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CN113728094A - 包含在含有人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞培养液的化妆品组合物 - Google Patents

包含在含有人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞培养液的化妆品组合物 Download PDF

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CN113728094A CN202080031264.7A CN202080031264A CN113728094A CN 113728094 A CN113728094 A CN 113728094A CN 202080031264 A CN202080031264 A CN 202080031264A CN 113728094 A CN113728094 A CN 113728094A
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Abstract

本发明涉及包含生长因子(growth factor)及细胞因子的干细胞培养液的制备方法及利用上述干细胞培养液的化妆品组合物，上述干细胞培养液是通过将在包含人血小板裂解物(human platelet lysate；hPL)的培养基中培养的间充质干细胞在无血清培养基中培养来获取的。若使用本发明的在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞的间充质干细胞培养液的制备方法，则可以获取与在包含胎牛血清的培养基中培养间充质干细胞的间充质干细胞培养液相比，细胞因子及生长因子的含量高且人真皮成纤维细胞的增殖促进能力、胶原蛋白的合成能力、弹性蛋白的合成能力、抑制黑色素合成的能力及生发功效优秀的间充质干细胞培养液，可以利用上述间充质干细胞培养液制备具有皮肤再生、改善皱纹、增进皮肤弹性、皮肤美白及生发效果的化妆品，可以在化妆品领域及医药行业广为使用。

Description

包含在含有人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞 培养液的化妆品组合物
技术领域
本发明涉及包含生长因子(growth factor)及细胞因子的干细胞培养液的制备方法及利用上述干细胞培养液的化妆品组合物，上述干细胞培养液是通过将在包含人血小板裂解物(human platelet lysate；hPL)的培养基中培养的间充质干细胞在无血清培养基中培养来获取的。
背景技术
皮肤老化大体分为两种来研究，其中之一为“内源性老化”，即随着年龄增加的老化现象，另一种为“外源性老化”，是指由外部环境，即，紫外线或环境污染等引起的老化现象。关于皮肤老化，至今提出多种理论，其中，对于皮肤老化在科学上最接近的理论为由氧化引起皮肤老化的理论。人的皮肤由包括角质层的表皮、真皮以及结合组织构成，其中角质层由通过作为表皮(epidermis)基底细胞的角质细胞(keratinocyte)的分化过程形成的死去的细胞层构成，起到从外部环境的影响中保护人体的作用。并且，存在于皮肤内部的真皮层由胶原蛋白(collagen)和弹性蛋白(elastin)构成，给皮肤带来弹性，起到防止皮肤下坠的作用。抗氧化理论是根据胶原蛋白和弹性蛋白因外部的紫外线等因素而生成的自由基(free radical)受到损伤，从而使皮肤弹性减少生成皱纹的理论。
迄今为止，为了防止上述的皮肤老化，尤其是为了防止皱纹而使用视黄醇之类的物质或者植物提取物等。但是，这些物质的上述效果低，或者具有诱发皮肤刺激、发红、炎症而对皮肤产生副作用的缺点。
人的肤色由皮肤内部的黑色素(melanin)浓度和分布来决定，除遗传因素外，还受到太阳紫外线、疲劳、压力等环境或生理条件的影响。黑色素通过称为酪氨酸酶(tyrosinase)的酶对作为氨基酸的一种的酪氨酸(tyrosine)起作用，将其转换为多巴(DOPA)、多巴醌(dopaquinone)后经过非酶反应的氧化反应来生成。若上述黑色素的合成在皮肤内过度发生，则会使皮肤的色调发暗，还生成黑斑或雀斑等。因此，如果抑制皮肤内黑色素的合成，不仅可以实现皮肤色调明亮而使皮肤美白，而且还可以改善由紫外线、激素及遗传原因引起的黑斑、雀斑等皮肤色素过度沉着症。过去，将对苯二酚(hydroquinone)或者抗坏血酸(ascorbic acid)、曲酸(kojic acid)、谷胱甘肽(glutathione)之类的对酪氨酸酶具有抑制活性的物质配制于软膏或者化妆品，将其用于皮肤美白或者改善黑斑、雀斑的目的。其中，对苯二酚数十年来一直作为对色素沉着最具效果的成分来使用，但据报告，长期使用会发生过敏反应等副作用(白斑点、黑斑点)，已在多国呈现出使用受限的趋势。谷胱甘肽、半胱氨酸等硫醇(thiol)类化合物具有特有的不适的气味和不以经皮吸收的问题，因此难以使用。并且，它们的配糖体及衍生物的极性高，难以用作化妆品的配合成分。
并且，通过抑制酪氨酸酶的酶活性来显现美白效果的抗坏血酸易被氧化，引起与之配合的化妆品变色、变臭等问题，为了克服其不稳定性，开发并使用了抗坏血酸棕榈酸酯(Ascorbylpalmitate)、抗坏血酸二棕榈酸酯(Ascorbyl-dipalmitate)、抗坏血酸硬脂酸酯(Ascorbyl stearate)、抗坏血酸磷酸酯镁(Ascorbyl magnesium phosphate)等衍生物，但若不使用特殊的技术就难以浸透至皮肤内部，而且具有对酪氨酸酶的抑制活性低的缺点。因此，需要开发少量即可显现酪氨酸酶抑制活性并可以抑制黑色素生物合成的抑制剂。
发明内容
技术问题
