KR20050009764A - 섬유아세포 성장 인자-19 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PRO533 단백질에 대하여 상동성을 갖는 신종 폴리펩티드 및 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 이들 핵산 서열, 이종성 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법이 본문에 제공된다. 본 발명은 인간을 포함하는 포유동물에서 종양 세포 성장 및 증식의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관계된다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭된 유전자의 동정에 기초한다. 이러한 유전자 증폭은 유전자 산물의 과발현과 관계되고 종양발생 및(또는) 자기분비적 시그널링에 공헌한다. 따라서, 증폭된 유전자가 코딩하는 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료(예방을 포함)을 위한 타겟으로서 유용하고 암 치료의 예후의 지시자의 역활을 할 수 있다. 나아가, 길항제를 포함하는 화합물, 조성물 및 본 발명의 방법은 FgF-19 조정인 특징인 질환에 대하여 치료적 효과를 가지는 것으로 기대된다.

Description

섬유아세포 성장 인자-19{Fibroblast growth factor-19}

기술분야

본 발명은 1997년 11월 24일 출원된 가출원 제60/066,840호를 우선권 주장한 정규출원이고, 그 가출원의 전문을 본원에 참고로 삽입하고 그 가출원에 대하여 USC §119 하의 우선권을 주장한다.

본 발명은 섬유아세포 성장 인자와 상동성(homology)을 갖는 것을 특징으로 하는 신규의 DNA의 동정 및 확인, 신규 폴리펩티드의 재조합 생산에 관한 것이다. 구체적으로는, 섬유아세포 성장 인자군 중의 신규 인자{여기서는 FGF-19(PRO533)로 명명됨}의 동정, 분리, 특성 규명과 함께 그 용도에 관한 것이다. 특히, 종양 및(또는) FGF-19 변화에 의해 특징지워지는 기타 증상을 진단하고 예방하기 위한 조성물 및 진단 및 예방 방법에 관한 것이다.

배경기술

세포외(extracellular) 단백질은 다세포 생물의 형성, 분화 및 생존에 중요한 역할을 한다. 각 세포의 운명 즉, 증식, 이동, 분화 또는 타 세포와의 상호 관계는 타 세포들로부터 전해지는 정보 및(또는) 주변 환경에 의해 지배된다. 흔히이 정보는 분비성 폴리펩티드(예: 유사분열 촉진인자, 생존 인자, 세포 독소 인자, 분화 인자, 뉴로펩티드 및 호르몬)에 의해서 전달되는데, 이렇게 전달된 정보는 여러 세포 수용체 또는 막 단백질에 의해 받아들여진다. 이들 분비성 폴리펩티드 또는 시그날 분자는 보통 세포 분비 경로를 따라 세포 외부의 작용 부위로 이동된다.

분비성 단백질은 의약, 진단 시약, 바이오 센서 및 바이오 리액터를 포함한 여러 산업에 다양하게 응용된다. 혈전융해제, 인터페론, 인터루킨, 에리쓰로포이에틴, 콜로니 촉진 인자 및 기타 여러 사이토킨과 같은 현재의 단백질 의약품 대부분은 분비성 단백질이다. 이들의 수용체(막단백질)도 치료 또는 진단제로서의 잠재성이 있다. 신규의 자연성 분비 단백질을 찾아내고자 하는 노력은 업계과 학계 모두에서 진행되고 있다. 신규의 분비 단백질을 코딩하는 서열을 찾아내기 위해 포유류의 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 데에 초점을 맞추고 있다. 예를 들어 클레인 등 (Klein et al.)의 논문[Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 7108-7113면(1996)]과 미국특허 제5,536,637호에는 이러한 스크리닝 방법이 개시되어 있다.

