KR20130028294A - 개과 동물의 와튼 젤리-유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 특성화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 다분화능 줄기세포, 상기 다분화능 줄기세포를 분화시키는 방법 및 상기 다분화능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포는 개의 조직에서 유래되어, 연골세포, 골세포, 지방세포, 신경세포 등의 중배엽 유래 세포로 용이하게 분화될 수 있으므로, 애완동물관련 시장에서 개의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

개과 동물의 와튼 젤리-유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 특성화{Isolation and characterization of canine wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells}

본 발명은 개과 동물의 와튼 젤리-유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 특성화에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 다분화능 줄기세포, 상기 다분화능 줄기세포를 분화시키는 방법 및 상기 다분화능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.

이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells; MSCs)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다 (C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 공급원이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기 세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다.

개과 동물(canine)은 말과(Canidae)에 속하는 포유류 동물이며, 고양이와 함께, 인간과 가장 가까이 생활하는 매우 드문 종류의 동물이다. 개과 동물은 사람과 함께 생활공간을 공유하고 노년까지도 함께 생활하기 때문에, 개과 동물과 관련된 산업은 범세계적인 산업을 이루고 있다. 이처럼 생활환경을 공유하는 개과 동물이 부상을 당할 경우, 그 치유가 문제되므로, 세포 치료제의 개발의 중요성이 부각되어 왔다. 인간과 쥐 유래의 줄기세포는 여러 종래기술에서 시도되어 왔으나, 개과 동물의 경우, 애완동물 시장과 관련하여, 그 근육, 뼈, 연골, 힘줄 또는 근육의 치료를 위한 세포 치료제로서의 필요성이 큼에도 불구하고 아직 연구가 미진한 상황이다.

한편, 성체줄기세포를 세포 치료제로 사용하기 위해서 현 기술단계에서는 미분화 상태가 유지될 수 있는 배양 조건이 규격화되어야 하며, 이와 더불어, 조직으로부터 분리한 성체줄기세포는 다종의 세포가 혼합된 상태이기 때문에, 균질의 성체줄기세포를 다량 배양할 수 있는 기술도 해결해야 할 문제점 중에 하나이다. 특히 조직 또는 혈액으로부터 성체줄기세포를 분리하는 방법은 통상적으로 다수의 표면항원에 대한 항체를 이용한 Cell sorting을 예로 들 수 있다. 상기 방법은 성체줄기세포의 표면항원을 파악하고 있어야 한다는 한계가 있으며, 문제는 성체줄기세포 공통의 표면항원(이하, 마커)이 밝혀지지 않았고, 또한 성체줄기세포 마커가 다양하게 개발되어 있지 않은 상태이며, 알려진 마커도 분화상태에 따라서 발현 정도가 다르며, 특히 Sorting하는 장비가 고가라는 점에서 활용하는데 제약이 많다.

인간의 제대조직의 구성요소인 와튼 젤리는 중간엽 줄기세포(MSCs)의 근원으로 사용될 수 있다(La Rocca, G., et. al., Histochem. Cell Biol., 131(2):267-282, 2009; Petsa, A., et. al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 45(10):573-576, 2009; Zeddou, M., et. al., Cell Biol. Int., 34(7):693-701, 2010). MSCs는 다양한 조직의 분화 및 자가 복제를 가능하게 한다. 줄기세포로서 알려진 MSCs는 골수, 지방 조직, 태반, 혈관, 골격근, 피부, 뇌 등의 다양한 조직에서 발견될 수 있다(Fang, B., et. al., Exp. Biol. Med,. 235(1):130-138, 2010; Huang, H. I., et. al., Tissue Eng. Part A, 16(5):1491-1501, 2010; Kang, S. G., et. al., Neurosurgery, 67(3):711-720, 2010; Rada, T., et. al., Stem Cell Rev., Rep. 7(1):64-76, 2011; Tran, T. C., et. al., J. Cell. Physiol., 226(1):224-235, 2011; Wei, Y., et. al., Exp. Cell Res., 15(7):1016-1027, 2011; Zucconi, E., et. al., Stem Cells Dev., 19(3):395-402, 2010).

줄기세포 생물학에서, 와튼 젤리로부터 유래한 중간엽 줄기세포는 인간에서 재생 의학적 응용에 사용하기 위한 줄기세포의 주요한 근원으로 제시되고 있다(Seshareddy, K., et. al., Methods Cell., Biol. 86:101-119, 2008; Troyer, D. L., et. al., Stem Cells, 26(3):591-599, 2008). 와튼 젤리로부터 유래한 중간엽 줄기세포는 시험관 조건 및 생체내 조건에서 간질환 동물 모델에 대해서 긍정적인 결과를 보여주었다(Campard, D., et. al., Gastroenterology, 134(3):833-848, 2008; Lin, S. Z., et. al., Cell Transplant., 19(11):1451-1463, 2010).

최근에는, 개의 MSCs가 수의학 재생성 질병의 연구에서 치료적 효과를 나타냄이 보고되었다(Byeon, Y. E., et. al., Cytotherapy, 12(5):626-636, 2010; Ryu, H. H., et. al., J. Vet. Sci., 10(4):273-284, 2009). 본 발명자들은 개의 와튼 젤리유래 중간엽 줄기 세포(cWJ-MSCs)가 수의학에서 줄기세포 연구를 위한 모델 시스템이 될 수 있음을 제시한다. 아울러, cWJ-MSCs는 개의 재생성 의학 연구에서 치료용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 개의 와튼 젤리가 개에 유용하게 사용될 수 있는 MSCs의 근원이 될 수 있음을 제시한다.

이에, 본 발명자들은 수득이 용이한 새로운 세포 공급원인 개의 와튼 젤리(wharton's jelly)로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여, 상기 중간엽 줄기세포가 연골세포, 골세포, 지방세포, 신경세포 등의 중배엽 유래 세포로 분화될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 다분화능 줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다분화능 줄기세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다분화능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 개과 동물의 와튼 젤리로부터 유래된 다분화능 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법은 (ⅰ) 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 배양된 세포를 회수하는 단계를 포함한다.

