EA012070B1 - Получение рекомбинантных генов в прокариотических клетках с применением двух внехромосомных элементов - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение в основном относится к способам получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотических клетках, в частности в бактериях, посредством применения двух различных внехромосомных элементов, в частности плазмид, которые можно использовать для осуществления способов согласно изобретению. Последовательности ДНК, для которых подходят эти способы, включают в себя кодирующие и не кодирующие белки последовательности.

Description

Настоящее изобретение в основном относится к способам ίη νίνο для получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотических клетках, в частности в бактериях, с применением двух различных внехромосомных элементов и внехромосомных элементов, в частности плазмид, которые можно применять для осуществления способов согласно изобретению. Последовательности ДНК, для которых подходят данные способы, включают в себя кодирующие и не кодирующие белки последовательности.

Эволюция представляет собой непрерывный процесс наследственной изменчивости и фенотипической селекции. Генетическое разнообразие популяции можно увеличить созданием новых мутантных сочетаний, улучшающих характеристики индивидуумов в популяции. Направленную эволюцию микроорганизмов традиционно осуществляют в ходе процесса классического усовершенствования штамма посредством последовательных неспецифического мутагенеза и скрининга.

До настоящего времени направленную эволюцию применяли почти исключительно как инструмент для белковой инженерии. Посредством способов создания мутаций, таких как сайт-специфический мутагенез, кассетный мутагенез, неспецифический мутагенез и вносящая ошибки ПЦР, получены варианты функций белков, и полученные таким образом библиотеки подвергнуты скринингу на предмет их способности осуществлять конкретную функцию. Рекурсивное применение данной процедуры успешно использовали для модификации физических и каталитических свойств ферментов, таких как оптимум рН, термостабильность, стабильность в растворах, стереоселективность, каталитическая активность и субстратная специфичность, а также механизмы токсической устойчивости у бактерий и диапазон хозяев, и стабильность вирусов.

Подходы традиционного мутагенеза для получения новых свойств у ферментов имеют ряд ограничений. Данные подходы применимы только к генам или последовательностям, которые клонированы и функционально охарактеризованы и которые обладают отдельной функцией. Также с подходами традиционного мутагенеза можно исследовать только очень ограниченный ряд общего количества перестановок, даже для одного гена. Однако при определенных обстоятельствах для экспрессии белка с новыми свойствами может быть необходимо модифицировать не только один ген, но и дополнительные гены. Такие дополнительные гены могут представлять собой, например, гены, которые совместно обеспечивают единый фенотип, или гены, играющие роль в одном или нескольких клеточных механизмах, таких как транскрипция, трансляция, посттрансляционные модификации, секреция или протеолитическое разрушение генного продукта. Попытка индивидуальной оптимизации всех генов, обладающих такой функцией, посредством подходов традиционного мутагенеза была бы практически неосуществимой задачей.

Подходы традиционного мутагенеза для получения новых свойств у ферментов имеют ряд ограничений. Данные подходы применимы только к генам или последовательностям, которые клонированы и функционально охарактеризованы и которые обладают отдельной функцией. Также с подходами традиционного мутагенеза можно исследовать только очень ограниченный ряд общего количества перестановок, даже для одного гена. Однако при определенных обстоятельствах для экспрессии белка с новыми свойствами может быть необходимо модифицировать не только один ген, но и дополнительные гены. Такие дополнительные гены могут представлять собой, например, гены, которые совместно обеспечивают единый фенотип, или гены, играющие роль в одном или нескольких клеточных механизмах, таких как транскрипция, трансляция, посттрансляционные модификации, секреция или протеолитическое разрушение генного продукта. Попытка индивидуальной оптимизации всех генов, обладающих такой функцией, посредством подходов традиционного мутагенеза была бы практически неосуществимой задачей.

Большинство проблем, связанных с подходами традиционного мутагенеза, можно преодолеть посредством рекомбинационных подходов, включающих в себя случайную рекомбинацию различных последовательностей функциональных генов, обеспечивая молекулярное смешивание от природы сходных или случайным образом мутировавших генов. По сравнению с традиционным мутагенезом, вероятность получения мутантов с улучшенным фенотипом с применением рекомбинации значительно выше. Основные преимущества рекомбинационных подходов по сравнению с традиционными технологиями манипуляций с ДНК представляют собой, в частности, простоту экспериментирования и свободу от продиктованных последовательностью ДНК ограничений.

Большинство из того, что известно о процессах рекомбинации, стало известно из исследований простых одноклеточных организмов, таких как бактерии. Изучение рекомбинации у таких организмов обладает преимуществом простоты манипуляции последовательностями ДНК и возможностью изучения событий специфической рекомбинации, индуцированных синхронно в большой части клеток. В равной степени важным является растущая убежденность в том, что изучаемые у микроорганизмов процессы в большинстве аспектов идентичны или сходны с путями, которыми клетки млекопитающих, например человеческие клетки, образуют генетическое разнообразие. Кроме того, определение этих механизмов приобрело дополнительную важность в поисках разработки более эффективных механизмов целенаправленного воздействия на гены и замещения генов в клетках млекопитающих.

Хотя существует множество различных систем для осуществления рекомбинации в прокариотических клетках, большинство из них не обеспечивают простого и надежного детектирования новой, полученной в результате рекомбинации, последовательности ДНК. Таким образом, в данной области все еще

- 1 012070 существует необходимость в эффективных прокариотических тестовых системах, которые, в частности, обеспечивают быструю и простую детекцию рекомбинантов и/или отбор рекомбинантов под селективным давлением.

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является предоставление улучшенных способов и средств для простого и эффективного получения рекомбинантных мозаичных генов в прокариотических клетках, в частности, для скрининга и детектирования таких рекомбинантных последовательностей.

В настоящем изобретении данную лежащую в его основе техническую проблему решают посредством предоставления способа получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК у прокариот, включающего в себя следующие стадии:

a) получение первичной прокариотической клетки, содержащей реципиентную молекулу ДНК, содержащую первую последовательность ДНК, для рекомбинации и способную автономно реплицироваться в прокариотической клетке, и донорную молекулу ДНК, содержащую вторую последовательность ДНК для рекомбинации и по меньшей мере первую маркерную последовательность, кодирующую генный продукт и не способную к автономной репликации в прокариотической клетке,

b) культивирование первичных прокариотических клеток в селективных условиях, позволяющих рост и/или размножение клеток только в случае, если экспрессирован генный продукт первой маркерной последовательности, и

c) выделение вторичных прокариотических клеток, растущих и/или размножающихся в селективных условиях и содержащих гибридную молекулу ДНК по меньшей мере с первой маркерной последовательностью и образованной из первой и второй последовательностей рекомбинантной последовательности ДНК, полученной вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК.

Настоящее изобретение относится к прокариотической системе для скрининга событий рекомбинации по меньшей мере между двумя отличающимися, или гетерологичными, последовательностями ДНК или субстратами рекомбинации ίη νίνο. Система согласно изобретению позволяет получить новые полезные последовательности ДНК с улучшенными свойствами быстрым и эффективным способом по меньшей мере из двух отличающихся последовательностей ДНК, способом, включающим в себя обмен ίη νίνο ДНК из двух внехромосомных элементов, содержащих две последовательности ДНК для рекомбинации. Два внехромосомных элемента с отсутствием гомологии в их нуклеотидных последовательностях вводят в прокариотическую клетку-хозяин в виде реципиентной молекулы ДНК и донорной молекулы ДНК. Реципиентная молекула может автономно реплицироваться у хозяина, тогда как донорная молекула не способна к репликации. Однако донорная молекула содержит по меньшей мере одну уникальную кодирующую белок маркерную последовательность, такую как маркер устойчивости к антибиотику или пищевой маркер, не присутствующий ни в геноме клетки-хозяин, ни в реципиентной молекуле. После введения обоих внехромосомных элементов прокариотическим клеткам-хозяевам клетки культивируют в условиях, стимулирующих рекомбинацию между двумя гетерологичными генами. Эти условия могут включать в себя, например, культивирование клеток в присутствии антибиотика, к которому клетки обычно чувствительны, или культивирование клеток в среде с отсутствием незаменимого питательного вещества, которое клетка не может синтезировать самостоятельно и которое, следовательно, необходимо добавлять извне. В применяемых условиях культивирования клетки могут расти и размножаться, т.е. делиться только в том случае, если экспрессирован генный продукт соответствующего маркера. Однако необходимым условием для экспрессии маркерной последовательности является то, что нереплицирующаяся донорная молекула и реплицирующаяся реципиентная молекула образуют коинтеграт, который может реплицироваться с участка инициации репликации реципиентной молекулы и, таким образом, обеспечивать наличие маркерной последовательности. Образование этого коинтеграта происходит в результате рекомбинации между двумя субстратами рекомбинации, приводящей к образованию новых молекул ДНК, последовательности которых отличаются от последовательностей исходных последовательностей ДНК. Таким образом, клетки-хозяева, растущие и размножающиеся в применяемых селективных условиях, содержат новые рекомбинантные последовательности ДНК. Таким образом, способ согласно изобретению обеспечивает простую и быструю систему селекции для идентификации рекомбинантных последовательностей ДНК. С применением способа согласно изобретению можно легко получать большие библиотеки рекомбинантных, мутантных последовательностей ДНК, и варианты, приобретшие желательную функцию, можно затем идентифицировать посредством применения подходящей системы селекции и скрининга.

Изучение процессов рекомбинации в простом одноклеточном организме, таком как прокариотический организм, обладает очевидным преимуществом простоты манипуляции последовательностями ДНК и возможностью изучения событий специфической рекомбинации, индуцированных синхронно в большей части клеток. Кроме того, в течение последних нескольких десятилетий накоплено множество знаний и в ферментационной технологии, и в общей генетике прокариотических организмов. Другое большое преимущество прокариотических клеток-хозяев относится к их очень короткому времени удвоения. Таким образом, при применении прокариотических клеток-хозяев возможно провести множество циклов клеточного деления и, таким образом, множество циклов рекомбинации и получить множество новых

- 2 012070 рекомбинантных последовательностей ДНК в течение короткого периода.

Способ согласно изобретению можно проводить или в прокариотических клетках дикого типа, или в прокариотических клетках, дефективных в отношении репарации ошибочного спаривания. Процессы, посредством которых происходит репарация поврежденной ДНК, и механизмы генетической рекомбинации тесно связаны, и известно, что система репарации ошибочного спаривания оказывает ингибирующее действие на частоту рекомбинации между отличающимися последовательностями, т.е. гомологичной рекомбинации. Таким образом, мутации в системе репарации ошибочного спаривания значительно увеличивают общую частоту рекомбинационных событий в прокариотических клетках. С другой стороны, известно, что прокариотические клетки дикого типа обладают зависимым от репарации ошибочного спаривания механизмом рекомбинации, основанным на расположенных на расстоянии друг от друга ошибочных спариваниях в двух субстратах рекомбинации. В зависимости от последовательностей ДНК для рекомбинации, для получения рекомбинантных последовательностей можно использовать или прокариотические клетки дикого типа, или прокариотические клетки, дефективные в отношении репарации ошибочного спаривания.

Способ согласно изобретению для получения и детектирования последовательностей рекомбинантных ДНК обладает тем преимуществом, что можно подвергнуть рекомбинации значительно отличающиеся последовательности ДНК. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что можно вызвать рекомбинацию последовательностей с высокой степенью общего несоответствия и обладающих только очень короткими участками гомологии или идентичности. Анализ рекомбинантных последовательностей выявил, что наиболее протяженные участки идентичности, в которых происходила рекомбинация, содержали только 18-22 нуклеотидов. Большинство из событий рекомбинации происходило в гомологичных участках длиной 10-15 нуклеотидов. В некоторых случаях рекомбинация происходила на участках длиной только 4-5 нуклеотидов.

Таким образом, способ согласно изобретению допускает рекомбинацию последовательностей ДНК, происходящих из различных прокариотических видов или различных прокариотических родов для получения рекомбинантных последовательностей ДНК с выгодными свойствами.

Способ согласно изобретению для получения и детектирования последовательностей рекомбинантных ДНК обладает тем преимуществом, что можно рекомбинировать более двух отличающихся последовательностей, где две отличающиеся последовательности для рекомбинации могут представлять собой или предварительно отобранные, или неотобранные последовательности.

Например, множество отличающихся последовательностей ДНК вплоть до полной геномной библиотеки можно вставлять в реципиентные, а также донорные молекулы ДНК. Потом отдельные отличающиеся последовательности ДНК можно самих с собой рекомбинировать случайным образом. Также возможно вставлять первый набор отличающихся последовательностей ДНК вплоть до полной геномной библиотеки только в реципиентные молекулы ДНК, а второй набор отличающихся последовательностей ДНК вплоть до полной геномной библиотеки вставлять в донорные молекулы ДНК, или наоборот, а затем рекомбинировать два набора друг с другом случайным образом. В обоих случаях не происходит селекции в отношении того, какая пара отличающихся последовательностей ДНК будет подвергнута рекомбинации.

