KR20040039382A

KR20040039382A - 골격근 간질 유래 다분화능 줄기세포

Info

Publication number: KR20040039382A
Application number: KR10-2004-7004069A
Authority: KR
Inventors: 데쯔로 다마끼; 기요시 안도; 아끼라 아까쯔까; 요시히꼬 나까무라; 도모미쯔 호따; 가즈히로 사꾸라다
Original assignee: 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤; 데쯔로 다마끼; 기요시 안도
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-20
Publication date: 2004-05-10
Also published as: EP1437406A4; JPWO2003027281A1; WO2003027281A3; EP1437406A2; CA2461121A1; US20050079606A1; WO2003027281A2

Abstract

본 발명은 골격근의 간질에서 유래하는 다분화능 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명의 다분화능 줄기세포는 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포로 분화하는 능력을 가지고, 조직이나 세포의 재생, 심부전, 간부전, 신부전, 백혈병, 신경변성질환, 관절염, 당뇨병, 동맥경화 등의 치료에 유용하다.

Description

골격근 간질 유래 다분화능 줄기세포{PLURIPOTENT STEM CELLS ORIGINATING IN SKELETAL MUSCLE INTESTINAL TISSUE}

근육 중의 위성 세포는 탄생 후의 근육의 증식, 수복 및 유지에 작용하는 근육 분화 유도능을 갖는 특수한 세포로서 알려져 있다 (Dev. Biol.,218; 115-124, 2000). 마우스의 위성 세포는 탄생 시에는 근육 섬유 내의 라미나막의 내측에 존재하는 핵의 약 30 % 를 차지하지만, 2 개월 후에는 약 5 % 까지 감소한다 (Myogenesis [AG Engel and C. Franszini-Amstrong, eds, New York : McGraw-Hill] pp97-118, 1994). 이러한 위성 세포의 감소는 탄생 후의 근육의 성장을 반영하고 있다 (Muscle Nerve,6, 574-580, 1983). 또한, 위성 세포는 성숙한 성인의 근육에 존재하고, 라미나막의 내측에 근접한 위치에서 근육 섬유와 접촉하고 있다는 특징을 가지고 있다 (Myogenesis [AG Engel and C. Franszini-Amstrong, eds,New York : McGraw-Hill] pp97-118, 1994).

마우스에서는 2 개월을 지나면 위성 세포는 세포 분열을 정지하여 휴지기에 들어간다. 그러나, 위성 세포는 신장, 운동, 상처, 전기 자극 등의 여러 가지 자극을 받아 활성화하는 것이 알려져있다 (Muscle Nerve,8, 217-222, 1985; Int. J. Sports Med., 9, 297-299, 1988; Muscle Nerve,17, 608-613, 1994 ; Myogenesis [AG Engel and C. Franszini-Amstrong, eds, New York : McGraw-Hill] pp97-118, 1994). 위성 세포의 자손인 근육 전구 세포는 복수회의 세포 분열을 일으킨 후에 근육 세포로 분화하여 인접하는 근육 섬유와 융합한다. 한편, 휴지기의 위성 세포 자체의 수는 변성과 재생을 반복해도 변화하지 않기 때문에, 위성 세포는 자기 복제에 의해 일정한 수로 유지되고 있다 (Muscle Nerve,6, 574-580, 1983 ; Mech. Ageing Dev.30, 63-72, 1985; Anat. Embryol.,180, 471-478, 1989). 따라서, 위성 세포는 단분화능을 갖는 줄기세포로서, 그의 자손인 근육 전구 세포와는 생물학적으로도 생화학적으로도 상이한 성질을 가지고 있다 (Mol. Cell. Biol. Hum. Dis.,3, 210-256, 1993 ; Myogenesis [AG Engel and C. Franszini-Amstrong, eds, New York : McGraw-Hill] pp97-118, 1994).

이상으로부터 위성 세포는 성체의 근육 중에 존재하고, 장래 근육이 되는 근육 전구 세포를 유도하는 생리 기능을 갖는 것으로 생각된다.

위성 세포에 더하여, 최근 골격근 내에 다능성 (pluripotency) 을 갖는 side-population cell (SP 세포) 이라는 줄기세포가 존재하는 것이 나타났다. SP 세포는 헥스트 ·다이 (Hoechst 33342) 를 배출한다는 성질을 이용하여 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 에 의해 분리할 수 있다 (Nature,401, 390-394, 1999 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96, 14482-14486, 1999). 조직으로부터 분리된 SP 세포를 방사선에 의해 골수를 파괴한 마우스에 이식하면 모든 주요한 혈액 세포로 분화하는 것이 나타나있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96, 14482-14486, 1999). 또한, 골수 및 근육에서 분리된 SP 세포는 근육을 재생하는 능력도 갖는다는 특징을 가진다. 그러나, 위성 세포가 될 수 있는 것은 근육 유래의 SP 세포뿐이었다 (Nature,401, 390-394, 1999). 또한, SP 세포는 적당한 배양 조건에 둠으로써 데스민 양성의 근육으로 분화하는 것도 나타났다 (Nature,401, 390-394, 1999). 한편, Pax7 유전자를 녹아웃한 마우스에서는 근육의 위성 세포가 완전히 소실되어 SP 세포가 증가하고 있는 것이 발견되었다 (Cell,102, 777-786, 2000).

이 결과는 위성 세포와는 상이한 다능성 줄기세포가 골격근에 존재하는 것을 시사하고 있다. 그러나, 위성 세포와는 상이한 줄기세포가 골격근의 어디에 존재하고, 어떤 생리 기능이나 분화능을 갖고 있는지는 밝혀져 있지 않다.

한편, 위성 세포는 m-카드헤린 양성 및 CD34 음성을 나타내는 세포인 것이 알려져 있고, 또한 골격근으로부터 분리된 SP 세포는 CD34 음성, Sca-1 양성, c-kit 음성 및 CD45 음성을 나타내는 세포 (Nature,401, 390-394, 1999) 인 것이 알려져있다.

나이가 들어가거나 만성 질환, 상처 등을 원인으로 하는 조직의 장해나 장기부전은 고령화 사회를 맞이하여 큰 문제가 되고 있다. 현재, 조직이나 장기의장해를 약물로 치료하는 방법은 없고, 병의 진행에 따라 환자는 병상에 눕거나 간호를 필요로 하는 상태가 된다. 한편, 장기 이식도 공여자 부족 외에 감염증이나 거절 반응의 문제가 있다. 최근의 성체 줄기세포 생물학의 진전으로부터, 우리 성체의 여러 가지 조직에 체성(體性) 줄기세포가 존재하는 것이 시사되어 있다. 또한, 나이가 들어감에 따라 이들 체성 줄기세포가 감소하는 것이 고령자의 조직 장해나 장기부전의 근본적인 원인으로서 생각되게 되고 있다. 따라서, 손실된 체성 줄기세포를 보충하는 치료는 조직 장해나 장기부전의 치료에 유효하다고 생각되고 있다 (세포,33, 101-104, 2001).

본 발명은 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포 등으로의 분화능을 갖는 골격근 간질에서 유래하는 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 줄기세포를 함유하는 조직 또는 세포의 재생약 등의 의약 및 상기 세포의 이용방법에 관한 것이다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (24) 에 관한 것이다.

(1) 골격근의 간질에서 유래하는 다분화능 줄기세포.

(2) c-met 양성을 나타내는 상기 (1) 기재의 다분화능 줄기세포.

(3) CD34 양성을 나타내는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 다분화능 줄기세포.

(4) Sca1 양성을 나타내는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포.

