KR101491915B1 - 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체 및 이를 이용한 파클리탁셀 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파클리탁셀 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 파클리탁셀 정제방법 중 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)의 전처리 과정 중 분별침전 방법에 사용되며, 파클리탁셀의 대량 정제, 정제된 파클리탁셀의 순도 향상 및 파클리탁셀의 정제 수율 향상을 유도할 수 있는 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체 및 이를 이용한 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

Description

파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체 및 이를 이용한 파클리탁셀 정제방법{Increase material for fractional precipitation and purification method using thereof}

본 발명은 파클리탁셀 정제방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 파클리탁셀 정제방법 중 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)의 전처리 과정 중 분별침전 방법에 사용되며, 파클리탁셀의 대량 정제, 정제된 파클리탁셀의 순도 향상 및 파클리탁셀의 정제 수율 향상을 유도할 수 있는 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체 및 이를 이용한 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

파클리탁셀은 주목 나무의 표피에서 발견된 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제로서, 현재 항암제 중 시장규모 1위, 주요 항암화학치료제 시장의 22% 정도를 점유하고 있다. 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있으며, 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상실험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다.

파클리탁셀의 주요 생산 방법에는 세 가지가 있다. 첫째, 주목나무에서 직접 추출하는 방법으로 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출 및 정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 둘째, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetyl paclitaxel 등)를 얻어 사이드 체인(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성 방법이다. 그러나, 이 방법 역시 전구체를 주목나무에서 직접 얻어야 하므로 직접 추출의 경우와 마찬가지인 문제점들을 가진다. 셋째, 주목나무에서 칼루스(callus)를 유도하고 종균배양(seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이다. 이들 중 세 번째 방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀의 분리 및 정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도(98% 이상의 순도)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스로부터 파클리탁셀을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있는데, 이 과정에서 특히 전 처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들은 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전 처리 없이 추출을 거친 원료(crude) 파클리탁셀을 고성능액체크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하기 때문에 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 스케일업(scale-up) 및 대량생산에 많은 어려움이 따른다. 대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 파클리탁셀을 추출하면 순도는 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 정도의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 팩킹된 충진재(resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등 상당히 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로 적합하지 않다. 따라서 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능하면 높여(최소 50% 이상) 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다.

종래 HPLC의 전처리 공정으로는 분별침전(fractional precipitation)이 개발되어 사용되었다. 상기 분별침전은 식물세포배양액으로부터 식물세포를 회수하고 회수한 식물세포를 용매 추출한 후에 흡착 공정과 핵산(hexane) 침전 공정을 거치면 시료의 순도가 대략 15% 정도인데 이를 분별침전 공정을 통해 50% 이상의 높은 순도의 파클리탁셀을 간단하게 얻을 수 있었다. 그러나 분별침전의 단점은 침전에 많은 시간(3일 이상)이 소요되어 대량생산 공정에 응용되는데 많은 어려움이 있었다.

이로 인해, 종래 HPLC 전처리 공정보다 짧은 시간으로 높은 순도(60% 이상)의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 원료 파클리탁셀을 정제하여 높은 순도(60% 이상)의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 정제방법 및 상기 정제방법에 사용되는 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체를 제공하려는 목적이 있다.

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(Biomass) 및 수용성 유기용매를 포함하는 혼합물로부터 추출액을 제조하는 1단계; 상기 추출액과 비극성 유기용매를 혼합한 후 액-액 추출하여 조추출물을 제조하는 2단계; 상기 조추출물, 비극성 유기용매 및 흡착제를 혼합한 후 여과하여 여과액을 제조하는 3단계; 상기 여과액 및 비극성 유기용매를 포함하는 혼합용액을 비수용성 유기용매에 첨가하여 침전물을 제조하는 4단계; 상기 침전물, 수용성 유기용매 및 표면적 증가물질을 포함하는 반응액을 제조하는 5단계; 및 상기 반응액을 1 ~ 10 ℃에 보관하여 파클리탁셀 침전물을 수득하는 6단계; 를 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 택서스속 식물체 유래 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래 바이오매스를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 수용성 유기용매는 C₁ ~ C₅의 알코올 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름 (chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 핵산(hexane) 및 벤젠(benzene)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 표면적 증가물질은 다공성 실리카와 다공성 알루미나; 또는 다공성 알루미나;를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 6단계의 반응액 보관은 1 ~ 12시간 동안 수행하며, 파클리탁셀의 수율은 60% 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 흡착제활성탄(activated carbon), 백토(active clay), 실로퓨트(sylopute) 및 실리카(SiO₂)로 이루어진 군 중 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 6단계의 침전은 5 ~ 18 시간 동안 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 다공성 실리카 및 다공성 알루미나를 포함하는 표면적 증가체; 또는 다공성 알루미나를 포함하는 표면적 증가체;이고, 파클리탁셀, 메탄올 및 물을 포함하는 혼합물에 상기 표면적 증가체를 첨가하면 제타 포텐셜(zeta potential)이 0 ~ 40 mV인 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 표면적 증가체는 평균 표면적이 200 ~ 290 ㎡/g일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 표면적 증가체는 다공성 실리카 : 다공성 알루미나를 0.01 ~ 30 : 70 ~ 99.99 중량비로 포함할 수 있다.

본 발명은 종래 파클리탁셀의 HPLC 전처리 공정보다 짧은 시간으로 높은 순도(60% 이상)의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 정제방법을 제공할 수 있다. 이로 인해, 상기 정제방법은 파클리탁셀의 대량 생산 공정에 응용될 수 있는 효과가 있다.