Однако также возможно по стадиям рекомбинировать несколько предпочтительных предварительно отобранных отличающихся последовательностей, где на каждой стадии проводят отбор в отношении того, какую пару отличающихся последовательностей необходимо рекомбинировать. Например, если необходимо рекомбинировать три отличающихся последовательности ДНК, то на первой стадии получают первые прокариотические клетки, где, например, в бактериальные клетки данного вида вводят реципиентную молекулу ДНК с первой последовательностью ДНК для рекомбинации и донорную молекулу ДНК со второй последовательностью ДНК для рекомбинации. Данные прокариотические клетки культивируют в селективных условиях так, что растут и размножаются только те клетки, в которых соответствующие реципиентные и донорные молекулы ДНК сформировали гибридную молекулу, обеспечивающую экспрессию маркерной последовательности донорной молекулы и рекомбинацию между двумя последовательностями ДНК для рекомбинации. Таким образом, получают вторичные прокариотические клетки, содержащие гибридную молекулу с первой и второй рекомбинантными вследствие рекомбинации последовательностями ДНК. Первую и вторую рекомбинантные последовательности выделяют и одну из них вставляют, например, в реципиентную молекулу, тогда как в донорную молекулу вставляют третью последовательность ДНК для рекомбинации. Затем, на следующей стадии, реципиентную молекулу, содержащую одну из рекомбинантных последовательностей, и донорную молекулу, содержащую третью последовательность ДНК для рекомбинации, снова вводят прокариотическим клеткам-хозяевам и подвергают еще одному циклу рекомбинации.

Например, если необходимо рекомбинировать четыре отличающиеся последовательности ДНК, тогда на первой стадии получают два различных набора первичных прокариотических клеток. Например, первый набор первичных прокариотических клеток можно получать посредством введения в прокариотические клетки реципиентной молекулы ДНК с первой последовательностью ДНК для рекомбинации и донорной молекулы ДНК со второй последовательностью ДНК для рекомбинации. Подобным образом

- 3 012070 второй набор первичных прокариотических клеток можно получать посредством введения в клетки того же вида реципиентной молекулы ДНК с третьей последовательностью ДНК для рекомбинации и донорной молекулы ДНК с четвертой последовательностью ДНК для рекомбинации. Каждый набор прокариотических клеток культивируют в селективных условиях для осуществления рекомбинации. Таким образом, получают первый набор прокариотических клеток, содержащих гибридную молекулу с первой и второй рекомбинантными последовательностями ДНК, рекомбинантными вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК для рекомбинации. Также получают другой набор прокариотических клеток, содержащих гибридную молекулу с третьей и четвертой рекомбинантными последовательностями ДНК, рекомбинантными вследствие рекомбинации между третьей и четвертой последовательностями ДНК для рекомбинации. Затем полученные таким образом первую, вторую, третью и четвертую рекомбинантные последовательности ДНК выделяют из их соответствующих клеток-хозяев. На следующей стадии первую или вторую рекомбинантную последовательность можно вставлять в донорную молекулу ДНК, а третью и четвертую рекомбинантную последовательность - в реципиентную молекулу ДНК. Затем полученные таким образом донорную и реципиентную молекулы ДНК вводят в прокариотическую клетку-хозяина и подвергают еще одному циклу рекомбинации. Таким способом также можно рекомбинировать пять, шесть или более отличающихся последовательностей ДНК.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения донорная молекула ДНК и реципиентные молекулы ДНК представляют собой различные линейные или кольцевые структуры ДНК. Термин структура ДНК означает молекулу ДНК, например, вектор, такой как плазмида или бактериофаг, которая отличается тем, что при введении в прокариотическую клетку-хозяина присутствует в виде внехромосомного элемента. Таким образом, в контексте настоящего изобретения внехромосомный элемент представляет собой молекулу ДНК, не интегрирующуюся в хромосому(ы) прокариотической клеткихозяина.

Донорная молекула ДНК должна быть способна гибридизоваться с реципиентной молекулой ДНК, так, чтобы могла образоваться гибридная молекула. Предпочтительно донорная молекула ДНК и реципиентная молекула ДНК в основном не обладают гомологией, за исключением последовательностей ДНК для рекомбинации.

В соответствии с изобретением реципиентная молекула ДНК должна быть способна к автономной репликации в прокариотической клетке-хозяине при введении в эту клетку. Таким образом, реципиентная молекула ДНК должна обладать по меньшей мере одним участком инициации репликации, позволяющим реципиентной молекуле ДНК реплицироваться независимо от генетического материала хозяина. В контексте настоящего изобретения участок инициации репликации, или оп. представляет собой область молекулы ДНК, используемую клеточными ферментами для инициации репликации этой молекулы ДНК. В участке инициации репликации две цепи ДНК размыкаются с формированием репликационного глазка, что создает область одноцепочечных ДНК на каждой стороне глазка. Затем может присоединяться комплекс ДНК-полимеразы и начинать синтез новых цепей ДНК с использованием старых цепей в качестве матрицы. Как правило, малые ДНК, включающие в себя бактериальные плазмиды или бактериофаги, имеют один участок инициации репликации.

В одном из вариантов осуществления изобретения реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду, а именно двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК. Плазмида представляет собой внехромосомный элемент, способный реплицироваться независимо от генетического материала хозяина. В другом варианте осуществления изобретения реципиентная молекула ДНК представляет собой бактериофаг, а именно фаг, ДНК которого присутствует в прокариотической клетке в виде внехромосомного элемента.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду, способную реплицироваться в клетке-хозяине Е. сой. Предпочтительно реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду Е. сой рЛСУС184 или ее производное. Плазмида рЛСУС184 является Тс1^к и Саш^к.

В соответствии с изобретением донорная молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, не способную реплицироваться в прокариотической клетке-хозяине, но способную формировать гибридную молекулу с реципиентной ДНК. Таким образом, в качестве донорной молекулы ДНК можно использовать любую молекулу ДНК, при условии, что она содержит, по меньшей мере, маркерную последовательность и не может независимо реплицироваться в данной прокариотической клетке-хозяине. Примеры пригодных донорных молекул включают в себя в качестве неограничивающих примеров способные к замыканию в кольцо линейные двухцепочечные ДНК, например, полученные посредством ПЦР и содержащие соответствующую маркерную последовательность, плазмиды и бактериофаги. В случае применения в качестве донорной молекулы ДНК плазмиды или бактериофага, данная молекула или не имеет функционального участка(ов) инициации репликации совсем, или имеет участок(ки) инициации репликации, который(ые) у используемых прокариотических клеток-хозяев не функционален, т.е. не активен.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления донорная молекула ДНК не содержит участка инициации репликации. Это означает, что донорная молекула ДНК не содержит никакой последовательности, способной функционировать в какой-либо прокариотической клетке-хозяине в качестве участка

- 4 012070 инициации репликации, т.е. последовательности, с которой могут связываться белковые факторы, вовлеченные в инициацию репликации. Участок инициации репликации может отсутствовать вследствие делеции последовательностей нуклеиновых кислот, функционирующих в качестве участка инициации репликации.

В другом варианте осуществления изобретения функционирование участка инициации репликации донорной молекулы ДНК нарушают посредством одной или нескольких мутаций, нарушающих или функционирование самого участка инициации репликации, или функционирование вовлеченных в репликацию белков, в частности белков, связывающихся с последовательностью нуклеиновой кислоты участка инициации репликации, посредством чего инициируется репликация. Например, известно, что у Е. сой ключевой белок инициации репликации, ЭпаЛ, связывается со специфическими последовательностями, так называемыми ЭпаЛ-боксами, на участке инициации репликации на хромосоме и расплавляет три АТ-богатых, 13-мерных прямых повтора. Полагают, что дополнительное связывание белка ЭпаЛ с одноцепочечными 6-мерными участками в открытой области стабилизирует открытый комплекс (для обзора см. Лапд е! а1., ΡΝΑ8, 100 (2003), 8692-8697). ЭпаЛ-боксы и АТ-богатые области, как правило, находятся на участке инициации репликации множества прокариотических репликонов, и показано, что белок ЭпаЛ играет ключевую роль в инициации репликации в этих участках инициации репликации. Таким образом, определенные мутации Эна Л-боксов и/или АТ-богатых областей или соответствующих участков в последовательности участка инициации репликации, такие как замещения, делеции и т. п. соответствующих оснований, могут предотвращать связывание белков, необходимых для инициации репликации, и, таким образом, ингибировать функционирование участка инициации репликации внехромосомного элемента. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения функционирование участка инициации репликации донорной молекулы ДНК можно нарушить посредством одной или нескольких мутаций в последовательности нуклеиновой кислоты участка инициации репликации донорной молекулы ДНК, в частности, в ЭпаЛ-боксах и/или АТ-богатых областях участка инициации репликации.

Кроме того, известно, что одного белка ЭпаЛ недостаточно для формирования открытого комплекса в участке инициации репликации плазмид, таких как ВК2, Ρ1, Е, р8С101 или В6К. В этих случаях для эффективного формирования открытого комплекса необходимо связывание плазмидного белка Вер, хотя и в сочетании с белком ЭпаЛ и белком НИ или 1НЕ (фактор интеграции хозяина) хозяина. Необходимость специфичного для плазмиды инициаторного белка для формирования открытого комплекса представляет собой ключ к способности плазмиды к осуществлению контроля над частотой событий инициации в ее участке инициации репликации (для обзора см. Лапд е! а1., ΡNΑ§, 100 (2003), 8692-8697). Это означает, что мутации плазмидных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белковые факторы с необходимыми для репликации плазмиды функциями, также могут нарушить функционирование участка инициации репликации внехромосомного элемента. Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения функционирование участка инициации репликации донорной молекулы ДНК можно нарушать посредством одной или нескольких мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот, кодирующих белковые факторы с необходимыми для репликации донорной молекулы ДНК функциями.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения донорная молекула ДНК содержит участок инициации репликации, активный только в определенных прокариотических клеткаххозяевах, но не в той прокариотической клетке, в которую вводят донорную молекулу ДНК для осуществления рекомбинации между двумя последовательностями ДНК для рекомбинации. Существует множество сообщений о том, что участок инициации репликации, активный в конкретных бактериальных видах, не функционирует в других видах бактерий. Например, известно, что участок инициации репликации К1еЙ81е11а рпеишошае (опС) не активен в Саи1оЬас1ег сгезсеШиз, Рзеибошопаз рийба или ВйобоЬас!ег зрйаегснбез (О'№111 апб Вепбег, 1. Вас!егю1., 170 (1988), 3774-3777). Также известно, что плазмиды Васй1и8 8иЬйЙ8 не могут реплицироваться в клетках Е. сой. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления донорная молекула ДНК и/или ее участок инициации репликации происходят из прокариотического вида, отличного от прокариотического вида, в клетки которого вводят донорную молекулу ДНК.

В особенно предпочтительном варианте осуществления донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. зиЬййз рМ1Х91, являющуюся производной плазмиды р1Ь253 и способную реплицироваться в В. зиЬййз, но не в Е. сой, и содержащую маркер зрес^В, маркер рй1ео^В и рестрикционные участки 8са1, РриМ1 и ЕсоО1091 для вставки чужеродной последовательности ДНК. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. зиЬййз рМ1Х101, являющуюся производной плазмиды р1Ь253 и способную реплицироваться в В. зиЬййз, но не в Е. сой, и содержащую маркерную последовательность !с^В и рестрикционные участки Хйо1 и ΡδΐΙ для вставки чужеродной последовательности ДНК.

В другом варианте осуществления изобретения участок инициации репликации донорной молекулы ДНК функционален только в определенном температурном диапазоне, например при температуре, ниже чем 45°С. Если донорная молекула ДНК содержит такой чувствительный к температуре участок инициа

- 5 012070 ции репликации, она не будет способна к репликации при непермиссивных условиях, т.е. при температуре выше 45°С, которая еще позволяет рост прокариотической клетки-хозяина.

В контексте настоящего изобретения термин маркерные последовательности относится к последовательностям ДНК, которые являются уникальными в данной прокариотической клетке и которые расположены или на донорной молекуле ДНК, или на реципиентной молекуле, предпочтительно выше или ниже субстрата рекомбинации или на уже рекомбинантной последовательности ДНК. Присутствие маркерной последовательности на той же молекуле ДНК, что и субстрат рекомбинации или на уже рекомбинантной последовательности ДНК, предпочтительно в сочетании с другой маркерной последовательностью, которая может находиться на другой стороне субстрата рекомбинации, делает возможным распознавание и отбор субстрата рекомбинации или уже рекомбинантной последовательности молекулярными или генетическими способами.

В соответствии с изобретением, донорная молекула ДНК содержит первую маркерную последовательность, позволяющую отбор кроссоверов, содержащих субстраты рекомбинации. Первая маркерная последовательность предпочтительно в сочетании с дополнительными маркерными последовательностями, присутствующими или на донорной молекуле ДНК, или на реципиентной молекуле ДНК, также позволяет проведение дополнительных циклов рекомбинации повторяющимся способом.

В соответствии с изобретением первая маркерная последовательность представляет собой кодирующую белок последовательность ДНК, генный продукт которой необходим для роста и размножения прокариотической клетки-хозяина в применяемых селективных условиях. Первая маркерная последовательность выбрана из группы, состоящей из пищевого маркера, маркера устойчивости к антибиотику и последовательности, кодирующей субъединицу фермента, функционирующего только в том случае, если в одной и той же клетке экспрессированы две или более субъединицы.

Пищевой маркер представляет собой маркерную последовательность, кодирующую генный продукт, способный компенсировать ауксотрофность организма или клетки, и, таким образом, обуславливает прототрофность этого ауксотрофного организма или клетки. В контексте настоящего изобретения термин ауксотрофность означает, что организму или клетке необходимо расти в среде, содержащей необходимое питательное вещество, которое ауксотрофный организм самостоятельно синтезировать не может. Генный продукт пищевого маркера обеспечивает синтез необходимого питательного вещества, отсутствующего у акусотрофной клетки. Таким образом, при экспрессии гена пищевого маркера добавлять данное необходимое питательное вещество в среду, в которой растет организм, не обязательно, так как организм стал прототрофным.