(5) m-카드헤린 음성을 나타내는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포.

(6) CD45 음성을 나타내는 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포.

(7) CD14 음성, CD31 음성, CD49d 음성, CD117 음성, FLK-1 음성 및 CD144음성을 나타내는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포.

(8) CD34 음성, CD45 음성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성을 나타내는 상기 (1) 기재의 다분화능 줄기세포.

(9) 적어도 골격근 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(10) 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈관내피 세포 및 지방 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(11) 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액세포, 혈관내피세포, 지방 세포, 연골 세포, 골아 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 각막 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 세포.

(12) 골격근이 포유동물 유래의 것인 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 세포

(13) 포유동물이 인간 및 래트에서 선택되는 것인 상기 (12) 기재의 세포.

(14) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.

(15) 의약이 조직 또는 세포의 재생약인 상기 (14) 기재의 의약.

(16) 의약이 장기부전의 치료약인 상기 (14) 기재의 의약.

(17) 조직 또는 세포가 근육, 심장, 혈액, 혈관, 뼈, 관절, 췌장, 간장, 신경계의 조직 또는 세포인 상기 (15) 기재의 의약.

(18) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 특이적으로 인식하는 항체.

(19) 상기 (18) 기재의 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 골격근으로부터 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 정제하는 방법.

(20) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 세포를 증식시키는 물질을 스크리닝하는 방법.

(21) 상기 (1) 내지 (13) 의 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 세포로부터 각종 세포로의 분화를 유도하는 물질을 스크리닝하는 방법.

(22) 각종 세포가 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액세포, 혈관내피세포, 지방 세포, 골아 세포, 연골 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 피부 세포 및 각막 세포에서 선택되는, 상기 (21) 기재의 스크리닝 방법.

(23) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 불사화(不死化)시키는 방법.

(24) 스피어를 형성시키는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 분리하는 방법.

줄기세포 (Stem Cell) 란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하고, 다분화능 줄기세포 (Multipotent stem cell)라고도 한다.

다분화능 줄기세포 중, 생체 내의 모든 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 다능성 줄기세포 (Pluripotent stem cell) 라고 하고, 또한 개체를 재구축하는 능력을 갖는 세포를 전능성 줄기세포 (Totipotent stem cell) 라고 한다.

줄기세포로서는, 배반포로부터 취득되는 ES 세포 (배성 줄기세포), 조직 중에 존재하는 체성 줄기세포 및 생식 세포로 분화하는 생식성 줄기세포 등을 들 수 있다.

체성 줄기세포와 생식성 줄기세포는 다시 성체 유래와 태아 유래의 둘로 분류할 수 있다. 인체를 구성하는 세포에는 각각 특유의 수명이 존재함에도 불구하고, 평생 조직이나 장기의 세포수에 큰 변화는 일어나지 않는다. 이것은 사멸한 세포를 보충하기 위해 세포의 재생 ·신생이 엄밀한 제어하에 생애에 걸쳐 실시되고 있기 때문이다. 이렇게, 성체 조직에서의 세포의 재생 ·신생을 실시하는 기능을 갖는 세포가 체성 줄기세포 (조직 줄기세포) 이다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 신규의 성체 체성 줄기세포로 분류되고, 자기 복제능과 체성 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 체성 세포로서는 성체 조직을 구성하는 세포라면 어느 것이라도 좋지만, 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액세포, 혈관내피세포, 지방 세포, 골아 세포, 연골 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 피부세포, 각막 세포 등 통상 자기 복제능을 갖지 않는 세포를 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포로서는, 세포 표면 항원에 대해서 이하의 (1)내지 (6) 중 어느 하나 또는 복수의 성질을 갖는 세포 및 (7) 의 성질을 갖는 세포를 들 수 있다.

(1) c-met 양성을 나타낸다.

(2) CD34 양성을 나타낸다.

(3) Sca1 양성을 나타낸다.

(4) m-카드헤린 음성을 나타낸다.

(5) CD45 음성을 나타낸다.

(6) CD14 음성, CD31 음성, CD49d 음성, CD117 음성, FLK-1 음성 및 CD144 음성을 나타낸다.

(7) CD34 음성, CD45 음성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성을 나타낸다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 골격근의 간질에서 유래하고, 적어도 골격근 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 즉, 본 발명의 다분화능 줄기세포는 골격근 세포와 그 이외의 세포, 바람직하게는 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈관내피세포 및 지방 세포, 보다 바람직하게는 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액세포, 혈관내피세포, 지방 세포, 연골 세포, 골아 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 각막 세포로 분화하는 능력을 갖는다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 골격근의 간질에서 유래하지만, 상기 골격근으로서는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 염소, 원숭이, 인간 등의 포유동물의 골격근이 사용된다. 본 발명의 다분화능 줄기세포를 인간의 치료용도에 사용하는 경우에는 인간 유래인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 분리 ·정제하는 방법을 설명한다.

1. 골격근 간질 세포를 생체로부터 분리하는 방법

인간의 골격근에서 다분화능 세포를 취득하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 이하의 방법으로 취득할 수 있다.

세포 치료를 필요로 하는 환자의 상완이두근의 외측두나 하퇴의 봉공근 등의 근육을 포함하는 결합 조직을 절피하여 적출 후 봉합한다. 취득한 전체 근육은 가위 혹은 메스를 이용하여 잘게 다진 후, 0.06 % 콜라게나아제 및 10 % FBS 함유 고농도 글루코오스 배지에 현탁하여 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션한다. 잘게 다진 근육에서 분리해낸 세포를 회수한 후, 원심분리법에 의해 세포를 회수하고, 10 % FBS 함유 고농도 글루코오스 배지에 현탁한다. 상기 현탁액을 우선 반경 40 ㎛ 마이크로필터를 통과시킨 후, 반경 20 ㎛ 의 마이크로필터를 통과함으로써 인간 골격근 간질 세포액을 얻을 수 있다.

래트나 마우스로부터 다분화능 줄기세포를 취득하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 이하의 순서로 취득할 수 있다.

래트 혹은 마우스를 경추탈구에 의해 치사시키고, 70 % 에탄올로 충분히 소독한 후, 피부를 절제하여 대퇴사두근을 취득한다. 대퇴사두근은 가위나 메스를 이용하여 잘게 다진 후, 0.06 % 콜라게나아제 및 10 % FBS 함유 고농도 글루코오스 배지에 현탁하여 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션한다. 잘게 다진 근육에서 분리해낸 세포를 회수한 후, 원심분리법에 의해 세포를 회수하고 10 % FBS 함유 고농도 글루코오스 배지에 현탁한다. 상기 현탁액을 우선 반경 40 ㎛ 마이크로필터를 통과시킨 후, 반경 20 ㎛ 의 마이크로필터를 통과시킴으로써 래트 및 마우스 골격근 간질 세포액을 얻을 수 있다.

2. 다분화능 줄기세포를 취득하는 방법

상기 1 에서 얻어진 골격근 간질 세포액으로부터 목적의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 취득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법 [Int. Immunol.,10(3), 275-283(1998)], 자기 비즈를 사용하는 방법, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법 [J. Immunol.,141(8), 2797-2800 (1988)] 등을 들 수 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 본 발명의 다분화능 줄기세포를 취득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 있는 분자 (이하, 표면 항원이라 칭함) 를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 칼럼으로서 사용함으로써, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 취득할 수도 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다 (플로우 사이토미터 자유 자재, p14-23, 슈준사, 1999년). 어떠한 방법도 세포의 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체의 형광 측정을 실시하여, 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로써 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광의 종류를 조합함으로써, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 형광으로서는, FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), APC(Allo-phycocyanin), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, PerCP, TRI-Color, QuantumRed 등을 들 수 있다 (플로우 사이토미터 자유자재, p3-13, 슈준사, 1999년).