상기 방법으로 제조된 다분화능 줄기세포는 다음과 같은 특성을 갖는다: (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD45, CD41a 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고; (c) 미분화상태로 계대수 14 이상 배양되는 능력을 갖는다.

이때, 상기 개과 동물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 이리, 개, 카니스 루푸스, 코요테, 재칼, 여우 등이 될 수 있고, 상기 (ⅰ)단계에서 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나 와튼 젤리를 세절하고 콜라게나제로 처리한 다음 원심분리하여 수득함이 바람직하며, 상기 (ⅰ)단계에서 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포를 배양하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 부착 배양함이 바람직하고, 상기 사용된 DMEM 배지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 소태아혈청(FBS)를 포함하는 저글루코오스 DMEM 배지를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 용어 “줄기세포”란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells), 다분화능 (다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다. 본 발명의 용어 “만능 줄기세포 (totipotent stem cells)”란, 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 용어 “전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)”란, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴 (inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못하는 세포를 의미한다. 본 발명의 용어 “다분화능 줄기세포”는 줄기세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 줄기세포는 다분화능 줄기세포일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 다음과 같은 특성을 가지는 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포를 제공한다: (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD45, CD41a 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고; (c) 미분화상태로 계대수 14 이상 배양되는 능력을 갖는다.

이때, 상기 중배엽 유래 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 연골세포, 골세포, 지방세포, 신경세포 등이 될 수 있고, 상기 개과 동물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 이리, 개, 카니스 루푸스, 코요테, 재칼, 여우 등이 될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 다분화능 줄기세포를 다양한 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 상기 다분화능 줄기세포를 다양한 세포로 분화시키는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 다분화능 줄기세포를 아스코빅 산, L-프롤린, TGF-3, BMP-6 및 ITS를 함유한 연골세포 분화배지에 배양하여 연골세포로 분화시키거나, 상기 다분화능 줄기세포를 아스코빅산 2-포스페이트, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유한 배양배지에 배양하여 골세포로 분화시키거나, 상기 다분화능 줄기세포를 3-이소부틸-1-메틸-젠틴, 덱사메타손, 인도메타신 및 인슐린을 함유한 배양배지에 배양하여 지방세포로 분화시키거나, 상기 다분화능 줄기세포를 도코사헥세노익산(DHA), B27 첨가제 및 DMSO를 함유한 배양배지에 배양하여 신경세포로 분화시킬 수 있다.

본 발명의 용어 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어지는 현상을 들 수 있다. 상대적으로, “미분화”란 상술한 분화가 일어나지 않은 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.

한편, 상기 방법으로 분화된 태반의 각각의 하부조직 세포로부터 유래된 줄기세포의 분화정도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 분야에 익히 공지된 기법인 유세포 분석방법, 면역세포화학적 방법, PCR 및 유전자 발현 프로파일을 사용하여 세포 표면 표지 또는 형태의 변화를 측정하는 방법, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태변화를 조사하는 방법, 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RT-PCR, Oil red O 염색법, Safranin O 염색법, Type II collagen 면역조직화학 염색법, alkaline phosphate 염색법 및 Alizarin S 염색법 등을 이용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 다분화능 줄기세포 또는 상기 다분화능 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 이때, 상기 분화된 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

상기 본 발명의 다분화능 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 본 발명의 다분화능 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 본 발명의 다분화능 줄기세포는 그의 특성상 개의 연골, 건 또는 인대의 강화, 치료 또는 대체에 사용될 수 있다.

인간에서, 골수. 제대혈, 지방조직 및 태반(Friedenstein, A. J., et. al., Cell Tissue Kinet., 20(3):263-272, 1987; Hipp, J., et. al., Stem Cell Rev., 4(1):3-11, 2008; Koestenbauer, S., et. al., Cell Transplant., 18(10):1059-1068, 2009; Mihu, C. M., et. al., Rom. J. Morphol. Embryol., 49(4):441-446, 2008; Parolini, O., et. al., Stem Cells, 26(2):300-311, 2008) 뿐만 아니라 특이적 기관 조직(Kang, K. S., et. al., Toxicol. Sci., 120 Suppl 1:S269-289, 2011)을 포함하는 다양한 줄기세포 근원이 존재한다. 이 중에서, 인간에서 와튼 젤리라 불리는 제대 매트릭스로부터 얻어진 줄기세포의 분리 및 특성화에 대한 몇 가지 보고되었다(Lin, S. Z., et. al., Cell Transplant., 19(11):1451-1463, 2010; Troyer, D. L., et. al., Stem Cells, 26(3):591-599, 2008). 와튼 젤리는 구하기 쉽고 줄기세포가 풍부한 근원이다. 더욱이, 와튼 젤리는 분만 후 버려져 폐기물로 취급되었다(Troyer, D. L., et. al., Stem Cells, 26(3):591-599, 2008). 그러나, 개에서 와튼 젤리로부터 유래된 줄기세포에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 최초로 개과 동물의 와튼 젤리로부터 MSCs를 분리 및 특성화한 것을 보고하였다. 본 발명에서, 4개의 개과 동물의 와튼 젤리 샘플로부터 세포를 분리 배양하였고, 성공률은 100% 였다. 모든 분리된 세포(4개의 샘플로부터)는 유사한 세포 형태 및 계대배양 능력을 보여주었다. 하나의 세포주가 무작위로 선택되었다. 모든 실험, CDPL, 유세포 분석 및 분화 연구는 오직 선택된 세포주에 의해 실시되었다(3세트). 본 발명자들은 cWJ-MSCs를 계대수 14가 될 때까지, 기본 배양배지(10% FBS를 가진 LG-DMEM)로 배양하였다. 상기 cWJ-MSCs는 모든 줄기세포와 유사하게 자가 복제를 할 수 있었다. 본 발명자들은 누적 집단 더블링 레벨의 계산을 통해 cWJ-MSCs가 강력하게 세포를 증식시킬 수 있음을 입증하였다. cWJ-MSCs의 방추 모양의 형태와 부착 형질은 중간엽 줄기 세포의 전형적인 특징이다(Troyer, D. L., et. al., Stem Cells, 26(3):591-599, 2008). 면역형질적 특성은 cWJ-MSCs가 중간엽 줄기세포 마커인 CD90(99.41%) 및 CD105(99.84%)에 대해 양성임을 나타내었다. 조혈모 표면 마커에서, CD34(2.62%) 및 CD45(0.38%)에 대한 음성 또는 약간의 발현 양상을 나타내었다. MSC의 경우에, CD34는 음성적으로 발현되었으나, Viera 등(Vieira, N. M., et. al., Cell Transplant., 19(3):279-289, 2010)은 개의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포에서 10% CD34-양성 세포가 본 발명자들이 입증한 것보다 더 양성적인 집단임을 보여주었다. 본 발명자들은 개과 동물의 줄기 세포가 유세포 분석에 의해 검출된 작은 차이점을 갖을 수 있다는 점에 대해 의문을 나타내었다.

