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KR20220003495A - Ctgf 발현 억제용 조성물 - Google Patents

Ctgf 발현 억제용 조성물 Download PDF

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KR20220003495A
KR20220003495A KR1020210192889A KR20210192889A KR20220003495A KR 20220003495 A KR20220003495 A KR 20220003495A KR 1020210192889 A KR1020210192889 A KR 1020210192889A KR 20210192889 A KR20210192889 A KR 20210192889A KR 20220003495 A KR20220003495 A KR 20220003495A
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원철희
민달희
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주식회사 레모넥스
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Abstract

본 발명은 CTGF의 발현 수준을 RNAi에 의해 억제시킴으로써, 비대흉터 및 켈로이드와 같은 섬유 증식성 질환을 우수한 효율로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

CTGF 발현 억제용 조성물{Composition for inhibiting CTGF expression}
본 발명은 CTGF 발현을 높은 효율로 억제하여, 우수한 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.
조직 리모델링은 생리학적 또는 병리학적 스트레스에 반응하여 기존 조직을 재건하는 것이다. 병리생리학에서 조직 리모델링은 결합조직성장인자(Connective tissue growth factor, CTGF), 근섬유 분화 및 활성화, 세포 외 기질(ECM)의 침착 및 섬유화의 과발현으로 특징지어진다. 다양한 신호 분자 및 인자들 중에서, CTGF는 조직 리모델링에서 중추적인 매개체로 간주되어 왔다. CTGF는 다양한 신호 전달 경로에 관여하여, 세포 부착 및 이동, ECM 리모델링 및 장기구조의 변화를 일으킨다. 조직 리모델링 및 섬유화는 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 당뇨병성 망막증 및 피부 섬유증(켈로이드 및 비대흉터)과 같은 수많은 섬유성 장애와 관련이 있다.
피부에서 상처 치유 과정은 매우 복잡하고, 염증, 세포 분화 및 증식, 조직 리모델링(콜라겐 생성 포함)의 중복된 단계로 구성된다. 몇몇 사이토카인과 성장인자, 특히 TGF-β는 창상 치유의 초기와 후기 단계에서 중요한 역할을 한다. TGF-β는 CTGF 상향 조절을 통해 백혈구 이동, 혈관 신생, 섬유 아세포 이동 및 ECM 성분(콜라겐 및 피브로넥틴) 생산을 매개한다. CTGF의 과발현은 비대흉터와 켈로이드 환자에서 관찰되었기 때문에, CTGF 발현의 억제는 섬유화 과정을 억제하거나 역전시킬 수 있는 섬유화 기전을 조절하는 매력적인 전략이다.
많은 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 CTGF 발현을 억제하거나, 과도한 콜라겐 생성 및 섬유화를 감소시키는 작용을 조사했다. siRNA는 CTGF 억제를 위한 유망한 후보물질 중 하나이다. siRNA에 유도된 RNA 간섭은 표적 mRNA를 서열 상보적으로 인식하고 절단하는, 매우 특이하고 효율적인 유전자 사일런싱 기구에 의해 매개된다. 새로운 치료제로서의 높은 잠재력에도 불구하고, 1) 생물학적 시스템에서의 핵산 분해 효소에 의한 급속한 분해, 2) 효과적은 siRNA 투여량의 유지, 3) 생물학적 장벽을 가로지르는 효율적인 전달의 어려움과 같은 몇 가지 한계와 장벽이 존재한다.
현재까지 siRNA의 전달을 위해 양이온성 고분자, 지질나노입자(LNP), 바이러스 및 다양한 나노물질이 개발되었다. 양이온성 고분자와 LNP의 임상적 적용은 생체 내 구조의 독성 및/또는 불안정성 때문에 신중해야하고, 바이러스성 유전자 전달은 낮은 포장능력 외 돌연변이 유발 문제가 있다. siRNA 백본의 화학적 변형은 안정성과 세포흡수를 증가시킬 수 있으나, 여전히 고비용, 노동 집약성, 시간 소모적인 공정 및 표적세포에서의 만족스러운 효능을 위한 높은 양의 siRNA 투여와 같은 단점을 여전히 갖고 있다.
한국공개특허 제2016-0026905호
본 발명은 CTGF 발현을 높은 효율로 억제하여, 우수한 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1의 서열과 10 뉴클레오티드 이상 상보적인 서열로 이루어진 핵산분자;를 포함하는 CTGF 유전자 발현 억제용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 서열번호 1의 서열과 16 뉴클레오티드 이상 상보적인 서열로 이루어진 핵산분자;를 포함하는 조성물.
3. 위 1에 있어서, 서열번호 1의 서열 전체와 상보적인 서열로 이루어진 핵산분자;를 포함하는 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 핵산분자는 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA의 일 가닥(strand)을 이루는 것인 조성물.
5. 위 4에 있어서, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 52의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 53의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 54의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 55의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 56의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 57의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 58의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 59의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 60의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 61의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 62의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 63의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 64의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 65의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 66의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 67의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 68의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 69의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 70의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 71의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 72의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA;로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA 또는 dsRNA를 포함하는 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 센스 RNA 및 안티센스 RNA 서열의 3' 말단에 UU 또는 dTdT의 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
7. 위 4에 있어서, 서열번호 87 내지 99의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 이루어진 PNA를 적어도 하나 포함하는 조성물.
8. 위 7에 있어서, 상기 PNA의 적어도 하나의 말단에 서열번호 101 내지 113으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열로 이루어진 펩티드; 또는 mPEG5000이 더 결합된 것인 조성물.
9. 위 1 내지 8 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 위 9에 있어서, 상기 섬유증식성 질환은 비대흉터, 켈로이드, 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유화증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 피부경화증, 당뇨병성 망막증, 듀켄씨근이영양증, 방사-유도 섬유증, 심근 섬유증, 당뇨병성 신장질환, 만성 신부전증, 만성 바이러스성 간염, 담도섬유화, 지방간염, 알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간염, 증식유리체망막병증, 근골격계 종양, 골육종, 횡문근육종, 교모세포종, 폐암, 난소암, 식도암, 대장암, 췌장암, 신장경화증, 사르코이드증, 녹내장, 황반변성, 망막하섬유화증, 맥락막혈관신생, 유리체망막병증, 증식유리체망막병증, 당뇨망막병증, 각막염, 익상편, 검열반, 피부경화증, 자궁근종, 전신경화증, 사구체 신염, 사람 면역 결핍 바이러스성 신질환, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 레이노병, 류마티스 관절염, 다발근염, 혈관협착증, 치주염 및 치주은으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
11. CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지한 다공성 실리카 입자;를 포함하고,
상기 다공성 실리카 입자는 직경 5nm 미만의 기공을 갖는 실리카 입자를 120℃ 내지 180℃에서 24시간 내지 96시간 동안 팽창제와 반응시켜 상기 직경 5nm 미만의 기공을 팽창시키는 단계; 및 상기 기공이 팽창된 실리카 입자를 400℃ 이상의 온도에서 3시간 이상 하소하는 단계를 포함하여 제조되며,
상기 다공성 실리카 입자의 평균 직경은 100 nm 내지 1000nm이고, 그 BET 표면적은 200m2/g 내지 700m2/g이고, 그 g당 부피는 0.7ml 내지 2.2ml이며,
상기 다공성 실리카 입자는 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상인 것인, CTGF 유전자 발현 억제용 조성물:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
상기 현탁액의 pH는 7.4이고,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
12. 위 11에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 외부 표면 또는 기공 내부가 중성의 pH에서 양전하 또는 무전하를 띠는 것인 조성물.
13. 위 11에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 친수성 또는 소수성 작용기를 갖는 것인 조성물.
14. 위 11에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 1의 서열과 10 뉴클레오티드 이상 상보적인 것인 조성물.
15. 위 11에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 1의 서열과 16 뉴클레오티드 이상 상보적인 것인 조성물.
16. 위 11에 있어서, 서열번호 1의 서열 전체와 상보적인 서열로 이루어진 핵산분자;를 포함하는 조성물.
17. 위 11에 있어서, 상기 핵산분자는 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA의 일 가닥(strand)을 이루는 것인 조성물.
18. 위 17에 있어서, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 52의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 53의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 54의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 55의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 56의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 57의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 58의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 59의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 60의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 61의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 62의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 63의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 64의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 65의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 66의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 67의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 68의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 69의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 70의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 71의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 72의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA;로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA 또는 dsRNA를 포함하는 조성물.
19. 위 18에 있어서, 상기 센스 RNA 및 안티센스 RNA 서열의 3' 말단에 UU 또는 dTdT의 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
20. 위 17에 있어서, 서열번호 87 내지 99의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 이루어진 PNA를 적어도 하나 포함하는 조성물.
21. 위 20에 있어서, 상기 PNA의 적어도 하나의 말단에 서열번호 101 내지 113으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열로 이루어진 펩티드; 또는 mPEG5000이 더 결합된 것인 조성물.
22. 위 11 내지 21 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
23. 위 22에 있어서, 상기 섬유증식성 질환은 비대흉터, 켈로이드, 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유화증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 피부경화증, 당뇨병성 망막증, 듀켄씨근이영양증, 방사-유도 섬유증, 심근 섬유증, 당뇨병성 신장질환, 만성 신부전증, 만성 바이러스성 간염, 담도섬유화, 지방간염, 알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간염, 증식유리체망막병증, 근골격계 종양, 골육종, 횡문근육종, 교모세포종, 폐암, 난소암, 식도암, 대장암, 췌장암, 신장경화증, 사르코이드증, 녹내장, 황반변성, 망막하섬유화증, 맥락막혈관신생, 유리체망막병증, 증식유리체망막병증, 당뇨망막병증, 각막염, 익상편, 검열반, 피부경화증, 자궁근종, 전신경화증, 사구체 신염, 사람 면역 결핍 바이러스성 신질환, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 레이노병, 류마티스 관절염, 다발근염, 혈관협착증, 치주염 및 치주은으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
본 발명의 조성물은 CTGF 및 콜라겐의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 핵산분자를 포함하고 있어, CTGF 또는 콜라겐의 과발현으로 인한 다양한 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.
도 1은 병리학적 경로를 통해 유도된 CTGF의 과발현으로 인한 비대흉터 및 켈로이드의 세포 기전 및 LEM-S401의 효과적인 CTGF 발현 억제 원리를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2,3은 A549(도 2) 및 HaCaT(도 3) 세포 각각을 6시간 동안 다양한 용량의 LEM-S401(12.5, 25, 50, 100 nM)로 6시간 동안 처리하고, CTGF 발현을 12 ng/mL의 TGF-ß에 의해 유도하였고, CTGF mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 이용하여 대조군(미처리, siCTGF만 처리, DegradaBALL만 처리, scrambled siRNA 처리)과 비교한 것이다(*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.005).
도 4,5는 A549(도 4) 및 HaCaT(도 5) 세포 각각을 LEM-S401 및 siCTGF를 담지한 지질나노입자(Lipid nanoparticle, LNP)로 처리하여 비교한 것으로, 세포를 72시간 및 96시간 동안 배양하였고, 수득 12시간 전에 TGF-ß를 처리하였다(*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.005).
도 6은 LEM-S401를 마우스 피부에 피하주입하고, LEM-S401 주입 부위에서의 siCTGF 및 DegradaBALL의 피부 체류 시간을 측정하기 위해 절제된 마우스 피부의 형광이미지를 다른 시점에 촬영하였고(1,3,5일)(왼쪽, Scale bar: 25mm), DAPI 염색 후 같은 방식으로 처리된 피부 절편의 형광 이미지를 촬영한 것이다(오른쪽, Scale bar: 100μm).
도 7은 DegradaBALL에 담지되지 않은 FITC-접합된 siCTGF를 피하 주입한 절제된 피부의 형광이미지를 다른 시점에서 촬영한 것이고(왼쪽), DAPI 염색 후, 같은 방식으로 처리된 피부 절편의 형광 이미지를 촬영한 것이다(Scale bar: 100μm).