나아가, 본 발명의 정제방법으로 정제한 파클리탁셀은 결정입자의 크기가 100 ㎛ 이하로 매우 작으며, 이로 인해 약학적 활성도가 높아 원료의약품으로 활용도가 높은 파클리탁셀을 제공할 수 있다.

또한 정제 후 제품(파클리탁셀)의 건조(특히, 잔류 용매 및 수분 제거)에 매우 효과적으로 적용할 수 있는 파클리탁셀 정제방법을 제공할 수 있다.

도 1은 실험예 2에서 측정한 파클리탁셀 수율 그래프이다.
도 2는 실험예 2에서 측정한 파클리탁셀의 순도 그래프이다.
도 3은 실험예 3에서 제타 포텐셜 값과 분별침전 6시간 후의 파클리탁셀 수율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 4에서 분별침전 시간에 따라 전자현미경으로 관찰한 파클리탁셀 침전물의 결과 이미지이다.
도 5는 실험예 4에서 전자현미경으로 관찰한 파클리탁셀 침전물의 평균 직경과 분별침전 시간의 상관 그래프이다.
도 6은 실험예 4의 동일한 분별침전 시간(18 시간)에서 측정한 파클리탁셀 침전물 입자 크기와 실험예 3에서 측정한 제타 포텐션과의 관계를 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 HPLC의 전처리 공정으로는 사용하던 분별침전은 침전에 많은 시간(3일 이상)이 소요되어 대량생산 공정에 응용되는데 많은 어려움이 있었다. 이로 인해, 종래 HPLC 전처리 공정보다 짧은 시간으로 높은 순도(60% 이상)의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명은 다공성 실리카 및 다공성 알루미나; 또는 다공성 알루미나;를 포함하는 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체 및 상기 표면적 증가체를 이용하는 정제방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래 파클리탁셀의 HPLC 전처리 공정보다 짧은 시간으로 높은 순도(60% 이상)의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 정제방법을 효과가 있다. 또한, 상기 정제방법은 파클리탁셀의 대량 생산 공정에 응용될 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체는 다공성 실리카 및 다공성 알루미나; 또는 다공성 알루미나;를 포함한다.

상기 표면적 증가체는 용매에 첨가할 경우 표면적이 증가하여 파클리탁셀의 침전을 용이하게 하는 역할을 위해 첨가하는 것으로, 용매에서 부유하는 성질이 있어 제타 포텐셜(zeta potential) 측정이 매우 용이한 물질을 사용할 수 있으며, 이로 인해 제타 포텐셜을 조절할 수도 있다. 또한, 상기 표면적 증가체는 다공성 알루미나; 또는 다공성 실리카 및 다공성 알루미나;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 표면적 증가체는 파클리탁셀, 메탄올 및 물을 포함하는 혼합물에 첨가될 경우, 제타 포텐셜이 0 ~ 40 mV로 조절할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

나아가, 상기 표면적 증가체에 사용할 수 있는 다공성 알루미나 및 다공성 실리카는 통상적으로 구매 및/또는 합성할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

더불어 상기 표면적 증가체는 다공성 실리카-알루미나 혼합체; 또는 다공성 알루미나;를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 분무열분해 공정으로 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 분무열분해 공정은 실리카 전구체 및 알루미늄 전구체, 또는 알루미늄 전구체를 녹인 용액에 기공형성을 위한 주형제를 첨가하여 분무용액을 제조하는 단계; 상기 분무용액을 액적화한 다음 운반기체를 통하여 건조부 및 반응부를 포함하는 분무열분해 반응기의 반응부로 이동하는 단계; 및 상기 반응부를 통과한 입자들을 포집하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 건조부는 2존(zone)으로 나뉜 것일 수 있고, 건조부의 온도는 200 ~ 400 ℃일 수 있으며, 1존과 2존의 온도 차이는 40 ~ 60℃를 보일 수 있다.

또한, 상기 반응부의 온도는 550 ~ 650 ℃일 수 있다.

나아가, 상기 건조부 및 반응부는 평균 직경이 50 ~ 60 ㎜이고, 길이가 1,000 ~ 1,500 ㎜인 것을 사용할 수 있다.

상기 운반기체는 분무열분해 반응기로 액적화한 용액을 운반할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 공기일 수 있다.

상술한 방법으로 포집한 입자들은 500 ~ 600 ℃에서 3 ~ 5 시간 동안 소성시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 소성 단계를 거친 입자들은 평균 표면적이 200 ~ 290 m²/g이고, 더욱 바람직하게는 220 ~ 260 m²/g일 수 있다.

또한, 상기 소성 단계를 거친 입자들은 기공 부피(pore volume) 평균은 0.5 ~ 0.7 cm³/g이며, 기공의 평균 직경은 6.5 ~ 9.0 ㎚일 수 있고, 더욱 바람직하게는 기공의 평균 직경은 7.0 ~ 9.0 ㎚일 수 있다.

만약, 상기 표면적 증가체가 다공성 실리카-알루미나 혼합체일 경우, 실리카 전구체 및 알루미늄 전구체의 전체 농도는 0.1 ~ 0.3 M이고, 실리카 전구체 0.01 ~ 30 중량비 및 알리미늄 전구체 70 ~ 99.99 중량비를 포함하는 용액을 사용하여 상술한 바와 같은 분무열분해 공정을 통하여 표면적 증가체를 제조할 수 있다.

또한, 만약, 상기 표면적 증가체가 다공성 알루미나일 경우, 알루미늄 전구체 0.2 M을 포함하는 용액을 사용하여 상술한 바와 같은 분무열분해 공정을 통하여 제조할 수 있다.

