KR101125538B1 - 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물세포 배양액으로부터 항암물질인 파클리탁셀을 효율적으로 전처리하기 위한 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법에 관한 것으로, 분별침전 공정 시 이온교환수지와 유리비드를 사용하여 반응액 부피당 표면적(surface area per working volume, S/V) 증가에 의해 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 파클리탁셀의 정제 방법은 흡착제 처리 및 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정으로 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 분별침전 공정 시 반응액 부피당 표면적을 증가시켜 높은 수율 향상 및 침전시간을 단축시킬 수 있어 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있고, 효율적이며 경제적인 방법으로 이차대사산물의 정제공정에도 유용하다.

파클리탁셀 정제, 흡착제, 마이셀, 분별침전, 이온교환수지, 유리비드

Description

마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법{Method of micelle-fractional precipitation hybrid process for the purification of paclitaxel}

본 발명은 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법에 관한 것으로, 흡착제 처리 및 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정으로 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리할 수 있으며, 분별침전 공정 시 반응액 부피당 표면적 증가에 의해 높은 수율 향상 및 침전시간을 단축시킬 수 있고 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법에 관한 것이다.

파클리탁셀(paclitaxel)은 현재 가장 효과 있는 디터페노이드(diterpenoid) 계열의 항암물질로 1971년 Wani 등에 의하여 파클리탁셀의 화학적 구조가 규명되었으며 1979년 Schiff 등에 의하여 항암 기작이 밝혀졌다. 파클리탁셀은 독특한 항암 기작으로 주목 받았는데 기존의 항암제와는 다른 방식인 유사분열기의 암세포 분열을 억제함으로써 비교적 낮은 독성과 강력한 항암활성으로 1990년대부터 가장 널리 이용 되고 있는 항암제이다. 난소암(refractory ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 카포시 종양(kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 등의 치료에 대해 미국 FDA(U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하였으며, head & neck tumor, 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적응증이 계속 확대되고 있다. 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상시험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다.

파클리탁셀의 주요 생산 방법에는 첫째, 주목나무(yew tree)에서 직접 추출(extraction)하는 방법이 있는데 이 방법은 주목 나무의 수피로부터 분리 및 정제하므로 원료의 계속적인 공급이 어렵고, 정제과정에서 고비용이 요구되며 자원과 생태계 파괴의 문제점을 야기한다. 둘째, 주목나무의 잎으로부터 전구체를 얻어 side chain을 화학적으로 결합하는 반합성(semisynthesis) 방법이 있는데 이 방법 역시 전구체를 주목나무에서 직접 얻어야 하므로 환경보호수인 주목나무(yew tree) 보호에 적합하지 않다. 셋째로 주목나무에서 callus를 유도하고 종균배양(seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이 있다. 식물세포 배양 방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

식물세포 배양으로부터 파클리탁셀을 생산하기 위해서는 여러 단계의 분리 및 정제 공정을 거치게 되는데, 일반적으로 세포배양액으로부터 회수한 바이오매스(biomass)를 유기용매로 먼저 추출하고, 전처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다. 이 과정에서 특히 전처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들은 정제를 위한 전처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전처리 없이 추출을 거친 crude 제품을 HPLC(high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하는 방법을 채택하여 많은 양의 유기용매 사용, column packing material(resin)의 수명 단축, 처리량(throughput) 감소 등 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며, scale-up에 많은 어려움이 따른다.

파클리탁셀의 정제방법에 관한 공지기술은 하기와 같다.

국제특허 공개공보 제2000/40573호는 파클리탁셀 함유물질에서 액체/액체 추출공정으로부터 얻은 낮은 순도의 농축물을 실리카 컬럼을 통해 1차 정제한 후 아세톤/물 용액을 이용하여 침전시키고, 실리카 컬럼과 결정화를 반복함으로써 고순도의 파클리탁셀을 얻는 공정이 제시하고 있다. 그러나 고순도의 파클리탁셀을 얻기 위해서는 총 3회의 실리카 크로마토그래피의 수행과 2번의 결정화 단계를 반복적으로 수행하여야 하며, 이에 따라 많은 용매와 시간이 소요될 뿐만 아니라, 아세톤/물 용액을 이용한 침전 방법이 선행되어야 했으며 회수율이 49 ~ 73 %로 현저히 떨어지는 단점이 있다.