鉴于此，本发明人在多次致力于开发改善皱纹效果、美白效果及生发效果优秀的化妆品的结果，确认到相比于通过在包含胎牛血清(FBS)的培养基中培养干细胞来获取的干细胞培养液，通过在包含人血小板裂解物(hPL)的培养基中培养干细胞来获取的干细胞培养液中的细胞因子及生长因子丰富，人真皮成纤维细胞的增殖促进能力、胶原蛋白的合成能力、弹性蛋白的合成能力、抑制黑色素合成的能力及生发促进能力优秀，明确其作为功能性化妆品的卓越效果，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法、通过上述方法制备的间充质干细胞培养液以及包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤再生的化妆品组合物、包含上述间充质干细胞培养液的用于改善皱纹及增进皮肤弹性的化妆品组合物、包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤美白的化妆品组合物以及包含上述间充质干细胞培养液的用于促进生发或育发的化妆品组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，包括：步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
并且，本发明提供用于制备富含生长因子及细胞因子的用于皮肤再生、改善皱纹、皮肤美白、生发的化妆品组合物的间充质干细胞培养液的制备方法，包括：步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
并且，本发明提供通过上述制备方法制备的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤再生的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于改善皱纹及增进皮肤弹性的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤美白的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于促进生发或育发的化妆品组合物。
发明的效果
若使用本发明的在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞的间充质干细胞培养液的制备方法，则可以获取与在包含胎牛血清的培养基中培养间充质干细胞的间充质干细胞培养液相比细胞因子及生长因子的含量高且人真皮成纤维细胞的增殖促进能力、胶原蛋白的合成能力、弹性蛋白的合成能力、抑制黑色素合成的能力及生发功效优秀的间充质干细胞培养液，可以利用上述间充质干细胞培养液制备具有皮肤再生、改善皱纹、增进皮肤弹性、皮肤美白及生发效果的化妆品，可以在化妆品领域及医药行业广为使用。
附图说明
图1示出可通过商业途径购买的分析试剂盒(蛋白质组分析仪人XL细胞因子阵列试剂盒(proteome profiler human XL cytokine array kit)，R&D公司)的阵列图。
图2a为根据培养条件分析干细胞培养液内存在的蛋白质及生长因子的结果。Con-media表示在没有细胞的条件下培养的无血清培养基(serum-free DMEM)，FBS-CM表示在10％的胎牛血清条件下培养的间充质干细胞培养液，hPL-CM表示在4％的人血小板裂解物条件下培养的间充质干细胞培养液。粗实线方框表示实验对照组，细实线方框表示只在人血小板裂解物条件下检测出的蛋白质。
图2b为示出只在人血小板裂解物培养条件下表达的蛋白质的图。
图2c为确认干细胞培养液内生长因子的表达的图。
图2d为确认干细胞培养液内具有皮肤回春效果的蛋白质的表达的图。
图2e为确认与干细胞功效标记物、移动或再生相关的蛋白质的表达的图。
图2f为确认未在图2b至图2e中分类但在人血小板裂解物培养条件下表达的蛋白质的图。
图3为示出根据培养条件分析比较存在于干细胞培养液内的作为代表性主要生长因子的血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-beta1)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的含量的图。
图4为示出根据培养条件比较人真皮成纤维细胞的增殖促进效果的图。
图5为示出根据培养条件比较胶原蛋白合成效果的图。
图6为示出根据培养条件比较弹性蛋白合成效果的图。
图7为示出利用三维(3D)人造皮肤根据培养条件比较皮肤美白效果的图。
图8为示出根据培养条件比较在人毛乳头细胞中的增殖促进效果的图。
图9为示出根据培养条件和分离方法比较人真皮成纤维细胞的增殖促进效果的图。
图10为示出根据培养条件和分离方法比较血管内皮生长因子的含量的图。
具体实施方式
本发明提供富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，包括：步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
本发明中的“人血小板裂解物”是将人类的血小板冷冻(freeze)/解冻(thaw)后获取的浑浊的淡黄色液体。血小板冷冻/解冻通过溶解血小板来释放出细胞扩增所需的大量的生长因子。
在本发明中，“干细胞培养液”是指包含通过培养干细胞获取的培养基中所包含的组分的物质，用于制备上述培养液的间充质干细胞的种类不受限制。可以为源自软骨、骨组织、脂肪组织及骨髓的干细胞，优选为源自骨髓的间充质干细胞。
本发明的上述间充质干细胞培养液的制备方法的特征在于，可以在上述“步骤1)”的培养时在包含人血小板裂解物的培养基中培养，可以在上述“步骤2)”的培养时在无血清培养基中培养，可以使用上述步骤之后获取的干细胞培养液。
经过上述两个步骤，获取的干细胞培养液内不含血清和抗生素，可以获取适于化妆品组合物的干细胞培养液。
在本发明中，用于培养干细胞的培养基可以不受限制地使用本发明所属技术领域已知的基础培养基。基础培养基可以通过人工合成制备，也可以使用商业上制备的培养基。商业上制备的培养基的例有杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)、最低基础培养基(MEM，Minimal Essential Medium)、基础伊戈尔培养基(BME，Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最低基础培养基(α-MEM，α-Minimalessential Medium)、格氏最低基础培养基(G-MEM，Glasgow's Minimal EssentialMedium)以及伊氏改良杜氏培养基(Isocove's Modified Dulbecco's Medium)等，但不限定于此。
本发明使用的培养基可以包括所有不包含抗氧化剂的培养基、在上述培养基中添加抗氧化剂的培养基或者包含抗氧化剂的培养基。
