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KR101697141B1 - 연골 재생용 세포 치료제 - Google Patents

연골 재생용 세포 치료제 Download PDF

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KR101697141B1
KR101697141B1 KR1020160033012A KR20160033012A KR101697141B1 KR 101697141 B1 KR101697141 B1 KR 101697141B1 KR 1020160033012 A KR1020160033012 A KR 1020160033012A KR 20160033012 A KR20160033012 A KR 20160033012A KR 101697141 B1 KR101697141 B1 KR 101697141B1
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김진아
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Abstract

본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있어, 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

연골 재생용 세포 치료제 {Cellular therapeutic agents for cartilage regeneration}
본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
최근의 생명공학은 인간 복지를 최종 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 그 중 줄기세포를 이용한 기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식, 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. 이에 줄기세포에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 줄기세포의 적용 가능성을 다양하게 제시해 왔다.
줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 구분될 수 있다. 배아 줄기세포는 수정란이나 발생중인 태아 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 태아 성장이 완료된 후의 개체 조직인 골수, 제대혈, 지방, 태반, 근육, 활액막, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다. 한편, 배아 줄기세포는 윤리적으로 제한이 있기 때문에 세포치료제로 사용하기 위한 한계가 있으나, 이에 반해 성체 줄기세포는 주로 골수, 지방, 제대혈 및 태반 등에서 획득이 가능하여 윤리적인 면에서 문제가 제기되지 않는다.
이중, 태반 유래 줄기세포의 경우 출산 후 폐기되는 태반을 이용함으로써, 채취가 용이하고 다량의 줄기 세포를 손쉽게 확보 가능한 장점이 있다. 지방이나 골수 유래 줄기세포는 분리, 추출되는 공여자의 나이나 건강상태 등에 영향을 받아 증식력이나 분화능 등에 제한이 있고 변동성이 많지만, 태반 유래 줄기세포의 경우 성체 줄기세포 중 가장 이른 시기에 수득할 수 있는 줄기세포로서 공여자의 나이 등의 변수에 따라 줄기세포능에 영향을 거의 받지 않으며 뛰어난 증식력 및 분화능을 가진다. 또한, 태반 유래 줄기세포는 신경계 질환, 간 질환, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 활용 가능한 줄기세포군을 분리할 수 있다는 장점이 있다.
상술한 장점 때문에, 태반 유래 줄기세포에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제818214호에는 NAC(N-acrtyl-L-cysteine) 함유 배지를 이용하여 양막 또는 탈락막으로부터 줄기세포를 분리하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제871984호에는 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지를 이용하여 양막, 장막, 기저 탈락막 및 태반 조직으로부터 유래된 줄기세포의 다분화능에 관해 개시하고 있다. 그러나 현재까지 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포에 대한 연구는 수행된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 태반 유래 줄기세포 중에서도 줄기세포능이 더욱 우수한 줄기세포를 찾기 위한 연구를 계속한 결과, 태반의 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT) 중 융모막에 연한 부위로서 약 25% 두께에 해당하는 조직층인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)을 분리하여 이로부터 유래된 줄기세포를 제조하고, 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포가 다분화능 줄기세포로서 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 및 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있어, 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 태반(Pla)의 세부 조직인 융모막(chorionic membrane; CM), 융모-영양막(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer; CMT), 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT), 영양막 상층부(upper portion of chorionic trophoblast layer; uCT) 및 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)의 단면 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P31)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 3는 태반 전체 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P29)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 4는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가 시간을 나타낸 도이다.
도 5는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 집락 형성 단위를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포의 표면인자 발현 특성을 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포(Adipogenesis), 연골세포(Chondrogenesis) 또는 골세포(Osteogenesis)로의 분화 정도를 관찰하기 위한 각 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Safranin-O로 염색한 후, 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Type II collagen을 이용한 면역조직화학염색을 수행한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여, Alkaline phosphate로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여, Alizarin red S로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포로의 분화를 관찰하기 위하여, Oil red O로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 연골 손상 동물모델에 제대혈 유래 줄기세포(UCB) 또는 영양막 기저층 유래 줄기세포(bCT)의 투여 후 H&E 및 Safranin-O 염색을 통해 연골 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 연골 손상 동물모델에 제대혈 유래 줄기세포(UCB) 또는 영양막 기저층 유래 줄기세포(bCT)의 투여 후 연골 재생 효과를 ICRS(International Cartilage Repair Society) macroscopic score를 이용한 정량화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.