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 생체 내에서 취출한 골격근 조직으로부터 상기 1 의 방법에 따라 골격근 간질 용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과, 한번 적당한 배지 중에서 배양 ·증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차 항체와 목적 세포 샘플을 혼합하고, 얼음위에서 30 분 내지 1 시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30 분 내지 1 시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

자기 비즈를 사용하는 방법에서는, 목적 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 대량으로 분리할 수 있다. 분리 순도는 전술한 플로우 사이토미터를 사용하는 방법에는 미치지 않지만, 정제를 반복함으로써 충분히 높은 세포 순도를 확보할 수 있다.

구체적으로는, 골격근 간질 용액에 일차 항체를 반응시킨 후, 미반응 일차 항체를 제거하고, 일차 항체와 특이적으로 결합하는 자기 비즈를 결합시킨 이차 항체를 결합시킨다. 잔존하는 이차 항체를 세정하여 제거한 세포는 자석을 설치한 스탠드에서 분리한다. 이들의 조작에 필요한 재료 및 장치는 DYNAL 사로부터 입수할 수 있다.

자기 비즈를 사용하는 방법은 세포 샘플 중에서 불필요한 세포를 제거하는 경우에도 동일하게 이용할 수 있다. 불필요한 세포를 보다 효율적으로 제거하기 위해서는 Stem Cell Technologies사 (Vancouver, Canada) 에서 판매되고 있는 StemSep 를 사용하는 방법을 사용한다.

각종 표면 항원으로서는, 조혈계 세포의 표면 항원, 혈관내피 세포의 표면 항원, 간엽계 세포의 표면 항원, 인테그린의 표면 항원, 매트릭스 수용체, 접착 분자, 사이토카인 수용체 등을 들 수 있다.

조혈계 세포의 표면 항원으로서는 CD34, c-kit (CD117), CD14, CD45, CD90, Sca-1, Ly6c, Ly6g 등을 들 수 있고, 혈관내피 세포의 표면 항원으로서는 Flk-1, CD31, CD105, CD144 등을 들 수 있으며, 간엽계 세포의 표면 항원으로서는 CD140 등을 들 수 있고, 인테그린의 표면 항원으로서는 CD49b, CD49d, CD29, CD41 등을 들 수 있으며, 매트릭스 수용체로서는 CD54, CD102, CD106, CD44 등을 들 수 있고, 접착 분자로서는 m-카드헤린 등을 들 수 있으며, 사이토카인 수용체로서는 c-met 등을 들 수 있다.

전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로써, 목적으로 하는 세포를 취득할 수 있다.

예컨대, CD34 양성을 나타내는 세포를 취득하기 위해서는, 항 CD34 항체를결합시킨 칼럼에 상기 1에서 조제한 골격근 간질 용액을 통탑(通塔)함으로써 CD34 양성을 나타내는 세포를 항 CD34 항체와 결합시킨다. 통탑 후, 항 CD34 항체로부터 CD34 양성을 나타내는 세포를 용리 (溶離) 시킴으로써 목적의 세포를 분리할 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포를 분리하는 방법으로서 이하에 설명하는 배양법에 따라, 골수 간질 유래를 세포화한 후 스피어를 형성하는 세포의 분리 방법을 사용할 수도 있다. 스피어란 배양 상청 중에서의 세포 덩어리로서, 현미경하에서 접착성의 세포나 단세포에서 부유하는 세포 등과 용이하게 식별할 수 있다.

세포의 배양에 사용하는 배지로서는, 통상 공지 (조직 배양의 기술기초편, 제 3 판, 아사쿠라 서점 1996) 의 조성의 세포 배양용 배지를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 소 등의 혈청을 5 내지 20 % 첨가한 α-MEM, DMEM 혹은 IMDM 등의 세포 배양용 배지 등이 사용된다.

배양 조건으로서는 세포가 배양 가능하면 어떠한 조건이라도 좋지만, 배양 온도는 33 내지 37 ℃ 가 바람직하고, 또한 5 내지 10 % 의 이산화탄소가스로 가득찬 부란기에서 배양하는 것이 바람직하다.

배양은 통상의 조직 배양용 플라스틱제 배양접시에 접착 혹은 부유시켜 실시하는 것이 바람직하다. 세포를 접착하여 배양하는 경우에는 배양접시 일면에 세포가 증식할 무렵, 배지를 제거하여 트립신, EDTA 용액을 가함으로써 세포를 부유시킨다. 부유된 세포는 PBS 혹은 상기 세포 배양용 배지에서 세정 후, 상기 세포 배양용 배지에서 5 배 내지 20 배 희석하여 새로운 배양접시에 첨가함으로써다시 계대 배양할 수 있다.

상기 방법에서 취득된 본 발명의 다분화능 줄기세포는 전술한 각종 표면 항원에 대한 항체를 사용한 FACS 법에 의해 세포의 순도를 검정할 수 있다.

3. 본 발명의 다분화능 줄기세포의 검정 방법

본 발명의 다분화능 줄기세포는 이하의 방법으로 검정된다.

상기 2 의 방법으로 분리된 본 발명의 다분화능 줄기세포를 96 웰의 배양 플레이트에 1 세포/웰이 주입되도록 희석하여 상기 세포액을 각 웰에 넣는다. 그 후, 세포 배양을 실시하고 분화 유도된 세포를 이하의 방법으로 해석함으로써 본 발명의 다분화능 줄기세포를 검정할 수 있다.

세포의 배양에 사용하는 배지로서는, 통상 공지 (조직배양의 기술기초편 제 3 판, 아사쿠라 서점 1996) 의 조성의 세포 배양용 배지를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 소 등의 혈청을 5 내지 20 % 첨가한 α-MEM, DMEM 혹은 IMDM 등의 세포 배양용 배지 등이 사용된다.

배양은 통상의 조직 배양용 플라스틱제 배양접시에 접착 혹은 부유시켜 실시하는 것이 바람직하다. 세포를 접착하여 배양하는 경우에는 배양접시 일면에 세포가 증식할 무렵, 배지를 제거하여 트립신, EDTA 용액을 가함으로써 세포를 부유시킨다. 부유한 세포는 PBS 혹은 상기 세포 배양용 배지에서 세정한 후, 상기 세포 배양용 배지에서 5 배 내지 20 배 희석하여 새로운 배양접시에 첨가함으로써 다시 계대 배양할 수 있다.

이상의 방법으로 세포를 배양한 결과, 세포가 증식되면 상기 세포는 자기 복제능을 가지고 있게 된다.

또한, 다분화능을 갖고 있는지에 대해서는 배양한 세포로부터 램덤으로 출현하는 분화된 세포를 동정하거나, 세포가 증식을 정지하여 분화로 진행하도록 배양을 컨플루언트하게 한 후 분화한 세포를 동정함으로써 검정할 수 있다.

분화한 세포의 동정 방법으로서는, 분화한 세포의 마커를 인식하는 항체 또는 DNA/RNA 등의 프로브를 사용하는 공지의 방법 (면역 염색·in situ 하이브리다이제이션, 별책 실험의학, 노지 스미하레 편집, 요도사) 을 사용할 수 있다.

분화한 세포를 식별하는 마커로서는 이하의 것을 들 수 있다.

