KR20060126570A - 2개의 염색체외 인자의 사용에 의한 원핵 세포에서 재조합유전자의 발생 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 2개의 상이한 염색체외 인자를 사용함으로써 원핵 세포, 특히 세균에서 재조합 DNA 서열을 발생하고 검출하기 위한 방법, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 염색체외 인자, 특히 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 방법이 관련된 DNA 서열은 단백질-코드화 및 비-코드화 서열을 포함한다.
재조합 유전자, 염색체외 인자, 원핵 세포.
Description
본 발명은, 2개의 상이한 염색체외 인자를 사용함으로써 원핵 세포, 특히 세균에서 재조합 DNA 서열을 발생 및 검출하기 위한 생체내 방법, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 염색체외 인자, 특히 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 방법이 관련되는 DNA 서열은 단백질-코드화 및 비-코드화 서열을 포함한다.
진화는 유전자 변형 및 표현형 도태의 연속 과정이다. 개체군의 유전적 다양성은 개체군 내에 있는 개체의 성능을 개선시키는 새로운 돌연변이체 조합을 발생시킴으로써 증폭될 수 있다. 미생물의 유도된 진화는, 전통적으로 종래의 균주 개선 방법을 통해 순차적인 무작위 돌연변이유발 및 선별에 의하여 달성되어 왔다.
유도된 진화는 지금까지 단백질을 조작하기 위한 수단으로서 거의 독점적으로 사용되어 왔다. 부위 특이적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발, 및 오류가 많은 PCR과 같은 돌연변이 기술에 의하여, 단백질 기능의 변형체가 발생되었으며 이렇게 제조된 라이브러리는 특이적 기능을 수행하는 능력에 대해 선별되어 왔다. 최적 pH, 열적 내성, 용매 안정성, 입체선택성, 촉매적 활성 및 기질 특이성 뿐만 아니라 세균에서의 독성 내성 메카니즘 및 바이러스의 숙주 범위 및 안정성과 같은, 효소의 물리적 및 촉매적 성질의 변형을 위하여 이러한 절차의 반복 적용이 성공적으로 사용되어 왔다.
효소에서 새로운 성질을 진화시키기 위한 전통적인 돌연변이유발 접근법은 다수의 제약을 갖고 있다. 이러한 접근법은 클론화되고 기능적으로 특징결정되며 별개의 기능을 가진 유전자 또는 서열에만 적용될 수 있다. 또한, 전통적인 돌연변이유발 접근법은 심지어 단일 유전자에 대해서도 매우 한정된 수의 치환 만을 조사할 수 있다. 그러나, 특정한 상황 하에서, 새로운 성질을 가진 단백질을 발현시키기 위하여, 단지 하나의 유전자가 아니라 추가의 유전자들을 변형시키는 것이 필요할 수도 있다. 이러한 추가의 유전자들은, 예를들어 전사, 번역, 후-번역 변형, 유전자 생성물의 분비 또는 단백질가수분해적 분해와 같은 하나 이상의 세포 메카니즘에서 중요한 역할을 하는 하나의 표현형 또는 유전자를 협조적으로 부여하는 유전자일 수 있다. 전통적인 돌연변이유발 접근법에 의하여 이러한 기능을 가진 모든 유전자들을 개별적으로 최적화하려는 시도는 실질적으로 불가능한 작업일 것이다.
종래의 돌연변이유발 접근법과 연관된 대부분의 문제는, 기능성 유전자의 상이한 서열을 무작위로 재조합하는 것을 포함한 재조합 접근법에 의해 극복될 수 있으며, 이는 자연적으로 유사하거나 무작위 돌연변이된 유전자의 분자 혼합을 가능하게 한다. 재조합에 의한 종래의 돌연변이유발에 비하여, 개선된 표현형을 가진 돌연변이를 수득할 가능성이 상당히 높다. 종래의 DNA 조작 기술에 비해 재조합 접근법의 주된 장점은, 특히 실험적 단순성 및 DNA 서열에 의해 부여된 제약으로부터의 자유이다.
재조합 과정에 대해 알려진 것의 대부분은 세균과 같은 단순하고 단세포의 유기체의 연구로부터 나왔다. 이러한 유기체에서의 재조합 연구는, DNA 서열의 조작 용이성 및 대부분의 세포에서 동시에 유도된 특정한 재조합 사건의 연구 가능성이라는 장점을 갖는다. 동일하게 중요한 것은, 미생물에서 연구된 과정이 대부분의 측면에서 포유동물 세포, 예를들어 인간 세포가 유전적 다양성을 발생시키는 방식과 동일하거나 유사하다는 확신이 점점 증가한다는 것이다. 또한, 이러한 메카니즘을 정의하는 것은, 포유동물 세포에서 유전자 표적화 및 유전자 대체의 더욱 효율적인 메카니즘을 개발하기 위한 탐구에서 추가의 중요성을 갖는다.
원핵 세포에서 재조합을 수행하기 위해 다수의 상이한 체계가 존재하긴 하지만, 이들의 대부분은 새로 재조합된 DNA 서열을 용이하고 신뢰할 수 있을 정도로 검출하지 못한다. 따라서, 선택적 압력 하에 재조합체를 빠르고 간단하게 검출하고/하거나 재조합체를 선별할 수 있도록 하도록 하는, 효율적인 원핵생물 시험 체계가 당 기술분야에서 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제점은 원핵 세포에서 재조합 모자이크 유전자를 간단하고 효율적으로 발생시키기 위해, 특히 이러한 재조합 서열을 선별하고 검출하기 위해 개선된 방법 및 수단을 제공하는데 있다.
본 발명은
a) 재조합되어지는 첫번째 DNA 서열을 포함하고 원핵 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 수용체 DNA 분자, 및 재조합되어지는 두번째 DNA 서열 및 유전자 생성물을 코드화하는 적어도 첫번째 마커 서열을 포함하고 원핵 세포에서 자율적으로 복제될 수 없는 공여체 DNA 분자를 함유하는, 첫번째 원핵 세포를 발생시키고,
b) 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물이 발현된다면 단지 세포의 성장 및/또는 증식을 가능하게 하는 선택적 조건 하에 첫번째 원핵 세포를 배양하고,
c) 선택적 조건 하에 성장 및/또는 증식되고, 첫번째 및 두번째 DNA 서열 간의 재조합에 기인한 적어도 첫번째 마커 서열 및 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열의 하이브리드 DNA 분자를 함유하는, 두번째 원핵 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 원핵생물에서 재조합 DNA 서열을 발생시키고 검출하는 방법을 제공함으로써 상기 기초가 되는 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 생체내에서 적어도 2개의 분기된(diverging) (즉, 이종의) DNA 서열 또는 재조합 기질 간의 재조합 사건을 선별하기 위한 원핵생물 체계를 제공한다. 본 발명의 체계는, 재조합되어지는 2개의 DNA 서열을 함유하는 2개의 염색체외 인자로부터 DNA의 생체내 교환과 연관된 공정에 의해, 적어도 2개의 분기된 DNA 서열로부터 빠르고 효율적인 방식으로 개선된 성질을 가진 새롭고 유리한 DNA 서열을 발생시킬 수 있다. 그들의 뉴클레오티드 서열에서 상동성을 나타내지 않는 2개의 염색체외 인자는 수용체 DNA 분자 및 공여체 DNA 분자의 형태로 원핵 숙주 세포 내에 도입된다. 수용체 분자는 숙주 내에서 자율적으로 복제될 수 있는 반면, 공여체 분자는 복제 능력을 갖지 않는다. 그러나, 공여체 분자는 숙주 세포의 게놈에 존재하지도 않고 수용체 분자에 존재하지도 않는 적어도 하나의 특유의 단백질-코드화 마커 서열, 예컨대 항생물질 내성 마커 또는 영양 마커를 함유한다. 원핵 숙주 세포 내에 염색체외 인자를 양쪽 모두 도입한 후에, 2개의 이종 유전자 간에 재조합을 강제로 일으키는 조건 하에서 세포를 배양한다. 이러한 조건은 예를들어 세포가 보통 민감한 항생물질의 존재 하에서 세포를 배양하거나, 또는 필수 영양소가 부족한 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있고, 여기에서 세포가 그 자체로 합성될 수 없고 따라서 외부에서 필수 영양소가 공급되어야 한다. 적용된 배양 조건 하에서, 각각의 마커 서열의 유전자 생성물이 발현된다면 세포가 단지 성장하고 증식, 즉 분열될 수 있다. 그러나, 마커 서열의 발현을 위한 예비요건은, 비-복제 공여체 분자 및 복제 수용체 분자가 수용체 분자의 개시점으로부터 복제될 수 있는 공동-통합체(co-integrate)를 형성하고 따라서 마커 서열을 유지할 수 있어야 한다는 것이다. 이러한 공동-통합체의 형성은, 모 DNA 서열과 상이한 서열을 가진 새로운 DNA 분자의 발생을 일으키는 2개의 재조합 기질 간의 재조합으로부터 얻어진다. 따라서, 적용된 선택 조건 하에 성장되고 증식된 숙주 세포는 새로운 재조합 DNA 서열을 함유한다. 따라서, 본 발명의 방법은 재조합 DNA 서열을 동정하기 위해 용이하고 빠른 선택 체계를 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 재조합되고 돌연변이된 DNA 서열의 큰 라이브러리가 쉽게 발생될 수 있고, 이어서 적절한 선택 또는 선별 체계를 사용함으로써 원하는 기능을 획득한 변형체가 동정될 수 있다.
단순한 단일세포 유기체, 예컨대 원핵생물에서 재조합 공정의 연구는, DNA 서열의 조작 용이성 및 대부분의 세포에서 동시발생적으로 유도된 특정한 재조합 사건의 연구 가능성이라는 명백한 장점을 갖는다. 또한, 지난 수 십 년에 걸쳐, 발효 공학 및 원핵생물 유기체의 기본 유전학 양쪽 모두에서 전문가의 부가 축적되었다. 원핵 숙주 세포의 다른 주된 장점은 그들의 매우 짧은 배가 시간에 관련된다. 즉, 원핵 숙주 세포의 사용에 의하여, 다수 라운드(round)의 세포 분열 및 이에 따른 다수 라운드의 재조합을 수행할 수 있고, 그 결과 짧은 시간 내에 다수의 새로운 재조합 DNA 서열을 형성할 수 있다.
본 발명의 방법은 야생형 또는 불일치 수복-결손(mismatch repair-defective) 원핵 세포에서 수행될 수 있다. 손상된 DNA가 수복되는 방법 및 유전자 재조합 메카니즘은 긴밀한 관계를 갖고, 불일치 수복 기구는 분기 서열, 즉 동종 재조합 간에 재조합 빈도에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 불일치 수복 체계의 돌연변이는 원핵 세포에서 재조합 사건의 전체 빈도를 크게 증진시킨다. 다른 한편, 원핵생물 야생형 세포는 불일치 수복-의존성 재조합 메카니즘을 갖는 것으로 알려져 있고, 이것은 2개의 재조합 기질에서 멀리 떨어져 있는 불일치를 기초로 한다. 재조합되어지는 DNA 서열에 의존하여, 재조합된 서열을 수득하기 위해 야생형 또는 불일치 수복-결손 원핵 세포가 사용될 수 있다.
재조합 DNA 서열을 발생시키고 검출하기 위한 본 발명의 방법은, 매우 분기된 DNA 서열이 재조합될 수 있다는 장점을 갖는다. 뜻밖에도, 본 발명자들은 고도의 전체 분기를 갖고 단지 매우 짧은 상동성 또는 동일성의 연속범위를 공유하는 서열을 재조합할 수 있음을 알아내었다. 재조합 서열의 분석은, 재조합이 발생한 가장 긴 동일성의 연속범위가 단지 18 내지 22개 뉴클레오티드를 포함한다는 것을 밝혀내었다. 대부분의 재조합 사건은 10 내지 15개 뉴클레오티드 길이를 가진 상동성 연속범위에서 발생하였다. 일부 경우에, 단지 4 내지 5개 뉴클레오티드의 길이를 가진 연속범위에서 재조합이 발생하였다.
따라서, 본 발명의 방법은 유리한 특징을 가진 재조합 DNA 서열을 발생시키기 위하여 상이한 원핵생물 종 또는 상이한 원핵생물 속으로부터 유래된 DNA 서열의 재조합을 가능하게 한다.
재조합 DNA 서열을 발생시키고 검출하기 위한 본 발명의 방법은, 2개 이상의 분기 서열이 재조합될 수 있고 이에 의해 재조합되어지는 2개의 분기 서열이 사전-선택되거나 비-선택된 서열일 수 있다는 장점을 갖는다.
예를들어, 전체 유전자 라이브러리까지의 다양한 분기된 DNA 서열이 수용체 뿐만 아니라 공여체 DNA 분자 내에 삽입될 수 있다. 그 후에, 각각의 분기된 DNA 서열은 우연히 그 자체와 재조합될 수 있다. 또한, 전체 유전자 라이브러리까지의 분기된 DNA 서열의 첫번째 세트를 수용체 DNA 분자 내에 삽입하고, 전체 유전자 라이브러리까지의 분기된 DNA 서열의 두번째 세트를 공여체 DNA 분자 내에 삽입하거나, 또는 그 역으로 삽입한 다음, 2개의 세트를 상호간에 재조합하는 것이 가능하다. 양쪽 경우에, 분기된 DNA 서열의 쌍이 재조합되어지는 것에 관해 선택이 존재하지 않는다.