不包含抗氧化剂的培养基可以使用杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)，但不限定于此，可以根据需要在上述培养基中添加抗氧化剂进行培养。并且，可以根据需要利用包含抗氧化剂的α-最低基础培养基(α-MEM)进行培养。
本发明的抗氧化剂可以不受限制地包括能够用于细胞培养的抗氧化剂，可以为选自由戊二酮、半胱氨酸、半胱胺、泛醇、β-巯基乙醇以及抗坏血酸组成的组中的一种以上。在将抗氧化剂添加至培养基的情况下，可以添加10μg/ml至50μg/ml浓度的上述氧化剂，优选地，可以添加10μg/ml至30μg/ml浓度的上述氧化剂，更优选地，可以添加25μg/ml浓度的上述添加剂。
在本发明的一例中，不包含抗氧化剂的培养基使用杜氏改良伊戈尔培养基，更优选地，使用低葡萄糖杜氏改良伊戈尔培养基(LG-DMEM)，包含抗坏血酸作为抗氧化剂的培养基使用α-最低基础培养基。
在本发明中，上述“步骤1)的间充质干细胞”可以为通过密度梯度离心法(Gradient centrifugation method，GCM)分离的间充质干细胞或者通过层分离培养方法(韩国专利申请第10-2006-0075676号，subfractionation culturing method，SCM)分离的间充质干细胞。
在本发明中，相比于将“上述步骤1)的间充质干细胞”用作通过密度梯度离心法分离间充质干细胞来制备的间充质干细胞培养液，将“上述步骤1)的间充质干细胞”用作通过层分离培养方法分离间充质干细胞来制备的间充质干细胞培养液中所含的生长因子及细胞因子含量更高，皮肤再生、改善皱纹、皮肤美白、生发或育发的效果优秀。
上述“层分离培养方法”是指根据比重分离干细胞的方法，可以为如下工序：首先，从个体提取骨髓并在细胞培养液中培养后，只收集上清液，将其移到未使用涂敷剂处理或未处理的培养容器进行培养后，再反复几次相同的过程。优选地，可以为包括如下步骤的方法：步骤1)，培养从个体分离的骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移到新的容器中培养；步骤3)，仅分离上述步骤2)的上清液，在培养容器中在35℃至39℃的温度下培养1小时至3小时后，在35℃至39℃的温度下培养12小时至36小时，反复进行2次至3次，然后在35℃至39℃的温度下培养24小时至72小时，每次都将上清液移到新的培养容器进行反复培养；以及步骤4)，从最终的培养容器中获取单克隆干细胞。
在本发明中，上述“步骤1)”的培养可以为包括将间充质干细胞以10细胞/cm2(cells/cm2)至10000细胞/cm2的细胞密度接种于包含人血小板裂解物的培养基中培养的步骤的方法，优选地，可以为包括将间充质干细胞以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中培养的步骤的方法。
在本发明中，上述“步骤1)”的培养基中可以包含0.1％(w/w)至20％(w/w)的人血小板裂解物，优选地，可以包含1％(w/w)至10％(w/w)的人血小板裂解物。
在本发明中，与包含胎牛血清的培养基用作上述“步骤1)”的培养基来制备的间充质干细胞培养液相比，将包含人血小板裂解物的培养基用作上述“步骤1)”的培养基来制备的间充质干细胞培养液中所含的生长因子及细胞因子含量更高，皮肤再生、改善皱纹、皮肤美白、生发或育发的效果优秀。
在本发明中，上述“生长因子及细胞因子”可以为间充质干细胞表达的任意生长因子、细胞因子或者蛋白质，优选地，可以为选自由载脂蛋白-A-1(apolipoprotein-A-1)、趋化因子(C-X-C基序)配体-4(chemokine(C-X-C motif)ligand-4，CXCL-4)、趋化因子(C-C基序)配体-5(chemokine(C-C motif)ligand-5，CCL-5)、视黄醇结合蛋白-4(Retinolbinding protein-4，RBP-4)、尿激酶受体(Urokinase receptor，uPAR)、维生素D-BP(Vitamin D-BP)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)、肝细胞生长因子(Hepatocytegrowth factor，HGF)、成纤维细胞生长因子7(Fibroblast growth factor 7，FGF7)、成纤维细胞生长因子19(Fibroblast growth factor 19，FGF19)、血管生成素(Angiogenin)、血管生长素-1(Angiopoietin-1)、血管生长素-2(Angiopoietin-2)、Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf related protein 1，DKK-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(insulin likegrowth factor binding protein-2，IGFBP-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生因子-AA(platelet derived growth factor-AA，PDGF-AA)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)、血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor，LIF)、趋化因子(C-X-C基序)配体-12(chemokine(C-X-C motif)ligand-12，CXCL-12)、趋化因子(C-C基序)配体-2(chemokine(C-C motif)ligand-2，CCL-2)、正五聚蛋白-3(Pentraxin-3)、趋化因子(C-C基序)配体-7(chemokine(C-C motif)ligand-7，CCL-7)、脂联素(Adiponectin)、Fas配体(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6))、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-17A(IL-17A)、补体成分5/补体成分5a(C5/C5a)、分化群14(Clusterof