나아가, 본 발명은 상술한 바와 같이 제조된 표면적 증가체를 사용하여 파클리탁셀을 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(Biomass) 및 수용성 유기용매를 포함하는 혼합물로부터 추출액을 제조하는 1단계; 상기 추출액과 비극성 유기용매를 혼합한 후 액-액 추출하여 조추출물을 제조하는 2단계; 상기 조추출물, 비극성 유기용매 및 흡착제를 혼합한 후 여과하여 여과액을 제조하는 3단계; 상기 여과액 및 비극성 유기용매를 포함하는 혼합용액을 비수용성 유기용매에 첨가하여 침전물을 제조하는 4단계; 상기 침전물, 수용성 유기용매 및 표면적 증가물질을 포함하는 반응액을 제조하는 5단계; 및 상기 반응액을 1 ~ 10 ℃에 보관하여 파클리탁셀 침전물을 수득하는 6단계; 를 포함한다.

먼저, 1단계로 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(Biomass) 및 수용성 유기용매를 포함하는 혼합물로부터 추출액을 제조한다.

상기 택서스속 식물체는 통상적인 식물 분류에서 택서스 속에 속하는 식물이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 택서스속 식물체 유래 바이오매스는 통상적인 바이오매스 제조방법으로 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에서 유래된 바이오매스라면 특별히 제한하지 않는다.

나아가, 상기 수용성 유기용매는 바이오매스로부터 파클리탁셀을 추출하기 위해 사용되며, 통상적으로 식물체의 바이오매스에서 파클리탁셀을 추출하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅의 알코올 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

더불어, 상기 추출액은 바이오매스 100 중량부에 대하여 수용성 유기용매 70,000 ~ 90,000 중량부 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 상기 혼합물에서 추출액을 추출하는 방법은 통상적으로 식물체의 바이오매스에서 추출물을 추출할 때 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 20 ~ 28 ℃에서 20 ~ 40 분 동안 교반하여 추출할 수 있다. 또한, 상기 추출은 1회 수행할 수 있으나, 바람직하게는 2 ~ 4회 반복하여 수행할 수 있다.

한편, 상기 추출액을 농축하지 않고 비극성 유기용매와 혼합하여 액체-액체 추출을 진행할 경우, 잔류 수분의 영향으로 액-액 추출 효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있어, 추출액을 농축하지 않고 2단계를 진행하는 것보다 상기 추출액을 농축하여 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일구현예에서는 상기 추출액을 농축하여 사용할 수 있다. 상기 농축은 통상적으로 액체를 농축하는데 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 감압농축 또는 진공농축 방법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 감압농축 방법을 이용할 수 있다.

상기 감압농축은 상기 추출액을 원액의 20 ~ 50%로 농축할 수 있다.

또한, 상기 감압농축은 통상적으로 액체의 감압농축에 사용되는 조건이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 700 ~ 800 ㎜Hg 및 35 ~ 50 ℃에서 수행할 수 있다.

다음, 2단계는 상기 추출액과 비극성 유기용매를 혼합한 후 액-액 추출하여 조추출물을 제조한다.

상기 비극성 유기용매는 수용성 유기용매와의 상 분리를 통하여 원료 파클리탁셀에 함유된 극성불순물을 제거하는 역할을 하며, 통상적으로 액-액 추출에서 사용되는 비극성 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 추출액은 비극성 유기용매 100 중량부에 대하여 300 ~ 500 중량부 혼합하여 사용할 수 있다.

만약, 상기 비극성 유기용매 100 중량부에 대하여 추출액 300 중량부 미만으로 혼합할 경우, 후속 공정에서 비극성 유기 용매를 제거하기 위해 많은 부담이 초래될 수 있다. 만약, 상기 비극성 유기용매 100 중량부에 대하여 추출액 500 중량부 초과로 혼합할 경우, 추출하고자 하는 물질의 추출 효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 액-액 추출은 1회 이상 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 ~ 4회 반복하여 수행할 수 있다.

나아가, 상기 조추출물은 액-액 추출에서 수용성 유기용매의 하층인 비극성 유기용매에 존재하는 것으로, 상기 비극성 유기용매 층을 회수하여 수득할 수 있다.

상기 조추출물의 수득은 통상적으로 유기용매에서 추출물을 수득하는 방법이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 비극성 유기용매를 20 ~ 28 ℃ 및 700 ~ 800 ㎜Hg에서 농축 및/또는 건조하여 수득할 수 있다.

다음으로, 3단계는 상기 조추출물, 비극성 유기용매 및 흡착제를 혼합한 후 여과하여 여과액을 제조한다.

상기 비극성 유기용매는 조추출물에서 타르 및 왁스 성분을 제거하는 역할을 하며, 통상적으로 식물세포에서 식물 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위해 사용되는 비극성 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 흡착제는 통상적으로 식물 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 활성탄(activated carbon), 백토(active clay), 실로퓨트(sylopute) 및 실리카(SiO₂)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

나아가, 상기 조추출물, 비극성 유기용매 및 흡착제의 혼합은 조추출물 100 중량부에 대하여 비극성 유기용매 240,000 ~ 800,000 중량부 및 흡착제 30 ~ 70 중량부 포함하는 것을 사용할 수 있다.

한편, 상기 여과액을 건조하지 않고 비극성 유기용매와 혼합한 후 비수용성 유기용매에 첨가하여 침전반응을 진행할 경우, 잔류용매의 영향으로 침전 효율이 저하될 수 있는 문제가 발생할 수 있어, 여과액을 건조하지 않고 4단계를 진행하는 것보다 상기 여과액을 건조하여 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일구현예에서는 상기 여과액을 건조하여 사용할 수 있다. 상기 건조는 통상적으로 액체를 건조하여 건조 시료로 제조하는데 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 감압건조 또는 진공건조 방법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 감압건조 방법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 감압건조는 통상적으로 액체를 감압 건조하여 시료로 제조하는데 사용되는 조건이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 700 ~ 800 ㎜Hg 및 35 ~ 50 ℃에서 20 ~ 50분 동안 수행할 수 있다.

