KR20070018738A - 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포 배양용기를 이용한 층분리배양법에 의해 중간엽 분리세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.　 본 발명의 분리방법은 사람 골수에서 중간엽 줄기세포를 간편하고, 경제적이며, 오염 가능성을 최대한 줄일 수 있는 방법으로 임상시험 및 세포치료제 생산에 이용될 수 있다.

중간엽 줄기세포, 교원질, 층분리배양법

Description

층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포 분리방법{The method for isolation of mesenchymal stem cells from bone marrow using subfractionation culture method}

도 1은 사람 골수로부터의 중간엽 줄기세포를 분리하는 층분리배양법의 설명도이고,

도 2는 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포들을 나타낸 그림이고,

(A) 최종 배양용기의 단일성 세포주(40배)

(B) 최종 배양용기의 단일성 세포주(200배)

(C) 단일클론 세포

도 3은 층분리배양법을 통하여 분리된 세포 표면에서 발현되고 있는 중간엽 줄기세포 특이 항원들이 발현함을 나타낸 그림이고,

도 4는 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포들이 골수에 있는 조혈모 줄기세포가 아님을 확인한 결과를 나타낸 그림이고,

도 5는 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포를 톨루이딘 블루(Toluidine blue)로 세포염색하여 연골세포로의 분화를 나타낸 그림이고,

도 6은 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포를 연골세포 특이 단백질에 대한 항체인 Collagen type II로 면역염색하여 연골세포로의 분화를 나타낸 그림이고,

도 7은 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포의 골화세포로의 분화를 나타낸 그림이고,

도 8은 층분리배양법을 통하여 분리된 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화를 나타낸 그림이고,

도 9는 RT-PCR 실험으로 분화 세포 특이 유전자 발현 유무를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

(A) 연골세포 특이 유전자인 Collagen type II 유전자 발현

(B) 골세포 특이 유전자인 Osteopontin 유전자 발현

(C) 지방세포 특이 유전자인 PPARγ2 유전자 발현

도 10은 분리된 중간엽 줄기세포주가 사이토카인을 분비함을 나타낸 그림이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 배양용기를 이용한 층분리배양법에 의해 중간엽 분리세포를 분리하는 방법 에 관한 것이다.　

줄기세포는 우리 몸의 210여개 모든 기관의 조직으로 성장할 수 있는 잠재적 능력을 갖고 있고, 무한히 분열할 수 있으며 적절한 조작을 통해 원하는 장기로 분화할 수 있다.　 줄기세포를 이용한 난치병의 치료가능성은 대단히 높아 당뇨병 환자에게 인슐린을 생산하는 세포를 주입하고 심장마비 환자에게 심근세포를 제공할 수 있고 줄기세포를 이용하면 백혈병, 골다공증, 간염, 파킨슨씨병, 노인성 치매, 화상 등 수많은 질병 치료가 가능할 것이다.　 줄기세포를 수득하는 방법으로 냉동 배아세포에서 얻는 방법이 효율적이라고 할 수 있지만(Thomson, J.A. et al,Science. 282: 1145-1147, 1998) 윤리적인 면에서 아직도 많은 논란이 있다(Frankel, M.S. et al., Science. 287: 1397, 2000).　 줄기세포를 추출할 수 있는 배아를 생명체로 볼 것인가 아니면 세포덩어리로 볼 것인가가 논란의 핵심으로 종교계 등에서 배아복제 및 배아실험을 강력히 반대하고 있다.

줄기세포를 추출할 수 있는 방법으로는 냉동배아 이용방법뿐만 아니라 체세포 핵이식방법이나 성체 줄기세포이용방법이 있다.　 체세포 핵이식방법은 성인세포에서 얻은 핵을 이미 핵을 제거한 난자에 넣어 배아 줄기세포를 얻는 방법이다(Hwang, W.S. et al., Science. 303: 1669-1674, 2004).　 이 방법은 자신의 세포에서 분화되기 때문에 거부반응이 없다는 장점이 있으나 배아에 대한 개념규정논란, 또 이 배아를 자궁에 이식하면 "인간복제"로 이어 진다는 점 등의 윤리적인 문제가 있다.　 따라서 배아줄기세포에 대한 연구보다 활발히 행해지는 분야는 성체 줄기세포연구이다.　 성체줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포이다.　 성체 줄기세포는 각종장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으나 골수에서 얻는 방법이 가장 흔히 시행된다.　 그러나 많은 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포들을 분리, 배양하는 데 있어 항상 균일한 형태의 세포를 얻는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 활발히 연구가 행해지고 있다.