cWJ-MSCs의 중간엽성 능력을 확인하고자, 본 발명자들은 다양한 분화연구를 수행하였다. 연골형성 분화 연구에서, cWJ-MSCs는 침전물 형성 및 분화 조건하에서 톨루이딘 블루 및 알시안 블루-파스를 이용한 양성적 염색결과를 나타내었다. 또한, 연골형성 마커의 유전자 발현 양상도 대조군 조건에 비하여 분화 조건하에서 증가하였다. 골 형성 분화 후에, cWJ-MSCs는 알리자린 레드 S 및 본 코사를 이용한 명백한 양성적 염색결과를 나타내었다. 본 발명자는 분화 후에 증가된 골 형성 마커 유전자의 발현 수준을 정량하였다. 아울러, 본 발명자는 cWJ-MSCs가 지방세포 계통의 세포로도 분화될 수 있음을 발견하였다. 지방세포의 분화 조건하에서, 몇 가지 지방성 비말이 오일 레드 O로 염색되었다. 다른 분화 실험에서처럼, 분화후에 지방 형성 마커의 유전자 발현 수준이 증가하였다. 신경 분화시, 본 발명자는 신경 마커의 발현을 입증하였다. cWJ-MSCs는 기본적인 비분화 조건하에서 조차도, 단백질 및 유전자 수준에서 GFAP를 발현시켰다.

개과 동물의 재생의학 연구에서, 개과 동물의 줄기세포를 사용한 몇 가지 연구결과가 보고되었다(Byeon, Y. E., et. al., Cytotherapy, 12(5):626-636, 2010; Ryu, H. H., et. al., J. Vet. Sci., 10(4):273-284, 2009). 이들 연구결과의 대부분은 사용된 줄기세포가 개과 동물의 지방 조직 또는 제대혈에서 유래되었음을 나타내었다(23, 27). 치료제의 용도면에서 고려한다면, 줄기세포의 다양한 근원을 확립하는 것이 요구된다.

결론적으로, 본 발명자들이 제시한 실험결과자료는 cWJ-MSCs가 용이하게 분리될 수 있고, 자가 복제의 줄기 세포 특징을 보여줄 수 있다는 점을 나타내었다. 상기 cWJ-MSCs는 연골모세포, 조골세포, 지방세포 및 신경세포로 분화될 수 있다. 따라서, 상기 cWJ-MSCs는 재생 질병 및 수의학에 사용될 수 있는 잠재적인 치료적 특성을 갖을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 cWJ-MSCs가 줄기 세포 생물학 연구에 유용하고 개과 동물의 전 임상단계에 사용하기 위한 줄기세포의 근원이 될 수 있음을 제시하였다.