그러나, 단계적 방식으로 몇 가지, 바람직하게는 사전-선택된 분기 서열을 재조합하는 것이 또한 가능하며, 이에 의해 각각의 단계에서 분기된 DNA 서열의 쌍이 재조합되도록 선택이 행해진다. 예를들어, 3개의 분기 DNA 서열이 재조합되어야 한다면, 첫번째 단계에서 첫번째 원핵 세포가 발생되고 이에 의해 재조합되어지는 첫번째 DNA 서열을 가진 수용체 DNA 분자 및 재조합되어지는 두번째 DNA 서열을 가진 공여체 DNA 분자가 주어진 종의 세균 세포 내에 도입된다. 단지 세포들 만이 생육되고 증식되도록 선택된 조건 하에서 이러한 원핵 세포를 배양하고, 여기에서 각각의 수용체 및 공여체 DNA 분자가 하이브리드 분자를 형성하며, 이는 공여체 분자의 마커 서열의 발현을 가능하게 하고 재조합되는 2개의 DNA 서열 간에 재조합을 가능하게 한다. 따라서, 재조합에 기인한 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열과의 하이브리드 분자를 함유하는 두번째 원핵 세포가 수득된다. 첫번째 및 두번째 재조합된 서열을 단리하고 이들의 하나를 예를들어 수용체 분자 내에 삽입하는 반면, 재조합되는 세번째 DNA 서열을 공여체 분자 내에 삽입한다. 이후의 단계에서, 재조합된 서열의 하나를 포함하는 수용체 분자 및 재조합되는 세번째 DNA 서열을 포함하는 공여체 분자를 다시 원핵 숙주 세포에 도입하여 다른 라운드의 재조합을 겪게한다.
예를들어 4개의 분기 DNA 서열이 재조합되어야 한다면, 첫번째 단계에서 2개의 상이한 세트의 첫번째 원핵 세포가 발생된다. 예를들어, 재조합되어지는 첫번째 DNA 서열을 가진 수용체 DNA 분자 및 재조합되어지는 두번째 DNA 서열을 가진 공여체 DNA 분자를 원핵 세포 내에 도입함으로써, 첫번째 원핵 세포의 첫번째 세트가 발생될 수 있다. 유사하게, 재조합되어지는 세번째 DNA 서열을 가진 수용체 DNA 분자 및 재조합되어지는 네번째 DNA 서열을 가진 공여체 DNA 분자를 동일한 종의 세포 내에 도입함으로써, 첫번째 원핵 세포의 두번째 세트가 발생될 수 있다. 원핵 세포의 각 세트를 재조합 실행을 위한 선택적인 조건 하에 배양한다. 따라서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열 간의 재조합에 기인한 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열과의 하이브리드 분자를 함유하는 원핵 세포의 첫번째 세트를 수득한다. 또한, 재조합되어지는 세번째 및 네번째 DNA 서열 간의 재조합에 기인한 세번째 및 네번째 재조합된 DNA 서열과의 하이브리드 분자를 함유하는 원핵 세포의 다른 세트가 수득된다. 이렇게 수득된 첫번째, 두번째, 세번째 및 네번째 재조합 DNA 서열을 각각의 숙주 세포로부터 단리한다. 이후의 단계에서, 첫번째 또는 두번째 재조합 서열을 공여체 DNA 분자 내에 삽입할 수 있고, 세번째 또는 네번째 재조합 서열을 수용체 DNA 분자 내에 삽입할 수 있다. 이렇게 수득된 공여체 및 수용체 DNA 분자는 양쪽 모두 원핵 숙주 세포 내에 도입되어, 다른 라운드의 재조합을 겪게 된다. 이러한 방식으로, 5개, 6개 또는 그 이상의 분기 DNA 서열이 재조합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자 및 수용체 DNA 분자는 상이한 선형 또는 원형 DNA 구조이다. 용어 "DNA 구조"는 DNA 분자, 예를들어 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 벡터를 의미하고, 염색체외 인자의 형태로 원핵 숙주 세포 내에 도입될 때 존재함을 특징으로 한다. 본 발명의 문맥에서, "염색체외 인자"는 원핵 숙주 세포의 염색체(들) 내에 통합되지 않는 DNA 분자이다.
공여체 DNA 분자는 수용체 DNA 분자와 하이브리드형성될 수 있어야 하고 따라서 하이브리드 분자가 형성될 수 있다. 바람직하게는, 공여체 DNA 분자 및 수용체 DNA 분자가 재조합되어지는 DNA 서열을 제외하고는 일반적으로 상동성을 공유하지 않는다.
본 발명에 따르면, 수용체 DNA 분자는 그 세포 내에 도입될 때 원핵 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있어야 한다. 따라서, 수용체 DNA 분자는 숙주 유전자 물질과 독립적으로 수용체 DNA 분자를 복제시킬 수 있는 적어도 하나의 복제 개시점을 가져야 한다. 본 발명의 문맥에서, "복제 개시점" 또는 "ori"는 DNA 분자의 복제를 개시하기 위해 세포 효소에 의해 사용되는 DNA 분자의 영역이다. 개시점에서, DNA의 2개 가닥을 떼어내어 복제 버블을 형성하고, 이것은 버블의 각 측면에서 단일-가닥 DNA의 영역을 생성한다. DNA 폴리머라제 구조가 개입될 수 있고 주형으로서 이전의 가닥을 사용하여 새로운 DNA 가닥을 합성하기 시작한다. 세균 플라스미드 또는 박테리오파지를 포함하는 작은 DNA는 통상 하나의 개시점을 갖는다.
본 발명의 구현양태에서, 수용체 DNA 분자는 플라스미드, 특히 이중-가닥 원형 DNA 분자이다. "플라스미드"는 숙주 유전 물질과 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 인자이다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 수용체 DNA 분자는 박테리오파지, 특히 염색체외 인자의 형태로 원핵 세포에 존재하는 DNA의 파지이다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 수용체 DNA 분자는 플라스미드이고, 이것은 이.콜리(E. coli) 숙주 세포에서 복제될 수 있다. 바람직하게는, 수용체 DNA 분자는 이.콜리 플라스미드 pACYC184 또는 그의 유도체이다. 플라스미드 pACYC184는 TetR 및 CamR이다.
본 발명에 따르면, 공여체 DNA 분자는 원핵 숙주 세포에서 복제될 수 없지만 수용체 DNA와 하이브리드 분자를 형성할 수 있는 DNA 분자이다. 따라서, DNA 분자는 이것이 적어도 마커 서열을 함유하고 주어진 원핵 숙주 세포 내에서 독립적으로 복제할 수 없는 한 공여체 분자로서 사용될 수 있다. 적절한 공여체 분자의 예는 이에 한정되지 않지만 원형화될 수 있고 예를들어 PCR에 의해 발생되고 적절한 마커 서열, 플라스미드 및 박테리오파지를 함유하는 선형 이중-가닥 DNA를 포함한다. 플라스미드 또는 박테리오파지가 공여체 DNA 분자로서 사용되는 경우에, 이러한 분자는 복제의 기능적 개시점(들)을 전혀 갖지 않거나, 또는 사용된 원핵 숙주 세포에서 기능성이 아닌, 즉 활성이 아닌 복제 개시점(들)을 갖는다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, 공여체 DNA 분자는 복제 개시점을 함유하지 않는다. 이것은, 공여체 DNA 분자가 원핵 숙주 세포에서 복제 개시점으로서 작용할 수 있는 서열, 즉 복제 개시에 연관된 단백질 인자가 결합될 수 있는 서열을 함유하지 않음을 의미한다. 복제 개시점의 부재는 개시점으로 작용하는 핵산 서열의 결실에 기인할 수도 있다.
본 발명의 다른 구현양태에서, 공여체 DNA 분자의 복제 개시점의 기능은, 복제 개시점 자체의 기능 또는 복제에 관련된 단백질, 특히 복제가 개시되어지는 개시점의 핵산 서열에 결합하는 단백질의 기능을 없애는 하나 이상의 돌연변이에 의해 손상될 수 있다. 예를들어, 이.콜리에서 복제 개시를 위한 주요 단백질 DnaA는 복제의 염색체 개시점에서 특정한 서열, 이른바 DnaA-박스에 결합하고 3개의 AT-풍부 13량체 직접 반복물을 용융시키는 것으로 알려져 있다. 개방 영역에서 단일 가닥 6량체 박스에 DnaA 단백질의 추가의 결합은 개방 착물을 안정화시키는 것으로 생각된다 (검토를 위하여 문헌 [Jiang 등, PNAS, 100(2003), 8692-8697] 참조). DnaA 박스 및 AT-풍부 영역은 다양한 원핵생물 레플리콘의 개시점에서 일반적으로 발견되고 DnaA 단백질은 이러한 개시점에서 복제 개시에 주요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, DnaA 박스 및/또는 AT-풍부 영역 또는 복제 개시점의 서열에서 상응하는 부위의 특정한 돌연변이, 예컨대 적절한 염기 치환, 결실 등은 복제 개시를 위해 필요한 단백질의 결합을 방지할 수 있고 따라서 염색체외 인자의 개시점의 기능을 억제한다. 본 발명의 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자의 복제 개시점의 기능은 공여체 DNA 분자의 복제 개시점의 핵산 서열에서, 특히 개시점의 DnaA 박스 및/또는 AT-풍부 영역에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 손상될 수 있다.
또한, DnaA 단백질 단독은 RK2, P1, F, pSC101 또는 R6K과 같은 플라스미드의 개시점에서 개방 착물의 형성을 위해 충분하지 않은 것으로 알려져 있다. 이러한 경우에, 숙주 DnaA 단백질 및 HU 또는 IHF (통합된 숙주 인자) 단백질과 제휴된다 하더라도, 개방 착물의 효율적인 형성은 플라스미드 Rep 단백질의 결합을 필요로 한다. 개방 착물 형성을 위한 플라스미드-특이적 개시 단백질의 요건은, 복제 개시점에서 개시 사건의 빈도를 조절하는 플라스미드의 능력에 매우 중요하다 (검토를 위하여 문헌 [Jiang 등, PNAS, 100(2003), 8692-8697] 참조). 이것은, 플라스미드 복제에서 필수적인 기능을 가진 단백질 인자를 코드화하는 플라스미드 핵산 서열의 돌연변이가 염색체외 인자의 복제 개시점의 기능을 손상시킬 수 있음을 의미한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자의 복제 개시점의 기능은 공여체 DNA 분자의 복제에서 필수적인 기능을 가진 단백질 인자를 코드화하는 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 손상될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자는, 재조합되어지는 2개의 DNA 서열 사이에서 재조합을 실행하기 위하여 공여체 DNA 분자가 도입되어진 원핵 세포에서가 아니라 특정한 원핵 숙주 세포에서만 활성인 복제 개시점을 함유한다. 특정한 세균 종에서 활성인 복제 개시점이 다른 세균 종에서 기능하지 않는다는 여러 기록이 존재한다. 예를들어, 크렙시엘라 뉴모니애의 복제 개시점(oriC)은 카울로박터 크레센투스, 슈도모나스 푸티다 또는 로도박터 스패로이데스에서 활성이 아닌 것으로 알려져 있다 [O'Neill and Bender, J.Bacteriol., 170(1988), 3774-3777]. 또한, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)의 플라스미드가 이.콜리 세포에서 복제할 수 없는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자 및/또는 그의 복제 개시점은 공여체 DNA 분자가 도입된 세포의 원핵생물 종이 아닌 원핵생물 종으로부터 유래된다.
특히 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자는 비.섭틸리스(B. subtilis) 플라스미드 pMIA91이고, 이것은 플라스미드 pIL253의 유도체이고 이.콜리에서가 아니라 비.섭틸리스에서 복제될 수 있고 외래 DNA 서열을 삽입하기 위하여 specR 마커, phleoR 마커 및 제한효소 부위 ScaI, PpuMI 및 EcoO109I 을 포함한다. 다른 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자는 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101이고, 이것은 플라스미드 pIL253의 유도체이며 비.섭틸리스에서 복제될 수 있지만 이.콜리에서 복제되지 않고 외래 DNA 서열을 삽입하기 위해 tcR 마커 서열 및 제한효소 부위 KhoI 및 PstI을 포함한다.
본 발명의 다른 구현양태에서, 공여체 DNA 분자의 복제 개시점은 특정한 온도 범위, 예를들어 45도 미만의 온도에서만 기능성이다. 공여체 DNA 분자가 온도 감수성 개시점을 함유한다면, 이것은 비-허용 조건 하에서, 즉 원핵 숙주 세포의 생육을 허용하는 45℃ 이상의 온도에서 복제될 수 없을 것이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "마커 서열"이란 주어진 원핵 세포에서 유일하고 공여체 DNA 분자 또는 수용체 분자에, 바람직하게는 재조합 기질의 상류 또는 하류 또는 이미 재조합된 DNA 서열에 위치하는 DNA 서열을 가리킨다. 바람직하게는 재조합 기질의 다른쪽 면에 위치할 수 있는 다른 마커 서열과 조합하여, 재조합 기질 또는 이미 재조합된 DNA 서열과 동일한 DNA 분자 위에서 마커 서열의 존재는, 분자 방법에 의하든 유전자 방법에 의하든, 재조합 기질 또는 이미 재조합된 DNA 서열이 인식되고 선택될 수 있도록 한다.
본 발명에 따르면, 공여체 DNA 분자는 재조합 기질과 연관된 교차를 선택할 수 있도록 하는 첫번째 마커 서열을 포함한다. 첫번째 마커 서열은, 바람직하게는 공여체 DNA 분자 또는 수용체 DNA 분자에 존재하는 추가의 마커 서열과 조합하여, 추가 라운드의 재조합이 반복적인 방식으로 수행될 수 있도록 한다.
본 발명에 따르면, "첫번째 마커 서열"은 단백질-코드화 DNA 서열이고, 이것의 유전자 생성물은 적용되어진 선택적 조건 하에서 원핵 숙주 세포가 성장하고 증식되는데 필수적이다. 첫번째 마커 서열은 영양 마커, 항생물질 내성 마커, 및 양쪽 또는 그 이상의 소단위(subunit)들이 동일한 세포에서 발현될 때에만 작용하는 효소의 소단위를 코드화하는 서열로 구성된 군에서 선택된다.