골수는 조혈모세포로 분화하는 줄기세포가 주요한 성분을 이루지만 비조혈모세포로 분화하는 줄기세포도 일부 존재한다 (Friedenstein, A.J. et. al., Exp. Hematol. 4: 267-274, 1976; Mets, T. et al., Mech. Ageing Dev. 16: 81-89, 1981).　 이 세포들은 조혈모세포의 성장을 보조하는 기능이 있고, 조혈모세포와 같이 배양시 분화하지 않으면서 재생됨이 관찰되어 가소성 유착 세포(plastic adherent cell) 혹은 집락형성단위 섬유아세포(colony-forming-unit fibroblast)라고 명명되었다가 골수 기질 세포(marrow stromal cell) 혹은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 라고 불리게 되었다.

1987년 Friedenstein 등이 쥐의 골수에서 분리한 일부 세포로 뼈를 형성하는데 성공한 이후, 다른 많은 연구자 들이 배양용기에 부착하는 중간엽 줄기세포의 특성을 이용해 분리에 성공하였다(Friedenstein, A.J. et al., Cell Tissue Kinet. 20: 263-272, 1987; Caplan, A.I. et al., Orthop. Res. 9: 641-650, 1991; Clark, B.R. et al., Ann. NY Acad. Sci. 770: 70-78, 1995; Bruder, S.P. et al., J. Cell Biochem. 64: 278-294, 1997; Zohar, R. et al., Blood. 90: 3471-3481, 1997; Prockop, D.J. et al, Science. 276: 71-74, 1997).　 이 방법으로 분리한 세포들은 그 형태가 다양하였고 실험실 배양 혹은 생체에 이식 시 골화세포, 지방세포, 연골세포 혹은 근육 등으로 분화하는 다양한 양상을 보였다.　 또한 생체에 주입 시 뼈, 연골, 근육, 폐, 비장, 흉선 등으로 이동됨이 관찰되었다(Pereira, R.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 1142-1147, 1998; Ferrari, G. et al., Science. 279: 1528-1530, 1998).

1999년 Pittenger 등의 실험에 의하여 사람에서도 골수에서 분리한 중간엽 줄기세포가 자가 재생 (self-renewal) 능력과 뼈, 연골, 지방으로 분화할 수 있는 능력이 있음을 알게 되었다.　 이 실험에 의해 성체 중간엽 줄기세포가 실험실에서의 조작이 가능함이 알려졌으며, 줄기세포치료의 개념이 도입될 수 있게 되었다.　 이후 골수 중간엽 줄기세포가 간세포 (hepatocyte), 심근세포, 신경 및 뇌세포로 분화될 수 있음이 알려지게 되었으며(Theise, N.D. et al., Hepatology. 32: 11-16, 2000; Alison, M.R. et al., Nature. 406: 257, 2000; Orlic, D. et al., Nature. 410: 701-705, 2001; Jackson, K.A. et al., J. Clin. Invest. 107: 1395-1402,　 2001; Kopen, G.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 10711-10716, 1999; Woodbury, D. et al, J. Neurosci. Res. 61:364-370, 2000) 성체 줄기세포도 유전자를 재활성화 시키면, 모든 종류의 세포로 분화가 가능함이 알려졌다.　 따라서 성체 줄기세포를 이용하여 손상된 인체의 모든 기관을 대체하려는 시도가 활발히 시도되고 있으며 현재 골절, 건손상, 연골손상, 간부전 (hepatic failure), 심근경 색, 신경손상, 뇌손상, 뇌졸중, 파킨슨병, 기타뇌신경퇴행성 질환 등의 치료를 위한 활발한 연구가 진행 중이다 (Horwitz, E.M. et al., Nat. Med. 5: 309-313, 1999; Pittenger, M.F. et al., Circ. Res. 95: 9-20, 2004).

이렇게 활발한 임상 적용의 시도에도 불구하고 아직도 골수에서 중간엽 줄기세포의 분리나 배양들이 임상시험에 적용될 수 있게 확실하게 정립된 방법이 없는 실정이다.　