다음, 4단계는 상기 여과액 및 비극성 유기용매를 포함하는 혼합용액을 비수용성 유기용매에 첨가하여 침전물을 제조한다.

상기 비극성 유기용매는 상기 여과액에서 비극성 불순물을 제거하는 역할을 하며, 통상적으로 식물 유래 추출물에서 비극성 불순물을 제거하기 위해 사용되는 비극성 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 포함할 수 있다.

상기 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름 (chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 핵산(hexane) 및 벤젠(benzene)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 핵산을 포함할 수 있다.

상기 여과액 및 비극성 유기용매의 혼합은 여과액 100 중량부에 대하여 비극성 유기용매100 ~ 1,000 중량부를 포함할 수 있다.

또한, 상기 비수용성 유기용매에 첨가되는 혼합용액은 비수용성 유기용매 : 혼합용액 = 100 : 5 ~ 20 (v/v)으로 첨가될 수 있다.

한편, 상기 침전물을 건조하지 않고 수용성 유기용매와 혼합할 경우, 잔류용매의 영향으로 침전 효율이 저하될 수 있는 문제점이 발생할 수 있어, 침전물을 건조하지 않고 5단계를 진행하는 것보다 상기 침전물을 건조하여 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일구현예에서는 상기 침전물을 건조하여 사용할 수 있다. 상기 건조는 통상적으로 시료를 건조하는데 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 감압건조 또는 진공건조 방법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 진공건조 방법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 진공건조는 통상적으로 시료를 진공으로 건조하는데 사용되는 조건이라면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 진공건조기를 사용하여 18 ~ 30시간 동안 수행할 수 있다.

다음으로, 5단계는 상기 침전물, 수용성 유기용매 및 표면적 증가물질을 포함하는 반응액을 제조한다.

상기 표면적 증가물질은 용매에 첨가할 경우 표면적이 증가하여 파클리탁셀의 침전을 용이하게 하는 역할을 위해 첨가하는 것이다. 또한, 용매에서 부유하는 성질을 가지는 표면적 증가물질을 사용할 경우, 제타 포텐셜(zeta potential) 측정이 매우 용이할 수 있으며, 이로 인해 제타 포텐셜을 조절할 수도 있다.

만약, 상기 표면적 증가물질로 이온교환수지 또는 유리비드를 사용할 경우, 용매에 부유할 수 없어 제타 포텐셜 측정이 힘들고, 표면적 증가물질이 침전 용액에 골고루 분산되지 않아 침전효과를 극대화하기 어려운 문제점이 발생할 수 있다.

따라서, 바람직하게는 상술한 방법에 의해 제조한 본 발명의 표면적 증가체를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 다공성 실리카 및 다공성 알루미나; 또는 다공성 알루미나;를 포함하는 표면적 증가물질을 사용할 수 있다.

또한, 상기 수용성 유기용매는 침전물을 용해시켜 순도 60% 이상의 파클리탁셀을 분별침전하기 위해 사용하는 것으로, 통상적으로 분별침전에서 사용되는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅의 알코올 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올 및/또는 물을 포함할 수 있다.

만약, 상기 수용성 유기 용매로 메탄올 및 물을 사용할 경우, 메탄올 100 중량부에 대하여 물 20 ~ 50 중량부, 바람직하게는 메탄올 100 중량부에 대하여 물 25 ~ 40 중량부 포함하는 것을 사용할 수 있다.

한편, 상기 반응액 제조시 수용성 유기 용매로 메탄올 및 물을 사용하고, 상기 침전물을 메탄올 및 물과 한번에 혼합할 경우, 침전물에 불순물이 많이 포함될 수 있어 침전 효율(순도)이 저하되는 문제점이 발생할 수 있어, 침전물을 수용성 유기용매 1종에 먼저 용해시키지 않고 한꺼번에 혼합하는 것보다 상기 침전물을 수용성 유기용매 1종에 먼저 용해시켜 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일구현예에서는 상기 침전물을 수용성 유기 용매 1종에 용해시켜 사용할 수 있다. 상기 수용성 유기 용매는 메탄올 또는 물을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 메탄올에 침전물을 용해시켜 용해액을 제조한 후 상기 용액에 물을 첨가할 수 있다.

또한, 메탄올 및 침전물의 혼합비는 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 침전물 1 : 메탄올 150 ~ 300 (w/v)을 포함하는 용해액을 제조할 수 있다.

나아가, 상기 용해액 및 물의 혼합비는 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 용해액의 농도가 55 ~ 70 %가 될 때까지 물을 첨가할 수 있다.

다음으로, 6단계는 상기 반응액을 1 ~ 10 ℃에 보관하여 파클리탁셀 침전물을 수득한다.

상기 반응액 보관은 1 ~ 10 ℃에 할 수 있으며, 바람직하게는 3 ~ 8 ℃, 더욱 바람직하게는 4 ~ 7 ℃에서 수행할 수 있다.

상기 보관은 파클리탁셀의 침전반응을 유도하기 위해 수행하는 것으로, 종래 분별침전에 소요되던 시간인 3일보다 월등히 짧은 6 ~ 18 시간 동안 수행할 수 있다.

