ES2315849T3 - Generacion de genes recombinantes en celulas procarioticas usando dos elementos extracromosomicos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes en procariotas, que comprende las etapas de: a) generar una primera célula procariota que contiene una molécula de ADN receptora extracromosómica, que comprende una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y que puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota, y una molécula de ADN donadora extracromosómica, que comprende una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar y al menos una primera secuencia marcadora que codifica un producto génico y que no puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota, b) cultivar la primera célula procariota en condiciones selectivas, que fuerzan a la formación de un cointegrado o molécula híbrida entre las moléculas de ADN receptora y donadora, y a la recombinación de las dos secuencias de ADN que se van a recombinar y que solo permiten el crecimiento y/o propagación de la célula si se expresa el producto génico de la primera secuencia marcadora, y c) aislar una segunda célula procariota hecha crecer y/o propagar en condiciones selectivas y que contiene una molécula de ADN híbrida con al menos la primera secuencia marcadora y una primera y segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y segunda secuencias de ADN, en el que la célula procariota es deficiente de forma transitoria o permanente en el sistema de reparación de apareamiento erróneo.

Description

Generación de genes recombinantes en células procarióticas usando dos elementos extracromosómicos.

La presente invención se refiere en general a métodos in vivo para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en células procariotas, en particular bacterias, usando dos elementos extracromosómicos diferentes, y a elementos extracromosómicos, en particular plásmidos que se pueden usar para llevar a cabo los métodos de la invención. Las secuencias de ADN para las que estos métodos son importantes incluyen secuencias que codifican proteínas y no codificantes.

La evolución es un proceso continuo de variación genética y selección fenotípica. La diversidad genética de una población se puede amplificar creando nuevas combinaciones mutantes que mejoran el rendimiento de individuos dentro de la población. La evolución dirigida de microorganismos se ha llevado a cabo tradicionalmente por el procedimiento clásico de mejora de cepa, por mutagénesis aleatoria secuencial y cribado.

Hasta ahora la evolución dirigida se ha usado casi exclusivamente como una herramienta para la ingeniería de proteínas. Por técnicas de mutación tales como la mutagénesis de sitio dirigida, mutagénesis por inserción de un casete, mutagénesis aleatoria, y PCR propensa a error, se han generado variantes de funciones de proteínas y en las genotecas así producidas se ha cribado su capacidad para llevar a cabo una función específica. La aplicación recursiva de este procedimiento se ha llevado a cabo satisfactoriamente para la modificación de propiedades físicas y catalíticas de enzimas tales como el pH óptimo, termotolerancia, estabilidad en disolventes, estereoselectividad, actividad catalítica y especificidad de sustrato, así como mecanismos de resistencia de toxicidad en bacterias y la gama de hospedantes y estabilidad de virus.

Los métodos de mutagénesis tradicionales para desarrollar nuevas propiedades en enzimas tienen una serie de limitaciones. Estos métodos sólo se pueden aplicar a genes o secuencias que se han clonado y caracterizado funcionalmente y que tienen una función discreta. Además, los métodos de mutagénesis tradicionales sólo pueden explorar una serie muy limitada del número total de permutaciones, incluso para un solo gen. Sin embargo, en determinadas circunstancias puede ser necesario modificar no sólo un gen, si no genes adicionales con el fin de expresar una proteína con propiedades nuevas. Dichos genes adicionales pueden ser por ejemplo genes que de forma cooperativa confieren un solo fenotipo o genes que tienen una función en uno o más mecanismos celulares tales como transcripción, traducción, modificaciones postraduccionales, secreción o degradación proteolítica de un producto génico. El intento de optimizar individualmente todos los genes que tienen dicha función mediante métodos de mutagénesis tradicionales sería una tarea prácticamente imposible.

La mayoría de los problemas asociados con los métodos de mutagénesis convencionales se pueden superar por métodos de recombinación que conllevan la recombinación aleatoria de diferentes secuencias de genes funcionales, que permiten la mezcla molecular de genes naturales similares o mutados aleatoriamente. En comparación con la mutagénesis convencional con recombinación, la probabilidad de obtener mutantes con fenotipo mejorado es significativamente mayor. Las principales ventajas de los métodos de recombinación frente a las tecnologías de manipulación de ADN convencionales son en particular la simplicidad experimental y la ausencia de limitaciones impuestas por la secuencia de ADN.

Mucho de lo que se sabe sobre los procesos de recombinación ha venido de estudios de organismos sencillos unicelulares, tales como bacterias. El estudio de la recombinación en dichos organismos tiene la ventaja de la facilidad de manipulación de las secuencias de ADN y la posibilidad de estudiar sucesos de recombinación específicos inducidos de forma sincronizada en una gran proporción de células. Igualmente importante es la creciente creencia de que los procesos estudiados en microorganismos son iguales o similares en muchos aspectos a los caminos en los que las células de mamíferos, p. ej. células humanas, generan la diversidad genética. Además, el definir estos mecanismos ha adquirido una importancia añadida en la investigación del desarrollo de mecanismos más eficaces de reconocimiento génico y sustitución génica en células de mamíferos.

Datsenko et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, National Academy of Science.
Washington, US, Vol. 97, No. 12, 6 June 2000, 6640-6645, describen un método para alterar genes cromosómicos en Escherichia coli en el que los cebadores de la PCR proporcionan la homología de los genes dirigidos. El procedimiento de recombinación requiere la recombinasa Red del fago \lambda.

Zhang et al., (1998) Nature Genetics Vol 20, 123-128, describen la recombinación homóloga usando RecE y RecT como un método de genotecnología de ADN no limitado por la disposición de los sitios de escisión de endonucleasas de restricción o el tamaño del ADN objetivo.

El documento EP0687730 describe un método de transformación de plantas por el cual se prepara una planta transgénica regenerada que contiene los genes deseados introducidos en la misma con una alta eficacia y que permite la preparación en la posterior generación de una planta transgénica que contiene los genes deseados pero no los genes resistentes a fármacos usados como marcadores de selección. El método implica la formación de un plásmido cointegrante en Agrobacterium tumerofaciens.

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Aunque existen numerosos sistemas diferentes para realizar la recombinación en células procariotas, la mayoría de estos no permiten una detección fácil y fiable de secuencias de ADN recién recombinadas. Por lo tanto, en la técnica todavía existe una demanda de sistemas de ensayo de procariotas eficaces, que permitan en particular una detección rápida y sencilla de recombinantes y/o una selección de recombinantes bajo presión selectiva.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención es proporcionar métodos y medios mejorados para una generación sencilla y eficaz de genes mosaico recombinantes en células procariotas, en particular para el cribado y la detección de dichas secuencias recombinantes.

La presente invención resuelve este problema técnico subyacente proporcionando un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes en procariotas, que comprende las etapas de:

a)

generar una primera célula procariota que contiene una molécula de ADN receptora, que comprende una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y que se puede replicar de forma autónoma en la célula procariota, y una molécula de ADN donadora, que comprende una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar y al menos una primera secuencia marcadora que codifica un producto génico y que no puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota,

b)

cultivar la primera célula procariota en condiciones selectivas que sólo permiten el crecimiento y/o propagación de la célula si se expresa el producto génico de la primera secuencia marcadora, y

c)

aislar una segunda célula procariota hecha crecer y/o propagada en condiciones selectivas y que contiene una molécula de ADN híbrida con al menos la primera secuencia marcadora y una primera y segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y segunda secuencias de ADN,

en el que la célula procariota es deficiente de forma transitoria o permanente en el sistema de reparación de apareamiento erróneo.

La presente invención proporciona un sistema procariota para cribar sucesos de recombinación entre al menos dos secuencias de ADN que divergen, o heterólogas, o sustratos de recombinación in vivo. El sistema de la invención permite la generación de nuevas secuencias de ADN ventajosas con propiedades mejoradas de una forma rápida y eficaz a partir de al menos dos secuencias de ADN que divergen, por un procedimiento que implica el intercambio in vivo de ADN de dos elementos extracromosómicos que contienen las dos secuencias de ADN que se van a recombinar. Los dos elementos extracromosómicos que no muestran homología en sus secuencias de nucleótidos se introducen en una célula hospedante procariota en forma de una molécula de ADN receptora y una molécula de ADN donadora. La molécula receptora se puede replicar de forma autónoma en el hospedante, mientras que la molécula donadora no tiene la capacidad de replicarse. Sin embargo, la molécula donadora contiene al menos una secuencia marcadora que codifica una proteína única tal como un marcador de resistencia a antibiótico o marcador nutricional que no está presente ni en el genoma de la célula hospedante ni en la molécula receptora. Después de introducir ambos elementos extracromosómicos en la célula hospedante procariota, la célula se cultiva en condiciones que fuerzan la recombinación entre los dos genes heterólogos. Estas condiciones pueden incluir, por ejemplo, un cultivo de la célula en presencia de un antibiótico al cual la célula normalmente es sensible, o un cultivo de la célula en un medio que carece de un nutriente esencial, que la célula no puede sintetizar por sí misma y que por lo tanto debe suministrarse externamente. En las condiciones de cultivo aplicadas la célula sólo puede crecer y propagarse, es decir, dividirse, si se expresa el producto génico de la respectiva secuencia marcadora. Sin embargo, un requisito previo para la expresión de la secuencia marcadora es que la molécula donadora no replicativa y la molécula receptora replicativa formen un cointegrado que puede replicarse desde el origen de la molécula receptora y así asegura el mantenimiento de la secuencia marcadora. La formación de este cointegrado da como resultado la recombinación entre los dos sustratos de recombinación que conduce a la generación de nuevas moléculas de ADN cuyas secuencias difieren de las de las secuencias de ADN parentales. Las células hospedantes que se han hecho crecer y propagar en las condiciones selectivas aplicadas contienen, por lo tanto, nuevas secuencias de ADN recombinadas. Por lo tanto, el procedimiento de la invención proporciona un sistema de selección fácil y rápido para identificar secuencias de ADN recombinantes. Con el procedimiento de la invención se puede generar fácilmente una gran genoteca de secuencias de ADN mutadas, recombinadas, y después se pueden identificar variantes que han adquirido una función deseada usando un sistema de selección o cribado adecuados.

El estudio de procedimientos de recombinación en un organismo sencillo, unicelular, tal como un procariota tiene la ventaja obvia de la facilidad de manipulación de las secuencias de ADN y la posibilidad de estudiar sucesos de recombinación específicos inducidos de forma sincronizada en una gran proporción de células. Además, a lo largo de las últimas décadas se ha acumulado una gran experiencia tanto en la tecnología de fermentación como en la genética básica de organismos procariotas. Otra ventaja principal de las células hospedantes procariotas se refiere a sus tiempos de duplicación muy cortos. Por lo tanto, mediante el uso de células hospedantes procariotas se pueden llevar a cabo muchos ciclos de división celular y por lo tanto muchos ciclos de recombinación y crear una pluralidad de secuencias de ADN recombinantes nuevas en un tiempo muy corto.

El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo en células procariotas naturales o deficientes en la reparación de apareamiento erróneo. Los procesos por los cuales el ADN es reparado y los mecanismos de recombinación genética están íntimamente relacionados; y se sabe que el mecanismo de reparación de apareamiento erróneo tiene efectos inhibidores en la frecuencia de recombinación entre secuencias divergentes, es decir, recombinación homóloga. Por lo tanto, las mutaciones del sistema de reparación de apareamiento erróneo potencian mucho la frecuencia total de sucesos de recombinación en células procariotas. Por otra parte, se sabe que las células procariotas naturales tienen un mecanismo de recombinación dependiente de la reparación de apareamiento erróneo, que se basa en apareamientos erróneos muy alejados en dos sustratos de recombinación. Dependiendo de las secuencias de ADN que se van a recombinar, se pueden usar células procariotas naturales o deficientes en reparación de apareamiento erróneo, para obtener secuencias recombinadas.

El procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinadas tiene la ventaja de que se pueden recombinar secuencias de ADN que divergen mucho. Los autores de la invención encontraron de forma inesperada que las secuencias con un alto grado de divergencia global y que sólo compartían tramos muy cortos de homología o identidad, se podían recombinar. Un análisis de las secuencias recombinadas puso de manifiesto que los tramos más largos de identidad en los que se producía recombinación comprendían 18-22 nucleótidos. La mayoría de los sucesos de recombinación ocurrían en tramos homólogos con una longitud de 10-15 nucleótidos. En algunos casos la recombinación se producía en tramos con una longitud de sólo 4-5 nucleótidos.

Por lo tanto, el procedimiento de la invención permite la recombinación de secuencias de ADN derivadas de diferentes especies procariotas o diferentes géneros de procariotas, con el fin de crear secuencias de ADN recombinantes con características ventajosas.

El procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinadas tiene la ventaja de que se pueden recombinar más de dos secuencias que divergen, de modo que las dos secuencias que divergen que se van a recombinar pueden ser secuencias preseleccionadas o no seleccionadas.

