KR20140042204A

KR20140042204A - 파클리탁셀의 분리 및 정제방법

Info

Publication number: KR20140042204A
Application number: KR1020120108633A
Authority: KR
Inventors: 김진현; 정경열; 김건중; 박규연
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-04-07
Also published as: KR101401144B1

Abstract

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에서 타르 성분을 제거하는 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 사용한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

Description

파클리탁셀의 분리 및 정제방법{Method for isolating and purifying paclitaxel}

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래 타르 성분을 효과적으로 제거하는 방법 및 이를 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

파클리탁셀은 주목 나무의 표피에서 발견된 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제로서, 현재 항암제 중 시장규모 1위, 주요 항암화학치료제 시장의 22% 정도를 점유하고 있다. 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있으며, 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상실험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다.

파클리탁셀의 주요 생산 방법에는 세 가지가 있다. 첫째, 주목나무에서 직접 추출하는 방법으로 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출 및 정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 둘째, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetylpaclitaxel 등)를 얻어 사이드 체인(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성 방법이다. 이 방법 역시 전구체를 주목나무에서 직접 얻어야 하므로 직접 추출의 경우와 마찬가지인 문제점들을 가진다. 셋째, 주목나무에서 칼루스(callus)를 유도하고 종균배양 (seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이다. 이들 중 세 번째 방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀의 분리 및 정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도 (>98%)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스로부터 파클리탁셀을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있는데, 이 과정에서 특히 전 처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들은 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전 처리 없이 추출을 거친 원료(crude) 파클리탁셀을 HPLC(high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 스케일업(scale-up) 및 대량생산에 많은 어려움이 따른다. 대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 파클리탁셀을 추출하면 순도는 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 정도의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 팩킹된 원료(resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등 상당히 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로 적합하지 않다. 따라서 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능하면 높여(최소 50% 이상) 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다.

따라서 본 발명은 바이오매스의 효과적인 전처리 공정에 관한 것으로, 상기 전처리 공정을 통해 시료의 순도를 높여 최종 정제에서의 비용을 줄일 수 있는 전처리 공정을 제공하는 것이다.

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에서 타르 성분을 제거하기 위한 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제의 사용방법에 관한 것이다.

상기 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제는 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 또는 아세나프텐(acenaphthene)이 포함된 군에서 선택된 1종 이상의 타르 성분을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 발명은 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제에 의한 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서,

(a) 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 수용성 유기용매를 첨가하여 추출한 후 추출액을 감압 농축하고,

(b) 상기 농축액에 비극성 유기용매를 첨가하여 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하고,

(c) 상기 액체-액체 추출한 후 감압농축 및 건조하여 얻은 제1시료를 얻는 단계;

(d) 상기 제1시료를 비극성 유기용매와 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제의 혼합액에 넣고, 교반한 후 여과하고,

(e) 상기 여과된 여과액을 감압 건조한 후 비극성 유기용매에 녹이고,

(f) 상기 비극성 유기용매에 비수용성 유기용매를 첨가하여 침전을 유도하고 여과하여 파클리탁셀 침전물을 회수하고,

(g) 상기 파클리탁셀 침전물을 진공 건조하여 파클리탁셀을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 파클리탁셀 분리 및 정제 방법을 통해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 류마티스 관절염 또는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 파클리탁셀 분리 및 정제 방법을 통해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래의 타르 성분을 효과적으로 제거하여 시료의 순도를 높이고 이를 통해 최종 정제에서의 비용을 줄일 수 있는 전처리 공정을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 전처리 공정에서 주된 타르 성분을 제거하는 실리카계 흡착제 또는 스틸렌계 흡착제를 제공할 수 있다.

도 1은 바이오매스에 존재하는 타르 성분을 분석하기 위하여, 준비예 2에서 준비한 제1시료를 사용하여 GC/MS 크로마토그램 분석 결과로 5개의 주요 피크를 확인할 수 있다.
도 2는 상기 실시예 2-1 내지 2-5에서 얻은 파클리탁셀을 상기 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석을 통하여 각 파클리탁셀의 함량을 분석한 결과이다.