상기에서 수득한 파클리탁셀 침전물은 평균 직경이 10 ~ 100 ㎛이고, 70 ~ 85 %의 높은 순도를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

준비예 . 바이오매스 준비

본 실시예에서 사용한 바이오매스는 식물세포배양액을 사용하여 제조하였다, 상기 식물세포배양액은 택서스 종(Taxus chinensis )의 잎으로부터 칼루스(callus)를 유도하여 세포주(cell line)를 수득한 후 배양 및 현탁하여 현탁액 세포를 수득하였다. 상기 현탁액 세포는 24℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm 으로 교반하여 배양하였다. 배양한 현탁액 세포는 수정된 겜보르그 B5(Gamborg's B5) 배지, 30 g/ℓ 수크로오스(sucrose), 10 ㎛ 나프탈렌 아세트산(NAA; naphthalene acetic acid), 0.2 ㎛ 6-벤질 아미노 퓨린(BA; 6-benzylamino purine), 1 g/ℓ 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 및 1 g/ℓ 2-(엔-모르폴리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid; MES)에서 배양하였다. 상기 배양은 2주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주며 수행하였고, 생산과 배양을 연장시키기 위해 7일과 21일째 되는 날에 1.5%의 맥아당(maltose)를 첨가해 주고 유도인자(elicitor)로서 배양 초기에 4 ㎛의 질산은(AgNO₃)을 첨가했다.

상기 배양 후 배양액으로부터 디캔터(decanter; 웨스트팔리아사의 CA150 Claritying Decanter 사용) 및 고속원심분리기(알파-라발사의 BTPX205GD-35CDEEP 사용)를 이용하여 식물세포 및 세포조각(cell debris)을 회수하였다. 이하, 회수한 식물세포 및 세포조각은 바이오매스(Biomass)로 사용하였다.

실시예 1. 표면적 증가체 제조.

알루미늄 전구체로 알루미늄 나이트라이트(aluminum nitrate; Al(NO₃)_3·9H₂O, Aldrich사 제품)를 사용하였고, 실리카 전구체로는 테트라에틸 오소규산염(tetraehtyl orthosilicate; TEOS, Adrich사 제품, 97%)를 사용하였다. 기공 형성을 위한 주형제로는 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프리필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol); Aldrich사 제품, 제품명: P123)를 사용하였다.

표면적 증가체 제조를 위해 상기 실리카 전구체를 물에 녹인 후 알루미늄 전구체를 녹이고, P123을 첨가하여 분무용액 1 내지 2를 제조하였다. 또한, 알루미늄 전구체와 실리카의 전체 농도는 0.2 M로 고정하였고, 알루미늄 기준 P123의 몰 비는 0.07로 고정시켜 수행하였다. 상기 알루미늄 전구체와 실리카 전구체의 몰비는 100 : 0, 80 : 20으로 변화시켜주었고, 상기 몰비는 하기 표 1에 나타내었다.

구분	몰비(%)
	알루미늄 전구체	실리카 전구체
표면적 증가체 1(분무용액 1)	100	0
표면적 증가체 2(분무용액 2)	80	20

상기 분무용액 1 내지 2는 초음파 액적 발생장치(aerosol generator, 진동자 6개, 1.7 MHz, 동림엔지니어링)를 이용하여 액적화한 후 운반기체를 통하여 반응기 내로 이동시켰다. 상기 운반기체는 공기를 사용하였으며, 유량은 10 ℓ/분으로 고정하였다. 상기 반응기의 건조부 및 반응부의 반응기는 길이 1200 mm, 직경 55 mm인 석영관을 각각 사용하였다. 상기 건조부는 2존(two-zone)으로 나누고 각각의 온도를 300 ℃, 350 ℃로 고정시키고, 상기 반응부의 온도는 600 ℃로 고정시켰다.

상기 반응부를 통과한 입자들은 테플론 필터를 이용하여 포집하였다. 포집한 입자에 잔존하는 유기물들을 없애기 위해, 전기로 내에서 소성시켜 제거하였다. 상기 전기로의 온도는 550 ℃(승온 속도: 1 ℃/분) 공기분위기 하에서 4 시간 동안 소성시켜 표면적 증가체 1 내지 2를 수득하였다.

실시예 2. 파클리탁셀 분별침전

준비예에서 제조한 바이오매스 및 메탄올(methanol)을 혼합하는데, 바이오매스:메탄올을 1:1(w/v)로 혼합한 후, 25 ℃에서 30분 동안 추출하여 추출물을 획득하였다. 이후 획득한 추출물을 여과하고, 여과된 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출하여 여과한 여과액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에 첨가한 후 40℃ 및 감압상태에서 첨가한 여과액의 30%까지 농축하여 농축액을 제조하였다. 이후 농축액 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 혼합하는데, 농축액:메틸렌 클로라이드를 1:4(v/v)로 혼합한 후, 25 ℃에서 30분 동안 액-액 추출(liquid-liquid extraction)을 3회 반복 수행하였다.

상기 액-액 추출을 통해 생성된 극성불순물은 상층인 메탄올 층에서 제거하고, 파클리탁셀은 메틸렌 클로라이드 층에서 회수하여 25 ℃, 감압상태에서 농축 및 건조하여 조추출물을 수득하였다.

상기 조추출물에서 식물세포 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위하여, 조추출물 및 메틸렌 클로라이드를 혼합하는데, 조추출물:메틸렌 클로라이드를 1:5(v/w)로 혼합하여 조추출물 용액을 제조하였다. 이후 조추출물 용액에 흡착제(adsorbent)인 실로퓨트(sylopute; Fuji Silyv/a Chemical Ltd., Japan)를 조추출물 대비 50%(w/w) 비율로 첨가하여 40℃에서 30분 동안 교반하며 반응시킨 후 여과하여 여과용액을 수득하였다. 상기 여과용액은 30℃ 및 감압상태에서 건조하여 건조 시료를 제조하였다.