Por ejemplo, se puede insertar una variedad de secuencias de ADN divergentes hasta una genoteca entera, en el receptor así como en las moléculas de ADN donadoras. Después, las secuencias de ADN individuales divergentes se pueden recombinar al azar entre sí. También es posible insertar un primer conjunto de secuencias de ADN divergentes hasta una genoteca entera solo en las moléculas de ADN receptoras e insertar un segundo conjunto de secuencias de ADN divergentes hasta una genoteca entera en las moléculas de ADN donadoras, o viceversa, y después recombinar los dos conjuntos entre sí al azar. En ambos casos no hay selección de que par de secuencias de ADN divergentes se recombinarán.

Sin embargo, también es posible recombinar varias secuencias divergentes preferiblemente preseleccionadas en etapas, de modo que en cada etapa se hace una selección de que par de secuencias de ADN divergentes se recombinarán. Si se van a recombinar, por ejemplo, tres secuencias de ADN que divergen, entonces en la primera etapa se generan las primeras células procariotas, de modo que por ejemplo, una molécula de ADN receptora con una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y una molécula de ADN donadora con una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar, se introducen en células bacterianas de una especie dada. Estas células procariotas se cultivan en condiciones selectivas de modo que, sólo se hacen crecer y propagar células en las que las respectivas moléculas de ADN receptora y donadora han formado una molécula híbrida que permite la expresión de la secuencia marcadora de la molécula donadora y la recombinación entre las dos secuencias de ADN que se van a recombinar. Así, se obtienen las segundas células procariotas que contienen una molécula híbrida con una primera y una segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación. La primera y segunda secuencias recombinadas se aíslan y una de ellas se inserta por ejemplo, en una molécula receptora, mientras que la tercera secuencia de ADN que se va a recombinar se inserta en la molécula donadora. Después, en la siguiente etapa, la molécula receptora que comprende una de las secuencias recombinadas y la molécula donadora que comprende la tercera secuencia de ADN que se va a recombinar se introducen otra vez en una célula hospedante procariota y se somete a otro ciclo de recombinación.

Si se van a recombinar, por ejemplo, cuatro secuencias de ADN que divergen, entonces en la primera etapa se generan dos conjuntos diferentes de primeras células procariotas. Por ejemplo, se puede generar un primer conjunto de primeras células procariotas introduciendo una molécula de ADN receptora con una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y una molécula de ADN donadora con una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar, en las células procariotas. Igualmente, se puede generar un segundo conjunto de primeras células procariotas introduciendo una molécula de ADN receptora con una tercera secuencia de ADN que se va a recombinar y una molécula de ADN donadora con una cuarta secuencia de ADN que se va a recombinar, en células de la misma especie. Cada conjunto de células procariotas se cultiva en condiciones selectivas para realizar la recombinación. Así, se obtiene un primer conjunto de células procariotas que contiene una molécula híbrida con una primera y una segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y la segunda secuencias de ADN que se van a recombinar. También se obtiene otro conjunto de células procariotas que contienen una molécula híbrida con una tercera y una cuarta secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la tercera y la cuarta secuencias de ADN que se van a recombinar. Después, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de ADN recombinadas así obtenidas se aíslan de sus respectivas células hospedantes. En la siguiente etapa la primera o la segunda secuencias recombinadas se pueden insertar en una molécula de ADN donadora y la tercera o cuarta secuencias recombinadas en una molécula de ADN receptora. Las moléculas de ADN tanto donadora como receptora así obtenidas se introducen después en una célula hospedante procariota y se someten a otro ciclo de recombinación. De esta forma, también se pueden recombinar cinco, seis o más secuencias de ADN que divergen.

En una realización preferida de la invención la molécula de ADN donadora y las moléculas de ADN receptoras son estructuras de ADN lineales o circulares diferentes. La expresión "estructura de ADN" significa una molécula de ADN, por ejemplo un vector tal como un plásmido o bacteriófago, que se caracteriza porque está presente tras la introducción en la célula hospedante procariota en forma de un elemento extracromosómico. En el contexto de la presente invención "elemento extracromosómico" es, por lo tanto, una molécula de ADN que no se integra en el o los cromosomas de la célula hospedante procariota.

La molécula de ADN donadora debe ser capaz de hibridar con la molécula de ADN receptora de modo que pueda formarse una molécula híbrida. Preferiblemente, la molécula de ADN donadora y la molécula de ADN receptora no comparten homología en general, con la excepción de las secuencias de ADN que se van a recombinar.

De acuerdo con la invención la molécula de ADN receptora debe poder replicarse de forma autónoma en una célula hospedante procariota tras la introducción en la célula. Por lo tanto la molécula de ADN receptora debe tener al menos un origen de replicación que permita a la molécula de ADN receptora replicarse independientemente del material genético del hospedante. En el contexto de la presente invención un "origen de replicación" u "ori" es la región de una molécula de ADN que es usada por las enzimas celulares para iniciar la replicación de esa molécula de ADN. En el origen, las dos cadenas de ADN son separadas para formar una burbuja de replicación, que crea una región de ADN monocatenario en cada lado de la burbuja. Después, la maquinaria de la ADN polimerasa se puede mover en ella y empezar a sintetizar las nuevas cadenas de ADN, usando las cadenas antiguas como molde. Los ADN pequeños, incluyendo los plásmidos bacterianos o bacteriófagos normalmente tienen un solo origen.

En una realización de la invención la molécula de ADN receptora es un plásmido, en particular una molécula de ADN circular bicatenaria. Un "plásmido" es un elemento extracromosómico que puede replicarse independientemente del material genético del hospedante. En otra realización de la invención la molécula de ADN receptora es un bacteriófago, en particular un fago, cuyo ADN está presente en la célula procariota en forma de un elemento extracromosómico.

En una realización preferida de la invención, la molécula de ADN receptora es un plásmido, que puede replicarse en una célula hospedante de E. coli. Preferiblemente, la molécula de ADN receptora es el plásmido de E. coli pACYC184 o uno de sus derivados. El plásmido pACYC184 es Tet^{R} y Cam^{R}.

De acuerdo con la invención, la molécula de ADN donadora es una molécula de ADN que no puede replicarse en la célula hospedante procariota, pero puede formar una molécula híbrida con el ADN receptor. Por lo tanto, se puede usar cualquier molécula de ADN como molécula donadora siempre que contenga al menos una secuencia marcadora y no pueda replicarse independientemente en una célula hospedante procariota dada. Los ejemplos de molécula donadora adecuada comprenden, pero no se limitan a ADN bicatenarios lineales que pueden hacerse circulares, generados por ejemplo por PCR y que contienen una secuencia marcadora adecuada, plásmidos y bacteriófagos. En el caso de que se use un plásmido o un bacteriófago como molécula de ADN donadora, esta molécula no tiene (un) origen(es)
funcional(es) de replicación en absoluto o tiene (un) origen(es) de replicación que está(n) en las células hospedantes procariotas no funcional(es), es decir no activo(s).

Por lo tanto, en una realización de la invención la molécula de ADN donadora no contiene un origen de replicación. Esto significa, que la molécula de ADN donadora no contiene ninguna secuencia que pueda funcionar en ninguna célula hospedante procariota como un origen de replicación, es decir, secuencias a las que pudieran unirse factores proteínicos implicados en la iniciación de la replicación . La ausencia de un origen de replicación puede deberse a una deleción de las secuencias de ácidos nucleicos que funcionan como origen.

En otra realización de la invención, la función del origen de replicación de la molécula de ADN donadora está alterada por una o más mutaciones que suprimen la función del propio origen de replicación o la función de las proteínas implicadas en la replicación, en particular las proteínas que se unen a la secuencia de ácidos nucleicos del origen por el que se inicia la replicación. Por ejemplo, se sabe que en E. coli la proteína clave para iniciar la replicación, DnaA, se une a secuencias específicas, las llamadas cajas DnaA, en el origen de replicación cromosómico y funde tres repeticiones directas de oligonucleótidos de 13 bases ricas en AT. La unión adicional de la proteína DnaA a cajas de hexámeros monocatenarios en la región abierta, se cree que estabiliza el complejo abierto (para una revisión véase Jiang et al., PNAS, 100 (2003), 8692-8697). Las cajas de DnaA y regiones ricas en AT se encuentran habitualmente en el origen de una variedad de replicones procariotas y se ha mostrado que la proteína DnaA tiene una función importante en el inicio de la replicación en estos orígenes. Por lo tanto, algunas mutaciones de las cajas DnaA y/o regiones ricas en AT o los sitios correspondientes en la secuencia del origen de replicación, tales como sustituciones, deleciones de bases etc. adecuadas, pueden prevenir la unión de las proteínas necesarias para iniciar la replicación y así inhibir la función del origen de un elemento extracromosómico. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, la función del origen de replicación de la molécula de ADN donadora puede alterarse mediante una o más mutaciones en la secuencia de ácidos nucleicos del origen de replicación de la molécula de ADN donadora, en particular en las cajas DnaA y/o regiones ricas en AT del origen.

Además, se sabe que la proteína DnaA sola no es suficiente para la formación de un complejo abierto en el origen de plásmidos tales como RK2, P1, F, pSC101 o R6K. En estos casos, la formación eficaz de un complejo abierto requiere la unión de la proteína Rep del plásmido, aunque de forma coordinada con la proteína DnaA del hospedante y proteína HU o IHF (factor del hospedante integrado). El requisito para una proteína de inicio específica de plásmido para la formación de complejo abierto es clave para la capacidad del plásmido para ejercer el control sobre la frecuencia de los sucesos de inicio en su origen de replicación (para una revisión véase Jiang et al., PNAS, 100 (2003), 8692-8697). Esto significa que mutaciones de las secuencias de ácidos nucleicos del plásmido que codifican factores proteínicos con funciones esenciales en la replicación del plásmido, también pueden alterar la función del origen de replicación de un elemento extracromosómico. Por lo tanto, en otra realización preferida de la invención la función de origen de replicación de la molécula de ADN donadora puede alterarse por una o más mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican factores proteínicos con funciones esenciales en la replicación de la molécula de ADN donadora.

En otra realización preferida de la invención, la molécula de ADN donadora contiene un origen de replicación que sólo es activo en algunas células hospedantes procariotas, pero no en la célula procariota en la que se introduce la molécula de ADN donadora con el fin de realizar la recombinación entre dos secuencias de ADN que se van a recombinar. Hay numerosas publicaciones de que un origen de replicación que es activo en una especie bacteriana particular no funciona en otra especie bacteriana. Por ejemplo, se sabe que el origen de replicación de Klebsiella pneumoniae (oriC) no es activo en Caulobacter crescentus, Pseudomonas putida o Rhodobacter sphaeroides (O'Neill and Bender, J. Bacteriol., 170 (1988), 3774-3777). También se sabe que los plásmidos de Bacillus subtilis no pueden replicarse en células de E. coli. Por lo tanto, en una realización preferida la molécula de ADN donadora y/o su origen de replicación derivan de una especie procariota distinta de las especies procariotas en cuyas células se introduce la molécula de ADN donadora.

En una realización particularmente preferida, la molécula de ADN donadora es el plásmido pMIX91 de B. subtilis, que es un derivado del plásmido pIL253 y que puede replicarse en B. subtilis, pero no en E. coli, y que comprende el marcador spec^{R}, el marcador phleo^{R} y los sitios de restricción ScaI, PpuMI y EcoO109I para insertar una secuencia de ADN extraña. En otra realización particularmente preferida, la molécula de ADN donadora es el plásmido pMIX101 de B. subtilis, que es un derivado del plásmido pIL253 y que puede replicarse en B. subtilis, pero no en E. coli, y que comprende la secuencia marcadora tc^{R}, y los sitios de restricción XhoI y Pstl para insertar una secuencia de ADN extraña.

En otra realización de la invención, el origen de replicación de la molécula de ADN donadora es funcional sólo en un determinado intervalo de temperatura, por ejemplo a una temperatura menor que 45ºC. Si la molécula de ADN donadora contiene dicho origen sensible a la temperatura, no podrá replicarse en condiciones no permisivas, es decir una temperatura superior a 45ºC, que todavía permite el crecimiento de la célula hospedante procariota.

En el contexto de la presente invención la expresión "secuencias de marcadoras" se refiere a secuencias de ADN que son únicas en una célula procariota dada y que están situadas en la molécula de ADN donadora o la molécula receptora, preferiblemente secuencia abajo o secuencia arriba de un sustrato de recombinación o una secuencia de ADN ya recombinada. La presencia de una secuencia marcadora en la misma molécula de ADN que el sustrato de recombinación o la secuencia de ADN ya recombinada, preferiblemente combinada con otra secuencia marcadora, que puede estar situada en el otro lado del sustrato de recombinación, permite que el sustrato de recombinación o la secuencia de ADN ya recombinada sea reconocida y seleccionada sea por métodos moleculares o genéticos.