differentiation 14，CD14)、几丁质酶3样蛋白1(Chitinase 3-like 1)、降脂蛋白(adipsin)、C-反应蛋白(C-reactive protein)、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidaseIV，DPP IV)、胱抑素C(Cystatin C)、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Emmprin)、生长/分化因子15(Growth/differentiation factor 15，GDF15)、骨桥蛋白(Osteopontin)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)E1(nexin)、血小板反应蛋白(Thrombospondin)-1(TSP-1)、抵抗素(Resistin)、脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)以及内皮糖蛋白(Endoglin)组成的组中的一种以上、两种以上、三种以上、四种以上、五种以上、六种以上、七种以上、八种以上、九种以上、十种以上、十一种以上、十二种以上、十三种以上、十四种以上、十五种以上、十六种以上、十七种以上、十八种以上、十九种以上、二十种以上、二十一种以上、二十二种以上、二十三种以上、二十四种以上、二十五种以上、二十六种以上、二十七种以上、二十八种以上、二十九种以上、三十种以上、三十一种以上、三十二种以上、三十三种以上、三十四种以上、三十五种以上、三十六种以上、三十七种以上、三十八种以上、三十九种以上、四十种以上、四十一种以上、四十二种以上、四十三种以上、四十四种以上、四十五种以上、四十六种以上、四十七种以上或者四十八种以上。更优选地，将间充质干细胞在包含人血小板裂解物的培养基中培养后获取，将获取的干细胞在无血清培养基中再次培养而获取间充质干细胞培养液，上述“生长因子及细胞因子”可包括选自由该间充质干细胞培养液内特异性存在的载脂蛋白-A-1、趋化因子(C-X-C基序)配体-4、趋化因子(C-C基序)配体-5、视黄醇结合蛋白-4、维生素D-BP、脂联素、脑源性神经营养因子、补体成分5/补体成分5a、分化群14、Fas配体、生长/分化因子15、白细胞介素-6、白细胞介素-8、血小板衍生因子-AA、巨噬细胞集落刺激因子以及白血病抑制因子组成的组中的一种以上、两种以上、三种以上、四种以上、五种以上、六种以上、七种以上、八种以上、九种以上、十种以上、十一种以上、十二种以上、十三种以上、十四种以上、十五种以上或者十六种以上，更优选地，与将间充质干细胞在包含胎牛血清的培养基中培养后获取，将获取的干细胞在无血清培养基中再次培养后获取的间充质干细胞培养液相比，将间充质干细胞在包含人血小板裂解物的培养基中培养后获取，将获取的干细胞在无血清培养基中再次培养后获取的间充质干细胞培养液中如下的成分显著增加，上述“生长因子及细胞因子”还可包括选自由该间充质干细胞培养液中显著增加的血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子19、血管生成素、血管生长素-1、血管生长素-2、Dickkopf相关蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、血管细胞粘附分子-1、趋化因子(C-X-C基序)配体-12、趋化因子(C-C基序)配体-2、正五聚蛋白-3、趋化因子(C-C基序)配体-7、巨噬细胞移动抑制因子、白细胞介素-22、白细胞介素-4、白细胞介素-17A、几丁质酶3样蛋白1、降脂蛋白、C-反应蛋白、二肽基肽酶IV、胱抑素C、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、骨桥蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、血小板反应蛋白-1、抵抗素、尿激酶受体以及内皮糖蛋白组成的组中的一种以上、两种以上、三种以上、四种以上、五种以上、六种以上、七种以上、八种以上、九种以上、十种以上、十一种以上、十二种以上、十三种以上、十四种以上、十五种以上、十六种以上、十七种以上、十八种以上、十九种以上、二十种以上、二十一种以上、二十二种以上、二十三种以上、二十四种以上、二十五种以上、二十六种以上、二十七种以上、二十八种以上、二十九种以上、三十种以上、三十一种以上或者三十二种以上。
并且，本发明提供用于制备富含生长因子及细胞因子的用于皮肤再生、改善皱纹、皮肤美白、生发或育发的化妆品组合物的间充质干细胞培养液的制备方法，包括：步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
在本发明中，上述“皮肤再生”可以是指在皮肤的一部分消失的情况下补充该部分或者增进皮肤细胞的增殖的所有作用，在促进真皮成纤维细胞增殖的情况下可以表现出皮肤再生的效果。本发明的上述用于制备化妆品组合物的间充质干细胞培养液对人真皮成纤维细胞的增殖促进效果优秀，皮肤再生的效果优秀。
在本发明中，上述“改善皱纹”是指保持或增强与皮肤的皱纹及弹性相关的能力。在皮肤的结构中，存在于真皮层的胶原纤维(collagen：胶原蛋白)和弹性纤维(elastin：弹性蛋白)是起到该作用的主要蛋白质，其主管皮肤弹性，而胶原蛋白的生物合成受皮肤内源性、外源性的影响。本发明的上述用于制备化妆品组合物的间充质干细胞培养液的胶原蛋白合成能力和弹性蛋白合成能力优秀，改善皱纹的效果优秀。
在本发明中，上述“美白”是指使肤色明亮的效果。肤色由黑色素细胞(melanocyte)中合成的黑色素的量来决定。本发明的上述用于制备化妆品组合物的间充质干细胞培养液减少黑色素的合成，皮肤美白效果优秀。
在本发明中，“生发”是指从头皮中长出头发，“育发”是指头发的长度变长(即，头发生长)，与本发明所属技术领域中使用的其他术语“养发”的含义相同。生发或育发效果通过真皮毛乳头细胞的生成或增殖来促进，本发明的上述用于制备化妆品组合物间充质干细胞培养液促进真皮毛乳头细胞的增殖，生发及育发的效果优秀。
并且，本发明提供通过上述制备方法制备的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液。