본 발명의 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포는 개과 동물의 조직에서 유래되어, 연골세포, 골세포, 지방세포, 신경세포 등의 중배엽 유래 세포로 용이하게 분화될 수 있으므로, 애완동물관련 시장에서 개과 동물의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 cWJ-MSCs의 프라이머리 배양 및 CPDL을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 갯과의 와튼 젤리 조직의 수거한 결과이다. (B) cWJ-MSCs의 위상차 현미경 사진으로서, 세포는 LG-DMEM (10% FBS)로 배양되었다. 상기 세포는 인간 중간엽 줄기세포에서 보여진 것과 같은 섬유아세포-유사 형태 및 방추 형태를 보여주었다. 스케일바 = 50㎛. (C) cWJ-MSCs의 누적된 성장 곡선을 나타매고, CPDL이 재료 및 방법 섹션에서 기술된 공식으로 계산되었다. 상기 CPDL은 3패시지 내지 14 패시지에서 측정되었다. 세포는 패시지 14까지 일관성있게 성장할 수 있다.
도 2는 cWJ-MSCs의 유세포 분석결과를 나타낸다. 분석은 계대수 5인 시점에서 수행하였다. 수치는 표시된 항원의 강도를 나타낸다.
도 3은 cWJ-MSCs의 연골세포 분화결과를 나타낸다. 연골 형성 유도 3주 후에 펠렛 형성이 관찰되었다. (A) 상기 펠릿은 15ml 폴리프로필렌 튜브의 바닥에서 형성되었다. 검은 화살표는 펠렛을 나타낸다. (B) 알 모양의 연골형성 펠렛 사진이다. 연골형성 침전물을 (C) 톨루이딘 블루 및 (D) 알시안 블루-파스 염색한 결과를 나타낸다. 침전물을 파라핀에 침지하여 3㎛ 절편으로 세절하고 슬라이드에 안치시켰다. 슬라이드는 톨루이딘 블루 및 알시안 블루-파스로 염색하였다. 염색된 조직은 전형적인 연골성의 조직 형질을 보여주었다. 스케일 바 = 100㎛. (E) COL2A1, AGGRECAN인 연골형성 특이적 마커의 mRNA 발현 레벨 감지를 위한 RT-PCR 결과를 나타낸다. 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)가 mRNA의 양을 평가하기 위해 내부대조군으로 사용되었다.
도 4는 cWJ -MSCs의 골형성 분화결과를 나타낸다. (A-D) 골 형성 유도 3주 후 알리자린 레드 S 및 (E-H) 본 코사 염색한 결과를 나타낸다. (A, B) 골 형성 분화 세포가 골 형성 유도 배지에서 성장되었다. 분화된 세포는 대조군 세포와 구별되게 알리자린 레드 S와 강하게 염색되었다. (C, D, G 및 F) 대조군 세포는 10 % FBS를 지닌 정상적인 LG- DMEM에서 성장되었다. 알리자린 레드 S 및 본 코사와의 어떠한 염색도 관찰되지 않았다. 스케일바 = 50㎛. 정량화를 위해, 알리자린 레드 S로 염색된 세포가 100 mM 세틸피리디니엄 클로라이드와 같이 용해되었고, 흡광도가 분광광도계로 0.5초간 570nm에서 측정되었다(I). 분화된 세포는 대조군 세포보다 13배 더 큰 염색 양을 보여주었다. 본 발명자는 이들 분석을 세번 실시하였고 평균값 ± 표준오차를 플롯팅하였다(***, p<0.001). (J) 골 형성 특이 마커의 mRNA 발현 레벨의 감지를 위한 RT-PCR; SPARC, MSX2, COL1A1 및 BGLAP를 나타낸다. 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게 나아제 (GAPDH)가 mRNA의 양을 평가하기 위해 내부대조군으로 사용되었다.
도 5는 cWJ-MSCs의 지방세포 분화결과를 나타낸다. (A-D) 지방형성 유도 3주 후의 오일 레드 O 염색결과이다. (A, B) 지방으로 분화된 세포를 지방형성 유도 배지에 처리하였다. 분화된 세포의 지방성 비말은 오일 레드 O로 염색하였다. 검은 화살표는 염색된 적색의 지방성 비말을 나타낸다. (C, D) 대조군 세포는 10 % FBS를 갖는 LG-DMEM에서 배양되었다. 오일 레드 O로 염색되지 않았다. 스케일바 = 50㎛. 정량화를 위해 염색된 세포가 100 % 이소프로판올로 용해되어 흡광도가 스펙트로포토미터로 0.5초간 500nm에서 측정되었다. (E) 분화된 세포는 대조군 세포보다 5배 더 큰 염색 양을 보여주었다. 본 발명자는 이들 분석을 세번 실시하였고 평균값 ± 표준오차를 플롯팅하였다(**, p<0.01). (F) 지방형성 특이 마커의 mRNA 발현 레벨의 감지를 위한 RT-PCR; LPL, LEPTIN 및 FABP4를 나타낸다. 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제 (GAPDH)가 mRNA의 양을 평가하기 위해 내부대조군으로 사용되었다.
도 6은 cWJ-MSCs의 신경세포 분화결과를 나타낸다. cWJ-MSCs가 GFAP 및 베타 III 튜불린, 성상세포 및 신경세포 특이 마커로 면역염색되었다. (A-C) 음성 대조군은 Alexa 488 (녹색, B), Alexa 594 (빨간색, C)로 확인되었으며 핵 감지만을 위해 Hoechst가 사용되었다(파란색, A). (D, E) 대조군 세포는 10 % FBS를 갖는 LG-DMEM에서 배양되었다. 대조군 세포는 GFAP에 양성이었으나 베타 III 튜불린에는 양성이지 않았다. (F, G) 신경 세포 분화 후, 분화된 세포가 GFAP 및 베타 III 튜불린으로 염색되었다. 스케일바 = 50㎛. (H, I) 전체 핵 세포에 상대적인 GFAP 및 베타 III 튜불린 양성 세포의 수는 카운팅에 의해 결정하였고 평균값 ± 표준오차를 플롯팅하였다(**, p<0.01). (J) GFAP 및 MAP2의 mRNA 발현 레벨의 감지를 위한 RT-PCR;. 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)가 mRNA의 양을 평가하기 위해 내부대조군으로 사용되었다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 동물

건강한 성체 개(n=4; 4.5±0.4kg)를 사용하였다. 본 연구는 동물의 윤리적인 사용법에 대한 연구소규정에 근거하여 수행되었다. 본 발명은 서울대학교의 "실험동물 보호 및 사용에 대한 규정"에 따라 수행되었다. 개의 제왕 절개시에, 아세프로마진 말레이트(0.1 mg/kg)를 투여하고, 이오펜탄 소디엄(15 mg/kg)을 정맥주사하여 마취시켰다. 또한, 마취상태를 지속적으로 유지하기 위하여 이소플루란을 사용하였다. 상술한 모든 과정은 멸균조건에서 수행되었다.

실시예 1-2: 세포 분리 및 배양

공지된 방법을 변형시켜서 세포를 분리하였다(Seshareddy, K., et. al., Methods Cell., Biol. 86:101-119, 2008). 개의 와튼 젤리는 제왕 절개시에 수득하였다. 와튼 젤리는 그의 거대구조로 인하여 태반과 구별되는 제대 매트릭스이다. 상기 수득한 와튼 젤리를 멸균 표본 컵에 담고, 0.9% 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거하였다. 겸자를 이용하여 혈관을 물리적으로 제거하였다. 이어, 개의 와튼 젤리 조직을 외과용 칼로 세절하고, 소화액(콜라게나제 type I, 2mg/ml)에 침지하였다. 상기 세절된 조직을 37℃에서 약 3-4시간동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 상기 조직을 PBS로 세척하고 350 x g로 5분동안 원심분리하였다. 침전된 세포를 기본 배양배지(10% FBS, 낮은 글루코스 DMEM)에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 기본 배양배지가 담긴 T75 폴리스티렌 세포 배양용기(Nunc, 미국)에 접종(seeding)하였다. 접종된 세포가 배양용기의 바닥에 부착되어 70-80%의 컨플루언시(confluency)에 도달할 때 까지, 기본 배양배지를 일주일에 3번 교체하면서 배양하였다.