De acuerdo con la invención, la molécula de ADN donadora comprende una primera secuencia marcadora que permite la selección de entrecruzamientos que implican sustratos de recombinación. La primera secuencia marcadora, preferiblemente combinada con secuencias marcadoras adicionales presentes en la molécula de ADN donadora o la molécula de ADN receptora, también permite llevar a cabo más ciclos de recombinación de una forma iterativa.

De acuerdo con la invención, la "primera secuencia marcadora" es una secuencia de ADN que codifica una proteína, cuyo producto génico es esencial para el crecimiento y propagación de la célula hospedante procariota en las condiciones selectivas aplicadas. La primera secuencia marcadora se selecciona del grupo que consiste en una secuencia que codifica un marcador nutricional, un marcador de resistencia a antibiótico y una secuencia que codifica una subunidad de una enzima que funciona solo si ambas o más subunidades son expresadas en la misma célula.

Un "marcador nutricional" es una secuencia marcadora que codifica un producto génico que puede compensar una auxotrofía de un organismo o célula y así puede conferir prototrofía al organismo o célula auxótrofos. En el contexto de la presente invención el término "auxotrofía" significa que un organismo o célula deben crecer en un medio que contenga un nutriente esencial que no puede ser sintetizado por el propio organismo auxótrofo. El producto génico del gen marcador nutricional promueve la síntesis de este nutriente esencial que falta en la célula auxótrofa. Por lo tanto, tras la expresión de este gen marcador nutricional, no es necesario añadir este nutriente esencial al medio en el que el organismo o célula se hacen crecer, puesto que el organismo o célula han adquirido prototrofía.

Un "marcador de resistencia a antibiótico" es un gen marcador en el que tras la expresión el producto génico confiere a una célula, en la que tiene lugar la expresión del gen marcador de antibiótico, la capacidad de crecer en presencia de un antibiótico dado en una concentración dada, mientras que una célula sin el marcador de resistencia a antibiótico no puede.

Una "secuencia que codifica una subunidad de una enzima" se puede usar como una secuencia marcadora, si una célula no puede sintetizar todas las subunidades de una enzima que son necesarias para el montaje de la estructura completa de la enzima y por lo tanto para obtener la actividad completa de la enzima, y si la presencia o ausencia de la actividad enzimática se puede seguir por medios genéticos y/o moleculares. Si, por ejemplo, es necesaria la actividad de una enzima para una ruta bioquímica esencial de la célula, que permite el crecimiento y/o propagación de la célula en un entorno particular, y la célula no puede sintetizar todos los componentes de la estructura de la enzima completa, entonces la célula no puede sobrevivir en ese entorno. Por lo tanto, la "secuencia que codifica una subunidad de una enzima" usada como secuencia marcadora, tras la expresión permite el montaje de la enzima completa y la supervivencia de la célula.

Preferiblemente, el producto génico de la primera secuencia marcadora confiere resistencia a un antibiótico a una célula que es sensible a dicho antibiótico. En particular, la primera secuencia marcadora es spec^{R} cuyo producto génico confiere a la célula resistencia a la espectinomicina, phleo^{R} cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la fleomicina o tc^{R} cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la tetraciclina.

En otra realización de la invención la molécula de ADN donadora contiene una segunda secuencia marcadora. En otra realización más de la invención, la molécula de ADN receptora contiene una tercera secuencia marcadora y opcionalmente una cuarta secuencia marcadora. Es decir, en una realización de la invención, la molécula de ADN donadora puede comprender al menos una primera y una segunda secuencias marcadoras, opcionalmente incluso más secuencias marcadoras, que pueden estar dispuestas por ejemplo secuencia arriba o secuencia abajo del sustrato de recombinación. En otra realización, la secuencia de ADN receptora puede comprender una tercera y una cuarta secuencias marcadoras, opcionalmente incluso más secuencias marcadoras, que pueden estar dispuestas por ejemplo, secuencia arriba o secuencia abajo del sustrato de recombinación. Estos marcadores adicionales permiten aumentar la restricción de la selección de las secuencias de ADN recombinadas, puesto que la molécula híbrida formada en la segunda célula procariota y que comprende las dos secuencias de ADN recombinadas diferentes, puede contener al menos cuatro secuencias marcadoras diferentes juntas.

De acuerdo con la invención, la "segunda, tercera y cuarta secuencias marcadoras" son secuencias que codifican proteínas o no codificantes, seleccionadas del grupo que consiste en marcadores nutricionales, marcadores de pigmentos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de sensibilidad a antibióticos, sitios de reconocimiento de cebador, límites intrón/exón, secuencias que codifican una subunidad particular de una enzima, secuencias promotoras, secuencias génicas reguladas secuencia abajo y sitos de enzimas de restricción.

Un "marcador de pigmento" es un gen marcador en el que el producto génico está implicado en la síntesis de un pigmento que tras la expresión teñirá la célula en la que se expresa el marcador de pigmento. Una célula sin el marcador de pigmento no sintetiza el pigmento y por lo tanto no se tiñe. Por lo tanto, el marcador de pigmento permite una detección fenotípica rápida de la célula que contiene el marcador de pigmento.

Un "marcador de sensibilidad a antibiótico" es un gen marcador en el que el producto génico tras la expresión destruye la capacidad de la célula para crecer en presencia de un antibiótico dado con una concentración dada.

"Sitios de reconocimiento de cebador" son sitios de reasociación para cebadores de PCR específicos de sitio, que permiten una rápida identificación de las respectivas secuencias marcadoras por PCR.

En una realización preferida de la invención, la segunda secuencia marcadora de la molécula de ADN donadora y la tercera y cuarta secuencias marcadoras de la molécula de ADN receptora son secuencias que codifican proteínas, cuyos productos génicos confieren resistencia a un antibiótico a una célula que es sensible a ese antibiótico. Preferiblemente, el producto génico de la tercera secuencia marcadora confiere a una célula resistencia a la tetraciclina y el producto génico de la cuarta secuencia marcadora confiere a una célula resistencia al cloranfenicol.

En el contexto de la presente invención las expresiones "secuencias de ADN que se van a recombinar" y "sustrato de recombinación" significa cualesquiera dos secuencias de ADN que se pueden recombinar como resultado de procesos de recombinación homóloga o no homóloga.

Los sucesos de recombinación homóloga de varios tipos se caracterizan por el aparejamiento de bases de una cadena de ADN dañada con una pareja homóloga, en los que la extensión de la interacción puede implicar cientos de pares de bases perfectamente apareadas. En contraste, la recombinación ilegítima o no homóloga se caracteriza por la unión de extremos de ADN que no comparten o solo comparten algunos pares de bases complementarias. En las células procariotas, los sucesos de reparación y recombinación no homólogos ocurren con frecuencias significativamente menores que los sucesos de recombinación homólogos.

En una realización preferida de la invención, los dos sustratos de recombinación, es decir la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar, son secuencias que divergen, es decir, secuencias que no son idénticas pero que muestran un cierto grado de homología. En el contexto de la invención, el término "homología" indica el grado de identidad que existe entre las secuencias de dos moléculas de ácido nucleico, mientras que "divergencia" indica el grado de no identidad entre las secuencias de dos moléculas de ácido nucleico. De acuerdo con la invención, las secuencias de ADN que se va a recombinar difieren entre sí en dos o más posiciones con respecto a su alineamiento entero. En una realización de la invención, la divergencia total entre los dos sustratos de recombinación, con respecto a su longitud total, es más de 0,1%, en particular más de 5% y preferiblemente más de 25%. Esto significa, que las secuencias de ADN que se va a recombinar pueden diferir en más de 30%, en más de 40% e incluso en más de 50%. En una realización de la invención particularmente preferida, las dos secuencias de ADN que se van a recombinar comparten al menos una o más regiones homólogas o idénticas, las cuales, sin embargo, pueden ser muy cortas. De acuerdo con la invención, las regiones homólogas o idénticas pueden comprender menos de 25 nucleótidos, en particular menos de 20 o menos de 15 nucleótidos e incluso menos de 10 nucleótidos, por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 nucleótidos.

Los sustratos de recombinación o secuencias de ADN que se van a recombinar pueden tener un origen natural o sintético. Por lo tanto, en una realización de la invención, la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias naturales. Las secuencias naturales se pueden aislar de cualquier fuente natural incluyendo virus, organismos procariotas vivos o muertos tales como bacterias, organismos eucariotas vivos o muertos tales como hongos, animales, plantas y seres humanos, o partes de los mismos, por cualquier método de aislamiento adecuado, o se pueden sintetizar por medios químicos. Las secuencias naturales también pueden comprender aquellas secuencias que después de aislarlas de una fuente natural se someten a mutagénesis. En otra realización de la invención, la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias artificiales que no se encuentran en una fuente natural. Las secuencias artificiales se pueden sintetizar por cualesquiera métodos químicos conocidos.

En una realización preferida de la invención, las secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias que codifican proteínas, por ejemplo, secuencias que codifican enzimas, que se pueden usar para la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o aquellos compuestos producidos con ayuda de las enzimas se pueden usar para producir fármacos, cosméticos, alimentos, etc. Las secuencias que codifican proteínas también pueden ser secuencias que codifican proteínas que tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas importantes para medicina, incluyen citoquinas y factores de crecimiento. La recombinación de las secuencias que codifican proteínas permite generar nuevas secuencias mutadas que codifican proteínas con funciones alteradas, preferiblemente mejoradas y/o funciones recién adquiridas. De esta forma se puede, por ejemplo, lograr mejoras en la termoestabilidad de una proteína, para cambiar la especificidad del sustrato de una proteína, para mejorar su actividad, desarrollar nuevos sitios catalíticos y/o fusionar dominios de dos enzimas diferentes. Las secuencias de ADN que codifican proteínas que se van a recombinar pueden incluir secuencias de diferentes especies que codifican las mismas proteínas o similares, que en su contexto natural tienen funciones similares o iguales. Las secuencias de ADN que codifican proteínas que se van a recombinar pueden incluir secuencias de la misma familia de proteínas o enzimas. Las secuencias que codifican proteínas que se van a recombinar también pueden ser secuencias que codifican proteínas con diferentes funciones, por ejemplo, secuencias que codifican enzimas que catalizan diferentes etapas de una ruta metabólica dada. En una realización preferida de la invención, la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar se seleccionan del grupo de secuencias de genes de la superfamilia Oxa de beta-lactamasas.

En otra realización preferida de la invención, las secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias no codificantes tales como secuencias que, por ejemplo, están implicadas en su contexto celular natural en la regulación de la expresión de una secuencia que codifica proteína. Los ejemplos de secuencias no codificantes incluyen, pero no se limitan a secuencias promotoras, secuencias que contienen sitios de unión de ribosoma, secuencias intrón, secuencias de poliadenilación, etc. Por recombinación de dichas secuencias no codificantes se pueden desarrollar secuencias mutadas, que en un entorno celular dan como resultado una regulación alterada de un proceso celular, por ejemplo, una expresión alterada de un gen.

De acuerdo con la invención, un sustrato de recombinación o secuencia de ADN que se va a recombinar puede comprender, por supuesto, más de una secuencia que codifica proteína y/o más de una secuencia no codificante. Por ejemplo, un sustrato de recombinación puede comprender una secuencia que codifica proteína más una secuencia no codificante o una combinación de diferentes secuencias que codifican proteínas y diferentes secuencias no codificantes. Por lo tanto, en otra realización de la invención, las secuencias de ADN que se van a combinar pueden consistir en uno o más tramos de secuencias codificantes con secuencias no codificantes que se interponen y/o flanquean. Esto significa que la secuencia de ADN que se va a recombinar puede ser, por ejemplo, una secuencia génica con secuencias reguladoras en su extremo 5' y/o una región 3' no traducida o una secuencia génica de mamífero con una estructura de exón/intrón. En otra realización más de la invención, las secuencias de ADN que se van a recombinar pueden consistir en tramos de ADN continuos más largos que contienen más de una sola secuencia codificante, opcionalmente con secuencias no codificantes que se interponen, tales como un operón. Las secuencias de ADN que se van a recombinar pueden ser secuencias que ya han experimentado uno o más sucesos de recombinación, por ejemplo sucesos de recombinación homóloga y/o no homóloga.

Los sustratos de recombinación pueden comprender secuencias de ADN naturales no mutadas y/o secuencias de ADN mutadas. Por lo tanto, en una realización preferida, se pueden recombinar secuencias naturales con secuencias mutadas ya existentes con el fin de desarrollar nuevas secuencias mutadas.