도 8 내지 15은 0,4,8,12일에 LEM-S401(1 nmol)를 마우스 피부 상처 주위에 피하주입한 결과를 나타낸 것으로, 도 8 내지 10은 CTGF 및 콜라겐 유형 1,3의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 사용하여 16일째에 측정한 것이고, 도 11은 상처입은 마우스 피부의 이미지를 LEM-S401 처리군 및 대조군(완충액, DegradaBALL only, siCTGF only) 간 피부 불규칙 및 부드러움을 처리 10일째에 비교한 것이며, 도 12는 CTGF와 콜라겐 유형 1,3을 각각 인식하는 항체로 조직 염색 후, LEM-S401, 자유 siCTGF, DegradaBALL only 및 완충액으로 처리한 피부 절편의 형광이미지를 촬영한 것으로, 이어 2차 항체를 피부 절편에 처리한 것이고(Scale bar: 100 μm), 도 13 내지 15는 도 12의 이미지를 기반으로 면역조직화학 데이터를 정량분석한 것이다(*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.005).
도 16은 DegradaBALL의 농도를 증가시킴에 따른 A549 및 HaCaT 세포에서의 독성을 CCK-8 분석으로 측정한 것이다.
도 17은 A549 및 HaCaT 세포 각각을 2 ng/mL의 TGF-ß로 24시간 동안 처리한 결과로서, 세포들은 다른 시점에서 수득되었고, CTGF 발현 수준은 RT-PCR로 분석되었다.
도 18 내지 24는 LEM-S401를 상처 형성 후 10,14,18,22일에 상처 부위에 피하주입한 결과로서, 도 18 내지 20은 주입 부위의 CTGF 및 콜라겐 유형 1,3의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 측정한 것이고, 도 21은 수득한 마우스 피부의 CTGF 및 콜라겐 유형 1,3의 형광 이미지를 면역조직화학법으로 측정한 것이며(Scale bar: 100 μm), 도 22 내지 24는 면역조직화학 데이터를 정량화한 것이다(*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.005).
도 25는 siRNA를 DDV(다공성 실리카 입자, DegradaBALL)에 담지하여 마우스 피하주입한 경우와, 담지하지 않은 free-siRNA를 마우스 피하주입한 경우의 체내 형광 이미지 검출 비교 결과이다.
도 26,27은 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA(#1); 서열번호 4의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 5의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA(#2); 서열번호 7의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA(#3)의 A549 및 HaCaT 세포 내 CTGF 발현 수준 억제능을 확인한 것으로, 도 26은 siRNA 처리 12시간 후 TGF-β를 처리한 것이고, 도 27은 TGF-ß 처리 24시간 후 siRNA를 처리한 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 29는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 30은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 31은 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 32는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다.
DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 33은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 34는 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 35는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 36은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 37은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 38은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 39는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 40은 일 예시에 따른 siRNA 또는 dsRNA 방출을 확인하는 튜브이다.
도 41은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 담지된 siRNA의 시간 경과에 따른 방출 정도이다.
본 발명의 구체적 설명에 있어서 용어의 구체적 의미를 정의하고자 하나, 이는 당업계 통상의 기술자에 이해되는 의미로 받아들여질 것일 뿐, 하기에 정의된 특정 의미로 제한하고자 하는 의도는 아니다.
"siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.　siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA　분자는 센스 가닥(표적 유전자의 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(표적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, siRNA　분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.　siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA　말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, siRNA　분자는 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된　siRNA　분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의　siRNA　분자를 생성한다.
"dsRNA"는 siRNA의 전구체 분자로서, 표적세포의 DICER 효소(Ribonuclease III)를 포함하는 RISC 복합체와 만나 siRNA로 절단되고, 이 과정에서 RNAi가 발생한다. dsRNA는 siRNA 보다 수 뉴클레오티드 만큼 긴 서열을 갖고, 센스 가닥(표적 유전자의 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(표적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다.
"PNA"는 DNA 또는 RNA와 유사한 구조를 가지나, DNA 또는 RNA와는 달리 전하를 띠지 않도록 설계되어 강한 결합력을 갖는 합성 폴리머로서, DNA와 RNA가 데옥시리보오스(deoxyribose) 또는 리보오스(ribose) 당 백본(backbone)을 각각 갖는 반면, PNA의 백본은 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신((N-(2-aminoethyl)-glycine) 단위가 펩티드 결합으로 연결된 구조를 갖는다. 퓨린(purine)과 피리미딘(pyrimidine) 염기가 메틸렌(-CH2-)과 카보닐 그룹(-C=O-)으로 백본에 연결되어 있는 구조이고, 펩티드와 유사하게 양 말단에 각각 N-말단과 C-말단을 갖는다.
"핵산"은 임의의 PNA, DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 단백질 산물을 암호화하지 않는 유전자, 예컨대, siRNA 유전자의 경우에, "유전자 발현"이란 용어는 전구체 siRNA가 유전자로부터 생성되는 과정을 의미한다. 통상, 상기 과정은, 단백질 암호 유전자에 대해 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도되는 전사와는 달리, siRNA 유전자의 전사 산물이 해독되어 단백질을 생성하지 않지만, 전사로 언급된다. 그럼에도 불구하고, siRNA 유전자로부터 성숙 siRNA의 생성은 그 용어가 본원에 사용되는 대로 "유전자 발현"이란 용어에 의해 포함된다
"표적 유전자 (target gene)"란 용어는 본원에 개시되는 주제의 방법 및 조성물을 사용하여 조절하기 위해 표적으로 삼는 유전자를 의미한다. 그러므로, 표적 유전자는 그 발현 레벨이 mRNA 또는 폴리펩티드 레벨로 siRNA에 의해 하향 조절되는 핵산 서열을 포함한다. 유사하게, "표적 RNA" 또는 "표적 mRNA"란 용어는 siRNA가 결합하여 표적 유전자의 발현의 조절을 유도할 표적 유전자의 전사체를 의미한다.
"전사 (transcription)"란 용어는 유전자의 암호 서열에 존재하는 구조 정보의 RNA로서 발현을 유도하는 유전자와 RNA 폴리머라제의 상호작용을 포함하는 세포 과정을 의미한다.
"하향 조절(down-regulation)"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포 내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 감소된 것을 의미한다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다.
"예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 서열과 10 뉴클레오티드 이상 상보적인 서열로 이루어진 핵산분자;를 포함하는 CTGF 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
서열번호 1의 서열과의 상보성이 연속적으로 또는 비연속적으로, 10 뉴클레오티드(nucleotide; nt) 이상, 11 뉴클레오티드 이상, 12 뉴클레오티드 이상, 13 뉴클레오티드 이상, 14 뉴클레오티드 이상, 15 뉴클레오티드 이상, 16 뉴클레오티드 이상, 17 뉴클레오티드 이상 또는 18 뉴클레오티드 전체일 수 있다.
상기 핵산분자는 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA의 일 가닥(strand)을 이루는 것일 수 있는데, 이러한 경우, 상기 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA는 RNAi(RNA 간섭; RNA interference)에 의해 상기 CTGF 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, CTGF 유전자의 전사체인 mRNA 서열 중, 서열번호 1의 서열로 이루어진 부위의 적어도 일부에 상보적으로 결합하여 CTGF 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
상기 핵산분자가 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA의 일 가닥(strand)을 이루는 경우, 그 서열은 당업계 통상의 기술자의 수준에서 상기 siRNA, dsRNA, PNA 또는 miRNA의 설계에 있어 고려해야할 조건들에 부합하여 설계된 것임은 자명한 것인데, 이러한 경우, 회문구조(palindrome) 서열을 갖지 않도록 하여 머리핀 구조(hairpin shape), 십자형 구조(cross shape)로 인한 RNAi 효율 저하현상을 회피하도록 설계된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 siRNA 또는 dsRNA의 예를 들자면, 서열번호 100(5'-AACUUGAACU-3')의 서열을 포함하지 않도록 설계된 것일 수 있고, 본 발명의 PNA의 예를 들자면, 양 말단이 C와 G를 각각 가져 상보적인 관계가 형성되는 것을 회피하도록 설계한 것일 수 있으며, 상기 핵산분자 전체 서열 길이를 적절한 길이 이상을 유지하여 RNAi의 효율을 안정적으로 가질 수 있도록 설계할 수 있다.
상기 핵산분자의 전체 서열 길이는 10 내지 30, 11 내지 29, 12 내지 28, 13 내지 27, 14 내지 26, 15 내지 25, 16 내지 24, 16 내지 23, 16 내지 22, 16 내지 21 또는 16 내지 20 뉴클레오티드 길이일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 아니하고, 적절한 길이 이상을 유지하여 RNAi의 효율을 안정적으로 가질 수 있도록 하되, 적절한 길이 이하를 유지하여 생체 내 전달 효율성을 유지하기 위해 바람직하게는 16 내지 20 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
상기 핵산분자는, 구체적으로, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 2의 서열)일 수 있고, 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 53의 서열)일 수 있고, 서열번호 54의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 55의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 56의 서열)일 수 있고, 서열번호 57의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 58의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 59의 서열)일 수 있고, 서열번호 60의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 61의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 62의 서열)일 수 있고, 서열번호 63의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 64의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 65의 서열)일 수 있고, 서열번호 66의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 67의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 68의 서열)일 수 있고, 서열번호 69의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있으며, 서열번호 70의 서열로 이루어진 센스 RNA와 상보적으로 결합하여 siRNA를 이루는 안티센스 RNA(서열번호 71의 서열)일 수 있고, 서열번호 72의 서열로 이루어진 가닥(strand)과 상보적으로 결합하여 dsRNA를 이루는 가닥일 수 있다.
상기 핵산분자는, 구체적으로, 서열번호 87 내지 99의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 이루어진 PNA일 수 있다.
상기 언급된 서열의 구체적인 정보는 첨부된 서열목록 및 하기 표 1에 구체적으로 표기하였다.
본 발명의 핵산분자는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 것일 수 있다.
본 발명의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 본 발명의 핵산분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 본 발명의 핵산분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 핵산분자가 siRNA의 센스 RNA 또는 안티센스 RNA를 이루는 경우, 상기 센스 RNA 및 안티센스 RNA 서열의 3' 말단에 UU 또는 dTdT의 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있는데, 이는 핵산가수분해효소에의 저항성 증대를 통한 siRNA 또는 dsRNA의 구조적 안정성 증대, 안정한 RISC의 유도를 통한 siRNA 또는 dsRNA의 RNAi 효율성 증대 등의 장점을 siRNA 또는 dsRNA에 부여할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 핵산분자가 PNA를 이루는 경우, 적어도 하나의 말단에 서열번호 101 내지 113로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열로 이루어진 펩티드; 또는 mPEG5000이 더 결합된 것일 수 있는데, 이는 PNA의 조성물 내 용해도(solubility) 또는 침투성(penetration)을 상승시키기 위한 목적일 수 있고, 양 말단(N-말단 또는 C-말단) 중 C-말단에 결합됨이 별도의 링커를 요하지 않는다는 점에서 보다 바람직하다.
본 발명의 핵산분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 핵산분자 자체뿐만 아니라, 세포 내에서 본 발명의 핵산분자의 발현율을 증가시킬 수 있는 기타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 핵산분자는 세포 내 발현을 위한 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 핵산분자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 본 발명의 핵산분자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스 "쉘(shell)")의 친핵성으로 인해 분열 세포뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.
또한, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 벡터는 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 "선별마커(selection marker)"란 본 발명의 핵산분자가 도입된 세포의 선별을 용이하게 하기 위한 것이다. 상기 벡터에서 사용할 수 있는 선별마커로는 벡터의 도입 여부를 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자라면, 특별히 한정되지 않으나, 대표적으로 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질), 퓨로마이신(puromycin), 네오마이신(Neomycin: Neo), 하이그로마이신(hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 GFP(녹색 형광 단백질) 및 퓨로마이신 마커를 사용할 수 있다.