뉴런을 식별하는 마커로서는, Microtuble associate protein 2ab, Neurofilament 등을 들 수 있다. 글리아(glia)를 식별하는 마커로서는 glial fibrillary acidic protein 을 들 수 있다. 심근을 식별하는 마커로서는, Mkx2.5, GATA4, cardiac Troponin I 등을 들 수 있다. 근육을 식별하는 마커로서는, MyoD 등을 들 수 있다. 지방 세포를 식별하는 마커로서는, Peroxisome Proliferation-activated receptor γ2, lipoprotein lipase, fatty acid-binding protein 등을 들 수 있다. 혈관내피를 식별하는 마커로서는, kdr/flk1, Low density lipoprotein receptor 등을 들 수 있다. 혈액세포를 식별하는 마커로서는 CD45 를 들 수 있다. 뼈를 식별하는 마커로서는 알칼리포스페타아제를 들수 있다. 연골을 식별하는 마커로서는 타입 II 콜라겐을 들 수 있다. 췌장 β 세포를 식별하는 마커로서는 인슐린을 들 수 있다. 간장 세포를 식별하는 마커로서는 알부민을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 검정하는 다른 방법으로서는 NOD-SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficinet) 마우스에 GFP 등의 마커에 의해 표지된 본 발명의 다분화능 줄기세포를 이식하고, 전술한 면역 염색 혹은 in situ 하이브리다이제이션에 의해 분화 유도한 세포를 해석하는 방법을 들 수 있다.

4. 본 발명의 다분화능 줄기세포를 배양하는 방법

상기 2 의 방법에 의해 분리한, 다분화능 줄기세포를 배양하기 위해 사용하는 배지로서는, 통상 공지 (조직 배양의 기술기초편 제 3 판, 아사쿠라 서점 1996) 의 조성의 세포 배양용 배지를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 소 등의 혈청을 5 내지 20 % 첨가한 α-MEM, DMEM 혹은 IMDM 등의 세포 배양용 배지 등이 사용된다. 배양 조건으로서는 세포가 배양 가능하면 어떠한 조건이라도 좋지만, 배양 온도는 33 내지 37 ℃ 가 바람직하고, 또한 5 내지 10 % 의 이산화탄소가스로 가득찬 부란기에서 배양하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다분화능 줄기세포는 통상의 조직 배양용 플라스틱제 배양접시에 접착 혹은 부유시켜 증식하는 것이 바람직하다. 세포를 접착하여 배양하는 경우에는 배양접시 일면에 세포가 증식할 무렵, 배지를 제거하여 트립신, EDTA 용액을 가함으로써 세포를 부유시킨다. 부유한 세포는 PBS 혹은 상기 세포 배양용 배지에서 세정한 후, 상기 세포 배양용 배지에서 5 배 내지 20 배 희석하여 새로운 배양접시에 첨가함으로써 다시 계대 배양할 수 있다.

5. 본 발명의 다분화능 줄기세포를 포함하는 재생 치료약 또는 세포 치료약

본 발명의 다분화능 줄기세포는 각종 조직 또는 세포의 재생 또는 각종 장기부전의 치료약으로서 사용할 수 있다.

장기부전으로서는 성체 조직이나 세포의 파괴나 변성을 수반하는 질환이면 특별히 한정되지 않지만, 심부전, 간부전, 신부전, 백혈병, 신경변성질환, 관절염, 당뇨병, 동맥경화 등을 들 수 있다.

상기 질환에 의한 장기의 장해 부위 또는 장해의 크기에 따라, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 in vitro 에서 배양함으로써 분화 ·증식시키고, 상기 세포를 장기의 장해 부위로 이식함으로써 각종 장기부전을 치료할 수 있다. 또는, 장기의 장해 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

심부전의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 심근 세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 심근 세포로서는, 심근내피 세포 (Endocardial endothelial cell), 쿠션 세포 (Cushion cell), 심실형 심근 세포, 심방형 심근 세포, 동결근 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 심장의 장해 부위 또는 장해의 크기에 따라 in vitro 에서 분화 ·증식시켜 원하는 심근 세포를 취득하고, 이것을 심장 장해 부위로 이식함으로써 심부전의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 심장 장해 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

신부전의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 신장 네프론으로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 신장 네프론으로서는, 메산지움 세포, 포드사이토, 근위 요세관 세포, 원위 요세관 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 신장의 장해 부위 또는 크기에 따라 in vitro 에서 분화 ·증식시켜 원하는 신장세포를 취득하고, 이것을 신장 장해 부위로 이식함으로써 신부전의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 신장 장해 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

신경 변성 질환의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 신경계의 세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 신경계의 세포로서는, 바람직하게는 도파민 작동성 뉴런, 콜린 작동성 뉴런 등의 중추 신경계, 말초 신경계의 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 신경의 장해 부위 또는 크기에 따라, in vitro 에서 분화 ·증식시켜 원하는 신경계의 세포를 취득하고, 이것을 신경의 장해 부위로 이식함으로써 신경 변성 질환의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 신경의 장해 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

관절염의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 관절을 형성하는 세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 관절을 형성하는 세포로서는, 바람직하게는 연골 세포, 뼈, 인대 등을 들 수 있다

본 발명의 다분화능 줄기세포는 관절염 부위 또는 크기에 따라, in vitro 에서 분화 ·증식시키고, 원하는 관절을 형성하는 세포로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 관절의 장해 부위로 이식함으로써 관절염의 치료에 사용할 수 있다.

당뇨병의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 췌장 내분비 세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 췌장 내분비 세포로서는, β 세포, α 세포, δ 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 질환의 중함에 따라, in vitro 에서 분화 ·증식시켜 원하는 췌장 내분비 세포로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 췌장 질환 부위로 이식함으로써 당뇨병의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 췌장 질환 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

동맥경화의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 혈관세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 혈관세포로서는, 혈관내피 세포나 혈관 평활근 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 동맥경화 부위 또는 크기에 따라 in vitro 에서 분화 ·증식시킴으로써, 원하는 혈관으로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 동맥경화 부위로 이식함으로써 동맥경화의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 동맥경화의 장해 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

백혈병의 치료약으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 혈액으로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다. 혈액으로서는, 바람직하게는 조혈 줄기세포로부터의 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 필요량에 따라, in vitro 에서 분화 ·증식시킴으로써, 원하는 혈액으로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 골수에 이식함으로써 백혈병의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 골수로 직접 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

6. 본 발명의 다분화능 줄기세포를 인식하는 항체의 취득

이하에서, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법에 대해서 설명한다.

본 발명의 다분화능 줄기세포 3 내지 5 ×10⁵cells/마리 혹은 상기 세포로부터 조제한 세포막 획분 1 내지 10 ㎎/마리를 항원으로 하여 토끼, 염소 또는 3 내지 20 주령의 래트, 마우스 혹은 햄스터 등의 비인간 포유동물의 피하, 정맥내 또는 복강내에 적당한 면역 반응 항진제 [예컨대, 프로인드의 완전 면역 반응 항진제 (Complete Freund's Adjuvant) 또는 수산화알루미늄겔, 백일해균 백신 등] 과 함께 투여한다.

상기 항원의 투여는 1 회째 투여 후 1 내지 2 주간 간격으로 3 내지 10 회 실시한다. 각 투여 후 3 내지 7 일째에 안저정맥총에서 채혈하고, 상기 혈청이 면역에 사용한 항원과 반응하는지 여부를 산소 면역 측정법 [산소 면역 측정법 (ELISA 법) : 의학서원간 1976년, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 등에서 조사한다.

면역에 사용한 항원에 대해서 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 비인간 포유동물을 혈청 또는 항체 생성 세포의 공급원으로 한다.