국제특허 공개공보 제2000/078741호는 택산(taxanes)의 천연 원료를 유기용매로 추출하고, 염기 또는 산으로 침전물을 형성시키고, 이를 아세톤으로 녹여 핵산에 의한 퍼칼라라이징(percolorizing)으로 수지 및 색소를 제거하고, 염기 또는 산으로 침전물을 형성하고, 1회 이상의 크로마토그래피 실시 및 1회 이상의 아세톤과 핵산에 의한 결정화 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 일반적으로 파클리탁셀은 산 또는 염기 조건에서 10-디아세텔파클리탁셀 및 바카틴 Ⅲ으로 분해되는 것으로 알려져 있어, 파클리탁셀을 고수율로 정제하기 어려울 뿐만 아니라, 복잡한 과정으로 인해 다수의 시간이 소요되는 문제가 있다.

또한 2000년 분별침전(fractional precipitation) 공정에 의해 높은 순도(>50%)의 파클리탁셀을 얻을 수 있는 효율적인 전처리 방법이 개발되었으나 침전에 많은 시간(~3 days)이 소요되어 대량생산 공정에 응용되는데 많은 어려움이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정과 용해도 차이를 이용한 분별침전 공정을 접목한 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법을 제공하는데 목적이 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 흡착제 처리 및 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정으로 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리할 수 있으며, 분별침전 공정 시 반응액 부피당 표면적 증가에 의해 높은 수율 향상 및 침전시간을 단축시킬 수 있고 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 안출된 것으로, 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명은 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법 에 관한 것으로,

(a) 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 수용성 유기용매를 첨가하여 추출한 후 추출액을 감압 농축하고,

(b) 상기 농축액에 비극성 유기용매를 첨가하여 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하고,

(c) 상기 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1건조물을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻은 여액을 건조하는 단계;

(d) 상기 여액을 건조하여 얻은 제2건조물을 비수용성 유기용매와 양이온계면활성제의 혼합액에 넣고, 교반한 후 정체시켜 상 분리 후 마이셀이 형성된 양이온계면활성제 층을 회수하고,

(e) 상기 회수된 양이온계면활성제 층에 비수용성 유기용매를 더 첨가하여 교반한 후 정체시켜 상 분리 후 비수용성 유기용매 층을 회수하고, 이를 감압 농축 및 건조하고,

(f) 상기 비수용성 유기용매 층을 회수하고, 이를 감압 농축 및 건조하여 얻은 제3건조물을 수용성 유기용매와 물의 혼합용매에 첨가한 후 이온교환수지 또는 유리비드를 넣고 교반한 다음 정체시켜 분별 침전된 침전물을 회수한 후 여과하는 것을 포함한다.

본 발명의 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액은 파클리탁셀 함유물질을 의미하는 것으로, 상기 택서스속(Taxus genus) 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana ), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (a) 과정에서 사용되는 수용성 유기용매는 바이오매스(biomass)로부터 파클리탁셀을 추출하기 위해 사용되며, 본 발명에 사용되는 수용성 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스(biomass)로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 (a) 과정에서 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스(biomass)를 메탄올에 0.1 ~ 100 %(w/v), 바람직하게는 1 ~ 50 %(w/v)로 첨가한 후 실온에서 30분 동안 교반하여 추출 및 여과하는 공정을 2회 이상 반복하여 바이오매스(biomass) 유래 파클리탁셀 유도체를 추출할 수 있다.

상기 (b) 과정에서 사용되는 비극성 유기용매는 수용성 유기용매와의 상 분리를 통하여 파클리탁셀 유도체에 함유된 극성불순물을 제거하는 역할을 하며, 본 발명에 사용되는 비극성 유기용매의 구체적인 예로는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 1 내지 3회의 액체-액체 추출을 수행함으로써 파클리탁셀 유도체에 함유된 극성불순물을 가장 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 (a) 과정에서 파클리탁 셀 유도체 추출에 사용된 수용성 유기용매가 알콜인 경우, 메틸렌 클로라이드가 액체-액체 추출에 일반적으로 사용된다. 메틸렌 클로라이드는 알콜 농축액의 20 ~ 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다.