본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것으로서, 이는 본 발명의 핵산분자의 CTGF 유전자의 발현을 억제함으로써 달성되는 효과일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 예방 또는 치료 대상 질환인 섬유증식성 질환의 예로서, 비대흉터, 켈로이드, 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유화증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 피부경화증, 당뇨병성 망막증, 듀켄씨근이영양증, 방사-유도 섬유증, 심근 섬유증, 당뇨병성 신장질환, 만성 신부전증, 만성 바이러스성 간염, 담도섬유화, 지방간염, 알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간염, 증식유리체망막병증, 근골격계 종양, 골육종, 횡문근육종, 교모세포종, 폐암, 난소암, 식도암, 대장암, 췌장암, 신장경화증, 사르코이드증, 녹내장, 황반변성, 망막하섬유화증, 맥락막혈관신생, 유리체망막병증, 증식유리체망막병증, 당뇨망막병증, 각막염, 익상편, 검열반, 피부경화증, 자궁근종, 전신경화증, 사구체 신염, 사람 면역 결핍 바이러스성 신질환, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 레이노병, 류마티스 관절염, 다발근염, 혈관협착증, 치주염 및 치주은으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 질환일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 아니하고, CTGF 또는 콜라겐 등의 과발현으로 인한 질환에 해당하는 것이라면 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 핵산분자의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 섬유증식성 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지체에 담지한 것일 수 있고, 담지체의 종류에 있어 핵산분자를 담지할 수 있는 것으로서 당업계에 공지된 것이라면 특별한 제한은 없으나, 예를 들면, 리포좀, 리포펙타민, 덴드리머, 마이셀, 다공성 실리카 입자, 아미노클레이 및 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 바람직하게는 높은 핵산분자 담지율, 서방성, 생분해성 등의 장점을 갖는 다공성 실리카 입자일 수 있다.
본 발명은 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지한 다공성 실리카 입자;를 포함하는 CTGF 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다. 상기 다공성 실리카 입자는 실리카(SiO2) 소재의 입자이며, 나노 사이즈의 입경을 갖는다.
본 발명의 다공성 실리카 나노입자는 다공성 입자로서, 나노사이즈의 기공을 갖고, 그 표면 및/또는 기공 내부에 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지할 수 있다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 생분해성 입자로서, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지하여 체내에 투여되었을 때 체내에서 생분해되면서 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 방출할 수 있는데, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 체내에서 서서히 분해되어 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자가 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 예를 들면, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상이다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
상기 현탁액의 pH는 7.4이고,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
상기 수학식 1은 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것이다.
상기 수학식 1에서의 흡광도 A0, At는 예를 들면 도 34에 예시된 바와 같이, 원통형 투과막에 다공성 실리카 입자 및 현탁액을 넣고, 투과막 외부에도 동일한 현탁액을 넣고 측정된 것일 수 있다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 생분해성으로서, 현탁액 내에서 서서히 분해될 수 있고, 직경 50kDa는 약 5nm에 해당하는 것으로서 생분해된 다공성 실리카 입자는 직경 50kDa의 투과막을 통과할 수 있고, 원통형 투과막은 60rpm 수평 교반 하에 있으므로 현탁액이 고루 섞일 수 있으며 분해된 다공성 실리카 입자는 투과막 외부로 나올 수 있다.
상기 수학식 1에서의 흡광도는 예를 들어 투과막 외부의 현탁액이 새로운 현탁액으로 교체되는 환경 하에 측정된 것일 수 있다. 현탁액은 지속적으로 교체되는 것일 수 있고, 일정 기간마다 교체되는 것일 수 있으며, 상기 일정 기간은 정기 또는 비정기적인 기간일 수 있다. 예를 들어 1시간 내지 1주일의 범위 내에서, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 6시간 간격, 12시간 간격, 24시간 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 7일 간격 등으로 교체될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
상기 흡광도의 비가 1/2가 된다는 것은 t시간 후에 흡광도가 초기 흡광도의 절반이 된다는 것인 바, 이는 다공성 실리카 입자의 대략 절반이 분해되었다는 의미이다.
상기 현탁액은 완충용액일 수 있고, 구체적인 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 및 SBF(simulated body fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PBS일 수 있다.
본 발명의 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상으로, 예를 들면 t는 24 내지 120일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 24 내지 96, 24 내지 72, 30 내지 70, 40 내지 70, 50 내지 65 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/5가 되는 t가 예를 들면 70 내지 140일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 110, 70 내지 140, 70 내지 120, 70 내지 110 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
*본 발명의 다공성 실리카 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/20가 되는 t가 예를 들면 130 내지 220일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 130 내지 200, 140 내지 200, 140 내지 180, 150 내지 180 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 측정되는 흡광도가 0.01 이하가 되는 t가 예를 들면 250 이상, 예를 들어, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상 등일 수 있으며, 그 상한은 2000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 입자에서 상기 수학식 1의 흡광도의 비와 t는 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로서, 예를 들면 피어슨 상관 계수가 0.8 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.9 이상, 0.95 이상일 수 있다.
상기 수학식 1의 t는 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있다.
예를 들면, 입자의 표면적을 증가시켜 t를 감소시키거나, 표면적을 감소시켜 t를 증가시킬 수 있다. 표면적은 입자의 직경, 기공의 직경을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 표면 및/또는 기공 내부에 치환기를 위치시켜 다공성 실리카 입자가 환경(용매 등)에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 다공성 실리카 입자에 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지시키고 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자와 다공성 실리카 입자 간의 친화도를 증가시켜, 다공성 실리카 실리카 입자가 환경에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 입자의 제조시에 표면을 보다 치밀하게 제조하여 t를 증가시킬 수도 있다. 상기에는 수학식 1의 t를 조절할 수 있는 다양한 예시를 서술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 예를 들면 구형 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 평균 직경이 예를 들면 150nm 내지 1000nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 150nm 내지 800nm, 150nm 내지 500nm, 150nm 내지 400nm, 150nm 내지 300nm, 150nm 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
*본 발명의 다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경이 예를 들면 1nm 내지 100nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 5nm 내지 100nm, 7nm 내지 100nm, 7nm 내지 50nm, 10nm 내지 50nm, 10nm 내지 30nm, 7nm 내지 30nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 큰 직경을 가져 다량의 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지할 수 있고, 크기가 큰 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 담지도 가능하다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 BET 표면적이 예를 들면 200m2/g 내지 700m2/g일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 200m2/g 내지 700m2/g, 200m2/g 내지 650m2/g, 250m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 700m2/g, 300m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 600m2/g, 300m2/g 내지 550m2/g, 300m2/g 내지 500m2/g, 300m2/g 내지 450m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 나노입자는 g당 부피가 예를 들면 0.7ml 내지 2.2ml일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7ml 내지 2.0ml, 0.8ml 내지 2.2ml, 0,8 ml 내지 2.0ml, 0.9 ml 내지 2.0ml, 1.0 ml 내지 2.0ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. g당 부피가 과도하게 작아지면 분해 속도가 너무 빨라질 수 있고, 과도하게 큰 입자는 제조가 어렵거나, 온전한 형상을 가질 수 없을 수 있다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 외부 표면 및/또는 기공 내부에 친수성 치환기 및/또는 소수성 치환기가 존재할 수 있다. 예를 들면 표면 및 기공 내부 모두 친수성 치환기만 존재하거나, 소수성 치환기만 존재할 수도 있고, 표면 또는 기공 내부에만 친수성 치환기가 존재하거나, 소수성 치환기가 존재할 수도 있고, 표면에는 친수성 치환기, 기공 내부에는 소수성 치환기가 존재할 수도 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
본 발명의 다공성 실리카 입자에 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 방출은 주로 나노입자의 분해에 의해 수행되는 것인 바, 상기 치환기의 조절로 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 나노입자 자체의 분해 속도가 조절되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출 속도가 조절될 수 있고, 또한, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 나노입자로부터 확산되어 방출될 수도 있는데, 상기 치환기의 조절로 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 나노입자에 대한 결합력이 조절되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 방출이 조절될 수 있다.
또한, 난용성(소수성) CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력 증진을 위해 기공 내부에는 소수성 치환기가 존재하고, 사용, 제형화의 용이성 등의 측면에서 입자의 표면은 친수성 치환기가 존재하도록 하는 등의 처리도 가능하다.
친수성 치환기는 예를 들면 히드록시기, 카르복시기, 아미노기, 카르보닐기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 티올기, 암모늄기, 에스터기, 이미드기, 티오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 폴리에틸렌글리콜기 등을 들 수 있고, 소수성 치환기는 예를 들면 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30의 헤테로아릴기, 할로겐기, C1 내지 C30의 에스테르기, 및 할로겐 함유기 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 외부 표면 및/또는 기공 내부가 양전하, 음전하 및/또는 무전하로 대전된 것일 수 있다. 예를 들면 표면 및 기공 내부 모두 양전하로 대전되거나, 음전하로 대전될 수 있고, 표면 또는 기공 내부만 양전하로 대전되거나, 음전하로 대전될 수 있고, 표면은 양전하, 기공 내부는 음전하로 대전될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하며, 무전하의 경우도 마찬가지이다.
상기 대전은 예를 들면 비이온성 치환기, 양이온성 치환기 또는 음이온성 치환기가 존재함으로써 된 것일 수 있다.
상기 양이온성 치환기는 예를 들면 염기성기로서 아미노기, 그 외 질소함유기 등일 수 있고, 구체적으로는, 아미노기, 아미노알킬기, 알킬아미노기, 질소원자를 포함하는 헤테로고리 방향족화합물기, 시안기 및 구아니딘기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 음이온성 치환기는 예를 들면 산성기로서 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H), 티올기(-SH) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
마찬가지로 상기 대전에 의해 상기 치환기의 조절로 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 나노입자 자체의 분해 속도가 조절되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출 속도가 조절될 수 있고, 또한, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 나노입자로부터 확산되어 방출될 수도 있는데, 상기 치환기의 조절로 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 나노입자에 대한 결합력이 조절되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출이 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 그 표면 및/또는 기공 내부에 상기 외에 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 담지, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 표적 세포로의 이동, 그외 기타 목적을 위한 물질의 담지 또는 그외 추가 치환기의 결합 등을 위한 치환기가 존재할 수 있으며, 이에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머 등을 더 포함할 수 있다.
전술한 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 전하, 결합물질 등은 예를 들면 표면 개질에 의해 부가될 수 있다.
표면 개질은 예를 들면 도입하고자 하는 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 예를 들면 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정을 거쳐 제조된 것일 수 있고, 필요에 따라 하소(calcination) 공정, 표면 개질 공정 등을 더 거쳐 제조된 것일 수 있다. 하소 및 표면 개질 공정을 모두 거친 경우는 하소 이후에 표면 개질 된 것일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 예를 들면 평균 기공 직경이 1nm 내지 5nm인 입자일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반 및 균질화시켜 얻어질 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 메탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 물과 유기 용매의 혼합 용매 사용시 그 비율은 예를 들면 물과 유기용매를 1: 0.7 내지 1.5의 부피비, 예를 들어, 1: 0.8 내지 1.3의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 예를 들면 용매 1리터당 1g 내지 10g, 예를 들어 상기 범위 내에서 1g 내지 8g, 2g 내지 8g, 3g 내지 8g 등의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질은 용매에 계면활성제를 첨가하여 교반한 후에 첨가될 수 있다. 실리카 전구물질은 예를 들면 TMOS(Tetramethyl orthosilicate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반은 예를 들면 10분 내지 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구물질은 예를 들면 용매 1리터당 0.5ml 내지 5ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 4ml, 0.5ml 내지 3ml, 0.5ml 내지 2ml, 1ml 내지 2ml 등으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라 촉매로서 수산화나트륨을 더 사용할 수 있으며, 이는 용매에 계면활성제를 첨가한 후 실리카 전구물질의 첨가 전에 교반하면서 첨가될 수 있다.
상기 수산화나트륨은 예를 들면 1M 수산화나트륨 수용액 기준으로 용매 1리터당 0.5ml 내지 8ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 5ml, 0.5ml 내지 4ml, 1ml 내지 4ml, 1ml 내지 3ml 2ml 내지 3ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질의 첨가 후에 용액을 교반하며 반응시킬 수 있다. 교반은 예를 들면 2시간 내지 15시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 13시간, 5시간 내지 12시간, 6 시간 내지 12시간, 6시간 내지 10시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 시간(반응 시간)이 너무 짧은 경우에는 결정핵 생성(nucleation)이 부족할 수 있다.
상기 교반 이후에는 용액을 숙성(aging)시킬 수 있다. 숙성은 예를 들면 8시간 내지 24시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 8시간 내지 20시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 반응산물을 세척 및 건조시켜 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있다.