De acuerdo con la invención, se usa una célula procariota como célula hospedante para introducir las moléculas de ADN receptora y donadora. Las expresiones "célula procariota" y "célula hospedante procariota" incluyen cualquier célula en la que el genoma esté presente libremente dentro del citoplasma como una estructura circular, es decir, una célula, en la que el genoma no está rodeado por una membrana nuclear. Una célula procariota se caracteriza además porque no depende necesariamente de oxígeno y sus ribosomas son menores que los de las células eucariotas. Las células procariotas incluyen arqueobacterias y eubacterias. Dependiendo de la composición de la pared celular, las eubacterias se pueden dividir en bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas y cianobacterias.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, la célula procariota es una célula de una arqueobacteria o una eubacteria, de modo que en una realización preferida de la invención, la célula procariota es una bacteria Gram negativa, una bacteria Gram positiva o una cianobacteria. Preferiblemente, la bacteria Gram negativa es Escherichla coli, por ejemplo la cepa AB1157 de E. coli o su mutante MutS^{-}, la cepa MXP1 de E. coli.

De acuerdo con la invención, se puede preferir usar células hospedantes procariotas para el procedimiento de la invención, que tengan un sistema de reparación funcional. La reparación del apareamiento erróneo (MMR, por sus siglas en inglés mismatch repair) es una de las mayores contribuciones para evitar las mutaciones debidas a errores de la ADN polimerasa en la replicación. Sin embargo, la reparación del apareamiento erróneo promueve la estabilidad genética asegurando la fidelidad de la recombinación genética. Mientras que en bacterias y también en levaduras y células de mamíferos, la recombinación entre sustratos de ADN homólogos que contienen algunos apareamientos erróneos (< 1%) ocurre de forma mucho menos eficaz que entre secuencias idénticas, la frecuencia de recombinación (conversión y/o entrecruzamiento de genes) se eleva mucho en líneas que carecen de MMR. Esto significa que la alta fidelidad de la recombinación no es causada sólo por las propiedades intrínsecas de las enzimas de recombinación, si no también por la edición de la recombinación por el sistema de reparación de apareamiento erróneo. Así pues, la maquinaria de reparación de apareamiento erróneo tiene un efecto inhibidor en la recombinación entre secuencias que divergen. En E. coli son necesarias dos proteínas del sistema de MMR dirigido por metilo, en particular MutS y MutL, para esta fuerte actividad de antirrecombinación, mientras que el efecto de las otras proteínas del sistema de MMR, MutH y UvrD, es menos pronunciado. Además de sus funciones en la MMR y la recombinación homóloga, las proteínas de la
MMR también tienen una función importante en la eliminación de ADN no homólogo durante la conversión de genes.

En otra realización preferida de la invención, se usan células procariotas que son deficientes en el sistema de reparación de apareamiento erróneo. En el contexto de la presente invención, la expresión "deficiente en el sistema de reparación de apareamiento erróneo" significa que el sistema de MMR de una célula procariota es alterado de forma transitoria o permanente. La deficiencia de la MMR de una célula o un organismo se puede lograr mediante cualquier estrategia que altere de forma transitoria o permanente el sistema de MMR, incluyendo pero no limitado a una mutación de uno o más genes implicados en la MMR, tratamiento con un agente tal como luz UV que de como resultado una alteración global de la MMR, tratamiento con un agente tal como 2-aminopurina o un heterodúplex que contenga una cantidad excesiva de apareamientos erróneos para saturar e inactivar de forma transitoria el sistema de MMR, y la expresión o represión inducibles de uno o más genes implicados en la MMR, por ejemplo por promotores regulables, que permitirían la inactivación transitoria.

En una realización preferida de la invención, la deficiencia de reparación de apareamiento erróneo de la célula hospedante procariota se debe a una mutación de al menos uno de los genes implicados en la MMR. En una realización preferida, las células procariotas tienen un gen mutS mutado, un gen mutL mutado, un gen mutH mutado y/o un gen UvrD mutado.

En otra realización, la célula hospedante procariota tiene deteriorada u obstaculizada una o más de las proteínas de recombinación principales. Se ha mostrado que una célula alterada, por ejemplo, en los genes AddAB, muestra una frecuencia más alta de recombinación homóloga y no homóloga. En otra realización, la célula hospedante procariota sobreexpresa una o más de las proteínas de recombinación principales tales como recA. Esta proteína está implicada en la recombinación homóloga promoviendo la renaturalización del ADN monocatenario para formar la molécula heterodúplex necesaria para el suceso de recombinación e inicia el intercambio de cadenas de ADN.

De acuerdo con la invención, la primera célula procariota se genera por introducción simultánea o secuencial de la molécula de ADN receptora y la molécula donadora en la célula hospedante procariota. Por lo tanto, en una realización de la invención, la primera célula procariota se puede generar introduciendo en una primera etapa la molécula de ADN receptora en una célula hospedante procariota particular. Después de recuperar la célula hospedante procariota que alberga la molécula receptora, se introduce la molécula de ADN donadora en una segunda etapa en la célula que alberga la molécula de ADN receptora. En otra realización de la invención, tanto las moléculas de ADN receptora como donadora se pueden introducir simultáneamente en la célula hospedante procariota.

De acuerdo con la invención, la introducción de las moléculas de ADN tanto receptora como donadora en la célula hospedante procariota se puede realizar por cualquier método adecuado conocido incluyendo, pero no restringido a transformación, conjugación, transducción, sexducción, infección y/o electroporación.

En el contexto de la presente invención el término "transformación" significa la captación del entorno de una molécula de ácido nucleico aislada, preferiblemente purificada, por una célula, por ejemplo una célula microbiana. Las células de algunas especies procariotas tales como Bacillus o Diplococcus son competentes de forma espontánea, mientras que células de otras especies procariotas tales como E. coli deben someterse a tratamientos especiales con el fin de hacerlas competentes, es decir, inducir la transferencia de la molécula de ácido nucleico a través de la membrana celular. Se conocen varias bacterias por su capacidad para intercambiar ADN por transformación.

"Conjugación" significa la transferencia mediada por plásmido de un plásmido bacteriano de una célula bacteriana a otra célula bacteriana a través de contacto de célula a célula. La maquinaria de transferencia implicada normalmente es codificada por plásmidos o transposones conjugativos. Los ejemplos de dichos plásmidos son plásmidos conjugativos o plásmidos cooperadores. Los plásmidos conjugativos son plásmidos autotransmisibles que llevan genes que promueven el contacto de célula a célula (movilización de genes). Contienen los genes para generar puentes de conjugación. Una vez hecho un puente, se pueden transferir también otros plásmidos e incluso ADN cromosómico (transposones conjugativos). Los plásmidos movilizables contienen genes de movilización, pero necesitan la "ayuda" de los plásmidos conjugativos para moverse entre las células. La conjugación es una de las rutas principales para el intercambio genético entre diferentes grupos filogenéticos de células procariotas y entre procariotas y eucariotas.

"Sexducción" es un procedimiento por el cual se transfiere material genético de una célula procariota con un factor F o plásmido F a una célula que no contiene este factor F^{-} (célula F). El factor F normalmente está presente en el citoplasma de una célula bacteriana, pero ocasionalmente puede estar incorporado en diferentes sitios del cromosoma bacteriano, lo cual conduce a la formación de células Hfr. La integración del factor F es reversible, de modo que tras la desintegración incorrecta del plásmido, surgen los llamados factores F sustituidos (F') que pueden contener material genético que en el cromosoma bacteriano flanquea el sitio de integración original del factor F. El plásmido F' se puede transferir con frecuencia alta a células F^{-}.

"Transducción" significa la transferencia de una molécula de ácido nucleico de una célula bacteriana a otra célula bacteriana por un bacteriófago, que comprende la liberación de un bacteriófago de una célula y la posterior infección de la otra célula. Hay dos tipos de transducción. Puede ocurrir una transducción especializada durante el ciclo de vida lisógeno de un bacteriófago moderado, por la cual el material genético de la bacteria puede sustituir una parte del genoma del bacteriófago. Este trozo de ADN bacteriano se replica como parte del genoma del fago y puede ser transferido por el fago a otra célula receptora. En el caso de una transducción generalizada, el genoma entero de un fago lítico puede ser sustituido por ADN bacteriano. Cuando este fago infecta otra bacteria, inyecta el ADN en el receptor donde puede ser intercambiado por un trozo del ADN de la célula receptora.

La "electroporación" es un procedimiento en el que se mezclas células con moléculas de ácido nucleico y después se exponen brevemente a pulsos de voltaje eléctrico alto. La membrana celular de la célula hospedante se vuelve penetrable permitiendo así que ácidos nucleicos extraños entre en la célula huésped.

En una realización preferida particular de la invención, la molécula de ADN donadora es irradia con luz UV primero para la introducción en la célula hospedante procariota, puesto que se sabe que esta irradiación conduce a un aumento de las frecuencias de recombinación.

De acuerdo con la invención, la primera célula procariota que contiene las moléculas de ADN receptora y donadora se cultiva en condiciones tales que fuerzan tanto a la formación de una molécula cointegrada o híbrida entre las moléculas de ADN receptora y donadora, como a la recombinación, preferiblemente recombinación no homóloga, entre dos sustratos de recombinación, es decir, condiciones que permiten la selección de secuencias de ADN recombinadas.

Si la primera secuencia marcadora de la molécula de ADN donadora es un marcador de resistencia a antibiótico, la primera célula procariota que contiene las moléculas de ADN receptora y donadora se cultiva en presencia de un antibiótico al que es sensible la célula hospedante procariota y al que el producto génico de la primera secuencia marcadora confiere resistencia. En una realización particularmente preferida, el primer procariota es cultiva en presencia de espectinomicina si la primera secuencia marcadora presente en la molécula de ADN donadora es spec^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la espectinomicina. En otra realización particularmente preferida, el primer procariota se cultiva en presencia de fleomicina si la primera secuencia marcadora presente en la molécula de ADN donadora es phleo^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la fleomicina. En otra realización particularmente preferida, el primer procariota se cultiva en presencia de tetraciclina si la primera secuencia marcadora presente
en la molécula de ADN donadora es tc^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la tetraciclina.

Si la primera secuencia marcadora de la molécula de ADN donadora es un marcador nutricional, la primera célula procariota que contiene las moléculas de ADN receptora y donadora se cultiva en un medio que carece de un nutriente esencial particular que no puede ser sintetizado por la propia célula hospedante y que es suministrado a la célula hospedante tras la introducción de la molécula donadora y expresión del primer marcador génico contenido en la molécula donadora. Tras la expresión del primer marcador génico nutricional, no es necesario añadir este nutriente esencial al medio en el que se hace crecer la célula procariota.

Si la segunda secuencia marcadora, la tercera secuencia marcadora y/o la cuarta secuencia marcadora son marcadores de resistencia a antibióticos, entonces en una realización preferida, la primera célula procariota se puede cultivar adicionalmente en presencia de un segundo, un tercer y/o un cuarto antibiótico a los que los productos génicos de la segunda secuencia marcadora, la tercera secuencia marcadora y la cuarta secuencia marcadora, respectivamente, confieren resistencia. Preferiblemente, la primera célula procariota se cultiva no sólo en presencia de fleomicina o espectinomicina o tetraciclina, si no además también en presencia de cloranfenicol. Lo más preferiblemente, la primera célula procariota se hace crecer y propagar en presencia de fleomicina, espectinomicina, cloranfenicol y tetraciclina.

Después de cultivar las células procariotas en condiciones selectivas, se aíslan las segundas células procariotas que contienen una molécula cointegrada o híbrida formada por las moléculas de ADN receptora y donadora. Este cointegrado contiene las secuencias de ADN recombinantes. La presencia de las secuencias de ADN cointegradas y/o recombinantes se puede verificar y detectar por varios medios tales como análisis de perfiles de restricción, amplificación por PCR y/o secuenciación. Si, por ejemplo, la segunda secuencia marcadora de la molécula donadora y la tercera o cuarta secuencias marcadoras de la molécula receptora son secuencias de reconocimiento de cebador únicas, entonces fragmentos específicos del cointegrado se pueden amplificar por PCR usando cebadores adecuados que reconocen estas secuencias de marcadores, con el fin de detectar la presencia de la respectiva combinación de marcadores. Si no se ha formado cointegrado, es decir, no se ha producido recombinación, estos fragmentos no se pueden detectar. Si, por ejemplo, la segunda secuencia marcadora de la molécula donadora y la tercera y cuarta secuencias marcadoras de la molécula receptora son sitios de escisión de enzimas de restricción únicos, entonces el cointegrado se puede someter a un análisis con enzimas de restricción, con el fin de detectar los fragmentos de ADN específicos. Si no se ha formado cointegrado, es decir, no se ha producido recombinación, estos fragmentos no se pueden detectar.

De acuerdo con la invención, la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas contenidas en la molécula de ADN híbrida de la segunda célula procariota, se pueden aislar y/o analizar y/o seleccionar. La primera y segunda secuencias de ADN recombinadas obtenidas se pueden aislar, por ejemplo, por amplificación por PCR o escisión con enzimas de restricción adecuadas. Un análisis de la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas contenidas en la molécula de ADN híbrida se puede llevar a cabo, por ejemplo, por métodos de secuenciación.