"영양 마커"는 유기체 또는 세포의 영양요구성을 상쇄할 수 있는 유전자 생성물을 코드화하는 마커 서열이고, 이것은 영양요구성 유기체 또는 세포에 원영양성을 부여할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "영양요구성"은 유기체 또는 세포가 영양요구성 유기체 자체에 의해 합성될 수 없는 필수 영양소를 함유하는 배지에서 생육되어야 함을 의미한다. 영양 마커 유전자의 유전자 생성물은 영양요구성 세포에서 빠진 필수 영양소의 합성을 촉진한다. 따라서, 영양 마커 유전자의 발현 시에, 유기체 또는 세포가 원영양성을 획득하기 때문에, 유기체 또는 세포가 생육되는 배지에 이러한 필수 영양소를 첨가하는 것은 필요하지 않다.
"항생물질 내성 마커"는 발현시에 유전자 생성물을 세포에 부여하는 마커 유전자이고, 여기에서 항생물질 마커 유전자의 발현이 일어나며 주어진 농도에서 주어진 항생물질의 존재 하에 생육되는 능력이 있는 반면, 항생물질 내성 마커를 갖지 않은 세포는 그럴 수 없다.
세포가 완전한 효소 구조의 조립을 위해 그리고 효소의 완전 활성을 수득하기 위해 요구되는 효소의 모든 소단위를 합성할 수 없다면, 그리고 효소 활성의 존재 또는 부재가 유전자 및/또는 분자 수단에 의해 감시될 수 있다면, "효소의 소단위를 코드화하는 서열"이 마커 서열로서 사용될 수 있다. 예를들어, 특별한 환경에서 세포의 성장 및/또는 증식을 가능하게 하는 세포의 필수적인 생화학 경로를 위하여 효소의 활성이 필요하다면, 세포가 완전한 효소 구조의 모든 성분을 합성할 수 없고, 세포가 그 환경에서 생존할 수 없다. 따라서, 마커 서열로서 사용되는 "효소의 소단위를 코드화하는 서열"은 발현시에 완전 효소의 조립 및 세포의 생존을 가능하게 한다.
바람직하게는, 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물은 항생물질에 감수성인 세포에 그 항생물질에 대한 내성을 부여한다. 특히, 첫번째 마커 서열은 스펙티노마이신에 대한 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 specR, 플레오마이신에 대한 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 phleoR, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 tcR이다.
본 발명의 다른 구현양태에서, 공여체 DNA 분자는 두번째 마커 서열을 함유한다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 수용체 DNA 분자는 세번째 마커 서열 및 임의로 네번째 마커 서열을 함유한다. 이것은, 본 발명의 구현양태에서, 공여체 DNA 분자가 적어도 첫번째 및 두번째 마커 서열, 임의로 더 많은 마커 서열을 포함할 수 있고, 예를들어 재조합 기판의 상류 또는 하류에 배열될 수 있음을 의미한다. 다른 구현양태에서, 수용체 DNA 서열은 세번째 및 네번째 마커 서열, 임의로 더 많은 마커 서열을 포함할 수 있고, 이것은 예를들어 재조합 기질의 상류 또는 하류에 배열될 수 있다. 두번째 원핵 세포에서 형성되고 2개의 상이한 재조합 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 분자가 적어도 4개의 상이한 마커 서열들을 모두 함유할 수 있기 때문에, 이러한 추가의 마커는 재조합된 DNA 서열의 선택 엄격성을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, "두번째, 세번째 및 네번째 마커 서열"은 영양 마커, 안료 마커, 항생물질 내성 마커, 항생물질 감수성 마커, 프라이머 인식 부위, 인트론/엑손 경계, 효소의 특정한 소단위를 코드화하는 서열, 프로모터 서열, 하류 조절 유전자 서열 및 제한 효소 부위로 구성된 군에서 선택되는 단백질-코드화 또는 비-코드화 서열이다.
"안료 마커"는 유전자 생성물이 발현시에 그 세포를 착색시키는 안료의 합성에 연관되어지는 마커 유전자이고, 여기에서 안료 마커가 발현된다. 안료 마커를 갖지 않은 세포는 안료를 합성하지 않고 따라서 착색되지 않는다. 따라서, 안료 마커는 안료 마커를 함유하는 세포의 표현형 검출을 빠르게 한다.
"항생물질 감수성 마커"는, 유전자 생성물이 발현 시에 주어진 농도에서 주어진 항생물질의 존재 하에 세포가 생육되는 능력을 파괴하는 마커 유전자이다.
"프라이머 인식 부위"는 부위-특이적 PCR 프라이머를 위한 어닐링 부위이고, 이것은 PCR에 의한 각각의 마커 서열을 빠르게 확인할 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자의 두번째 마커 서열 및 수용체 DNA 분자의 세번째 및 네번째 마커 서열은 단백질-코드화 서열이고, 그의 유전자 생성물은 항생물질에 감수성인 세포에 그 항생물질에 대한 내성을 부여한다. 바람직하게는, 세번째 마커 서열의 유전자 생성물은 테트라사이클린 내성을 세포에 부여하고, 네번째 마커 서열의 유전자 생성물은 클로람페니콜 내성을 세포에 부여한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "재조합되어지는 DNA 서열" 및 "재조합 기질"은, 상동성 또는 비-상동성 재조합 과정의 결과로서 재조합될 수 있는 2개의 DNA 서열을 의미한다.
몇가지 유형의 상동성 재조합 사건은 상동성 파트너와 손상된 DNA 사슬과의 염기 쌍합을 특징으로 하며, 여기에서 상호작용 정도는 수 백 개의 거의 완벽히 일치된 염기 쌍을 포함할 수 있다. 이와 반대로, 비정규 또는 비-상동성 재조합은 단지 몇 개의 상보성 염기 쌍을 공유하거나 공유하지 않는 DNA의 말단이 연결됨을 특징으로 한다. 원핵 세포에서, 비-상동성 수복 및 재조합 사건은 상동성 재조합 사건보다 상당히 낮은 빈도로 일어난다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 2개의 재조합 기질, 즉 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열은 분기 서열이고, 이것은 동일하지 않지만 특정한 정도의 상동성을 나타낸다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "상동성"은 2개의 핵산 분자의 서열 간에 존재하는 동일성 정도를 나타내는 반면, "분기(divergence)"는 2개의 핵산 분자의 서열 간에 비-동일성의 정도를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 재조합되어지는 DNA 서열은 그의 전체 정렬의 측면에서 2개 이상의 위치에서 서로 상이하다. 본 발명의 구현양태에서, 전체 길이에 비해, 2개의 재조합 기질 간의 전체 분기는 0.1％ 이상, 특히 5％ 이상, 바람직하게는 25％ 이상이다. 이것은, 재조합되어지는 DNA 서열은 30％ 이상, 40％ 이상, 심지어 50％ 이상 만큼 상이할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 특히 바람직한 구현양태에서, 재조합되어지는 2개의 DNA 서열은 적어도 하나 이상의 상동성 또는 동일한 영역을 공유하지만, 이것은 매우 짧을 수 있다. 본 발명에 따르면, 상동성 또는 동일한 영역은 25개 미만의 뉴클레오티드, 특히 20개 또는 15개 미만의 뉴클레오티드, 심지어 10개 미만의 뉴클레오티드, 예를들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
재조합되어지는 재조합 기질 또는 DNA 서열은 천연 또는 합성 기원을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현양태에서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열은 천연 발생 서열이다. 천연 발생 서열은 바이러스, 살아있거나 죽은 원핵생물 유기체, 예컨대 세균, 살아있거나 죽은 진핵생물 유기체, 예컨대 진균, 동물, 식물 및 인간, 또는 그의 일부를 포함한 천연 공급원으로부터 적절한 단리 방법에 의해 단리될 수 있거나, 또는 화학적 수단에 의해 합성될 수 있다. 천연 발생 서열은 천연 공급원으로부터 단리 후에 돌연변이유발되어지는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열은 천연 공급원에서 발견되지 않는 인공적인 서열이다. 인공 서열은 공지된 화학 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 재조합되어지는 DNA 서열은 단백질-코드화 서열, 예를들어 천연 및 비-천연 화합물의 공업적 제조를 위해 사용될 수 있는 효소를 코드화하는 서열이다. 효소 또는 효소의 도움으로 제조된 화합물은 약물, 화장품, 식품 등의 제조를 위해 사용될 수 있다. 단백질-코드화 서열은 인간 및 동물 건강 분야에서 치료적 용도를 가진 단백질을 코드화하는 서열일 수 있다. 의학적으로 중요한 단백질의 중요한 부류는 사이토카인 및 성장 인자를 포함한다. 단백질 코드화 서열의 재조합은 변경된, 바람직하게는 개선된 기능 및/또는 새로 획득된 기능을 가진 단백질을 코드화하는 새로 돌연변이된 서열을 발생시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 예를들어 단백질의 열안정성의 개선을 달성하고, 단백질의 기질 특이성을 변화시키고, 그의 활성을 개선시키고, 새로운 촉매 부위를 발전시키고 및/또는 2개의 상이한 효소로부터 도메인을 융합하는 것이 가능하다. 재조합되어지는 단백질-코드화 DNA 서열은 자연적 환경에서 유사하거나 동일한 기능을 가진 동일하거나 유사한 단백질을 코드화하는 상이한 종으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 재조합되어지는 단백질-코드화 DNA 서열은 동일한 단백질 또는 효소 계로부터 서열을 포함할 수 있다. 재조합되어지는 단백질 코드화 서열은 상이한 기능을 가진 단백질을 코드화하는 서열 - 예를들어, 주어진 대사 경로의 상이한 단계를 촉매화하는 효소를 코드화하는 서열일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현양태에서, 베타-락타마제의 옥사(Oxa) 상과의 유전자 서열 군으로부터 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열이 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현양태에서, 재조합되어지는 DNA 서열은 예를들어 자연적 세포 환경에서 단백질-코드화 서열의 발현 조절에 관련된 서열과 같은 비-코드화 서열이다. 비-코드화 서열의 예는 이에 한정되지 않지만 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위를 함유하는 서열, 인트론 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함한다. 이러한 비-코드화 서열을 재조합함으로써, 돌연변이된 서열을 진화시키는 것이 가능하고, 이것은 세포 환경에서 세포 과정의 조절을 변경- 예를들어 유전자 발현을 변경시킨다.
본 발명에 따르면, 재조합 기질 또는 재조합되어지는 DNA 서열은 물론 하나 이상의 단백질 코드화 서열 및/또는 하나 이상의 비-코드화 서열을 포함할 수 있다. 예를들어, 재조합 기질은 하나의 단백질 코드화 서열 + 하나의 비-코드화 서열 또는 상이한 단백질-코드화 서열과 상이한 비-코드화 서열의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 재조합되어지는 DNA 서열은 개입 및/또는 인접 비-코드화 서열과 함께 코드화 서열의 하나 이상의 연속범위로 구성될 수 있다. 이것은, 재조합되어지는 DNA 서열이 예를들어 5'-말단 및/또는 비번역 3'-영역 또는 엑손/인트론 구조를 가진 포유동물 유전자 서열에서 조절 서열을 가진 유전자 서열일 수 있음을 의미한다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 재조합되어지는 DNA 서열은 임의로 오페론과 같은 개입 비-코드화 서열과 함께 하나 이상의 코드화 서열을 함유하는 더욱 큰 연속 DNA 연속범위로 구성될 수 있다. 재조합되어지는 DNA 서열은 하나 이상의 재조합 사건, 예를들어 상동성 및/또는 비-상동성 재조합 사건을 이미 경험한 서열일 수 있다.
재조합 기질은 비-돌연변이 야생형 DNA 서열 및/또는 돌연변이된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 따라서 바람직한 구현양태에서, 새로운 돌연변이된 서열을 진화시키기 위하여 이미 존재하는 돌연변이 서열과 야생형 서열을 재조합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 원핵 세포는 수용체 및 공여체 DNA 분자를 도입하기 위한 숙주 세포로서 사용된다. 용어 "원핵 세포" 및 "원핵 숙주 세포"는 게놈이 원형 구조로서 세포질 내에 자유롭게 존재하는 세포, 즉 핵 막에 의해 게놈이 둘러싸이지 않은 세포를 포함한다. 원핵 세포는 반드시 산소 의존성일 필요는 없고 그의 리보솜이 진핵 세포의 리보솜보다 더 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 원핵 세포는 고세균(archaebacterium) 및 진정세균(eubacterium)을 포함한다. 세포벽의 조성에 의존하여 진정세균은 그람-양성 세균, 그람-음성 세균 및 남세균(cyanobacterium)으로 나뉠 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 원핵 세포는 고세균 또는 진정세균의 세포이고, 이에 의해 본 발명의 바람직한 구현양태에서 원핵 세포는 그람-음성 세균, 그람-양성 세균 또는 남세균이다. 바람직하게는, 그람-음성 세균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 예를들어 이.콜리 세균 AB1157 또는 그의 MutS- 변이체, 이.콜리 균주 MXP1이다.