상기 미반응 물질의 분리는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있고, 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 상기 얻어진 다공성 실리카 입자의 기공을 확장하고, 기공 확장은 기공 팽창제를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 트리헥실벤젠, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있고, 구체적으로, 트리메틸벤젠을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 기공 팽창제는 예를 들면 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자를 기공 팽창제와 혼합하고, 가열하여 반응시켜 수행될 수 있다.
상기 용매는 예를 들면 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면 용매 1리터당 10g 내지 200g, 예를 들어 상기 범위 내에서 10g 내지 150g, 10g 내지 100g, 30g 내지 100g, 40g 내지 100g, 50g 내지 100g, 50g 내지 80g, 60g 내지 80g 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 용매 중에 고르게 분산되어 있는 것일 수 있고, 예를 들면 용매에 다공성 실리카 입자를 첨가하고 초음파 분산시킨 것일 수 있다. 혼합용매를 사용하는 경우에는 제1 용매에 다공성 실리카 입자를 분산시킨 후에 제2 용매를 첨가한 것일 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 용매 100부피부에 대하여 10 내지 200부피부, 상기 범위 내에서, 10 내지 150부피부, 10 내지 100부피부, 10 내지 80부피부, 30 내지 80부피부, 30 내지 70부피부 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 120℃ 내지 190℃로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 120℃ 내지 190℃, 120℃ 내지 180℃, 120℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 160℃, 130℃ 내지 150℃, 130℃ 내지 140℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 6시간 내지 96시간 수행 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 80시간, 30시간 내지 72시간, 24시간 내지 80시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 80시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 66시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 88시간, 48시간 내지 80시간, 48시간 내지 72시간, 6시간 내지 96시간, 7시간 내지 96시간, 8시간 내지 80시간, 9시간 내지 72시간, 9시간 내지 80시간, 6시간 내지 72시간, 9시간 내지 96시간, 10시간 내지 80시간, 10시간 내지 72시간, 12시간 내지 66시간, 13시간 내지 60시간, 14시간 내지 96시간, 15시간 내지 88시간, 16시간 내지 80시간, 17시간 내지 72시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 예시한 범위 내에서 시간 및 온도를 조절하여 반응이 과다하지 않으면서 충분히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 늘리거나, 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 짧게하는 등에 의할 수 있다. 반응이 충분하지 않으면 기공의 확장이 충분하지 못할 수 있고, 반응이 과다하게 진행되면 기공의 과다 확장에 의해 입자가 붕괴될 수 있다.
상기 반응은 예를 들면 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있다. 구체적으로, 상온에서 상기 온도까지 0.5℃/분 내지 15℃/분의 속도로 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 교반 하에 수행될 수 있다. 예를 들면 100rpm 이상의 속도로 교반될 수 있고, 구체적으로 100rpm 내지 1000rpm의 속도로 수행도리 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 이후에는 반응액을 서서히 냉각시킬 수 있으며, 예를 들면 단계적으로 감온하여 냉각시킬 수 있다. 구체적으로 상기 온도에서 상온까지 0.5℃/분 내지 20℃/분의 속도로 단계적으로 감온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 냉각 이후에 반응 산물을 세척 및 건조시켜 기공이 확장된 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있다.
상기 미반응 물질의 분리는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있고, 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 얻어진 입자는 하소될 수 있는데, 하소는 입자를 가열하여 그 표면 및 내부의 실라놀기를 제거하여 입자의 반응성을 낮추고, 좀 더 치밀한 구조를 갖게 하고, 기공을 채우는 유기물들을 제거하는 공정으로, 예를 들면 400℃ 이상의 온도로 가열될 수 있다. 그 상한은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 1000℃, 900℃, 800℃, 700℃ 등일 수 있다. 가열은 예를 들면 3시간 이상 수행될 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 24시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 400℃ 내지 700℃에서 3시간 내지 8시간, 구체적으로 500℃ 내지 600℃에서 4시간 내지 5시간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
기공을 채우는 유기물을 제거함으로써, 잔존 유기물에 의해 나타나는 세포 독성, 거품 발생 등의 문제를 방지할 수 있다.
이후, 얻어진 다공성 실리카 입자는 표면개질 될 수 있고, 표면 개질은 표면 및/또는 기공 내부에 수행될 수 있다. 입자 표면과 기공 내부는 동일하게 표면개질될 수도 있고, 서로 다르게 표면개질될 수도 있다.
상기 표면 개질을 통해 입자가 대전되도록 하거나, 친수성 및/또는 소수성 성질을 갖도록 할 수 있다.
보다 구체적으로, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자의 효과적인 담지를 위하여, 아미노기, 아미노알킬기, 알킬아미노기, 질소원자를 포함하는 헤테로고리 방향족화합물기, 시안기 및 구아니딘기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 치환기를 갖도록 하여, 상기 다공성 실리카 입자의 표면개질을 수행할 수 있다.
표면 개질은 예를 들면 도입하고자 하는 친수성, 소수성, 양이온성, 음이온성 등의 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
상기 알콕시실란을 다공성 실리콘 입자와 반응시키면 실리콘 원자와 산소 원자간 공유 결합이 형성되어 알콕시실란이 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부와 결합될 수 있고, 상기 알콕시실란은 도입하고자 하는 치환기를 가지고 있는 바, 해당 치환기가 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부에 도입될 수 있다.
상기 반응은 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양전하로의 대전은 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 음전하로의 대전은 예를 들면 카르복시기, 술폰산기, 티올기 등의 산성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 무전하(양전하 또는 음전하가 아닌, 전하가 없는 상태)로의 대전은 전하를 갖지 않는 통상의 작용기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 양전하로의 대전과 음전하로의 대전을 적절히 조합하여, 양전하와 음전하의 상쇄를 통한 무전하로 대전시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 친수성 성질은 친수성기, 예를 들면 히드록시기, 카르복시기, 아미노기, 카르보닐기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 티올기, 암모늄기, 에스터기, 이미드기, 티오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 폴리에틸렌글리콜기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소수성 성질은 소수성 치환기, 예를 들면 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30의 헤테로아릴기, 할로겐기, C1 내지 C30의 에스테르기, 할로겐 함유기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, Trimethoxy(octadecyl)silane, Trimethoxy-n-octylsilane, Trimethoxy(propyl)silane, Isobutyl(trimethoxy)silane, Trimethoxy(7-octen-1-yl)silane, Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane, Trimethoxy(2-phenylethyl)silane, Vinyltrimethoxysilane, Cyanomethyl, 3-(trimethoxysilyl)propyl] trithiocarbonate, (3-Bromopropyl)trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 외에 상기 표면 개질을 통해 난용성(소수성) CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력 증진을 위해 기공 내부에는 소수성 치환기가 존재하고, 사용, 제형화의 용이성 등의 측면에서 입자의 표면은 친수성 치환기가 존재하도록 하는 등의 처리도 가능하고, 표면에 다른 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질을 결합시키기 위한 치환기가 존재할 수도 있다.
또한, 상기 표면 개질은 복합적으로 수행될 수도 있다. 예를 들어, 외부 표면 또는 기공 내부에 2회 이상의 표면 개질이 수행될 수도 있다. 구체적인 예를 들자면, 아미노기가 도입된 실리카 입자에 카르복실기를 포함하는 화합물을 아미드 결합으로 결합시켜 양전하로 대전된 입자를 다른 표면특성을 가지게 변화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 온도, 시간, 그리고 표면개질에 사용되는 화합물의 양 등은 표면개질하고자 하는 정도에 따라 선택될 수 있는 것으로서, 본 발명의 핵산분자 또는 물질들의 친수성, 소수성, 전하 정도에 따라 반응 조건을 달리하여 다공성 실리카 입자의 친수성, 소수성, 전하 정도를 조절함으로써, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질들의 방출 속도를 조절할 수 있다. 예를 들면, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질들이 중성의 pH에서 강한 음전하를 띠는 경우에는 다공성 실리카 입자가 강한 양전하를 띠도록 하기 위해, 반응 온도를 높이거나 반응 시간을 길게 할 수 있으며, 화합물 처리량을 늘릴 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 예를 들면 소기공의 입자 제조, 기공 확장, 표면 개질, 기공 내부 개질 공정을 거쳐 제조된 것일 수도 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정은 전술한 바의 공정에 의할 수 있으며, 소기공의 입자 제조 이후, 그리고 기공 확장 공정 이후에 세척 및 건조 공정을 수행할 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 미반응 물질의 분리는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소기공의 입자 제조 이후의 세척은 앞서 예시한 범위 내의 방법/조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장 이후의 세척은 앞서 예시보다는 보다 완화된 조건으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 세척을 3회 이내 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표면 개질과 기공 내부 개질은 각각 전술한 바의 공정에 의할 수 있으며, 표면 개질과 기공 내부 개질의 순서로 공정이 수행될 수 있고, 상기 두 공정 사이에 입자의 세척 공정이 추가로 수행될 수 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 이후에 세척을 보다 완화된 조건으로 수행하는 경우 기공 내부에 입자 제조, 기공 확장에 사용된 계면활성제 등의 반응액이 채워져 있어 표면 개질시에 기공 내부는 개질되지 않고 표면만 개질될 수 있다. 그러고 나서 입자를 세척하면 기공 내부의 반응액이 제거될 수 있다.
상기 표면 개질과 기공 내부 개질 공정 사이의 입자 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 다공성 실리카 입자의 표면 및/또는 기공 내부에 담지될 수 있고, 담지는 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 혼합하여 수행될 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
상기 다공성 실리카 입자와 본 발명의 핵산분자의 비율은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 중량비가 1: 0.05 내지 0.8, 예를 들어 상기 범위 내에서 1: 0.05 내지 0.7, 1:0.05 내지 0.6, 1: 0.1 내지 0.8, 1: 0.1 내지 0.6, 1: 0.2 내지 0.8, 1: 0.2 내지 0.6 등일 수 있다.
상기 다공성 실리카 입자에 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 연장된 시간에 걸쳐 점진적으로 방출될 수 있다. 이와 같이 느린 방출은 연속성 또는 비연속성, 선형 또는 비선형일 수 있으며, 다공성 실리카 입자의 특징 및/또는 그와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자와의 상호작용에 기인하여 달라질 수 있다.
상기 다공성 실리카 입자에 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 다공성 실리카 입자가 생분해되면서 방출되는데, 본 발명에 따른 다공성 실리카 입자는 서서히 분해되어 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자가 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 다공성 실리카 입자에 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 다공성 실리카 입자로부터 이탈되어 확산되면서도 방출될 수 있고, 이는 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출 환경과의 관계에 영향을 받는 것인 바, 이를 조절하여 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 방출을 조절할 수 있다. 예를 들면 표면개질에 의해 다공성 실리카 입자의 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자와의 결합력을 강화 또는 약화시킴으로써 조절할 수 있다.
보다 구체적인 예를 들자면, 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 난용성(소수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 소수성 치환기를 가져 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 소수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "난용성"은 (물에 대해) 불용성(insoluble), 실질적으로 불용성(practically insoluble) 또는 극히 약간의 가용성(only slightly soluble)인 것을 포함하는 의미로서 이는 "Pharmaceutical Science" 18th Edition(U.S.P., Remington, Mack Publishing Company 발행)에 정의되어 있는 용어이다.
상기 난용성 물질은 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 미만, 구체적으로 5g/L 미만, 보다 구체적으로 1g/L 미만일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 수용성(친수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 친수성 치환기를 가져 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 친수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
수용성 물질은 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 전하를 띠는 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 그와 반대 전하로 대전되어 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 산성기 또는 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
구체적으로, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 중성의 pH에서 양전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 중성의 pH에서 음전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력이 증가되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H) 등의 산성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
또한, CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 중성의 pH에서 음전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 양전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질과의 결합력이 증가되어 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 아미노기, 그 외 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질은 필요한 치료 유형, 방출 환경, 사용되는 다공성 실리카 입자에 의존하여 예를 들면 7일 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 방출될 수 있다.
또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 생분해성으로서 100% 분해될 수 있으므로, 이에 담지된 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자 또는 물질은 100% 방출될 수 있다.