실시예 1-3: 누적 집단 더블링 레벨 분석( Cumulative Population Doubling Level Analysis )

cWJ-MSCs의 추산된 성장 효율 및 증식 잠재력은 공식(CPDL = ln(Nf/Ni)ln2, Ni 는 초기 시딩 세포 수, Nf는 최종 수거 세포수, ln은 자연로그)을 사용한 전체 누적 집단 더블링 레벨에 의해 결정되었다. 세포(5×10⁴)는 6웰 배양 플레이트(Nunc)에 3배수로 접종하고, 5-7일 후에 계대배양하였다. 최종 세포수를 계수하고, 5×10⁴ 세포를 다시 접종하였다. 누적된 더블링 레벨을 산출하기 위해서, 각 패시지의 집단 더블링을 계산하고, 이를 이전 패시지의 집단 더블링 레벨에 합산하였다.

실시예 1-4: 유세포 분석

cWJ-MSCs를 유세포 분석에 적용하기 위하여, 제조사(BD Biosciences, 미국)의 프로토콜에 따라 특이적인 항체로 염색하였다. 간략하게, 배양된 cWJ-MSCs를 PBS에서 2-3회 세척하고, 0.25 % trypsin/EDTA를 사용하여 수거하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하여 항체 염색을 위해 그룹으로 분할하였다. 각 분획은 약 1×10⁶ 개의 세포를 포함하도록 하였다. 마우스 항-인간 CD3, 마우스 항-인간 CD11c, 마우스 항-인간 CD28, 마우스 항-인간 CD34, 마우스 항-인간 CD38, 마우스 항-인간 CD41a, 마우스 항-인간 CD45, 마우스 항-인간 CD62L, 마우스 항-인간 CD90(BD Biosciences) 및 마우스 항-인간 CD105 (Serotec, USA)를 세포 표면항원을 감지하기 위하여 사용하였고, 모든 항체에는 플루오레신 이소사이오사이어네이트(FITC) 또는 파이코에리스린(PE)을 결합시켰다. 세포를 4℃에서 30분간 염색하였다. 항체를 반응시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고, 500㎕의 PBS에 재현탁시켰다. FACS Calibur™(BD Biosciences) 및 Cell Quest Pro™(BD Biosciences) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

실시예 1-5: 연골세포로의 분화

공지된 방법을 변형시킨 방법으로 연골세포로 분화시켰다(Seo, M. S., et. al., J. Vet. Sci., 10(3):181-187, 2009). 대략적으로, 5×10⁵개의 세포를 15㎖ 폴리프로필렌 튜브에 담고, 원심분리하여 침전시켰다. 상기 침전물에 연골세포 분화 배지(Lonza)를 가하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3주동안 배양하였다. 이때, 상기 연골세포 분화 배지는 일주일에 3번 교체하면서 배양하였다. 3주가 경과한 후, 원형의 침전물을 파라핀에 포매시키고, 3㎛ 크기로 절편화하였다. 조직학적으로 평가하기 위하여, 상기 절편을 톨루이딘 블루(toluidine blue) 및 알시안 블루 파스(alcian blue-PAS)로 염색하였다. 슬라이드에 안치된 3㎛ 크기의 절편에서 파라핀을 제거하고, 증류수로 수화시켰다. 톨루이딘 블루 염색을 위해, 상기 슬라이드를 톨루이딘 블루 워킹 용액에 1분간 침지하였다. 증류수로 세척하여 잔류하는 염색약을 제거하였다. 상기 슬라이드를 95% 및 100% 알코올로 순차적으로 세척하여 신속하게 탈수시켰다. 알시안 블루-파스로 염색하기 위하여, 상기 슬라이드를 알시안 블루(pH 2.5), 과요오드산(0.5%) 및 쉬프(schiff) 시약으로 염색하였다. 상기 슬라이드를 자일렌으로 세척하고, 카나다 발삼을 가한 후, 커버슬립을 덮었다.

실시예 1-6: 골세포 분화

골세포 분화는 50 μM 아스코빅산 2-포스페이트, 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 상기 기본 배양배지를 포함하는 골세포 분화 배지를 사용하여 수행하였다. 기본 배양배지를 대조군 배지로 사용하였다. 상기 골세포 분화 배지는 3주동안 일주일에 2번씩 교체하였다. 분화가 종료된 후, 상기 분화된 세포를 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 및 본 코사(Von Kossa)로 염색하여 칼슘 축적을 확인하였다. 알리자린 레드 S로 염색하기 위하여, 상기 분화된 세포를 PBS로 세척하고, 70% 냉각된 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 증류수로 3회 세척하고, 40mM 알리자린 레드 S(pH 4.2)로 실온에서 10분동안 염색하였다. 증류수로 5번 세척하여 비특이적으로 염색된 염색약을 제거하였다. 본 코사로 염색하기 위하여, 자외선 조사 조건하에서 30-60분간 질산은(5%)으로 염색하고, 2-3분 동안 티오황산나트륨으로 염색하였으며, 그런 다음 5분간 핵 레드(Nuclear Red) 염색약으로 대비염색하였다. 알리자린 레드 S는 100 mM 세틸피리디니엄 클로라이드로 1시간 동안 용해되었다. 용해된 알리자린 레드 S의 방출정도를 분광광도계를 사용하여 570 nm에서 측정하였다(Park, S. B., et. al., Growth Factors, 27(6):425-437, 2009).