본 발명에 따르면, 기능 수복 체계를 가진 본 발명의 방법을 위해 원핵 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 불일치 수복(MMR) 체계는 복제에서 DNA 폴리머라제 오류에 기인한 돌연변이를 피하게 하는 가장 큰 기여인자의 하나이다. 그러나, 불일치 수복은 유전자 재조합의 충실도를 보장함으로써 유전자 안정성을 촉진한다. 세균에서 그리고 효모 및 포유동물 세포에서, 약간의 불일치(<1％)를 함유하는 상동성 DNA 기질 간의 재조합은 동일한 서열 간에서보다 훨씬 더 낮은 효율로 일어나는 반면, 재조합 빈도(유전자 전환 및/또는 교차)는 MMR-결손 라인에서 상당히 상승된다. 이것은, 재조합의 높은 충실도가 재조합 효소의 고유한 성질에 의해 유발될 뿐만 아니라 불일치 수복 체계에 의한 재조합의 교정에 의해 유발될 수 있음을 의미한다. 즉, 불일치 수복 기구는 분기된 서열 간의 재조합에 대해 억제 효과를 갖는다. 이.콜리에서, 이러한 강한 재조합방지 활성을 위하여 메틸-특이적 MMR 체계, 즉 MutS 및 MutL의 2개 단백질이 요구되는 반면, 다른 MMR 체계 단백질, MutH 및 UvrD의 효과는 적게 나타난다. MMR 및 상동성 재조합에서의 역할에 추가로, MMR 단백질은 유전자 전환 동안에 비-상동성 DNA를 제거함에 있어서 중요한 역할을 한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현양태에서, 불일치 수복 체계에서 결함이 있는 원핵 세포가 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "불일치 수복 체계에서 결함이 있는"이란, 원핵 세포의 MMR 체계가 일시적으로 또는 영구적으로 손상됨을 의미한다. 세포 또는 유기체의 MMR 결함은, 이에 한정되지 않지만 MMR에 연관된 하나 이상의 유전자의 돌연변이, MMR의 전체적인 손상을 가져오는 UV 광과 같은 작인으로의 처리, MMR 체계를 일시적으로 포화 및 불활성화하기 위해 과량의 불일치를 함유하는 2-아미노퓨린 또는 헤테로2본쇄와 같은 작인으로의 처리, 및 MMR에 연관된 하나 이상의 유전자의 유도성 발현 또는 억제를 포함하는 MMR 체계를, 예를들어 일시적 불활성화를 가능하게 하는 조절가능한 프로모터를 통하여, 일시적으로 또는 영구적으로 손상시키는 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 원핵 숙주 세포의 불일치 수복 결함은 MMR에 연관된 적어도 하나의 유전자의 돌연변이에 기인한다. 바람직한 구현양태에서, 원핵 세포는 돌연변이된 mutS 유전자, 돌연변이된 mutL 유전자, 돌연변이된 mutH 유전자 및/또는 돌연변이된 UvrD 유전자를 갖는다.
다른 구현양태에서, 주 재조합 단백질의 하나 이상에서 원핵 숙주 세포가 손상되거나 훼방된다. 예를들어 AddAB 유전자에서 손상된 세포는 높은 빈도의 상동성 및 비-상동성 재조합을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 다른 구현양태에서, 원핵 숙주 세포는 recA와 같은 주요 재조합 단백질의 하나를 과다발현시킨다. 이 단백질은 재조합 사건을 위해 요구되는 헤테로2본쇄 분자를 형성하기 위해 단일-가닥 DNA의 복원을 촉진함으로써 상동성 재조합에 연관되고, DNA 가닥의 교환을 개시한다.
본 발명에 따르면, 수용체 DNA 분자 및 공여체 수용체 분자를 원핵 숙주 세포 내에 동시에 또는 순차적으로 도입함으로써 첫번째 원핵 세포가 발생된다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현양태에서, 첫번째 단계에서 수용체 DNA 분자를 특정한 원핵 숙주 세포에 도입함으로써 첫번째 원핵 세포가 발생될 수 있다. 수용체 분자를 가진 원핵 숙주 세포의 회수 후에, 공여체 DNA 분자를 두번째 단계에서 수용체 DNA 분자를 가진 세포 내에 도입한다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 수용체 및 공여체 DNA 분자 양쪽 모두가 원핵 숙주 세포 내에 동시에 도입될 수 있다.
본 발명에 따르면, 수용체 및 공여체 DNA 분자 양쪽 모두를 원핵 숙주 세포에 도입하는 것은, 이에 한정되지 않지만 형질전환, 접합, 형질도입(transduction), 반성도입(sexduction), 감염 및/또는 일렉트로포레이션(electroporation)을 포함한 공지된 적절한 방법에 의해 실행될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "형질전환"은 세포, 예를들어 미생물 세포에 의하여 환경으로부터 단리되고 바람직하게는 정제된 핵산 분자가 흡수되는 것을 의미한다. 바실러스 또는 디플로코쿠스와 같은 일부 원핵생물 종의 세포는 자연적으로 수용력이 있는 반면, 이.콜리와 같은 다른 원핵생물 종의 세포는 이들을 수용능으로 만들기 위해, 다시말해서 세포 막을 가로질러 핵산의 전달을 유도하기 위해 특별한 처리를 받아야 한다. 몇가지 세균이 형질전환을 통해 DNA를 교환하는 능력에 대해 알려져 있다.
"접합"은 세포-대-세포 접촉을 통해 하나의 세균 세포로부터 다른 세균 세포 내로 세균 플라스미드를 플라스미드-매개 전달하는 것을 의미한다. 연관된 전달 기구는 보통 플라스미드 또는 접합 트랜스포손에 의해 코드화된다. 이러한 플라스미드의 예는 접합 플라스미드 또는 헬퍼 플라스미드이다. 접합 플라스미드는 세포-대-세포 접촉을 촉진하는 유전자(기동 유전자)를 보유한 자기-전달가능한 플라스미드이다. 이들은 접합 다리를 발생시키기 위한 유전자를 함유한다. 일단 다리가 만들어지면, 다른 플라스미드 및 염색체 DNA (접합 트랜스포손)가 전달될 수 있다. 기동성 플라스미드는 기동 유전자를 함유하지만, 세포들 사이에서 이동하기 위해 접합 플라스미드의 "도움"을 필요로 한다. 접합은 원핵 세포의 상이한 계통발생적 군 간에 그리고 원핵생물과 진핵생물 간에 유전자 교환을 위한 주요 경로의 하나이다.
"반성도입"은 F-인자 또는 F-플라스미드를 가진 원핵 세포로부터 F-인자를 함유하지 않는 세포(F--세포)로 유전 물질이 전달되는 과정이다. F-인자는 보통 세균 세포의 세포질에 존재하지만, 때때로 세균 염색체의 여러 부위에 혼입될 수 있고 이것은 Hfr-세포의 형성을 이끈다. F-인자의 통합은 가역적이고, 이에 의해 플라스미드의 올바르지 못한 분해 시에 세균 염색체에서 F-인자의 원래의 통합 부위에 인접한 유전 물질을 함유할 수 있는 이른바 치환된 F-인자(F')가 발생한다. F'-플라스미드는 높은 빈도로 F--세포로 전달될 수 있다.
"형질도입"은 박테리오파지에 의해 하나의 세균 세포로부터 다른 세균 세포로 핵산 분자의 전달을 의미하고, 이것은 하나의 세포로부터 박테리오파지의 방출 및 다른 세포의 후속 감염을 포함한다. 2가지 유형의 형질도입이 존재한다. 용원성 박테리오파지의 용원 생활 주기 동안에 분화된 형질도입이 일어날 수 있고, 이에 의해 세균의 유전 물질이 박테리오파지 게놈의 일부를 치환할 수 있다. 이러한 조각의 세균 DNA가 파지 게놈의 일부로서 복제되고, 파지에 의하여 다른 수용체 세포 내로 전달될 수 있다. 일반화된 형질도입의 경우에, 용균 파지의 전체 게놈이 세균 DNA에 의해 치환될 수 있다. 이러한 파지가 다른 세균을 감염시킬 때, 이것은 DNA를 수용체 내로 주입하고 이때 수용체 세포의 DNA의 조각을 교환할 수 있다.
"일렉트로포레이션"은 세포가 핵산 분자와 혼합된 다음 고 전압의 펄스에 잠깐 노출되는 과정이다. 숙주 세포의 세포 막은 투과성이 되며 이에 의해 외래 핵산이 숙주 세포에 들어갈 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현양태에서, 자외선 조사가 재조합 빈도를 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문에 원핵 숙주 세포 내로의 도입에 앞서서 공여체 DNA 분자를 UV-조사한다.
본 발명에 따르면, 수용체와 공여체 DNA 분자 간에 공동-통합체 또는 하이브리드 분자의 형성 및 2개의 재조합 기질 간의 재조합, 바람직하게는 비-상동성 재조합을 강제로 일으키는 조건, 즉 재조합 DNA 서열을 선택할 수 있도록 하는 조건 하에서 수용체 및 공여체 DNA 분자를 함유하는 첫번째 원핵 세포를 배양한다.
공여체 DNA 분자의 첫번째 마커 서열이 항생물질 내성 마커로 사용된다면, 원핵 숙주 세포가 감수성이고 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물이 내성을 부여하는 항생물질의 존재 하에서 수용체 및 공여체 DNA 분자를 함유하는 첫번째 원핵 세포가 배양된다. 특히 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자에 존재하는 첫번째 마커 서열이 스펙티노마이신 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 specR이라면,첫번째 원핵생물을 스펙티노마이신의 존재 하에 배양한다. 다른 특히 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자에 존재하는 첫번째 마커 서열이 플레오마이신 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 phleoR이라면, 첫번째 원핵생물을 플레오마이신의 존재 하에 배양한다. 다른 특히 바람직한 구현양태에서, 공여체 DNA 분자에 존재하는 첫번째 마커 서열이 테트라사이클린 내성을 세포에 부여하는 유전자 생성물인 tcR이라면 첫번째 원핵생물을 테트라사이클린의 존재 하에 배양한다.
공여체 DNA 분자의 첫번째 마커 서열이 영양 마커라면, 숙주 세포 자체에 의해 합성될 수 없으며 공여체 분자의 도입 및 공여체 분자에 함유된 첫번째 마커 유전자의 발현 시에 숙주 세포에 공급되는 특정한 필수 영양소가 부족한 배지에서, 수용체 및 공여체 DNA 분자를 함유하는 첫번째 진핵 세포를 배양할 수 있다. 첫번째 영양 마커 유전자의 발현 시에, 원핵 세포가 성장하는 배지에 필수 영양소를 첨가할 필요는 없다.
두번째 마커 서열, 세번째 마커 서열 및/또는 네번째 마커 서열이 첫번째 원핵 세포의 바람직한 구현양태에서 항생물질 내성 마커이라면, 이 바람직한 구현양태에서 두번째 마커 서열, 세번째 마커 및 네번째 마커 서열의 유전자 생성물이 각각 내성을 부여하는 두번째, 세번째 및/또는 네번째 항생물질의 존재 하에서 첫번째 원핵 세포를 배양할 수 있다. 바람직하게는, 첫번째 원핵 세포를 플레오마이신 또는 스펙티노마이신 또는 테트라사이클린의 존재 하에 배양할 뿐만 아니라 클로람페니콜의 존재 하에 배양한다. 가방 바람직하게는, 첫번째 원핵 세포를 플레오마이신, 스펙티노마이신, 클로람페니콜 및 테트라사이클린의 존재 하에 배양하고 증식한다.
선택적 조건 하에 원핵 세포를 배양한 후에, 수용체 및 공여체 DNA 분자에 의해 형성된 공동-통합체 또는 하이브리드 분자를 함유하는 두번째 원핵 세포를 단리한다. 이러한 공동-통합체는 재조합 DNA 서열을 함유한다. 공동-통합체 및/또는 재조합 DNA 서열의 존재는 제한 프로파일 분석, PCR 증폭 및/또는 서열결정과 같은 여러 수단에 의해 입증 및 검출될 수 있다. 예를들어, 공여체 분자의 두번째 마커 서열 및 수용체 분자의 세번째 또는 네번째 마커 서열이 특유의 프라이머 인식 서열을 갖는다면, 각각의 마커 조합의 존재를 검출하기 위하여 이러한 마커 서열을 인식하는 적절한 프라이머를 사용함으로써 공동-통합체의 특정한 단편을 PCR-증폭시킬 수 있다. 공동-통합체가 형성되지 않는다면, 즉 재조합이 일어나지 않는다면, 이러한 단편은 검출될 수 없다. 예를들어 공여체 분자의 두번째 마커 서열 및 수용체 분자의 세번째 또는 네번째 마커 서열이 특유의 제한효소 절단 부위를 갖는다면, 특이적 DNA 단편을 검출하기 위해 공동-통합체를 제한 효소 분석으로 처리할 수 있다. 공동-통합체가 형성되지 않는다면, 즉 재조합이 일어나지 않는다면, 이러한 단편이 검출될 수 없다.
본 발명에 따르면, 두번째 원핵 세포의 하이브리드 DNA 분자에 함유된 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열이 단리 및/또는 분석 및/또는 선택될 수 있다. 수득된 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열을 예를들어 PCR 증폭 또는 적절한 제한효소로의 절단에 의해 단리할 수 있다. 하이브리드 DNA 분자에 함유된 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열의 분석은 예를들어 서열결정 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 일단 단리된 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열이 각각 공여체 DNA 분자 및 수용체 DNA 분자의 안에 다시 삽입될 수 있으며, 본 발명의 방법을 사용함으로써 다른 라운드의 재조합을 겪게된다.
본 발명의 추가의 측면은 새롭거나 개선된 기능 및 성질을 가진 신규 단백질, 효소 및 비-코드화 서열의 발생 방법에 관한 것이며, 이에 의하면 원핵 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열을 발생시키고 검출하기 위한 본 발명의 방법을 사용함으로써 공지된 단백질 코드화 서열 또는 공지된 비-코드화 서열을 1 라운드 이상의 재조합을 겪게한다. 본 발명은 본 발명의 방법의 하나에 의해 발생된 단백질, 효소 및 비-코드화 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91에 관한 것이고, 이것은 프라스미드 pIL253의 유도체이고 이.콜리에서가 아니라 비.섭틸리스에서 복제될 수 있으며, specR 마커 및 PhleoR 마커를 포함하고 외래 DNA 서열을 삽입하기 위해 제한 부위 ScaI, PpuMI 및 EcoO109I을 포함한다.
본 발명은 비.섭틸리스 플라스미드 p-MIX101에 관한 것이고, 이것은 플라스미드 pIL253의 유도체이고, 이.콜리가 아닌 비.섭틸리스에서 복제할 수 있고 외래 DNA 서열을 삽입하기 위해 tcR 마커 서열 및 제한 부위 XhoI 및 PsrII을 포함한다.