상기 (c) 과정에서 사용되는 흡착제는 실리카계 흡착제를 사용하는 것이 바람직하며, 실리카계 흡착제를 사용하는 경우, 바이오매스(biomass) 유래 왁스, 타르 등의 불순물을을 효과적으로 제거할 수 있으며, 파클리탁셀의 순도 및 정제 공정의 효율성을 높이는데 효과적이다.

상기 (c) 과정의 흡착제 처리는 흡착제를 상기 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1건조물의 20 ~ 100 %(w/w)로, 바람직하게는 20 ~ 60 %(w/w)로 첨가하고, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 더 첨가하여 20 ~ 60 ℃에서 30분 동안 교반한 후 여과하여 얻은 여액을 건조하는 것으로, 상기 범위의 흡착제를 사용할 경우 바이오매스(biomass) 유래 불순물을을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한 (c) 과정의 흡착제 처리에 사용되는 유기용매는 파클리탁셀에 대해서는 친화성이 강하고 타르 및 왁스 성분들과 같은 불순물들과는 친화성이 약해야 한다.

상기 (d) 및 (e) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 헥산, 벤젠에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 상기 (d) 과정에 사용되는 비수용성 유기용매는 양이온계면활성제 층과의 상 분리를 통한 비극성불순물의 효율적인 제거에 목적이 있고, (e) 과정에 사용되는 비수용성 유기용매는 마이셀에 포함되어 있는 파클리탁셀을 회수하는데 그 목적이 있다. 상기 (d) 과정의 비수용성 유기용매로 가장 바람직하게는 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether)와 헥산의 혼합물이 사용될 수 있고, 상기 (d) 과정의 비수용성 유기용매로 가장 바람직하게는 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether)를 사용할 수 있다.

본 발명의 (d) 과정은 마이셀(micelle) 공정으로 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 형성 및 상 분리(phase separation)에 의하여 불순물을 제거하는 방법이다. 마이셀 형성에 사용되는 양이온계면활성제는 N-세틸프리디늄 클로라이드(N-cetylpridinium chloride), 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드(hexadecyltrimethylammonium chloride), 도데실트리메틸암모늄 클로라이드(dodecyltrimethylammonium chloride)에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물이 사용될 수 있으며, 도 1에서 보이는 바와 같이 상기 양이온계면활성제는 친수성(5) (hydrophilic)과 소수성(6) (hydrophobic)으로 구성되어 있는데 마이셀(4) 내부로는 물에 녹지 않는 파클리탁셀(7)을 hydrophobic tail group이 감싸게 되고, 외부로는 hydrophilic head group이 있어 수용액에 용해될 수 있다. 상기 (d) 과정의 마이셀 공정에서 비수용성 유기용매 층(1)은 파클리탁셀을 포함한 양이온계면활성제 층(3)과 상 분리(2)되어 파클리탁셀이 포함되어 있는 양이온계면활성제 층으로부터 불순물들을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한 본 발명의 마이셀 공정에 사 용된 양이온계면활성제는 수용액 상태로 사용하는 것이 좋으며, 양이온계면활성제를 수용액의 1 ~ 20 %(w/v), 가장 좋게는 5 ~ 15 %(w/v)로 사용하는 것이고, 상기 범위의 양이온계면활성제 수용액을 사용하는 경우, 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리하는데 효과적이다.

상기 (f) 과정은 수용성 유기용매에서 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용한 분별침전 공정으로 도 2에 분별침전 공정의 개략도를 나타내었다. 분별침전은 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 정제할 수 있는 매우 간편한 방법으로, 용해도 차이를 이용하여 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있는 대표적인 전처리 공정이다. 그러나 종래의 분별침전 공정은 분별침전에 소요되는 시간(~3 days)이 매우 길어 대량 분리 및 정제에 많은 어려움이 있었다. 따라서 본 발명에서는 도 2에서 보는 바와 같이 분별침전 공정 시 이온교환수지(14) (ion exchange resin)와 유리비드(14) (glass bead)를 사용하여 분별침전에 필요한 반응기 내 표면적을 증가시켜 실험을 수행하였다.

