을 사용하여 인비트로(in vitro) Ub-Sic1 분해 검정을 실시하였다. 다양한 시간 동안 프로테아좀 또는 MSNPN-프로테아좀 복합체와의 반응을 항-T17 및 항-USP14 항체를 사용하여 SDS-PAGE/IB로 분석하였다. 정제된 인간 프로테아좀 또는 프로테아좀-MSNPN 복합체(5 nM)를 프로테아좀 검정 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM ATP) 내에서 폴리유비퀴틴화된 Sic1PY(Ub-Sic1PY; 20 nM)와 다양한 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 2 × SDS 샘플 버퍼와 혼합시키고 75℃에서 10 분 동안 끓인 후 항-T7 항원을 사용하여 면역블롯팅하였다. USP14를 유지하는 상기 정제된 프로테아좀이 Ub-Sic1에 사용되었을 때에, Ub-Sic1은 배양 30 분 내에 완전히 분해되었다(도 16). 본 실시예에서 MSNPN에 결합된 상기 프로테아좀이 Ub-Sic1을 분해하였지만, 프로테아좀 단독과 매우 구별되는 패턴을 가지고 분해한 것을 밝혀졌다. 특히, 초기 시점에서 프로테아좀-MSNPN 복합체는 프로테아좀 단독보다 더욱 신속하게 Ub-Sic1을 분해했고, Ub-사슬 트리밍 효과는 적게 관찰되었다. 이는 짐작컨대, 상기 복합체 형성 과정 동안에, 프로테아좀으로부터의 내부 USP14의 전위를 반영한다(도 16). 상기 복합체 내의 USP14의 부족으로 인해 증가된 프로테아좀 활성은 직접 프로테아좀 전달 전략에 유리할 수 있다.
실시예 10: MSNPN 처리 세포의 투과 전자 현미경 분석
MSNPN(80 μg/mL)이 처리된 세포들은 0.05 M 소듐 카코딜레이트(sodium cacodylate) 버퍼(pH 7.2) 내에서 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드로 4℃에서 4 시간 동안 고정되었다. 상기 샘플을 0.05 M 소튬 카코딜레이트 버퍼(pH 7.2)로 3 회 세척하고 0.05 M 소튬 카코딜레이트 버퍼(pH 7.2) 중의 1% 오스뮴 테톡사이드(OsO4)로 4℃에서 2 시간 동안 후-고정하였다. 그런 다음, 물로 세척하고 증류수 중의 0.5% 우라닐 아세테이트로 일괄적으로 염색하였다. 그런 다음, 샘플을 30% 내지 100%의 일련의 등위 에탄올로 탈수시킨 후, 100% 산화 프로필렌으로 실온에서 15분 동안 2회 탈수시켰다. Spurr 수지(ERL 4221, DER? 736 에폭시 수지, NSA 및 DMAE과 혼합됨) 시리즈를 사용하여 침투를 실시하였다. 최종적으로, 시료를 몰드 내의 새로운 100% Spurr 수지 내에 위치시키고 70℃에서 밤새 중합체화하였다. 초박 섹션(ultrathin section)이 ultramicrotome MTX (RMC, USA)로 준비되었다. 섹션을 Formvar-코팅된 구리 그리드에 흡착 또는 로딩하고 80 kV에서 TEM(JEM 1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 11: 세포 배양
HELA, HEK293-pre1-HTBH, HEK293-trex-htau40, 및 tau-BiFC를 포함하는 실시예에서 사용된 세포들은 4.5 g/L D-글루코스 및 보충제로서 10% 우혈청 배지(Fetal Bovine Serum, FBS), 100 units/mL 페니실린 및 100 g/mL 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)에서 배양되었다. 세포는 37℃, 5% CO2 하에서 가습 인큐베이터 내에 유지되었다. 프로테아좀-MSNPN 복합체로 처리되기 전날에, 세포를 라운드 커버 글라스(φ 25 mm, No. 1, Deckglaser, Germany) 상에 접종하였다. 상기 복합체 또는 이의 대조를 실험 전에 커버 글라스 상의 부착 세포에 첨가한 후 인큐베이션 시간 후에 배지를 제거하였다. PBS로 세포를 3회 집중적으로 세척하여 결합되지 않은 나노입자를 제거한 후에 형광 이미지를 수득하였다.