Маркер устойчивости к антибиотику представляет собой маркерный ген, чей генный продукт при экспрессии в клетке, в которой происходит экспрессия маркерного гена антибиотика, обеспечивает ей способность роста в присутствии данного антибиотика при данной концентрации, тогда как клетка без маркера устойчивости к антибиотику расти не может.

Кодирующую субъединицу фермента последовательность можно применять в качестве маркерной последовательности в том случае, если клетка не может синтезировать все субъединицы фермента, необходимые для сборки структуры полного фермента и, таким образом, для достижения полной активности фермента, и если наличие или отсутствие ферментативной активности можно контролировать генетическими и/или молекулярными средствами. Например, если активность фермента необходима для жизненно важного биохимического пути в клетке, позволяющего рост и/или размножение клетки в конкретной среде, и клетка не может синтезировать все компоненты структуры полного фермента, тогда клетка не может выжить в этой среде. Таким образом, кодирующая субъединицу фермента последовательность, используемая в качестве маркерной последовательности, обеспечивает при экспрессии сборку полного фермента и выживание клетки.

Предпочтительно генный продукт первой маркерной последовательности обуславливает устойчивость к антибиотику клетки, которая чувствительна к этому антибиотику. В частности, первая маркерная последовательность представляет собой §рес^к, генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к спектиномицину, рЬ1ео^к, генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к флеомицину, или 1с^к. генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к тетрациклину.

В другом варианте осуществления изобретения донорная молекула ДНК содержит вторую маркерную последовательность. В еще одном варианте осуществления изобретения реципиентная молекула ДНК содержит третью маркерную последовательность и, необязательно, четвертую маркерную последовательность. Это означает, что в одном варианте осуществления изобретения донорная молекула ДНК может содержать, по меньшей мере, первую и вторую маркерную последовательность, необязательно, даже более маркерных последовательностей, которые могут располагаться, например, или выше, или ниже субстрата рекомбинации. В другом варианте осуществления реципиентная последовательность ДНК может содержать третью и четвертую маркерную последовательность, необязательно, даже более маркерных последовательностей, которые могут располагаться, например, или выше, или ниже субстрата рекомбинации. Данный дополнительный маркер позволяет увеличить строгость отбора последовательностей рекомбинантных ДНК, так как гибридная молекула, сформированная во вторичной прокариотической клетке и содержащая две различных последовательности рекомбинантных ДНК, может содержать в

- 6 012070 общей сложности по меньшей мере четыре различных маркерных последовательности.

В соответствии с изобретением вторая, третья и четвертая маркерные последовательности являются кодирующими или не кодирующими белки последовательностями, выбранными из группы, состоящей из пищевых маркеров, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам, маркеров чувствительности к антибиотикам, участков распознавания праймеров, границ интронов/экзонов, последовательностей, кодирующих конкретную субъединицу фермента, промоторных последовательностей, регулируемых ниже генных последовательностей и участков ферментов рестрикции.

Пигментный маркер представляет собой маркерный ген, генный продукт которого вовлечен в синтез пигмента, который при экспрессии окрашивает клетку, в которой экспрессирован пигментный маркер. Клетка без пигментного маркера не синтезирует пигмент и, таким образом, не окрашивается. Таким образом, пигментный маркер позволяет быстрое выявление содержащей пигментный маркер клетки по фенотипу.

Маркер чувствительности к антибиотику представляет собой маркерный ген, генный продукт которого при экспрессии нарушает способность клетки расти в присутствии данного антибиотика в данной концентрации.

Участки распознавания праймеров представляют собой участки отжига для сайт-специфических праймеров для ПЦР, позволяющие быструю идентификацию соответствующих маркерных последовательностей посредством ПЦР.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вторая маркерная последовательность донорной молекулы ДНК и третья и четвертая маркерные последовательности реципиентной молекулы ДНК являются кодирующими белок последовательностями, генные продукты которых обуславливают устойчивость к антибиотику клетки, чувствительной к этому антибиотику. Предпочтительно генный продукт третьей маркерной последовательности обуславливает устойчивость клетки к тетрациклину, а генный продукт четвертой маркерной последовательности обуславливает устойчивость клетки к хлорамфениколу.

В контексте настоящего изобретения термины последовательности ДНК для рекомбинации и субстрат рекомбинации означают две любых последовательности ДНК, способные к рекомбинации в результате процессов гомологичной или негомологичной рекомбинации.

События гомологичной рекомбинации различных типов характеризуются спариванием оснований поврежденной цепи ДНК с гомологичным партнером, где область взаимодействия может включать в себя сотни почти полностью соответствующих пар оснований. Напротив, незаконная или негомологичная рекомбинация характеризуется связыванием концов ДНК, не обладающих или обладающих небольшим количеством комплементарных пар оснований. В прокариотических клетках, события негомологичных репарации и рекомбинации происходят со значительно меньшей частотой, чем события гомологичной рекомбинации.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения два субстрата рекомбинации, т. е. первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации, являются отличающимися последовательностями, т.е. последовательностями, не являющимися идентичными, но имеющими определенную степень гомологии. В контексте изобретения термин гомология означает степень идентичности, существующую между последовательностями двух молекул нуклеиновой кислоты, тогда как отличие означает степень неидентичности между последовательностями двух молекул нуклеиновой кислоты. В соответствии с изобретением, последовательности ДНК для рекомбинации отличаются друг от друга в двух или более позициях по отношению к их общему выравниванию. В одном варианте осуществления изобретения общее отличие между двумя субстратами рекомбинации относительно их общей длины составляет более чем 0,1%, в частности более чем 5% и предпочтительно более чем 25%. Это означает, что последовательности ДНК для рекомбинации могут отличаться более чем на 30%, более чем на 40% и даже более чем на 50%. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения две последовательности ДНК для рекомбинации обладают по меньшей мере одной или несколькими гомологичными или идентичными областями, которые, однако, могут быть очень короткими. В соответствии с изобретением гомологичные или идентичные области могут содержать менее чем 25 нуклеотидов, в частности менее чем 20 или менее чем 15 нуклеотидов и даже менее чем 10 нуклеотидов, например 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов.

Субстраты рекомбинации или последовательности ДНК для рекомбинации могут обладать естественными или синтетическими участками инициации репликации. Таким образом, в одном из вариантов осуществления первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации являются встречающимися в природе последовательностями. Встречающиеся в природе последовательности можно выделять из любого природного источника, включая вирусы, живые или мертвые прокариотические организмы, такие как бактерии, живые или мертвые эукариотические организмы, такие как грибы, животные, растения и люди, или из его частей посредством подходящих способов выделения, или их можно синтезировать химическими способами. Встречающиеся в природе последовательности также могут содержать такие последовательности, которые после выделения из природного источника подвергали мутагенезу. В другом варианте осуществления изобретения первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации

- 7 012070 представляют собой искусственные последовательности, которые не находятся в природном источнике Искусственные последовательности можно синтезировать любыми известными химическими способами.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности ДНК для рекомбинации представляют собой кодирующие белки последовательности, например последовательности, кодирующие ферменты, которые можно применять для промышленного производства природных или неприродных соединений. Ферменты или соединения, получаемые при помощи ферментов, можно применять для производства лекарственных средств, косметики, продуктов питания и т.д. Кодирующие белки последовательности также могут представлять собой последовательности, кодирующие белки, обладающие терапевтическим применением в областях здоровья человека и животных. Важные классы важных с медицинской точки зрения белков включают в себя цитокины и факторы роста. Рекомбинация кодирующих белки последовательностей позволяет получать новые мутантные последовательности, кодирующие белки с измененными, предпочтительно улучшенными, функциями и/или вновь приобретенными функциями. Например, таким образом, можно достичь улучшенной термостабильности белка, изменения субстратной специфичности белка, увеличить его активность, включить новые каталитические участки и/или слить домены двух разных ферментов. Кодирующие белки последовательности ДНК для рекомбинации могут включать в себя последовательности из различных видов, кодирующие одни и те же или сходные белки, которые в их природном окружении обладают сходными или идентичными функциями. Кодирующие белки последовательности ДНК для рекомбинации могут включать в себя последовательности из одного семейства белков или ферментов. Кодирующие белки последовательности для рекомбинации также могут представлять собой последовательности, кодирующие белки с различными функциями, например последовательности, кодирующие ферменты, катализирующие различные стадии данного метаболического пути. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации выбраны из группы генных последовательностей суперсемейства бета-лактамаз Оха.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности ДНК для рекомбинации представляют собой некодирующие последовательности, такие как последовательности, которые, например, в их природном клеточном окружении вовлечены в регуляцию экспрессии кодирующей белок последовательности. Примеры некодирующих последовательностей включают в себя в качестве неограничивающих примеров промоторные последовательности, последовательности, содержащие связывающие рибосому участки, интронные последовательности, последовательности полиаденилирования и т. д. Посредством рекомбинации таких некодирующих последовательностей возможно получить мутантные последовательности, которые в клеточном окружении приведут к измененной регуляции клеточного процесса, например измененной экспрессии гена.

В соответствии с изобретением субстрат рекомбинации или последовательность ДНК для рекомбинации может, разумеется, содержать более одной кодирующей белок последовательности и/или более чем одной некодирующей последовательности. Например, субстрат рекомбинации может содержать одну кодирующую белок последовательность плюс одну некодирующую последовательность или сочетание разных кодирующих белки последовательностей и различных некодирующих последовательностей. Таким образом, в другом варианте осуществления изобретения последовательности ДНК для рекомбинации могут состоять из одного или нескольких участков кодирующих последовательностей с промежуточными и/или фланкирующими некодирующими последовательностями. Это означает, что последовательность ДНК для рекомбинации может представлять собой, например, генную последовательность с регуляторными последовательностями на ее 5'-конце и/или в нетранслируемой З'-области, или последовательность гена млекопитающего с экзон/интронной структурой. В еще одном варианте осуществления изобретения последовательности ДНК для рекомбинации могут состоять из больших непрерывных участков ДНК, содержащих более одной кодирующей последовательности, необязательно с промежуточными некодирующими последовательностями, таких как оперон. Последовательности ДНК для рекомбинации могут представлять собой последовательности, уже испытавшие одно или несколько событий рекомбинации, например события гомологичной и/или негомологичной рекомбинации.

Субстраты рекомбинации могут содержать немутировавшие последовательности ДНК дикого типа и/или мутантные последовательности ДНК. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления можно рекомбинировать последовательности дикого типа с уже существующими мутантными последовательностями для получения новых мутантных последовательностей.

В соответствии с изобретением прокариотическую клетку используют в качестве клетки-хозяина для введения реципиентной и донорной молекул ДНК. Термины прокариотическая клетка и прокариотическая клетка-хозяин включают в себя любую клетку, у которой геном свободно присутствует в цитоплазме в виде кольцевой структуры, т.е. клетку, геном которой не окружен ядерной мембраной. Прокариотическая клетка дополнительно отличается тем, что она не обязательно зависит от кислорода, и ее рибосомы меньше, чем рибосомы эукариотических клеток. Прокариотические клетки включают в себя архебактерии и эубактерии. В зависимости от состава клеточной стенки, эубактерии можно разделить на грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии и цианобактерии.

Таким образом, согласно настоящему изобретению прокариотическая клетка представляет собой

- 8 012070 клетку архебактерии или эубактерии, где в предпочтительном варианте осуществления изобретения прокариотическая клетка представляет собой грамотрицательную бактерию, грамположительную бактерию или цианобактерию. Предпочтительно грамотрицательная бактерия представляет собой ЕэсйетюЫа οοΐί, например штамм Е. οοΐί АВ1157 или его мутант Ми18^-, штамм Е. οοΐί МХР1.

В соответствии с изобретением для способа согласно изобретению может быть предпочтительно использовать прокариотические клетки-хозяева с функциональной системой репарации. Система репарации ошибочного спаривания (ММК) представляет собой один из мощнейших действующих факторов предотвращения мутаций вследствие ошибок ДНК-полимеразы при репликации. Однако репарация ошибочного спаривания содействует генетической стабильности, обеспечивая также точность генетической рекомбинации. В то время как у бактерий, а также у дрожжей и в клетках млекопитающих рекомбинация между гомологичными субстратами ДНК, содержащими небольшое количество несоответствий (<1%), происходит значительно менее эффективно, чем между идентичными последовательностями, частота рекомбинации (генной конверсии и/или кроссинговера) у дефицитных по ММК линий значительно увеличена. Это означает, что высокая точность рекомбинации вызвана не только внутренними характеристиками ферментов рекомбинации, но также и редактированием рекомбинации системой репарации ошибочного спаривания. Таким образом, система репарации ошибочного спаривания оказывает ингибирующий эффект на рекомбинацию между отличающимися последовательностями. У Е. οοΐί для этой сильной антирекомбинационной активности необходимы два белка управляемой метилированием системы ММК, т.е. Ми18 и Ми1Ь, тогда как действие других белков системы ММК, Ми!Н и υντΌ, менее выражено. Кроме их ролей в ММК и гомологичной рекомбинации, белки ММК также играют важную роль в удалении негомологичной ДНК во время генной конверсии.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения применяют прокариотические клетки, дефицитные по системе репарации ошибочного спаривания. В контексте настоящего изобретения термин дефицитный по системе репарации ошибочного спаривания означает, что система ММК прокариотической клетки транзиторно или постоянно ослаблена. Дефицита ММК клетки или организма можно добиться любым способом, транзиторно или постоянно повреждающим систему ММК, включая в качестве неограничивающих примеров мутацию одного или нескольких вовлеченных в ММК генов, обработку таким средством, как УФ-излучение, приводящим к глобальному повреждению ММК, обработку таким средством, как 2-аминопурин или гетеродуплекс, содержащий избыточное количество несоответствий для транзиторного насыщения или инактивации системы ММК, и индуцируемую экспрессию или репрессию одного или нескольких вовлеченных в ММК генов, например, посредством регулируемых промоторов, что могло бы позволить транзиторную инактивацию.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения дефицит репарации ошибочного спаривания прокариотической клетки-хозяина происходит вследствие мутации по меньшей мере одного из вовлеченных в ММК генов. В предпочтительном варианте осуществления прокариотические клетки несут мутантный ген ши1§, мутантный ген ти1Ь, мутантный ген ши1Н и/или мутантный ген ϋντΌ.