本发明的间充质干细胞培养液因促进真皮成纤维细胞的增殖而具有皮肤再生的效果，因促进胶原蛋白和弹性蛋白的合成而具有改善皱纹的效果，因抑制黑色素细胞中黑色素的合成而具有美白效果，因促进真皮毛乳头细胞的增殖而具有生发或育发的效果。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤再生的化妆品组合物。
在本发明中，上述“化妆品组合物”为包含上述干细胞培养液的组合物，其剂型可以为任意形态。上述剂型的例有，利用上述化妆品组合物制备的化妆品可以为霜剂类、面膜类、乳液类、精油类、化妆水类、粉底类以及彩妆粉底类等，为了实现本发明的目的，可以制备为上述剂型中的任意形态来使用，但不限定于上述例。
在本发明中，上述化妆品组合物还可以包含选自由纯水、多元醇、表面活性剂、粘度调节剂、螯合剂、乳化剂、pH调节剂、酸碱剂、抗氧化剂、保湿剂、光泽剂、防腐剂、香味剂、香料、凝胶剂、稳定剂、着色剂及色素组成的组中的一种以上的添加物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于改善皱纹及增进皮肤弹性的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于皮肤美白的化妆品组合物。
并且，本发明提供包含上述间充质干细胞培养液的用于促进生发或育发的化妆品组合物。
并且，本发明提供皮肤再生的方法，包括使用上述间充质干细胞培养液处理个体的步骤。
并且，本发明提供改善皱纹及增进皮肤弹性的方法，包括使用上述间充质干细胞培养液处理个体的步骤。
并且，本发明提供皮肤美白的方法，包括使用上述间充质干细胞培养液处理个体的步骤。
并且，本发明提供促进生发或育发的方法，包括使用上述间充质干细胞培养液处理个体的步骤。
在本说明书中未另行定义的术语具有本发明所属技术领域中通常所用的含义。
以下，通过实施例详细说明本发明。但下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容不受下述实施例的限制。
实施例1.在包含胎牛血清或者人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞及收集培养液
1.1获取通过层分离培养方法分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞
使用局部麻醉剂麻醉35岁男性骨髓提供者的臀部后，使用注射针头扎入髂骨采取骨髓。在100mm的培养容器中放入10ml的包含20％的胎牛血清、1％的青霉素/链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基(GIBCO-BRL，Life-technologies公司，明尼苏达州，美国)、放入3ml的人骨髓，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2小时。培养后，稍微倾斜培养容器的一端，在不使附着在容器底部的细胞脱落的前提下，最大限度地只将培养容器的上层培养液移到新的容器。反复相同的过程一次后，将所得的培养液移到底部涂敷有胶原蛋白(collagen)的培养容器(Becton Dickinson公司)后，在37℃的温度下培养2小时。将培养液再次移到涂敷有胶原蛋白的容器，24小时后再次移到新的容器，24小时后再次移到新的容器。最后，48小时后移到新的容器后，用肉眼确认剩余的细胞在容器底部附着生长。经过约3天至5天的时间，细胞形成单细胞群(single clone)，使用胰蛋白酶处理来分离这些单细胞群，从而获取通过层分离培养方法(韩国专利申请第10-2006-0075676号)分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞。
1.2在包含胎牛血清或者人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞及收集培养液
将通过与实施例1.1相同的层分离培养方法分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞以1000细胞/cm2的细胞密度接种于低葡萄糖杜氏改良伊戈尔培养基(Low glucoseDMEM)，在37℃及5％CO2的培养箱中培养。在此情况下，在37℃及5％CO2的培养箱中分别培养干细胞，直至在包含10％(w/w)的胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)或者包含4％(w/w)的人血小板裂解物的培养基中的细胞增殖程度(confluency)达到80％为止。人血小板裂解物是从Mill Creek Life Sciences公司购入的。
然后，使用磷酸盐缓冲溶液(PBS，phosphate buffered saline)洗涤3次，将培养的干细胞移到未添加抗生素(庆大霉素或青霉素)、酚红(phenol red)的无血清培养基(serum free media)培养72小时后，收集源自干细胞的培养液，将收集的培养液以3000rpm的转速离心分离后，进行过滤(Top filter system，Nunc公司)，从而完成FBS-CM(胎牛血清条件培养基(FBS-conditioned medium))以及hPL-CM(人血小板裂解物条件培养基(hPL-conditioned medium))，冷藏及冷冻保管来使用。将在没有细胞的相同条件下培养的无血清培养基用作对照组。
实施例2.通过蛋白阵列方法分析存在于FBS-CM或hPL-CM的生长因子
分析了通过与实施例1相同的方法制备的FBS-CM及hPL-CM内存在的细胞因子。分析方法是使用可以通过商业途径购入的分析试剂盒(蛋白质组分析仪人XL细胞因子阵列试剂盒，R&D公司)根据与试剂盒一同提供的说明书来实施，发色后的观察则使用LAS4000(富士公司，日本)。
将在没有细胞的相同条件下培养的无血清培养基用作对照组，将通过与实施例1相同的方法制备的FBS-CM及hPL-CM作为实验组来进行比较。能够确认各干细胞培养液内所含成分的阵列图(ARRAY MAP)如图1和表1所示。通过Image J仪器比较分析斑点(spot)来确认各生长因子的相对含量，通过实验获取的阵列结果如图2所示。
Figure BDA0003319558900000131
Figure BDA0003319558900000141