본 발명에서 "만능 줄기세포(totipotent stem cells)"란, 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)"란, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하고 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "다분화능 줄기세포"는 줄기세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 "줄기세포"는 바람직하게는 다분화능 줄기세포이다.
본 발명에서 "태반(placenta)"이란, 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 생체 내 조직을 의미하는데, 무게 500-600 g, 지름 15-20 cm, 두께 2-3 cm 정도의 원반형태이다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며, 그 사이에서 모체의 혈액과 태아의 혈관 사이에 영양분 및 산소의 전달이 이루어지게 된다. 태반은 크게 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구분할 수 있고, 보다 상세하게는 양막 상피, 양막, 융모막, 영양막, 탈락막으로 구분 할 수 있다. 태반의 단면도를 도 1에 간략히 나타내었다.
본 발명에서 “영양막 기저층”이란, 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 중 융모막에 연한(근접한) 부위의 20 내지 30% 두께에 해당되는 조직으로, 보통 약 5-6㎜의 두께에 해당하는 조직층을 의미한다.
본 발명에서 “영양막”이란, 배포 외부에 위치한 배자의 외배엽층으로, 난자를 자궁벽에 부착시키며 배자에 영양분을 공급하는 조직을 의미한다. 이것에서 융모막 및 양막이 유래하며, 영양막의 내세포층은 융모를 덮으며, 세포영양막이라 부른다.
본 발명에서 “융모막”이란, 인체발생학에서는 배자체 최외층의 세포성 막을 의미한다.
본 발명에서 “탈락막”이란, 만출후에 탈락하는 자궁의 점막을 의미한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 태반으로부터 분리한 영양막 기저층 조직에 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하여 얻어진 세포를, 성장 인자를 사용하지 않고, 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양한 다음 회수함으로써 수득될 수 있다. 상기 효소에는 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 콜라게나아제는 콜라게나아제 A, I, II, III 또는 IV등을 포함한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 다음과 같은 특징을 나타낸다.
(a) 섬유아세포(fibroblastic cell) 모양의 형태학적 특징;
(b) 25 내지 30 이상의 계대수에 이르도록 장기간 동안 증식할 수 있는 능력;
(c) 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화할 수 있는 능력;
(d) 집락형성능;
(e) CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및,
(f) CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성;
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 종류의 세포로 분화할 수 있으며, 예를 들어, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 또는 건세포(tenocyte) 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순 한계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은, 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.
줄기세포를 분화시키는 방법은 종래 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 포함하는 배지에서 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, BMP-6(bone morphogenetic protein 6), TGF-β(Transforming growth factor beta), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 배지에서 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, 아스코르브산, β-글리크로포스페이트(β-glycrophosphate) 및 아스코르브산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate)를 포함하는 배지에 배양하여 골세포로 분화시키는 방법 등을 사용함이 바람직하다.
상기 방법으로 분화된 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 분화 정도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 분야에 공지된 기법인 유세포 분석방법, 면역세포화학적 방법, PCR 또는 유전자-발현 프로파일을 사용하여 세포 표면 표지 또는 형태의 변화를 측정하는 방법, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태변화를 조사하는 방법, 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RT-PCR, Oil-red O 염색법, Safranin O 염색법, Type II collagen 면역조직화학 염색법, ALP(alkaline phosphate) 염색법 또는 Alizarin red S 염색법 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 조직 재생 효과가 우수하다. .
따라서 본 발명은 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
상기 분화된 세포는 특별히 제한되지 않으나, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포, 건세포 등을 포함하며, 치료 목적에 맞게 선택될 수 있다.