В другом варианте осуществления у прокариотической клетки-хозяина повреждены или ингибированы один или несколько главных белков рекомбинации. Показано, например, что клетка с поврежденными генами ЛббЛВ демонстрирует высокую частоту гомологичной и негомологичной рекомбинации. В другом варианте осуществления у прокариотической клетки-хозяина сверхэкспрессирован один из главных белков рекомбинации, такой как гесА. Этот белок вовлечен в гомологичную рекомбинацию, обеспечивая ренатурацию одноцепочечной ДНК, с формированием гетеродуплексной молекулы, необходимой для события рекомбинации, и инициирует обмен цепей ДНК.

В соответствии с изобретением первичную прокариотическую клетку получают посредством одновременного или последовательного введения реципиентной молекулы ДНК и донорной реципиентной молекулы в прокариотическую клетку-хозяина. Таким образом, в одном из вариантов осуществления первичную прокариотическую клетку можно получать введением на первой стадии реципиентной молекулы ДНК в конкретную прокариотическую клетку-хозяина. На второй стадии после восстановления несущей реципиентную молекулу прокариотической клетки-хозяина в несущую реципиентную молекулу клетку вводят донорную молекулу ДНК. В другом варианте осуществления изобретения и реципиентную, и донорную молекулы ДНК в прокариотическую клетку-хозяина можно вводить одновременно.

В соответствии с изобретением введение и реципиентной, и донорной молекулы ДНК в прокариотическую клетку-хозяина можно проводить любым известным подходящим способом, включающим в себя в качестве неограничивающих примеров трансформацию, конъюгацию, трансдукцию, сексдукцию, инфекцию и/или электропорацию.

В контексте настоящего изобретения термин трансформация означает захват клеткой, например микробной клеткой, из окружающей среды выделенной, предпочтительно очищенной, молекулы нуклеиновой кислоты. Клетки некоторых прокариотических видов, таких как ВасШиэ или Όίρΐο^^ιΐδ. компетентны от природы, тогда как клетки других прокариотических видов, таких как Е. отН. для того, чтобы сделать их компетентными, т. е. для индукции переноса молекулы нуклеиновой кислоты через клеточную мембрану, необходимо подвергать специальной обработке.

Некоторые бактерии известны по способности обменивать ДНК посредством трансформации.

- 9 012070

Конъюгация означает опосредованный плазмидами перенос бактериальной плазмиды из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку посредством контакта клетки с клеткой. Механизм переноса, как правило, кодируется плазмидами или конъюгативными транспозонами. Примеры таких плазмид включают в себя конъюгативные плазмиды или плазмиды-помощники.

Конъюгативные плазмиды представляют собой самопередающиеся плазмиды, несущие гены, стимулирующие образование контакта клетки с клеткой (гены мобилизации). Они содержат гены для образования конъюгационных мостиков. После образования мостика также могут передаваться другие плазмиды и даже хромосомная ДНК (конъюгационные транспозоны). Мобилизуемые плазмиды содержат гены мобилизации, но для перемещения между клетками требуют помощи конъюгативных плазмид. Конъюгация представляет собой один из главных путей генетического обмена между различными филогенетическими группами прокариотических клеток и между прокариотами и эукариотами.

Сексдукция представляет собой процесс, посредством которого генетический материал переносится из прокариотической клетки с Р-фактором или Р-плазмидой в клетку, не содержащую этот Рфактор (Р^--клетка). Р-фактор, как правило, находится в цитоплазме бактериальной клетки, но иногда может интегрироваться в различные участки бактериальной хромосомы, что ведет к формированию клеток Н£г. Интеграция Р-фактора обратима, где при неправильном выщеплении плазмиды возникают так называемые замещенные Р-факторы (Р'), содержащие генетический материал, фланкирующий в бактериальной хромосоме исходный участок интеграции Р-фактора. Р'-Плазмида с высокой частотой может передаваться в Р^--клетки.

Трансдукция означает перенос молекулы нуклеиновой кислоты из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку бактериофагом, что включает в себя высвобождение бактериофага из одной клетки и последующее заражение другой клетки. Существует два типа трансдукции. Специфическая трансдукция может происходить во время лизогенного жизненного цикла умеренного бактериофага, когда генетический материал бактерий может замещать часть генома бактериофага. Эта часть бактериальной ДНК реплицируется как часть фагового генома и фаг может ее перенести в другую реципиентную клетку. В случае неспецифической трансдукции бактериальной ДНК может быть замещен целый геном литического фага. Когда этот фаг инфицирует другую бактерию, он инъецирует ДНК реципиенту, где она может быть заместить часть ДНК реципиентной клетки.

Электропорация представляет собой процесс, в котором клетки смешивают с молекулами нуклеиновой кислоты, а затем кратковременно воздействуют импульсами высокого электрического напряжения. Клеточная мембрана клетки-хозяина становится проницаемой, тем самым, позволяя чужеродным нуклеиновым кислотам проникать в клетку-хозяина.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения донорную молекулу ДНК до введения в прокариотическую клетку-хозяина подвергают УФ-облучению, так как известно, что это облучение приводит к увеличению частоты рекомбинации.

В соответствии с изобретением первичную прокариотическую клетку, содержащую реципиентную и донорную молекулы ДНК, культивируют в таких условиях, которые стимулируют образование коинтеграта или гибридной молекулы между реципиентной и донорной молекулами ДНК и рекомбинацию, предпочтительно негомологичную рекомбинацию, между двумя субстратами рекомбинации, т. е. в условиях, позволяющих отбор последовательностей рекомбинантных ДНК.

Если первая маркерная последовательность донорной молекулы ДНК представляет собой маркер устойчивости к антибиотику, первичную прокариотическую клетку, содержащую реципиентную и донорную молекулы ДНК, культивируют в присутствии антибиотика, к которому клетка-хозяин чувствительна и к которому генный продукт первой маркерной последовательности обуславливает устойчивость. В особенно предпочтительном варианте осуществления, если находящаяся на донорной молекуле ДНК первая маркерная последовательность представляет собой §рес^к, генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к спектиномицину, первичный прокариотический организм культивируют в присутствии спектиномицина. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, если находящаяся на донорной молекуле ДНК первая маркерная последовательность представляет собой р111ео'\ генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к флеомицину, первичный прокариотический организм культивируют в присутствии флеомицина. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, если находящаяся на донорной молекуле ДНК первая маркерная последовательность представляет собой 1с'\ генный продукт которого обуславливает устойчивость клетки к тетрациклину, первичный прокариотический организм культивируют в присутствии тетрациклина.

Если первая маркерная последовательность донорной молекулы ДНК представляет собой пищевой маркер, первичную прокариотическую клетку, содержащую реципиентную и донорную молекулы ДНК, культивируют в среде с отсутствием конкретного необходимого питательного вещества, которое клеткахозяин самостоятельно синтезировать не может и снабжение которым клетки-хозяина происходит при введении донорной молекулы и экспрессии первого маркерного гена, содержащегося в донорной молекуле. При экспрессии гена первого пищевого маркера добавлять необходимое питательное вещество к среде, в которой растет прокариотическая клетка, не обязательно.

Если вторая маркерная последовательность, третья маркерная последовательность и/или четвертая

- 10 012070 маркерная последовательность представляют собой маркеры устойчивости к антибиотикам, тогда в предпочтительном варианте осуществления первичную прокариотическую клетку можно дополнительно культивировать в присутствии второго, третьего и/или четвертого антибиотика, к которым генные продукты второй маркерной последовательности, третьей и четвертой маркерной последовательности, соответственно, обуславливают устойчивость. Предпочтительно первичную прокариотическую клетку культивируют не только в присутствии флеомицина, или спектиномицина, или тетрациклина, но также дополнительно и в присутствии хлорамфеникола. Наиболее предпочтительно, чтобы первичная прокариотическая клетка росла и размножалась в присутствии флеомицина, спектиномицина, хлорамфеникола и тетрациклина.

После культивирования прокариотических клеток в селективных условиях выделяют вторичные прокариотические клетки, содержащие коинтеграт или гибридную молекулу, сформированные реципиентной и донорной молекулами ДНК. Данный коинтеграт содержит рекомбинантные последовательности ДНК. Присутствие коинтеграта и/или рекомбинантных последовательностей ДНК можно проверять и выявлять несколькими способами, такими как анализ профиля рестрикции, амплификация ПЦР и/или секвенирование. Например, если вторая маркерная последовательность донорной молекулы и третья или четвертая маркерная последовательность реципиентной молекулы представляют собой уникальные последовательности распознавания праймеров, тогда специфические фрагменты коинтеграта для выявления присутствия соответствующего сочетания маркеров можно амплифицировать в ПЦР с применением соответствующих праймеров, распознающих эти маркерные последовательности. Если коинтеграт не образовался, т.е. рекомбинация не произошла, эти фрагменты выявить нельзя. Например, если вторая маркерная последовательность донорной молекулы и третья или четвертая маркерная последовательность реципиентной молекулы представляют собой уникальные участки расщепления рестрикционных ферментов, тогда коинтеграт для выявления специфических фрагментов ДНК можно подвергнуть анализу рестрикционными ферментами. Если коинтеграт не образовался, т.е. рекомбинация не произошла, эти фрагменты выявить нельзя.

В соответствии с изобретением первую и вторую последовательности рекомбинантных ДНК, содержащиеся в гибридной молекуле ДНК вторичной прокариотической клетки, можно выделять, и/или анализировать, и/или отбирать. Полученные первую и вторую последовательности рекомбинантных ДНК можно выделять, например, посредством амплификации ПЦР или расщепления соответствующими рестрикционными ферментами. Анализ содержащихся в гибридной молекуле ДНК первой и второй последовательностей рекомбинантных ДНК можно проводить, например, посредством способов секвенирования.

В соответствии с изобретением выделенные первая и вторая последовательности рекомбинантных ДНК можно снова вставлять в донорную молекулу ДНК и реципиентную молекулу ДНК, соответственно, и подвергать новому циклу рекомбинации с применением способа согласно изобретению.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения новых белков, ферментов и некодирующих последовательностей с новыми или улучшенными функциями и свойствами, где известные кодирующие белки последовательности или известные некодирующие последовательности подвергают одному или нескольким циклам рекомбинации с применением способа согласно изобретению для получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клеткехозяине. Настоящее изобретение также относится к белкам, ферментам и некодирующим последовательностям, полученным любым из способов согласно изобретению.

Настоящее изобретение также относится к плазмиде В. 8иЬй118 рМ1Х91, являющейся производным плазмиды р1Ь253 и способной реплицироваться В. 8иЬШ18, но не в Е. сой, и содержащей маркер зрес^к и маркер рЫео^к и рестрикционные участки 8са1, РриМ1 и ЕсоО1091 для вставки чужеродной последовательности ДНК.

Настоящее изобретение также относится к плазмиде В. 8иЬй118 рМ1Х101, являющейся производным плазмиды р1Ь253 и способной реплицироваться В. 8иЬй118, но не в Е. сой, и содержащей маркерную последовательность 1с^к и рестрикционные участки Х1ю1 и РьИ для вставки чужеродной последовательности ДНК.