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에서 흡착제를 사용하여 주된 타르 성분을 제거하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 주된 타르 성분을 제거하기 위한 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제의 사용방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 또는 아세나프텐(acenaphthene)이 포함된 군에서 선택된 1종 이상의 타르 성분을 제거하기 위한 스틸렌(styrene)계 또는 실리카(silica)계 흡착제의 사용방법을 제공한다.

본 발명의 스틸렌계 흡착제는 특별히 한정하지는 않지만, 하기 화학식 1로 표현되는 구조를 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게는 HP20을 사용할 수 있다.

본 발명의 HP20은 겉보기 밀도(Shipping Weight)가 670 ~ 680 g/ℓ이고, 수분함유율은 50 ~ 70 이며, 포어 볼륨이 1 ~ 2 ㎖/g 및 포어 반경이 200 ~ 300 Å인 것이 바람직하다.

본 발명의 실리카계 흡착제는 특별히 한정하지는 않지만, 표면적이 200 ~ 1600 m²/kg이고 포어 직경이 2 ~ 20 nm인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 포함된 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 또는 아세나프텐(acenaphthene)이 포함된 군에서 선택된 1종 이상의 타르 성분을 제거하는 흡착제의 사용방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에서 타르 성분을 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명의 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액은 파클리탁셀 함유물질을 의미하는 것으로, 상기 택서스속(Taxus genus) 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 실리카계 흡착제에 의해 제거되는 타르 성분이 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 또는 아세나프텐(acenaphthene)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양엑에서 타르성분을 제거하는 실리카계 흡착제의 표면적이 200 ~ 1600 m²/kg이고 포어 직경이 2 ~ 20 nm인 실리카계 흡착제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 실리카계 흡착제에 의한 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서,

(a) 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 수용성 유기용매를 첨가하여 추출한 후 추출액을 농축하고,

(b) 상기 농축액에 비극성 유기용매를 첨가하여 액체-액체 추출한 후 농축 및 건조하고,

(c) 상기 액체-액체 추출한 후 농축 및 건조하여 얻은 제1시료를 얻는 단계;

(d) 상기 제1시료를 비극성 유기용매와 실리카계 흡착제의 혼합액에 넣고, 교반한 후 여과하고,

(e) 상기 여과된 여과액을 건조한 후 비극성 유기용매에 녹이고,

(g) 상기 파클리탁셀 침전물을 건조하여 파클리탁셀을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 (a) 과정에서 사용되는 수용성 유기용매는 바이오매스(biomass)로부터 파클리탁셀을 추출하기 위해 사용되며, 본 발명에 사용되는 수용성 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스(biomass)로부터 파클리탁셀을 비교적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 (a) 과정에서 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스(biomass)를 메탄올에 0.1 ~ 100 %(w/v), 바람직하게는 1 ~ 50 %(w/v)로 첨가한 후 실온에서 교반하여 추출 및 여과하는 공정을 2회 이상 반복하여 바이오매스(biomass) 유래 원료(crude) 파클리탁셀을 추출할 수 있다.

상기 (b) 과정에서 사용되는 비극성 유기용매는 수용성 유기용매와의 상 분리를 통하여 원료 파클리탁셀에 함유된 극성불순물을 제거하는 역할을 하며, 본 발명에 사용되는 비극성 유기용매의 구체적인 예로는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 1 내지 3회의 액체-액체 추출을 수행함으로써 원료 파클리탁셀에 함유된 극성불순물을 가장 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 (a) 과정에서 원료 파클리탁셀 추출에 사용된 수용성 유기용매가 알콜인 경우, 메틸렌 클로라이드가 액체-액체 추출에 일반적으로 사용된다. 메틸렌 클로라이드는 알콜 농축액의 20 ~ 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다.