본 발명은 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91를 함유하는 비.섭틸리스 균주 DSM4393 (2005년 2월 21일에 독일 브라운쉬베이그 DSMZ, Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁됨, SB202pMIX91) 및 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101을 함유하는 비.섭틸리스 균주 1A423 (2005년 2월 21일에 독일 브라운스쉬베이그 DSMZ, Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁됨, 1A423pMIX101)에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 방법에서 공여체 DNA 분자로서 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91 및 pMIX101의 용도, 즉 원핵 숙주 세포에서, 바람직하게는 이.콜리 세포에서 재조합 DNA 서열을 발생시키고 및/또는 검출하기 위한 플라스미드 pMIX91 또는pMIX101의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 방법에서 수용체 DNA 분자로서 이.콜리 플라스미드 pACYC184 또는 pMIX100 또는 이들의 유도체의 용도, 즉 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 이.콜리 세포에서 재조합 DNA 서열을 발생시키고 및/또는 검출하기 위한 플라스미드 pACYC184 또는 pMIX100의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 원핵 숙주 세포에서 재조합된 DNA 서열을 발생시키고 검출하기 위한 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다. 첫번째 구현양태에서, 키트는 원핵 숙주 세포로서 이.콜리 균주 AB1157의 세포를 포함하는 첫번째 용기, 수용체 DNA 분자로서 사용될 수 있는, 이.콜리 플라스미드 pACYC184 또는 이.콜리 플라스미드 pMIX100을 함유한 이.콜리 균주 AB1157의 세포를 포함하는 두번째 용기, 및 공여체 DNA 분자로서 사용될 수 있는, 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91을 함유한 비.섭틸리스 균주 DSM4393의 세포 또는 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101을 함유한 비.섭틸리스 균주 1A423의 세포를 포함하는 세번째 용기를 적어도 포함한다. 본 발명의 두번째 구현양태에서, 키트는 균주 AB1157의 MutS- 변이체인 이.콜리 균주 MXP1의 세포를 원핵 숙주 세포로서 포함하는 첫번째 용기, 플라스미드 pACYC184 또는 pMIX100을 함유한 이.콜리 균주 AB1157의 세포를 포함하는 두번째 용기, 및 플라스미드 pMIX91을 함유한 비.섭틸리스 균주 DSM4393의 세포 또는 플라스미드 pMIX101을 함유한 비.섭틸리스 균주 1A423의 세포를 포함하는 세번째 용기를 적어도 포함한다. 또 다른 구현양태에서, 키트는 이.콜리 균주 AB1157 또는 이.콜리 균주 MXP1의 세포를 포함하는 첫번째 용기, 이.콜리 플라스미드 pACYC184 또는 pMIX100의 DNA를 포함하는 두번째 용기, 및 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91 또는 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101의 DNA를 포함하는 세번째 용기를 적어도 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 원핵 세포에서 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 하이브리드 유전자 및/또는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 하이브리드 유전자 및/또는 코드화된 단백질의 제조 방법은, 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하기 위한 방법을 수행하여, 하이브리드 유전자 및/또는 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 단백질을 원핵 세포에서 생산하는 단계를 포함한다. 발현 후에, 하이브리드 유전자 및/또는 코드화된 단백질을 원핵 세포에서 선택하고/하거나 그로부터 단리한다.
본 발명은 하이브리드 유전자를 생산하기 위한 본 발명의 방법 또는 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 하이브리드 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하이브리드 유전자를 생성하기 위한 본 발명의 방법 또는 재조합 DNA 서열을 발생하고 검출하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득가능하고/하거나 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 단백질을 제조하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한, 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 하기 서열 목록, 도면 및 실시예에 의해 예증된다.
도 1은 2개의 DNA 서열 간에 재조합을 발생 및/또는 검출하기 위한 본 발명의 방법을 도식적으로 나타낸다. 첫번째 서열 oxa7 유전자는 공여체 DNA 분자로서 비.섭틸리스 플라스미드 pTG2-phleo 위에 존재한다. pTG2-phleo는 스펙티노마이신 및 플레오마이신에 대한 내성을 부여하는 specR 및 phleoR 마커를 보유한다. 일렉트로포레이션에 의하여 pTG2-phleo를 수용체 DNA 분자로서 플라스미드 pTG3을 함유하는 이.콜리 숙주 세포 내에 도입한다. pTG3은 두번째 DNA 서열, oxa11 유전자 및 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 cmR 마커를 함유한다. pTG2-phleo의 도입 후에, 세포를 스펙티노마이신 및 플레오마이신의 존재 하에 배양하고, 이것은 2개의 플라스미드 간에 공동-통합체의 형성 및 동시에 유전자 간에 재조합을 강제로 일으킨다. 따라서, 배양시에, 새로 재조합된 DNA 서열 R1 및 R2를 함유하는 이량체 플라스미드를 함유하는 이.콜리 세포를 수득한다. 제한효소 프로파일 분석, R1 및 R2 재조합 유전자의 PCR 증폭 및/또는 R1 및 R2의 서열결정에 의하여 재조합된 DNA 서열을 분석할 수 있다.
도 2는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 적절한 플라스미드를 구축하기 위해 사용되는 플라스미드 pUC19-phleo, pic156, pACYC184 및 pIL253의 물리적 지도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 구축된 플라스미드의 물리적 지도를 나타낸다. 플라스미드 pMIX96 및 pMIX97는 각각 oxa11 대신에 oxa5 및 oxa1을 갖는 것 이외에는 pMIX95와 동일하기 때문에 이들은 도시하지 않는다. pMIX99는 oxa11 대신에 oxa1을 갖는 것 이외에는 pMIX98과 동일하다.
도 4는 22％-분기 oxa 유전자 간에 본 발명의 생체내 재조합 공정에 의하여 수득된 유전자의 구조를 나타낸다. 교차가 일어나는 서열 동일성의 연속범위를 상 세히 나타낸다.
도 5는 이.콜리 숙주 세포에서 수용체 DNA 분자로서 사용될 수 있는 이.콜리 플라스미드 pMIX100의 구조를 나타낸다. PMIX100은 플라스미드 pACYC184로부터의 복제 개시점 뿐만 아니라 그로부터의 클로람페니콜-내성 유전자를 보유한다. PMIX100은 pBluescript SK+로부터 유전자 lacZ를 보유한다.
도 6은 비.섭틸리스 플라스미드 pIL253의 유도체이고 이.콜리 숙주 세포에서 공여체 DNA 분자로서 사용될 수 있는 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101의 구조를 나타낸다. pMIX101은 에리트로마이신 내성을 부여하는 마커 ErmR 및 테트라사이클린 내성을 부여하는 TcR를 보유한다. 플라스미드 pACYC184로부터 테트라사이클린 내성 유전자가 증폭되었다.
도 7은 형질전환 효율 조절 플라스미드 pMIX102의 구조를 나타낸다. pBluescript SK+의 유도체인 pMIX102는 플라스미드 pACYC184로부터 증폭된 TcR 유전자를 함유한다. pMIX102에서 plac 프로포머테 의해 TcR 유전자가 구동된다.
도 8은 형질전환 효율 조절 플라스미드 pMIX103의 구조를 나타낸다. pBluescript SK+의 유도체인 pMIX103은 플라스미드 pACYC184로부터 증폭된 TcR 유전자를 함유한다. pMIX103에서, plac와는 반대쪽 방향에서 TcR 유전자가 클론화된다. 따라서, 유전자가 그 자체의 프로모터로부터 발현된다.
도 9는 oxa7, oxa11 및 oxa5 유전자를 이.콜리 플라스미드 pMIX100 및 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101 내로 클론화하기 위한 전략을 도식적으로 나타낸다. pMIX100 내로 oxa7, oxa11을 클론화하기 위하여, 그의 5'말단에 PstI 또는 XhoI을 함유하는 프라이머를 사용하여 유전자를 증폭하였다. 효소로의 소화 후에, 증폭된 DNA 단편을 PstI + XhoI으로 미리 절단된 pMIX100과 독립적으로 결찰시켰다. 이.콜리 DHB10의 수용능 세포를 결찰 혼합물과 일렉트로포레이트하고, 포지티브 클론을 가진 콜로니를 Cm(30㎍/ml) + X-Gal(80㎍/ml) + IPTG (0.5mM)를 함유하는 LB 플레이트 상에서 클로람페니콜-내성/백색에 의하여 표현형으로 선택하였다. 플라스미드 DNA를 수득하고, 제한효소 지도에 의해 분석하였다. 결과는 pMIX104가 oxa7을 보유하고, pMIX106은 oxa11을 보유하고 pMIX107은 oxa5를 보유함을 입증하였다. 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101 내로의 클론화를 위하여, PstI 및 XhoI으로의 제한에 의하여 pMIX104로부터 0.9kb 단편으로서 oxa7을 수득하고, 동일한 효소로 앞서 절단된 pMIX101과 결찰시켰다. 결찰 생성물에 의한 비.섭틸리스 1A423 수용능 세포의 형질전환 후에, 세포를 0.5㎍/ml의 에리트로마이신(Erm)을 함유하는 LB에서 선택하였다.
서열 1 및 2는 oxa7의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 ScaI 및 PpuMI 제한 부위의 도입을 위하여 각각 OLG1 및 OLG2의 서열을 나타낸다.
서열 3 및 4는 oxa11의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 BamHI 및 EcoO109I 제한 부위의 도입을 위하여 프라이머 OLG3 및 OLG4의 서열을 나타낸다.
서열 5 및 6은 oxa5의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 BamHI 및 EcoO109I 제한 부위의 도입을 위하여 프라이머 OLG5 및 OLG6의 서열을 나타낸다.
서열 7 및 8은 oxa1의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 BamHI 및 EcoO109I 제한 부위의 도입을 위하여 프라이머 OLG7 및 OLG8의 서열을 나타낸다.
서열 9 및 10은 oxa11의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 ScaI 및 EcoO109I 제한 부위의 도입을 위하여 프라이머 OLG9 및 OLG10의 서열을 나타낸다.
서열 11은 oxa1의 증폭화 및 각각 5' 및 3' 말단에서 ScaI 및 EcoO109I 제한 부위의 도입을 위하여 프라이머 OLG8과 함께 사용되는 프라이머 OLG11의 서열을 나타낸다.
서열 12 및 13은 하이브리드 플라스미드 pMIX93에 함유된 재조합 유전자 R1의 증폭화를 위하여 각각 프라이머 OLG12 및 OLG13의 서열을 나타낸다.
서열 14는 하이브리드 플라스미드 pMIX95, pMIX96 및 pMIX97의 하나에 함유된 재조합 유전자 R1의 증폭화를 위하여 프라이머 OLG12 (서열 12)와 함께 사용된 프라이머 OLG14의 서열을 나타낸다.
서열 15는 하이브리드 플라스미드 pMIX93에 함유된 재조합 유전자 R2의 증폭화를 위하여 프라이머 OLG17 (서열 17)와 함께 사용된 프라이머 OLG15의 서열을 나타낸다.
서열 16은 하이브리드 플라스미드 pMIX95, pMIX96 및 pMIX97의 하나에 함유된 재조합 유전자 R2의 증폭화를 위하여 프라이머 OLG17 (서열 17)와 함께 사용된 프라이머 OLG16의 서열을 나타낸다.
서열 17은 프라이머 OLG17의 서열을 나타낸다.
실시예
1
스펙티노마이신
및/또는
플레오마이신
내성에 의해 재조합
DNA
서열을 선택하는, 이중 플라스미드 체계(이.
콜리
/비.
섭틸리스
)를 사용한 이종 유전자의
생체내
재조합
1. 재료 및 방법
1.1 세균 균주 및 플라스미드
이 실시예에서 사용된 세균 균주 및 플라스미드를 각각 표 1 및 표 2에 나타낸다.
| 세균 균주 | ||
| 균주 | 유전자형 | 참조 또는 공급원 |
| 이.콜리 AB1157 NalR hsd- | thr1 leu6 proA2 his4 thil argE3 lacY1 galK2 ara14 xyl15 mtl1 tsx33 str31 supE44thr+ hsdR-B nalR | M.Radman 균주 콜렉션 |
| 이.콜리 MIXP1 | mutS::Tn5(kanR) 이외에 AB1157 NalR R- 동일 | M.Radman 균주 콜렉션으로부터의 mutS 대립유전자 |
| 이.콜리 DH5α | SupE44 ΔlacU169 (φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 | (8) |
| 비.섭틸리스 DSM4393 | aroB2 trpC2 his6 | 독일 균주 콜렉션 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorgansimen und Zellkulturen GmbH) |
| 플라스미드 | ||
| 플라스미드 | 선택 | 참조 또는 공급원 |
| pACYC184 | TetR CamR | 뉴 잉글랜드 바이오랩스(1) |
| pIL253 | ErmR | (6) |
| pic156 | AmpR SpecR | (7) |
| pUC19-Phleo | AmpR PhleoR | (2) |
1.2 성장 조건 및 배양 배지
이.콜리 및 비.섭틸리스 균주 양쪽 모두를 37℃에서 LB 배지(디프코 래보러토리즈, 미국 디트로이트)에 배양하였다. 배지를 플레이트(LBA)에서 사용할 때, 리터 당 15g의 한천(Difco)을 사용하였다. 필요할 때 배지를 항생물질로 보충하였으며 최종 농도는 다음과 같았다: 테트라사이클린(시그마-알드리치 쉬미, 프랑스 세인트 쾡틴 팔라비에), 12.5㎍/ml; 클로람페니콜 (시그마-알드리치 쉬미) 30㎍/ml; 암피실린(시그마-알드리치 쉬미), 100㎍/ml; 에리트로마이신 (시그마-알드리치 쉬미) 0.5㎍/ml; 스펙티노마이신(시그마-알드리치 쉬미), 75㎍/ml; 플레오마이신(유로메덱스, 프랑스 스트라스보르그), 2㎍/ml. LBA가 스펙티노마이신 + 플레오마이신으로 보충될 때, 최종 농도는 각각 60 및 1㎍/ml이었다.
1.3
DNA
의 조작 및 미생물
형질도입
P1-매개 형질도입(3)을 사용하여 이.콜리 MIXP1 균주를 구축하였다.
형질전환
공급업자의 지시에 따라서 에펜도르프 엘렉트로포레이터 2510 (독일 함부르그 에펜도르프 AG)를 사용하여 일렉트로형질전환에 의해 이.콜리 균주에서 플라스미드를 도입하였다.