Настоящее изобретение также относится к штамму В. 8иЬй118 Ό8Μ17158, содержащему плазмиду В. 8иЫ1118 рМ1Х91 (депонировано в Ό8ΜΖ, ОеийсНе 8атт1ипд £иг М1кгоогдаш8теп ииб 2е11ки1(игеп СтЬН, Вгаии8сйете1д, Сегтапу 21 февраля 2005 г., 8В202рМ1Х91) и к штамму В. 8иЬй118 17159, содержащему плазмиду В. 8иЫ1118 рМ1Х101 (депонировано в ^§ΜΖ, ОеийсНе §атт1ипд £иг М1кгоогдаш8теп ипб Ζе11ки1ΐи^еи СтЬН, Вгаип8сйете1д, Сегтапу оп 21 февраля 2005 г., 1А423рМ1Х101).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению плазмид В. 8иЬй118 рМ1Х91 и рМ1Х101, соответственно, в качестве донорных молекул ДНК в способе согласно изобретению, т.е. применению плазмид рМ1Х91 или рМ1Х101 для получения и/или детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. сой.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению плазмид Е. сой рЛСУС184 или рМ1Х100 или их производных в качестве реципиентной молекулы ДНК в способе согласно изобретению, т.е. применению плазмид рЛСУС184 или рМ1Х100 для получения и/или детектирования рекомбинант

- 11 012070 ных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. сой.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, который можно применять для проведения способа согласно изобретению для получения и детектирования в прокариотической клеткехозяине последовательностей рекомбинантных ДНК. В первом варианте осуществления набор содержит, по меньшей мере, первый контейнер, содержащий клетки штамма Е. сой АВ1157 в качестве прокариотической клетки-хозяина, второй контейнер, содержащий клетки штамма Е. сой АВ 1157, содержащие плазмиду Е. сой рАСУС184 или плазмиду Е. сой рМ1Х100, которые можно применять в качестве реципиентной молекулы ДНК, и третий контейнер, содержащий клетки штамма В. зиЬ11йз Ό8Μ4393, содержащие плазмиду В. зиЬййз рМ1Х91, или клетки штамма В. зиЬййз 1А423, содержащие плазмиду В. зиЬΪ11Ϊ8 рМ1Х101, которые можно применять в качестве донорной молекулы ДНК. Во втором варианте осуществления изобретения набор содержит, по меньшей мере, первый контейнер, содержащий клетки штамма Е. сой МХР1, являющегося мутантом Ми18^- штамма АВ 1157, в качестве прокариотической клетки-хозяина, второй контейнер, содержащий клетки штамма Е. сой АВ 1157, содержащие плазмиду рАСУС184 или рМ1Х100, и третий контейнер, содержащий клетки штамма В. зиЬййз П8М4393, содержащие плазмиду рМ1Х91, или клетки штамма В. зиЬййз 1А423, содержащие плазмиду рМ1Х101. В другом варианте осуществления набор содержит, по меньшей мере, первый контейнер, содержащий или клетки штамма Е. сой АВ1157, или штамм Е. сой МХР1, второй контейнер, содержащий ДНК плазмиды Е. сой рАСУС184 или рМ1Х100, и третий контейнер, содержащий ДНК плазмиды В. зиЬййз рМ1Х91 или плазмиды В. зиЬййз рМ1Х101.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения в прокариотической клетке гибридного гена и/или кодируемого гибридным геном белка. Способ получения гибридного гена и/или кодируемого белка включает в себя стадию проведения способа согласно изобретению для получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК, где в прокариотической клетке получают гибридный ген и/или кодируемый гибридным геном белок. После экспрессии гибридный ген и/или кодируемый белок отбирают в прокариотической клетке и/или выделяют из нее.

Настоящее изобретение также относится к гибридному гену, который можно получить способом согласно изобретению для получения гибридного гена или способом согласно изобретению для получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК.

Настоящее изобретение также относится к кодируемому гибридным геном белку, который можно получить способом согласно изобретению для получения гибридного гена или способом согласно изобретению для получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК и/или который можно получить способом согласно изобретению для получения кодируемого геном белка.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующим списком последовательностей, фигурами и примерами.

На фиг. 1 схематически проиллюстрирован способ согласно изобретению для осуществления и/или детектирования рекомбинации между двумя последовательностями ДНК. Первая последовательность, ген оха7, находится на плазмиде В. зиЬййз рТС2-рй1ео в качестве донорной молекулы ДНК. рТС2-рй1ео несет маркеры зрес^к и рй1ео^к, обуславливающие устойчивость к спектиномицину и флеомицину. Посредством электропорации рТС2-рй1ео вводят в клетку-хозяин Е. сой, содержащую плазмиду рТС3 в качестве реципиентной молекулы ДНК. рТС3 содержит вторую последовательность ДНК, ген оха11 и маркер ст¹/ обуславливающий устойчивость к хлорамфениколу. После введения рТС2-рй1ео клетки культивируют в присутствии спектиномицина и флеомицина, которые стимулируют формирование коинтеграта между двумя плазмидами и параллельно рекомбинацию между генами. Таким образом, при культивации получают клетки Е. сой, содержащие димерную плазмиду, содержащую новые последовательности рекомбинантных ДНК Е1 и Е2. Последовательности рекомбинантных ДНК можно анализировать посредством анализа рестрикционных профилей, амплификации ПЦР рекомбинантных генов Е1 и Е2 и/или секвенирования Е1 и Е2.

На фиг. 2 показаны физические карты плазмид риС19-рй1ео, р1с156, рАСУС184 и р1Ь253, применяемых для конструирования подходящих плазмид для проведения способа согласно изобретению.

На фиг. 3 показаны физические карты плазмид, сконструированных для проведения способа согласно изобретению. Плазмиды рМ1Х96 и рМ1Х97 не показаны, так как они являются такими же, как и рМ1Х95, но содержат оха5 и оха1, соответственно, вместо оха11. рМ1Х99 является такой же, как и рМ1Х98, но содержит оха1 вместо оха11.

На фиг. 4 показана структура генов, полученных ίη у1уо в процессе рекомбинации согласно изобретению между отличающихся на 22% генов оха. Участки идентичности последовательностей, в которых происходил кроссинговер, показаны подробно.

На фиг. 5 показана структура плазмиды Е. сой рМ1Х100, которую можно применять в качестве реципиентной молекулы ДНК в клетке-хозяине Е. сой. рМ1Х100 несет участок инициации репликации плазмиды рАСУС184, а также ген устойчивости к хлорамфениколу из нее. рМ1Х100 также несет ген 1;·κΖ из рВ1иезспр1 8К+.

На фиг. 6 показана структура плазмиды В. зиЬййз рМ1Х101, являющейся производной плазмиды В. зиЬййз р1Ь253 и которую можно использовать в качестве донорной молекулы ДНК в клетке-хозяине Е.

- 12 012070 сой. ρΜΙΧΙΟΙ несет маркер Егт^к, обуславливающий устойчивость к эритромицину, и Тс^к. обуславливающий устойчивость к тетрациклину. Ген устойчивости к тетрациклину амплифицирован из плазмиды рАСУС184.

На фиг. 7 показана структура плазмиды для контроля эффективности трансформации ρΜΙΧ102. ρΜΙΧ102, производная рВ1нс5СГ1р1 8К+, содержит ген Тс^к, амплифицированный из плазмиды рАСУС184. В ρΜΙΧ102 ген Тс^к находится под контролем промотора р1ас.

На фиг. 8 показана структура плазмиды для контроля эффективности трансформации ρΜΙΧ103. ρΜΙΧ103, производная ρΒΙυβδΜρΐ 8К+, содержит ген Тс^к, амплифицированный из плазмиды ρАСΥС184. В ρΜΙΧ103 ген Тс^к клонирован в противоположном направлении, чем ]э1ас. Таким образом, ген экспрессируется со своего собственного промотора.

На фиг. 9 схематически проиллюстрирована стратегия для клонирования генов оха7, оха11 и оха5 в плазмиду Е. сой ρΜΙΧ100 и в плазмиду В. зиЬййз ρΜΙΧ101. Для клонирования генов оха7, оха11 и оха5 в ρΜΙΧ100 гены амплифицировали с применением праймеров, содержащих на своих 5'-концах участки РзИ или ΧΙιοΙ. После расщепления этими ферментами амплифицированные фрагменты ДНК независимо лигировали в ρΜΙΧ100, которую предварительно расщепляли с применением ΡδΐΙ+ΧΙιοΙ. Компетентные клетки Е. той ΌΗ810 подвергали электропорации с использованием смесей после лигирования, а колонии, несущие положительные клоны, фенотипически отбирали по устойчивости к хлорамфениколу/белой окраске на планшетах с ЬВ, содержащих Ст (30 мкг/мл) + Χ-6;·11 (80 мкг/мл) + РТС (0,5 мМ). Выделяли плазмидные ДНК и анализировали посредством рестрикционного картирования. Результаты подтверждали, что ρΜΙΧ104 несет оха7, ρΜΙΧ106 несет οχα11, а ρΜΙΧ107 несет оха5. Для клонирования в плазмиду В. зиЫШз ρΜΙΧ101 οχα7 получали в виде фрагмента длиной 0,9 т.п.н. из ρΜΙΧ104 посредством рестрикции с применением РзП и ΧΙιοΙ и лигировали в ρΜΙΧ101, которую предварительно расщепляли теми же ферментами. После трансформации продуктом лигирования компетентных клеток В. зиЬ(1115 1А423 клетки отбирали в ЬВ, содержащей 0,5 мкг/мл эритромицина (Егт).

В 8ЕО ΙΌ № 1 и 2 приведены последовательности праймеров ОЬС1 и ОЬС2, соответственно, для амплификации οχα7 и введения рестрикционных участков Зс/Н и ΡρυΜΙ на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 3 и 4 приведены последовательности праймеров ОБС3 и ОЬС4, соответственно, для амплификации οχα11 и введения рестрикционных участков ВатШ и ЕсоО109I на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 5 и 6 приведены последовательности праймеров ОБС5 и ОЬС6, соответственно, для амплификации оха5 и введения рестрикционных участков ВатШ ЕсοО109I на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 7 и 8 приведены последовательности праймеров ОБС7 и ОЬС8, соответственно, для амплификации οxа1 и введения рестрикционных участков ВатШ ЕсοО109I на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 9 и 10 приведены последовательности праймеров ОБС9 и ОЬС10, соответственно, для амплификации οxа11 и введения рестрикционных участков §саI ЕсοО109I на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 11 приведена последовательность праймера ОЬС11, применяемого вместе с праймером ОБС8 (8ЕО ΙΌ № 8) для амплификации οxа1 и введения рестрикционных участков 8са! ЕсοО109I на 5'- и 3'-концах соответственно.

В 8ЕО ΙΌ № 12 и 13 приведены последовательности праймеров ОБ612 и ОЬ613, соответственно, для амплификации рекомбинантного гена К1, содержащегося в гибридной плазмиде ρΜΙΧ93.

В 8ЕО ΙΌ № 14 приведена последовательность праймера ОЬС14, применяемого вместе с праймером ОБС12 (8ЕО ΙΌ № 12) для амплификации рекомбинантного гена К1, содержащегося в одной из гибридных плазмид ρΜΙΧ95, ρΜΙΧ96 и ρΜΙΧ97.

В 8ЕО ΙΌ № 15 приведена последовательность праймера ОЬС15, применяемого вместе с праймером ОБС17 (8ЕО ΙΌ № 17) для амплификации рекомбинантного гена В2, содержащегося в гибридной плазмиде ρΜΙΧ93.

В 8ЕО ΙΌ № 16 приведена последовательность праймера ОЬС16, применяемого вместе с праймером ОБС17 (8ЕО ΙΌ № 17) для амплификации рекомбинантного гена В2, содержащегося в одной из гибридных плазмид ρΜΙΧ95, ρΜΙΧ96 и ρΜΙΧ97.

В 8ЕО ΙΌ № 17 приведена последовательность праймера ОБ617.

Пример 1. Рекомбинация ίη νίνο гетерологичных генов системы из двух плазмид (Е. отН/В. зиЬййз), где рекомбинантные последовательности ДНК отбирают по устойчивости к спектиномицину и/или флеомицину.

1. Материалы и методы.

1.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

Применяемые в этом примере бактериальные штаммы и плазмиды показаны в табл. 1 и 2 соответственно.

- 13 012070

Таблица 1

Бактериальные штаммы

Штаммы	Генотип	Ссылка или источник
ЁЁ СО11 АВ1157 Ν31Κ ЬзсГ	ЕЬг1 1еи6 ргоА2 Мз4, Εϊιίΐ агдЕЗ 1асУ1 да1К2 ага14 ху115 ПЙ11 ЕзхЗЗ з±г31 зирЕ44Ейг+ ЬзоР.'В па1Е	коллекция штаммов М. Кас1п1ап
Е. СО11 ΜΙΧΡ1	Аз АВ1157 Ма1Е К’ ЬиЕ тиЕЗ::Тп5 (капЕ)	аллель тиЕЗ из коллекции штаммов М, Вабтап
Е. со11 ϋΗ5α	ЗирЕ44 Д1асЧ169 (ф801ас2 ΔΜ15) ЬзбК17 гесА1 епбА1 дугА96 Ε1τί-1 ге1 А1	(8)
В. зиЬйбНз Ο3Μ4393	агоВ2 7грС2 Ызб	Германская коллекция штаммов ϋ5ΜΖ

Таблица 2

Плазмиды

Плазмиды	Отбор	Ссылка или источник
рАСУС184	Тек6 СапТ	Νθη Епд1апб В1о1аЬз (1)
р!Ь253	ЕгтЕ	(6)
рйс156	Атрк ЗресЕ	(7)
риС19-РЬ1ео	Атрк РЬ1ео“	(2)

1.2. Условия выращивания и среды для культивирования.

Штаммы Е. со11 и В. 8иЬШ18 культивировали при 37°С в среде ЬВ (ΌίΓοο БаЬогаЮпев. ΩοΙγοιΙ. И8А). Когда среду применяли в планшетах (ЬВА). на литр добавляли 15 г агара (ЭГсо). Когда было необходимо. среду дополняли антибиотиками. где конечные концентрации были следующими: тетрациклин (8щша-Л1бпс11 СЫт1е. 8ΐ. ОнепЦп Ра11ау1ег. Егаисе). 12.5 мкг/мл; хлорамфеникол (81дта-А1бйсй СЫт1е). 30 мкг/мл; ампициллин (8|дта-А1бпс11 СЫт1е). 100 мкг/мл; эритромицин (8|дта-А1бпс11 СЫт1е). 0.5 мкг/мл; спектиномицин (8щта-Л1бпс11 СЫт1е). 75 мкг/мл; флеомицин (Еиготебех. ЗйазЬоигд. Егапсе). 2 мкг/мл. Когда ЬВЛ дополняли спектиномицином плюс флеомицином. конечные концентрации составляли 60 и 1 мкг/мл соответственно.