실시예 12: 프로테아좀의 세포내 내재화 평가
프로테아좀이 세포 내로 내재화되는 것을 MSNPN이 가능하게 하는지의 여부를 측정하기 위해, TAMRA-표지된 MSNPN-프로테아좀 복합체(도 10b의 5)를 혈청 함유 배양 배지에 첨가하였다. 이후에, TAMRA-표지된 MSNPN 단독으로 또는 프로테아좀-MSNPN 복합체(1:50)로 24 시간 동안 처리한 후 격렬한 세척 후에, HeLa 세포를 형광, 공초점 및 투과전자현미경에 의해 검사하였다(도 17a 및 도 17b). 복합체는 세포질 내에서 주로 발견되었으며, 이는 세포내 이입 소포에 축적됨을 나타내는 것이다. 다양한 농도 및 몰비로, 상기 복합체는 배양 후 2 시간 내에 세포로 진입했고, 96 시간 이상(데이터 미기재) 동안 사이토졸(cytosol) 내에서 유지되었다. MSNPN 또는 프로테아좀-MSNPN 복합체의 세포 생존력에 대한 효과는 300 μg/mL 미만의 농도에서 조금 관찰되었다(도 18).
실시예 13: 엔도시토시스( endocytosis ) 억제제의 존재 하의 MSNPN 의 세포 흡수
세포를 제니스테인, 클로르프로마진, 및 노코다졸과 같은 다양한 엔도시토시스 억제제의 존재 하에 프로테아좀-MSNPN 복합체로 처리한 후에, 형광 현미경 및 유세포분석기로 측정하였다. HeLa 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 인큐베이터 내에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포를 37℃에서, 또는 무혈청 배지에서 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하면서 클로르프로마진(10 g/mL)으로 처리하여 클라트린-의존 엔도시토시스를 억제하고, 제니스테인(200 M)을 처리하여 카비올레(caveolae)-의존 엔도시토시스를 억제하고, 또는 아밀로라이드(50 μM) 및 노코다졸(20 μM)을 처리하여 거대 음작용(macropinocytosis)을 저해하였다. 그런 다음, 세포를 20 g/mL의 MSNPN과 동일 조건 하에서 1 시간 동안 인큐베이션하고 2 mL의 PBS로 3 회 세척하였다. 나노입자 흡수를 정량하기 위해, 세포를 트립신화하여 수집하고 4℃에서 원심분리한 후 차가운 PBS로 세척하였다. 세포를 1% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁시키고 여과하였다. 형광 강도를 아르곤 레이저가 장착된 Aria Ⅲ 유세포분석기(Becton Dickinson, USA)를 사용하여 측정하였다. 실험은 3 회 실시되었으며 데이터는 평균±SD로 나타내었다.
복합체의 세포 흡수는 에너지-의존성인 것으로 나타났고, 카비올레(caveolae)- 및 클라트린-매개된 엔도시토시스 두 가지 모두에 의해 처리되었다. 그러나, 클로르프로마진(chlorpromazine, 클라트린 분해 억제제)은 제니스테인(genistein, 카비올레-연관된 티로신 키나제) 또는 아밀로라이드(amiloride) 및 노코다졸(nocodazole, 거대 음작용(macropinocytosis)의 억제제)보다 더욱 나노입자 내재화를 지연시켰으며, 이는 콜레스테롤이 풍부한 지질 래프트(raft)가 상대적으로 큰 MSNPN을 에워싸는데 활용될 수 있음을 제시하는 것이다.
상기 결과는 프로테아좀-MSNPN 복합체가 엔도시토시스 수송을 통해 내재화되는 것을 제시한다. 수송 후에, 외부 프로테아좀이 활성화되는지 및 구조적으로 온전한지의 여부를 시험하기 위해, 프로테아좀은 산성 pH 유사(mimicking) 엔도좀 조건에서 배양되었고, 이들의 단백질 분해 활성은 모니터링되었다. 프로테아좀의 활성은 pH 7.5 보다 pH 5.5에서 약 4배 더 낮았다(도 19). 그러나, pH가 증가함에 따라, pH 5.5로 pH를 낮추는 것이, 프로테아좀 활성의 신속한 감소를 초래한 반면에, 단백질 분해 활성은 정상 수준으로 회복되었다.
pH 변화 전, 후에 조성물 및 프로테아좀의 활성을 네이티브 PAGE로 측정하였다. 정제된 프로테아좀 또는 전체 세포 용해물 샘플을 850 volt-hours로 3.5% 비변성 PAGE에 용해시키고 프로테아좀을 형광 기질 suc-LLVY-AMC (Bachem)로 시각화시켰다. pH 변화 후에, 프로테아좀 조성물 또는 동기(gating)의 현저한 변화는 보이지 않았다.