상기 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자는 상술한 바대로, 서열번호 1의 서열과의 상보성이 10 뉴클레오티드(nucleotide; nt) 이상, 11 뉴클레오티드 이상, 12 뉴클레오티드 이상, 13 뉴클레오티드 이상, 14 뉴클레오티드 이상, 15 뉴클레오티드 이상, 16 뉴클레오티드 이상, 17 뉴클레오티드 이상 또는 18 뉴클레오티드 전체일 수 있고, 관련된 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명은 상술한 CTGF 유전자의 전사체의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 핵산분자를 담지한 다공성 실리카 입자;를 포함하는 CTGF 유전자 발현 억제용 조성물;을 포함하는 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 핵산분자, 다공성 실리카 입자, CTGF 유전자 발현의 억제, 섬유증식성 질환, 약학적 조성물의 다양한 제형 등에 관한 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
이하, 본 발명에서 사용된 siRNA는 'siCTGF'로, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 'DegradaBALL 또는 DDV'로, siCTGF가 담지된 DegradaBALL은 'LEM-S401'로 각각 약칭될 수 있다.
실험방법
1. 실험재료
DegradaBALL과 TAMRA가 결합된 DegradaBALL은 Lemonex, Inc. (서울 한국)에서 제공받았고, 세포 계수 키트-8(Cell counting kit-8)은 Dojindo molecular technologies, Inc. (Maryland, USA)에서 구입했다. TGF-ß는 Peprotech (New Jersey, USA)에서 구입했고, 10% 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 둘베코 변형 이글스 배지 (DMEM), 태아 소 혈청 (FBS), 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640), 페니실린-스트렙토 마이신 및 0.05% 트립신-EDTA는 WelGene (대한민국)에서 구입했다. 모든 핵산분자는 Lemonex(서울, 대한민국)에 의해 합성되었고, 이의 서열 및 본 명세서 전반에 있어 사용된 핵산분자 서열은 하기 표 1에 제시하였다. 모든 PCR 프라이머는 Cosmogenetech (서울, 한국)에서 구입했다. 항-마우스 CTGF 항체는 Abcam (Cambridge, UK)으로부터 구입하였고 항-마우스 콜라겐 1, 3 항체는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. Trizol 세포 용해 용액은 Molecular Probes Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입했고, 모든 PCR 시약은 TaKaRa Bio Inc. (Shiga, Japan)에서 구입했다. 모든 화학 물질은 수령한 대로 사용하였다.
Target sequence 1:
5'-CTC ATT AGA CTG GAA CTT -3'
(Position in gene sequence: 1280)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 1
5'- CUCAUUAGACUGGAACUU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 2
5'- AAGUUCCAGUCUAAUGAG -3'
dsRNA: 서열번호 3
5'- CUCAUUAGACUGGAACUU UU UCU AAA G-3'
antisense PNA: 서열번호 87
5'-TTA GAC TGG AAC TTG A-3'
antisense PNA 서열번호 88
5'-CAT TAG ACT GGA ACT T-3'
Target sequence 2:
5'-G GAA CTT GAA CTG ATT CA-3'
(Position in gene sequence: 1291)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 4
5'-GGAACUUGAACUGAUUCA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 5
5'- UGAAUCAGUUCAAGUUCC -3'
dsRNA: 서열번호 6
5'- GGAACUUGAACUGAUUCA UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 3:
5'-CTG AGT GAC TCT ATA TAG CT-3'
(Position in gene sequence: 2185)		 siRNA GC content: 40.0%
siRNA Sense strand: 서열번호 7
5'- CUGAGUGACUCUAUAUAGCU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 8
5'- AGCUAUAUAGAGUCACUCAG -3'
dsRNA: 서열번호 9
5'- CUGAGUGACUCUAUAUAGCU UU UCU AAA G-3'
Target sequence 4:
5'-GCA TGA AGA CAT ACC GAG C-3'
(Position in gene sequence: 1030)		 siRNA GC content: 52.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 10
5'- GCAUGAAGACAUACCGAGC -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 11
5'- GCUCGGUAUGUCUUCAUGC -3'
dsRNA: 서열번호 12
5'- GCAUGAAGACAUACCGAGC UU UCU AAA G-3'
Target sequence 5:
5'-ATG TTT GCA CCT TTC TAG-3'
(Position in gene sequence: 2296)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 13
5'- AUGUUUGCACCUUUCUAG -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 14
5'- CUAGAAAGGUGCAAACAU -3'
dsRNA: 서열번호 15
5'- AUGUUUGCACCUUUCUAG UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 6:
5'-TG AGA GGA GAC AGC CAG T-3'
(Position in gene sequence: 26)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 16
5'- UGAGAGGAGACAGCCAGU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 17
5'- ACUGGCUGUCUCCUCUCA -3'
dsRNA: 서열번호 18
5'- UGAGAGGAGACAGCCAGU UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 7:
5'-TTC GGT GGT ACG GTG TAC -3'
(Position in gene sequence: 518)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 19
5'- UUCGGUGGUACGGUGUAC -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 20
5'- GUACACCGUACCACCGAA -3'
dsRNA: 서열번호 21
5'- UUCGGUGGUACGGUGUAC UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 8:
5'-TCC TTC CAG AGC AGC TGC AA-3'
(Position in gene sequence: 549)		 siRNA GC content: 55.0%
siRNA Sense strand: 서열번호 22
5'- UCCUUCCAGAGCAGCUGCAA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 23
5'- UUGCAGCUGCUCUGGAAGGA -3'
dsRNA: 서열번호 24
5'- UCCUUCCAGAGCAGCUGCAA UU UCU AAA G-3'
Target sequence 9:
5'-TG TGT GAC GAG CCC AAG GA-3'
(Position in gene sequence: 699)		 siRNA GC content: 57.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 25
5'- UGUGUGACGAGCCCAAGGA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 26
5'- UCCUUGGGCUCGUCACACA -3'
dsRNA: 서열번호 27
5'- UGUGUGACGAGCCCAAGGA UU UCU AAA G-3'
Target sequence 10:
5'-TGC CTG GTC CAG ACC ACA GA-3'
(Position in gene sequence: 801)		 siRNA GC content: 60.0%
siRNA Sense strand: 서열번호 28
5'- UGCCUGGUCCAGACCACAGA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 29
5'- UCUGUGGUCUGGACCAGGCA -3'
dsRNA: 서열번호 30
5'- UGCCUGGUCCAGACCACAGA UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 11:
5'-CAG GCT AGA GAA GCA GAG-3'
(Position in gene sequence: 890)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 31
5'- CAGGCUAGAGAAGCAGAG -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 32
5'- CUCUGCUUCUCUAGCCUG -3'
dsRNA: 서열번호 33
5'- CAGGCUAGAGAAGCAGAG UU UCU AAA G-3'
Target sequence 12:
5'-TGT GCA TGG TCA GGC CTT-3'
(Position in gene sequence: 913)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 34
5'- UGUGCAUGGUCAGGCCUU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 35
5'- AAGGCCUGACCAUGCACA -3'
dsRNA: 서열번호 36
5'- UGUGCAUGGUCAGGCCUU UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 13:
5'-TGA TTT CAG TAG CAC AAG-3'
(Position in gene sequence: 1330)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 37
5'- UGAUUUCAGUAGCACAAG -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 38
5'- CUUGUGCUACUGAAAUCA -3'
dsRNA: 서열번호 39
5'- UGAUUUCAGUAGCACAAG UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 14:
5'-TAG CGT GCT CAC TGA CCT-3'
(Position in gene sequence: 1623)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 40
5'- UAGCGUGCUCACUGACCU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 41
5'- AGGUCAGUGAGCACGCUA -3'
dsRNA: 서열번호 42
5'- UAGCGUGCUCACUGACCU UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 15:
5'-CTG ATT CGA ATG ACA CTG TT-3'
(Position in gene sequence: 1742)		 siRNA GC content: 40.0%
siRNA Sense strand: 서열번호 43
5'- CUGAUUCGAAUGACACUGUU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 44
5'- AACAGUGUCAUUCGAAUCAG -3'
dsRNA: 서열번호 45
5'- CUGAUUCGAAUGACACUGUU UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 16:
5'-CAG ATT GTT TGC AAA GGG-3'
(Position in gene sequence: 2081)		 siRNA GC content: 44.4%
siRNA Sense strand: 서열번호 46
5'- CAGAUUGUUUGCAAAGGG -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 47
5'- CCCUUUGCAAACAAUCUG -3'
dsRNA: 서열번호 48
5'- CAGAUUGUUUGCAAAGGG UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 17:
5'-GCA TCA GTG TCC TTG GCA-3'
(Position in gene sequence: 2102)		 siRNA GC content: 55.6%
siRNA Sense strand: 서열번호 49
5'- GCAUCAGUGUCCUUGGCA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 50
5'- UGCCAAGGACACUGAUGC -3'
dsRNA: 서열번호 51
5'- GCAUCAGUGUCCUUGGCA UU CCU UUC UAA AG-3'
Target sequence 18:
5'-GAC ATT AAC TCA TTA GAC -3'
(Position in gene sequence: 1272)		 siRNA GC content: 33.3%
siRNA Sense strand: 서열번호 52
5'-GACAUUAACUCAUUAGAC -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 53
5'-GUCUAAUGAGUUAAUGUC -3'
dsRNA: 서열번호 54
5'-GACAUUAACUCAUUAGAC UU UCU AAA G-3'
Target sequence 19:
5'-AAC TCA TTA GAC TGG AAC -3'
(Position in gene sequence: 1278)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 55
5'- AACUCAUUAGACUGGAAC -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 56
5'- GUUCCAGUCUAAUGA GUU -3'
dsRNA: 서열번호 57
5'- AACUCAUUAGACUGGAAC UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 89
5'-TCC AGT CTA ATG AGT T-3'
antisense PNA 서열번호 90
5'-TTC CAG TCT AAT GAG T-3'
Target sequence 20:
5'-ACT CAT TAG ACT GGA ACT -3'
(Position in gene sequence: 1279)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 58
5'- ACUCAUUAGACUGGAACU -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 59
5'- AGUUCCAGUCUAAUGAGU -3'
dsRNA: 서열번호 60
5'- ACUCAUUAGACUGGAACU UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 91
5'-AGT TCC AGT CTA ATG A-3'
Target sequence 21:
5'- TTA GAC TGG AAC TTG AAC -3'
(Position in gene sequence: 1284)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 61
5'- UUAGACUGGAACUUGAAC -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 62
5'-GUUCAAGUUCCAGUCUAA -3'
dsRNA: 서열번호 63
5'- UUAGACUGGAACUUGAAC UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 92
5'-TCA AGT TCC AGT CTA A-3'
antisense PNA 서열번호 93
5'-TTC AAG TTC CAG TCT A-3'
Target sequence 22:
5'- ATT AGA CTG GAA CTT GAA -3'
(Position in gene sequence: 1283)		 siRNA GC content: 33.3%
siRNA Sense strand: 서열번호 64
5'- AUUAGACUGGAACUUGAA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 65
5'-UUCAAGUUCCAGUCUAAU -3'
dsRNA: 서열번호 66
5'- AUUAGACUGGAACUUGAA UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 94
5'-CAA GTT CCA GTC TAA T-3'
antisense PNA 서열번호 95
5'-TTC AAG TTC CAG TCT A-3'
Target sequence 23:
5'- CAT TAG ACT GGA ACT TGA -3'
(Position in gene sequence: 1282)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 67
5'- CAUUAGACUGGAACUUGA -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 68
5'-UCAAGUUCCAGUCUAAUG -3'
dsRNA: 서열번호 69
5'- CAUUAGACUGGAACUUGA UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 96
5'-CAA GTT CCA GTC TAA T-3'
antisense PNA 서열번호 97
5'-TCA AGT TCC AGT CTA A-3'
Target sequence 24:
5'- TCA TTA GAC TGG AAC TTG -3'
(Position in gene sequence: 1281)		 siRNA GC content: 38.9%
siRNA Sense strand: 서열번호 70
5'- UCAUUAGACUGGAACUUG -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 71
5'-CAAGUUCCAGUCUAAUGA -3'
dsRNA: 서열번호 72
5'- UCAUUAGACUGGAACUUG UU UCU AAA G-3'
antisense PNA 서열번호 98
5'-AGT TCC AGT CTA ATG A-3'
antisense PNA 서열번호 99
5'-CAA GTT CCA GTC TAA T-3'
Mouse CTGF siRNA siRNA Sense strand: 서열번호 73
5'- gcaccagugu gaagacaua -3'
siRNA Antisense strand: 서열번호 74
5'- uaugucuuca cacuggugc -3'
Human ß-actin Primer Forward: 서열번호 75
5' gctcgtcgac aagggctc -3'
Reverse: 서열번호 76
5'- caaacatgat ctgggtca -3'
Human CTGF Primer Forward: 서열번호 77
5'- caagggcctc ttctgtgact -3'
Reverse: 서열번호 78
5'- ccgtcggtac atactccaca -3'
Mouse ß-actin Primer Forward: 서열번호 79
5'- gcctcccttc ttgggtatgg aa -3'
Reverse: 서열번호 80
5'- cagctcagta acagtccgcc -3'
Mouse CTGF Primer Forward: 서열번호 81
5'- gggcctcttc tgcgatttc -3'
Reverse: 서열번호 82
5'- atccaggcaa gtgcattggt a -3'
Mouse Collagen 1 Primer Forward: 서열번호 83
5'- gagcggagag tactggatcg -3'
Reverse: 서열번호 84
5'- gttcgggctg atgtaccagt -3'
Mouse Collagen 3 Primer Forward: 서열번호 85
5'- agctttgtgc aaagtggaac ctgg -3'
Reverse: 서열번호 86
5'- caaggtggct gcatcccaat tcat -3'
2. 동물모델
모든 동물 실험은 서울대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)를 준수하여 수행하였고, C57BL/6 수컷 쥐(5주)는 ORIENT BIO(성남시, 한국)에서 구입하였다.