1.3. Манипуляции с ДНК и микроорганизмами.

Трансдукция.

Штамм Е. соб ΜΙΧΡ1 конструировали с применением опосредованной Р1 трансдукции (3). Трансформация.

Плазмиды \геге вводили в штаммы Е. сой посредством электропорации с применением ЕррепбогГ Е1ес1горогаЮг 2510 (ЕррепбогГ АС. НатЬигд. Сегтапу) и по инструкциям поставщика. Получали компетентные клетки В. 8иЬШ18 и трансформировали. как описано у УазЬш е1 а1. (9).

Манипуляции с ДНК.

Для молекулярно-биологических способов применяли установленные протоколы (4). Ферменты для манипуляций с ДНК приобретали из Епд1апб Вю1аЬз (Веуег1у. МА. И8А). ΜΒΙ Еегтеп1ав (У11ши8.

БцНиаша). Рготеда (Маб1воп. νίβ.) или 81га1адепе (Ба 1о11а. СА. И8А) и применяли. как рекомендовано производителем. Когда было необходимо расщепленную рестрикционными эндонуклеазами ДНК очищали от агарозного геля с применением набора Ыис1ео8рт Е.х1гас1 Кй (Масйегу-Ыаде1).

Плазмидную ДНК выделяли из Е. со11 с применением набора №1с1ео8рш Кй (Масйегу-Ыаде1 СтЬН

- 14 012070 & Со., Ойген Сегтапу) по инструкциям производителя. Для выделения плазмидной ДНК из В. киЬйШ использовали тот же набор, но первую стадию лизиса проводили посредством инкубации клеток с 2 мг мл^-1 лизоцима 30 мин при 37°С.

Используемые праймеры синтезировали в Ргойдо Егапсе 8А8 (Рапк, Егапсе).

Нуклеотидные последовательности определяли в обоих направлениях посредством Сепоте Ехргекк (Меу1ап, Егапсе). Последовательности анализировали с применением пакета 1пГоЫодеп (Сепоро1е б'Еугу, Еугу, Егапсе). Для сравнения последовательностей использовали программу С1ийа1\У.

Амплификация посредством ПЦР.

Реакции ПЦР проводили с применением Майегсус1ег СгаЛеп! (ЕррепбогГ АС, НатЬигд, Сегтапу). Реакции проводили в объеме 50 мкл с применением высокоточной ДНК-полимеразы Негси1а§е Епбапсеб ΌΝΑ ро1утегаке (81га1едепе) в следующих условиях: 96°С в течение 3 мин, 35 циклов, состоящих из 96°С в течение 30 с, температуры отжига в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин и конечная стадия элонгации при 72°С в течение 10 мин. Температуру отжига определяли посредством вычитания 5°С из нижней температуры Т_т используемых праймеров. Когда было необходимо, продукты ПЦР очищали с применением набора №1с1ео8рт Ехйас! (Мас11егу-№ще1). Продукты амплификации анализировали посредством электрофореза в 0,7% агарозных гелях (81§та).

2. Общий принцип.

Данный эксперимент проводили для получения новых проявляющих выгодные свойства молекул посредством рекомбинации двух исходных генов, обладающих различными степенями идентичности последовательностей, ш у1уо. Применяемый принцип является таким, как указано далее.

Гены для рекомбинации находились на двух различных плазмидах, не обладающих гомологией их нуклеотидных последовательностей. Первая плазмида представляет собой репликативную плазмиду Е. сой, обуславливающую устойчивость или к хлорамфениколу (Ст), или тетрациклину (Тс). Она основывается на стандартном клонирующем векторе рАСУС184, низкокопийной плазмиде, полученной из Νον Епд1апб Вю1аЬ§.

Вторая плазмида представляет собой плазмиду ВасШик киЬййк, полученную из р1Ь253 (81топ апб Сборт, 1988). Она не способна реплицироваться в Е. сой и несет два маркера устойчивости к антибиотикам для спектиномицина (8рс) и флеомицина (РЫео) соответственно.

Для рекомбинации пар гетерологичных генов, находящихся на этих двух векторах, плазмиду В. киЬпосредством электропорации вводят в штаммы Е. сой, несущие репликативную плазмиду. Это схематически показано на фиг. 1. Такие штаммы или полноценны (+), или дефицитны (-) по системе репарации ошибочного спаривания (ММК), контролирующей и мутагенез, и рекомбинацию.

После электропорации, трансформантов отбирали с применением антибиотиков, к которым плазмида В. киЫШк обеспечивает устойчивость (8рс и РЫео). Такое селективное давление стимулирует рекомбинацию между гетерологичными генами, так как в этих условиях могут расти только клетки, несущие коинтеграт, формируемый плазмидами В. киЬйШ и Е. сой. Гибридная плазмида обуславливает устойчивость к 8рс и РЫео и реплицируется с участка инициации репликации Е. сой, так как участок инициации репликации В. киЬйШ не функционален. Кроме того, она несет два рекомбинантных гена К1 и К2.

Первая стадия представляла собой клонирование исходно выбранных в качестве цели для оценки эффективности рекомбинации генов в векторы Е. сой и В. киЬйШ

Эксперимент по рекомбинации между генами оха проводили и в штаммах дикого типа, и в штаммах, дефицитных по репарации ошибочного спаривания. Эксперименты проводили или между парами идентичных генов, или между парами отличающихся генов.

Плазмидные ДНК до электропорации подвергали УФ-облучению, так как было показано, что это облучение ведет к 10-кратному увеличению частот рекомбинации.

Рекомбинацию также проводили в штаммах, временно являющихся мутантными, посредством обработки 2-аминопурином. 2-Аминопурин представляет собой аналог аденина, встраивающийся в ДНК во время роста бактерий и насыщающий систему ММК. Таким образом, образуется транзиторный мутантный фенотип, так как после удаления 2-аминопурина восстанавливается состояние дикого типа. Данный временный контроль активности репарации ошибочного спаривания обеспечивает стабильный фон для используемых в рекомбинации штаммов, позволяя избегать накопления мутаций в их геномах.

3. Результаты.

Конструирование вектора В. киЬйШ

Для конструирования вектора В. киЬййк с тем, чтобы он нес гены для рекомбинации, два генных маркера, обуславливающих устойчивость к антибиотикам спектиномицину (крес^К) и флеомицину (рЫео^К), соответственно, клонировали в плазмиду р1Ь253, следуя принципу двухстадийного клонирования.

Сначала из плазмиды рю156 получали ген крес^К в виде фрагмента 8ас1 длиной 1294 п.н. Фрагмент очищали, а затем лигировали в расщепленную 8ас1 р1Ь253. Компетентные клетки В. киЬййк Ό84393 трансформировали смесью после лигирования, а трансформанты отбирали на планшетах с ЬВА, содержащих 75 мкг мл^-1 спектиномицина. Рестрикционные анализы полученной из трансформантов плазмид

- 15 012070 ной ДНК подтверждал, что она содержала производные р1ЬР253, несущие ген §рес^К.

На второй стадии ген р111ео^К клонировали в р1Ь253-§рес. Плазмиду рИС19-рй1ео расщепляли рестрикционными ферментами ЕсоК! и 8аИ и фрагмент длиной 574 п.н., соответствующий рй1ео^К очищали от геля и лигировали в р1Ь253-§рес, предварительно расщепленную теми же ферментами. Компетентные клетки В. киЬййк Ό8Μ4393 трансформировали смесью после лигирования, а трансформантов отбирали на планшетах с ЬВЛ, содержащих 60 мкг мл^-1 флеомицина. Рестрикционные анализы полученной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она содержала ожидаемую плазмиду размером 6,69 т.п.н., несущую гены зрес^К и рй1ео^К. Плазмиду обозначили рМ1Х91 (см. фиг. 3).

Конструирование вектора для контроля эффективности трансформации.

Для применения в экспериментах по рекомбинации в качестве контроля эффективности трансформации штаммов Е. сой при отборе с спектиномицином и флеомицином сконструирован вектор. Вектор сконструирован так, как указано далее: после расщепления р1с156 с применением ВатН1 и ЕсоК1 получали ген устойчивости к спектиномицину (зрес^К) в виде фрагмента длиной 1,25 т.п.н. Его клонировали по соответствующим сайтам рИС-рЫео после гена устойчивости к флеомицину (рй1ео^К). После электропорации компетентных клеток Е. сой ΌΗ10Β смесью после лигирования устойчивые к спектиномицину и флеомицину колонии отбирали на планшетах с ЬВЛ, содержащих оба антибиотика в конечных концентрациях 60 мкг/мл и 1 мкг/мл, соответственно. Рестрикционные анализы выделенной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она соответствует ожидаемой конструкции длиной 4,46 т.п.н., которую обозначили рМ1Х92 (см. фиг. 3).

Клонирование кодирующих β-лактамазы генов в векторы Е. сой и В. 8иЬй118.

В качестве мишени для оценки эффективности рекомбинации в штаммах Е. сой дикого типа и мутантном Ми18^- выбрали четыре гена, кодирующих β-лактамазы. Такие гены, оха7 (инвентарный номер СепВапк Х75562), оха11 (инвентарный номер СепВапк Ζ22590), оха5 (инвентарный номер СепВапк Х58272) и оха1 (инвентарный номер СепВапк 102967) демонстрируют различные степени отличия их нуклеотидных последовательностей.

Последовательность оха1 и последовательности оха5, оха7 и оха11, соответственно, отличаются на 40%. Последовательность оха5 и последовательности оха7 и оха11, соответственно, отличаются: на 22%. Последовательность оха7 и последовательность оха11 отличаются на 5%.

Четыре гена оха клонировали в плазмиду Е. сой рЛСУС184, тогда как оха7, оха11 и оха1 также клонировали в плазмиду В. 8иЬй118 рМ1Х91. Клонирование генов проводили следующим образом: оха 7 амплифицировали посредством ПЦР с применением праймеров, сконструированных для внесения сайтов 8са1 и РриМ1 на 5'- и 3'-концах амплифицируемой ДНК, соответственно (праймеры ОЬС1 с 8ЕО ΙΌ № 1 и ОЬС2 с 8ЕО ΙΌ № 2). Продукт ПЦР расщепляли этими рестрикционными ферментами и полученный фрагмент длиной 991 п.н. лигировали в рМ1Х91, предварительно расщепленную теми же ферментами. Компетентные клетки В. 8иЫ1Й8 О8М4393 трансформировали смесью после лигирования, а отбор трансформантов проводили на планшетах с ЬВЛ, содержащих 75 мкг мл спектиномицина. Рестрикционные анализы полученной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она содержит ожидаемую плазмиду рМ1Х94 длиной 6,89 т.п.н., несущую оха7 (см. фиг. 3).

Для клонирования оха7 в вектор Е. сой рЛСУС184, описанный выше продукт ПЦР, а также рЛСУС184, расщепляли с применением РриМ1 и 8саЕ С применением фрагмента Кленова ДНКполимеразы Ι у расщепленных ДНК формировали тупые концы и проводили их лигирование. Компетентные клетки Е. сой ЭН10В подвергали электропорации со смесью после лигирования, а трансформантов отбирали на планшетах с ЬВЛ, содержащих 12,5 мкг мл^-1 тетрациклина. Рестрикционные анализы выделенной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она соответствовала ожидаемой конструкции длиной 4,33 т.п.н., которую обозначили рМ1Х93 (см. фиг. 3).

Для клонирования оха11, оха5 и оха1 в рЛСУС184 гены амплифицировали посредством ПЦР с применением праймеров, сконструированных для внесения сайтов ВатН1 и ЕсоО1091 на 5'- и 3'-концах амплифицируемой ДНК соответственно. Пары праймеров, применяемых для амплификации оха11, оха5 и оха1 составляли, соответственно, ОЬС3 (8ЕО ΙΌ № 3)/ОЬС4 (8ЕО ΙΌ № 4), ОЬС5 (8ЕО ΙΌ № 5)/ОЬС6 (8ЕО ΙΌ № 6) и ОЬС7 (8ЕО ΙΌ № 7)/ОЬС8 (8ЕО ΙΌ № 8). Продукты ПЦР расщепляли с применением ВатН и ЕсоО109I и полученные фрагменты длиной 997 п.н. (оха11), и 830 п.н. (оха5), и 936 п.н. (оха1) независимо лигировали в рЛСУС184, предварительно расщепленную теми же ферментами. Компетентные клетки Е. сой ЭН10В подвергали электропорации с применением смесей после лигирования, а трансформантов отбирали на планшетах с ЬВЛ, содержащих 30 мкг мл^-1 хлорамфеникола. Рестрикционные анализы полученной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она соответствует ожидаемым плазмидам 6,89 т.п.н. плазмидам рМЕХ95 (3,72 т.п.н.), рМЕХ96 (3,55 т.п.н.) и рМЕХ97 (3,66 т.п.н.) (см. фиг. 3).

Для клонирования оха11 и оха1 в рМЕХ91 гены амплифицировали посредством ПЦР с применением праймеров, сконструированных для внесения сайтов 8са! и ЕсоО109I на 5'- и 3'-концах амплифицируемой ДНК соответственно. Для амплификации оха11 и оха1 соответственно использовали пары праймеров ОЬС9 (8ЕС ΙΌ № 9)/ОЬС10 (8ЕС ΙΌ № 10), и 0Ь11 (8ЕС ΙΌ № 11)/ОЬС8. Продукты ПЦР расщепля

- 16 012070 ли 8са1 и ЕсоО1091 и полученные фрагменты длиной 995 п.н. (оха11) и 934 п.н. (оха1) независимо лигировали в рМ!Х91, предварительно расщепленную теми же ферментами. Компетентные клетки В. киЫШк Ό8Μ4393 трансформировали смесью после лигирования, а отбор трансформантов проводили на планшетах с ЬВЛ, содержащих 75 мкг мл^-1 спектиномицина.