본 발명에서 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 분화세포 군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 조정, 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 영양막 기저층(bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 세포치료제는 연골 손상, 연골 결함, 골 결손, 건-인대 결손, 지방조직 결손 등에 대한 치료용으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 “연골 결함”이란 신체 내 포함되는 연골에 손상, 결함(defect) 또는 부족이 있는 경우를 포괄하는 의미로서, 예를 들어 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 또는 골관절염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 관절 내에 투여함으로써 관절 연골의 병변을 치료하거나, 건 또는 인대 부위에 투여함으로써 치료 혹은 예방 하는 등의 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 관절이나 건, 또는 인대 부위에 투여함으로써 상기 조직의 손상부위에 대한 회복이나 조정을 도모하거나, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포로부터 유래된 연골조직 구성물 등 줄기세포 유래 물질을 이용하여 관절(예를 들어, 무릎관절 등)의 조직을 재구성하거나 재생 등의 방법으로 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 증식능과 분화능이 우수하여 조직 재생 효과가 우수하다.
따라서 본 발명은 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
상기 조직은 특별히 제한되지 않으나, 연골, 지방, 골, 신경, 인대, 건 등의 조직을 포함한다.
상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)등을 포함하며, 예를 들어, 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 또는 척추 연골일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
*상기 지방은 체내 위치에 상관없이 모두 포함하며, 예를 들어, 피하 지방(subcutaneous fat), 위장간에 위치하는 지방(omentum, mesentery), 골수지방(bone marrow fat), 후복강 지방(retroperitoneal fat)등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 수 득
태반은 삼성서울병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 삼성서울병원에서 제왕 절개한 정상 분만에서 기증에 동의한 산모로부터 수집하였다. 수집된 태반은 멸균된 용기에 넣어 옮겼으며, 태반 조직으로부터 양막을 벗겨 낸 후, 융모막(CM)과 탈락막(DC)사이에 위치한 양막층(tCT) 중 융모막에 연한(근접한) 부위의 약 25% 두께에 해당(약 5-6 ㎜ 두께)되는 영양막 기저층 조직을 멸균된 포?W과 메스를 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 분리된 영양막 기저층 조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 8-10번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 영양막 기저층 조직을 50 ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 2-3시간 반응시켜 영양막 기저층으로부터 유래된 세포를 수득하였다. 수득한 영양막 기저층으로부터 유래된 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 수득하였다.
비교예 1: 타 조직 유래 줄기세포의 수득
1-1. 태반 전체로부터 유래된 줄기세포의 수득
전체 태반 조직을 세절하고, PBS로 세척하여 태반 조직으로부터 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 조직에 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 반응시켜 태반 세포를 수득하였다. 상기 수득한 태반 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-2. 태반 세부조직으로부터 유래된 줄기세포의 수득
태반으로부터 세부조직인 융모막(chorionic membrane; CM), 융모-영양막(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer; CMT), 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT), 및 영양막 상층부(upper portion of chorionic trophoblast layer; uCT) 조직을 각각 분리하였다. 보다 구체적으로, 전체 태반 조직 중 멸균된 포?W과 메스를 이용하여 양막을 벗겨낸 후, 탈락막을 조심스럽게 제거하여 융모-영양막을 분리하였으며, 이 중 일부를 다시 융모막 및 영양막층 전체로 분리하였다. 상기 영양막층 전체 조직에서 영양막 상층부를 분리하기 위해, 상기 실시예 1의 영양막 기저층을 제외한, 융모막(CM)과 탈락막(DC)사이에 위치한 양막층(tCT) 중 탈락막에 연한(근접한) 부위의 약 75% 두께에 해당되는 조직을 멸균된 포?W과 메스를 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 상기 과정을 통해 각각 분리된 태반 세부조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 8-10번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 세부조직을 50 ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 2-3시간 반응시켜 융모막, 융모-영양막, 영양막층 전체 및 영양막 상층부로부터 유래된 세포를 각각 수득하였다. 수득한 각 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 융모막, 융모-영양막, 영양막층 전체 및 영양막 상층부로부터 유래된 줄기세포를 각각 수득하였다.