성장 인자는 단독으로 또는 세포 표면의 특정 수용체와 결합함으로써 세포의 성장과 증식을 향상시키는 분자성 시그날 또는 매개자이다. 그러나, 성장 인자는 세포 성장 이외의 다른 세포 반응에도 관여한다. 따라서, 성장 인자는 다기능성의 강력한 세포성 조절제로 특징지워진다. 성장 인자는 생물학적으로 증식, 화학주성 및 세포외 기질 생산 촉진과 같은 작용을 한다. 성장 인자는 일면으로는 촉진 작용을 하지만 다른 일면으로는 저해 작용을 한다. 예를 들면, 형질 전환성 성장 인자(TGF-β)는 다면성을 가지고 있어서 어떤 세포(특히, 결합 조직)에서는 증식을촉진시키는 반면 어떤 세포(예: 림프구 및 상피 세포)에서는 증식을 저해한다.

성장 인자가 갖는 성장 촉진 또는 저해의 생리적 작용 효과는 표적 조직의 발생 및 분화 단계에 좌우된다. 세포가 내분비 분자에 의해 국부적으로 조절되는 메카니즘은 자가 경로, 이웃 세포에 의한 경로 및 인접 세포에 의한 경로로 이해된다. 펩티드 성장 인자는 세포간 정보 전달의 기초를 제공하는 생물학적 언어의 한 요소이다. 펩티드 성장 인자에 의해 세포가 서로 정보를 주고 받아 세포간의 상호 작용을 매개하며 유전자 발현을 조절되는 것이다. 이 다기능성 인자의 작용 효과는 다른 펩티드의 존재 여부에 의해 좌우된다.

섬유아세포 성장 인자(FGF)는 정상적인 복상 섬유아세포 및 확립된 세포주 모두에 대한 헤파린 결합성의 강력한 유사분열 자극인자의 군이다. [고드포다로위쯔, 디. 등(1984), Proc., Natl., Acad., Sci. USA 81:6983면 참조] FGF 군에는 산성 FGF(FGF-1), 염기성 FGF(FGF-2), INT-2(FGF-3), K-FGF/HST(FGF-4), FGF-5, FGF-6, KGF(FGF-7), AIGF(FGF-8) 및 FGF-9 내지 FGF-18이 포함된다. 모든 FGF는 보존적 잔기로서 2개의 시스테인 잔기를 가지고 있고 그 아미노산 서열도 30 내지 50%의 상동성이 있다. 이 인자들은 정상 복상 중배엽 유래 세포 및 신경릉 유래 세포, 유도 과립막 세포, 부신 피질 세포, 크론도사이트, 근원세포, 각막 및 혈관 내피 세포(소 또는 인간), 혈관 평활근 세포, 수정체, 망막 및 전립선 상피 세포, 희돌기교세포, (신경교)성상세포, 크론도사이트, 근원세포 및 골아세포 등에 대해 유사분열 촉진성을 갖는다.

섬유아세포 성장 인자는 여러 다양한 세포 형태에 대해 비유사분열 방식으로촉진할 수도 있다. 이 성장 인자는 상처 부위로의 세포 이동 촉진(화학 주성), 새로운 혈관 형성 개시(맥관 형성), 신경의 부활 및 지탱(신경 영양성), 내분비 기능의 조절, 특정 세포성 단백질의 발현, 세포외 기질 생산 및 세포 생존의 촉진 또는 억제하는 등의 기능을 한다. [바이어드, 에이. 및 볼렌, 피., Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1): 369-418면(1990) 참조] 따라서 섬유아세포 성장 인자를 사용하여 상처 치료, 신경 치료, 측부 혈관 형성 등을 촉진시키기 위한 치료학적 접근이 시도되고 있다. 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자는 심장 질환 및 심장 외과수술에서의 심장 근육 손상을 최소화하기 위한 방안으로 제시된 바 있다. [미국특허 제4,378,437호 참조]