상기 (d) 과정의 실리카계 흡착제 처리는 실리카계 흡착제를 상기 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1시료의 20 ~ 80 %(w/w)로, 바람직하게는 30 ~ 60 %(w/w)로 첨가하고, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 더 첨가하여 20 ~ 60 ℃에서 30분 동안 교반한 후 여과하여 얻은 여과액을 건조하는 것으로, 상기 범위의 실리카계 흡착제를 사용할 경우 바이오매스(biomass) 유래 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한 (c) 과정의 흡착제 처리에 사용되는 유기용매는 파클리탁셀에 대해서는 친화성이 강하고 타르 및 왁스 성분들과 같은 불순물들과는 친화성이 약해야 한다.

상기 (d) 과정에서 사용되는 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 상기 (d) 과정에 사용되는 비극성 유기용매는 실리카계 흡착제에 포함되어 있는 파클리탁셀을 회수하는데 그 목적이 있다. 상기 (d) 과정의 비극성 유기용매로 가장 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 사용할 수 있다.

상기 (d) 과정에서 사용되는 실리카계 흡착제가 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래 타르 성분을 제거할 수 있다.

상기 (e) 과정에서 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 사용할 수 있다.

상기 (f) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methylt-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 핵산, 벤젠에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 상기 (f) 과정에 사용되는 비수용성 유기용매는 실리카계 흡착제층과의 상 분리를 통한 비극성불순물의 효율적인 제거에 목적이 있다. 상기 (f) 과정의 비수용성 유기용매는 핵산을 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 파클리탁셀 분리 및 정제 방법을 통해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 파클리탁셀 분리 및 정제 방법을 통해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 류마티스 관절염 또는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

준비예 1: 식물세포배양액 준비.

본 발명에 사용된 식물세포배양액은 택서스종(Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. 택서스종으로부터 얻은 현탁액 세포는 24 ℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 상기 현탁액 세포는 수정된 겜보르그 비5(Gamborg's B5) 배지, 30 g/ℓ 수크로오스(sucrose), 10 um 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid), 0.2 um 6-벤질 아미노 퓨린(6-benzylamino purine), 1 g/ℓ 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 및 1 g/ℓ 2-(엔-모르폴리노)에탄술폰산(2-(N-molpholino) ethanesulfonic acid)에서 배양하였다. 세포 배양은 2주마다 새로운 배지로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7일과 21일째 되는 날에 1 ~ 2%의 맥아당(maltose)를 첨가해주고 유도인자로서 배양 초기에 4 um의 질산은(AgNO₃)를 첨가했다. 상기 배양된 세포는 배양액으로부터 디캔터(웨스트팔리아사의 CA150 Claritying decanter사용) 및 고속원심분리기(알파-라발사의 BTPX205GD-35CDEEP 사용)를 이용하여 식물세포와 세포조각을 회수하였다.

본 발명에서는 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스(biomass)라 한다.

준비예 2: 시료 준비.

본 발명의 실리카계 흡착제의 성능 분석을 위해 제1시료를 준비하였다.

식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1 (w/v)로 첨가하여 25 ℃에서 4회 반복 메탄올 추출하고 추출액을 회전증발기(rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 원액의 30%까지 농축하여 액-액 추출을 수행하였다. 농축된 메탄올 용액에 메틸렌 클로라이드를 첨가(메틸렌 농축액의 35%)하고, 30분 동안 교반 후 정체시켜 상 분리를 유도하였다. 액-액 추출을 수행하여 파클리탁셀이 포함된 하층인 메틸렌 클로라이드 층에서 제1시료를 회수하여 농축하고 여과지(150 mm, Whatman)로 감압 여과 후 건조하였다. 상기 액-액 추출 후 건조된 제1시료를 하기 실시예들의 실리카계 흡착제의 성능 분석을 위해 사용하였다.

실시예 1: 타르 성분을 제거하는 실리카계 흡착제 제조.