분리 초기에 단핵세포들만을 Ficoll-paque이라는 방법을 사용하여 분리하여 세포를 배양용기에 부착시키는 방법인 Friedenstein 등이 사용한 분리 방법이 아직도 많이 사용되고 있지만 이러한 방법을 사용할 경우 세포의 특성이 일정하지 않고, 중간엽줄기세포와 기타 단핵세포들이 같이 존재할 수 있어 단일성 세포군들을 만들기가 어렵다.　 따라서 보다 동일한 세포를 얻기 위한 여러 방법이 고안되었는데 배양용기 바닥에 붙어 자라는 모든 세포를 분리하는 Luria et al.의 방법은 중간엽 줄기세포가 아닌 타 줄기세포가 섞여서 분리될 수 있다는 단점이 있고(Luria et al., Transfusion, 11:345-349, 1971)　 Simmons et al의 중간엽 줄기세포 세포표면 항원 중 Sca-1, STRO-1에 대한 특이 항체를 사용한 줄기 세포 분리방법은 항체를 이용한 방법이기 때문에 비용이 많이 들고, 오염문제가 항상 존재한다(Simmons et al., Blood, 78:55-62, 2002).　 Hung et al.의 방법은 세포크기의 차이를 이용한 중간엽 줄기 세포 분리방법으로 이 역시 중간엽 줄기세포의 순도가 일정하지 않고, 타 줄기세포가 섞일 수 있다는 단점이 있다(Hung et al., Stem Cells, 20:249-258, 2002).　 이에 비해 본 발명의 방법은 비용이 적게 들고, 오염 문제가 없으며 타 줄기세포가 섞일 염려가 없다.　

대한민국 특허 10-2003-0010269에는 제대혈 유래 간엽줄기세포, 전구세포의 분리배양방법 및 간엽조직으로의 분화유도방법에 대해 기재되어 있고, 대한민국 특허 10-2003-0079362에는 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양방법에 대해 기재되어 있고 10-2004-0090207에는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법이 기재되어 있다.　 그러나 상기 문헌 중 어느 것도 골수로부터 별도의 시약이나 도구를 이용하지 않고 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 대해서는 언급하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 비중이 작음에 착안한 본 발명의 층분리배양법이 세포 배양용기 외에 일체의 다른 기구를 사용하지 않는 간편하고, 경제적이며, 오염 가능성을 최대한 줄일 수 있는 방법이고 상기 방법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포는 다른 세포로 분화가 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

　　　　　　　　

본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포의 비중을 이용한 층분리배양법 및 이를 이용하여 분리된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.　　　　　　

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 비중을 이용한 층분리배양법을 제공한다.

또한, 본 발명은 층분리배양법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 개체로부터 골수를 채취하는 단계;

2) 채취한 골수를 배양하는 단계;

3) 단계 2)의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계;

4) 단계 3)의 상층액만을 분리하여 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서 반복 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법을 제공한다.

골수에는 혈액세포들을 만드는 조혈모 줄기세포, 연골, 뼈, 근육, 신경세포들을 만들 수 있는 중간엽 줄기세포, 기타 종류의 세포들을 만들 수 있는 타 줄기세포들 및 줄기세포이외의 세포들이 존재하며 이 중 중간엽 줄기세포는 다른 세포들에 비해 크기가 작다고 알려져 있다(Prockop et al., Cytotherapy, 5:393-396, 2001).　 이에 본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 크기가 작기 때문에 비중도 작을 것이라고 가정하고 이러한 가정에 따라 상층액만 분리하는 층분리배양법으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

먼저, 사람 골수를 추출하여 세포배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하여 최종 플레이트에서 세포가 자라는 것을 확인하였다.　 골수는 소, 돼지, 말, 개, 염소, 토끼 및 쥐 등을 포함한 모든 동물로부터 채취가 가능하며, 본 실험에서는 사람의 골수를 추출하여 사용하였다.　

상기 배양용기에는 코팅제로 세포의 부착을 향상시킬 수 있는 모든 물질이 이용될 수 있다. 바람직하게는 콜라겐(collagen), 폴리리신(poly-lysine), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 젤라틴(gelatin)이 사용될 수 있고 보다 바람직하게는 콜라겐 또는 폴리리신, 보다 더 바람직하게는 콜라겐이 사용될 수 있다. 또한, 교원질이 코팅된 배양용기에서 3회 내지 6회, 바람직하게는 4회 내지 5회 반복배양하는 것이다.　 코팅되지 않은 배양용기도 분리된 중간엽 세포가 수적으로 적으나 사용할 수 있음을 확인하였다.