섬유아세포 성장 인자는 유사분열 촉진성 사이토카인의 큰 군을 구성한다. 이 군의 최초 구성원은 3T3 섬유아세포에 대한 강력한 증식능을 보이는 화합물로 확인되었다. FGF 구성원들은 중배엽 또는 신경외배엽 유래성 세포에 대해 다양한 활성(예컨대, 발생과정 중 분화된 표현형을 촉진하거나 저해하고, 맥관 형성 및 신경 영양에 관여하며, 세포 이동을 조절하는 것 포함)을 나타내는 것으로 확인되었다. [골드파르브, 엠., Cytikine Growth Factor Rev. 7: 311-25면 (1996); 나스키, 엠. 씨. 및 오르니쯔, 디.엠., Front Biosci. 3: D781-94면 (1998); 및 슬라빈, J. Cell Biol. Int. 19: 431-44면 (1995) 참조] 부분적으로는 FGF와 FGF 수용체(FGFR)의 발현이 조절되기 때문에 생물학적 특이성이 나타나는 것으로 생각된다. FGF 군의 구성원과 결합되어 있는, 밀접하게 연관된 4개의 수용체 타이로신 키나아제가 확인되었다. 이들 FGFR들 중 3개에 대해서는 여러 스플라이스 형태가 있는것으로 확인되었다. 지금까지의 연구에 의하면, 비록 상대적 친화도의 차이로 인하여 선택성이 생긴다고 여겨지기는 하지만, 한 가지 예외적인 경우를 제외하고는 각 FGF는 다양한 FGFR 동형체와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. [마띠에우, 엠. 등, J. Biol. Chem., 270: 24197-203면 (1995); 오르니쯔, 디.엠. 및 피. 레더, J. Biol. Chem., 267: 16305-11면 (1992); 오르니쯔, 디.엠. 및 피. 레더, J. Biol. Chem., 271: 15292-7면 (1996); 및 산토스-오캄포, 에스. 등 J. Biol. Chem., 271: 1726-31면 (1996) 참조] FGF는 FGFR과 직접 상호 작용을 한다. 그러나, 생물학적 활성을 위해서는 FGF 이합체화를 용이하게 하는 것으로 여겨지는 헤파린 또는 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(예: 신디칸 또는 페를레칸)을 필요로 하고 이는 기능 조절을 위한 추가적 가능성을 제시한다. [아비에저 등, Cell 79: 1005-13면 (1994); 바쉬킨 등 biochemistry 28: 1737-43(1989); 포크만, 제이. 등 Am. J. Pathol. 130: 393-400면 (1988); 허르 등 J. Biol. Chem. 272: 16382-89; 키에퍼, 엠.씨. 등 A528-530 N.Y. Acad. Sci. 638: 167-76면 (1991); 마흐, 에이치 등, Biochemistry 32: 5480-90 (1993); 모스카텔리, 디., J. Cell Physiol. 131: 123-30; 오르니쯔, 디.엠. 및 피. 레더, Mol. Cell. Biol., 12: 240-47면 (1992); 및 삭셀라, 오. 등 J. Cell Biol. 107: 743-51 (1988) 참조]

유전자 발현의 변화는 비조절된 세포 성장과 탈분화와 밀접하게 연관되어 있다. 비조절 세포 성장과 탈분화는 모든 암의 공통적인 특징이다. 연구가 잘 되어 있는 종양의 게놈에 있어서는, 악성 세포 성장을 방지하고(하거나) 악성 세포 성장을 촉진하는 특정 유전자(예: 종양 유전자)의 과발현을 방지하는 열성 유전자(통상적으로 종양 억제 유전자이라 함)의 발현이 감소됨이 밝혀져 있다. 이들 각 유전적 변화는 완전한 종양 표현형을 나타내는 징후의 원인인 것으로 보인다. [헌터, Cell 64: 1129면 (1991); 비숍, Cell 64: 235-248면 (1991) 참조]

암 세포에서 유전자(종양 유전자)의 과발현 메카니즘으로 잘 알려져 있는 것은 유전자 증폭이다. 유전자 증폭이란 모세포의 염색체내에서 특정 유전자가 다량 생산되는 과정을 말한다. 이 과정 중에는 유전자를 함유하고 있는 염색체의 일부가 비정상적으로 복제되고, 이렇게 복제된 단편이 염색채 내로 다시 재조합되는 일이 일어난다. [알리탈로 등, Adv. Cancer Res. 47: 235-281면 (1986) 참조] 유전자의 증폭과 과발현은 복제수에 비례하는 것으로 믿어진다.