구형의 메조기공 실리카계 흡착제는 분무열분해공정을 이용하여 제조하였다. 테트라에틸올소실리케이트(Tetraethylorthosilicate; TEOS; Aldrich, 97%)를 실리카 전구체로 사용하고, 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide; CTAB; Aldrich), 플루오닉 P123(Pluonic P123; EO₂₀PO₇₀EO₂₀, Aldrich) 및 폴리스틸렌(polystyrene) 나노입자를 주형제로 사용하였다. 분무용액은 TEOS를 녹인 용액에 CTAB, P123, CTAB/P123 혼합 템플릿 및 P123을 첨가하여 제조하였다. 제조한 분무용액을 액적 발생장치에 의해 미세 액적화되고 고온반응기에서 건조 및 열분해시켜 메조기공 실리카 입자를 제조하였다. 이때 반응기는 석영관으로 직경 55 mm, 길이는 1200 mm이다. 합성한 실리카 분말은 450 ~ 700 ℃의 온도에서 열처리하여 잔류할 수 있는 유기물을 완전히 제거하였다. 제조된 메조기공 실리카의 표면적은 질소 흡착으로 BET식을 이용하여 계산하였고, 기공 부피는 상압력 P/P0 = 0.995 에서 흡착된 질소 부피를 이용하고, 평균 기공크기는 질소 탈착 등온선을 이용하여 BJH방법을 이용하여 측정하였다. 2 nm 급 실리카(Silica Ⅰ)는 CTAB을 이용해서 얻었고, 5 nm 급 실리카 (Silica Ⅱ)는 CTAB/P123 혼합 템플릿을 사용하여 제조하였고, 9 nm 급 실리카 (Silica Ⅲ)는 P123을 템플릿으로 사용하여 제조하였으며, 19 nm 급 실리카 (Silica Ⅳ)는 PS 나노입자를 이용하여 제조하였다.

상기 제조된 실리카 Ⅰ 내지 Ⅳ의 물리적인 물성은 하기 표 1과 같은 것으로 확인하였다.

실리카 흡착제	표면적(m²/g)	포어 볼륨(cm³/g)	포어 직경(nm)
실리카 Ⅰ	1574	0.811	2.19
실리카 Ⅱ	955	1.47	4.92
실리카 Ⅲ	522	1.45	9.07
실리카 Ⅳ	204	1.13	18.7

실시예 2: 실리카계 흡착제를 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제.

실시예 2-1. 실리카 Ⅰ을 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제

본 발명의 상기 실시예 1에서 제조한 실리카 Ⅰ(2 nm급 실리카)를 이용하여 준비예 2에서 준비한 제1시료를 분리 및 정제하여 파클리탁셀을 얻었다.

상기 준비예 2의 액-액 추출 후 식물세포 유래 타르 성분을 제거하기 위하여 제1시료를 메틸렌 클로라이드에 20% (v/w) 비율로 녹이고, 흡착제인 실리카 Ⅰ를 제1시료 대비 50% (w/w) 비율로 첨가하였다. 이후 40 ℃ 항온조(PS-1000, EYELA, Japan)에서 30분 동안 교반하여 반응시킨 후 여과하였다. 상기 여과로 얻은 여과액은 30℃, 감압상태에서 건조하여 건조된 시료를 얻고 이 건조된 시료를 핵산 침전 공정에 이용하였다. 핵산 침전 공정은 상기 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹이고 핵산에 떨어뜨려 침전을 유도하여 비극성불순물을 제거하였다(메틸렌 클로라이드/핵산 = 1/10, v/v). 핵산 침전 후 여과를 통하여 파클리탁셀 침전물을 얻고 35 ℃에서 24시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)으로 건조하였다.

실시예 2-2. 실리카 Ⅱ를 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제

본 발명의 상기 실시예 1에서 제조한 실리카 Ⅱ(5 nm급 실리카)를 이용하여 준비예 2에서 준비한 제1시료를 분리 및 정제하여 파클리탁셀을 얻었다.

5 nm 급 실리카Ⅱ를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-3. 실리카 Ⅲ를 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제

본 발명의 상기 실시예 1에서 제조한 실리카 Ⅲ(9 nm급 실리카)를 이용하여 준비예 2에서 준비한 제1시료를 분리 및 정제하여 파클리탁셀을 얻었다.

9 nm 급 실리카Ⅲ를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-4. 실리카 Ⅳ를 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제

본 발명의 상기 실시예 1에서 제조한 실리카 Ⅳ(19 nm급 실리카)를 이용하여 준비예 2에서 준비한 제1시료를 분리 및 정제하여 파클리탁셀을 얻었다.