상기 단계 2 및 3의 배양은 37℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양하고, 상기 단계 4의　반복배양은　37℃에서 4시간 이하 배양 후(바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분) 37℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고(바람직하게는 18 시간 내지 30시간) 이어서 37℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며(바람직하게는 36시간 내지 60시간), 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 수행한다.

본 발명의 실시예에서 분리한 방법을 간단히 요약하면 다음과 같다.　

배양한 세포들은 단일성 세포군을 형성하는데, 이 단일성 세포군들을 분리한 후 계대배양한 결과, 초기단계 세포들은 중간엽 줄기세포들와 자라는 모양이 유사하다고 알려진 섬유아세포와 비슷한 모양을 지니고 있었다.　 5번의 계대배양까지는 모양에 큰 변화를 발견할 수 없으며(도 2 참조), 세포의 양이 2배로 증가하는 시간은 24-36 시간 정도로 섬유아세포와 큰 차이가 없음이 관찰되었다.　 상기와 같이 본 발명의 층분리방법은 반복 배양하는 방법을 통하여 타 세포들을 제거하고 일정한 단계 후에 타 세포들에 비해 비중이 작은 중간엽 줄기세포들만을 분리하는 방법으로서, 줄기세포 특이 항체나 세포배양용기 이외의 분리기구를 사용하지 않으므로 매우 경제적이고 간편한 분리방법이다.

　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　

또한, 본 발명은 층분리배양법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포를 제공한다. 본 발명의 층분리배양법으로 분리한 세포가 실제로 줄기세포의 특성을 가지 고 있는지 그리고 순수하게 분리되었는지 확인해보았다.

먼저, 분리한 세포에 줄기세포 특이성을 가진 세포표면 항원들이 존재하는지 유세포분석을 실시한 결과, 중간엽 줄기세포 특이성을 지닌 intergrin 항원인 CD29와 matrix receptor 항원들인 CD44와 CD105에 양성반응을 보임으로써 분리된 세포가 줄기세포임을 확인하였다.　 이러한 세포표면 항원들의 발현은 몇 차례의 계대배양을 한 후의 세포들에서도 동일하게 유지되는 특성을 보여 본 연구에 의해 분리한 세포가 계대배양을 하더라도 중간엽 줄기세포의 특이 항원들이 지속적으로 유지됨을 확인하였다.　 또한, 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)가 가지는 세포표면 항원들도 가지고 있는지를 확인하기 위해, 조혈모세포의 항원들인 HLA-DR과 CD34 단백질의 발현을 살펴보니 음성반응을 보였다.　 이는 골수로부터 분리한 세포가 조혈모세포가 섞이지 않은 순수한 줄기세포임을 의미한다.　

상기와 같이, 세포 표면의 항원들의 발현 결과들로 미루어 볼 때, 골수에서 분리, 배양된 세포들이 중간엽 줄기세포임이 확인되었다. 본 발명자들은 본 발명의 층분리배양법으로 분리한 세포들이 줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 알아보기 위한 또 다른 방법으로 분화실험을 실시하였다.

각각 분화유도 배양액에 배양하여 연골세포, 골화세포 및 지방세포로 분화시킨 실험 줄기세포들에 면역조직화학 염색을 실시한 결과, 각각의 세포들이 실제로 연골세포, 골화세포 및 지방세포로 분화되었음을 확인하였다(도 5 내지 8).　　 RT-PCR을 이용하여, 상기 세포에서 분화된 세포들에서 관찰되는 특이 유전자인 Collagen type II (Col-2), Osteopontin 및 PPARγ2의 발현을 살펴본 결과, 분화된 세포들에서는 각각의 특이 유전자들이 발현됨을 확인하였다(도 9 참조).

상기와 같이, 중간엽 줄기세포의 비중이 작음에 착안하여 교원질이 코팅된 세포배양용기 외에 일체의 다른 기구를 사용하지 않은 본 발명의 층분리배양법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포는 다른 세포와 섞이지 않은 순수하고 분화능을 갖는 줄기세포임을 확인하였다.

상기에서 본 발명의 층분리배양법으로 분리한 중간엽 줄기세포는 연골, 골화 및 지방세포 이외에도 신경세포, 근육세포(심장근육세포 포함) 및 인대세포들로도 분화가 가능하다고 여겨진다(Reyes et al., Blood, 98:2615-2625, 2001)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.

<실시예 1> 골수에서 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　 100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 10 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 3 ml를 넣어 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　 배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포 들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다.