Рестрикционные анализы полученной из трансформантов плазмидной ДНК показали, что она соответствует ожидаемым плазмидам рМ1Х98 (6,89 т.п.н.) и рМ1Х99 (6,83 т.п.н.). См. фиг. 3.

Рекомбинация генов оха ίη νίνο у Е. сой дикого типа по сравнению с мутантом ΜιιΙδ^-.

На первой стадии компетентные клетки Е. сой АВ1157 и ее мутанта ΜιιΙδ^-. Е. сой МХР1 посредством электропорации независимо трансформировали полученными из рАСУС184 несущими гены оха плазмидами, рМ1Х93, рМ1Х95, рМ1Х96 или М1Х97. Трансформантов отбирали на основе их устойчивости к тетрациклину или хлорамфениколу. Присутствие пригодных плазмид далее подтверждали посредством рестрикционного анализа и/или ПЦР.

На второй стадии из содержащей тетрациклин или хлорамфеникол селективной среды получали компетентные клетки штаммов дикого типа и Ми1§^-, несущие репликативные плазмиды. Затем такие компетентные клетки посредством электропорации независимо трансформировали несущими гены оха плазмидами В. кийййк, рМ1Х94, рМ1Х98 или рМ1Х99.

После электропорации, трансформантов отбирали на планшетах с ЬВ, содержащих антибиотики для каждой обуславливающей устойчивость плазмиды В. киЬййк: спектиномицин и флеомицин, в конечных концентрациях в размере 60 мкг мл^-1 и 1 мкг мл^-1 соответственно. Такое селективное давление стимулирует рекомбинацию между генами оха, так как в данных условиях могут расти только те клетки, которые несут гибридную плазмиду, сформированную плазмидами В. киЬййк и Е. сой. Планшеты в течение ночи инкубировали при 37°С, а затем плазмидную ДНК трансформантов анализировали посредством расщепления рестрикционными ферментами для подтверждения того, что она содержит гибридные плазмиды (длиной приблизительно 10,5 т.п.н.), несущие два рекомбинантных гена В¹ и К². В некоторых случаях рекомбинантные гены амплифицировали посредством ПЦР и секвенировали. Если резидентная плазмида представляла собой рМ1Х93, то К1 амплифицировали с применением ОЬ612 (8ЕО ΙΌ № 12)/ОйС13 (8ЕО ΙΌ № 13), а К2 с применением ОЙС15 (8ЕО ΙΌ № 15)/ОйС17 (8ЕО ΙΌ № 17); если резидентная плазмида представляла собой рМ1Х95, рМ1Х96 или рМ1Х97, то К1 амплифицировали с применением ОЕ612/ОБ614 (8ЕО ΙΌ № 14), а В2 с применением ОБ616 (8ЕО ΙΌ № 16)/ОБ617.

В экспериментах по рекомбинации плазмиду В. киЬййк рМЙХ91 использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как плазмиду Е. сой рМЙХ92 использовали в качестве контроля эффективности трансформации при отборе на спектиномицине и флеомицине. рМЙХ92 может реплицироваться в штаммах, несущих плазмиды, производные рАСУС184, так как их участки инициации репликации (Со1Е1 и р15 соответственно) совместимы. Плазмидные ДНК перед электропорацией подвергали УФ-облучению (200 Дж/м²), так как показано, что это облучение приводит к 10-кратному увеличению частот рекомбинации.

Частоты рекомбинации подсчитывали делением эффективности трансформации, полученной с плазмидами В. 8иЫ1Й8, на эффективность трансформации, полученную с контрольным вектором рМЙХ92. В свою очередь, эффективность трансформации подсчитывали как количество колониеобразующих единиц (КОЕ), полученных на грамм ДНК в ранее описанных условиях.

Полученные результаты обобщены в табл. 3. У штамма дикого типа рекомбинанты в экспериментах получали при использовании идентичных или отличающихся на 5% генов оха, тогда как у мутанта Ми1§ рекомбинация также происходила между отличающимися на 22% генами.

Таблица 3

Частоты рекомбинации ίη νίνΌ, полученные для генов оха у штаммов Е. сой дикого типа и Мн18^-

Генетическое отличие	Частоты рекомбинации
штамм дикого типа	штамм МиЕЗ“
0		10‘4
5	ГсР	ЙЁ5
22	-
40	-	-

Рекомбинация генов оха ίη νί\Ό у Е. сой дикого типа по сравнению с обработанной 2аминопурином (2-АР).

На первой стадии компетентные клетки Е. сой АВ1157 трансформировали посредством электропорации производными от рАСУС184 несущими ген оха11 плазмидами, рМРХ95. Трансформантов отбирали на основе их устойчивости. Присутствие подходящей плазмиды подтверждали рестрикционным анализом и/или ПЦР.

На второй стадии получали компетентные клетки данного штамма в присутствии 200 мкг/мл 2-АР и

- 17 012070 независимо подвергали электропорации плазмидами В. διώΐίΐίδ рМ1Х94, несущей оха7, или рМ1Х98, несущей оха11.

Плазмиду В. киЬйШ рМ1Х91 использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как плазмиду Е. со11 рМ1Х92, несущую маркеры Зрс^К и Рй1ео^К, использовали в качестве контроля эффективности трансформации. Плазмидные ДНК перед электропорацией подвергали УФ-облучению для увеличения частоты рекомбинации.

Результаты обобщены в табл. 4. У штамма дикого типа рекомбинанты в экспериментах получали при использовании идентичных генов оха, тогда как у обработанного 2-АР штамма, рекомбинация также происходила между отличающимися на 5% генами.

Таблица 4 Частоты рекомбинации ίη νίνο, полученные для генов оха у штаммов Е. сой дикого типа и обработанного 2-АР

Генетическое отличие	Чзсфофы рекомбинации
штамм дикого типа	ппгамм МиЬ5
0	ЙЁ1	ИГ5
5	-

Заслуживало внимания то, что рекомбинация происходила между различающимися на 22% генами, у которых наибольший участок идентичных последовательностей составлял 22 нуклеотида (оха5/оха11) и 18 нуклеотидов (оха5/оха7) соответственно (см. фиг. 5 и 6). Сообщалось, что рекомбинация становится неэффективной ниже минимальной длины участков гомологии, известных как МЕРЗ (минимальный эффективный участок процессинга). Длина МЕРЗ варьирует в зависимости от пути рекомбинации, но описано, что она находится в интервале от 23 до 90 пар оснований (5).

Анализы последовательностей генов К1 и К2, находящихся на полученных 54 гибридных плазмидах, в экспериментах, включающих в себя отличающиеся на 5 или 22% гены, показали, что 46 из этих гибридных плазмид отличались друг от друга. Этот результат означает, что они соответствовали различным событиям рекомбинации, и, следовательно, что посредством рекомбинации ίη νί\Ό получена высокая степень генетического разнообразия.

Большинство из рекомбинантных генов были получены посредством нереципрокных одиночных кроссинговеров в различных участках идентичности последовательностей в интервале от 4 до 101 нуклеотида. В некоторых случаях наблюдали множественные кроссинговеры, с получением мозаичных генов или К1, или К2. Рекомбинантные гены, полученные при скрещивании оха7/оха5 и оха11/оха5, изображены на фиг. 4.

Сравнение последовательностей ДНК и выведенных из них аминокислотных последовательностей рекомбинантных генов также выявило, что 53% из них соответствуют новым генам оха (4). Так как во время рекомбинации не образовывалось сдвигов рамки считывания или стоп-кодонов, они предположительно могут кодировать 38 новых функциональных β-лактамаз.

Таблица 5

Сравнение нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей рекомбинантных генов оха, полученных посредством рекомбинации ίη νί\Ό

Сравнение последовательностей	Новые гены	Новые белки
В1	33/54	21/54
К2	25/54	17/54
Всего	58/108 (53%)	38/108 (35%)

Пример 2. Рекомбинация ίη νί\Ό гетерологичных генов системы из двух плазмид (ЕксйепсШа со11/ВасШи8 киЬДШ), где рекомбинантные последовательности ДНК отбирают по устойчивости к тетрациклину.

Для подтверждения полученных в примере 1 результатов и облегчения клонирования и рекомбинации генов разработали другую систему из двух плазмид. Эта система основана на отборе клеток, устойчивых к тетрациклину.

1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

Используемые в данном примере бактериальные штаммы и плазмиды приведены в табл. 6 и 7 соответственно.

- 18 012070

Таблица 6

Бактериальные штаммы

Штаммы	Генотип	Ссылка или источник
Е. со11 АВ1157 На” НзсГ	Тйг1 1еиб ргоА2 Й1з4, ΐϊιίΐ агдЕЗ 1асУ1 да1К2 ага14 ху115 πιΐ.11 ЬзхЗЗ зсг31 зирЕ441:Нг+ йзбН'В па1в	коллекция штаммов М. Кабтап
Е. соИ ΜΙΧΡ1	Аз АВ1157 Νθΐ* В ЬиС ти£2::Тп5 (капк)	аллель ти±5 из коллекции штаммов М. Вабтап
Е. соИ ϋΗΙΟΒ	Г’ тпсгА Д(тгг‘ йзбРМЗ-тсгВС) ф80 1асгДт15 Д1асХ74 гесА1 епс!А1 агаР139 Д(ага, 1еи)7697 да1К λ” грзЪ пирС	ΙηνίΡΓοςβηε Ы£е ТесЙпоЬодаез Са£ 18290-015
В. зиЬШ1з 1А423	агдСН15 1еиВ8 гесА4 £Иг-5 Ьзбв£ К'М'	Вас111из СепеМс збоск сепьег (ΟΗίο 5£аСе υηίνθΓδίΙγ, ОЗА)

Таблица 7

Плазмиды

Плазмиды	Отбор
плазмида Е. σοΙί ρΜΙΧΙΟΟ	Стк
плазмида В. зиЫШз ρΜΙΧίΟΙ	Тск, Егт*
плазмиды для контроля эффективности трансформации рМ1Х102 и рМТХЮЗ	Атр”, Тск

2. Результаты.

2.1. Конструирование плазмиды Е. сой рМ1Х100.

Плазмида рМ1Х100 несет участок инициации репликации рЛСУС184, а также ее ген устойчивости к хлорамфениколу. рМ1Х100 также несет ген 1ас2 из рВ1иезспр! 8К+, облегчающий отбор в экспериментах по клонированию. 1ас2 кодирует фрагмент β-галактозидазы, обуславливая α-комплементацию для отбора синих/белых рекомбинантов в среде, содержащей Х-Са1 и 1РТС. Таким образом, колонии, несущие рМ1Х100, должны быть в этой среде синими, а колонии, несущие плазмиду со вставленным в полилинкер (МС8) геном, должны быть белыми. Физическая карта плазмиды рМ1Х100 показана на фиг. 5.

2.2. Конструирование плазмиды В. зиЫШз рМ1Х101.

Плазмида рМ1Х101 представляет собой производное плазмиды В. зиЫШз р1Ь253. Так как маркер р1Ь253 Егт^В, обуславливающий устойчивость к эритромицину, не пригоден в Е. сой, вводили маркер устойчивости к тетрациклину, позволяющий отбор гибридных молекул в экспериментах по рекомбинации. Ген устойчивости к тетрациклину амплифицировали с плазмиды рЛСУС184. Таким образом, рМ1Х101 несет два маркера: Егт^В в качестве селекционного маркера в В. зиЫШз для клонирования генов-мишеней и Тс^В для отбора рекомбинантных гибридных молекул в Е. сой. Физическая карта плазмиды рМ1Х101 показана на фиг. 6.

2.3. Конструирование плазмид для контроля эффективности трансформации рМ1Х102 и рМ1Х103.

Так как вектор В. зиЬййз не способен реплицироваться в Е. сой, для оценки частоты рекомбинации необходим контроль эффективности трансформации. Так как рекомбинанты отбирают по устойчивости к тетрациклину, тот же маркер должен присутствовать на контрольном векторе. Плазмида рМ1Х102, про

- 19 012070 изводное рВ1иеэспр1 8К+, содержит ген Тс^К, амплифицированный с рАСУС184. В рМ1Х102 ген Тс^К находится под контролем промотора р1ас. Физическая карта плазмиды рМ1Х102 показана на фиг. 7.

Во втором контрольном векторе рМ1Х103 ген 1с^К клонирован в противоположном направлении от р1ас. Таким образом, этот ген экспрессируется со своего собственного промотора. Физическая карта плазмиды рМ1Х103 показана на фиг. 8.

2.4. Клонирование οχα7, οχα11 и οχα5 в плазмиду Е. Μί рМ1Х100.

Для подтверждения результатов экспериментов по рекомбинации между отличающимися на 0, 5 и 22% генами οχα, полученные в примере 1, οχ;·ι7. οχα11 и оха5 клонировали в плазмиду Е. сοI^ рМ1Х100. Эти гены амплифицировали с применением праймеров, содержащих на своих 5'-концах участки Рэй или ХМ. После расщепления этими ферментами амплифицированные фрагменты ДНК независимо лигировали в рМ1Х100, предварительно расщепленную РэЙ+ХМ. Компетентные клетки Е. сοI^ ΌΗΒ10 подвергали электропорации со смесями после лигирования, а колонии, несущие положительные клоны, отбирали по фенотипу устойчивости к хлорамфениколу/белого цвета на планшетах с ЬВ, содержащих Ст (30 мкг/мл) + Х-Са1 (80 мкг/мл) + 1РТС (0,5 мМ). Для каждого клонирования οχα анализировали пять таких трансформантов.