비.섭틸리스의 수용능 세포를 준비하고 문헌[Yasbin 등] (9)에 의해 기재된 바와 같이 형질전환하였다.
DNA
조작
분자 생물학 기술을 위하여 프로토콜을 다음과 같이 수립하였다(4). DNA 조작을 위한 효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 메사츄세츠주 베버리), MBI 퍼멘타스(리투아니아 빌니우스), 프로메가(위스콘신주 매디슨) 또는 스트라타겐(미국 캘리포니아주 라 졸라)로부터 구입하고, 제조업자에 의해 추천된 바와 같이 사용하였다. 필요한 경우, 뉴셀로스핀 추출 키트(NuceloSpin Extract Kit) (Machery-Nagel)을 사용하여 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 DNA를 아가로스 겔로부터 정제하였다.
제조업자의 지시에 따라서 뉴클레오스핀 키트(독일 듀렌 마케리-나겔 GmbH & Co.)를 사용하여 플라스미드 DNA를 이.콜리로부터 단리하였다. 비.섭틸리스로부터 플라스미드 DNA를 단리하기 위하여 동일한 키트를 사용하였으나, 세포를 2 mg ml-1의 리소자임과 함께 37℃에서 30분동안 배양함으로써 첫번째 용균 단계를 수행하였다.
사용된 프라이머는 프로리고 프랑스 SAS(프랑스 파리)에 의해 합성하였다.
게놈 익스프레스(프랑스 메일랭)에 의하여 양쪽 방향에서 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 인포비오겐 패키지에 의해 서열을 분석하였다 (게노폴 데브리, 프랑스 에브리). 서열 비교를 위하여 클루스탈W 프로그램을 사용하였다.
PCR
증폭
마스터사이클러 그라디언트(Mastercycler Gradient) (독일 함부르그 에펜도르프 AG)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 하기 조건: 96℃ 3분동안, 96℃에서 30초동안 35회 주기, 30초의 어닐링 온도, 72℃에서 1분, 및 72℃에서 10분동안 최종 연속범위 단계의 조건 하에서 고-충실도 헤르큘라제 증진 DNA 폴리머라제(스트라트겐)를 사용하여 50㎕ 부피에서 반응을 수행하였다. 사용된 프라이머의 최저 Tm에 5℃를 뺌으로써 어닐링 온도를 결정하였다. 필요할 때, 뉴클레온스핀 추출 키트(마케리-나겔)을 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 0.7％ 아가로스 겔(시그마)에서 전기영동에 의해 증폭 생성물을 분석하였다.
2. 일반적 전략
2개의 모 유전자의 생체내 재조합에 의해 유리한 성질을 나타내는 새로운 분자를 발생시키기 위해 이 실험을 수행하였으며, 이것은 상이한 정도의 서열 동일성을 공유한다. 사용된 전략은 다음과 같다:
재조합되어지는 유전자는 그들의 뉴클레오티드 서열에서 상동성을 나타내지 않는 2개의 상이한 플라스미드에 의해 보유된다. 첫번째 것은 클로람페니콜(Cm) 또는 테트라사이클린(Tc) 내성을 부여하는 이.콜리-복제 플라스미드이다. 이것은 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 수득된 저-복제 수 플라스미드인 표준 클론화 벡터 pACYC184를 기초로 한다.
두번째 것은 pIL253(사이몬 앤드 콜핀, 1988)으로부터 유래된 바실러스 섭틸리스 플라스미드이다. 이것은 이.콜리에서 복제할 수 없고 각각 스펙티노마이신(Spc) 및 플레오마이신(Phleo)을 위한 2개의 항생물질 내성 마커를 보유한다.
이러한 2개의 벡터에 의해 보유된 이종 유전자의 쌍을 재조합하기 위하여, 복제 플라스미드를 가진 이.콜리 균주 내로의 일렉트로포레이션에 의해 비.섭틸리스 플라스미드를 도입한다. 이것을 도 1에 도식적으로 나타낸다. 이러한 균주는 돌연변이유발 및 재조합을 양쪽 모두 조절하는 불일치 수복 체계(MMR)에 대해 능숙하거나(+) 또는 결함이 있다(-).
일렉트로포레이션 후에, 비.섭틸리스 플라스미드가 내성(Spc 및 Phleo)을 부여하는 항생물질에 의해 형질전환체를 선택한다. 비.섭틸리스와 이.콜리 플라스미드 간에 형성된 공동-통합체를 가진 세포 만이 이러한 조건 하에서 성장할 수 있기 때문에, 이러한 선택 압력은 이종 유전자 간의 재조합을 강제로 일으킨다. 비.섭틸리스의 플라스미드가 기능성이 아니기 때문에, 하이브리드 플라스미드는 Spc 및 Phleo에 대한 내성을 부여하고 이.콜리 기원으로부터 복제된다. 또한, 이것은 2개의 재조합 유전자 R1 및 R2를 보유한다.
첫번째 단계는, 재조합 효율을 평가하기 위하여 표적으로서 초기에 선택된 유전자의 이.콜리 및 비.섭틸리스 벡터에서 클론화하는 것이다.
oxa 유전자 간의 재조합 실험을 야생형 및 불일치 수복 결함 균주 양쪽에서 수행하였다. 동일한 유전자 또는 분기 유전자의 쌍 사이에서 실험을 수행하였다.
자외선 조사가 재조합 빈도의 10배 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 플라스미드 DNA를 일렉트로포레이션에 앞서서 UV-조사하였다.
2-아미노퓨린으로의 처리에 의해 임시로 제공된 돌연변이체 균주에서 재조합을 수행하였다. 2-아미노퓨린은 세균의 성장 동안에 DNA 내로 혼입되는 아데닌 유사체이고 MMR 체계를 포화시킨다. 즉, 2-아미노퓨린의 제거 후에 야생형 상태가 회복되기 때문에 일시적인 돌연변이체 표현형이 발생된다. 이러한 불일치 수복 활성의 일시적 조절은, 그들의 게놈에서 돌연변이의 축적을 피하면서, 재조합에서 사용되는 균주에 안정한 배경을 제공한다.
3. 결과
비.
섭틸리스
벡터의 구축
재조합을 위해 표적 유전자를 보유하는 비.섭틸리스 벡터를 구축하기 위하여, 2단계 클론화 전략에 따라서, 항생물질 스펙티노마이신(specR) 및 플레오마이신(phleoR)에 대해 내성을 부여하는 2개의 유전자 마커를 플라스미드 pIL253에서 클론화하였다.
먼저, specR 유전자는 플라스미드 pic156으로부터 1294bps의 길이의 SacI 단편으로서 수득되었다. 단편을 정제하고 SacI-소화 pIL253에 결찰시켰다. 비.섭틸리스 DS4393 수용능 세포를 결찰 혼합물로 형질전환하고, 75㎍ ml-1 스펙티노마이신을 함유하는 LBA 플레이트 상에서 선택하였다. 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석은, 이들이 specR 유전자를 보유한 pILF253-유도체를 가짐을 입증하였다.
두번째 단계에서, pIL253-spec 내로 phleoR 유전자를 클론화하였다. 플라스미드 pUC19-phleo를 EcoRI 및 SalI 제한효소로 소화하고, phleoR에 상응하는 574 bps 길이의 단편을 겔-정제하고, 동일한 2개의 효소로 미리 소화된 pIL253-spec. 로 결찰시켰다. 비.섭틸리스 DSM4393 수용능 세포를 결찰 혼합물로 형질전환하고, 60 ㎍ml-1의 플레오마이신을 함유하는 LBA 플레이트 위에서 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 specR 및 phleoR 유전자를 보유한 예상된 6.69-kb 플라스미드를 갖고 있음을 증명하였다. 플라스미드를 pMIX91로 명명하였다 (도 3 참조).
형질전환 효율 조절 벡터의 구축
재조합 실험에서 스펙티노마이신 및 프레오마이신 선택 하에 이.콜리 균주의 형질전환 효율의 조절로서 사용되는 벡터를 구축하였다. 벡터를 다음과 같이 구축하였다: BamH1 및 EcoRI으로 pic156의 소화 후에 스펙티노마이신 내성 유전자(spec)를 1.25kb의 단편으로서 수득하였다. 이것을 플레오마이신 내성 유전자(phleoR) 옆에 있는 pUC-phleo의 상응하는 부위에 클론화하였다. 결찰 혼합물로 이.콜리 DH10B 성분 세포의 일렉트로포레이션 후에, 60㎍/ml 및 1㎍/ml 의 최종 농도로 양쪽 항생물질을 함유하는 LBA 플레이트 위에서 스펙티노마이신 및 플레오마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 형질전환체로부터 단리된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 4.46kb 길이의 예상된 구축물에 상응한다는 것을 나타내었으며, 이것은 pMIX92로 명명되었다 (도 3 참조).
β-
락타마제를
코드화하는 유전자의 이.
콜리
- 및 비.
섭틸리스
벡터 내로의
클론화
야생형 및 MutS- 돌연변이체 이.콜리 균주 양쪽에서 재조합 효율을 평가하기 위해, β-락타마제를 코드화하는 4개 유전자를 표적으로서 선택하였다. 이러한 유전자 oxa7 (진뱅크 수탁 번호 X75562), oxa11 (진뱅크 수탁 번호 Z22590), oxa5(진뱅크 수탁 번호X58272) 및 oxa1 (진뱅크 수탁 번호 J02967)은 그들의 뉴클레오티드 서열에서 상이한 정도의 분기를 나타낸다. oxa1의 서열 및 oxa5, oxa7 및 oxa11의 서열은 각각 40％ 만큼 분기된다. oxa5 및 oxa7 및 oxa11의 서열은 각각 22％ 만큼 분기된다. oxa7의 서열 및 oxa11의 서열은 5％ 만큼 분기된다.
4개의 oxa 유전자를 이.콜리 플라스미드 pACYC184 내로 클론화하는 반면, oxa7, oxa11 및 oxa1을 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91 내로 클론화하였다. 유전자의 클론화를 다음과 같이 수행하였다: 증폭된 DNA의 5' 및 3' 말단에서 ScaI 및 PpuMi 부위를 도입하기 위해 고안된 프라이머를 가지고 PCR에 의해 oxa7을 증폭시켰다 (서열 1을 가진 프라미머 OLG1 및 서열 2를 가진 프라이머 OLG2). PCR 생성물을 제한 효소로 소화시키고, 얻어진 991bps 길이의 단편을 동일한 효소에 의해 미리 절단된 pMIX91에 결찰시켰다. 비.섭틸리스 DSM4393 수용성 세포를 결찰 혼합물과 형질전환하고, 형질전환체 선택을 75㎍ml-1의 스펙티노마이신을 함유하는 LBA 플레이트에서 수행하였다. 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석은, 이들이 oxa7을 보유하는 예상된 6.89kb 플라스미드 pMIX94를 갖는 것을 증명하였다 (도 3 참조).
oxa7을 이.콜리 벡터 pACYC184 내로 클론화하기 위하여, 상기 기재된 PCR 생성물 뿐만 아니라 pACYC184를 PpuMI 및 ScaI로 소화시켰다. DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용함으로써 소화된 DNA로부터 블런트 말단이 발생되고, 이들 사이의 결찰이 수행되었다. 이.콜리 DH10B 수용능 세포를 결찰 혼합물로 일렉트로포레이트하고, 12.5 ㎍ ml-1의 테트라사이클린을 함유하는 LBA 플레이트 위에서 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체로부터 단리된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 4.33kb 길이의 예상된 구조물과 상응함을 나타내며, 이것을 pMIX93으로 명명하였다 (도 3 참조).
oxa11, oxa5 및 oxa1을 pACYC184 내로 클론화하기 위하여, BamHI 및 EcoO109I 부위를 각각 증폭된 DNA의 5' 및 3' 말단에 도입하기 위해 고안된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 유전자를 증폭시켰다. oxa11, oxa5 및 oxa1을 각각 증폭시키기 위하여 OLG3(서열 3)/OLG4(서열 4), OLG5(서열 5)/OLG6(서열 6) 및 OLG7(서열 7)/OLG8(서열 8) 프라이머 쌍을 사용하였다. PCR 생성물을 BamHI 및 EcoO109I로 소화시키고, 997bps(oxa11) 및 830bps(oxa5) 및 936bps(oxa1)의 단편을 동일한 효소로 미리 절단된 pACYC184에 독립적으로 결찰시켰다. 이.콜리 DH10B 수용능 세포를 결찰 혼합물로 일렉트로포레이트하고, 30㎍ ml-1의 클로람페니콜을 함유하는 LBA 플레이트 상에서 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체로부터 단리된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 예상된 6.89kb 플라스미드 pMIX95(3.72kb), pMIX(3.55kb) 및 pMIX97(3.66kb)에 상응함을 나타내었다 (도 3 참조).
oxa11 및 oxa1을 pMIX91 내로 클론화하기 위하여, 증폭된 DNA의 5' 및 3' 말단에서 ScaI 및 EcoO109I 부위를 도입하기 위해 고안된 프라이머를 사용한 PCR에 의해 유전자를 증폭시켰다. 각각 oxa11 및 oxa1을 증폭하기 위하여 OLG9(서열 9)/OLG10(서열 10) 및 OL11(서열 11)/OLG8 프라이머를 사용하였다. ScaI 및 EcoO109I로 PCR 생성물을 소화시키고, 995bps(oxa11) 및 934bps(oxa1)의 단편을 동일한 효소로 미리 절단된 pMIX91에 독립적으로 결찰시켰다. 비.섭틸리스 DSM4393 수용능 세포를 결찰 혼합물로 형질전환하고, 75㎍ ml-1의 스펙티노마이신을 함유하는 LBA 플레이트 상에서 형질전환체 선택을 수행하였다. 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 예상된 플라스미드 pMIX98(6.89kb) 및 pMIX(6.83kb)에 상응함을 증명하였다. 도 3 참조.
MutS
-
변이체
이.