(f) 과정에 사용되는 수용성 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 상기 (f) 과정에 사용되는 수용성 유기용매는 파클리탁셀을 녹일 수 있어야 하며 증류수 첨가에 의해 용해도 차이를 유발하여 파클리탁셀 침전에 효과적이어야 한다.

또한 상기 (f) 과정은 수용성 유기용매(13)가 혼합용매의 50 ~ 70 %(v/v)가 되도록 물(12)을 더 첨가하여 분별침전 공정을 수행하는 것이 바람직하며, 상기 범위에서 파클리탁셀이 결정화되어 침전물(15) 형성이 가능해진다.

상기 (f) 과정에서 사용되는 이온교환수지는 양이온교환수지, 음이온교환수지 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하며, 상기 양이온교환수지 및 음이온교환수지는 스티렌계 기본구조를 가질 수 있다. 이온교환수지 첨가량은 분별침전을 위한 반응액 부피당 표면적(S/V)이 0.428 mm^-1인 것이 가장 바람직하다.

또한 상기 (f) 과정에서 사용되는 이온교환수지의 평균입경은 0.3 ~ 1.5 mm인 것이 바람직하며, 상기 범위일 때 주어진 분별침전 시간에서 높은 순도 및 수율을 얻을 수 있다.

본 발명의 (f) 과정에서 반응액 부피당 표면적(surface area per working volume, S/V) 증가를 위해 이온교환수지 대신 유리비드를 사용할 수 있으며, 유리비드의 평균입경은 0.5 ~ 0.8 mm인 것을 사용하는 것이 좋고, 상기 범위일 때 주어진 분별침전 시간에서 높은 순도 및 수율을 얻을 수 있다.

또한 본 발명의 (f) 과정은 1 ~ 10 ℃의 저온에서 수행되며, 상기 온도범위에서 분별침전 공정을 하게 되면 높은 파클리탁셀 순도 및 수율을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법은 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정과 용해도 차이를 이용한 분별침전 공정을 접목한 마이셀-분별침전 하이브리드 공정으로, 보다 구체적으로는 흡착제 처리 및 양이온계면활성제를 이용한 마이셀 공정으로 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 분별침전 공정 시 반응액 부피당 표면적 증 가에 의해 높은 수율 향상 및 침전시간을 단축시킬 수 있어 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있고 효율적이고 경제적인 방법으로 대량 생산이 가능한 효과가 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 이는 발명의 구성 및 효과를 이해시키기 위한 것 일뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[시험예 1] 파클리탁셀의 분석방법

분별침전 공정에서 파클리탁셀 침전물 형태 확인 및 크기 측정을 위해 전자현미경 SV-35 Video Microscope system(Some Tech., Korea)을 사용하였으며, 고배율(×100)에서 관찰 하였다. 관찰된 파클리탁셀 침전물은 IT-Plus system(Some Tech., Korea)에서 동화상으로 확인하였으며, 이를 통해 파클리탁셀 침전물의 형태 및 크기를 확인하였다.

또한 HPLC(Waters)를 사용하여 파클리탁셀의 함량을 분석하였으며, 모든 분석 시료는 3개씩 취하여 분석 후 평균값으로 함량을 결정하였다. 분석에 사용한 컬럼은 Capcell Pak C18 UG 120 (250 mm × 4.6 mm, Shiseido, Japan), 컬럼 온도는 40 ℃, 이동상은 acetonitrile/water (65/35~35/65, v/v gradient), 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 20 μL이며, UV(227 nm) detector를 사용하였다. 파클리탁셀 표준물질은 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95 %)을 사용하였다.