폴리클로날 항체는 상기 혈청을 분리, 정제함으로써 조제할 수 있다.

모노클로날 항체는 상기 항체 생성 세포와 비인간 포유동물 유래의 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 제작하고, 상기 하이브리도마를 배양하거나 동물에 투여하여 상기 동물을 복수암화시키며, 상기 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 조제할 수 있다.

항체 생성 세포로서는, 비장세포, 림프절, 말초혈중의 항체 생성 세포, 특히 비장세포가 바람직하게 사용된다.

골수종 세포로서는 8-아자구아닌 내성 마우스 (BALB/c 유래) 골수종 세포주인 P3-X63Ag8-U1(P3-U1) 주 [Current Topics in Microbiology and Immunology,18, 1(1978)], P3-NS1/1-Ag41(NS-1) 주 [European J. Immunology,6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14(SP-2) 주 [Nature,276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653) 주 [J. Immunology,123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8(X63) 주 [Nature,256, 495 (1975)] 등 마우스 유래의 주화 세포가 바람직하게 사용된다.

하이브리도마 세포는 이하의 방법에 의해 제작할 수 있다.

항체 생성 세포와 골수종 세포를 혼합하고, HAT 배지 (정상 배지에 히포크산틴, 티미딘 및 아미놉테린을 첨가한 배지) 에 현탁한 후, 7 내지 14 일간 배양한다. 배양 후 배양 상청의 일부를 취하여 산소 면역 측정법 등에 의해 항원에 반응하고, 항원을 포함하지 않는 단백질에는 반응하지 않는 것을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하고, 산소 면역 측정법에 의해 안정되고 높은 항체가가 발견된 것을 모노클로날 항체 생성 하이브리도마 세포로서 선택한다.

폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 분리, 정제하는 방법으로서는, 원심 분리, 황산암모늄 침전, 카프릴산 침전, 또는 DEAE-세파로오스칼럼, 음이온 교환 칼럼, 프로테인 A 또는 G-칼럼 혹은 겔 여과 칼럼 등을 사용하는 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 처리하는 방법을 들 수 있다.

상기 방법으로 취득한, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여, 검체 세포가 본 발명의 다분화능 줄기세포에 특이적인 표면 항원을 발현하고 있는지의 여부를 용이하게 검정할 수 있다.

7. 본 발명의 다분화능 줄기세포에서 발현하고 있는 표면 항원 및 상기 표면 항원을 코딩하는 유전자의 취득

본 발명의 다분화능 줄기세포에서 특이적으로 발현하고 있는 표면 항원 유전자는 두 개의 상이한 유래의 샘플 사이에서 상이한 발현 형태를 취하는 유전자를 취득하는 방법인 서브트랙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA85, 5738-5742 (1988)] 이나 Representational difference analysis [Nucleic Acids Research,22, 5640-5648 (1994)] 에 의한 방법에 의해 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.

우선, 다분화능을 갖는 골격근 간질 유래 줄기세포에서 제작한 cDNA 라이브러리를 본 발명의 다분화능 줄기세포 이외의 대조 세포에서 취득한 mRNA 를 사용하여 서브트랙션을 실시한다. 본 발명의 다분화능 줄기세포에 특이적으로 발현하고 있는 유전자를 농축한 차분화 cDNA 라이브러리를 조제한 후, 상기 차분화 cDNA 라이브러리의 삽입 cDNA 서열을 5'말단측에서 랜덤하게 염기 서열 해석을 실시하고, 분비 시그널 서열을 가지는 것만을 선택한다 (랜덤 서열 해석). 이렇게 하여 얻어진 표면 항원을 코딩하는 cDNA 의 전장 염기 서열을 결정함으로써, 상기 cDNA 가 코딩하는 단백질이 분비 단백질인지 막 단백질인지를 구별할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 랜덤 서열 해석 대신에 시그널 시퀀스 트랩법을 사용할 수도 있다 [Science,261, 600-603 (1993); Nature Biotechnology, 17, 487-490 (1999)]. 시그널 시퀀스 트랩법이란, 분비 시그널 서열을 가지는 유전자를 선택적으로 스크리닝하는 방법이다.

효율적으로 특이적인 표면 항원을 취득하기 위해서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포 유래의 시그널 시퀀스 트랩 라이브러리를 제작할 때에 서브트랙션을 실시하는 것이 가능한 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다분화능 줄기세포로부터 제작한 시그널 시퀀스 트랩 라이브러리를 대조 세포에서 취득한 mRNA 를 사용하여 서브트랙션을 실시하고, 분비 시그널 서열을 포함하는 DNA 단편을 취득한다. 이렇게 하여 취득된 분비 시그널 서열을 포함하는 DNA 단편은 전장 cDNA 를 크롬화하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 분비 시그널 서열을 포함하는 DNA 단편을 프로브로 하여 표면 항원를 코딩하는 전장 cDNA 를 취득할 수 있다.

표면 항원을 코딩하는 전장 cDNA 는 그의 전장 염기 서열을 해석함으로써, 상기 cDNA 가 코딩하는 단백질이 분비 단백질인지 막단백질인지를 구별할 수 있다.

랜덤 서열 해석 혹은 시그널 시퀀스 트랩법을 사용한 경우에도 얻어진 크롬이 막단백질을 코딩하는 경우는 염기 서열로부터 유추되는 아미노산 서열에 의거하여 합성 펩티드를 제작하고, 상기 합성 펩티드를 항원으로 하여 상기 방법에 의해 특이적인 항체를 취득할 수 있다.

또한, 막단백질의 경우는 수용체인 경우도 있다. 수용체인 경우에는 다분화능 줄기세포의 특이적인 증식, 또는 여러 가지 세포로의 분화의 조절에 작용하고 있을 가능성이 있어 해당 수용체의 리간드의 탐색에 사용할 수 있다. 분비 단백질의 경우는 다분화능 줄기세포를 증식 혹은 분화시키기 위해 사용할 수 있다.

8. 다분화능 줄기세포의 증식 인자 및 각종 세포로의 분화 유도 인자의 스크리닝 방법

본 발명의 다분화능 줄기세포의 증식 인자 및 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포 등으로의 분화 유도 인자의 스크리닝 방법으로서는, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 무혈청 배지 중에서 배양시킬 때에, 검체가 되는 여러 가지 물질을 첨가시켜 상기 세포가 증식하는지, 또는 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포 등의 세포로 분화 유도되는지를 측정함으로써 실시할 수 있다.

검체가 되는 물질로서는, 각종 사이토카인이나 증식 인자 등의 분비 단백질, 세포 접착 분자 등의 막결합 단백질, 조직 추출액, 합성 펩티드, 합성 화합물, 미생물 배양액 등의 어떠한 것이어도 좋다.

상기 검체 물질의 세포를 증식시키는 능력은 세포의 콜로니 형성능이나 BrdU 의 취입을 지표로 측정할 수 있다.

콜로니 형성능은 본 발명의 다분화능 줄기세포를 저밀도로 파종함으로써 조사할 수 있다.

BrdU 의 취입은 BrdU 를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 면역 염색에 의해 조사할 수 있다.

상기 검체 물질의 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포 등의 세포로 분화시키는 능력은 각 세포에 특이적으로 발현하는 마커를 지표로 하는 방법, 세포내에 도입한 리포터 유전자의 발현을 지표로 하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다.