19 nm 급 실리카Ⅳ를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-5. 스틸렌계 흡착제 HP20 을 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제

스틸렌계 흡착제인 HP20을 이용하여 준비예 2에서 준비한 제1시료를 분리 및 정제하여 파클리탁셀을 얻었다.

스킬렌계 흡착제인 HP20을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실험예 1. 바이오매스의 타르 성분 분석

바이오매스에 존재하는 타르 성분을 분석하기 위하여, 준비예 2에서 준비한 제1시료를 사용하여 GC(GC-2014, Shimadzu, Japan), HP-5 column(25 m, 0.33 μm film, 0.20 mm ID, HP) 및 FID(flame ionization detector)를 사용하였다. 컬럼 내에서의 분리 온도는 50 ~ 250 ℃까지 5 ℃/min으로 프로그래밍하였다. 사용 가스는 헬륨이며 1 ㎖/min으로 흘려주었다.

상기 GC/MS 크로마토그램 분석 결과, 5개의 주요 피크를 확인하였으며(도 1) 각 피크의 머무름 시간이 6.374, 8.208, 15.209, 20.045, 24.474 분으로 확인되었다. 상기 머무름 시간으로 각 피크의 물질이 하기 표 1이라는 것을 확인하였다.

성분	머무름 시간(분)	확인된 타르 성분
1	6.374	2-피콜린(2-picoline)
2	8.208	올소-자일렌(o-xylene)
3	15.209	2,5-크실레놀(2,5-xylenol)
4	20.045	1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene)
5	24.474	아세나프텐(acenaphthene)

상기 표 2에서도 알 수 있듯, 바이오매스의 주요 타르 성분은 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌 (o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 및 아세나프텐(acenaphthene)인 것을 알 수 있다. 따라서 본원발명의 실리카계 흡착제의 타르 성분 제거효과는 상기 5개의 주요 타르 성분의 함량을 비교하여 평가하였다.

실험예 2. 파클리탁셀의 함량 분석

실리카계 흡착제 처리를 통해 분리 및 정제한 파클리탁셀의 함량을 분석하기 위하여 HPLC(high performance liquid chromatography; Waters, USA)과 Capell Pak C18(250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 사용하였다. 이동상은 아세토나이트릴(acetonitrile)과 증류수 혼합용액(65/35∼35/65, v/v, gradient mode)을 유량 1 ㎖/min으로 흘려주었다. 시료 주입양은 20 ㎕ 이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다.

상기 실시예 2-1 내지 2-5에서 얻은 파클리탁셀을 상기 HPLC 분석을 통하여 각 파클리탁셀의 함량을 분석하였다. 상기 크로마토그램 분석결과, 흡착제를 처리하지 않은 대조군보다 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 처리한 실험군의 순도 및 수율에서 뛰어난 성능을 보이는 것을 확인하였다.

도 2에서 알 수 있듯이, 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 처리하지 않은 대조군보다 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 처리한 실험군들의 수율이 2배 내지 2.25배 높은 것을 확인하였다. 또한, 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 처리하지 않은 대조군보다 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 처리한 실험군들의 순도가 1.7배 내지 5배 높은 것을 확인하였다.

도 2의 A는 흡착제를 사용하지 않고 분리 및 정제한 대조군 파클리탁셀을 분석한 결과이고, B는 실리카계 흡착제 실리카 Ⅰ(2 nm급 실리카)를 사용하여 분리 및 정제한 파클리탁셀을 분석한 결과, C는 실리카계 흡착제 실리카 Ⅱ(5 nm급 실리카)를 사용하여 분리 및 정제한 파클리탁셀을 분석한 결과, D는 실리카계 흡착제 실리카 Ⅲ(9 nm급 실리카)를 사용하여 분리 및 정제한 파클리탁셀을 분석한 결과, E는 실리카계 흡착제 실리카 Ⅳ(19 nm급 실리카)를 사용하여 분리 및 정제한 파클리탁셀을 분석한 결과 및 F는 스틸렌계 흡착제 HP20을 사용하여 분리 및 정제한 파클리탁셀을 분석한 결과이다.