실시예 14: 세포내 프로테아좀의 활성
MSNPN-매개된 프로테아좀 전달이 세포 내의 총 프로테아좀 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 시험했다. HeLa 세포를 제조예 6과 같이 제조된 프로테아좀-MSNPN 복합체로 24 시간 동안 처리한 후 세포를 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% 글리세롤, 0.2% NP40, 1 mM ATP, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제를 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 7.5) 내에 용해시켰다. 용해물을 26 G 3/8" 주사기를 사용하여 균질화하고 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 결과적으로 생성된 나노입자가 없는 상청액을 LLVY-AMC 가수분해 활성을 측정하는데 사용하였다. 프로테아좀-MSNPN 복합체를 포함하는 펠렛을 검정 버퍼(50 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mg/mL 알부민, 1 mM fresh ATP, 1 mM 신선한 DTT)에 재현탁하고 40 μM의 LLVY-AMC를 사용하여 프로테아좀 활성을 측정하였다. 상기 측정은 2 분 간격으로 37 사이클이 실시되었다. 상기 용해물로부터 LLVY-AMC 가수분해 활성으로부터 프로테아좀 활성이 10 μM의 MG132에 의해 저해됨이 확인되었다.
프로테아좀-MSNPN 복합체-처리된 세포의 상청액에서 LLVY-AMC 가수분해 활성이 처리되지 않은 세포의 활성과 사실상 동일했던 반면에, 현저하게 증가된 활성이, 내재화된 인간 프로테아좀을 유지한 프로테아좀-전달된 세포의 펠렛 분획으로부터 관찰되었다. MSNPN-매개된 프로테아좀 전달에 의해 강화된 프로테아좀 활성은, 선행 연구들에 보고된 바와 같이, 세포에 대해 허용 가능한 것으로 나타났고(도 18의 (b)), 폴리- 및 자유-유비퀴틴 또는 RP 및 CP 서브유닛의 세포 수준은 현저하게 변화되지 않았다.
실시예 15: 프로테아좀에 의한 타우 단백질 분해
외부 프로테아좀 전달이 생세포(living cell) 내에서의 단백질 분해에 영향을 미치는지의 여부를 연구하기 위해, 독시사이클린 유도(doxycycline induction, 유도 가능한 타우 세포주) 상에서 인간 타우의 가장 긴 이성체(htau40)를 발현시키는, HEK293-유도된 세포주를 사용했다. 단백질 샘플은 환원제, 베타-머캅토에탄올(βME)의 존재 및 부재 하에 제조되었으며, 응집된 타우 단백질 및 이들의 절단된 형태는 표시된 시간 동안 Dox 처리(0.5 μg/mL) 후에 유도 가능한 세포주로부터 감지되었다. 이들 세포들은, 고용량-의존 방식으로 htau40을 발현시켰고, SDS-저항성 타우 응집체의 형성과 일치하는, 배양 2 일 후에 서서히 타우 종을 이동시켰다(도 20a 및 도 20b). 타우는, 특히 타우병증 및 알츠하이머 질환(AD) 진행의 초기 단계에서, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 분해되는 것으로 생각된다.
유도 가능한 타우 세포주를 Dox(0.5 μg/mL, 24 시간), MSNPN(5 μg/mL), 및 프로테아좀-MSNPN 복합체(50 μg/mL, 1:50 몰비, 24 시간)로 처리한 샘플을 SDS-PAGE/IB로 분석하였다. His IB는 외부 프로테아좀의 β4 서브유닛을 위한 것이다. 다양한 농도의 Dox(0, 0.5, 1, 5, 및 10 ng/mL), MSNPN, 및/또는 인간 프로테아좀으로 처리한 후에 타우 수준은 세 번의 독립적인 실험(n=3)으로부터 필름 이미지의 밀도계를 사용하여 정량화되었다. 나노입자 단독으로의 처리는 효과가 거의 없어 보였던 반면에, 정제된 프로테아좀이 MSNPN을 통해 전달되었을 때, 과발현된 타우의 수준은 현저하게 감소되었다(도 21a 및 도 21b). 독성이 있고 응집성 있는 것으로 알려진, 절단된 타우의 수준은 프로테아좀-MSNPN 처리에 의해 또한 현저하게 감소되었다. 타우의 촉진된 분해는 전달된 프로테아좀의 양(0, 5, 10, 25, 및 50 μg/mL, 1:50 비)에 의존적이었다.