[제조예 1] 식물세포 배양

본 실험에 사용된 식물세포 배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 데칸더 원심분리기(Westfalia, CA 150 Clarifying Decanter)를 이용하였으며, 식물 세포조각(debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기(α-Lavel, BTRX 205 GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 본 발명에서는 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스(biomass)라 한다.

[실시예 1] 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제

세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스(biomass)를 메탄올에 1 %(w/v)로 첨가하여 실온에서 30분 동안 추출 및 여과하고, 바이오매스(biomass)에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 농축(원액의 30 %)하고 농축액에 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 첨가(농축액의 25 %)하고 실온에서 30분 동안 액체-액체 추출을 3회 반복 수행하여 극성불순물을 제거한 후 감압 농축 및 건조하였다. 상기 액체-액체 추출 한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1건조물(파클리탁셀 순도: 8 %)에 흡착제인 sylopute(Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan) 50 %(w/w)와 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 40 ℃에서 30분 동안 교반한 후 여과하였다. 여액은 30 ℃, 감압상태에서 건조하여 마이셀 공정에 이용하였다. 상기 여액을 건조하여 얻은 제2건조물을 MtBE(methyl-t-butyl-ether) 25 mL에 녹인 후 5 %(w/v) 양이온계면활성제인 CPC(N-cetylpridinium chloride) 수용액 12.5 mL와 헥산 25 mL를 넣고 실온에서 교반하였다. 30분 동안 교반 후 정체시켜 상 분리 후 마이셀이 형성되어 있는 양이온계면활성제 층을 회수하였으며, 동일한 조건으로 4회 반복 실험을 수행하였다. 4회 반복 실험을 통하여 회수한 양이온계면활성제 층에 다시 MtBE를 넣어 계면활성제 층으로부터 마이셀을 분해시켜 줌으로써 파클리탁셀은 MtBE 층으로 회수되며, 동일한 방법으로 4회 반복 실험을 수행하였다. 상기 회수된 MtBE 층을 감압 농축 및 건조하여 얻은 제3건조물을 메탄올에 용해하고, 메탄올이 61.5 %(v/v)가 될 때까지 증류수를 떨어뜨렸다. 반응액 부피 당 표면적을 증가시키기 위해 양이온교환수지로 평균입경이 0.5 mm인 Amberlite IR-120(styrene-divinylbenzene(gel), Rohm and Haas, USA)를 넣은 후 4 ℃에서 각각 6시간, 9시간, 12시간, 15시간 동안 냉장 보관하여 파클리탁셀 침전물을 얻었다. 상기 파클리탁셀 침전물을 여과하고 35 ℃에서 24 시간 동안 진공 건조하여 HPLC로 분석 하였다.

[실시예 2]

양이온교환수지로 평균입경이 0.5 mm인 Amberlite 200(styrene-divinylbenzene(copolymer), Rohm and Haas, USA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 3]

양이온교환수지 대신 음이온교환수지로 평균입경이 0.5 mm인 Amberlite IRA-400(styrene-divinylbenzene(gel), Rohm and Haas, USA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 4]

양이온교환수지 대신 음이온교환수지로 평균입경이 0.5 mm인 Amberlite IRA-96(styrene-divinylbenzene(macroreticular), Rohm and Haas, USA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 5]

양이온교환수지 대신 평균입경이 0.7 mm인 유리비드(Glastechnigue Mfg, Germany를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[비교예 1]

양이온교환수지를 사용하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[비교예 2]

양이온교환수지 대신 비이온교환수지로 평균입경이 0.5 mm인 Amberlite XAD-16(polystyrene(apolar), Rohm and Haas, USA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[비교예 3]

양이온교환수지 대신 비이온교환수지로 평균입경이 0.25 mm인 DIAION HP 20(styrene-DVB, Mitsubishi, Japan)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

하기 표 1은 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1 ~ 3에서 분별침전 9시간 경과 후 정 제된 파클리탁셀의 수율 및 순도를 나타낸 것이다.

[표 1]

본 발명에서는 기초실험을 통하여 선정한 최적의 반응액 부피당 표면적(S/V)인 0.428 mm^-1으로 고정하여 실험을 수행하였으며, 마이셀 공정을 거친 순도 45 %의 파클리탁셀 시료를 분별침전하여 파클리탁셀을 정제하였다.