상기 건조 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 헥산(hexane)에 떨어뜨려 침전을 유도하여 비극성불순물(non-polar impurity)을 제거하였다(methylene chloride/hexane=1/10, v/v). 다음으로, 비극성 불순물이 제거된 침전물은 여과하여 파클리탁셀(Paclitaxel) 침전물을 회수하고 회수한 침전물은 24시간 동안 진공건조(UP-2000, EYELA, Japan)하였다.

분별침전을 위하여, 상기 진공건조한 침전물을 메탄올에 용해시키고(pure paclitaxel basis: 0.5%, w/v), 상기 침전물을 용해한 메탄올의 농도가 61.5%가 될 때까지 교반(180 rpm) 하에 증류수(distilled water)를 한 방울씩 떨어뜨려 반응액을 제조하였다. 이후 상기 반응액은 침전기에 첨가하였다.

반응액 부피당 표면적(S/V: surface area/working volume, 1007.589 mm-¹)을 증가시키기 위하여, 상기 반응액이 첨가된 침전기 내부에 실시예 1에서 제조한 표면적 증가체 1을 첨가하여 침전용액 1을 제조하였다. 표면적 증가에 따른 영향을 배재하기 위하여 표면적을 1007.589 mm^-1로 고정하고 분별침전 시간(6 시간, 12 시간, 18 시간 및 24 시간)에 따른 파클리탁셀의 수율과 순도를 확인하였다.

상기 침전용액 1은 저온(4 ~ 7 ℃)의 항온·항습기(KCL-2000W, EYELA, Japan)에 보관하여 파클리탁셀 침전물 1을 얻었다. 상기 파클리탁셀 침전물 1은 여과하고 35 ℃에서 24시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하여 건조 파클리탁셀 침전물 1을 제조하였다.

실시예 3.

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 건조 파클리탁셀 침전물을 제조하되, 반응액이 첨가된 침전기 내부에 실시예 1에서 제조한 표면적 증가체 2를 첨가하여 침전용액 2를 제조하였고, 이로부터 건조 파클리탁셀 침전물 2를 수득하였다.

비교예 1.

반응액이 첨가된 침전기 내부에 표면적 증가체를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 건조 파클리탁셀 침전물을 제조하였다.

비교예 2 ~ 4

실시예 1과 동일한 방법으로 표면적 증가체 3 내지 5를 제조하되, 알루미늄 전구체와 실리카 전구체의 몰비는 50 : 50, 20 : 80, 0 : 100으로 변화시켜주었고, 상기 몰비는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	몰비(%)
	알루미늄 전구체	실리카 전구체
표면적 증가체 3(분무용액 3)	50	50
표면적 증가체 4(분무용액 4)	20	80
표면적 증가체 5(분무용액 5)	0	100

또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 건조 파클리탁셀 침전물을 제조하되, 반응액이 첨가된 침전기 내부에 상기에서 제조한 표면적 증가체 3, 표면적 증가체 4 또는 표면적 증가체 5를 각각 첨가하여 침전용액 3, 침전용액 4 또는 침전용액 5를 각각 제조하였고, 이로부터 건조 파클리탁셀 침전물 3, 건조 파클리탁셀 침전물 4 또는 건조 파클리탁셀 침전물 5를 수득하였다.

실험예 1. 표면적 증가체의 물성분석

실시예 1에서 제조한 표면적 증가체 1 내지 2, 및 비교예 2 내지 4에서 제조한 표면적 증가체 3 내지 5의 질소 흡착/탈착 등온선은 200 ℃에서 전처리 후 마이트로메트릭스(Micrometrics)사의 ASAP 2000을 이용하여 -196 ℃에서 측정하였다. 상대압력 0.06 ~ 0.3 범위에서 흡착 데이터와 Brunauer-Emmett-Teller(BET)법을 이용하여 표면적을 계산하였다. 기공부피는 상대압력 0.995에서 흡착 부피로부터 계산하였으며 기공크기는 17 ~ 3000 Å 범위에서 탈착 등온선으로부터 Barrett-Joyner-Halenda(BJH)법을 이용하여 계산하였다. 계산한 결과는 표 3에 나타내었다.

구분	평균 표면적(㎡/g)	기공 부피(㎤/g)	기공의 평균 직경(㎚)
표면적 증가체 1	239	0.65	8.6
표면적 증가체 2	253	0.50	7.1
표면적 증가체 3	302	0.58	6.9
표면적 증가체 4	411	0.62	6.0
표면적 증가체 5	375	0.99	9.4

표 3에서 확인되는 바와 같이, 표면적 증가체 1 내지 5는 평균 표면적, 기공의 부피 및 기공의 평균 직경에서 특별한 차이가 없는 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 파클리탁셀 함량 분석

파클리탁셀 함량 분석을 위해, 실시예 2 내지 3 및 비교예 2 내지 4에서 제조한 건조 파클리탁셀 침전물 1 내지 5 및 비교예의 건조 파클리탁셀 침전물의 고속액체 크로마토그래피를 수행하였다.