동일한 과정을 한 번 더 반복 한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　 배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다.　 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다.　 앞의 여러 층분리 단계들을 거쳐서 이 단계에까지 올 수 있는 세포들은 세포의 비중이 타 세포들보다 월등히 작은 세포들임을 짐작할 수 있다.　 약 3 내지 5일의 시간이 지나면 세포들이 단일성 세포군(single clone)을 형성하는데, 이 단일성 세포군들을 트립신을 처리하여 분리한 다음 웰당 10² 내지 6x10² 의 세포수로 6-well에 배양용기로 옮겼다.　 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 4 내지 5일 배양한 후 약 80% 자랐을 때, 세포들을 0.25% trypsin/1mM EDTA(GIBCO-BRL)를 처리하여 수득한 후, 75㎠ 배양용기로 옮겨 계대배양하였다.　

상기 세포의 모양을 현미경으로 관찰한 결과, 초기단계 세포들의 모양은 섬유아세포와 비슷한 모양을 지니고 있었고, 5번의 계대배양까지는 모양에 큰 변화를 발견할 수 없었다(도 2).　 세포의 양이 2배로 증가하는 시간은 24-36 시간 정도로 섬유아세포와 큰 차이가 없음이 관찰되었다.

<실시예 2> 분리된 중간엽 줄기세포 확인

<2-1> 유세포분석기를 통한 중간엽 줄기세포의 특성 분석

상기 실시예 <1-1>에서와 같은 방법으로 골수세포에서 분리한 세포에 줄기세포 특이성을 가진 세포표면 항원들이 존재하는지 유세포분석기(BDbioscience)를 사용하여 알아보았다.

75㎠ 배양용기에서 6 내지 7일 정도 계대배양한 줄기세포에 0.25% 트립신/1mM EDTA (GIBCO-BRL)를 처리하여 세포를 수득하였다.　 1X PBS/0.4% BSA로 2회 세척하여 트립신이나 배양액 성분을 제거하였다.　 원심분리로 세포를 침전시킨 후에 세포수를 측정하여 1 X 10⁶개의 세포를 1.5 ml 튜브에 모아 0.1% 정상 염소 혈청(goat serum)(Vector)으로 실온에서 1시간 블로킹하였다.　 블로킹이 끝나면 1X PBS/0.4% BSA로 2회 세척한 후 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate(FITC) 또는 피코에리스린(phycoerythrin, PE)이 부착된 항체 CD29, CD34, CD44, CD105, HLA-DR(Serotec Ltd, Kidlington, OX, UK)로 처리하여 4^oC에서 40분간 반응시켰다.　 이를 1X PBS/0.4% BSA로 2회 세척한 후 0.5 ml 1X PBS/0.4% BSA에 현탁하여 유세포분석기에 로딩하여 분석하였다.　 양성 비교 중간엽 줄기세포로는 인간 중간엽 줄기 세포(HMSC 8292, Cambrex Bio Science)를 사용하여 실험하였다.　

그 결과, 중간엽 줄기세포 특이성을 지닌 인테그린(intergrin) 항원인 CD29와 매트릭스 수용체(matrix receptor) 항원들인 CD44와 CD105가 양성반응을 보였 다. 이 결과는 비교군으로 사용된 상품화되어 있는 중간엽 줄기세포(HMSC 8292)에서의 결과와도 일치함을 보였다(도 3). 이러한 세포표면 항원들의 발현은 6회의 계대배양을 한 후의 세포들에서도 동일하게 유지되는 특성을 보여 본 연구에 의해 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 특이 항원들을 계대배양을 하더라도 지속적으로 유지됨을 확인하였다.

<2-2> 분리된 세포에서 관찰된 조혈모 줄기세포 특이 표지자 미발현

분리된 세포들이 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)가 가지는 세포표면 항원들도 가지고 있는지를 확인하기 위해, 분리된 줄기세포를 6-7일 정도 배양한 후 조혈모세포의 항원들인 HLA-DR과 CD34 단백질의 발현을 살펴보니 음성반응을 보였다 이 결과들은 비교군으로 사용된 중간엽 줄기세포 (HMSC 8292) 에서의 결과와도 일치되는 결과였다(도 4).