상기 표 1을 통하여 반응액 부피당 표면적을 증가시키지 않은 비교예1(control)에 비해 양이온교환수지(Amberlite IR-120, Amberlite 200), 음이온교환수지(Amberlite IRA 400, Amberlite IRA 96) 및 유리비드(glass bead) 첨가에 의한 반응액 부피당 표면적(0.428 mm^-1) 증가에 의해 주어진 분별침전 시간(9시간)에서 수율을 상당히 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 부피당 표면적을 증가시키지 않은 비교예 1(control)의 경우에 비해 주어진 분별침전 시간(9시간) 동안 수율 측면에서 많은 증가효과가 있음을 알 수 있었다. 특히, 양이온교수지인 Amberlite 200의 경우 가장 높은 수율(~85 %) 및 순도(~87 %)를 얻을 수 있었다. 반면 비이온 교환수지(Amberlite XAD-16, DIAION HP 20)의 경우에는 침전이 전혀 형성되지 않아 표면적 증가에 의한 효과가 전혀 없음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 비이온교환수지의 경우 수지 표면이 비극성(hydrophobic)을 띄고 있어 파클리탁셀을 포함한 소수성 물질들이 강하게 흡착되는 것으로 판단된다. 또한 각각의 분별침전 조건에서 얻은 파클리탁셀 침전물의 형태 확인을 위해 전자현미경으로 측정한 결과 도 3에서 보는 바와 같이 양이온교환수지, 음이온교환수지, 유리비드(glass bead) 및 control의 경우에는 침전이 형성되어 있음을 확인할 수 있는 반면 비이온교환수지의 경우에는 전혀 침전이 형성되지 않음을 확인할 수 있었다.

도 4는 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1 ~ 3의 분별침전 시간에 따른 파클리탁셀의 수율(a) 및 순도(b)를 나타낸 것으로, 양이온교환수지(Amberlite 200)와 음이온교환수지(Amberlite IRA-400), 유리비드(glass bead) 첨가에 의해 표면적을 증가 시킨 경우와 표면적을 증가시키지 않은 control 경우의 침전시간 경과에 따른 침전 효과를 알아보기 위한 것이다. 도 4에서 보는 바와 같이 반응액 부피당 표면적(S/V)을 증가시킬 경우 control에 비해 동일한 침전시간에서 높은 수율을 얻을 수 있었다. 특히 양이온교수환수지인 Amberlite 200의 경우 침전 12시간 경에 대부분의 파클리탁셀을 회수(>98%) 할 수 있었다. 또한 침전 12시간 경과 이후부터는 수율 증가 효과가 거의 없음을 알 수 있었다. 반면 순도의 경우 침전시간 경과에 따라 점점 증가하다 침전 9시간 이후부터는 반응액 부피당 표면적(S/V)의 증가에 관계없이 순도(~85%) 변화가 거의 없었다. 전반적으로 침전 초기에 순도가 낮은 반면에 침전 시간이 경과함에 따라 순도가 점점 증가하는 경향을 보이는데, 이는 침 전 초기에는 상대적으로 불순물이 많이 침전되고 침전시간이 경과함에 따라 불순물의 침전이 감소하는 것으로 판단된다. 양이온교환수지와 음이온교환수지의 경우 유리비드(glass bead)나 control에 비해 상대적으로 침전 초기(6시간)에 높은 순도의 파클리탁셀을 얻을 수 있는데, 이는 침전 초기에 양이온교환수지와 음이온교환수지 표면의 charge가 불순물들을 흡착하여 제거함으로써 침전 효율(순도 향상)을 향상시키는 것으로 판단된다.

도 1은 파클리탁셀 전처리를 위한 마이셀 기반 분리 공정의 원리 및 개략도를 나타낸 것이다.

<도면의 주요 부분에 대한 설명>

1: 비수용성 유기용매 층 5: 친수성

2: 상 분리 6: 소수성

3: 양이온계면활성제 층 7: 파클리탁셀

4: 마이셀

도 2는 본 발명에 따른 분별침전 공정의 개략도를 나타낸 것이다.