De acuerdo con la invención, la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas aisladas se pueden insertar otra vez en una molécula de ADN donadora y una molécula de ADN receptora, respectivamente, y someter a otro ciclo de recombinación usando el procedimiento de la invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una procedimiento para generar proteínas, enzimas y secuencias no codificantes nuevas con funciones y propiedades nuevas o mejoradas, por el cual secuencias que codifican proteínas conocidas o secuencias no codificantes conocidas se someten a uno o más ciclos de recombinación usando el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes en una célula hospedante procariota. La presente invención también se refiere a las proteínas, enzimas y secuencias no codificantes, generadas por uno cualquiera de los procedimientos de la invención.

La presente invención también se refiere al plásmido de B. subtilis pMIX91, que es un derivado del plásmido pIL253 y que puede replicarse en B. subtilis, pero no en E. coli, y que comprende el marcador spec^{R} y el marcador phleo^{R} y los sitios de restricción ScaI, PpuMI y EcoO109I para insertar una secuencia de ADN extraña.

La presente invención también se refiere al plásmido de B. subtilis p-MIX101, que es un derivado del plásmido pIL253 y que puede replicarse en B. subtilis, pero no en E. coli, y que comprende la secuencia marcadora tc^{R} y los sitios de restricción XhoI y Pstl para insertar una secuencia de ADN extraña.

La presente invención también se refiere a la cepa DSM4393 de B. subtilis, que contiene el plásmido pMIX91 de B. subtilis (depositado en el DSMZ, Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania el 21 de Febrero de 2005, SB202pMIX91) y a la cepa 1A423 de B. subtilis, que contiene el plásmido pMIX101 de B. subtilis (depositado en el DSMZ, Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, el 21 de Febrero de 2005, 1A423pMIX101).

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los plásmidos pMIX91 y pMIX101 de B. subtilis, respectivamente, como moléculas de ADN donadora en el procedimiento de la invención, es decir, el uso del plásmido pMIX91 o pMIX101 para generar y/o detectar secuencias de ADN recombinantes en una célula hospedante procariota, preferiblemente en una célula de E. coli.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los plásmidos de E. coli pACYC184 o pMIX100 o derivados de los mismos, como molécula de ADN receptora en el procedimiento de la invención, es decir al uso del plásmido pACYC184 o pMIX100 para generar y/o detectar secuencias de ADN recombinantes en una célula hospedante procariota, preferiblemente en una célula de E. coli.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que se puede usar para llevar a cabo el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinadas en una célula hospedante procariota. En una primera realización el kit comprende al menos un primer envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli como célula hospedante procariota, un segundo envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli que contienen el plásmido pACYC184 de E. coli o el plásmido de pMIX100 E. coli , que se puede usar como molécula de ADN receptora, y un tercer envase que comprende células de la cepa DSM4393 de B. subtilis, que contienen el plásmido pMIX91 de B. subtilis, o células de la cepa 1A423 de B. subtilis, que contienen el plásmido pMIX101 de B. subtilis, que se puede usar como molécula de ADN donadora. En una segunda realización de la invención el kit comprende al menos un primer envase que comprende células de la cepa MXP1 de E. coli, que es un mutante MutS^{-} de la cepa AB1157, como célula hospedante procariota, un segundo envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli que contienen el plásmido pACYC184 o pMIX100 y un tercer envase que comprende células de la cepa DSM4393 de B. subtilis, que contienen el plásmido pMIX91, o células de la cepa 1A423 de B. subtilis, que contienen el plásmido pMIX101. En otra realización más el kit comprende al menos un primer envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli o la cepa MXP1 de E. coli, un segundo envase que comprende ADN del plásmido pACYC184 o pMIX100 de E. coli
y un tercer envase que comprende ADN del plásmido pMIX91 de B. subtilis o el plásmido pMIX101 de B. subtilis.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un gen híbrido y/o una proteína codificada por un gen híbrido en una célula procariota. El procedimiento para producir un gen híbrido y/o la proteína codificada comprende la etapa de llevar a cabo el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes, de modo que el gen híbrido y/o la proteína codificada por el gen híbrido son producidos en la célula procariota. Después de expresión, se seleccionan en la célula procariota y/o se aíslan de la misma el gen híbrido y/o la proteína codificada.

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La presente invención también se refiere a un gen híbrido que se puede obtener por el procedimiento de la invención para producir un gen híbrido o el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes.

La presente invención también se refiere a una proteína, que es codificada por un gen híbrido, que se puede obtener por el procedimiento de la invención para producir un gen híbrido o el procedimiento de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes, y/o que se puede obtener por el procedimiento de la invención para producir una proteína codificada por un gen híbrido.

La presente invención se ilustra mediante la siguiente lista de secuencias, figuras y ejemplos.

La Figura 1 ilustra de forma esquemática el procedimiento de la invención para generar y/o detectar recombinación entre dos secuencias de ADN. La primera secuencia, el gen oxa7, está presente en el plásmido pTG2-phleo de B. subtilis como molécula de ADN donadora. pTG2-phleo lleva los marcadores spec^{R} y phleo^{R} que confieren resistencia a la espectinomicina y fleomicina. Por electroporación se introduce pTG2-phleo en una célula hospedante de E. coli que contiene el plásmido pTG3 como molécula de ADN receptora. pTG3 contiene la segunda secuencia de ADN, el gen oxa11, y el marcador cm^{R} que confiere resistencia al cloranfenicol. Después de introducir pTG2-phleo la célula se cultiva en presencia de espectinomicina y fleomicina que fuerza a la formación de un cointegrado entre los dos plásmidos y recombinación simultáneamente entre los genes. Por lo tanto, tras el cultivo se obtiene una célula de E. coli que contiene un plásmido dímero que contiene las secuencias de ADN recién recombinadas R1 y R2. Las secuencias de ADN recombinadas se pueden analizar por análisis del perfil de restricción, amplificación por PCR de los genes recombinantes R1 y R2 y/o secuenciación de R1 y R2.

La Figura 2 muestra mapas físicos de los plásmidos pUC19-phleo, pic156, pACYC184 y pIL253 usados para construir plásmidos adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención.

La Figura 3 muestra mapas físicos de plásmidos que se construyeron para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Los plásmidos pMIX96 y pMIX 97 no se representan puesto que son como pMIX95 pero con oxa5 y oxa1, respectivamente, en lugar de oxa11. pMIX99 es como pMIX98, pero con oxa1 en lugar de oxa11.

La Figura 4 muestra la estructura de los genes obtenidos por el procedimiento de recombinación in vivo de la invención entre genes oxa que divergen un 22%.Se detallan tramos de identidad de secuencia en las que tienen lugar entrecruzamientos.

La Figura 5 muestra la estructura del plásmido pMIX100 de E. coli que se puede usar como molécula de ADN receptora en una célula hospedante de E. coli. PMIX100 lleva el origen de replicación del plásmido pACYC184, así como el gen de resistencia al cloranfenicol del mismo. PMIX100 también lleva el gen lacZ de pBluescript SK+.

La Figura 6 muestra la estructura del plásmido pMIX101 de B. subtilis que es un derivado del plásmido pIL253 de B. subtilis y que se puede usar como molécula de ADN donadora en una célula hospedante de E. coli. pMIX101 lleva el marcador Erm^{R} que confiere resistencia a la eritromicina y Tc^{R} que confiere resistencia a la tetraciclina. El gen de resistencia a la tetraciclina se amplificó a partir del plásmido pACYC184.

La Figura 7 muestra la estructura del plásmido de control de la eficacia de transformación pMIX102. pMIX102, un derivado de pBluescript SK+, contiene el gen Tc^{R} amplificado a partir del plásmido pACYC184. En pMIX102 el gen Tc^{R} es conducido por el promotor plac.

La Figura 8 muestra la estructura del plásmido de control de la eficacia de transformación pMIX103. pMIX103, un derivado de pBluescript SK+, contiene el gen Tc^{R} amplificado a partir del plásmido pACYC184. En pMIX103 el gen Tc^{R} se clona en dirección opuesta a plac. Por lo tanto, el gen es expresado a partir de su propio promotor.

La Figura 9 ilustra de forma esquemática la estrategia para clonar los genes oxa7, oxa11 y oxa5 en el plásmido pMIX100 de E. coli y en el plásmido pMIX101 de B. subtilis. Para clonar oxa7 y oxa11 en pMIX100 se amplificaron los genes usando cebadores que contenían PstI o Xhol en sus extremos 5'. Después de digestión con estas enzimas, los fragmentos de ADN amplificados se ligaron independientemente con pMIX100, que previamente se había cortado con PstI + Xhol. Se electroporaron células competentes de E. coli DHB10 con la mezcla de ligamiento, y se seleccionaron fenotípicamente colonias que albergaban clones positivos por la resistencia a cloranfenicol/color blanco en placas LB que contenían Cm (30 \mug/ml) + X-Gal (80 \mug/ml) + IPTG (0,5 mM). Se obtuvieron los ADN plasmídicos y se analizaron por cartografía de restricción. Los resultados confirmaron que pMIX104 lleva oxa7, pMIX106 lleva oxa11 y pMIX107 lleva oxa5. Para la clonación en el plásmido pMIX101 de B. subtilis, oxa7 se obtuvo como un fragmento de 0,9 kb de pMIX104 por restricción con PstI y Xhol y se ligó con pMIX101, que previamente se había cortado con las mismas enzimas. Después de la transformación de células competentes 1A423 de B. subtilis con el producto de ligamiento, las células se seleccionaron en LB que contenía eritromicina 0,5 \mug/ml (Erm).

Las SEQ ID No. 1 y 2 muestran las secuencias de los cebadores OLG1 y OLG2, respectivamente, para la amplificación de oxa7 y la introducción de los sitios de restricción ScaI y PpuMI en los extremos 5' y 3' respectivamente.

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Las SEQ ID No. 3 y 4 muestran las secuencias de los cebadores OLG3 y OLG4, respectivamente, para la amplificación de oxa11 y la introducción de los sitios de restricción BamHI y EcoO109I en los extremos 5' y 3' respectivamente.

Las SEQ ID No. 5 y 6 muestran las secuencias de los cebadores OLG5 y OLG6, respectivamente, para la amplificación de oxa5 y la introducción de los sitios de restricción BamHI y EcoO109I en los extremos 5' y 3' respectivamente.

Las SEQ ID No. 7 y 8 muestran las secuencias de los cebadores OLG7 y OLG8, respectivamente, para la amplificación de oxa1 y la introducción de los sitios de restricción BamHI y EcoO109I en los extremos 5' y 3' respectivamente.

Las SEQ ID No. 9 y 10 muestran las secuencias de los cebadores OLG9 y OLG10, respectivamente, para la amplificación de oxa11 y la introducción de los sitios de restricción ScaI y EcoO109I en los extremos 5' y 3' respectivamente.

La SEQ ID No. 11 muestra la secuencia del cebador OLG11, que se usó junto con el cebador OLG8 (SEQ ID No. 8) para la amplificación de oxa1 y la introducción de los sitios de restricción ScaI y EcoO109I en los extremos 5' y 3', respectivamente.

Las SEQ ID No. 12 y 13 muestran las secuencias de los cebadores OLG12 y OLG13, respectivamente, para la amplificación del gen recombinante R1 contenido en el plásmido híbrido pMIX93.

La SEQ ID No. 14 muestra la secuencia del cebador OLG14, que se usó junto con el cebador OLG12 (SEQ ID No. 12) para la amplificación del gen recombinante R1 contenido en uno de los plásmidos híbridos pMIX95, pMIX96 y pMIX97.

La SEQ ID No. 15 muestra la secuencia del cebador OLG15, que se usó junto con el cebador OLG17 (SEQ ID No. 17) para la amplificación del gen recombinante R2 contenido en el plásmido híbrido pMIX93.

La SEQ ID No. 16 muestra la secuencia del cebador OLG16, que se usó junto con el cebador OLG17 (SEQ ID No. 17) para la amplificación del gen recombinante R2 contenido en uno de los plásmidos híbridos pMIX95, pMIX96 y pMIX97.

La SEQ ID No. 17 muestra la secuencia del cebador OLG17.

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Ejemplo 1 Recombinación in vivo de genes heterólogos usando un sistema de plásmido doble (E. coli/B. subtilis) por el cual se seleccionan secuencias de ADN recombinante por resistencia a la espectinomicina y/o fleomicina 1. Material y métodos 1.1 Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este Ejemplo se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente.