상기 고속액체 크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography)은 미국 워터스(Waters)사의 HPLC 시스템 및 카펠 팍 C18(Capell Pak C18; 250×4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile) 및 증류수(distilled water) 혼합용액(65/35 ~ 35/65, v/v, gradient mode)을 유속(flow rate) 1.0 ㎖/분으로 흘려주었다. 시료 주입양은 20 ㎕ 이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다. 측정한 파클리탁셀 수율은 도면 1에 나타냈고, 측정한 파클리탁셀의 순도는 도면 2에 나타냈다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 표면적 증가체를 첨가하였을 때(실시예 2 내지 3 및 비교예 2 내지 4), 표면적 증가체를 첨가하지 않고 제조한 파클리탁셀 정제방법(비교예 1)에 비해 수율이 최대 3배 증가함을 알 수 있었다.

또한, 표면적 증가를 위해 표면적 증가체 1 내지 5 중 1종을 사용한 경우, 모두 파클리탁셀의 수율은 침전 시간에 따라 증가하였고 분별침전에 소요되는 시간도 단축할 수 있었다.

나아가, 표면적 증가체 1 또는 2를 사용한 경우(실시예 2 또는 3), 분별침전을 12시간 수행하였을 때 침전수율이 정상상태에 도달하였다. 하지만, 표면적 증가체 3 내지 5를 사용한 경우(비교예 2 내지 4), 분별침전을 18시간 수행하였을 때 침전수율이 정상상태에 도달하여, 본 발명의 실시예보다 오랜 시간 분별침전을 진행하여야 함을 확인할 수 있었다.

더불어, 분별침전 12 시간에서 표면적 증가체 1 또는 2를 첨가한 경우(실시예 2 또는 3)의 수율은 최대 76%로 비교예 1(표면적 증가가 없을 경우)의 23 %와 비교하여 약 3.3 배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 표면적 증가체에 따른 제타 포텐셜의 변화와 관계없이, 분별침전 시간에 따라 파클리탁셀 순도는 최대 약 80%로 비슷한 경향을 보였다.

따라서, 하기 도 1 및 도 2는 분별침전 시 표면적 증가체 1을 첨가하는 것이 가장 높은 수율(76%)로 고순도(81%)의 파클리탁셀을 얻을 수 있어 표면적 증가체로 가장 효과적임을 알 수 있었다. 또한, 표면적 증가체가 첨가되지 않을 경우에 비해 표면적 증가체를 첨가한 경우, 분별침전에 소요되는 시간을 18 시간(비교예 1 내지 4)에서 6 시간(실시예 2 내지 3)으로 획기적으로 단축할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 제타 포텐셜과 파클리탁셀 제조 수율의 연관성 분석

실리카 전구체 및 알루미나 전구체의 혼합비율에 따라 제타 포텐셜 값의 변화를 측정하였다. 상기 제타 포텐셜 값은 상기 실시예 2 내지 3 및 비교예 2 내지 4에서 제조한 침전용액 1 내지 5의 표면적 증가체와 반응액 사이의 제타 포텐셜 값의 변화를 측정하여 사용하였다.

상기 침전용액 1 내지 5를 ELS-Z(Photal, Japan)를 이용하여 제타 포텐셜(zeta potential)을 측정하였다. 측정된 제타 포텐셜은 ELS-Z software를 사용해 확인하였으며, 이를 통해 침전용액 1 내지 5에 부유해 있는 표면적 증가체의 제타 포텐셜 값을 확인하였다. 표면적 증가체 1 내지 5는 침전용액에 효과적으로 부유할 수 있어 제타 포텐셜 측정이 매우 용이하였다. 측정된 제타 포텐셜은 하기 표 4에 나타내었다.

구분	첨가한 표면적 증가체	제타 포텐셜(zeta potential, mV)
침전용액 1	표면적 증가체 1	35.41
침전용액 2	표면적 증가체 2	8.16
침전용액 3	표면적 증가체 3	-23.08
침전용액 4	표면적 증가체 4	-23.95
침전용액 5	표면적 증가체 5	-21.57

또한, 실리카 전구체 및 알루미나 전구체의 혼합비율에 따라 제타 포텐셜 값과 수율과의 연관성을 알아보기 위해, 상기 표 4의 제타 포텐셜 값과 분별침전 6시간 후의 파클리탁셀 수율을 그래프로 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 알루미나의 첨가 비율이 증가할수록 제타 포텐셜 값이 증가함을 알 수 있었으며, 제타 포텐셜 값이 증가함에 따라 제조되는 파클리탁셀의 수율도 비례하여 증가함을 알 수 있었다.

따라서, 같은 시간 동안 분별침전 수행할 경우, 표면적 증가체 1을 첨가하는 것이 가장 높은 수율(약 68%)로 파클리탁셀을 제조할 수 있어 표면적 증가체로 가장 효과적임을 알 수 있었다. 또한, 실리카 및 알루미나를 20 : 80으로 첨가하여 제조한 표면적 증가체 2도 표면적 증가체 3 내지 5보다 파클리탁셀의 제조 수율을 약 2배 향상시키는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 침전물 형태 및 크기 분석

분별침전을 통해 수득한 침전물의 형태 및 크기를 분석하기 위해, 실시예 2 내지 3 및 비교예 2 내지 4에서 제조한 파클리탁셀 침전물 1 내지 5는 전자현미경(SV-35 Video Microscope System, Some Tech., Korea)을 이용하여 분석하였다.