<도면의 주요 부분에 대한 설명>

11: 펌프 14: 이온교환수지 또는 유리비드

12: 물(증류수) 15: 파클리탁셀 침전물

13: 수용성 유기용매 16: 반응기

도 3은 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1 ~ 3에 따른 분별침전 9시간 후, 파클리탁셀 침전물의 전자현미경 사진으로 (A)는 실시예 1의 파클리탁셀 침전물, (B)는 실시예 2의 파클리탁셀 침전물, (C)는 실시예 3의 파클리탁셀 침전물, (D)는 실시예 4의 파클리탁셀 침전물, (E)는 실시예 5의 파클리탁셀 침전물, (F)는 비교예 1의 파클리탁셀 침전물, (G)는 비교예 2의 파클리탁셀 침전물, (H)는 비교예 3의 파클리탁셀 침전물 사진을 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1 ~ 3의 분별침전 시간에 따른 파클리탁셀의 수율(a) 및 순도(b)를 나타낸 것이다.

Claims (11)

1. (a) 택서스속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 수용성 유기용매를 첨가하여 추출한 후 추출액을 감압 농축하고,

   (b) 상기 농축액에 비극성 유기용매를 첨가하여 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하고,

   (c) 상기 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1건조물을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻은 여액을 건조하는 단계;

   (d) 상기 여액을 건조하여 얻은 제2건조물을 비수용성 유기용매와 양이온계면활성제의 혼합액에 넣고, 교반한 후 정체시켜 상 분리 후 마이셀이 형성된 양이온계면활성제 층을 회수하고,

   (e) 상기 회수된 양이온계면활성제 층에 비수용성 유기용매를 더 첨가하여 교반한 후 정체시켜 상 분리 후 비수용성 유기용매 층을 회수하고, 이를 감압 농축 및 건조하고,

   (f) 상기 비수용성 유기용매 층을 회수하고, 이를 감압 농축 및 건조하여 얻은 제3건조물을 수용성 유기용매와 물의 혼합용매에 첨가한 후 양이온교환수지, 음이온교환수지 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 어느 하나인 이온교환수지 또는 유리비드를 넣고 교반한 다음 정체시켜 분별 침전된 침전물을 회수한 후 여과하는 것을 포함하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 (a) 및 (f) 과정에서 사용되는 수용성 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물이고, (b) 과정에서 사용되는 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 에테르에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물이며, (d) 및 (e) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methylt-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 헥산, 벤젠에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
3. 제 2항에 있어서,

   상기 (d) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether)와 헥산의 혼합물이고, 상기 (e) 과정에서 사용되는 비수용성 유기용매는 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether)인 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 (c) 과정에서 사용되는 흡착제는 실리카계 흡착제를 사용하는 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 (c) 과정의 흡착제 처리는 흡착제를 상기 액체-액체 추출한 후 감압 농축 및 건조하여 얻은 제1건조물의 20 ~ 100 %(w/w)로 첨가하고, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 더 첨가하여 교반하는 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 (d) 과정에서 사용되는 양이온계면활성제는 N-세틸프리디늄 클로라이드(N-cetylpridinium chloride), 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드(hexadecyltrimethylammonium chloride), 도데실트리메틸암모늄 클로라이드(dodecyltrimethylammonium chloride)에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
7. 삭제
8. 제 1항에 있어서,

   상기 (f) 과정에서 사용되는 이온교환수지의 평균입경은 0.3 ~ 1.5 mm인 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
9. 제 1항에 있어서,

   상기 (f) 과정에서 사용되는 유리비드의 평균입경은 0.5 ~ 0.8 mm인 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
10. 제 1항에 있어서,

    상기 (f) 과정은 1 ~ 10 ℃의 저온에서 수행되는 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.
11. 제 1항에 있어서,

    상기 (f) 과정은 수용성 유기용매가 혼합용매의 50 ~ 70 %(v/v)가 되도록 물을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 마이셀-분별침전 하이브리드 공정에 의한 파클리탁셀의 정제 방법.

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