3. 세포 생존 측정
A549 및 HaCaT 세포를 100 μl의 성장배지(50-70 % 컨플루언시)를 갖는 96-웰 배양 플레이트에 웰당 10,000 세포의 밀도로 접종하였다. 세포를 혈청 함유 배지에서 적절한 농도의 DegradaBALL로 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 1 x PBS로 2회 세정한 후, 10 μl의 CCK-8을 함유한 100 μl의 무혈청 배지를 첨가한 다음, 1시간 더 배양하였다. 배양 플레이트 내 각 웰의 광학 밀도를 450 nm 파장에서 측정하였다. 삼중항(deviation of triplicates)의 평균 및 표준편차가 계산되고 플롯되었다.
4. 세포 기반 CTGF knockdown 분석
In vitro에서 LEM-S401의 CTGF 유전자 사일런싱 효율을 입증하기 위해, 무혈청 배지의 LEM-S401(12.5, 25, 50 및 100 nM) 500 μl를, 웰 당 25,000 세포의 컨플루언시로 접종한 플레이트 내 A549 및 HaCaT 세포에 처리하였다. 37℃의 가습된 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양한 후, 무혈청 배양액을 제거하고 1 x PBS로 2회 세정한 후, 혈청 함유 세포 배지를 교체하였다. 다시 6시간 후, 혈청 함유 배양 배지를 제거하고, 1 x PBS로 세척하였다. 혈청을 함유한 배지에서 TGF-ß(2 ng/mL) 500 μl를 세포로 처리하였고, CTGF 유도를 위해 배양 12시간 후, Trizol을 사용하여 총 RNA를 추출하였다.
LEM-S401에 의한 CTGF knockdown의 지속 기간을 측정하기 위해, A549 및 HaCaT 세포를 무혈청 배지에서 LNP를 함유한 LEM-S401 (50 nM siCTGF) 및 siCTGF (50 nM) 500 μl로 처리하였다. 가습된 5% CO2 배양기에서, 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, 무혈청 배양액을 제거하고, 1 x PBS로 2회 세척한 후, 혈청 함유 세포 배지를 교체하였다. 지시된 시간 동안 배양한 후, 세포를 혈청 함유 배양 배지에서 TGF-ß(2 ng/mL) 500 μl로 처리하고, CTGF 유도를 위해 세포를 24시간 더 배양하였다. 총 RNA는 Trizol을 사용하여 추출하였다.
5. RT-PCR
모든 in vitro 및 in vivo에서 추출한 RNA는 다음 반응 조건을 사용하여 열 순환 반응에 사용되었다. cDNA 합성: 65℃에서 5분, 42℃에서 2분, 42℃에서 50분, 70℃에서 15분 동안 불활성화 1사이클, 증폭 과정: 95℃에서 30 초, 55℃에서 60초, 72 ℃에서 30초 30사이클.
6. siCTGF 및 다공성 실리카 입자의 In vivo 이미징
LEM-S401 (33 mM)(FITC-접합 siCTGF 및 TAMRA-결합 DegradaBALL) 30 μl를 7개의 다른 부위에서 마우스 피부에 주사하였다. 희생시킨 후, FOBI 생체 내 이미징 기기(NeoScience Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 절제된 마우스 피부의 형광 이미지를 촬영하였다. 수득한 피부 샘플을 4% PFA 용액에 넣었다. 샘플을 파라핀에 끼우고, 10 μm 두께로 절단하였다. 탈수과정 후, 절편된 샘플을 DAPI로 염색하였다. 샘플은 20x 대물렌즈(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 BX71 현미경을 관찰되었다.
7. 마우스 피부 상처 모델을 이용한 In vivo 실험
마우스 피부에 생검 펀치(4 mm)를 이용하여 상처를 내도록 구멍을 뚫었다. 시간이 지남에 따라, 상처를 명확하게 관찰하기 위해 검은 실크 실을 사용하여 실리콘 부목(바깥 쪽 15 mm, 안쪽 8 mm)을 상처 주위에 봉합했다. 1 x PBS에서 LEM-S401(3 mM) 30 μL를 4일 마다(4일, 8일, 12일), 상처 주변의 4개의 상이한 부위에 피하 주입하였다. 상처는 Tegaderm과 붕대를 2일에 한번씩 바꾸면서 관리했고, 16일 후, 마우스를 희생시켰다.
LEM-S401가 조직 리모델링 과정에서 CTGF 발현을 억제할 수 있음을 입증하기 위해, 마우스 피부에 구멍을 뚫어, 생검 펀치(4 mm)를 사용하여 상처를 내고 밴드를 감쌌다. 상처가 완전히 닫힌 후, 1 x PBS에서 LEM-S401(33 mM) 30 μl를 4일마다 4개의 다른 부위(10일, 14일, 18일, 22일)에 상처 부위에 피하 주입하였고, 마우스를 26일 째에 희생시켰다.
8. 면역조직화학
마우스 피부 샘플을 24시간 동안 4℃에서 4% PFA 용액에서 배양하였다. 그 다음, 샘플을 파라핀에 끼우고 10 μm 두께로 절편을 만들었다. 절편화된 샘플을 탈수시키고, 투과 용액(1 x PBS 중 0.2% tween 20)에서 각각 10분씩 2회 배양하였다. 그 다음, 샘플을 가습된 대기 하 블로킹 용액(5% 정상 염소 혈청, 1 x PBS 중 0.2% tween 20)에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 실온에서 3시간 동안, 가습 챔버에서 2% 정상 염소 혈청 및 PBS 중 항체의 1: 100 희석액을 갖는 0.2% tween 20을 함유하는 1차 항체 용액과 함께 인큐베이션시켰다. 샘플을 투과용액에서 각각 10분 동안 3회 헹구고, 실온에서 2시간 동안 1 x PBS에서, 2% 정상 염소 혈청 및 0.2% tween 20을 함유하는 2차 항체 희석 용액과 함께 배양하였다. 샘플을 투과 용액으로 세척하고, DAPI로 염색하였다. 샘플은 20x 대물렌즈(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 BX71 현미경으로 관찰되었다.
9. 다공성 실리카 입자(DDV 또는 DegradaBALL)
9-1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 다공성 실리카 입자의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 1.5g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10ml에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10ml, TMB (trimethyl benzene) 10ml를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160℃, 48시간 반응시켰다.
반응은 25℃에서 시작하여 10℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1~10℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 하소
상기 2)에서 제조된 다공성 실리카 입자를 유리 vial에 담아 550℃에서 5시간 동안 가열하고, 반응 종료 후 상온으로 서서히 식혀 입자를 제조하였다.
(2) 다공성 실리카 입자의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140℃, 72시간으로 변경한 것을 제외하고는 상기 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 다공성 실리카 입자의 제조 (10L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 300nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920ml, 메탄올 850ml를 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 500nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800ml, 메탄올 1010 ml, CTAB 10.6g을 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 1000nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620ml, 메탄올 1380ml, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 4nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5mL를 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 7nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5mL를 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
*
(9) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 17nm)
기공 확장시에 TMB를 11mL를 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5mL를 사용한 것을 제외하고는 9-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
*
(11) 다공성 실리카 입자의 제조 (이중개질)
1) 소기공 입자의 제조
실시예 9-1-(1)-1)과 동일한 방법으로 소기공 입자를 제조하였다.
2) 기공 확장
실시예 9-1-(1)-2)와 동일한 방법으로 소기공 입자를 TMB와 반응시키고 냉각시키고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 실시예 9-1-(1)-2)와 동일 조건으로 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 3회 세척하고, 이후 실시예 9-1-(1)-2)와 동일 조건으로 건조하여 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 표면 개질
기공이 확장된 다공성 실리카 입자 0.8g 내지 1g을 50mL의 톨루엔에 분산시킨 후, (3-aminopropyl)triethoxysilane를 5mL 넣어주어 120℃로 환류한 채로 12시간 가열하였다. 해당 과정은 상기 서술된 세척과정 및 건조 과정을 거친 뒤 1mL의 트레에틸렌글리콜 (PEG3, 2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]acetic acid)와 100mg의 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 200mg의 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 30mL의 PBS에 분산시켜서 상온에서 교반한 채로 12시간 동안 반응을 보낸다. 이후 생성물은 상기의 세척 및 건조과정을 거친다.
기공 내부에 이전 단계의 반응액이 남아 있어, 기공 내부는 개질 되지 않는다.
4) 기공 내부 세척
표면개질된 입자 분말 800mg을 2M HCl/에탄올 40ml에 녹이고, 12시간 강하게 교반 하에 환류시켰다.
이후 냉각된 반응액을 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
5) 기공 내부 개질
① 후술하는 실시예 9-2-(2)-1)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 프로필기를 도입하였다.
② 후술하는 실시예 9-2-(2)-2)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 옥틸기를 도입하였다.
9-2. 다공성 실리카 입자의 표면 개질
(1) 양전하로의 대전
1) 입경 300nm의 입자
실시예 9-1-(4)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 톨루엔에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 1 mL의 APTES를 첨가하고 400 rpm으로 교반하며 130℃에서 교반하며 12시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
2) 입경 200nm의 입자
*① 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, APTES를 0.4ml 첨가하고, 반응 시간을 3시간으로 한 것을 제외하고는 상기 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 9-1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 9-1-(10)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 상기 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
(2) 소수성기의 도입
1) 프로필기
상기 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy(propyl)silane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy(propyl)silane를 0.35ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 9-2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
2) 옥틸기
상기 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy-n-octylsilane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy-n-octylsilane를 0.5ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 9-2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
(3) 음전하로의 대전
1) 카르복실기
상기 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자를 succinic anhydride와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며,
톨루엔 대신에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하고, APTES 대신에 80 mg의 succinic anhydride를 첨가하여 24시간 동안 상온에서 교반하며 반응시키고, 세척 시에 증류수 대신에 DMSO를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
2) 티올기
APTES 대신에 MPTES 1.1 mL를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 술폰산기
상기 실시예 9-2-(3)-2)의 다공성 실리카 나노입자 100 mg를 1 M 황산수용액을 1 mL와 30% 과산화수소수 20 mL에 분산하여 상온에서 교반하여 산화반응을 유도하여 티올기를 술폰산기로 산화시켰다. 이후 상기 실시예 9-2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
9-3. 핵산분자의 담지
실시예 9-2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 10 ㎍와 50 pmol의 핵산분자를 1xPBS 조건에서 섞은 후, 상온에서 30분간 두고 적재가 되도록 하였다.
실험결과
1. 본 발명 핵산분자의 CTGF 발현 억제 분석
상기 실시예에 따라, 제조된 핵산분자(PNA, siRNA 또는 dsRNA; 상기 표 1 참조)의 CTGF의 발현 억제율을 하기 표 2, 3에 나타내었다.