1-3. 골수 유래 줄기세포의 분리
골수(Bone Marrow)를 50 ml 튜브에 옮긴 후 동량의 PBS를 넣어 세척하고, 25℃, 2580 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상기 세척 과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전된 골수를 동량의 PBS에 현탁한 후(총 5 ml), 상기 용액을 미리 준비된 25 ml의 Ficoll 용액 위에 천천히 옮긴 뒤, 25℃, 2580 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 밀도차에 의해 분리된 세 개의 층 중 가운데에 위치한 세포층만을 분리하여 세척한 후, 다시 25℃, 2580 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 골수 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-4. 제대혈 유래 줄기세포의 분리
제대혈(Umbilical Cord Blood)을 50 ml 튜브에 옮긴 후 동량의 PBS를 넣어 세척하고, 25℃, 2580 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상기 세척 과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전된 제대혈을 동량의 PBS에 현탁한 후(총 5 ml), 상기 용액을 미리 준비된 25 ml의 Ficoll 용액 위에 천천히 옮긴 뒤, 25℃, 2580 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 밀도 차에 의해 분리된 세 개의 층 중 가운데에 위치한 세포층만을 분리하여 세척한 후, 다시 25℃, 2580 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 제대혈 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-5. 지방 또는 활막 유래 줄기세포의 분리
지방(Adipose) 또는 활막(Synovium) 조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 2-3번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 지방 또는 활막 조직을 잘게 잘라 준 후, 각 조직을 50 ml 튜브에 옮기고 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가한 뒤, 37℃ 조건에서 교반기를 이용하여 반응시켜 지방 또는 활막 세포를 수득하였다. 상기 수득한 지방 또는 활막 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 각각 배양하여 지방 또는 활막 유래 줄기세포를 수득하였다.
실시예 2: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 계 대 배양
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척한 후, 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하였다. 상기 줄기세포가 80% 이상 성장한 시점에서 트리플(TryPLE)을 처리하여 줄기세포를 배양 용기에서 분리하고, 분리된 줄기세포를 1/4의 비율로 희석한 다음, 다른 배양 용기에서 배양하는 방법으로 계대 배양을 수행하였다. 상기와 같은 계대 배양을 반복적으로 수행하면서, 더 이상 계대 배양 되지 않는 계대수(passage number)를 측정하였으며, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 계대 배양을 수행한 후, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 계대수가 31에 이르기까지 우수한 증식능을 가지고 있어, 장기간 배양이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포는 계대 배양 초기부터 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타내고, 하나의 형태가 아니라 다수의 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 도 2와 비교하면, 계대 배양 전후로 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 단일의 세포만을 특이적으로 유지하였으나, 태반 전체로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있었다.
실시예 3: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 집 락형성능 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가 시간 및 집락형성능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 상기 실시예 2의 방법으로 첫 번째 계대 배양을 수행하고, 상기 계대 배양이 종료되는 시점에서 100㎜ 디쉬에 5 X 103개씩 접종(seeding)한 후, 10일 동안 성장인자를 포함하지 않고 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. P2에서 P6까지 줄기세포의 수가 두 배가 되는데 걸리는 시간(집단 배가 시간)을 측정하였으며, 상기 배양된 줄기세포를 대상으로 김자 염색법(Giemsa stain)을 실시하여 줄기세포에서 몇 개의 집락이 형성되는지를 계수하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 집단 배가 시간 및 집락형성능을 측정하였다. 집락형성능의 경우 태반 전체 유래 줄기세포의 결과값을 100%로 하여 환산하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 집단 배가 시간(population doubling time)이 현저하게 짧아 세포 증식이 빠름을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 집락 형성능이 현저하게 우수함을 확인하였다.