외부 프로테아좀에 의한 번역 후 타우 조절을 확인하기 위해 정량적인 RT-PCR은 타우 및 GAPDH(정규화를 위한 조절)을 위한 프라이머를 사용하여 실시하였다. 배양된 세포로부터의 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 준비한 후, 온-컬럼 DNase I 처리와 함께 RNeasy mini-column(Qiagen)을 통해 추가 정제하였다. cDNA 샘플을 Accupower? RT-pre mix(Bioneer)를 사용하는 역전사로부터 제조하였다. 그런 다음, 희석된 cDNA, 리포터 염료로서 SYBR qPCR 마스터 혼합물(KAPA biosystem) 및 10 pmole의 유전자 특이 프라이머와 함께 Rotor-Gene RG 3000(Corbett Research, Sydney, AU)를 사용하여 실시간 PCR 반응을 실시하였다. 가열 사이클링 조건은 효소 활성화를 위해 95℃에서 3 분, 40 사이클 95℃에서 10 초 동안 40 사이클, 53℃에서 15 초 및 72℃에서 30 초를 포함하였다. 각 mRNA 수준을 GAPDH 수준으로 정규화시키고 수치들을 세 번의 독립적인 실험의 평균±SD로서 플롯팅하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다: Tau에 대한 포워드 프라이머 (5'-aaggtgacctccaagtgtgg-3') 및 리버스 프라이머 (5'-gggacgtgggtgatattgtc-3'); GAPDH에 대한 포워드 프라이머 (5'-gagtcaacggatttggtcgt-3') 및 리버스 프라이머 (5'-gacaagcttcccgttctcag-3').
타우 mRNA 수준은 상기 조건 하에서 비슷하였으며, 이는 외부 프로테아좀이 과발현된 타우의 분해를 직접 가속화시킴을 강하게 제시하는 것이다(도 22a). 전달된 프로테아좀은, 자가포식 유동 또는 Nrf2 및 p53 같은 외부 프로테아좀 기질의 수준에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 세포에 전달된 상기 외부 프로테아좀은, 유해한 비특이 단백질 분해에 관여하는 대신에, 과발현된 타우 같은 UPS에 비정상적으로 흡착 또는 로딩을 부여한, 단백질 기질을 보다 효율적으로 분해할 수 있다. 향후의 과제는, 프로테아좀 분해에 대한 이들의 상이한 민감성의 기저를 이루는 목표 단백질의 구별되는 특징들, 예를 들어, 타우의 과인산화 빈도 및 Ub 연결 특이성을 확인하는 것이 요구될 것이다.
MSNPN을 사용하는 프로테아좀의 전달은 AD의 병리학적 특성인, 타우 응집체의 형성을 효과적으로 지연시켰다(도 22b). 상기 효과는 자가포식에 의존적이었고, 아마도 가용성 타우 단백질의 가속화된 프로테아좀의 분해가 선행되었을 것이다(도 21a 및 도 23). 그러나, 상기 효과는, 프로테아좀 억제제인 10 μg MG132로 세포를 처리함으로써 제거되었고, 이는 가용성 타우 및 타우 응집체 둘 다의 현저한 축적을 초래하였다(도 22b). 특히, 프로테아좀-MSNPN 처리는, 응집된 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 수준을 변경하지 않았고, 이는 프로테아좀에 의해 처리되는 것이 불가능했다. 따라서, 단백질 수준에서의 외부 프로테아좀의 상기 효과는 UPS 기질에 의해 제한되었다.
실시예 16: 타우 올리고머화 정량
생세포에서 타우 올리고머화를 가시화하고 정량화하기 위해, 생체분자의 형광 상보성(BiFC)을 갖는 타우 세포를 활용했다. htau40에 독립적으로 융합된 비너스(Venus) 단백질의 N-말단부 및 C-말단부 둘 다를 본질적으로 발현하는 HEK293-유도된 안정한 세포주(Tau-BiFC)를 선행 기술에 따라 제조하였다[Zhang, X., et al. The proteasome: A target of oxidative damage in cultured human retina pigment epithelial cells. IOVS 49, 3622-3630 (2008)]. Tau-BiFC 세포를 105 cells/well의 밀도로 96-웰에 접종하고 DMSO 또는 30 nM의 오카다산(okadaic acid, OA)으로 24 시간 동안 배양하여 타우 올리고머화 과정을 촉진시켰다. 형광 이미지를 획득하여 Operetta(PerkinElmer)로 정량하고 분석하였다.
비너스 단백질의 N-말단부 및 C-말단부는 htau40에 독립적으로 융합되었고, 이는 정상 조건 하에서 기본 형광 신호만을 나타내었다. 그러나, 상기 형광은 타우 과인산화의 화학적 유도, 예를 들어, 오카다산에 의해 강하게 "턴-온(turned-on)" 되었고, 그 결과로 타우 올리고머화되었다.