<실시예 3> 골수 세포주의 형태적 특성확인

단일 세포 유도 골수 세포주의 형태적 특성을 확인하기 위하여, 세포 표면 단백질 패널을 FACS로 분석하였다(표 1). 도 1에 나타난 바와 같이, 상층액을 교원질 코팅된 배양용기로 이동시킨 단계에서 단일 콜로니를 분리한 것을 D1이라 했을 때, 그 후 4번째 단계의 번호 1인 단일 콜로니가 D4(#1), 번호 3인 단일 콜로니가 D4(#3), 5번째 단계의 번호 1인 단일 콜로니가 D5(#1), 번호 2인 단일 콜로니가 D5(#2)이다. D5(#2, FGF)는 D5(#2) 세포주를 Fibroblast Growth Factor(FGF)를 배 양액에 넣어서 키운 세포주이다.

상기 결과는 표면 단백질의 전체 발현 프로파일이 유사함을, 즉 모든 분리된 세포주가 CD29, CD44, CD73 (SH3, SH4), CD90, CD105 (SH2), CD166, 및 HLA-ClassI에 대해 양성임을 나타낸다. 그러나 테스트된 11 가지 세포 표면 단백질 중 9개의 세포 표면 단백질에서 각각의 줄기세포주는 비교적 독특한 발현 프로파일을 나타내고 CD44와 CD90은 발현레벨이 유사하다. 더 나아가, D5 (#1) 세포주는 CD31, CD34 및 HLA-DR에 음성이고 D5 (#2) 세포주는 CD31과 HLA-DR에는 음성이지만 CD34는 양성이다. 반면에 D5 (#3)는 CD31, CD34 및 HLA-DR에 양성이다. 이는 인간 골수에 몇 가지 다른 종류의 줄기세포가 존재함을 나타낸다.

<실시예 4> 중간엽 줄기세포의 분화

<4-1> 다양한 조직으로의 분화유도 실험

상기와 같이, 세포 표면의 항원들의 발현 결과들로 미루어 볼 때, 골수에서 분리, 배양된 세포들이 중간엽 줄기세포임이 확인되었다. 본 발명자들은 본 발명의 층분리배양법으로 분리한 세포들이 줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 알아보기 위한 또다른 방법으로 분화실험을 실시하였다.

먼저, 계대배양 세번째의 줄기세포들을 0.25% 트립신/1mM EDTA(GIBCO-BRL)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2 X 10⁵ 세포를 0.5 ml 배양액에 현탁하고 15 ml Falcon conical tube(Falcon)에 분할하고 원심분리로 침전시켜 펠렛을 만들었다.　

비교군은 상기 세포 펠렛을 DMEM 정상 배양액에 넣어 배양하였고 분화를 보고자 하는 실험군은 분화유도 배양액에서 배양하였다.　 연골세포 분화유도 배양액은 DMEM 정상 배양액에 6.25 ㎍/ml 인슐린(Sigma Chemical Co)과 트랜스페린(Sigma), 6.25 ng/ml 셀레노우스 산(selenous acid)(Sigma), 1.25 mg/ml BSA (Sigma), 5.35 ㎍/ml 리놀산(Sigma), TGF-β 10 ng/ml(R&D Systems)를 첨가하여 사용하였고, 골세포 분화 배양액은 DMEM 정상 배양액에 50 ㎍/ml ascorbate 2-phosphate (Sigma), 10^-8 M dexamethasone (Sigma), 10 mM β-glycerophosphate (Sigma)를 첨가한 배양액을 사용하였으며, 마지막으로 지방세포 분화 배양액은 50 ㎍/ml ascorbate 2-phosphate (Sigma), 10^-7 M dexamethasone (Sigma), 50 ㎍/ml indomethacine (Sigma)를 첨가한 배양액을 만들어 실험하였다.

배양액은 3일마다 새로 교체하였고 세포는 37℃, 5% CO₂ 에서 배양하였으며, 분화된 정도는 14일과 21일 후에 조직화학 염색과 면역조직화학 염색을 통하여 확인하였다.

<4-2> 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화

배양 14일 째, 연골세포로 분화시킨 실험 줄기세포들의 펠렛을 수득한 후,　 배양액을 제거하고 펠렛을 수득하여 OCT 화합물(Sakura Finetek)로 포매시킨(embedding) 후, 6 ㎛ 두께로 동결절편(frozen section)을 내어 2 분간 Toluidine blue(0.2 % Toludine blue 염색시약, 덕산)로 조직화학 염색하거나 Collagen type II 항체(Southen Biotechnology Associateies Inc.)를 실온에서 1시간 처리한 후, Histostain plus kit(Zymed Laboratories Inc.)을 사용하여 발색시키는 면역조직화학 염색을 통하여 연골세포로의 분화가 이루어졌는가를 확인하여 보았다.　 그 결과, 도 5와 6에서 볼 수 있듯이 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 연골세포로 분화되었음이 비교 세포군과 실험 세포군을 통하여 확인되었다.