실시예 4: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 표 면 마커 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 면역학적 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트리플 처리한 뒤 줄기세포를 수거하여 1000 rpm에서 4분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 비특이적 결합을 억제하기 위해 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 줄기세포를 세척한 후, 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 줄기세포를 PBS에 부유시켜 1 ×105 cell씩 플로우사이토미터 전용 둥근 플라스크에 분주하였다. 여기에 항체(PE-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 각각 넣고, 얼음에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 마지막으로 상층액을 제거한 후 줄기세포를 싱글화하고, 플로우사이토미터(FACS)를 이용해 면역학적 특성을 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 면역학적 특성을 분석하였다. 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
Figure 112016026500420-pat00001
표 1 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표지인자 발현 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표지인자 발현 특성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골 세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 연골세포 분화 유도 배지(0.1 μM 덱사메타손, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 40 ㎍/㎖ L-프롤린, 10 ng/㎖ TGF-β3, 500 ng/㎖ BMP-6, 50 mg/ml ITS premix가 포함된 DMEM 배지)에서 3주 동안 배양하여 연골세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Safranin-O 염색 및 Type II 콜라겐을 이용한 면역화학염색법을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7 내지 도 9에 나타내었다.
도 7 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 연골세포로 분화될 수 있는 우수한 연골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 6: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 골 세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 골세포 분화 유도 배지(10% FBS, 1% anti-biotics, 100 μM 덱사메타손, 50 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 μM β-글리크로포스페이트, 250 μM 아스코르브산이 포함된 DMEM 배지)에서 4주 동안 배양하여 골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 분화 유도 시작 후 2주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 ALP(Alkaline phosphate) 염색법으로 염색하였고, 4주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 Alizarin red S 염색법으로 염색함으로써, 골세포로의 분화 정도를 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7, 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 7, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 골세포로 분화될 수 있는 우수한 골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 7: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 지방 세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 지방세포 분화 유도 배지 1(10% FBS, 1% Anti-biotics, 1 μM 덱사메타손, 20 μM 인도메타신, 10 μM 인슐린, 50 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)가 포함된 DMEM 배지) 및 지방세포 분화 유도 배지 2(10% FBS, 1% Anti-biotics, 10 μM 인슐린이 포함된 DMEM 배지)를 3~4일씩 교대로 가하여 3주 동안 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 지방세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Oil red O 염색을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7 및 도 12에 나타내었다.
도 7 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 지방세포로 분화될 수 있는 우수한 지방세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 8: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골 손상 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과 검증