타우-BiFC 세포주를 50 μg/mL의 MSNPN 및 프로테아좀-MSNPN으로 처리한 후에 정량화된 타우 올리고머 수준을 비교하였으며, 값들은 전체 ~10,000 세포를 포함하는 세 번의 독립적인 배양의 평균(±SD)을 나타낸다. 유도 가능한 타우 세포와 일치하는, 프로테아좀-MSNPN 복합체로 처리한 타우-BiFC 세포는 MSNPN 단독으로 처리한 세포에 비하여 타우 응집이 현저하게 덜 한 것으로 보여졌다. 상기 결과는 MSNPN을 사용하는 외부 프로테아좀의 직접 전달이 단백질 독성의 조건 동안에 타우 단백질의 응집 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 17: 세포 생존 및 환원 스트레스 평가
Dox에 의한 타우 유도 하에서 세포 생존 및 ROS의 유도제인 파라?(paraquat)에 의한 환원 스트레스를 측정하기 위해, 유도 가능한 타우 세포 라인은 250 pg/mL의 Dox 및 1 mM의 파라?으로 3 시간 동안 사전배양되었고, 이후에 MSNPN 또는 프리테아좀- MSNPN 복합체로 12 시간 동안 처리되었다.
세포 생존력을 CCK-8(cell counting kit-8) 분석(Dojindo Laboratory, Japan)으로 측정하였다. 나노입자 처리 24 시간 전에 HeLa 세포를 96-웰 셀 배양 플레이트에 웰 당 1x104 세포의 밀도로 접종하였다. 24 시간 인큐베이션 후에, 세포를 다양한 농도의 MSNPN 또는 프로테아좀-MSNPN 복합체로 처리하였다. 대조 세포를 동일한 부피의 PBS로 처리하였다. 24 시간 후에, 배지를 제거하고, 100 mL의 무혈청 배지 및 10 mL의 CCK-8 용액을 각 웰에 첨가하였다. 상기 세포를 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 450 nm 파장에서 포르마잔 염의 광학 밀도를 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices, Inc., USA)를 사용하여 측정하고, 배지의 백그라운드 흡광을 제외하였다. 실험은 3회 반복되었으며 데이터를 평균±SD로 나타냈다.
값들은 평균±SD (n=5)를 나타냈다. (** 표시, p < 0.01). 프로테아좀 전달은, 과발현된 타우 및 ROS의 유도제인 파라?에 의해 유도된 세포 독성을 현저하게 완화시키며, 이는 상기 방법이 세포로부터의 단백질 독성 및 산화 스트레스를 경감시키는데 사용될 수 있는 것으로 보이는 것이다.
본 실시예에서 인간 프로테아좀 같은 고분자량 단백질 복합체가 화학적으로 개질된 다공성 나노입자를 사용하여 세포에 직접 전달될 수 있다는 것을 보고한다. 상기 외부 프로테아좀은 MSNPN에 결합되었을 때 및 이들이 엔도시토시스를 통해 세포 내로 내재화된 후에, 이들의 활성 및 기능성을 유지한다. 상기 방법을 사용한 증가된 세포의 프로테아좀은 세포에 허용 가능했고, 비특이 단백질 분해를 초래하지는 않았다. 중요하게는, 외부 프로테아좀이 있는 세포는 가용성 타우의 촉진된 분해, 타우 응집체의 지연된 축적, 타우 및 ROS에 의해 매개된 단백질 독성 스트레스에 대한 강화된 저항성을 보여주었다. 실리카 나노입자가 혈뇌 장벽 투과성이 되기 위해 비활성, 비항원성, 및 개질 가능하고 프로테아좀 생합성 또는 프로테아좀 활성의 인 시츄(in situ) 조절은 아직 개발되지 않았음을 고려하면, 상기 현재의 전략은 뉴런에 축적된 독성의 응집성 단백질에 대한 흥미로운 대안이 될 수도 있다. 수많은 질환들이 독성의 잘못 접힌(misfolded) 응집성 단백질에 의해 야기되기 때문에, 프로테아좀 전달의 범위는 신경변성 질환에 한정되지 않는다. 따라서, 직접 프로테아좀 전달은 단백질 독성 또는 산화 스트레스 하에서 세포들에게 있어서 잠재적으로 이로운 개입이 될 수 있다.