실시예 1-7: 지방세포 분화

지방세포 분화 배지는 500μM 3-이소부틸-1-메틸-젠틴(IBMX), 1μM 덱사메타손, 60μM 인도메타신 및 5㎍/㎖ 인슐린으로 구성된다. 배양된 세포가 80-90% 컨플루언시에 도달했을 때, 지방세포 분화 배지를 가하여 3주동안 배양하였다. 지방세포로의 분화를 확인하기 위하여, 오일 레드 O(Oil Red O)로 염색하였다. 세포를 적어도 1시간 동안 10% 포르말린으로 고정하고, 60% 이소프로판올로 세척한 다음, 희석된 오일 레드 O를 가하고 10분동안 반응시켰다. 결합된 염색약을 100% 이소프로판올을 사용하여 용해시키고, 방출된 염색약을 분광광도계를 사용하여 500 nm에서 측정하였다.

실시예 1-8: 신경세포 분화

세포를 기본 배양배지에 접종하여, 컨플루언트 세포집단을 형성하였다. 세포에 1mM 베타-머캅토에탄올 및 5% FBS를 가하여 사전반응시켰다. 사전반응 후, 세포에 100μM 도코사헥세노익산(DHA), B27 첨가제 및 1.5% DMSO로 구성된 무혈청 유도배지를 가하고 2일 동안 배양하였다(Jurga, M., et. al., J. Neurosci. Res., 83(4):627-637, 2006).

실시예 1-9: 면역 염색

면역 염색을 수행하기 위하여, 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시키고, PBS로 희석된 0.5% 트리톤-X 100를 상온에서 10분 동안 가하여 침투성을 부여하였다. 3회 세척한 후, 상기 세포를 4℃에서 하룻밤동안 정상적인 염소 혈청(NGS)으로 블로킹하였다. 세포에 1차 항체를 가하고, 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 3회 세척한 후, 상기 세포에 2차 항체(Alexa 488 & 594, 1:1000)를 가하고 1시간 동안 반응시켰다. 끝으로, 핵을 염색하기 위하여, Hoechst 33238(1㎎/㎖)를 PBS를 사용하여 1:100로 희석하고, 15분 동안 시료에 가하였다. 공초점 현미경(Eclipse TE2000)을 이용하여 시료를 촬영하였다. 1차 항체로는 토끼 항-글리얼 피브리랠리 산 단백질(Glial Fibrillary Acidic Protein) 및 마우스-항 신경 특이적 베타 III 튜불린(TU-20, Abcam, 영국)을 사용하였다.

실시예 1-10: 역전사 중합효소 사슬 반응( RT - PCR )

TRIzol을 사용하여 배양된 세포에서 총 RNA를 수득하였다. RNA 농도는 분광광도계를 사용하여 260nm에서 측정되었고, 총 RNA중 1㎍을 Superscript II 역전사 효소를 이용한 역전사에 사용하였다. cDNA는 Taq Platinum을 이용하여 증폭되었다. PCR 프라이머는 표 1에 기재되어 있다. PCR 산물은 3% 아가로스 겔에서 이티디움 브롬마이드를 이용하여 가시화되었다.

PCR 프라이머

마커	명칭	염기서열(5'-3')	서열번호
연골조직	COL2A1	Forward : gaaactctgccaccctgaatg	1
		Reverse : gctccaccagttcttcttgg	2
	Aggrecan	Forward : atcaacagtgcttaccaagaca	3
		Reverse : ataacctcacagcgatagatcc	4
골조직	SPARC	Forward : tgagaaggtatgcagcaacg	5
		Reverse : agtccaggtggagtttgtgg	6
	MSX2	Forward : tccgccagaaacaatacctc	7
		Reverse : aagggtaggacgctccgtat	8
	COL1A1	Forward : cacctcaggagaaggctcac	9
		Reverse : atgttctcgatctgctggct	10
	BGLAP	Forward : gtggtgcaaccttcgtgtc	11
		Reverse : gctcgcatacttccctcttg	12
지방조직	LPL	Forward : acacattcacaagagggtcac	13
		Reverse : ctctgcaatcacacggatg	14
	LEPTIN	Forward : ctatctgtcctgtgttgaagctg	15
		Reverse : tgtgtgaaatgtcattgatcctg	16
	FABP4	Forward : atcagtgtaaacggggatgtg	17
		Reverse : gacttttctgtcatccgcagta	18
신경조직	GFAP	Forward : tccgagggggcaaaagcacc	19
		Reverse : ggcaggctgctaaccgagagc	20
	MAP2	Forward : cagcgacaaggccgacacgt	21
		Reverse : gggccaaactcgacacccgg	22
내부대조군	GAPDH	Forward : aacatcatccctgcttccac	23
		Reverse : tccttggaggccatgtagac	24

실시예 1-11: 통계 분석

상기 데이터는 엑셀 소프트웨어를 사용하여 스튜던트 t-검정에 의해 분석하였고 평균값 ± 표준편차로 표현하였다. 통계적으로 유의한 데이터는 별표로 표시하였다(***, p<0.001; **, p<0.01).

실시예 2: 결과분석

실시예 2-1: cWJ - MSCs 분리 및 세포배양

개의 와튼 젤리 시료는 제왕 절개시에 수득하였다. 와튼 젤리의 조직은 제대 매트릭스이고, 수집된 시료는 멸균된 배양용기에 옮겨졌다(도 1A). 본 발명자들은 공지된 줄기세포 분리 및 배양방법을 사용하여 와튼 젤리로부터 cWJ-MSCs를 분리하였다. 배양된 세포를 기본 배양배지가 담겨진 T-25 세포 배양용기에 접종한 후, 수거하여 평가하였다. 상기 세포의 형태는 섬유아 세포와 유사하고 방추 형태를 나타내어, 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포(UCB-MSCs) 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSCs)와 유사하였다(도 1B). cWJ-MSCs의 줄기세포 능력 및 자가 복제 능력을 결정하기 위해서, 본 발명자는 CPDL를 통해 증식을 측정하고 계산하였다. 상기 세포를 계대수 14까지 배양하고 유지하였다. 증식속도를 측정하기 위해, 5×10⁴ 세포를 6-웰 배양 플레이트에 접종하고, 5-7일 후에 계대배양하였다. 본 발명자들은 증식속도가 감소할 때까지 세포를 계대배양하였다. 누적 집단을 통한 세포 증식의 일관성 있는 증가속도가 관찰되었다(도 1C). 이러한 결과는 cWJ-MSCs가 자가 복제 능력을 가짐을 암시한다.