如图2a所示，确认到源自干细胞的无血清培养液内存在多种细胞因子及生长因子。比较FBS-CM与hPL-CM，可以确认在FBS-CM中检测出32种蛋白质，在hPL-CM中检测出48种蛋白质。经确认，在hPL-CM中检测出的48种蛋白质为载脂蛋白-A-1、趋化因子(C-X-C基序)配体-4、趋化因子(C-C基序)配体-5、视黄醇结合蛋白-4、尿激酶受体、维生素D-BP、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子19、血管生成素、血管生长素-1、血管生长素-2、Dickkopf相关蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、血小板衍生因子-AA、巨噬细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、血管细胞粘附分子-1、白血病抑制因子、趋化因子(C-X-C基序)配体-12、趋化因子(C-C基序)配体-2、正五聚蛋白-3、趋化因子(C-C基序)配体-7、脂联素、Fas配体、巨噬细胞移动抑制因子、白细胞介素-22、白细胞介素-4、白细胞介素-17A、补体成分5/补体成分5a、分化群14、几丁质酶3样蛋白1、降脂蛋白、C-反应蛋白、二肽基肽酶IV、胱抑素C、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、生长/分化因子15、骨桥蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、血小板反应蛋白-1、抵抗素、脑源性神经营养因子以及内皮糖蛋白。上述48种蛋白质中，相比于FBS-CM，只在hPL-CM表达的代表性的蛋白质如图2b所示，生长因子相关蛋白质如图2c所示，皮肤回春(rejuvenation)相关蛋白质如图2d所示，干细胞功效标记物、移动或再生相关蛋白质如图2e所示，此外表达的蛋白质如图2f所示。
实施例3.比较FBS-CM或hPL-CM的生长因子含量
为了对通过上述实施例2确认的本发明的hPL-CM中包含更多种类的生长因子及蛋白质的情况进行进一步明确的比较，比较了通过与上述实施例1相同的方法制备的FBS-CM或hPL-CM内存在的代表性生长因子的含量，其结果如图3所示。
如图3所示，确认到与FBS-CM相比，hPL-CM中的血管内皮生长因子、转化生长因子-β1、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子的含量增加。具体地，血管内皮生长因子在hPL-CM中的含量为FBS-CM的3.5倍以上，转化生长因子-β1在hPL-CM中的含量为FBS-CM的2.2倍以上，肝细胞生长因子在hPL-CM中的含量为FBS-CM的1.7倍以上，成纤维细胞生长因子在hPL-CM中的含量为FBS-CM的1.6倍以上。即，再次确认在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞可以使干细胞培养液内存在的生长因子的含量增加。
实施例4.比较FBS-CM或者hPL-CM的人真皮成纤维细胞的增殖效果
通过上述实施例2、实施例3确认了本发明的hPL-CM包含更多种类和高浓度的生长因子及蛋白质，据此，确认其在改善皮肤的功效上是否也有差异。具体地，将使用无血清培养基处理人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast，HDF，从Lonza公司购入)24小时的组用作对照组。分别将使用通过与实施例1相同的方法制备的100％的FBS-CM原液、使用无血清培养基将上述FBS-CM原液稀释为50％的50％的FBS-CM稀释液、通过与实施例1相同的方法制备的100％的hPL-CM原液以及使用无血清培养基将上述hPL-CM原液稀释为50％的50％的hPL-CM稀释液处理人真皮成纤维细胞24小时的组作为各实验组，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)确认各对照组与实验组的人真皮成纤维细胞的增殖促进效果，其结果如图4所示。
如图4所示，经确认，相比于对照组，在hPL-CM处理组中的人真皮成纤维细胞的增殖促进效果增加100％以上，相比于FBS-CM处理组，在hPL-CM处理组中表现出人真皮成纤维细胞的增殖促进效果提高的倾向，由此确认hPL-CM的皮肤再生的效果。
实施例5.FBS-CM或hPL-CM合成胶原蛋白的效果
在本实施例中，为了确认作为干细胞培养液的皮肤老化抑制剂的有效性，利用源自人的皮肤成纤维细胞确认了胶原蛋白的合成率。具体地，在6-孔培养板中培养人真皮成纤维细胞24小时后，使用1000μl的通过与上述实施例1相同的方法制备的FBS-CM、hPL-CM或者对照组培养液(在没有细胞的相同条件下培养的无血清杜氏改良伊戈尔培养基(serum-free DMEM media))处理后，再培养72小时。使用胶原蛋白试剂盒(Sircol TM collagenassay kit)检测人真皮成纤维细胞新合成分泌的胶原蛋白的量，其结果如图5所示。
如图5所示，在FBS-CM处理组中检测到143.6μg/ml的胶原蛋白合成量，在hPL-CM处理组中检测到170.0μg/ml的胶原蛋白合成量，在hPL-CM处理组中检测到高出约18％的胶原蛋白合成量。即，确认到在给皮肤弹性、皮肤再生及皮肤皱纹的改善提供帮助的胶原蛋白的合成方面，hPL-CM比FBS-CM优秀。
实施例6.FBS-CM或hPL-CM合成弹性蛋白的效果
皮肤弹性通过由存在于真皮层的弹性蛋白构成的弹性纤维来显现，上述弹性纤维与胶原蛋白共同存在，在弹性蛋白与胶原蛋白充分存在的状态下，能够维持皮肤的弹性。实施了用来确认FBS-CM或hPL-CM促进合成弹性蛋白的效果的实验。具体地，在24孔培养板接种(seeding)人真皮成纤维细胞经过24小时后，若细胞全部附着，则去除所有培养基后，向各孔放入500μl的通过与实施例1相同的方法制备的FBS-CM、hPL-CM或者无血清培养基(对照组)后培养72小时，然后检测弹性蛋白的量，其结果如图6所示。
比较弹性蛋白合成量的结果如图6所示，检测出FBS-CM处理组及hPL-CM处理组中合成的弹性蛋白分别为38.3μg/ml及46.0μg/ml，在hPL-CM处理组中检测到高出约20％的弹性蛋白合成量。即，可以确认在给皮肤弹性、皮肤再生及皮肤皱纹的改善提供帮助的弹性蛋白的合成方面，hPL-CM更为有效。