제조예 8. 글루타티온( Glutathione , GSH )으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자의 합성
글루타티온으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자 (GSH-MSN)의 합성은 도 24에 도시된 바와 같이 실시된다. 우선, ep-tube를 사용하여, 기공이 확장되고 양전하로 표면 개질된 다공성 실리카 입자 50 mg을 1 mL의 Dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 충분히 분산시켰다. 그런 다음, 평균 분자량 312.37, 스페이서 암(spacer arm) 길이가 0.68 nm 인 Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)Propionate (SPDP) linker 20 mg을 ep-튜브에 넣어 두 물질이 고르게 섞이면서 반응이 일어날 수 있도록 24 시간 동안 오비탈쉐이커를 이용하여 상온에서 충분히 반응시켰다. 반응이 종료되면 원심분리기를 이용하여 생성 물질을 가라앉히고, 반응하지 않고 남은 SPDP를 제거하기 위해 DMSO와 에탄올을 이용하여 세척하였으며, 이 과정은 각 용액으로 세 번 반복하고 마지막 에탄올로 씻어준 후 원심분리기를 돌려 얻어진 가라앉은 생성물은 1 mL의 3차 증류수에 분산시켰다. 이 후 평균 분자량 307.33인 글루타티온을 넣어 24 시간 동안 오비탈쉐이커를 이용하여 상온에서 반응시키고 원심분리기를 이용하여 생성물질을 가라앉힌 후 증류수와 에탄올로 각각 5회 이상 씻어준 다음, 진공펌프를 이용하여 잔여 용매를 전부 제거하였다. 글루타티온의 정량은 상층액안에 녹아있는 피리딘-2-티온의 흡광도 (A343 nm)를 자외선-가시광선 분광분석기로 측정하여 알 수 있다. 이 후의 실시예로의 적용을 위해, 합성된 입자는 증류수에 분산시켜 4℃ 에서 보관하였다.
실시예 18. 합성된 글루타티온으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자로의 단백질 로딩 및 세포 내 도입 분석
합성된 나노입자의 유효성분의 효과적인 전달 및 작용 여부를 분석하기 위해서 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(Glutathione S-transferase, GST) 태그된 단백질을 로딩하였다. 이를 위해 GST 태그된 리보누클레아제(RNase)를 사용하여, 제조예 8에서와 같이 글루타티온으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자 내부의 GSH와 RNase의 GST 간의 GSH-GST 상호작용을 이용하여 로딩을 시도하였고, 로딩 전 후의 자외선-가시광선 흡광분석법을 통해서 입자를 분석하였다. GST 태그된 RNase를 로딩한 입자의 경우, 원심분리 후 상층액에 녹아있는 로딩되지 않은 GST 태그된 RNase의 흡광도를 이용하여 단백질의 로딩율을 측정하였으며 측정된 흡광 세기를 기준으로, 278 nm 에서의 흡광값과 기존에 보고된 흡광계수 (ε=9,800M-1cm-1)를 이용한 Beer-Lambert 수식을 통해 계산해 주었다.
A = εbc
[A: 측정된 흡광 세기, ε: 흡광 계수, b: 측정 용기의 경로 길이 (1 cm),
c: 물질의 몰 농도]
자외선-가시광선 흡광분석법을 통한 결과에서, 10 μg의 GSH-MSN당 4 μg의 GST 태그된 RNase를 로딩할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자는 목적에 맞는 유효성분을 다공성 실리카 나노입자에 성공적으로 로딩함으로써 이후 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였고 이를 검증하기 위해서 글루타티온으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자에 GST 태그된 RNase를 로딩하여 세포내 도입의 효율성 검증을 이행하였다. 특정 형광필터를 이용한 형광현미경으로 인간세포수준에서의 세포내 도입을 관찰하기 위해서 RNase에 형광염료를 도입하여 나노입자에 로딩하였다. 50,000개의 THP-1 세포주를 12-웰 배양 플레이트에 분주하고 24 시간 뒤에 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 넣어 분화시킨 후 4 μg의 GST 태그된 FAM-RNase를 GSH-MSN에 로딩하여 혈청이 없는 세포배지와 함께 4 시간 동안 처리하였다. 이 후 1X PBS로 잔여 물질을 두 차례 씻어주고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하여 12 시간 동안 5% CO2, 37℃ 환경에서 추가로 세포 성장을 진행시키고 358 nm 과 492 nm에서 형광필터를 가지는 공초점형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였으며, 각각의 형광은 세포핵의 형광(358 nm, 파란색), GST 태그된 RNase 형광(492 nm, 녹색)을 나타낸다. 도 25에서 볼 수 있듯이, 단백질의 강한 녹색 형광이 세포핵 주위의 세포질에서 고르게 관찰되었으며, 특히 Z축을 1 μm으로 구획하여 관찰해보았을 때 확실하게 세포 외부 표면이 아닌 세포질 내에 분포하는 것을 세포 형광 이미지를 통해 확인함으로써, 본 연구진이 합성한 나노입자가 외부물질의 세포내 도입이 어려운 것으로 알려진 세포주에 대해서도 단백질을 비롯한 약제학적 유효물질 전달 및 치료연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능한 것으로 확인하였다.