상기 전자현미경은 파클리탁셀 침전물을 고 배율(×100)에서 관찰하였다. 관찰한 파클리탁셀 침전물은 IT-Plus software(Some Tech., Korea)에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 파클리탁셀 침전물의 형태 및 크기를 확인하였다. 분별침전 시간에 따라 전자현미경으로 관찰한 파클리탁셀 침전물의 결과는 도면 4에 나타냈다. 또한, 상기 전자현미경으로 관찰한 파클리탁셀 침전물의 평균 직경과 분별침전 시간의 상관 그래프를 도면 5에 나타냈다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 파클리탁셀 침전물은 핵을 중심으로 가지가 성장하며 전체적으로 바늘 형태를 띠었다. 하지만 제타 포텐셜 값이 양(+)의 값으로 증가함에 따라 더 얇은 바늘형태의 침전물이 생성되며, 음(-)의 값으로 증가할수록 두꺼운 바늘의 형태를 띠는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 분별침전 시간(6 ~ 12 시간)이 경과함에 따라 파클리탁셀 침전물의 형태가 핵을 중심으로 가지가 많아지며 성장하는 것을 알 수 있었으며, 분별침전 12 시간 이후부터는 침전물의 개수가 많아지고 입자 크기는 작아지는 것을 알 수 있었다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 동일한 분별침전 시간에서는 표면적 증가체를 첨가하지 않은 비교예 1에 비해 표면적 증가체를 첨가하였을 경우(실시예 2 내지 3 및 비교예 2 내지 4)에서 파클리탁셀 침전물의 크기가 상당히 감소함을 알 수 있었다.

따라서, 같은 시간 동안 분별침전을 수행할 경우, 표면적 증가체 1을 첨가하는 것이 작은 크기의 파클리탁셀 침전물을 제조하는데 가장 바람직한 것을 알 수 있었다.

또한, 동일한 분별침전 시간(18 시간)에서 상기에서 측정한 파클리탁셀 침전물 입자 크기와 실험예 3에서 측정한 제타 포텐션과의 관계를 도면 6에 나타내었다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 파클리탁셀 침전물 입자 크기는 표면적 증가체의 첨가에 따른 용액의 제타 포텐셜 값과 연관성이 있었으며, 분별침전 용액의 제타 포텐셜 값이 증가할수록 분별침전을 통하여 얻은 파클리탁셀 침전물 입자의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

일반적으로 원료의약품(active pharmaceutical ingredient, API)의 경우, 결정화 과정에서 의약품 결정 크기를 작게 하여 그 활용도를 높이고자 한다. 결정입자의 크기가 작아질수록 제형 시 용해 속도(dissolution rate), 약 분산의 균등성(uniformity of drug dispersion), 생체 이용률(oral bioavailability) 등을 향상시킬 수 있는 장점을 가지기 때문이다. 또한 결정 입자 크기가 작을수록 정제 후 건조단계에서 잔류수분 및 잔류용매 제거에도 상당히 도움이 되기 때문이다. 이러한 측면에서 본 발명의 분별침전 공정에서 표면적 증가체에 의한 파클리탁셀 입자 크기 감소는 의약품의 활용 측면에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

Claims (12)

1. 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(Biomass) 및 수용성 유기용매를 포함하는 혼합물을 추출로부터 추출액을 제조하는 1단계;
   상기 추출액과 비극성 유기용매를 혼합한 후 액-액 추출하여 조추출물을 제조하는 2단계;
   상기 조추출물, 비극성 유기용매 및 흡착제를 혼합한 후 여과하여 여과액을 제조하는 3단계;
   상기 여과액 및 비극성 유기용매를 포함하는 혼합용액을 비수용성 유기용매에 첨가하여 침전물을 제조하는 4단계;
   상기 침전물, 수용성 유기용매 및 표면적 증가물질을 포함하는 반응액을 제조하는 5단계; 및
   상기 반응액을 1 ~ 10 ℃에 보관하여 파클리탁셀 침전물을 수득하는 6단계;를 포함하며,
   상기 표면적 증가물질은 다공성 실리카와 다공성 알루미나를 0.01 ~ 20 : 80 ~ 99.99 중량비로 포함하거나 또는 상기 표면적 증가물질은 다공성 알루미나만을 포함하며,
   상기 표면적 증가물질은 평균 표면적이 220 ~ 260 ㎡/g이고, 표면적 증가물질의 기공 부피 평균은 0.5 ~ 0.7 cm³/g이며, 표면적 증가물질의 기공의 평균 직경은 6.5 ~ 9.0 ㎚이며,
   6단계의 반응액을 6시간 동안 분별침전 수행시, 파클리탁셀의 수율이 55% ~ 69%이고, 6단계의 반응액을 12시간 동안 분별침전 수행시 파클리탁셀의 수율이 70% ~ 85%인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 택서스속 식물체 유래 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액 유래 바이오매스인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 수용성 유기용매는 C₁ ~ C₅의 알코올 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름 (chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 핵산(hexane) 및 벤젠(benzene)으로 이루어진 군 중 1종 이상인 파클리탁셀 정제방법.
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7. 제1항에 있어서, 상기 흡착제는 활성탄(activated carbon), 백토(active clay), 실로퓨트(sylopute) 및 실리카(SiO₂)로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 6단계의 반응액 보관은 6 ~ 18 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.
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10. 다공성 실리카 및 다공성 알루미나를 0.01 ~ 20 : 80 ~ 99.99 중량비로 포함하는 표면적 증가체; 또는 다공성 알루미나;를 포함하는 표면적 증가체;이고,
    상기 표면적 증가체는 평균 표면적이 220 ~ 260 ㎡/g이고, 표면적 증가물질의 기공 부피 평균은 0.5 ~ 0.7 cm³/g이며, 표면적 증가물질의 기공의 평균 직경은 6.5 ~ 9.0 ㎚이며
    파클리탁셀, 메탄올 및 물을 포함하는 혼합물에 상기 표면적 증가체를 첨가하면 제타 포텐셜(zeta potential)이 0 ~ 40 mV인 파클리탁셀 분별침전용 표면적 증가체.
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