콜리에
비해
wt
에서
oxa
유전자의
생체내
재조합
첫번째 단계에서, oxa 유전자, pMIX93, pMIX95, pMIX96 또는 MIX97을 보유한 pACYC184-유도체 플라스미드와의 일렉트로포레이션에 의하여, 이.콜리 AB1157 및 그의 MutS- 변이체 이 콜리 MXP1의 수용능 세포를 독립적으로 형질전환시켰다. 테트라사이클린 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 기초로 하여 형질전환체를 선택하였다. 적절한 플라스미드의 존재는 제한 및/또는 PCR 분석에 의해 입증되었다.
두번째 단계에서, 테트라사이클린 또는 클로람페니콜을 함유하는 선택 배지로부터 야생형 및 복제 플라스미드를 가진 MutS- 균주의 수용능 세포를 준비하였다. 그 후에, oxa 유전자, pMIX94, pMIX98 또는 pMIX99를 보유한 비.섭틸리스-플라스미드로의 일렉트로포레이션에 의해 이러한 수용능 세포를 독립적으로 형질전환하였다.
일렉트로포레이션 후에, 각각 60㎍ ml-1 및 1㎍ ml-1의 최종 농도에서 비.섭틸리스가 내성을 부여하는 항생물질: 스펙티노마이신 및 플레오마이신을 함유한 LBA 플레이트 상에서 형질전환체를 선택하였다. 비.섭틸리스 및 이.콜리 플라스미드 간에 형성된 하이브리드 플라스미드를 가진 세포 만이 이러한 조건 하에서 성장할 수 있기 때문에, 이러한 선택 압력은 oxa 유전자 간에 재조합을 강제로 일으킨다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한 후에, 이들이 2개의 재조합 유전자 R1 및 R2를 보유한 하이브리드 플라스미드(약 10.5kb 길이)를 갖는다는 것을 입증하기 위하여, 형질전환체의 플라스미드 DNA를 제한효소로의 소화에 의해 분석하였다. 일부 경우에, 재조합 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 서열결정하였다. 상재성 플라스미드가 pMIX93이라면, R1이 OLG12(서열 12)/OLG13(서열 13)으로 증폭되고 R2가 OLG15(서열 15)/OLG17(서열 17)로 증폭되며; 상재성 플라스미드가 pMIX95, pMIX96 또는 pMIX97이라면, R1이 OLG12/OLG14(서열 14)로 증폭되고 R2가 OLG16(서열 16)/OLG17로 증폭되었다.
재조합 실험에서, 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91을 네가티브 대조로서 사용한 반면, 이.콜리 플라스미드 pMIX92를 스펙티노마이신 및 플레오마이신 선택 하에 형질전환 효율의 대조로서 사용하였다. pMIX92는 그들의 복제 개시점(각각, ColE1 및 p15)이 화합성이기 때문에 pACYC184-유도체 플라스미드를 가진 균주에서 복제될 수 있다. 자외선 조사가 재조합 빈도의 10배 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 일렉트로포레이션(200 J/m2)에 앞서서 플라스미드 DNA를 UV-조사하였다.
비.섭틸리스 플라스미드에서 수득된 형질전환 효율을 대조 벡터 pMIX92에서 수득된 형질전환 효율로 나눔으로써 재조합 빈도를 계산하였다. 형질전환 효율을 앞서 기재된 조건에서 DNA의 ㎍당 수득된 콜로니 형성 단위(cfu)의 수로서 계산하였다.
수득된 결과를 표 3에 요약한다. 야생형 균주에서, 동일하거나 5％ 분기 oxa 유전자를 사용한 실험에서 재조합체가 수득된 반면, MutS- 변이체에서 재조합은 22％ 분기 유전자에서 발생하였다.
| 야생형 및 MutS- 이.콜리 균주에서 oxa 유전자 간에 수득된 생체내 재조합 빈도 | ||
| 유전자 분기(％) | 재조합 빈도 | |
| wt 균주 | MutS- 균주 | |
| 0 | 10-4 | 10-4 |
| 5 | 10-8 | 10-5 |
| 22 | - | 10-7 |
| 40 | - | - |
2-
아미노퓨린
(2-
AP
) 처리된 이.
콜리에
비해
wt
에서
oxa
유전자의
생체내
재조합
첫번째 단계에서, oxa11 유전자, pMIX95를 보유한 pACYC184-유도체 플라스미드로의 일렉트로포레이션에 의해 이.콜리 AB1157의 수용능 세포를 형질전환하였다. 그들의 내성을 기준으로 하여 형질전환체를 선택하였다. 적절한 플라스미드의 존재를 제한 및/또는 PCR 분석에 의해 입증하였다.
두번째 단계에서, 이러한 균주의 수용능 세포를 200 ㎍/ml의 2-AP의 존재 하에 제조하고, oxa7를 보유한 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX94 또는 oxa11을 보유한 pMIX98로 독립적으로 일렉트로포레이트하였다.
비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91을 네가티브 대조로서 사용한 반면, SpcR 및 PhleoR 마커를 보유한 이.콜리 플라스미드 pMIX92를 형질전환 효율의 대조로서 사용하였다. 재조합 빈도를 증가시키기 위해 일렉트로포레이션 전에 플라스미드 DNA를 UV-조사하였다.
결과를 표 4a에 요약한다. 야생형 균주에서, 동일한 oxa 유전자를 사용한 실험에서 재조합체를 수득한 반면, 2-AP 처리 균주에서 5％ 분기 유전자 간에 재조합이 발생하였다.
| 야생형 및 2-AP 처리된 이.콜리 균주 양쪽에서 oxa 유전자 간에 수득된 생체내 재조합 빈도 | ||
| 유전자 분기(％) | 재조합 빈도 | |
| wt 균주 | 2-AP 처리된 균주 | |
| 0 | 10-4 | 10-5 |
| 5 | - | 10-6 |
재조합은 22％ 분기 유전자 간에 발생하였으며, 여기에서 서열 동일성의 가장 긴 연속범위는 각각 22개 뉴클레오티드(oxa5/oxa11) 및 18개 뉴클레오티드(oxa5/oxa7)였다(도 5 및 도 6 참조). 재조합은 MEPS(최소 효율 처리 단편)으로서 공지된 상동성의 최소 길이 미만에서 비효율적이 되는 것으로 보고되었다. MEPS의 길이는 재조합 경로에 의존하여 변하지만, 23 내지 90개 염기쌍의 범위인 것으로 설명되었다(5).
5％ 또는 22％ 분기 유전자와 연관된 실험에서 얻어진 54개 하이브리드 플라스미드에 의해 보유되는 유전자 R1 및 R2의 서열 분석은, 이러한 하이브리드 플라스미드의 46개가 서로 상이함을 나타내었다. 이러한 결과는, 이들이 상이한 재조합사건에 상응하고 결국 고도의 유전자 분기성이 생체내 재조합에 의해 발생됨을 나타낸다.
4 내지 101개 뉴클레오티드 범위의 서열 동일성의 상이한 연속범위에서 비-상호적 단일 교차에 의해, 대부분의 재조합 유전자가 발생되었다. 일부 경우에서, R1 또는 R2 모자이크 유전자를 생성하는 다중 교차가 관찰되었다. oxa7/oxa5 및 oxa11/oxa5 간에 수득된 재조합 유전자를 도 4에 나타낸다.
DNA와 재조합 유전자의 유래된 아미노산 서열의 비교는, 이들의 53％가 새로운 oxa 유전자에 상응함을 나타내었다 (표 4b 참조). 재조합 동안에 프레임시프트 또는 정지 코돈이 발생되지 않기 때문에, 추정상 이들은 38개의 새로운 기능성 β-락타마제를 코드화할 수 있다.
| 생체내 재조합에 의해 수득된 재조합 oxa 유전자의 유도된 아미노산 서열과 뉴클레오티드의 비교 | ||
| 서열 비교 | 새로운 유전자 | 새로운 단백질 |
| R1 | 33/54 | 21/54 |
| R2 | 25/54 | 17/54 |
| 전체 | 58/108(53％) | 38/108(35％) |
실시예
2
테트라사이클린
내성에 의해 재조합
DNA
서열을 선택하는, 이중 플라스미드 체계(에스케리키아
콜리
/
바실러스
섭틸리스
)를 사용한 이종 유전자의 생체내 재조합
실시예 1에 수득된 결과를 입증하고 유전자의 클론화 및 재조합을 촉진하기 위하여 다른 이중 플라스미드 체계를 고안하였다. 이 체계는 테트라사이클린에 대해 내성인 세포의 선택을 기초로 한다.
1. 세균 균주 및 플라스미드
이 실시예에서 사용된 세균 균주 및 플라스미드를 각각 표 5 및 표 6에 나타낸다.
| 세균 균주 | ||
| 균주 | 유전자형 | 참조 또는 공급원 |
| 이.콜리 AB1157 NalR hsd- | thr1 leu6 proA2 his4 thil argE3 lacY1 galK2 ara14 xyl15 mtl1 tsx33 str31 supE44thr+ hsdR-B nalR | M.Radman 균주 콜렉션 |
| 이.콜리 MIXP1 | mutS::Tn5(kanR) 이외에 AB1157 NalR R- 동일 | M.Radman 균주 콜렉션으로부터의 mutS 대립유전자 |
| 이.콜리 DH10B | F- mcrA Δ(mrr- hsdPMS-mcrBC) φ80lacZΔm15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG | 인비트로젠 라이프 테크놀로지스(Invitrogene Life Technologies) 상품번호 18290-015Z |
| 비.섭틸리스 1A423 | araGH15 leuB8 recA4 thr-5 hsdRIR-M- | 바실러스 제네틱 스탁 센터(Bacillus Genetic stock center; 미국 오하이오 주립대학) |
| 플라스미드 | |
| 플라스미드 | 선택 |
| 이.콜리 플라스미드 pMIX100 | CmR |
| 비. 섭틸리스 플라스미드 pMIX101 | TcR, ErmR |
| 형질전환률 대조군 플라스미드 pMIX102 및 pMIX103 | AmpR, TcR |
2. 결과
2.1 이. 콜리 플라스미드 pMIX100 의 구축
플라스미드 pMIX100은 pACYC184의 복제 개시점 뿐만 아니라 그의 클로람페니콜-내성 유전자를 보유한다. pMIX100은 pBluescript SK+로부터 유전자 lacZ를 보유하며, 이것은 클론화 실험에서 선택을 촉진한다. lacZ는 β-갈락토시다제의 단편을 코드화하고, 이것은 X-Gal 및 IPTG를 함유하는 배지에서 재조합체의 청색/백색 선택을 위한 α-상보성을 제공한다. 따라서, pMIX100을 보유하는 콜로니는 이 배지에서 청색이어야 하고, 폴리링커(MCS)에 삽입된 유전자를 가진 플라스미드를 보유한 콜로니는 백색이어야 한다. 플라스미드 pMIX100의 물리적 지도를 도 5에 나타낸다.
2.2 비. 섭틸리스 플라스미드 pMIX101 의 구축
플라스미드 pMIX101는 비.섭틸리스 플라스미드 pIL253의 유도체이다. 에리트로마이신 내성을 부여하는 pIL253 마커 ErmR이 이.콜리에서 유용하지 않기 때문에, 재조합 실험에서 하이브리드 분자를 선택할 수 있도록 하는 테트라사이클린-내성 마커를 도입하였다. 테트라사이클린-내성 유전자를 플라스미드 pACYC184로부터 증폭시켰다. 따라서, pMIX101은 2개의 마커: 표적 유전자의 클론화를 위해 비.섭틸리스에서 선택 마커로서의 ErmR 및 이.콜리에서 재조합 하이브리드 분자를 선택하기 위한 TcR를 보유한다.
2.3 형질전환 효율 조절 플라스미드
pMIX102
및
pMIX103
의 구축
비.섭틸리스 벡터는 이.콜리에서 복제할 수 없기 때문에, 재조합 빈도를 산출하기 위하여 형질전환 효율 조절이 필요하다. 재조합체가 테트라사이클린 내성에 의해 선택되기 때문에, 동일한 마커가 조절 벡터에 존재해야 한다. pBluescript SK+의 유도체인 플라스미드 pMIX102는 pACYC184로부터 증폭된 TcR 유전자를 함유한다. pMIX102에서, TcR 유전자가 plac 프로모터에 의해 구동된다. 플라스미드 pMIX102의 물리적 지도를 도 7에 나타낸다.
두번째 조절 벡터 pMIX103에서, TcR 유전자를 plac와는 반대쪽 방향에서 클론화한다. 따라서, 이러한 유전자를 그 자체의 프로모터로부터 발현한다. 플라스미드 pMIX103의 물리적 지도를 도 8에 나타낸다.
2.4 이.
콜리
플라스미드
pMIX
내로
oxa7
,
oxa11
및
oxa5
의
클론화
실시예 1에서 수득된 0％, 5％ 및 22％ 분기-oxa 유전자 간의 재조합 실험 결과를 입증하기 위하여, oxa7, oxa11 및 oxa5를 이.콜리 플라스미드 pMIX100 내에 클론화하였다. 그의 5' 말단에서 PstI 또는 XhoI을 함유하는 프라이머를 사용하여 이러한 유전자를 증폭시켰다. 이러한 효소로의 소화 후에, 증폭된 DNA 단편을 PstI + XhoI으로 미리 절단된 pMIX100으로 독립적으로 결찰시켰다. 이.콜리 DHB10의 수용능 세포를 결찰 혼합물로 일렉트로포레이트하고, 포지티브 클론을 가진 콜로니를 Cm(30 ㎍/ml) + X-Gal(80 ㎍/ml) + IPTG(0.5mM)을 함유하는 LB 플레이트 위에서 클로람페니콜-내성/백색에 의해 표현형에 의해 선택하였다. 각각의 oxa-클론화를 위하여, 이러한 형질전환체의 5개를 분석하였다.
플라스미드 DNA를 수득하고 제한효소 지도에 의해 분석하였다. 결과는 pMIX104가 oxa7을 보유하고, pMIX106이 oxa11을 보유하고 pMIX107이 oxa5를 보유함을 입증하였다.