实施例7.利用三维人造皮肤的皮肤美白效果
为了确认干细胞培养液的皮肤美白效果，利用人造皮肤确认了黑色素量的减少。三维人造皮肤使用了MEL-300-Melanoderm tissues(MarTek公司，韩国)，在37℃及5％CO2的培养箱条件下培养并观察结果。具体地，将无血清培养液处理组设定为对照组，将使用200μl的1000μg/ml浓度的熊果苷处理的组、使用200μl的实施例1中制备的FBS-CM处理的组、混合100μl的1000μg/ml浓度的熊果苷及100μl的实施例1中制备的FBS-CM处理的组、使用200μl的实施例1中制备的hPL-CM处理的组、混合100μl的1000μg/ml浓度的熊果苷及100μl的实施例1中制备的hPL-CM处理的组设定为实验组。按照上述设定的，每两天一次使用FBS-CM、hPL-CM或熊果苷反复处理放置在transwell上的人造皮肤，培养21天后，检测黑色素合成量，检测结果如图7所示。
如图7所示，当以100％的对照组的黑色素合成量为基准时，作为阳性对照组的熊果苷(Arbutin)中，黑色素的合成量减少为74.1％，FBS-CM处理组及hPL-CM处理组分别减少为94.6％及85.6％。在使用作为阳性对照组的熊果苷与FBS-CM及hPL-CM混合(combination)来处理的情况下，确认到熊果苷/FBS-CM的黑色素合成量进一步减少为82.5％，熊果苷/hPL-CM的黑色素合成量进一步减少为76.7％。即，通过显示皮肤美白效果的三维人造皮肤的黑色素合成量，确认hPL-CM比FBS-CM显出更高的美白效果。
实施例8.确认FBS-CM或者hPL-CM的生发功效
生发可以通过真皮毛乳头细胞(dermal papilla)的生成及增殖来实现。因此，为了确认干细胞培养液根据培养条件的生发功效，利用人毛乳头细胞(primary humandermal papilla cell)来确认是否对生长，即，对增殖带来影响。具体地，将通过与实施例1相同的方法制备的FBS-CM处理组或通过与实施例1相同的方法制备的hPL-CM处理组设定为实验组，将无血清培养基处理组设定为对照组。在96孔培养板接种人毛乳头细胞(从PromoCell公司购入)经过24小时后，若细胞全部附着，则向各孔放入200μl的FBS-CM、hPL-CM或者无血清培养基后培养48小时，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)确认促进人毛乳头细胞增殖的效果，其结果如图8所示。
如图8所示，确认到当使用干细胞培养液处理时，hPL-CM处理组的促进增殖的效果为对照组的2.6倍以上，hPL-CM处理组的促进增殖的效果比FBS-CM处理组高出约20％，从而确认了hPL-CM的生发效果。
实施例9.根据培养条件和分离方法比较人真皮成纤维细胞的增殖效果
对使用通过浓度梯度离心法(Gradient centrifugation method，GCM)分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞以与实施例1、实施例2相同的方法制备的间充质干细胞培养液(以下称GCM-CM(GCM conditioned medium))与通过实施例1的层分离培养方法分离的干细胞培养液(以下称SCM-CM)的功效进行比较。
9.1设定实验组及对照组
将使用以与实施例1、实施例2相同的方法在包含胎牛血清或者人血小板裂解物的培养基中培养通过梯度离心法(GCM)分离的间充质干细胞后移到无血清培养基中培养来获取的间充质干细胞培养液(以下称GCM-FBS-CM或者GCM-hPL-CM)处理的GCM-FBS-CM处理组及GCM-hPL-CM处理组、将在包含胎牛血清或者人血小板裂解物的培养基中培养通过与实施例1相同的层分离培养方法分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞后移到无血清培养基中培养来并获取的间充质干细胞培养液(以下称SCM-FBS-CM或者SCM-hPL-CM)处理的SCM-FBS-CM处理组及SCM-hPL-CM处理组设定为实验组。将无血清培养基处理组设定为对照组。
9.2检测人真皮成纤维细胞的增殖效果
在96孔培养板接种人真皮成纤维细胞经过24小时后，若细胞全部附着，则去除全部培养基后，向各孔分别放入200μl的上述实施例9.1所述的干细胞培养液或者无血清培养基后培养48小时，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)确认促进人真皮成纤维细胞增殖的效果，其结果如图9所示。
如图9所示，确认到在相同的细胞株中，相比于胎牛血清培养条件，在人血小板裂解物培养条件的情况下，人真皮成纤维细胞的增殖效果更高，确认到与通过梯度离心法培养的情况相比，通过层分离方法培养的两个细胞株中的增殖率更高。
实施例10.根据培养条件和分离方法比较血管内皮生长因子含量
还对通过梯度离心法分离的间充质干细胞的培养液与通过实施例1的层分离培养方法分离的干细胞培养液的功效进行了比较。具体地，以实施例9.1中制备的对照组与作为实验组的GCM-FBS-CM组、GCM-hPL-CM组、SCM-FBS-CM组及SCM-hPL-CM组为对象，使用与实施例2相同的方法比较作为代表性生长因子的血管内皮生长因子的含量，其结果如图10所示。
比较干细胞培养液内血管内皮生长因子含量的结果如图10所示，确认到在以相同方式分离的间充质干细胞细胞株中，相比于在添加胎牛血清的培养基中培养的间充质干细胞培养液，在添加人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞培养液中的血管内皮生长因子的含量更高，确认到相比于通过梯度离心法培养的情况，通过层分离方法培养的两个细胞株中的含量更高。
以上，详细记述了本发明内容的特定部分，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，上述具体记述仅为优选的实施方式而已，而不是要限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应由随附的发明要求保护范围和其等效物来定义。
本发明的组合物可以根据目的配制为多种形态。下述将例示包含本发明的组合物作为活性成分的几种配制方法，但本发明不限定于此。