Получали плазмидные ДНК и анализировали посредством рестрикционного картирования. Результаты подтверждали, что рМ1Х104 несет οχα7, рМ1Х106 несет οχα11, а рМ1Х107 несет οχα5.

Для клонирования в плазмиду В. эиЬПНэ рМ1Х101 οχα7 получали посредством рестрикции Рэй и ХМ в виде фрагмента из рМ1Х104 длиной 0,9 т.п.н. и лигировали в рМ1Х101, предварительно расщепленную теми же ферментами. После трансформации компетентных клеток В. эиЬййэ 1А423 продуктом лигирования, клетки отбирали на ЬВ, содержащей 0,5 мкг/мл эритромицина (Егт). Плазмидную ДНК получали из 24 трансформантов и анализировали посредством рестрикции. Результаты подтверждали, что все клоны содержали плазмиду рМ1Х105 длиной 7 т.п.н.

Принцип клонирования генов оха7, οχα11 и οχα5 в плазмиду Е. Μί рМ1Х100 и в плазмиду В. эиЬййэ рМ1Х101 показан на фиг. 9.

2.5. Рекомбинация генов оха ίη νίνο у Е. Μί дикого типа по сравнению с мутантом Мий^-.

Компетентные клетки Е. Μί АВ1157 йэбК^- и ее мутанта ММК^-, Е. Μί АВ1157 йэбК^- СДтиЙ, посредством электропорации независимо трансформировали плазмидами рМ1Х104 (оха7), рМ1Х106 (οχα11) и рМ1Х107 (оха5).

Для рекомбинации генов оха штаммы Е. Μί, несущие эти плазмиды, подвергали электропорацией с применением рМ1Х105 (оха7). Плазмиду В. эиЬййэ рМ1Х101 использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как несущий маркер Тс^К вектор Е. Μί рМ1Х102 при отборе на тетрациклине использовали в качестве контроля эффективности трансформации. Все ДНК до электропорации подвергали УФоблучению для увеличения частоты рекомбинации.

Частоты рекомбинации подсчитывали делением эффективности трансформации, полученной с плазмидами В. эиЬййэ, на эффективность трансформации, полученную с контрольным вектором рМ1Х92. В свою очередь, эффективность трансформации подсчитывали как количество колониеобразующих единиц (КОЕ), полученных на грамм ДНК в ранее описанных условиях.

Полученные результаты обобщены в табл. 8. У штамма дикого типа рекомбинанты в экспериментах получали при использовании идентичных или отличающихся на 5% генов оха, тогда как у мутанта Ми1§^-, рекомбинация также происходила между отличающимися на 22% генами.

Таблица 8

Частоты рекомбинации ίη νίνο, полученные для генов оха у штаммов Е. Μί дикого типа и МиЙ5^-

Частоты рекомбинации согласовывались с частотами рекомбинации, полученными для первой системы из двух плазмид.

Для подтверждения рекомбинации трансформанты рМ1Х105 растили в жидких средах, содержащих тетрациклин (12,5 мкг/мл). Рестрикционные анализы полученной из этих культур плазмидной ДНК показали, что она совместно с резидентными плазмидами (или рМ1Х104, или рМ1Х106) содержит димеры, несущие рекомбинантные гены оха. Кроме того, из обеих колоний и плазмидной ДНК с применением специфических праймеров были успешно амплифицированы рекомбинантные гены К1 и К2.

Результаты демонстрируют, что рекомбинанты были получены с применением второй системы из двух плазмид с применением устойчивости к тетрациклину в качестве селективного давления.

Claims (43)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК у прокариот, включающий в себя стадии:

   a) получения первичной прокариотической клетки, содержащей внехромосомную реципиентную молекулу ДНК, содержащую первую последовательность ДНК для рекомбинации и способную автономно реплицироваться в прокариотической клетке, и внехромосомную донорную молекулу ДНК, содержащую вторую последовательность ДНК для рекомбинации и, по меньшей мере, первую маркерную последовательность, кодирующую генный продукт и не способную к автономной репликации в прокариотической клетке,

   b) культивирования первичной прокариотической клетки в селективных условиях, стимулирующих образование коинтеграта или гибридной молекулы между реципиентной и донорной молекулами ДНК, и рекомбинацию этих двух последовательностей ДНК для рекомбинации, и позволяющих рост и/или размножение клеток только в том случае, если экспрессирован генный продукт первой маркерной последовательности, и

   c) выделения вторичной прокариотической клетки, растущей и/или размножающейся в селективных условиях и содержащей гибридную молекулу ДНК, по меньшей мере, с первой маркерной последовательностью и образованной из первой и второй последовательностей рекомбинантной последовательности ДНК, полученной вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК, где прокариотическая клетка транзиторно или постоянно дефицитна по системе репарации ошибочного спаривания и где донорная молекула ДНК и реципиентная молекула ДНК являются отличными друг от друга линейными или кольцевыми плазмидами.
2. 2. Способ по п.1, где донорная молекула ДНК не имеет участка инициации репликации.
3. 3. Способ по п.1, где донорная молекула ДНК имеет нефункциональный участок инициации репликации.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду ВасШик 5иЫ1115, не способную реплицироваться в Е. со11.
5. 5. Способ по п.4, где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. киЫШк рМ1Х91, содержащую маркер §рес^к и маркер рЫео^к, или плазмиду В. киЫШк рМ1Х101, содержащую маркер 1с^к.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где первая маркерная последовательность структуры донорной ДНК выбрана из группы, состоящей из пищевого маркера, маркера устойчивости к антибиотику и последовательности, кодирующей субъединицу фермента.
7. 7. Способ по п.6, где генный продукт первой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость к антибиотику клетки, чувствительной к этому антибиотику.
8. 8. Способ по п.6 или 7, где первая маркерная последовательность представляет собой §рес^к, генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к спектиномицину, или рЫео^к, генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к флеомицину, или 1с^к. генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к тетрациклину.
9. 9. Способ получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК у прокариот, включающий в себя стадии:

   б) получения первичной прокариотической клетки, содержащей внехромосомную реципиентную молекулу ДНК, содержащую первую последовательность ДНК для рекомбинации и способную автономно реплицироваться в прокариотической клетке, и внехромосомную донорную молекулу ДНК, содержащую вторую последовательность ДНК для рекомбинации и, по меньшей мере, первую маркерную последовательность, кодирующую генный продукт и не способную к автономной репликации в прокариотической клетке,

   е) культивирования первичных прокариотических клеток в селективных условиях, стимулирующих образование коинтеграта или гибридной молекулы между реципиентной и донорной молекулами ДНК и рекомбинацию двух последовательностей ДНК для рекомбинации и позволяющих рост и/или размножение клеток только в том случае, если экспрессирован генный продукт первой маркерной последовательности, и

   1) выделения вторичных прокариотических клеток, растущих и/или размножающихся в селективных условиях и содержащих гибридную молекулу ДНК, по меньшей мере, с первой маркерной последовательностью и образованной из первой и второй последовательностей рекомбинантной последовательности ДНК, полученной вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК, где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. киЫШк рМ1Х91, содержащую маркер §рес^к и маркер р111ео'\ или плазмиду В. 8иЬШ18 рМ1Х101, содержащую маркер 1с^к.
10. 10. Способ по п.9, где реципиентная молекула ДНК является линейной или кольцевой структурой ДНК, в частности плазмидой или бактериофагом.
11. 11. Способ по п.9 или 10, где прокариотическая клетка имеет функциональную систему репарации ошибочного спаривания.

    - 21 012070
12. 12. Способ по п.9 или 10, где прокариотическая клетка транзиторно или постоянно дефицитна по системе репарации ошибочного спаривания.
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, где реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду, способную реплицироваться в ЕзсйейсЫа сой.
14. 14. Способ по п.13, где реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду Е. сой рАСУС184, или плазмиду Е. сой рМ1Х100, или их производное.
15. 15. Способ по любому из пп.1-14, где донорная молекула ДНК и/или ее участок инициации репликации происходят из вида прокариота, отличного от прокариотического вида, в клетки которого вводят молекулу донорной ДНК.
16. 16. Способ по любому из пп.1-15, где функционирование участка инициации репликации донорной ДНК нарушено мутацией.
17. 17. Способ по любому из пп.1-16, где донорная молекула ДНК содержит вторую маркерную последовательность.
18. 18. Способ по любому из пп.1-17, где реципиентная молекула ДНК содержит третью маркерную последовательность и, необязательно, четвертую маркерную последовательность.
19. 19. Способ по п.17 или 18, где вторая, третья и четвертая маркерные последовательности представляют собой кодирующие или не кодирующие белки последовательности, выбранные из группы, состоящей из пищевых маркеров, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам, маркеров чувствительности к антибиотикам, участков распознавания ферментов рестрикции, участков распознавания праймеров и последовательностей, кодирующих субъединицу фермента.
20. 20. Способ по п.19, где генные продукты третьей и четвертой маркерных последовательностей реципиентной молекулы ДНК обеспечивают устойчивость к антибиотику клетки, которая чувствительна к этому антибиотику.
21. 21. Способ по п.20, где генный продукт третьей маркерной последовательности обеспечивает устойчивость к тетрациклину.
22. 22. Способ по п.20, где генный продукт четвертой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость клетки к хлорамфениколу.
23. 23. Способ по любому из пп.1-22, где первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации отличаются по меньшей мере двумя нуклеотидами.
24. 24. Способ по любому из пп.1-23, где первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации являются встречающимися в природе последовательностями.
25. 25. Способ по п.24, где первая и/или вторая последовательности ДНК для рекомбинации происходят из вирусов, бактерий, растений, животных и/или человеческих существ.
26. 26. Способ по любому из пп.1-25, где первая и/или вторая последовательности ДНК для рекомбинации являются искусственными последовательностями.
27. 27. Способ по любому из пп.1-26, где каждая из первой и второй последовательностей ДНК для рекомбинации содержит одну или несколько кодирующих белок последовательностей и/или одну или несколько некодирующих последовательностей.
28. 28. Способ по любому из пп.1-27, где первичную прокариотическую клетку получают посредством одновременного или последовательного введения в прокариотическую клетку молекулы реципиентной ДНК и молекулы донорной ДНК.
29. 29. Способ по п.28, где молекулы реципиентной и донорной ДНК вводят в прокариотическую клетку посредством трансформации, конъюгации, трансдукции, сексдукции и/или электропорации.
30. 30. Способ по любому из пп.1-29, где первичную прокариотическую клетку культивируют в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, к которому генный продукт первой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость.
31. 31. Способ по п.30, где первичную прокариотическую клетку дополнительно культивируют в присутствии второго, третьего и/или четвертого антибиотиков, к которым генные продукты второй маркерной последовательности, третьей маркерной последовательности и четвертой маркерной последовательности, соответственно, обеспечивают устойчивость.
32. 32. Способ по любому из пп.1-31, где прокариотическая клетка представляет собой клетку архебактерии или эубактерии.
33. 33. Способ по п.32, где эубактерия представляет собой грамотрицательную бактерию, грамположительную бактерию или цианобактерию.
34. 34. Способ по п.33, где грамотрицательная бактерия представляет собой ЕзсйейсЫа сой.
35. 35. Способ по пп.1-8 и 12, где транзиторный или постоянный дефицит системы репарации ошибочного спаривания происходит вследствие мутации, делеции и/или индуцируемой экспрессии или репрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в систему репарации ошибочного спаривания, обработки средством, насыщающим систему репарации ошибочного спаривания, и/или обработки средством, глобально нокаутирующим репарацию ошибочного спаривания.
36. 36. Способ по пп.1-8, 12 и 35, где прокариотическая клетка несет мутантный ген ти18 и/или мутантный ген пцЦБ.

    - 22 012070
37. 37. Способ по любому из пп.1-36, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК, содержащиеся в гибридной молекуле ДНК вторичной прокариотической клетки, отбирают, и/или выделяют, и/или анализируют.
38. 38. Способ по п.37, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК выделяют посредством расщепления рестрикционными ферментами.
39. 39. Способ по п.37, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК амплифицируют посредством ПЦР.
40. 40. Способ по любому из пп.37-39, где выделенные первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК вставляют в донорную молекулу ДНК и реципиентную молекулу ДНК, соответственно, и подвергают другому циклу рекомбинации.
41. 41. Применение плазмид В. зиЫШз рМ1Х91 и ρΜΙΧΙΟΙ в качестве донорных молекул ДНК в способе по любому из пп.1-40 для получения и/или детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. сой.
42. 42. Применение плазмид Е. сой рЛСУС184 или ρΜΙΧ100 или их производных в качестве реципиентной молекулы ДНК в способе по любому из пп.1-40 для получения и/или детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. сой.
43. 43. Способ получения в прокариотической клетке гибридного гена и/или кодируемого гибридным геном белка, где осуществляют способ по любому из пп.1-40, и в прокариотической клетке получают гибридный ген или кодируемый гибридным геном белок, и гибридный ген и/или кодируемый белок отбирают в прокариотической клетке и/или выделяют из нее после экспрессии.