비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101 내로의 클론화를 위하여, PstI 및 XhoI으로의 제한에 의해 pMIX104로부터 0.9kb 단편으로서 oxa7를 수득하였으며, 이것을 동일한 효소로 미리 절단된 pMIX101과 결찰시켰다. 결찰 생성물로 비.섭틸리스 1A423 수용능 세포를 형질전환한 후에, 0.5 ㎍/ml의 에리트로마이신(Erm)을 함유하는 LB에서 세포를 선택하였다. 24개 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 수득하고 제한효소에 의해 분석하였다. 결과는, 모든 클론이 7kb 플라스미드 pMIX105를 함유함을 입증하였다.
oxa7, oxa11 및 oxa5 유전자를 이.콜리 플라스미드 pMIX100 내로 및 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101 내로 클론화하기 위한 전략을 도 9에 나타낸다.
2.5
MutS
-
돌연변이체 이.
콜리에
비해
wt
에서
oxa
유전자의
생체내
재조합
이.콜리 AB1157 hsdR- 및 그의 MMR- 돌연변이체, 이.콜리 AB1157 hsdR- CΔmutS의 수용능 세포를 플라스미드 pMIX104(oxa7), pMIX(oxa11) 및 pMIX(oxa5)로의 일렉트로포레이션에 의하여 독립적으로 형질전환하였다.
oxa 유전자를 재조합하기 위하여, 이러한 플라스미드를 가진 이.콜리 균주들을 pMIX105(oxa7)로 일렉트로포레이트하였다. 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101을 네가티브 대조로서 사용한 반면, TcR 마커를 보유한 이.콜리 벡터 pMIX102를 테트라사이클린 선택 하에 형질전환 효율의 대조로서 사용하였다. 재조합 빈도를 증가시키기 위하여 모든 DNA를 일렉트로포레이션에 앞서서 UV 조사하였다.
비.섭틸리스 플라스미드에서 수득된 형질전환 효율을 조절 벡터 pMIX92에서 수득된 형질전환 효율로 나눔으로써 재조합 빈도를 계산하였다. 앞서 기재된 조건에서 DNA의 ㎍당 수득된 콜로니 형성 단위(cfu)의 수로서 형질전환 효율을 계산하였다.
수득된 결과를 표 7에 요약한다. 야생형 균주에서, 동일하거나 5％ 분기 oxa 유전자를 사용하는 실험에서 재조합체가 수득된 반면, MutS- 변이체에서는 재조합이 22％ 분기 유전자 사이에서 발생하였다.
| 야생형 및 MutS- 이.콜리 균주에서 oxa 유전자 간에 수득된 생체내 재조합 빈도 | ||
| 유전자 분기(％) | 재조합 빈도 | |
| wt 균주 | MutS- 균주 | |
| 0 | 10-5 ~ 10-6 | 10-6 |
| 5 | - | 10-5~10-6 |
| 22 | - | - |
재조합 빈도는 이전의 이중 플라스미드 체계에서 수득된 것과 일치하였다.
재조합을 입증하기 위하여, pMIX105 형질전환체를 테트라사이클린을 함유하는 액체 배지(12.5 ㎍/ml)에서 생육시켰다. 이러한 배양액으로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한 분석은, 이들이 oxa-재조합 유전자를 보유한 이량체를 상재성 플라스미드(pMIX104 또는 pMIX106)와 함께 갖고 있음을 나타내었다. 또한, 특정한 플라이머를 사용하여 콜로니 및 플라스미드 DNA 양쪽 모두로부터 PCR에 의해 재조합 유전자 R1 및 R2를 성공적으로 증폭하였다.
결과는, 선택 압력으로서 테트라사이클린 내성을 사용하는 두번째 이중 플라스미드 체계에 의하여 재조합체들이 발생되었음을 증명한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Mixis France S.A.
<120> Generation of recombinant genes in prokaryotic cells by
using two extrachromosomal elements
<130> 18249
<140>
<141>
<160> 17
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 1
gcgcagtact cctcactcgg ggcggaaaag g 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 2
gcgcaggtcc cgtttgagct caggccgcg 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 3
gcggatccat gcctgcaggg acgcctttg 29
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 4
gcgcagggcc tggtcacgat gctgtacttt gtg 33
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 5
gcggatcctg ttagccacca aggtacca 28
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 6
gcgcagggcc tttagccacc aatgatgatg c 31
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 7
gcggatcccc ctttaccaaa ccaatac 27
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 8
gcgcagggcc taagggttgg gcgattttg 29
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 9
gcgcagtact atgcctgcag ggacgccttt g 31
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 10
tcgcgggacc tggtcacgat gctgtacttt gtg 33
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 11
gcgcagtact gggcgaaccc ggagcctcat 30
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 12
aagaaggagt gattacatga ac 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 13
cgcatctcgg gcagcgttg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 14
gcagatccgg aacataatgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 15
tgtcggcaga atgcttaatg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 16
cactatcgac tacgcgatca 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 17
gcttccccat gataagagc 19
Claims (48)
- a) 재조합되어지는 첫번째 DNA 서열을 포함하고 원핵 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 수용체 DNA 분자, 및 재조합되어지는 두번째 DNA 서열 및 유전자 생성물을 코드화하는 적어도 첫번째 마커 서열을 포함하고 원핵 세포에서 자율적으로 복제될 수 없는 공여체 DNA 분자를 함유하는, 첫번째 원핵 세포를 발생시키고,b) 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물이 발현된다면 단지 세포의 성장 및/또는 증식을 가능하게 하는 선택적 조건 하에 첫번째 원핵 세포를 배양하고,c) 선택적 조건 하에 성장 및/또는 증식되고, 첫번째 및 두번째 DNA 서열 간의 재조합에 기인한 적어도 첫번째 마커 서열 및 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열의 하이브리드 DNA 분자를 함유하는 두번째 원핵 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 원핵생물에서 재조합 DNA 서열을 발생시키고 검출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 공여체 DNA 분자 및 수용체 DNA 분자가 상이한 선형 또는 원형 DNA 구조, 특히 상이한 플라스미드 또는 박테리오파지인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용체 DNA 분자가 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에서 복제할 수 있는 플라스미드인 방법.
- 제3항에 있어서, 수용체 DNA 분자가 이.콜리(E. coli) 플라스미드 pACYC184 또는 이.콜리 플라스미드 pMIX100, 또는 이들의 유도체인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 DNA 분자가 복제 개시점을 갖지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 DNA 분자가 비-기능성 복제 개시점을 갖는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 공여체 DNA 분자 및/또는 그의 복제 개시점이, 공여체 DNA 분자가 도입되어진 세포의 원핵생물 종 이외의 원핵생물 종으로부터 유래된 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 공여체 DNA 분자가 이.콜리에서 복제할 수 없는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 플라스미드인 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 공여체 DNA 분자가 specR 마커 및 phleoR 마커를 포함하는 비.섭틸리스(B. subtilis) 플라스미드 pMIX91 또는 tcR 마커를 포함하는 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX101인 방법.
- 제6항에 있어서, 공여체 DNA의 복제 개시점의 기능이 돌연변이에 의해 손상받은 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 DNA 구조의 첫번째 마커 서열이 영양 마커, 항생물질 내성 마커 및 효소의 소단위(subunit)를 코드화하는 서열로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물이 항생물질에 감수성인 세포에 그 항생물질에 대한 내성을 부여하는 것인 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 첫번째 마커 서열이, 유전자 생성물이 스펙티노마이신 내성을 세포에 부여하는 것인 specR, 유전자 생성물이 플레오마이신 내성을 세포에 부여하는 것인 phleoR, 또는 유전자 생성물이 테트라사이클린 내성을 세포에 부여하는 것인 tcR인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 DNA 분자가 두번째 마커 서열을 함유하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 DNA 분자가 세번째 마커 서열 및 임의로 네번째 마커 서열을 함유하는 것인 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 두번째, 세번째 및 네번째 마커 서열이 영양 마커, 안료 마커, 항생물질 내성 마커, 항생물질 감수성 마커, 제한효소 부위, 프라이머 인식 부위 및 효소의 소단위를 코드화하는 서열로 구성된 군에서 선택되는 단백질-코드화 또는 비-코드화 서열인 방법.
- 제16항에 있어서, 수용체 DNA 분자의 세번째 및 네번째 마커 서열의 유전자 생성물이 항생물질에 감수성인 세포에 그 항생물질에 대한 내성을 부여하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 세번째 마커 서열의 유전자 생성물이 테트라사이클린 내성을 세포에 부여하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 네번째 마커 서열의 유전자 생성물이 클로람페니콜 내성을 세포에 부여하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열이 2개 이상의 뉴클레오티드만큼 상이한 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열이 자연 발생 서열인 방법.
- 제21항에 있어서, 재조합되어지는 첫번째 및/또는 두번째 DNA 서열이 바이러스, 세균, 식물, 동물 및/또는 인간으로부터 유래된 것인 방법.
- 제1항 내지 제20 중 어느 한 항에 있어서, 재조합되어지는 첫번째 및/또는 두번째 DNA 서열이 인공 서열인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합되어지는 첫번째 및 두번째 DNA 서열 각각이 하나 이상의 단백질-코드화 서열 및/또는 하나 이상의 비-코드화 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 DNA 분자 및 공여체 DNA 분자를 원핵 세포에 동시에 또는 순차적으로 도입함으로써 첫번째 원핵 세포가 발생되는 방법.
- 제25항에 있어서, 수용체 및 공여체 DNA 분자가 형질전환, 접합, 형질도입(transduction), 반성도입(sexduction) 및/또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 원핵 세포 내에 도입되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 첫번째 마커 서열의 유전자 생성물이 내성을 부여하는 하나 이상의 항생물질의 존재 하에서, 첫번째 원핵 세포가 배양되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 두번째 마커 서열, 세번째 마커 서열 및 네번째 마커 서열의 유전자 생성물이 각각 내성을 부여하는 두번째, 세번째 및/또는 네번째 항생물질의 존재 하에서, 첫번째 원핵 세포가 추가로 배양되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 세포가 고세균(archeabacterium) 또는 진정세균(eubacterium)의 세포인 방법.
- 제29항에 있어서, 진정세균이 그람-음성 세균, 그람-양성 세균 또는 남세균(cyanobacterium)인 방법.
- 제30항에 있어서, 그람-음성 세균이 에스케리키아 콜리인 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 세포가 기능성 불일치 수복 체계를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 세포가 불일치 수복 체계에서 일시적으로 또는 영구적으로 결함을 가진 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 불일치 수복 체계의 일시적 또는 영구적 결함이, 불일치 수복 체계에 연관된 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 결실 및/또는 유도성 발현 또는 억제, 불일치 수복 체계를 포화시키는 작인으로의 처리, 및/또는 불일치 수복 체계를 완전히 파괴(knock out)시키는 작인으로의 처리에 기인한 것인 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 원핵 세포가 돌연변이된 mutS 유전자 및/또는 돌연변이된 mutL 유전자를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 두번째 원핵 세포의 하이브리드 DNA 분자에 함유된 첫번째 및 두번째 재조합 DNA 서열이 선택되고/되거나 단리되고/되거나 분석되는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 첫번째 및 두번째 재조합된 DNA 서열이 제한 효소 절단에 의해 단리되는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 첫번째 및 두번째 재조합된 DNA 서열이 PCR에 의해 증폭되는 것인 방법.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 첫번째 및 두번째 재조합된 DNA 서열이 각각 공여체 DNA 분자 및 수용체 DNA 분자 내에 삽입되어 다른 라운드(round)의 재조합을 겪게되는 것인 방법.
- specR 마커 및 phleoR 마커, 및 외래 DNA 서열을 삽입하기 위한 제한 부위 ScaI, PpuMI 및 EcoO109I을 포함하는 바실러스 섭틸리스 플라스미드 pMIX91.
- tcR 마커 서열, 및 외래 DNA 서열을 삽입하기 위한 제한 부위 XhoI 및 PstI을 포함하는 바실러스 섭틸리스 플라스미드 pMIX101.
- 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 이.콜리 세포에서 재조합 DNA 서열을 발생 및/또는 검출하기 위한 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 공여체 DNA 분자로서 비.섭틸리스 플라스미드 pMIX91 또는 pMIX101의 용도.
- 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 이.콜리 세포에서 재조합 DNA 서열을 발생 및/또는 검출하기 위한 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 수용체 DNA 분자로서 이.콜리 플라스미드 pACYC184 또는 pMIX100 또는 이들의 유도체의 용도.
- 이.콜리 균주 AB1157 또는 이.콜리 균주 MXP1 또는 이.콜리 균주 DHB10의 세포를 포함하는 첫번째 용기, 플라스미드 pACYC184를 함유한 이.콜리 균주 AB1157의 세포 또는 플라스미드 pMIX100을 함유한 이.콜리 균주 DHB10의 세포를 포함하는 두번째 용기, 및 플라스미드 pMIX91을 함유한 비.섭틸리스 균주 DSM4393의 세포 또는 플라스미드 pMIX101을 함유한 비.섭틸리스 균주 1A423의 세포를 포함하는 세번째 용기를 적어도 포함하는 키트.
- 이.콜리 균주 AB1157 또는 이.콜리 균주 MXP1 또는 이.콜리 균주 DHB10의 세포를 포함하는 첫번째 용기, 플라스미드 pACYC184 또는 플라스미드 pMIX100의 DNA를 포함하는 두번째 용기, 및 플라스미드 pMIX91 또는 플라스미드 pMIX101의 DNA를 포함하는 세번째 용기를 적어도 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하고, 하이브리드 유전자 및/또는 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 단백질을 원핵 세포에서 생성시키고, 하이브리드 유전자 및/또는 코드화된 단백질을 원핵 세포에서 선택하고/하거나 발현 후에 그로부터 단리하는 것인, 원핵 세포에서 하이브리드 유전자 및/또는 하이브리드 유전자에 의해 코드화된 단백질의 생성 방법.
- 제46항에 따른 방법에 의해 수득가능한 하이브리드 유전자.
- 제47항에 따른 하이브리드 유전자에 의해 코드화되고 제46항의 방법에 의해 수득가능한 단백질.
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