<4-3> 중간엽 줄기세포의 골화세포로의 분화

배양 21일째, 골화세포로 분화시킨 실험 줄기세포를 실시예 <4-2>와 같은 방법으로 수득한 후, 동결절편을 5 % 질산은(덕산)을 전등아래에서 1시간 반응시키고, 수세한 후 5 % 티오황산나트륨(sodium thiosulfate, 덕산)로 2분간 처리하고, nuclear fast red(덕산)로 3-5분간 배경염색을 하는 von Kossa 염색을 통하여 확인한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 비교군의 음성 결과와는 달리 실험군에서 양성 결과를 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 골세포로도 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.

<4-4> 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화

배양 21일 째, 지방세포로 분화시킨 실험 줄기세포들을 실시예 <4-2>와 같은 방법으로 수득한 후, 동결절편을 20분간 gum-sucrose(덕산)로 고정하고, 100 % 프로필렌 글리콜(propylene glycol, 덕산)로 탈수한 후, oil red-O(덕산)로 15분간 실온에서 지방염색을 하는 Oil red-O 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 비교 세포군에서는 음성반응이었고, 실험 세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 지방세포로의 분화도 가능함을 확인하였다.

<실시예 5> RT-PCR 실험을 통한 분화세포 특이 유전자 검출

다음으로는 연골세포, 골세포, 그리고 지방세포로 분화시킨 세포들에서 각각의 분화된 세포들에서 관찰될 수 있는 특이 유전자들이 발현되는 지를 RT-PCR 분석을 이용하여 확인하여 보았다.　 분화시킨 세포에서 분리한 RNA를 실험군으로 사용하고, 분화시키지 않은 세포들에서 분리한 RNA를 비교군으로 하여 유전자들의 발현을 측정하였다.　 연골세포 특이 유전자로는 Collagen type II (Col-2), 골세포 특이 유전자로는 Osteopontin, 지방세포 특이 유전자로는 PPARγ2의 발현을 살펴보았다.

구체적으로, 상기 실시예에서 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화시킨 실험군 세포들, 그리고 분화시키지 않은 비교군 세포들에서 TRIZOL (Invitrogen Co)로 전체 RNA를 추출하였다.　 TRIZOL은 100 mm 배양용기당 1 ml을 사용하였으며, 처리 후 실온에서 5분간 배양하였다.　 여기에 클로로포름을 0.2 ml 넣어 15초간 흔들어 준 다음, 실온에 2~3분간 정온배치하였다.　 그리고나서 13,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하면, 페놀-클로로포름 하층, 중간층, 무색의 수용액 상층으로 분리가 되는데, 이 중에서 무색의 수용액 상층만 따로 모아서 새로운 튜브로 이동시켰다.　

상기 튜브에 0.5 ml의 아이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 넣은 후 강하게 혼합한 다음 실온에서 10분간 방치한 후, 다시 13,000 rpm으로, 4℃에서, 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 펠렛에 75 % 알코올을 첨가하여 다시 강하게 혼합한 후, 원심분리하였다.　 상층액은 버리고 RNA 펠렛은 5~10분간 건조시켜 RNase-free water(Ambion)에 녹여 -70℃에 보관하거나 OD₂₆₀을 측정하여 역전사 실험에 사용하였다.

cDNA합성은 Reverse Transcription System Kit(Promega)를 사용하여 전체 RNA 1㎍을 72℃에서 10분간 정온배치한 후, 42℃에서 15분, 95℃에서 5분, 4℃에서 5분 반응시켰다.　 PCR은 각 cDNA 특이적인 프라이머를를 디자인하여 사용하였는데 Osteopontin (330bp) 유전자는 서열번호 1과 2, PPARγ2 (352bp) 유전자는, 서열번호 3과 4, Collagen type II (Col-2, 500bp) 유전자는 서열번호 5와 6, 비교 유전자인 GAPDH (350bp)은 서열번호 7과 8로 기재되는 프라이머를 각각 사용하였다.

PCR 조건은 변성(denaturing)은 95℃에서 1분, 어닐링(annealing)은 56℃에서 1분, 연장(elongating)은 72℃에서 1분 동안 총35 cycle을 시행 하였다.　 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 관찰하였다.　