하기 표 1, 2를 참조하면, 서열번호 1의 서열과 상보성이 10 뉴클레오티드 이상 상보성을 갖는 가닥을 포함하는 핵산분자(서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 52의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 53의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 54의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 55의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 56의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 57의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 58의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 59의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 60의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 61의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 62의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 63의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 64의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 65의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 66의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 67의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 68의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 69의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 70의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 71의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 72의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 87 내지 99의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 이루어진 antisense PNA)의 경우, 90%를 상회하는 억제율을 보이는 반면, 이를 만족하지 못하는 타 핵산분자의 경우, 75% 미만의 낮은 억제율을 보임을 확인할 수 있다.
특히, 7 뉴클레오티드만의 상보성을 갖는 가닥을 포함하는 핵산분자(서열번호 4의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 5의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA; 서열번호 6의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA)의 경우, 60% 내외의 현저히 낮은 발현 억제율을 보이는 것으로 보아, 서열번호 1의 서열과의 상보성이 10 뉴클레오티드 이상임에 기술적 의의가 존재하는 것으로 판단된다.
이들 중, 발현 억제율이 가장 높고, 서열번호 1의 서열과 18 뉴클레오티드 전체로 상보적인 가닥을 포함하는, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA; 또는 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA를 선택하여 다음 실험을 진행하였다.
염기서열 번호
(/는 sense strand와 antisense strand 간 pair를 의미)		 발현 억제율 (%) 염기서열 번호 발현 억제율 (%)
1/2 또는 3 93.7 37/38 또는 39 74.6
4/5 또는 6 62.4 40/41 또는 42 71.8
7/8 또는 9 67.2 43/44 또는 45 63.5
10/11 또는 12 72.6 46/47 또는 48 74.2
13/14 또는 15 74.1 49/50 또는 51 71.6
16/17 또는 18 61.3 52/53 또는 54 90.3
19/20 또는 21 74.7 55/56 또는 57 90.1
22/23 또는 24 72.3 58/59 또는 60 91.9
25/26 또는 27 67.8 61/62 또는 63 92.2
28/29 또는 30 63.5 64/65 또는 66 91.5
31/32 또는 33 71.6 67/68 또는 69 92.8
34/35 또는 36 72.9 70/71 또는 72 91.6
PNA 염기서열 번호 발현 억제율 (%) PNA 염기서열 번호 발현 억제율 (%)
87 90.3 94 92.1
88 90.1 95 90.5
89 91.2 96 91.7
90 90.7 97 90.4
91 91.5 98 90.2
92 90.2 99 91.4
93 91.3
2. 다공성 실리카 입자(DDV 또는 DegradaBALL)
2-1. 입자의 형성 및 기공의 확장 확인
실험방법 실시예 9-1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 28 내지 31).
도 28은 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 29는 9-1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고,
도 30은 9-1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 31은 9-1-(1)과 9-1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
2-2. BET 표면적 및 기공의 부피 계산
실험방법 실시예 9-1-(1)의 소기공 입자, 실시예 9-1-(1),(7),(8),(10)의 다공성 실리카 입자의 표면적과 기공 부피를 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 크기의 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 32에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
구분 기공 직경(nm) BET 표면적(m2/g) 기공 부피
(mL/g)
실시예 9-1-(1)의 소기공 입자 2.1 1337 0.69
실시예 9-1-(7) 4.3 630 0.72
실시예 9-1-(8) 6.9 521 0.79
실시예 9-1-(1) 10.4 486 0.82
실시예 9-1-(10) 23 395 0.97
2-3. 생분해성 확인
실험방법 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인을 위해 37℃, SBF(pH 7.4)에서의 생분해 정도를 0시간, 120시간, 360시간에 현미경으로 관찰하였고, 이는 도 33에 나타내었다.
이를 참조하면 다공성 실리카 입자가 생분해되어 360시간 경과 후에는 거의 다 분해된 것을 확인할 수 있다.
2-4. 흡광도비 측정
시간별 하기 수학식 1에 따른 흡광도비를 측정하였다.
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50 kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
구체적으로, 다공성 실리카 입자 분말 5mg을 SBF (pH 7.4) 5ml에 녹였다. 이후 5ml의 다공성 실리카 입자 용액을 도 34에 도시된 직경 50 kDa의 기공을 갖는 투과막에 넣었다. 외부막에 15ml의 SBF를 첨가하고, 외부막의 SBF는 12시간마다 교체하였다. 다공성 실리카 입자의 분해는 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
이후 UV-vis spectroscopy에 의해 흡광도를 측정하였고, λ = 640 nm에서 분석되었다.
(1) 흡광도 비 측정
실험방법 실시예 9-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도비를 상기 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 35에 나타내었다.
이를 참조하면 흡광도비가 1/2가 되는 t가 약 58시간으로 굉장히 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
(2) 입경별
실험방법 실시예 9-1-(1),(5),(6)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 36에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 입경의 증가에 따라 t가 감소함을 알 수 있다.
(3) 기공 평균 직경별
실험방법 실시예 9-1-(1),(9)의 다공성 실리카 입자, 그리고 컨트롤로서 실험방법 실시예 9-1-(1)의 소기공 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 37에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 실시예의 다공성 실리카 입자는 컨트롤에 비해 t가 상당히 큰 것을 확인할 수 있다.
(4) pH별
실험방법 실시예 9-1-(4)의 다공성 실리카 입자의 pH별 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 SBF에서, 그리고 pH 2, 5, 및 7.4의 Tris에서 측정하였고, 그 결과는 도 38에 나타내었다.
이를 참조하면, pH 별 t의 차이는 있으나, 모두 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상이었다.
(5) 대전
실험방법 실시예 9-2-(1)-1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 39에 나타내었다(현탁액과 용매로는 Tris(pH 7.4)를 사용).
이를 참조하면, 양전하로 대전된 입자도 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상이었다.
2-5. 담지한 핵산분자의 방출
Cy5-siRNA를 로딩한 다공성 실리카 입자 10 ㎕를 SBF(pH 7.4, 37℃)에 재부유시키고, 기공 직경 20 kDa의 투과막(도 40의 튜브)에 넣었다.
이후, 투과 튜브를 1.5ml의 SBF에 담갔다.
siRNA의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
24시간 이전에는 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간 경과한 시간에 방출 용매를 회수하고, 그 이후는 24시간 간격으로, 0.5ml의 방출 용매를 형광 측정을 위해 회수하고 등량의 SBF를 첨가하였다.
Cy5-siRNA의 형광 강도는 670 nm 파장(λex = 647 nm)에서 측정하여 siRNA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 41에 나타내었다.
이를 참조하면 siRNA가 50% 방출된 시간이 약 48시간인 것을 확인할 수 있다.
3. in vitro 상 LEM-S401의 CTGF mRNA knockdown의 효과적 유도 확인
LEM-S401의 타겟 유전자 knockdown 효율을 측정하기 위해, A549(인간 폐암 비소 세포) 세포와 HaCaT(인간 케라티노사이트 세포) 세포를 siCTGF를 담지한 DegradaBALL(LEM-S401)로 처리하였다. 두 세포주 모두 기능적으로 활성인 CTGF 전사 경로를 가지고 있기 때문에, A549 및 HaCaT 세포가 섬유증 연구에서 in vitro 모델 세포로 널리 사용된다. 먼저, A549 세포를 다양한 농도의 LEM-S401(12.5, 25, 50 및 100 nM)로 처리한 다음, CTGF 발현을 유도하기 위해 2 ng/mL의 TGF-ß와 함께 배양하였다(도 1). 이전의 연구에서 TGF-ß가 in vitro에서 CTGF 발현을 유도한다는 것을 보여준 바 있고, TGF-ß를 A549 및 HaCaT 세포에 처리함으로써 CTGF 발현 수준이 현저히 증가함을 확인하였다(도 17). 세포주들에 대한 LEM-S401의 처리는 농도 의존적으로 CTGF의 mRNA 발현 수준을 감소시켰다. 한편, 대조군(siCTGF only, scrambled siRNA 및 vehicle(DegradaBALL) only)은 A549 및 HaCaT 세포 모두에서 CTGF의 mRNA 수준에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 2, 3). 이 결과는, LEM-S401가 세포 내로 siCTGF를 효율적으로 transfection 시켰고, CTGF 유전자의 knockdown을 유도함을 나타내는 것이다.
4. in vitro 상 LEM-S401의 서방적 siCTGF 방출
본 실험에서, LEM-S401는 A549 및 HaCaT 세포에서 LNP보다 CTGF knockdown 효과를 더 오래 유지했다. A549 및 HaCaT 세포를 LEM-S401(50 nM) 및 LNP(50 nM)에 담지된 siCTGF로 처리한 후, TGF-ß 처리에 의해 CTGF 발현을 유도했다. A549 세포에서 CTGF의 하향 조절은 LEM-S401 처리 후 96시간까지 지속되었다(CTGF 발현수준, 72시간: 26.3%, 96시간: 26.9%). 그러나, LNP에 담지된 siCTGF의 knockdown 효율은 72시간, 96시간 모두에서 높지 않았다(CTGF 발현수준, 72시간: 46.4%, 96시간: 58.6%). 또한, HaCaT 세포에서 LEM-S401의 knockdown 효율(CTGF 발현수준, 72시간: 34.3%, 96시간: 35.8%)은 LNP에 담지된 siCTGF(CTGF 발현수준, 72시간: 62.5%, 96시간: 78.8%) 대비 지속적이고, 월등했다(도 4, 5). 이를 종합하면, LEM-S401는 세포에서 LNP에 담지된 siCTGF 대비, 더 오랜 기간동안 타겟 mRNA 발현수준을 억제함을 알 수 있다.
5. 마우스 피부 상처 모델에서, LEM-S401의 CTGF 발현 및 비대흉터 형성 억제능 확인
다음으로, LEM-S401가 생체 내에서 CTGF 발현을 하향 조절할 수 있는지를 결정하기 위한 실험을 수행했다. 생체 내에서 유전자 knockdown 효능을 측정하기 전에, C57BL/6 마우스에 TAMRA-접합된 DegradaBALL에 담지된 FITC-접합된 siCTGF로 구성된 형광 라벨 LEM-S401를 주입하고, 담지되지 않은(자유) FITC-접합된 siCTGF만을 피하주입 경로를 통해 주입하여 LEM-S401와 자유 siCTGF의 주입 부위에서의 지속 시간을 비교하고자 하였다. 그리하여, 절제된 마우스 피부와 절편화된 피부의 형광 이미지 분석은 주입 후 1,3,5일째에 수행되었다. FITC-siCTGF를 담지한 TAMRA-DegradaBALL의 형광은 1일째에 주입 부위에서 강한 발광을 나타내었다. 그리고, 형광은 시간의 경과에 따라 천천히 감소하였으나, 주입 후 5일째까지 주입 부위에서의 형광은 유지되었다(도 6). 이러한 시간에 경과에 따라 주입부위에서의 형광이 감소하는 경향은 피부 절편 슬라이드의 경향에 따랐다(도 6). 반면, 담지되지 않은 자유 FITC-siCTGF 만을 주입한 쥐로부터 절제된 피부나 절편화된 피부 슬라이드에서의 형광 신호는 관찰되지 않았는데, 이는 자유 siCTGF가 체내에서 빠르게 분산되어 버리거나, 매우 빠른 확산을 유도하는 작은 조각으로 분해됨을 암시한다(도 7). 상기 데이터는 자유 siCTGF 대비, LEM-S401가 피부 내에서 현저히 높은 농도 수준의 siCTGF을, 적어도 주입 후 3일째까지 유지할 수 있음을 보여준다.
다음으로, LEM-S401가 CTGF 유전자 knockdown을 유도할 수 있고, 콜라겐 과량 생산을 감소시킴을 쥐 피부 상처 모델에서 증명하였다. 쥐의 등 피부에 생검 펀치로 상처 구멍을 만든 후(0일), 관리와 관찰을 위해 실리콘 부목을 상처 주위에 봉합하였다. LEM-S401는 상처 주위에 0,4,8,12일 째 피하주입하였다. 쥐는 16일째에 희생되었고, 피부에서의 CTGF의 발현 수준은 RT-PCR로 분석되었다. CTGF의 발현수준은 LEM-S401 처리 그룹에서 현저히 감소한 반면, siCTGF 또는 DegradaBALL 만을 처리한 그룹에서는 미처리군 대비 변화가 관찰되지 않았다. 게다가, 콜라겐 유형 1,3 발현 수준 역시 LEM-S401 처리 그룹에서 현저히 하향조절되었다(도 8 내지 10). CTGF에 의해 유도되는 것으로 알려진 콜라겐 유형 1,3은 비대흉터 및 켈로이드의 주된 구성요소이다. 그리하여, LEM-S401에 의해 발현이 억제된 CTGF가 콜라겐 유형 1,3의 발현 수준에 영향을 미쳤음을 확신할 수 있다.