실시예 2-2: 유세포 분석에 의한 면역형질의 특성화

일반적으로, MSCs는 독특한 세포 표면 항원 마커를 가지고 있다. 세포 치료 국제 학회에 따라, MSCs는 CD90 및 CD105에 대해 양성 발현을 나타내고, CD11c, CD34 및 CD45, 다른 계통 음성 표면 항원에 대해서는 음성 발현을 나타낸다고 알려져 있다(Dominici, M., et. al., Cytotherapy, 8(4):315-317, 2006).

본 발명자는 3회 계대배양된 cWJ-MSCs의 유세포 분석을 실시하고, 10개의 CD 마커(CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD41a, CD45, CD62L, CD90 및 CD105)를 사용하여 MSC 형질을 구별하였다. 그 결과, MSC 형질과 일관성 있는 발현 패턴을 나타내었다(도 2). cWJ-MSCs는 CD90 및 CD105에 대해 양성적으로 염색되었다. CD90은 또한 Thy-1로 불리우며 간 줄기세포, 피부각질 줄기세포, 자궁내막 즐기세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 다양한 줄기세포에 대한 마커이다(Gargett, C. E., Aust. N. Z. J. Obstet. Gynaecol., 46(3):250-253, 2006; Masson, N. M., et. al., Gastrointest. Liver Physiol., 291(1):G45-54, 2006; Nakamura, Y., et. al., Br. J. Dermatol., 154(6):1062-1070, 2006). CD105는 또한 SH2로 불리우며 공지된 MSC 마커이다(Dominici, M., et. al., Cytotherapy, 8(4):315-317, 2006). 면역세포에 대한 마커(CD3, CD11c, CD28, CD38 및 CD62L), 조혈모 세포에 대한 마커(CD34, CD45) 및 혈소판(CD41a)에 대한 마커는 검출되지 않았다. 이들 유세포 분석 결과는 cWJ-MSCs가 MSCs의 형질과 일치하는 전형적인 면역 형질을 나타냄을 입증하였다.

실시예 2-3: 연골 세포 분화의 유도

연골형성을 확인하기 위해서, cWJ-MSCs를 연골세포 분화 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 15㎖ 폴리프로필렌 튜브에 담겨져서 원심분리되어 침전물을 형성하였다. 상기 침전물을 37℃, 5% CO₂의 연골세포 분화 배지에서 2-3주간 배양하였다. 이때, 연골세포 분화 배지는 3일마다 교체하였다. 상기 침전물은 알모양으로 불투명한 덩어리였다(도 3A-B). 침전물이 튜브의 바닥에서 관찰되었다(도 3A). 상기 침전물은 톨루이딘 블루(도 3C) 및 알시안 블루-파스(도 3D)로 양성으로 염색되었다. 본 발명자는 또한 COL2A1 및 AGGRECAN와 같은 연골 형성 마커와 연관된 유전자 발현 양상을 확인하였다. 상기 연골 형성 마커는, 기본 배양배지에서 배양된 세포에 비하여, 연골세포 분화 배지에서 배양된 세포에서 증가하였다(도 3E).

실시예 2-4: 골세포 분화의 유도

골 형성을 조사하기 위해서, cWJ-MSCs를 골세포 분화 배지에서 배양하였다. 상기 골세포 분화 배지는 3주 동안, 3일마다 교체하였다. 분화된 후, 알리자린 레드 및 본 코사염색을 실시하여 골형성을 확인하였다. 기본 배양배지는 대조군으로 사용되었다. 알리자린 레드 및 본 코사 염색은 분화 조건하에서 양성이었다(도 4A, 4B, 4E and 4F). 그러나, 비분화 조건하에서는, 세포가 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색에 대하여 음성을 나타내었다(도 4C, 4D, 4G and 4H). 정량화를 위해, 알리자린 레드 S로 염색된 세포를 100 mM 세틸피리디니엄 클로라이드로 용출시켰다. 골형성 분화 세포는 대조군보다 10배 이상의 알리자린 레드 염색값을 나타내었다(도 4I). 유전자 발현 수준을 조사할 때, SPARC, MSX2, COL1A1 및 BGLAP와 같은 골형성 분화 마커는 분화 조건하에서 강하게 발현되었다(도 4J).

실시예 2-5: 지방 세포 분화의 유도

지방세포의 생성을 확인하기 위하여, cWJ-MSCs를 지방세포 분화 배지에서 배양하고, 이들 배지는 3주 동안, 3일마다 교체하였다. 기본 배양배지가 대조군으로 사용되었다. 오일 레드 O 염색을 수행하여 지방 형성을 확인하였다. 본 발명자들은 분화 조건하에서 지방성 비말(fatty droplet)을 검출하였으나, 대조군에서는 검출하지 못하였다(도 5 A 내지 D). 정량화를 위해, 염색된 세포를 100% 이소프로판올로 용출시켰다(도 5E). 분화된 세포는 대조군보다 5배 이상의 값을 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 LPL, LEPTIN 및 FABP4와 같은 지방 형성 연관 마커의 유전자 발현 수준을 조사하였다. 분화 후, 지방 형성 연관 마커는 대조군에 비해 증가되었다(도 5F).