그 결과,　 도 9에 나타난 바와 같이, 분화된 세포들에서는 각각의 특이 유전자들의 발현을 살펴볼 수 있었고, 분화시키지 않은 세포들에서는 특이 유전자들의 발현이 측정되지 않음을 확인하였다.　 즉 본 발명의 층분리배양법으로 분리한 골수의 줄기세포가 각각 연골, 골화, 지방세포로 분화되었음을 확인하였다.

<실시예 6> 분리된 골수 중간엽 줄기세포주로부터 사이토카인의 발현 확인

중간엽 줄기세포주 배양 상층액의 일부(50 ~ 100㎕)를 Quantikine® 인간 TGF-β1, b-NGF, LIF, IL10, HGF, IL2, TGF-α 및 IL12를 이용하여 ELISA로 측정하였다. TGF-β1, LIF, TGF-α 및 IL12는 높은 레벨로 분비된 반면 나머지는 낮게 분비되거나 분비되지 않았다. 분리된 중간엽 줄기세포주에서 높은 레벨의 TGF-β1이 분비된다는 것은 이러한 줄기 세포주가 T 세포 활성화를 억제하는 역할을 함을 나타낸다. 또한, LIF, TGF-α 및 IL10와 같은 다른 사이토카인들의 높은 레벨은 이러한 세포들이 면역 조절 활성을 나타낼 수 있음을 의미한다(도 10).

본 발명의 층분리배양법은 중간엽 줄기세포의 작은 비중을 이용하여 줄기세포 특이 항체나 세포배양용기 이외의 분리기구등을 사용하지 않고 사람 골수에서 중간엽 줄기세포를 간편하고, 경제적이며, 오염 가능성을 최대한 줄여 분리하는 방법으로 본 발명의 방법으로 분리한 중간엽 줄기세포는 임상시험 및 세포치료제 생산, 골수이식 시 나타나는 면역거부반응 감소, 척수손상치료, 전신 또는 부분 마비 치료, 파킨슨, 알츠하이머병등의 질환들을 위한 치료 및 연골, 뼈, 신경, 피부등의 조직 재생에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> INHA UNIV. <120> The method for isolation of mesenchymal stem cells from bone marrow using subfractionation culture method <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Osteopontin primer <400> 1 ctaggcatca cctgtgccat acc 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Osteopontin primer <400> 2 cgtgaccagt tcatcagatt catc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> PPARgamma2 primer <400> 3 gctgttatgg gtgaaactct g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> PPARgamma2 primer <400> 4 ataaggtgga gatgcaggct c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Collagen type II primer <400> 5 aagatggtcc caaaggtgct cg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Collagen type II primer <400> 6 agcttctcct ctgtctcctt gc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> GAPDH primer <400> 7 aactccctca agattgtcag ca 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> GAPDH primer <400> 8 tccaccaccc tgttgcttgt a 21

Claims (11)

1) 개체로부터 골수를 채취하는 단계;

2) 채취한 골수를 배양하는 단계;

3) 단계 2)의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계;

4) 단계 3)의 상층액만을 분리하여 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서 반복 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법.

　　　　　　　　

제 1항에 있어서, 단계 1의 개체는 사람, 소, 돼지, 말, 개, 염소, 토끼 및 쥐 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법.

제 1항에 있어서, 단계 2 및 3의 배양조건은 5%의 CO₂ 농도인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법.

제 1항에 있어서, 단계 4의　반복배양은　37℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 37℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 37℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시키는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법.

제 1항에 있어서, 단계 4의 반복 배양시에 교원질(collagen), 폴리-리신(poly-lysine), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 젤라틴(gelatin)이 코팅된 배양용기를 사용하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 층분리배양법.

제 1항의 층분리배양법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포.

제 6항에 있어서, 분리된 중간엽 줄기세포는 배양에 의해 연골조직, 골조직, 지방조직, 신경조직, 근육조직 또는 인대조직으로 분화되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.

제 6항에 있어서, 분리된 중간엽 줄기세포는 배양에 의해 연골, 뼈, 지방세 포, 신경세포, 근육세포 또는 인대세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.

제 6항에 있어서, 분리된 중간엽 줄기세포는 CD29, CD44, CD105, 세포표면 항체들을 발현하고 CD34, HLA-DR 세포표면 항체들은 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.

제 6항에 있어서, 분리된 중간엽 줄기세포는 골수이식 시 면역거부반응을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.

제 7항에 있어서, 상기 분화된 세포는 손상된 조직의 재생을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.

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