성장 인자 및 성장 인자 수용체를 코딩하는 원시 종양 유전자(proto oncogene)은 유방암을 비롯한 여러 인간의 악성 종양의 병리학적 진행 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)과 관련된 185 kd의 막간 당단백질 수용체(p185^HER2, HER2)를 코딩하는 인간 ErbB2 유전자(erbB2, 별칭 her2 또는 c-erbB-2)는 인간 유방암의 25 내지 30%로 과발현된다는 것이 밝혀졌다. [슬라몬 등, Science 235: 177-182면 (1987) 및 슬라몬 등, Science 244: 707-712면 (1989)참조] 원시 종양 유전자의 증폭은 악성 종양과 관련된 전형적인 현상이며 임상적으로 예보 기능을 하는 것으로 알려져 있다[슈와브 등 Genes Chromosomes Cancer 1, 181-193면 (1990); 알리탈로 등 상기 동문헌]. 따라서, erbB2 과발현은 특히, 겨드랑이 림프절이 관여되는 1차성 질환을 가진 환자의 경우[슬라몬 등 상기 동문헌(1987), (1989), 라브딘 및 참니스 Gene 159: 19-27면 (1995); 하이네스 및 스턴 Biochem Biophys Acta 1198: 165-184면 (1994) 참조], CMF(사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 플루오르우라실) 및 안쓰라싸이클린[바셀가 등 , Oncology 11(1): 43-48면 (1997) 참조]를 포함한 호르몬 치료 요법과 화학 치료 요법에 민감하고(하거나) 저항성이 있는 경우 불충분한 예후를 예보하는 것이 된다. 그러나, erbB2 과발현이 일어남에도 불구하고, 탁산(taxane) 처리에 대해 임상적으로 반응을 나타내는 HER2 양성 환자가 HER2 음성 환자보다 3배나 승산이 크다[상기 동일 문헌 참조]. 재조합 인간화 항-ErbB2(항-HER2) 모노클로날 항체(쥐과 동물의 항-ErbB2 항체 4D5, 일명 rhuMAb HER2 또는 헤르셉틴을 인간화한 것)는 예전에 과도한 항암 치료를 받았던 ErbB2 과발현 전이성 유방암 환자에게 임상적으로 효과적이었다[바셀가 등. J. Clin. Oncol. 14: 737-744면 (1996) 참조].

섬유아세포 성장 인자와 상동성을 갖는 cDNA 클론(DNA49435)를 동정하였다. 본 발명에서는 "PRO533"으로 명명된다. 이 신규한 FGF는 FGF-19로 명명되기도 한다. PRO533을 코딩하는 DNA(DNA49435)는 특정 종양 세포의 게놈 내에서 증폭되는 유전자로 확인되었다. 이러한 증폭은 유전자 산물의 과발현과 관련되고 종양 형성 및(또는) 자발성 신호에 기여하는 것으로 예상된다. 따라서, PRO533은 특정 암의 진단 및(또는) 치료(예방 포함)를 위한 쓸만한 타겟이고 종양 치료의 예후에 대한 예보자 기능도 할 수 있는 것으로 믿어진다. DNA49435는 연골 또는 뼈의 발달 및골다공증-가성신경교종에 대해서도 일정한 역할을 할 수 있을 것이다.

도 1은 본래의 PRO533 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 나타낸다. 시그날 펩티드는 일단 도 1(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 위치 1 내지 약 22임이 확인되었다. 원핵 생물의 막 지질단백질 인접 부위가 아미노산 잔기 Y48 내지 C58에 존재함에 반하여 N-미리스톨일화 부위는 아미노산 잔기 G15, G54, G66 및 G201에 존재하는 것으로 일단 확인되었다.

도 2는 PRO533(DNA49435)의 본래 서열을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서멸을 나타낸다. 시작 코돈은 뉴클레오타이드 464-466에 존재하고, 정지 코돈은 1112-1114에 존재한다.

도 3은 섬유아세포 정상 인자 서열 (FGF-15)인 AF00728_1의 6 내지 218 잔기와 DNA49435가 코딩하는 본래의 PRO533 단백질 서열의 3 내지 216 아미노산 잔기간의 블라스트(Blast)-2 스코어, 매치 및 퍼센트 동일성을 나타내는 배열이다.