이와 같이, 실시예 및 실험예를 통해 알 수 있듯이, 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제를 사용하여 파클리탁셀을 분리 및 정제하는 것이 상기 흡착제를 처리하지 않은 것보다 순도 및 수율에서 뛰어나게 높은 분리 및 정제 성능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 원료 의약품 대량생산에 활용도가 높은 발명이라 할 수 있으며, 파클리탁셀의 수요가 늘어나고 있는 현 상황에서 꼭 필요한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법이라 할 수 있다.

[ 제조예 ]

제조예 1 : 약학적 조성물의 제조

본 발명의 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1-1. 산제의 제조

파클리탁셀 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2. 정제의 제조

파클리탁셀 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3. 캡슐제의 제조

파클리탁셀 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 1-4. 환의 제조

파클리탁셀 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제조예 1-5. 과립의 제조

파클리탁셀 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

Claims

2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 및 아세나프텐(acenaphthene)을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 타르 성분을 제거하기 위한 스틸렌(styrene)계 또는 실리카(silica)계 흡착제의 사용방법.
제 1항에 있어서, 상기 스틸렌계 흡착제가 하기 화학식 (1)로 표현되는 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 흡착제의 사용방법

(1)
제 2항에 있어서, 상기 스틸렌계 흡착제가 HP20인 것을 특징으로 하는 흡착제의 사용방법.
제 1항에 있어서, 상기 실리카계 흡착제의 표면적이 200 ~ 1600 m²/kg이고 포어 직경이 2 ~ 20 nm인 것을 특징으로 하는 흡착제의 사용방법.
제 1항에 있어서, 상기 타르 성분은 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 포함된 것을 특징으로 하는 흡착제의 사용방법.
택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 흡착제를 사용하여 타르 성분을 제거하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 타르 성분이 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 및 아세나프텐(acenaphthene)을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 타르 성분을 제거하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 흡착제는 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제인 것을 특징으로 하는 타르 성분을 제거하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 실리카계 흡착제의 표면적이 200 ~ 1600 m²/kg이고 포어 직경이 2 ~ 20 nm인 것을 특징으로 하는 타르 성분을 제거하는 방법.
(a) 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 수용성 유기용매를 첨가하여 추출한 후 추출액을 농축하고,
(b) 상기 농축액에 비극성 유기용매를 첨가하여 액체-액체 추출한 후 농축 및 건조하고,
(c) 상기 액체-액체 추출한 후 농축 및 건조하여 얻은 제1시료를 얻는 단계;
(d) 상기 제1시료를 비극성 유기용매와 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제의 혼합액에 넣고, 교반한 후 여과하고,
(e) 상기 여과된 여과액을 건조한 후 비극성 유기용매에 녹이고,
(f) 상기 비극성 유기용매에 비수용성 유기용매를 첨가하여 침전을 유도하고 여과하여 파클리탁셀 침전물을 회수하고,
(g) 상기 파클리탁셀 침전물을 건조하여 파클리탁셀을 얻는 단계;
를 포함하는 실리카계 흡착제에 의한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 10항에 있어서, 상기 (a) 과정에서 사용되는 수용성 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 10항에 있어서, 상기 (b), (d) 및 (e) 과정에서 사용되는 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 10항에 있어서, (f) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methylt-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 핵산, 벤젠에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 파틀리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 10항에 있어서, 상기 (d) 과정에서 사용되는 스틸렌계 또는 실리카계 흡착제가 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래 타르 성분을 제거하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 14항에 있어서, 상기 타르 성분이 2-피콜린(2-picoline), 올소-자일렌(o-xylene), 2,5-크실레놀(2,5-xylenol), 1-메틸나프탈렌(1-methylnaphthalene) 또는 아세나프텐(acenaphthene)을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 14항에 있어서, 상기 실리카계 흡착제의 표면적이 200 ~ 1600 m²/kg이고 포어 직경이 2 ~ 20 nm인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 분리 및 정제 방법으로 정제된 파클리탁셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 분리 및 정제 방법으로 정제된 파클리탁셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 또는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.