TABLA 1 Cepas bacterianas

1

TABLA 2 Plásmidos

2

1.2 Condiciones de crecimiento y medios de cultivo

Tanto las cepas de E. coli como de B. subtilis se cultivaron a 37ºC en medio LB (Difco Laboratories, Detroit, EE.UU.). Cuando se usó medio en las placas (LBA), se añadieron 15 g de agar (Difco) por litro. Cuando el medio requerido se complementó con antibióticos, las concentraciones finales fueron las siguientes: tetraciclina (Sigma-Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, Francia), 12,5 \mug/ml; cloranfenicol (Sigma-Aldrich Chimie), 30 \mug/ml; ampicilina (Sigma-Aldrich Chimie), 100 \mug/ml; eritromicina (Sigma-Aldrich Chimie), 0,5 \mug/ml; espectinomicina (Sigma-
Aldrich Chimie), 75 \mug/ml; fleomicina (Euromedex, Strasbourg, Francia), 2 \mug/ml. Cuando el LBA se complementó con espectinomicina más fleomicina, las concentraciones finales fueron 60 y 1 \mug/ml, respectivamente.

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1.3 Manipulación de ADN y microorganismos Transducción

Se construyó la cepa MIXP1 de E. coli usando la transducción mediada por P1 (3).

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Transformación

Se introdujeron plásmidos en cepas de E. coli por electrotransformación usando un Eppendorf Electroporator 2510 (Eppendorf AG, Hamburg, Alemania) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se prepararon y transformaron células competentes de B. subtilis como describen Yasbin et al. (9)

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Manipulaciones de ADN

Se siguieron los protocolos establecidos para las técnicas de biología molecular (4). Las enzimas para las manipulaciones de ADN se adquirieron en New England Biolabs (Beverly, MA, EE.UU.), MBI Fermentas (Vilnius, Lituania), Promega (Madison, Wis.) o Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.) y se usaron como recomendaban los fabricantes. Cuando fue necesario, el ADN digerido con endonucleasas de restricción se purificó en geles de agarosa usando el kit NuceloSpin Extract (Machery-Nagel).

Se aisló el ADN plasmídico de E. coli usando el kit de NucleoSpin kit (Machery-Nagel GmbH & Co., Düren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para aislar el ADN plasmídico de B. subtilis se usó el mismo kit pero se llevó a cabo una primera etapa de lisis incubando las células con lisozima 2 mg.ml^{-1} 30 min a 37ºC.

Los cebadores usados fueron sintetizados por Proligo France SAS (Paris, Francia).

Las secuencias de nucleótidos fueron determinadas en ambas direcciones por Genome Express (Meylan, Francia). Las secuencias se analizaron mediante el paquete de Infobiogen (Genopole d'Evry, Evry, Francia). Se usó el programa ClustalW para las comparaciones de secuencias.

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Amplificaciones por PCR

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando un aparato Mastercycler Gradient (Eppendorf AG, Hamburg, Alemania). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 50 \mul usando la ADN polimerasa Herculase Enhanced de alta fidelidad (Strategene) en las siguientes condiciones: 96ºC durante 3 min, 35 ciclos de 96ºC durante 30 s, temperatura de reasociación durante 30 s, 72ºC durante 1 min, y una etapa final de elongación a 72ºC durante 10 min. La temperatura de reasociación se determinó restando 5ºC a la Tm menor de los cebadores usados. Cuando era necesario, los productos de la PCR se purificaban usando el kit NucleonSpin Extract (Machery-Nagel). Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,7% (Sigma).

2. Estrategia general

Este experimento se llevó a cabo con el fin de generar moléculas nuevas que presentan propiedades ventajosas, por recombinación in vivo de genes parentales, que comparten diferentes grados de identidad de secuencia. La estrategia usada es la siguiente:

Los genes que se van a recombinar son transportados por dos plásmidos diferentes que no muestran homología en sus secuencias de nucleótidos. El primero es un plásmido replicativo de E. coli que confiere resistencia al cloranfenicol (Cm) o la tetraciclina (Tc). Se basa en el vector de clonación estándar pACYC184, un plásmido de número de copias bajo obtenido de New England Biolabs.

El segundo es un plásmido de Bacillus subtilis derivado de pIL253 (Simon and Chopin, 1988). No puede replicarse en E. coli y lleva dos marcadores de resistencia a antibióticos para la espectinomicina (Spc) y la fleomicina (Phleo) respectivamente.

Para recombinar las parejas de genes heterólogos que llevan estos dos vectores, el plásmido de B. subtilis se introduce por electroporación en cepas de E. coli que albergan el plásmido replicativo. Esto se muestra de forma esquemática en la Figura 1. Estas cepas son competentes (+) o deficientes (-) en el sistema de reparación de apareamiento erróneo (NMR), que controla tanto la mutagénesis como la recombinación.

Después de electroporación, se seleccionan los transformantes con antibióticos para los que los plásmidos de B. subtilis confieren resistencia (Spc y Phleo). Dicha presión selectiva fuerza la recombinación entre genes heterólogos, puesto que sólo las células que albergan un cointegrado formado entre los plásmidos de B. subtilis y de E. coli pueden crecer en estas condiciones. El plásmido híbrido confiere resistencia a Spc y Phleo y se replica a partir del origen de E. coli, puesto que el de B. subtilis no es funcional. Además, lleva los dos genes recombinantes R1 y R2.

La primera etapa era la clonación en los vectores de E. coli y B. subtilis de los genes elegidos inicialmente como objetivo para evaluar la eficacia de la recombinación.

Los experimentos de recombinación entre los genes oxa se llevaron a cabo tanto en cepas naturales como deficientes en la reparación de apareamiento erróneo. Se hicieron experimentos entre parejas de genes idénticos o divergentes.

Los ADN plasmídicos se irradiaron con luz UV antes de la electroporación, puesto que se mostró que la irradiación conduce a un aumento de 10 veces de las frecuencias de recombinación.

La recombinación también se llevó a cabo en cepas hechas temporalmente mutágenas por tratamiento con 2-aminopurina. La 2-aminopurina es un análogo de adenina que se incorpora en el ADN durante el crecimiento de las bacterias y satura el sistema de NMR. Por lo tanto, se genera un fenotipo mutágeno transitorio, puesto que después de eliminar la 2-aminopurina se recupera el estado natural. Este control temporal de la actividad de reparación del apareamiento erróneo proporciona un fondo estable a las cepas usadas en recombinación evitando la acumulación de mutaciones en sus genomas.

3. Resultados Construcción del vector de B. subtilis

Con el fin de construir un vector de B. subtilis para llevar genes objetivo para la recombinación, se clonaron dos marcadores génicos que conferían resistencia a los antibióticos espectinomicina (spec^{R}) y fleomicina (phleo^{R}), respectivamente, en el plásmido pIL253 después de una estrategia de clonación de dos etapas.

Primero se obtuvo el gen spec^{R} como un fragmento Sacl de 1294 pb de longitud a partir del plásmido pic156. El fragmento se purificó y después se ligó a pIL253 hecho digerir con Sacl. Se transformaron células competentes DS4393 de B. subtilis con la mezcla de ligamiento y se seleccionaron los transformantes en placas de LBA que contenían espectinomicina 75 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico obtenido de los transformantes confirmó que albergaban derivados de pILF253 que llevan el gen spec^{R}.

En una segunda etapa, el gen phleo^{R} se clonó en pIL253-spec. El plásmido pUC19-phleo se hizo digerir con las enzimas de restricción EcoRI y SalI y el fragmento de 574 pb de longitud correspondiente a phleo^{R} se purificó en gel y se ligó a pIL253-spec, previamente hecho digerir con las mismas dos enzimas. Se transformaron células competentes DSM4393 con la mezcla de ligamiento y después se seleccionaron los transformantes en placas de LBA que contenían fleomicina 60 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico obtenido de los transformantes demostró que albergaban el plásmido de 6,69 kb esperado, que llevaba los genes tanto spec^{R} como phleo^{R}. El plásmido se llamó pMIX91 (véase la Figura 3).

Construcción del vector de control de la eficacia de transformación

Se construyó un vector para usar como un control de la eficacia de transformación de cepas de E. coli con selección con espectinomicina y fleomicina en experimentos de recombinación. El vector se construyó como sigue: el gen de resistencia a la espectinomicina (spec^{R}) se obtuvo como un fragmento de 1,25 kb después de digestión de pic156 con BamH1 y EcoRI. Se clonó en los sitios correspondientes de pUC-phleo, al lado del gen de resistencia a la fleomicina (phleo^{R}). Después de electroporación de células competentes DH10B de E. coli con la mezcla de ligamiento, se seleccionaron las colonias resistentes a espectinomicina y fleomicina en placas de LBA que contenían ambos antibióticos con concentraciones finales de 60 \mug/ml y 1 \mug/ml, respectivamente. El análisis de restricción del ADN plasmídico aislado de los transformantes mostró que se correspondían con la construcción esperada de 4,46 kb de longitud, que se llamó pMIX92 (véase la Figura 3).

Clonación de genes que codifican \beta-lactamasas en vectores de E. coli y B. subtilis

Se eligieron cuatro genes que codificaban \beta-lactamasas como objetivo para evaluar las eficacias de recombinación en cepas de E. coli tanto naturales como mutantes MutS^{-}. Dichos genes, oxa7 (número de acceso en GenBank X75562), oxa11 (número de acceso en GenBank Z22590), oxa5 (número de acceso en GenBank X58272) y oxa1 (número de acceso en GenBank J02967) presentan diferentes grados de divergencia en sus secuencias de nucleótidos. La secuencia de oxa1 y las secuencias de oxa5, oxa7 y oxa11, respectivamente, divergen en 40%. La secuencia de oxa5 y las secuencias de oxa7 y oxa11, respectivamente, divergen en 22%. La secuencia de oxa7 y la secuencia de oxa11 divergen en 5%.

Los cuatro genes oxa se clonaron en el plásmido pACYC184 de E coli, mientras que oxa7, oxa11 y oxa1 se clonaron también en el plásmido pMIX91 de B. subtilis. La clonación de los genes se hizo como sigue: oxa7 se amplificó por PCR con cebadores diseñados para introducir los sitios ScaI y PpuMI en los extremos 5' y 3', respectivamente, del ADN amplificado (cebadores OLG1 con la SEQ ID No. 1 y OLG2 con la SEQ ID No. 2). El producto de la PCR se hizo digerir con esas enzimas de restricción y el fragmento resultante de 991 pb de longitud se ligó a pMIX91, previamente cortado con las mismas enzimas. Se transformaron células competentes DSM4393 de B. subtilis con la mezcla de ligamiento y la selección de los transformantes se hizo en placas de LBA que contenían espectinomicina 75 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico obtenido de los transformantes demostró que albergaban el plásmido esperado de 6,89 kb pMIX94 que llevaba oxa7 (véase la Figura 3).

Para clonar oxa7 en el vector pACYC184 de E. coli, el producto de la PCR descrito antes, así como pACYC184, se hicieron digerir con PpuMI y ScaI. Los extremos romos se generaron a partir de ADN digeridos usando el fragmento Klenow de ADN polimerasa I, y se hizo el ligamiento entre ellos. Células competentes DH10B de E. coli se electroporaron con la mezcla de ligamiento, y los transformantes se seleccionaron en placas de LBA que contenían tetraciclina 12,5 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico de los transformantes mostró que se correspondían con la construcción esperada de 4,33 kb de longitud, que se llamó pMIX93 (véase la figura 3).

Para clonar oxa11, oxa5 y oxa1 en pACYC184, los genes se amplificaron por PCR usando cebadores diseñados para introducir los sitios BamHI y EcoO1091 en los extremos 5' y 3', respectivamente, del ADN amplificado. Se usaron las parejas de cebadores OLG3 (SEQ ID No. 3)/OLG4 (SEQ ID No. 4), OLG5 (SEQ ID No. 5)/OLG6 (SEQ ID No. 6) y OLG7 (SEQ ID No. 7)/OLG8 (SEQ ID No. 8) para amplificar oxa11, oxa5 y oxa1, respectivamente. Los productos de la PCR se hicieron digerir con BamHI y EcoO1091 y los fragmentos resultantes de 997 pb (oxa11) y 830 pb (oxa5) y 936 pb (oxa1) se ligaron independientemente a pACYC184, previamente cortado con las mismas enzimas. Células competentes DH10B de E. coli se electroporaron con mezclas de ligamiento, y los transformantes se seleccionaron en placas de LBA que contenían cloranfenicol 30 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico aislado de los transformantes mostró que se correspondían con los plásmidos esperados de 6,89 kb, pMIX95 (3,72 kb), pMIX96 (3,55 kb) y pMIX97 (3,66 kb) (véase la Figura 3).