실시예 19. 인간세포 수준에서의 글루타티온으로 표면 개질된 다공성 실리카 나노입자를 이용한 단백질 전달의 유효성 검증
합성된 GSH-MSN이 유효물질인 단백질을 올바로 로딩한 상태로 세포내 도입 후 세포질로 방출함으로써 DNA나 RNA같은 핵산의 발현양 조절을 검증하고자 하였다. 로딩되어 있는 RNase가 효과적으로 로딩 및 안정적인 방출이 가능한 경우, 표적하는 단일가닥 핵산을 분해함으로써 핵산이 가지고 있는 잠재적 질병을 억제하는 치료목적으로의 적용이 가능해진다. 이러한 효능을 검증하기 위해서 THP-1에 세포주에서 발현되는 특정 RNA를 표적으로 하여 이를 분해하는 RNase를 후보 단백질로 정하고 1X PBS 완충용액과 10 mM MgCl2 존재 하에서 in vitro 실험을 진행하였다. Ep-tube에서 RNase@MSN를 준비하고, 단일가닥 RNA(ssRNA)를 넣어준 후 30 분 동안 37℃ 환경에서 반응을 진행시키고 이후 젤전기영동을 통해서 RNA의 분해유무를 확인하였다. 도 26에서 볼 수 있듯이, 나노입자에 로딩된 RNase의 기능이 효과적으로 작동하는 것을 확인하였으며, 이 후 세포수준에서의 치료기능으로의 잠재력을 검증하고자 하였다. 50,000개의 THP-1 세포주를 12-웰 배양 플레이트에 분주하고 24 시간 뒤에 Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 넣어 분화시킨 후 4 μg의 GST 태그된 RNase를 GSH-MSN에 로딩하여 혈청이 없는 세포배지와 함께 4 시간 동안 처리하였다. 이 후 1X PBS로 잔여 물질을 두 차례 씻어주고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하여 12 시간 동안 5% CO2, 37℃ 환경에서 추가로 세포 성장을 진행시키고 qRT-PCR를 통해 특정 RNA의 발현량을 젤전기영동을 통해 비교하였다. 도 26은 본원의 다공성 실리카 나노입자를 단백질 전달체로 활용하여 특정 RNA 발현을 억제하는 RNase 전달과 기능적 유효성에 대한 분석 결과를 나타낸 것으로서, (a)는 ep-tube 단계에서의 in vitro RNase 활성분석으로서 젤전기영동을 통한 RNA 분해유무를 분석한 결과를 나타낸 이미지이고, (b)는 qRT-PCR을 통한 THP-1 세포주에서의 특정 RNA 발현양을 분석한 그래프이다. 도 26에서 볼 수 있듯이, MSN을 이용한 RNase의 전달의 경우에, 약 5~60%의 RNA 발현억제 효율을 얻을 수 있었으며, 본 연구진이 합성한 나노입자가 외부물질의 세포내 도입이 비교적 어려운 세포주에 대해서도 단백질을 비롯한 목적에 맞는 약제학적 유효물질 전달 및 치료연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단되었다.
실시예 20. in vivo 동물 모델에서의 MSN을 이용한 단백질 전달 평가
상기 세포 수준에서의 효과적인 단백질전달 결과를 바탕으로, 동물 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능함을 검증하고자, 마우스(쥐)를 실험대상으로 하였으며, Balb/c nude 수컷 마우스를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하고 RNase(시그마알드리치코리아)를 1x PBS (pH 7.4) 조건에서 음이온을 가지는 MSN에 정전기적 인력으로 로딩하여 마우스에 주입하고자 하였다. 5 주령 마우스에 HeLa 세포를 심어 이종이식(xenograft) 종양을 성장시켜 RNase 전달에 따른 종양치료 효과를 관찰하였다. 멸균된 1x PBS에 3,000,000개의 HeLa를 분산시켜 마우스에 피하투여하고, 70 mm3까지 종양이 성장하였을 때, PBS, MSN 및 RNase를 로딩한 MSN을 각각 마우스 종양 내 주사 투여하였다. 도 27에서 보여지듯이 PBS 또는 MSN만을 주입한 마우스에서는 종양성장 억제효과가 나타나지 않았지만, RNase를 로딩한 MSN을 주입하였을 때 종양의 크기가 약 3 배 내지 약 4 배 감소하였음을 확인할 수 있다. 상기 동물 실험 결과를 통해 본원에 따른 MSN이 약제학적 유효물질 전달 및 치료연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능함을 확인하였다.