상처 부위 결합조직의 과도성장에 의해 야기된, 고르지 않고, 울퉁불퉁하며, 불규칙적인 피부 표면은 비대흉터와 켈로이드의 주요 특징이다. 10일째 상처입은 피부 사진은 대조군에서 불규칙한 특징을 보였으나, LEM-S401 처리군에서의 피부사진은 규칙적이고 부드럽게 나타났다(도 11). 이것은 LEM-S401가 통제할 수 없는 불균일한 피부 형성을 억제하고, 이에 비대흉터 형성을 방지한다는 것을 증명하는 것이다. 면역조직화학 분석은 또한 대조군보다 LEM-S401 처리군에서 CTGF 및 콜라겐 유형 1,3의 발현이 유의적으로 낮음을 보여주었다(도 12 내지 15). 피부 상처의 회복과정에서, 조직 리모델링 과정은 표피가 회복된 후 진피에서 일어난다. 이 과정에서, 콜라겐 섬유의 발현이 증가하는데, 콜라겐 형성이 통제 불가능한 경우, 비대흉터나 켈로이드를 유발할 수 있다. 이에, 조직 리모델링 과정에서 LEM-S401가 CTGF와 콜라겐의 발현을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 표피가 회복된 후, LEM-S401를 주입하였다. 구체적으로, 생검 펀치를 사용하여 마우스 피부 구멍을 뚫었고(0일), 표피가 완전히 회복된 후, 10,14,18,22일에 LEM-S401를 상처 부위에 주입하였다. 통상적으로, 마우스 상처 모델에서, 상처 형성 후 표피를 완전히 회복시키는 데에 10일이면 충분했다. 26일째에 마우스를 희생시킨 후, CTGF 및 콜라겐 유형 1,3의 발현 수준을 RT-PCR로 분석하였다. LEM-S401 처리군의 CTGF와 콜라겐의 발현 수준은 대조군 대비 유의하게 낮았다(도 18 내지 20). 면역조직화학 분석은 CTGF와 콜라겐 유형 1,3 단백질 발현 수준이 LEM-S401 처리군에서 현저히 감소함을 보여주었다(도 21 내지 24).
<110> LEMONEX INC. <120> Composition for inhibiting CTGF expression <130> 19P03005 <150> US 62/712317 <151> 2018-07-31 <160> 113 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 1 cucauuagac uggaacuu 18 <210> 2 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target 1: siRNA antisense strand <400> 2 aaguuccagu cuaaugag 18 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target 1: dsRNA <400> 3 cucauuagac uggaacuuuu ucuaaag 27 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target 2: siRNA sense strand <400> 4 ggaacuugaa cugauuca 18 <210> 5 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target 2: siRNA antisense strand <400> 5 ugaaucaguu caaguucc 18 <210> 6 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target 2: dsRNA <400> 6 ggaacuugaa cugauucauu ccuuucuaaa g 31 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 7 cugagugacu cuauauagcu 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 8 agcuauauag agucacucag 20 <210> 9 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 9 cugagugacu cuauauagcu uuucuaaag 29 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 10 gcaugaagac auaccgagc 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 11 gcucgguaug ucuucaugc 19 <210> 12 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 12 gcaugaagac auaccgagcu uucuaaag 28 <210> 13 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 13 auguuugcac cuuucuag 18 <210> 14 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 14 cuagaaaggu gcaaacau 18 <210> 15 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 15 auguuugcac cuuucuaguu ccuuucuaaa g 31 <210> 16 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 16 ugagaggaga cagccagu 18 <210> 17 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 17 acuggcuguc uccucuca 18 <210> 18 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 18 ugagaggaga cagccaguuu ccuuucuaaa g 31 <210> 19 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 19 uucgguggua cgguguac 18 <210> 20 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 20 guacaccgua ccaccgaa 18 <210> 21 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 21 uucgguggua cgguguacuu ccuuucuaaa g 31 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 22 uccuuccaga gcagcugcaa 20 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 23 uugcagcugc ucuggaagga 20 <210> 24 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 24 uccuuccaga gcagcugcaa uuucuaaag 29 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 25 ugugugacga gcccaagga 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 26 uccuugggcu cgucacaca 19 <210> 27 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 27 ugugugacga gcccaaggau uucuaaag 28 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 28 ugccuggucc agaccacaga 20 <210> 29 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 29 ucuguggucu ggaccaggca 20 <210> 30 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 30 ugccuggucc agaccacaga uuccuuucua aag 33 <210> 31 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 31 caggcuagag aagcagag 18 <210> 32 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 32 cucugcuucu cuagccug 18 <210> 33 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 33 caggcuagag aagcagaguu ucuaaag 27 <210> 34 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 34 ugugcauggu caggccuu 18 <210> 35 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 35 aaggccugac caugcaca 18 <210> 36 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 36 ugugcauggu caggccuuuu ccuuucuaaa g 31 <210> 37 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 37 ugauuucagu agcacaag 18 <210> 38 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 38 cuugugcuac ugaaauca 18 <210> 39 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 39 ugauuucagu agcacaaguu ccuuucuaaa g 31 <210> 40 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 40 uagcgugcuc acugaccu 18 <210> 41 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 41 aggucaguga gcacgcua 18 <210> 42 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 42 uagcgugcuc acugaccuuu ccuuucuaaa g 31 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 43 cugauucgaa ugacacuguu 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 44 aacaguguca uucgaaucag 20 <210> 45 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 45 cugauucgaa ugacacuguu uuccuuucua aag 33 <210> 46 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 46 cagauuguuu gcaaaggg 18 <210> 47 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 47 cccuuugcaa acaaucug 18 <210> 48 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 48 cagauuguuu gcaaaggguu ccuuucuaaa g 31 <210> 49 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 49 gcaucagugu ccuuggca 18 <210> 50 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 50 ugccaaggac acugaugc 18 <210> 51 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 51 gcaucagugu ccuuggcauu ccuuucuaaa g 31 <210> 52 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 52 gacauuaacu cauuagac 18 <210> 53 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 53 gucuaaugag uuaauguc 18 <210> 54 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 54 gacauuaacu cauuagacuu ucuaaag 27 <210> 55 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 55 aacucauuag acuggaac 18 <210> 56 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 56 guuccagucu aaugaguu 18 <210> 57 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 57 aacucauuag acuggaacuu ucuaaag 27 <210> 58 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 58 acucauuaga cuggaacu 18 <210> 59 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 59 aguuccaguc uaaugagu 18 <210> 60 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 60 acucauuaga cuggaacuuu ucuaaag 27 <210> 61 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 61 uuagacugga acuugaac 18 <210> 62 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 62 guucaaguuc cagucuaa 18 <210> 63 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 63 uuagacugga acuugaacuu ucuaaag 27 <210> 64 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 64 auuagacugg aacuugaa 18 <210> 65 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 65 uucaaguucc agucuaau 18 <210> 66 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 66 auuagacugg aacuugaauu ucuaaag 27 <210> 67 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 67 cauuagacug gaacuuga 18 <210> 68 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 68 ucaaguucca gucuaaug 18 <210> 69 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 69 cauuagacug gaacuugauu ucuaaag 27 <210> 70 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 70 ucauuagacu ggaacuug 18 <210> 71 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 71 caaguuccag ucuaauga 18 <210> 72 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA <400> 72 ucauuagacu ggaacuuguu ucuaaag 27 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 73 gcaccagugu gaagacaua 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense strand <400> 74 uaugucuuca cacuggugc 19 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 75 gctcgtcgac aagggctc 18 <210> 76 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 76 caaacatgat ctgggtca 18 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 77 caagggcctc ttctgtgact 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 78 ccgtcggtac atactccaca 20 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 79 gcctcccttc ttgggtatgg aa 22 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 80 cagctcagta acagtccgcc 20 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 81 gggcctcttc tgcgatttc 19 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 82 atccaggcaa gtgcattggt a 21 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 83 gagcggagag tactggatcg 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 84 gttcgggctg atgtaccagt 20 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer forward strand <400> 85 agctttgtgc aaagtggaac ctgg 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer reverse strand <400> 86 caaggtggct gcatcccaat tcat 24 <210> 87 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 87 ttagactgga acttga 16 <210> 88 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 88 cattagactg gaactt 16 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 89 tccagtctaa tgagtt 16 <210> 90 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 90 ttccagtcta atgagt 16 <210> 91 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 91 agttccagtc taatga 16 <210> 92 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 92 tcaagttcca gtctaa 16 <210> 93 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 93 ttcaagttcc agtcta 16 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 94 caagttccag tctaat 16 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 95 ttcaagttcc agtcta 16 <210> 96 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 96 caagttccag tctaat 16 <210> 97 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 97 tcaagttcca gtctaa 16 <210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 98 agttccagtc taatga 16 <210> 99 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA antisense strand <400> 99 caagttccag tctaat 16 <210> 100 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA palindrome sequence <400> 100 aacuugaacu 10 <210> 101 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 101 Lys 1 <210> 102 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 102 Lys Lys 1 <210> 103 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 103 Lys Lys Lys 1 <210> 104 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 104 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 105 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 105 Arg 1 <210> 106 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 106 Arg Arg 1 <210> 107 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 107 Arg Arg Arg 1 <210> 108 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 108 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 109 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 109 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Cys 20 25 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 110 Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg 1 5 10 15 <210> 111 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 111 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 112 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate binding to PNA end <400> 113 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 52의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 53의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 54의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 55의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 56의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 57의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 58의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 59의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 60의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 61의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 62의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 63의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 64의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 65의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 66의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 67의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 68의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 69의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA, 서열번호 70의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 71의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 72의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA 및 서열번호 87 내지 99의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 이루어진 PNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 핵산 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 또는 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA를 포함하는 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 각 센스 RNA 및 안티센스 RNA 서열의 3' 말단에 UU 또는 dTdT의 서열을 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 PNA의 적어도 하나의 말단에 서열번호 101 내지 113으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열로 이루어진 펩티드; 또는 mPEG5000이 더 결합된 것인 핵산 분자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 섬유증식성 질환은 비대흉터, 켈로이드, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 복막후 섬유증, 피부경화증, 전신경화증, 방사-유도 섬유증, 심근 섬유증, 담도섬유화, 신장경화증, 망막하섬유화증, 당뇨병성 망막증, 듀켄씨근이영양증, 당뇨병성 신장질환, 만성 신부전증, 지방간염, 증식유리체망막병증, 근골격계 종양, 골육종, 횡문근육종, 대장암, 췌장암, 사르코이드증, 황반변성, 유리체망막병증, 각막염, 익상편, 검열반, 자궁근종, 사구체 신염, 사람 면역 결핍 바이러스성 신질환, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 류마티스 관절염, 다발근염 및 혈관협착증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 핵산 분자는 다공성 실리카 입자의 표면 또는 기공 내부에 담지된 것이고,
    상기 다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경이 5nm 내지 100nm이고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 24 이상인 것인, 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [수학식 1]
    At/A0
    (식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
    상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
    상기 현탁액의 pH는 7.4이고,
    At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 외부 표면 또는 기공 내부가 중성의 pH에서 양전하 또는 무전하를 띠는 것인 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 친수성 또는 소수성 작용기를 갖는 것인 섬유증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA; 또는 서열번호 3의 서열로 이루어진 가닥 및 이에 상보적인 가닥으로 이루어진 dsRNA;인 조성물.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 핵산 분자의 각 센스 RNA 및 안티센스 RNA 서열은 그 3' 말단에 UU 또는 dTdT의 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 핵산 분자의 PNA의 적어도 하나의 말단에 서열번호 101 내지 113으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열로 이루어진 펩티드; 또는 mPEG5000이 더 결합된 것인 조성물.
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