각 세포에서 특이적으로 발현하는 마커를 지표로 하는 방법으로서는, 분화한 세포의 마커를 인식하는 항체 또는 DNA/RNA 등의 프로브를 사용하는 공지의 방법 (면역 염색 ·in situ 하이브리다이제이션, 별책 실험 의학, 노지 스미하레 편집, 요도사) 을 들 수 있다.

각 세포에 특이적으로 발현하는 마커로서는 이하의 것을 들 수 있다. 뉴런을 식별하는 마커로서는, Microtuble associate protein 2ab, Neurofilament 등을 들 수 있다. 글리아를 식별하는 마커로서는 glial fibrillary acidic protein을 들 수 있다. 심근을 식별하는 마커로서는 Mkx2.5, GATA4, cardiac Troponin I 등을 들 수 있다. 근육을 식별하는 마커로서는 MyoD 등을 들 수 있다. 지방 세포를 식별하는 마커로서는, Peroxisome Proliferation-activated receptor γ2, lipoprotein lipase, fatty acid-binding protein 등을 들 수 있다. 혈관내피를 식별하는 마커로서는 kdr/flk1, Low density lipoprotein receptor 등을 들 수 있다. 혈액세포를 식별하는 마커로서는 CD45 를 들 수 있다. 뼈를 식별하는 마커로서는 알칼리포스파타아제를 들 수 있다. 연골을 식별하는 마커로서는 타입 II 콜라겐을 들 수 있다. 췌장 β 세포를 식별하는 마커로서는 인슐린을 들 수 있다. 간장 세포를 식별하는 마커로서는 알부민을 들 수 있다.

리포터 유전자의 발현을 지표로 하는 방법으로서는, 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포 등에서 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터와 리포터 유전자를 조합한 펙터 DNA 를 본 발명의 다분화능 줄기세포에 도입한 후, 상기 세포를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 지표로 하는 방법을 들 수 있다.

리포터 유전자로서는 GFP (Gleen fluorescent protein), 루시퍼라아제, 베타 갈락토시다아제 등을 들 수 있다.

9. 본 발명의 다분화능 줄기세포의 불사화 방법

본 발명의 다분화능 줄기세포를 함유하는 의약을 환자에게 투여하는 경우, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 암화하지 않고 불사화시키는 것이 바람직하다.

세포를 암화시키지 않고 불사화시키는 방법으로서는 테로멜라아제를 본 발명의 다분화능 줄기세포에 발현시키는 방법을 들 수 있다.

테로멜라아제를 본 발명의 다분화능 줄기세포에 발현시키는 방법으로서는, 테로멜라아제의 촉매 서브유닛인 TERT 유전자, 구체적으로는 서열 번호 19 로 표시되는 DNA 를 레트로바이러스 벡터에 도입하고, 상기 벡터를 다분화능 줄기세포에도입하는 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 다분화능 줄기세포에 내재하는 TERT 유전자를 유도 발현시키는 인자를 다분화능 줄기세포를 배양하는 배지 내에 투여함으로써, 또는 TERT 유전자를 유도 발현시키는 인자를 코딩하는 DNA 를 삽입한 벡터를 본 발명의 다분화능 줄기세포에 도입함으로써 테로멜라아제를 본 발명의 다분화능 줄기세포에 발현시킬 수 있다.

TERT 유전자를 유도 발현시키는 인자는 다분화능 줄기세포를 배양하는 배지 내에 직접 투여함으로써 테로멜라아제가 발현하고 있는 것을 지표로 하여 스크리닝할 수 있다. 또한, TERT 유전자 프로모터와 GFP (Green Fluorescent protein), 루시퍼라아제 혹은 베타 칼락토시다아제 등의 리포터 유전자를 삽입한 벡터 DNA 를 다분화능 줄기세포에 도입함으로써 스크리닝할 수 있다.

이하에서, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

실시예 1. 래트 골격 근육 중의 줄기세포의 분석

근육 중에서 새로운 근육 섬유를 신생하는 세포를 밝히기 위해서, 3 주령의 수컷 위스터 래트의 족저근을 조직화학적 수법으로 해석을 실시하였다. 래트는 탄생 후 23 ±1 ℃, 12 시간 밝게 하고 12 시간 어둡게 하는 주기로 사육을 실시하였다. 래트는 최종 농도가 60 ㎎/㎏ 이 되도록 염화벤토바르비탈을 주입함으로써 사망시키고 족저부위에서 근육을 적출하였다. 적출한 근육은 액체 질소로냉각시킨 이소펜탄 중에서 동결하고, 이하의 실험에 사용하기까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 면역 조직 염색에 사용하는 근육 조직의 절편은 동결 근육 표본을 -20 ℃ 로 평형화한 후 6 개의 단편으로 분단하여 전근육 조직을 해석할 수 있게 하였다. 절편은 7 ㎛ 의 두께로 조제하고, 하나의 조직 단편에서 10 내지 18 개의 절편을 제작하였다.

면역 염색에는 골격근 마커에 대한 항체인 항 myogenin 항체 (Dako 사 제조, F5D), 항 MyoD 항체 (Dako 사 제조, anti-MyoD1, 5.8A), 항 미오신 중쇄 항체 (Novocastra사 제조), 근육 섬유를 염색하는 항체인 항 라미닌 항체 (Chemicon, International사 제조), 세포 접착 분자에 대한 항체인 항 m-카드헤린 항체 (Santa Cruz사 제조, N-19), 조혈계 세포의 표면 항원에 대한 항체인 항 CD34 항체 (Santa Cruz사 제조, C-18) 를 각각 사용하였다. 골격근은 분화가 진행함에 따라, myogenin, MyoD, 미오신 중쇄, 라미닌의 순서로 세포 표면에 발현한다.

또한, 면역 반응은 비오틴 ·아비딘퍼옥시드 반응을 사용하여 시각화하였다.

생후 3 주령의 수컷 래트의 족저근 중의 근아세포의 해석을 조직 단편에 각종 항체를 사용한 면역 염색에 의해 실시하였다. 그 결과, 조직 단편에서 관찰된 MyoD 양성 세포의 약 70 % 는 기저 라미나의 내측, 즉 근섬유의 내측에 존재하였다. 나머지 30 % 의 MyoD 양성 세포는 작은 세포질을 가지고, 근섬유와 근섬유 사이의 간질 영역에 존재하고 있었다. myogenin 양성 세포에 대해서도 동일한 세포의 존재가 발견되었지만, 그 강도는 MyoD 양성 세포보다도 작았다. 항 myogenin 항체는 근섬유의 내측 및 간질 중의 세포질이 작은 세포를 염색하였다.일부의 세포에서는 myogenin 과 MyoD 의 양쪽을 발현하고 있었다.

해석한 절편 중에는 발생 단계에서 관찰되는 미오신 중쇄가 양성인 작은 근섬유가 하나의 등절편당 15 내지 20 개 검출되었다. 이들 미오신 중쇄 양성 세포의 핵은 myogenin 양성이고, 미오신 중쇄 양성 세포의 막은 라미닌 양성이었다.

이상의 결과에서 이러한 발생 단계에서 관찰되는 미오신 중쇄가 양성의 작은 근섬유는 새롭게 근육을 형성하는 세포로 생각된다.

이러한 근육을 형성하는 세포는 전자 현미경에 의한 해석에서도 관찰되었다.

작은 근섬유를 갖는 라미닌 양성의 세포는 간질 영역의 혈관의 근처에서 관찰되고, 새로운 근육이 생기는 위치와 전술한 면역 염색에서 myogenin 양성 및 MyoD 양성 세포가 관찰되는 위치가 일치하였다. 또한, 위성 세포도 근섬유 내에 관찰되었다.