실시예 21. in vivo 동물 모델에서의 MSN을 이용한 단백질 전달 평가
상기 세포 수준에서의 효과적인 단백질 전달 결과를 바탕으로, 동물 수준에서의 안정적이고 효과적인 단백질 전달체 역할의 가능성을 검증하고자, 마우스(쥐)를 실험대상으로 하였으며, Balb/c nude 수컷 마우스를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하고, Cy5 형광이 접합된 양이온을 가지는 MSN (Cy5-MSN)을 준비하여, FITC 형광염료가 접합된 이뮤노글로불린 G(FITC-IgG, 시그마알드리치코리아)를 1x PBS (pH 7.4) 조건에서 정전기적 인력으로 로딩하여 마우스에 주입하고자 하였다. 5 주령 마우스에 HeLa 세포를 심어 이종이식(xenograft) 종양을 성장시키고, 이후 FITC-IgG 및 Cy5-MSN 전달에 따른 형광 세기 및 분포를 Optix Mx3(GE Healthcare, USA) 기기를 통해 관찰하였다. 멸균된 1x PBS에 3,000,000개의 HeLa를 분산시켜 마우스에 피하투여하고, 70 mm3까지 종양이 성장하였을 때, PBS, Cy5-MSN, FITC-IgG, FITC-IgG 로딩된 Cy5-MSN을 마우스 종양 내 주사 투여하였다. 도 28a및 28b에서 보여지듯이 MSN과 IgG은 종양 조직에 잘 전달되었으며, MSN에 로딩하지 않은 상태의 IgG는 MSN에 로딩한 IgG에 비해, 종양에 주입 후 상대적으로 빨리 형광신호가 사라지는 것을 확인할 수 있다. 상기 동물 실험 결과를 통해 본원에 따른 MSN이 약제학적 유효물질의 높은 안정성과 그 기능을 효과적으로 유지함으로써 치료연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능함을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 평균 기공 직경이 1 nm 이상 내지 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자, 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 단백질 전달용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 리간드는 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것인, 단백질 전달용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함하는, 단백질 전달용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 표면에 결합된 상기 리간드에 결합되어 상기 다공성 실리카 나노입자 내에 흡착 또는 로딩된 단백질을 추가 포함하는, 단백질 전달용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기와 단백질의 정전기적 상호작용에 의해 상기 단백질이 상기 실리카 입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 것인, 단백질 전달용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질은 프로테아좀을 포함하는 단백질 복합체; 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase) 및 포스파타아제(phosphatase)로 이루어진 군에서 선택되는 효소; 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 단백질 전달용 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질은 전신 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질; 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 및상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자; 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 사이토카인 및 호르몬; 프로테아좀을 포함하는 단백질 복합체; 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 및 키나아제(kinase), 또는 포스파타아제(phosphatase)를 포함하는 효소; 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 단백질 전달용 조성물.
  8. 평균 기공 직경이 1 nm 이상 내지 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자; 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 흡착 또는 로딩된 단백질을 포함하는 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 단백질의 전달 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 단백질은 프로테아좀을 포함하는 단백질 복합체; 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase), 또는 포스파타아제(phosphatase)를 포함하는 효소; 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 단백질의 전달 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 다공성 실리카 나노입자는 그의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머를 추가 포함하는 것인, 단백질의 전달 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 단백질은 전신 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질; 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 및 상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자; 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 또는 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 사이토카인 및 호르몬; 프로테아좀을 포함하는 단백질 복합체; 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase), 또는 포스파타아제(phosphatase)를 포함하는 효소; 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 단백질 전달 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단백질 전달 방법.
  13. 제 8 항에 있어서,
    상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 단백질 전달 방법.
  14. 평균 기공 직경이 1 nm 이상 내지 100 nm 이하인 기공을 함유하는 다공성 실리카 나노입자; 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공의 내부 또는 외부 표면에 결합되며 표면 음전하 또는 양전하를 부여하는 작용기 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드; 및 상기 작용기 또는 리간드에 결합된 생리활성 물질을 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 생리활성 물질에 특이적으로 결합하는 작용기 또는 리간드는, 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것인, 생리활성 물질 전달용 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착 또는 로딩(loading)되는 것인, 생리활성 물질 전달용 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 약물, 단백질, 펩타이드, miRNA, siRNA, 효소, 보조영양제, 비타민, 천연물, 또는 추출물을 포함하는 것인, 생리활성 물질 전달용 조성물.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드, 또는 엡타머를 추가 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 생리활성 물질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 생리활성 물질의 전달 방법.
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