剂型例1：化妆水
包含本发明的间充质干细胞培养液的化妆品中的化妆水的剂型例如下：
成分(含量，单位：重量百分比)
Figure BDA0003319558900000201
剂型例2：霜剂
包含本发明的间充质干细胞培养液的化妆品中的霜剂的配方例如下：
成分(含量，单位：重量百分比)
Figure BDA0003319558900000202
Figure BDA0003319558900000211
剂型例3：精油
包含本发明的间充质干细胞培养液的化妆品中的精油的处方例如下：
成分(含量，单位：重量百分比)
Figure BDA0003319558900000212
Figure BDA0003319558900000221
以上，详细记述了本发明内容的特定部分，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，上述具体记述仅为优选的实施方式而已，而不是要限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应由随附的发明要求保护范围和其等效物来定义。

Claims (13)

1.一种富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；
步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及
步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，上述包含人血小板裂解物的培养基为包含1重量百分比至10重量百分比的人血小板裂解物的培养基。
3.根据权利要求1所述的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，
上述间充质干细胞为通过干细胞的层分离培养方法分离的源自骨髓的单克隆间充质干细胞，
上述层分离培养方法包括：
步骤1)，培养从个体分离的骨髓；
步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移到新的容器中培养；
步骤3)，仅分离上述步骤2)的上清液，在培养容器中在35℃至39℃的温度下培养1小时至3小时后，在35℃至39℃的温度下培养12小时至36小时，反复进行2次至3次，然后在35℃至39℃的温度下培养24小时至72小时，每次都将上清液移到新的培养容器进行反复培养；以及
步骤4)，从最终的培养容器中获取单克隆干细胞。
4.根据权利要求1所述的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，将上述步骤1)的间充质干细胞以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的密度接种。
5.根据权利要求1所述的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，上述生长因子及细胞因子包括选自由载脂蛋白-A-1、趋化因子(C-X-C基序)配体-4、趋化因子(C-C基序)配体-5、视黄醇结合蛋白-4、维生素D-BP、脂联素、脑源性神经营养因子、补体成分5/补体成分5a、分化群14、Fas配体、生长/分化因子15、白细胞介素-6、白细胞介素-8、血小板衍生因子-AA、巨噬细胞集落刺激因子以及白血病抑制因子组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求5所述的富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，上述生长因子及细胞因子还包括选自由血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子19、血管生成素、血管生长素-1、血管生长素-2、Dickkopf相关蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、血管细胞粘附分子-1、趋化因子(C-X-C基序)配体-12、趋化因子(C-C基序)配体-2、正五聚蛋白-3、趋化因子(C-C基序)配体-7、巨噬细胞移动抑制因子、白细胞介素-22、白细胞介素-4、白细胞介素-17A、几丁质酶3样蛋白1、降脂蛋白、C-反应蛋白、二肽基肽酶IV、胱抑素C、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、骨桥蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、血小板反应蛋白-1、抵抗素、尿激酶受体以及内皮糖蛋白组成的组中的一种以上。
7.一种用于制备富含生长因子及细胞因子的用于皮肤再生、改善皱纹、皮肤美白、生发或育发的化妆品组合物的间充质干细胞培养液的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)，在包含人血小板裂解物的培养基中培养间充质干细胞；
步骤2)，获取培养的干细胞后在无血清培养基中培养；以及
步骤3)，收集源自间充质干细胞的培养液后过滤来获取干细胞培养液。
8.一种富含生长因子及细胞因子的间充质干细胞培养液，其特征在于，由权利要求1至7中任一项所述的方法制备。
9.一种用于皮肤再生的化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的间充质干细胞培养液。
10.一种用于改善皱纹及增进皮肤弹性的化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的间充质干细胞培养液。
11.一种用于皮肤美白的化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的间充质干细胞培养液。
12.一种用于促进生发或育发的化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的间充质干细胞培养液。
13.一种选自由皮肤再生、改善皱纹及增肌皮肤弹性、皮肤美白及促进生发或育发组成的组中的一种方法，其特征在于，包括使用权利要求8所述的间充质干细胞培养液处理个体的步骤。
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