도 4는 DNA49435와 염색체 II로부터 얻어진 게놈 클론인 B03767간의 블라스트-2 스코어, 매치 및 퍼센트 동일성을 나타낸다.

도 5는 DNA49435를 분리하는 데에 사용될 수 있는 PCR 올리고머(FGF15, FGF15.p2, FGF15.r)의 혼성 영역과 뉴클레오타이드 서열과 함께 DNA47412(GenBank AA220994)로부터 얻은 이중가닥을 나타낸다.

도 6은 PRO533을 분리하는 과정에서 여러 공지된 서열 데이터베이스(예: GenBank, Dayhoff 등)를 검색하는 데에 사용한 AF007268(FGF-15 EST 서열)의 전체 서열을 나타낸다.

도 7은 여러 암 세포주에 있어서의 DNA49435의 노던 블롯을 나타낸다. 제 1 내지 8칸은 하기 암 세포주로부터 얻어진 폴리A RNA이다: (1) 원핵 백혈병 에치엘-60; (2) 헬라 에스 3; (3) 만성 골수 백혈병 케이-562; (4) 림프아세포 백혈병 MOLT-4; (5) 버키트 림프종 라지; (6) 결장직장 아데노암 에스더블유 480; (7) 폐암; (8) 흑색종 지361.

도 8은 태아(E12-16주)와 성인의 조직에서의 DNA49435의 인시투(in situ) 분석 결과를 나타낸다. 밝고 어두운 상은 다음을 나타낸다: A,B는 태아의 아래 갈비뼈 연골; C,D는 태아의 망막; E,F는 태아의 피부; G,H는 성인의 담즙 방광. 표현하고자 하는 영역은 화살표로 나타내어진다.

도 9는 FGF 수용체 4의 결합을 나타내는 웨스턴 블롯이다. N-말단 gD 에피토프 태그(B) 또는 C-말단 His8 에피토프 태그 (C)로 발현된 FGF1(A) 또는 PRO533(FGF-19)에 대해 수용체-Fc 융합 단백질의 결합 테스트를 하였다. 특정 결합 구성 성분은 상기 제1 내지 8칸에 표시되어 있다. 제9칸은 대조용으로서 겔상에 직접 주입된 FGF를 함유한다. 분자량 표지는 겔의 왼편에 해 놓았다.

도 10은 PRO533(FGF-19)의 헤파린에 대한 결합 의존도를 나타내는 웨스턴 블로팅이다. N-말단이 gD로 꼬리붙혀진(tagged) PRO533은 표시된 헤파린의 농도 존재하에 FGFR4-Fc와 상호 작용을 할 수 있었다.

도 11은 DNA49435(FGF-19)에 의해 코딩된 PRO533 서열의 다른 FGF 군 구성원과의 배열이다.

본 발명은 그 실시태양으로서 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

분리된 핵산은 (a) 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 바와 같이 약 23 내지 약 216개의 아미노산 잔기의 서열을 갖는 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 이 DNA 분자에 대한 상보체와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일한 DNA를 포함한다.

다른 일면으로는, 본 발명은 도 1(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 1 내지 126개를 갖는 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이는 상기 핵산 서열에 상보적이고 적어도 보통의 조건, 임의로는 매우 엄격한 조건하에서 안전하게 결합된 채로 존재한다. 또는 도 2(SEQ ID NO: 2)에 포함된 핵산 잔기 약 464-466 및 약 1109-1111의 상보체에 DNA 혼성화되는 것을 포함하는 PRO533 폴리펩티드를 코팅하는 핵산 분자를 제공한다. 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서 혼성화를 수행하는 것이 바람직하다.

다른 일면으로는, 본 발명은 (a) ATCC 기탁 번호 제209,480호 (DNA49435-1219)의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 이 분자에 대한 상보체와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일한 DNA를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산은 ATCC 기탁 번호 제209,480호 (DNA49435-1219)의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함한다.