Para clonar oxa11 y oxa1 en pMIX91, los genes se amplificaron por PCR usando cebadores diseñados para introducir los sitios ScaI y EcoO109I en los extremos 5' y 3', respectivamente, del ADN amplificado. Se usaron las parejas de cebadores OLG9 (SEQ ID No. 9)/OLG10 (SEQ ID No. 10), y OL11 (SEQ ID No. 11)/OLG8 para amplificar oxa11 y oxa1 respectivamente. Los productos de la PCR se hicieron digerir con ScaI y EcoO109I y el fragmento resultante de 995 pb (oxa11) y 934 pb (oxa1) se ligaron independientemente a pMIX91, previamente cortado con las mismas enzimas. Se transformaron células competentes DSM4393 de B. subtilis con la mezcla de ligamiento y la selección de los transformantes se hizo en placas de LBA que contenían espectinomicina 75 \mug.ml^{-1}. El análisis de restricción del ADN plasmídico obtenido de los transformantes demostró que se correspondía con los plásmidos esperados pMIX98 (6,89kb) y pMIX99 (6,83 kb). Véase la Figura 3.

Recombinación in vivo de genes oxa genes en E. coli natural comparado con mutante MutS^{-}

En una primera etapa, células competentes AB1157 de E. coli y su mutante MutS^{-}, E. coli MXP1, se transformaron independientemente por electroporación con plásmidos derivados de pACYC184 que llevaban genes oxa, pMIX93, pMIX95, pMIX96 o MIX97. Los transformantes se seleccionaron basándose en su resistencia a la tetraciclina o al cloranfenicol. La presencia de los plásmidos adecuados se confirmó posteriormente por análisis de restricción y/o de PCR.

En una segunda etapa, se prepararon células competentes de cepas tanto naturales como MutS^{-} que albergaban plásmidos replicativos, a partir de medios selectivos que contenían tetraciclina o cloranfenicol. Después, dichas células competentes se transformaron independientemente por electroporación con los plásmidos de B. subtilis que llevaban genes oxa, pMIX94, pMIX98 o pMIX99.

Después de electroporación, los transformantes se seleccionaron en placas de LBA que contenían antibióticos para los cuales el plásmido de B. subtilis confería resistencia: espectinomicina y fleomicina, con concentraciones finales de 60 \mug.ml^{-1} y 1 \mug.ml^{-1}, respectivamente. Dicha presión selectiva fuerza a la recombinación entre genes oxa, puesto que solo las células que albergan un plásmido híbrido formado entre los plásmidos de B. subitlis y de E. coli pueden crecer en esas condiciones. Las placas se incubaron toda la noche a 37ºC, y después el ADN plasmídico de los transformantes se analizó por digestión con enzimas de restricción, con el fin de confirmar que albergaban plásmidos híbridos (de aproximadamente 10,5 kb de longitud) que llevaban dos genes recombinantes, R1 y R2. En algunos casos, los genes recombinantes se amplificaron por PCR y se secuenciaron. Si el plásmido residente era pMIX93 R1 se amplificó con OLG12 (SEQ ID No. 12)/OLG13 (SEQ ID No. 13) y R2 con OLG15 (SEQ ID No. 15)/OLG17 (SEQ ID No. 17); Si el plásmido residente era pMIX95, pMIX96 o pMIX97, R1 se amplificó con OLG12/OLG14 (SEQ ID No. 14) y R2 con OLG16 (SEQ ID No. 16)/OLG17.

En experimentos de recombinación el plásmido pMIX91 de B. subtilis, se usó como un control negativo, mientras que el plásmido pMIX92 de E. coli se usó como control de la eficacia de transformación con selección con espectinomicina y fleomicina. pMIX92 puede replicarse en cepas que albergan plásmidos derivados de pACYC184 puesto que sus orígenes de replicación (ColE1 y p15, respectivamente) son compatibles. Los ADN plasmídicos se irradiaron con luz UV antes de la electroporación (200 J/m^{2}), puesto que se mostró que la irradiación conduce a un aumento de 10 veces de las frecuencias de recombinación.

Las frecuencias de recombinación se calcularon dividiendo la eficacia de transformación obtenida con plásmidos de B. subtilis entre la eficacia de transformación obtenida con el vector de control pMIX92. Las eficacias de transformación se calcularon a su vez como número de unidades formadoras de colonia (ufc) obtenidas por \mug de ADN en las condiciones descritas previamente.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 3. En la cepa natural, se obtuvieron recombinantes en experimentos usando genes oxa idénticos o con 5% de divergencia, mientras que en el mutante MutS^{-}, la recombinación sólo se produjo entre genes con 22% de divergencia.

TABLA 3 Frecuencias de recombinación in vivo obtenidas entre genes oxa en cepas de E. coli tanto naturales como MutS^{-}

3

Recombinación in vivo de genes oxa en E. coli natural comparado con tratada con 2-aminopurina (2-AP)

En una primera etapa, se transformaron células competentes AB1157 de E. coli por electroporación con plásmidos derivados de pACYC184 que llevaban el gen oxa 11, pMIX95. Los transformantes se seleccionaron basándose en su resistencia. La presencia de los plásmidos adecuados se confirmó por análisis de restricción y/o de PCR.

En una segunda etapa, se prepararon células competentes de esta cepa en presencia de 2-AP 200 \mug/ml y se electroporaron independientemente con los plásmidos de B. subtilis pMIX94 que llevaba oxa7 o pMIX98 que llevaba oxa11.

El plásmido de B. subtilis pMIX91 se usó como un control negativo, mientras que el plásmido de E. coli pMIX92, que llevaba los marcadores Spc^{R} y Phleo^{R} se usó como control de la eficacia de transformación. Los ADN plasmídicos se irradiaron con luz UV antes de electroporación con el fin de aumentar la frecuencia de recombinación.

Los resultados se resumen en la Tabla 4. En la cepa natural, se obtuvieron recombinantes en experimentos usando genes oxa idénticos, mientras que en la cepa tratada con 2-AP la recombinación sólo se produjo entre genes con 5% de divergencia.

TABLA 4 Frecuencias de recombinación in vivo obtenidas entre genes oxa en cepas de E. coli tanto naturales como tratadas con 2-AP

4

Hay que destacar que se produjo recombinación entre genes con 22% de divergencia, en los que el tramo más largo de identidad de secuencia era de 22 nucleótidos (oxa5/oxa11) y 18 nucleótidos (oxa5/oxa7), respectivamente (véanse las Figuras 5 y 6). Se ha publicado que la recombinación se hace ineficaz por debajo de una longitud de homología mínima, conocida como MEPS (segmento mínimo de procesamiento eficaz). La longitud del MEPS varía dependiendo de la ruta de recombinación, pero se ha descrito que está en el intervalo de 23 a 90 pares de bases (5).

El análisis de secuencia de los genes R1 y R2 que llevan los 54 plásmidos híbridos obtenidos en experimentos que implican genes con 5% o 22% de divergencia, mostró que 46 de los plásmidos híbridos eran diferentes entre sí. Este resultado indica que corresponden a diferentes sucesos de recombinación, y por consiguiente, que se ha generado un grado alto de diversidad genética por recombinación in vivo.

La mayoría de los genes recombinantes se generaron por entrecruzamientos sencillos no recíprocos en diferentes tramos de identidad de secuencia en el intervalo de 4 a 101 nucleótidos. En algunos casos, se observaron entrecruzamientos múltiples, que producían genes mosaico R1 o R2. Los genes recombinantes obtenidos entre oxa7/oxa5 y oxa11/oxa5 se representan en la Figura 4.

La comparación de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes recombinantes pusieron de manifiesto también que el 53% de ellos correspondían a nuevos genes oxa (véase la Tabla 4). Puesto que no se generaron desplazamientos del marco de lectura o codones de parada durante la recombinación, pudieron codificar de forma putativa 38 \beta-lactamasas nuevas funcionales.

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TABLA 4 Comparación de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de genes oxa recombinantes obtenidos por recombinación in vivo

5

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Ejemplo 2 Recombinación in vivo de genes heterólogos de sistema de plásmidos doble (Escherichia coli/Bacillus subtilis) en la que las secuencias de ADN recombinantes se seleccionan por resistencia a la tetraciclina

Se diseñó otro sistema de plásmidos doble para verificar los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 y facilitar la clonación y recombinación de genes. Este sistema se basa en la selección de células resistentes a la tetraciclina.

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1. Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este Ejemplo se muestran en la Tabla 5 y Tabla 6, respectivamente.

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TABLA 5 Cepas bacterianas

6

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TABLA 6 Plásmidos

7

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2. Resultados 2.1 Construcción del plásmido de E. coli pMIX100

El plásmido pMIX100 lleva el origen de replicación de pACYC184, así como su gen de resistencia al cloranfenicol. pMIX100 también lleva el gen lacZ de pBluescript SK+, que facilita la selección en los experimentos de clonación. lacZ codifica un fragmento de la \beta-galactosidasa que proporciona complementación \alpha para la selección azul/blanco de recombinantes en un medio que contiene X-Gal yIPTG. Así pues, las colonias que albergan pMIX100 deberían ser azules en este medio, y las que llevan el plásmido con un gen integrado en el policonector (MCS) deberían ser blancas. El mapa físico del plásmido pMIX100 se muestra en la Figura 5.

2.2 Construcción del plásmido de B. subtilis pMIX101

El plásmido pMIX101 es un derivado del plásmido pIL253 de B. subtilis. Puesto que el marcador de pIL253 Erm^{R}, que confiere resistencia a la eritromicina no es útil en E. coli, se introdujo el marcador de resistencia a la tetraciclina que permite la selección de moléculas híbridas en experimentos de recombinación. El gen de resistencia a la tetraciclina se amplificó a partir del plásmido pACYC184. Por lo tanto, pMIX101 lleva dos marcadores: Erm^{R}, como un marcador de selección en B. subtilis para la clonación de genes objetivo, y Tc^{R}, para seleccionar moléculas híbridas recombinantes en E. coli. El mapa físico del plásmido pMIX101 se muestra en la Figura 6.

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2.3 Construcción de los plásmidos de control de la eficacia de transformación pMIX102 y pMIX103

Puesto que el vector de B. subtilis no puede replicarse en E. coli, es necesario un control de la eficacia de transformación para calcular la frecuencia de recombinación. Puesto que los recombinantes se seleccionarán por la resistencia a la tetraciclina, debe estar presente el mismo marcador en el vector de control. El plásmido pMIX102, un derivado de pBluescript SK+ contiene el gen Tc^{R} amplificado de pACYC184. En pMIX102 el gen Tc^{R} es conducido por el promotor plac. El mapa físico del plásmido pMIX102 se muestra en la Figura 7.

En el segundo vector de control pMIX103 el gen Tc^{R} se clona en la dirección opuesta a plac. Por lo tanto, este gen es expresado a partir de su propio promotor. El mapa físico del plásmido pMIX103 se muestra en la Figura 8.

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2.4 Clonación de oxa7, oxa11 y oxa5 en el plásmido de E. coli pMIX100

Para verificar los resultados de los experimentos de recombinación entre genes oxa con 0%, 5% y 22% de divergencia obtenidos en el Ejemplo 1, se clonaron oxa7, oxa11 y oxa5 en el plásmido de E. coli pMIX100. Estos genes se amplificaron usando cebadores que contenían PstI o XhoI en sus extremos 5'. Después de digestión con estas enzimas, los fragmentos de ADN amplificados se ligaron independientemente con pMIX100, que previamente se había cortado con PstI + Xhol. Se electroporaron células competentes DHB10 de E. coli con la mezcla de ligamiento, y se seleccionaron fenotípicamente colonias que albergaban clones positivos por resistencia a cloranfenicol/color blanco en placas de LB que contenían Cm (30 \mug/ml) + X-Gal (80 \mug/ml) + IPTG (0,5 mM). Para cada clonación de oxa se analizaron cinco de dichos transformantes.

Se obtuvieron los ADN plasmídicos y se analizaron por cartografía de restricción. Los resultados confirmaron que pMIX104 lleva oxa7, pMIX106 lleva oxa11 y pMIX107 lleva oxa5.

Para la clonación en el plásmido pMIX101 de B. subtilis, oxa7 se obtuvo como un fragmento de 0,9 kb de pMIX104 por restricción con PstI y Xhol y se ligó con pMIX101, que previamente se había cortado con las mismas enzimas. Después de transformación de células competentes 1A423 de B. subtilis con el producto de ligamiento, las células se seleccionaron en LB que contenía eritromicina 0,5 \mug/ml (Erm). Se obtuvo ADN plasmídico de 24 transformantes y se analizó por restricción. Los resultados confirmaron que todos los clones contenían el plásmido de 7 kb pMIX105.

La estrategia para clonar los genes oxa7, oxa11 y oxa5 en el plásmido pMIX100 de E. coli y en el plásmido pMIX101 de B. subtilis se muestra en la figura 9.

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2.5 Recombinación in vivo de genes oxa en E. coli natural comparado con el mutante MutS^{-}

Células competentes de E. coli AB1157 hsdR^{-} y su mutante MMR^{-}, E. coli AB1157 hsdR^{-} C\DeltamutS, se transformaron independientemente por electroporación con los plásmidos pMIX104 (oxa7), pMIX106 (oxa11) y pMIX107 (oxa5).