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 조직 결손 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과를 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 가토(rabbit) 관절 연골 손상 동물모델을 제작하기 위하여, 건강한 가토를 선택하여 체중에 따른 적절한 양의 케타민과 럼푼으로 주사마취한 후, 가토가 충분히 전신마취가 되었음을 확인하고, 양쪽 하지의 슬관절 부위를 면도한 후, 자세를 유지시키면서 반창고로 고정하였다. 양측 슬관절 부위를 포비돈으로 소독하고, 슬개골을 촉지하여 위치를 확인한 후, 슬관절의 위, 아래, 슬개골의 내측을 지나는 절개선을 따라 방정중 접근(paramedian approach)으로 슬관절 내에 도달하고, 슬개골을 외측으로 젖히면서 슬관절을 굴곡시켜 관절 내부를 관찰하였다. 특이한 병적 소견이 없음을 확인한 후, 슬개골구 중앙 과간와(顆間窩, interchondylar notch)의 상단 앞 끝에서 1 ㎜ 위쪽에 뾰족한 송곳으로 흠집을 낸 후, 이를 중심으로 하여 드릴로 지름 3 ㎜, 깊이 5 ㎜의 구멍을 만들어 연골 전층(full thickness)에 손상을 주었다. 상기와 같이 연골 손상을 유발한지 8주와 16주 후에 손상 부위를 관찰하여, 연골 손상 부위가 천연 치유되지 않음을 확인하였다. 주사기를 이용하여 히알루론산과 본 발명에 따른 영양막 기저층 유래 줄기세포를 섞은 뒤, 500 ㎕를 상기 동물 모델의 오른쪽에 만들어진 연골 손상 부위에 주입하였다(상기 500 ㎕는 조성물의 양이 모자라거나 시술 시 실수할 경우를 생각하여 시술 편의상 여유있게 준비한 것임). 이후 슬개골을 원래 위치로 되돌린 후, 슬개골 주위의 연부 조직을 흡수성 실로 봉합하고, 피부를 비흡수성실로 봉합하였다. 반대측 다리에는 양성대조군으로 히알루론산과 제대혈 유래 줄기세포를 섞어 동량을 주입하였다. 가토가 마취에서 깨어나는 것을 확인한 후 자유롭게 움직일 수 있도록 허용하였으며, 수술 후 5일간 감염을 막기 위해 진통제와 항생제를 투여하였다. 8주와 16주가 경과한 후, 각 가토로부터 손상 및 치료를 수행하였던 관절 연골 부위의 절편을 얻어 H&E 및 Safranin O 염색을 수행하였으며, ICRS(International Cartilage Repair Society) macroscopic score를 이용한 정량화를 통해 새로 형성된 연골을 분석하였다. 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포를 주입한 군은 제대혈 유래 줄기세포을 주입한 군에 비해 새로 생성된 연골 세포층의 전체적인 두께가 2배 이상인 것을 확인하였다. 따라서 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 손상된 관절 연골 부위에서 연골세포를 우수한 효율로 생성할 수 있어, 효과적으로 관절 연골 손상을 치료할 수 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 종래의 태반 전체로부터 유래한 줄기세포가 다양한 특성을 가지는 세부조직으로부터 유래된 줄기세포가 혼합되어 있어 서로 다른 세포로 분화하는 능력이 균일하게 나타나지 않는데 반해, 본 발명에 따른 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 우수한 분화능과 기타 줄기세포의 여러 특성에 대한 균질성의 측면에서 볼 때, 종래의 태반 전체 유래 줄기세포에 비하여 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 영양막 기저층 유래 줄기세포는 다른 태반 세부조직인 융모막, 융모-영양막, 영양막 및 영양막 상층부 유래 줄기세포보다 성장, 증식, 형태 및 분화의 특성에서 일관된 양상을 보여 주었고, 가장 우수한 줄기세포의 특성을 보여주었다. 따라서 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 이용할 경우 목적하는 세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있으며, 다양한 질환에서 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 태반으로부터 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)을 분리하는 단계; 및
    상기 영양막 기저층에서 줄기세포를 분리하는 단계; 를 통해 얻어진 태반의 세부조직인 영양막 기저층 유래 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며,
    상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 가지며, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 줄기세포인, 연골 재생용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)인 것을 특징으로 하는, 연골 재생용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 연골 재생용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양막 기저층은 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 중 융모막과 근접한 부위로부터 20 내지 30% 두께에 해당하는 조직인 것을 특징으로 하는, 연골 재생용 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론산을 더 포함하는 연골 재생용 조성물.
  6. 태반으로부터 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)을 분리하는 단계; 및
    상기 영양막 기저층에서 줄기세포를 분리하는 단계; 를 통해 얻어진 태반의 세부조직인 영양막 기저층 유래 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며,
    상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 가지며, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 줄기세포인,
    연골 재생용 세포 치료제.
  7. 제6항에 있어서, 히알루론산을 더 포함하는 연골 재생용 세포 치료제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)인 것을 특징으로 하는, 연골 재생용 세포 치료제.
  9. 제6항에 있어서, 상기 연골 재생은 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 및 골관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 연골 결함에 있어서 연골을 재생하는 것인, 연골 재생용 세포 치료제.
  10. 태반으로부터 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)을 분리하는 단계; 및
    상기 영양막 기저층에서 줄기세포를 분리하는 단계; 를 통해 얻어진 태반의 세부조직인 영양막 기저층 유래 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며,
    상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 가지며, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 줄기세포인,
    골관절염 치료용 세포 치료제.
  11. 제10항에 있어서, 히알루론산을 더 포함하는 골관절염 치료용 세포 치료제.
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