이상의 관찰 결과는 성장 중의 근육의 간질 영역에는 새로운 근육 섬유를 만들어 내는 줄기세포가 존재하는 것, 및 위성 세포는 근육 섬유내에 존재하고 근육 섬유를 두껍게 하는 데에 작용하고 있는 것을 나타내고 있다.

생후 3 주령의 수컷 래트의 족저근 중의 근아 세포를 근육 조직 단편에 항 m-카드헤린 항체와 항 라미닌 항체를 사용한 이중 염색을 실시함으로써 해석하였다. 그 결과, m-카드헤린은 위성 세포가 존재하는 근섬유의 내측에 존재하였지만, 간질에서는 m-카드헤린은 관찰되지 않았다. m-카드헤린 양성 세포의 일부의 세포 표면은 MyoD 양성을 나타내지만, 기타 세포 표면은 MyoD 음성이었다. CD34 양성 세포는 항상 근섬유의 외측의 간질에서 관찰되었다. CD34 음성 세포의 수는 1 섹션당 30 내지 40 개 존재하고, 그 수는 MyoD 양성 세포의 수와 거의 동일하였다. CD34 양성 세포는 MyoD 를 함께 발현하고 있지 않았다.

이상의 결과는, 이전부터 알려져 있는 위성 세포가 m-카드헤린 양성, CD34 음성인 것과는 대조적으로, 본 해석에서 비로소 밝혀진 간질의 줄기세포는 m-카드헤린 음성, CD34 양성인 것이 밝혀졌다.

또한, 위성 세포와는 달리, MyoD 를 발현하고 있지 않기 때문에 본 세포는 근육으로의 분화의 제한을 받지 않고 있는 다분화능의 줄기세포인 것이 나타났다.

실시예 2. 마우스 골격근 간질로부터의 줄기세포의 분리

골격근의 간질 세포를 3 주령 내지 4 주령의 C57BL/6 마우스의 뒷다리의 대퇴부에서 적출하였다. 취득한 근육편은 가위에 의해 작게 잘라 다진 후, 0.06 % 의 콜라게나아제 타입 1A (시그마사 제조) 와 10 % 의 소태아 혈청을 포함하는 Dullbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지 중에서 37 ℃, 2 시간 인큐베이션을 실시하였다. 상기 처리에 의해 추출된 세포를 우선 40 ㎛ 의 나일론 ·메시로 여과한 후 20 ㎛ 의 나일론 ·메시로 여과하고, 1100 rpm 에서 5 분간 원심 분리를 실시함으로써 회수하였다. 얻어진 상기 세포는 20 % 의 소태아 혈청을 포함하는 Dullbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지 중에 부유시킴으로써 골격근 간질 세포액을 취득하였다.

골격근 간질 세포액에서 골격근의 줄기세포를 취득하기 위해, 항체와 플로우 사이토메트리 (FACS 분류기) 를 이용하여 분리를 실시하였다. 골격근 간질 세포액에 함유되는 혈구계의 세포를 제거하기 위해, 항 CD34 항체 (Pharminegn사 제조, RAM34) 와 항 CD45 항체 (Pharminegn사 제조, 30-F11) 를 사용하여 CD34 양성 ·CD45 음성 획분 (이후 골격근 간질 CD34+/45- 세포라 함) 과, CD34 음성 ·CD45 음성 획분 (이후, 골격근 간질 CD34-/45- 세포라 함) 을 분리하였다.

골격근 간질 CD34+/45- 세포에 관해서 다시, 조혈계 세포의 표면 항원인 CD14 를 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, rmC5-3), 혈관내피 세포의 표면 항원인 CD31 을 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, MEC13.3), 혈관내피 세포의 표면 항원인 CD144 를 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, 11D4.1), 혈관내피 세포의 표면 항원인 FLK-1 을 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, Ly-73), 인테그린의 표면 항원인 CD49d 를 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, R1-2), 모두 조혈 줄기세포의 표면 항원인 c-kit 를 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, 2B8), Sca-1 을 인식하는 항체 (Pharminegn사 제조, Ly6A/E) 를 사용하여 해석을 실시하였다.

그 결과, 골격근 간질 CD34+/45- 세포의 93.7 +/-1.3 % 가 Sca-1 양성이었지만 나머지는 모두 음성이었다. 이 결과는 골격근 간질 CD34+/45- 세포에는 조혈계 전구세포나 혈관 전구세포가 포함되어 있지 않은 것을 나타내었다.

또한, 골격근으로부터 분리된 side-population cell (SP 세포) 은 CD34 음성, Sca-1 양성, c-kit 음성, CD45 음성인 것이 보고되어 있기 때문에 (Nature,401, 390-394, 1999), 골격근 간질 CD34+/45- 세포는 SP 세포와는 상이한 신규의 세포인 것이 나타났다.

다음에, 취득한 골격근 간질 CD34+/45- 세포에서 RNA isolation kit (Isogen, Wako사 제조) 를 사용하여 mRNA 를 분리하고, RNA PCR kit ver.2.1(Takara사 제조) 을 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 합성된 cDNA 를 사용하여 RT-PCR 법에 의해 MyoD, myf-5, myf-6, Myogenin, m-카드헤린, c-meet, Pax-7, Pax-3, β-아크틴의 발현에 대해서 해석하였다. RT-PCR 의 해석에는 이하의 합성 DNA 프라이머를 사용하였다 ; MyoD (서열번호 1 및 2), myf-5 (서열번호 3 및 4), myf-6 (서열번호 5 및 6), Myogenin (서열번호 7 및 8), m-카드헤린 (서열번호 9 및 10), c-met (서열번호 11 및 12), Pax7 (서열번호 13 및 14), Pax3 (서열번호 15 및 16), β-아크틴 (서열번호 17 및 18).

RT-PCR 의 결과, 골격근 간질 CD34+/45- 은 내부 콘트롤의 β-아크틴 이외에는 c-met 만이 양성이고, 다른 마커에는 모두 음성이었다.

이 결과는 골격근 간질 CD34+/45- 가 Pax7 양성의 위성 세포와는 상이한 신규의 줄기세포인 것을 나타내고 있다.

실시예 3. 골격근 간질 CD34+/45- 세포의 배양

실시예 2 에 의해 취득한 골격근 간질 CD34+/45- 세포의 분화능을 해석하기 위해서, 이하의 방법으로 상기 세포의 배양을 실시하였다. 골격근 간질 CD34+/45- 세포를 1 ×10⁴세포/ml 의 조건에서 완전한 메틸셀룰로오스 배지 Methocult GFH 44s4V (StemCell Tech사 제조) 에서 배양하였다. 인큐베이터는 37 ℃, 5 % CO₂, 95 % 0₂에서 배양하였다. 3 일간의 배양에서 골격근 간질 CD34+/45- 세포는 균일한 크기의 둥근 형태를 한 세포로 이루어지는 콜로니를 형성하였다. 콜로니 내의 세포수는 시간경과적으로 증가하고, 그 일부는 배양접시로부터 떨어져 스피어를 형성하였다. 또한, 다른 일부의 세포는 7 일간 내지 10 일간에 걸쳐 작은 근육과 같은 세포로 분화를 시작하고 자율적으로 움직이기 시작하였다. 또한, 본 세포는 항 MyoD 항체 (Dako사 제조, 5.8A) 로 염색되었기 때문에 골격근 세포로 확인되었다. 또한, 골격근 세포 이외에도 혈관내피 세포와 같은 세포가 검출되고, 이 세포는 DiI-Ac-LDL (Biomedical Technologies사 제조) 를 취입하기 때문에 혈관내피 세포로 동정되었다. 또한, 세포내에 오일 방울을 가져 Oil red 로 염색되는 지방 세포도 검출되었다. 이상의 결과는 골격근 간질 CD34+/45- 세포가 작아도 골격근, 혈관내피 세포, 지방 세포로 분화하는 능력을 가진 다분화능의 줄기세포인 것을 나타내고 있다.