Para recombinar los genes oxa, se electroporaron cepas de E. coli que albergaban estos plásmidos con pMIX105 (oxa7). El plásmido de B. subtilis pMIX101 se usó como control negativo, mientras que el vector de E. coli pMIX102, que lleva el marcador Tc^{R}, se usó como el control de la eficacia de transformación con selección con tetraciclina. Todos los ADN se irradiaron con luz UV antes de electroporación con el fin de aumentar la frecuencia de recombinación.

Las frecuencias de recombinación se calcularon dividiendo la eficacia de transformación obtenida con plásmidos de B. subtilis entre la eficacia de transformación obtenida con el vector de control pMIX92. Las eficacias de transformación se calcularon a su vez como número de unidades formadoras de colonia (ufc) obtenidas por \mug de ADN en las condiciones descritas previamente.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 7. En la cepa natural, se obtuvieron recombinantes en experimentos usando genes oxa idénticos o con 5% de divergencia, mientras que en el mutante MutS^{-}, la recombinación sólo se produjo entre genes con 22% de divergencia.

TABLA 7 Frecuencias de recombinación in vivo obtenidas entre genes oxa en cepas de E. coli tanto naturales como MutS^{-}

8

Las frecuencias de recombinación estaban de acuerdo con las obtenidas con el sistema de plásmidos doble anterior.

Para confirmar la recombinación, se hicieron crecer transformantes pMIX105 en medio líquido que contenía tetraciclina (12,5 \mug/ml). El análisis de restricción del ADN plasmídico obtenido de estos cultivos mostró que albergaban dímeros que llevaban los genes recombinantes oxa, junto con plásmidos residentes (sea pMIX104 o pMIX106). Además, los genes recombinantes R1 y R2 se amplificaron satisfactoriamente por PCR a partir de ambas colonias y el ADN plasmídico usando cebadores específicos.

Los resultados demuestran que se generaron recombinantes con un segundo sistema de plásmidos doble usando resistencia a la tetraciclina como presión selectiva.

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<110> Mixis France S.A.

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<120> Generación de genes recombinantes en células procariotas usando dos elementos extracromosómicos

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<130> 18249

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 17

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip1cm

9

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 2

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\hskip1cm

10

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<210> 3

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 3

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\hskip1cm

11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 4

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\hskip1cm

12

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 5

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\hskip1cm

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 6

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\hskip1cm

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 7

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\hskip1cm

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 8

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\hskip1cm

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 9

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\hskip1cm

17

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<210> 10

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 10

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\hskip1cm

18

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<210> 11

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 11

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\hskip1cm

19

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<210> 12

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 12

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\hskip1cm

20

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<210> 13

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 13

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\hskip1cm

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 14

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\hskip1cm

22

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<210> 15

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip1cm

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 16

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\hskip1cm

24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 17

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\hskip1cm

25

Claims (48)

1. Procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes en procariotas, que comprende las etapas de:

a)

generar una primera célula procariota que contiene una molécula de ADN receptora extracromosómica, que comprende una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y que puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota, y una molécula de ADN donadora extracromosómica, que comprende una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar y al menos una primera secuencia marcadora que codifica un producto génico y que no puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota,

b)

cultivar la primera célula procariota en condiciones selectivas, que fuerzan a la formación de un cointegrado o molécula híbrida entre las moléculas de ADN receptora y donadora, y a la recombinación de las dos secuencias de ADN que se van a recombinar y que solo permiten el crecimiento y/o propagación de la célula si se expresa el producto génico de la primera secuencia marcadora, y

c)

aislar una segunda célula procariota hecha crecer y/o propagar en condiciones selectivas y que contiene una molécula de ADN híbrida con al menos la primera secuencia marcadora y una primera y segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y segunda secuencias de ADN,

en el que la célula procariota es deficiente de forma transitoria o permanente en el sistema de reparación de apareamiento erróneo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de ADN donadora y la molécula de ADN receptora son estructuras de ADN lineales o circulares diferentes, en particular plásmidos o bacteriófagos diferen-
tes.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la molécula de ADN donadora no tiene un origen de replicación.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la molécula de ADN donadora tiene un origen de replicación no funcional.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la molécula de ADN donadora es un plásmido de Bacillus subtilis, que no puede replicarse en E. coli.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la molécula de ADN donadora es el plásmido pMIX91 de B. subtilis que comprende el marcador spec^{R} y phleo^{R}, depositado en DSMZ (Ref. SB202pMIX91); o el plásmido pMIX101 de B. subtilis que comprende el marcador tc^{R} depositado en DSMZ (Ref. 1A423pMIX101).

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera secuencia marcadora de la estructura de ADN donadora se selecciona del grupo que consiste en un marcador nutricional, un marcador de resistencia a antibiótico y una secuencia que codifica una subunidad de una enzima.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el producto génico de la primera secuencia marcadora confiere resistencia a un antibiótico, a una célula que es sensible a ese antibiótico.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que la primera secuencia marcadora es spec^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la espectinomicina, o phleo^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la fleomicina, o tC^{R}, cuyo producto génico confiere a una célula resistencia a la tetraciclina.

10. Procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinantes en procariotas, que comprende las etapas de:

d)

generar una primera célula procariota que contiene una molécula de ADN receptora extracromosómica, que comprende una primera secuencia de ADN que se va a recombinar y que puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota, y una molécula de ADN donadora extracromosómica, que comprende una segunda secuencia de ADN que se va a recombinar y al menos una primera secuencia marcadora que codifica un producto génico y que no puede replicarse de forma autónoma en la célula procariota,

e)

cultivar la primera célula procariota en condiciones selectivas, que fuerzan a la formación de un cointegrado o molécula híbrida entre las moléculas de ADN receptora y donadora y la recombinación de dos secuencias de ADN que se van a recombinar y que solo permiten el crecimiento y/o propagación de la célula si se expresa el producto génico de la primera secuencia marcadora, y

\newpage

f)

aislar una segunda célula procariota hecha crecer y/o propagar en condiciones selectivas y que contiene una molécula de ADN híbrida con al menos la primera secuencia marcadora y una primera y segunda secuencias de ADN recombinadas debido a la recombinación entre la primera y segunda secuencias de ADN,

en el que la molécula de ADN donadora es el plásmido pMIX91 de B. subtilis que comprende el marcador spec^{R} y el marcador phleo^{R}, depositado en DSMZ (Ref. SB202pMIX91); o el plásmido pMIX101 de B. subtilis que comprende el marcador tc^{R} depositado en DSMZ (Ref. 1A423pMIX101).

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la molécula de ADN receptora es una estructura de ADN lineal o circular, en particular un plásmido o un bacteriófago.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que la célula procariota tiene un sistema de reparación de apareamiento erróneo funcional.

13. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que la célula procariota es deficiente en el sistema de reparación de apareamiento erróneo, de forma transitoria o permanente.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la molécula de ADN receptora es un plásmido, que puede replicarse en Escherichia coli.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la molécula de ADN receptora es el plásmido pACYC184 de E. coli o el plásmido pMIX100 de E. coli o un derivado de los mismos.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la molécula de ADN donadora y/o su origen de replicación derivan de una especie procariota distinta de la especie procariota en cuyas células se introduce la molécula de ADN donadora.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la función del origen de replicación del ADN donador está alterado por una mutación.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la molécula de ADN donadora contiene una segunda secuencia marcadora.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la molécula de ADN receptora contiene una tercera secuencia marcadora y opcionalmente una cuarta secuencia marcadora.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que la segunda, tercera y cuarta secuencias marcadoras son secuencias que codifican proteínas o no codificantes seleccionadas del grupo que consiste en marcadores nutricionales, marcadores de pigmentos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de sensibilidad a antibióticos, sitios de enzimas de restricción, sitios de reconocimiento de cebador y secuencias que codifican una subunidad de una enzima.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que los productos génicos de la tercera y cuarta secuencias marcadoras de la molécula de ADN receptora confieren resistencia a un antibiótico, a una célula que es sensible a ese antibiótico.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el producto génico de la tercera secuencia marcadora confiere a una célula resistencia a la tetraciclina.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el producto génico de la cuarta secuencia marcadora confiere a una célula resistencia al cloranfenicol.

24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar divergen en al menos dos nucleótidos.

25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias naturales.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la primera y/o segunda secuencias de ADN que se van a recombinar derivan de virus, bacterias, plantas, animales y/o seres humanos.

27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la primera y/o segunda secuencias de ADN que se van a recombinar son secuencias artificiales.

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que cada una de la primera y segunda secuencias de ADN que se van a recombinar comprenden una o más secuencias que codifican proteínas y/o una o más secuencias no codificantes.

29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que la primera célula procariota se genera introduciendo simultánea o secuencialmente la molécula de ADN receptora y la molécula de ADN donadora en una célula procariota.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que las moléculas de ADN receptora y donadora se introducen en la célula procariota por transformación, conjugación, transducción, sexducción y/o electroporación.

31. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que la primera célula procariota se cultiva en presencia de al menos un antibiótico al que el producto génico de la primera secuencia marcadora confiere resistencia.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la primera célula procariota se cultiva además en presencia de un segundo, un tercer y/o un cuarto antibiótico, al que los productos génicos de la segunda secuencia marcadora, la tercera secuencia marcadora y la cuarta secuencia marcadora, respectivamente, confieren resistencia.

33. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que la célula procariota es una célula de una arqueobacteria o una eubacteria.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que la eubacteria es una bacteria Gram negativa, una bacteria Gram positiva o una cianobacteria.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que la bacteria Gram negativa es Escherichia coli.

36. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9 y 13, en el que la deficiencia transitoria o permanente del sistema de reparación de apareamiento erróneo se debe a una mutación, una deleción y/o una expresión inducible o represión de uno o más genes implicados en el sistema de reparación de apareamiento erróneo, un tratamiento con un agente que satura el sistema de reparación de apareamiento erróneo y/o un tratamiento con un agente que anula globalmente la reparación de apareamiento erróneo.

37. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, 13 y 36, en el que la célula procariota tiene un gen mutado mutS y/o un gen mutado mutL.

38. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en el que la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas contenidas en la molécula de ADN híbrida de la segunda célula procariota se seleccionan y/o aíslan y/o analizan.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas se aíslan por escisión con enzimas de restricción.

40. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas se amplifican por PCR.

41. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en el que la primera y segunda secuencias de ADN recombinadas aisladas se insertan en una molécula de ADN donadora y una molécula de ADN receptora, respectivamente, y se someten a otro ciclo de recombinación.

42. Plásmido pMIX91 de Bacillus subtilis que comprende el marcador spec^{R} y el marcador phleo^{R} y los sitios de restricción ScaI, PpuMI y EcoO109 para insertar una secuencia de ADN extraña, depositado en DSMZ (Ref. SB202pMIX91).

43. Plásmido pMIX101 de Bacillus subtilis que comprende la secuencia marcadora tc^{R} y los sitios de restricción XhoI y PstI para insertar una secuencia de ADN extraña, depositado en DSMZ (Ref. 1A423pMIX101).

44. Uso de los plásmidos de B. subtilis pMIX91 o pMIX101 según las reivindicaciones 42 y 43 respectivamente, como moléculas de ADN donadoras en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, para generar y/o detectar secuencias de ADN recombinantes en una célula hospedante procariota, preferiblemente en una célula de E. coli.

45. Uso de los plásmidos de E. coli pACYC184 o pMIX100 o un derivado de los mismos como molécula de ADN receptora en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 para generar y/o detectar secuencias de ADN recombinantes en una célula hospedante procariota, preferiblemente en una célula de E. coli.

46. Kit que comprende al menos un primer envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli o la cepa MXP1 de E. coli o la cepa DHB10 de E. coli, un segundo envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli que contienen el plásmido pACYC184 o células de la cepa DHB10 de E. coli que contienen el plásmido pMIX100 y un tercer envase que comprende células de la cepa DSM4393 de B. subtilis que contienen el plásmido pMIX91, según la reivindicación 42, o células de la cepa 1A423 de B. subtilis que contienen el plásmido pMIX101, según la reivindicación 43.

47. Kit que comprende al menos un primer envase que comprende células de la cepa AB1157 de E. coli o la cepa MXP1 de E. coli o la cepa DHB10 de E. coli, un segundo envase que comprende ADN del plásmido pACYC184 o el plásmido pMIX100 y un tercer envase que comprende ADN del plásmido pMIX91, según la reivindicación 42, o el plásmido pMIX101, según la reivindicación 43.

48. Procedimiento para producir un gen híbrido y/o una proteína que codifica un gen híbrido en una célula procariota, en el que se lleva a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, y el gen híbrido y/o la proteína codificada por el gen híbrido son producidos en la célula procariota y el gen híbrido y/o la proteína codificada se seleccionan en la célula procariota y/o se aíslan de la misma después de la expresión.