실시예 2-6: 신경세포 분화의 유도

cWJ-MSCs를 신경 분화 배지에서 배양하였다. 기본 배양배지를 대조군으로 사용하였다. 신경 분화를 확인하기 위하여, 본 발명자는 면역 염색을 실시하였다. 2차 항체 Alexa 488 및 594로 반응시킨 음성 대조군은 어떠한 배경신호도 나타내지 않았다(도 6 A 내지 C). 본 발명자들은 성상세포 마커인 GFAP와 신경 마커인 베타 III 튜불린에 대한 면역염색을 수행하였다. 기본 배양 조건하에서, cWJ-MSCs는 GFAP를 발현하였지만, 베타 III 튜불린은 발현하지 않았다(도 6D 및 E). 신경 분화 이후, 상기 세포는 GFAP 및 베타 III 튜불린을 둘 다 발현하였다(도 6 F 및 G). 이에 따라, 본 발명자들은 GFAP 양성 및 베타 III 튜불린 양성 세포 집단을 대조군 조건 및 신경분화 조건에서 비교하였다. 정량화를 통하여, GFAP 양성 세포 집단이 그들 두 조건(대조군 조건, 90.1%; 신경분화 조건, 93.2%) 하에서 유사하게 발현됨을 확인하였다(도 6H). 베타 III 튜불린 양성인 세포는 신경 분화 조건하에서 양성적인 집단(9.2%)을 나타내었다(Fig. 6I). 그러나, 베타 III 튜불린 양성인 세포는 대조군 조건하에서 검출되지 않음을 보여주었다. 본 발명자들은 유전자 발현을 조사했을 때, GFAP가 대조군 조건 및 신경분화 조건하에서 모두 발현됨을 발견하였다. 분화 조건하에서, MAP2는 대조군에 비하여 양성이었다(도 6J). 이들 결과자료는 cWJ-MSCs가 신경 세포로 분화할 수 있는 능력이 있음을 나타내었다.

<110> KANG STEM HOLDINGS CO., LTD <120> Isolation and characterization of canine wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells <130> PA110164/KR <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL2A1 F <400> 1 gaaactctgc caccctgaat g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL2A1 R <400> 2 gctccaccag ttcttcttgg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Aggrecan F <400> 3 atcaacagtg cttaccaaga ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Aggrecan R <400> 4 ataacctcac agcgatagat cc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPARC F <400> 5 tgagaaggta tgcagcaacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPARC R <400> 6 agtccaggtg gagtttgtgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MSX2 F <400> 7 tccgccagaa acaatacctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MSX2 R <400> 8 aagggtagga cgctccgtat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1 F <400> 9 cacctcagga gaaggctcac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1 R <400> 10 atgttctcga tctgctggct 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BGLAP F <400> 11 gtggtgcaac cttcgtgtc 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BGLAP R <400> 12 gctcgcatac ttccctcttg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LPL F <400> 13 acacattcac aagagggtca c 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LPL R <400> 14 ctctgcaatc acacggatg 19 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LEPTIN F <400> 15 ctatctgtcc tgtgttgaag ctg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LEPTIN R <400> 16 tgtgtgaaat gtcattgatc ctg 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer FABP4 F <400> 17 atcagtgtaa acggggatgt g 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer FABP4 R <400> 18 gacttttctg tcatccgcag ta 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GFAP F <400> 19 tccgaggggg caaaagcacc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GFAP R <400> 20 ggcaggctgc taaccgagag c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAP2 F <400> 21 cagcgacaag gccgacacgt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAP2 R <400> 22 gggccaaact cgacacccgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH F <400> 23 aacatcatcc ctgcttccac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH R <400> 24 tccttggagg ccatgtagac 20

Claims (15)

1. (ⅰ) 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포를 배양하는 단계; 및
   (ⅱ) 배양된 세포를 회수하는 단계를 포함하여,
   다음과 같은 특성을 나타내는 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법:
   (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD45, CD41a 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
   (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
   (c) 미분화상태로 계대수 14 이상 배양되는 능력을 가짐.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 개과 동물은 이리, 개, 카니스 루푸스, 코요테, 재칼 및 여우로 구성된 군에서 선택되는 하나인 것인 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   (ⅰ)단계에서 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포는 와튼 젤리를 세절하고 콜라게나제로 처리한 다음 원심분리하여 수득한 것인 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   (ⅰ)단계에서 개과 동물의 와튼 젤리에서 분리한 줄기세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 부착 배양하는 것인 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 DMEM 배지에 소태아혈청(FBS)를 첨가하여 배양하는 것인 제조방법.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 DMEM배지는 저글루코오스(low-glucose) DMEM 배지인 것인 제조방법.
   
7. 다음과 같은 특성을 가지는 개과 동물의 와튼 젤리 유래 다분화능 줄기세포:
   (a) 사람 마커인 CD3, CD11c, CD28, CD34, CD38, CD45, CD41a 및 CD62L에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
   (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
   (c) 미분화상태로 계대수 14 이상 배양되는 능력을 가짐.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 중배엽 유래 세포는 연골세포, 골세포, 지방세포 또는 신경세포인 것인 다분화능 줄기세포.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 개과 동물은 이리, 개, 카니스 루푸스, 코요테, 재칼 및 여우로 구성된 군에서 선택되는 하나인 것인 다분화능 줄기세포.
   
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 덱사메타손, 아스코빅 산, L-프롤린, TGF-3, BMP-6 및 ITS를 함유한 연골세포 분화배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
    
11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 아스코빅산 2-포스페이트, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유한 배양배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
    
12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 3-이소부틸-1-메틸-젠틴, 덱사메타손, 인도메타신 및 인슐린을 함유한 배양배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법.
    
13. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 도코사헥세노익산(DHA), B27 첨가제 및 DMSO를 함유한 배양배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
    
14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 다분화능 줄기세포, 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포 또는 상기 다분화능 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 세포치료제는 개의 연골, 건 또는 인대의 강화, 치료 또는 대체에 사용되는 것인 세포 치료제.

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