실시예 4. 골격근 간질 CD34+/45- 세포의 이식

골격근 간질 CD34+/45- 세포의 생체 내에서의 기능을 밝히기 위해서, 우선 GFP 트랜스제닉 마우스에서 실시예 2 와 동일한 방법으로 골격근 간질 CD34+/45- 세포를 분리하였다. 다음에, 상기 GFP 트랜스제닉 마우스 유래 골격근 간질 CD34+/45- 세포를 NOD-scid 마우스의 경골근의 전방에 이식하였다. 6 주간 후 해부하여 분석을 실시한 결과, 근육섬유 및 혈관내피 세포에 GFP 단백의 발현이 관찰되었다. 이 결과는 골격근 간질 CD34+/45- 세포가 생체 내에서 골격근과 혈관내피 세포로 분화할 수 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 5. 인간 골격근 세포로부터의 골격근 간질 CD34+/45- 세포의 분리

환자로부터 인폼드 콘센트에 의한 승낙에 의거하여 채취한 전근을 가위 혹은 메스를 사용하여 다진 후 콜라게나아제 타입 1A (시그마사 제조) 를 0.06 %, FBS를 10 % 함유하는 DMEM (high glucose, GIBCO BRL사 제조) 에 현탁하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션하였다. 잘게 다진 근육에서 분리해낸 세포를 회수 후, 원심분리법에 의해 세포를 회수하고, FBS 를 10 % 함유하는 DMEM (high glucose) 에 현탁하였다. 상기 현탁액을 우선 반경 40 ㎛ 마이크로필터를 통과시킨 후, 반경 20 ㎛ 의 마이크로필터를 통과함으로써 인간 골격근 간질 세포액을 얻었다. 얻어진 세포를 실시예 2 와 동일하게 하여 항 CD34 항체와 항 CD45 항체를 사용하여 세포의 분리를 실시하였다. 그 결과, 전골격근 간질 세포의 7.54 % 가 CD34 양성 및 CD45 음성인 것이 관찰되었다. 본 결과는 마우스에서의 지견이 인간에게도 응용할 수 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 6. 마우스 골격근 간질 유래의 CD34-/45- 세포 중의 줄기세포의 배양

실시예 2 에 기재된 방법으로 취득한 약 10000 개의 CD34-/45- 세포를 CollagenCultMedium without Cytokines [스템셀·테크놀로지사 제조 (StemCell Technology Inc.)] 에 bFGF (10 ng/ml) 및 EGF (20 ng/ml) 를 추가한 배양액을 가한 35 ㎜ 의 배양접시에서 배양하였다. 그 결과, 약 1 % 를 조금 넘는 세포가 단일한 세포에 의한 콜로니를 형성하는 것이 관찰되었다. 또한, 콜로니를 형성한 세포는 배양을 계속함으로써 항 CD34 항체 (RAM34, Pharmingen사 제조) 에 의해 염색되고, CD34+/45- 세포가 출현하는 것을 나타내었다.

다시 배양을 계속함으로써 골격근이나 지방 세포, 혈관내피 세포에의 분화가 관찰되었다. 골격근으로의 분화는 항 MyoD 항체 (5.8 A, Dako사 제조) 의 염색으로, 혈관내피로의 분화는 표지한 저밀도 리보 단백 (Dil-Ac-LDL, BiomedicalTechnologys사 제조) 의 세포내로의 취입으로, 또한 지방 세포로의 분화는 oil-red0 (Sigma Aldrich) 염색에 의해 확인하였다.

이상의 결과는 CD34+/45- 세포가 CD34-/45- 세포에 함유되는 줄기세포에서 유도되는 것을 나타내고 있다. 또한, CD34-/45- 세포 중에 존재하는 콜로니 형성능을 갖는 세포가 다분화능 줄기세포인 것을 나타내고 있다.

또한, 실시예 1 에 나타낸 방법에 따라, 골수의 간질에 존재하는 세포를 해석하면, CD34 양성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성의 세포에 더하여 CD34 음성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성의 세포가 관찰되었다. 이상으로부터, CD34-/45- 세포 중에 존재하는 콜로니 형성능을 갖는 다분화능 줄기세포는 CD34 음성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성의 특징을 갖는 것으로 생각된다.

실시예 7. 마우스 골격근 간질 유래의 CD34+/45- 세포의 신장 피하로의 이식

실시예 2 에 기재한 방법으로 취득한 약 10000 개의 CD34+/45- 세포를 바로 동일 계통의 마우스인 C57BL/6 마우스의 신장 피하로 이식하였다. 이식 6 주 후에 신장을 적출하고, 조직 절편을 작성하여 이식한 세포의 착상 및 분화상태를 확인하였다.

광학 현미경 하에서 조직 절편을 관찰한 결과, 이식한 세포의 형태로서는 신피막하에 근섬유군 및 혈관 또한 미에린 구조를 갖는 신경축책군이 함께 관찰되었다. 이상의 결과는 CD34+/45- 세포가 근섬유, 혈관뿐만 아니라 신경에도 분화한 것을 나타내고, 다분화능을 갖는 것을 나타내고 있다.

또한, 광학 현미경하에서 조직 절편을 관찰한 결과, 신피막하에 관찰된 성숙형의 근섬유에는 위성 세포의 존재도 확인되었기 때문에 CD34+/45- 세포가 위성 세포로도 분화할 수 있는 것이 나타났다.

조직이나 세포의 재생 등에 유용한 골격근의 간질에 유래하는 다분화능 줄기세포를 제공한다.

「서열 프리 텍스트」

서열번호 1 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

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Claims

골격근의 간질에서 유래하는 다분화능 줄기세포.
제 1 항에 있어서 c-met 양성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, CD34 양성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, Sca1 양성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, m-카드헤린 음성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, CD45 음성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, CD14 음성, CD31 음성, CD49d 음성, CD117 음성, FLK-1 음성 및 CD144 음성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, CD34 음성, CD45 음성, m-카드헤린 음성 및 MyoD 음성을 나타내는 다분화능 줄기세포.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 골격근 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 세포.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈관내피 세포 및 지방 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 세포.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 연골 세포, 골아 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 각막 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기세포인 세포.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 골격근이 포유동물 유래의 것인 세포.
제 12 항에 있어서, 포유동물이 인간 및 래트에서 선택되는 것인 세포.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
제 14 항에 있어서, 의약이 조직 또는 세포의 재생약인 의약.
제 14 항에 있어서, 의약이 장기부전의 치료약인 의약.
제 15 항에 있어서, 조직 또는 세포가 근육, 심장, 혈액, 혈관, 뼈, 관절, 췌장, 간장, 신경계의 조직 또는 세포인 의약.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 특이적으로 인식하는 항체.
제 18 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 골격근에서 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 정제하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 세포를 증식시키는 물질을 스크리닝하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 세포로부터 각종 세포로의 분화를 유도하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제 21 항에 있어서, 각종 세포가 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 세포, 지방 세포, 골아 세포, 연골 세포, 신경계 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 전립선 세포, 유선 세포, 소장상피 세포, 피부세포 및 각막세포에서 선택되는 스크리닝 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 불사화시키는 방법.
스피어를 형성시키는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 분리하는 방법.