또 다른 일면으로는, 본 발명은 (a) 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 23 내지 216개의 아미노산 잔기의 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일한 DNA, 또는 (b) 이 DNA의 상보체를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

또 다른 일면으로는, 본 발명은 (a) 도 2(SEQ ID NO: 2)에 포함된 1 내지 826 및 약 1199 내지 2137 핵산 잔기의 서열을 갖는 PRO533 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 이 DNA 분자에 대한 상보체와 시험 DNA를 엄격한 조건에서 혼성화 테스트하고, 만일 시험 DNA가 상기 (a) 또는 (b)와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일하다면 시험 DNA 분자를 분리함으로써 제조된 적어도 20 내지 80개의 뉴클레오타이드를 갖는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 증폭된 유전자의 안티센스 분자로서 또는 증폭 반응에서 안티센스 프라이머로서 작용할 수 있다. 또한, 그러한 서열은 리보자임의 일부 및(또는) 삼중 나선 서열로 사용될 수 있고, 이는 다시 PRO533 발현의 조절에 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 N-말단 시그날 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 있거나 없는 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 막간 영역이 삭제되거나 불활성화 변형물, 또는 이에 대한 상보체를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 시그날 펩티드는도 1(SEQ ID NO: 1)의 서열 내에서 아미노산 1 위치에서 약 22 위치로 연장되는 것으로 일단 확인되었다. 원핵 생물의 막 지질단백질 인접 부위가 아미노산 잔기 Y48 내지 C58에 존재함에 반하여 N-미리스톨일화 부위는 아미노산 잔기 G15, G54, G66 및 G201에 존재하는 것으로 일단 확인되었다.

또한 본 발명은 (a) 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 아미노산 서열 23 내지 약 216의 잔기와 비교할 때 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 양성인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 (b) 이 DNA에 대한 상보체를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 PRO533 또는 그 변형물을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 상기에서 정의한 분리된 핵산 분자들 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포로는 CHO 세포, 이. 콜라이 또는 이스트가 사용될 수 있다. PRO533 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법도 제공된다. 이 방법에는 숙주 세포를 PRO533이 발현되기 적합한 조건에서 배양한 후 세포 배양액으로부터 PRO533을 회수하는 과정이 포함된다.

본 발명은 상기에서 정의된 분리된 핵산 서열들 중 어느 하나가 코딩하는 분리된 PRO533 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 도 1(SEQ ID NO: 1)의 23 내지 216 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 함유하는 분리된 서열 PRO533 폴리펩티드를 제공한다. 본래의 시그날 서열(도 1에서의 아미노산 1 내지 22)이 있거나 없는, 그리고 개시 메티오닌이 있거나 없는 본래의 PRO533 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 본 발명은 ATCC209480으로 기탁된 핵산에 의해 코딩되는 PRO533 폴리펩티드를제공한다.

또한 본 발명은 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 아미노산 23 내지 216 잔기 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 PRO533 폴리펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 아미노산 잔지 23 내지 216 서열과 비교할 때 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 양성인 아미노산 서열을 포함하는 분리된 PRO533 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 도 1(SEQ ID NO: 1)에 포함된 아미노산 잔기 23 내지 216 서열 또는 항-PRO533 항체에 대한 결합 부위를 제공할 만큼 충분한 단편을 포함하는 분리된 PRO533 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게는, PRO533 단편은 PRO533 폴리펩티드 본래의 생물학적 활성을 보유한다.

또한 본 발명은 (i) (a) 도 2(SEQ ID NO: 2)에 포함된 1 내지 826 및 약 1199 내지 2137 핵산 잔기의 서열을 갖는 PRO533 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 이 DNA 분자에 대한 상보체와 시험 DNA를 엄격한 조건에서 혼성화 테스트하고, 만일 시험 DNA가 상기 (a) 또는 (b)와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 서열이 동일하다면 시험 DNA 분자를 분리하고, (ii) 상기 폴리펩티드를 발현하는 데에 적합한 조건하에서 시험 DNA 분자를 포함한 숙주 세포를 배양하고, (iii) 세포 배양액으로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 제조된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 이종의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO533 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 분자를 제공한다. 키메릭 분자의 예에는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로부린의 Fc 영역에 융합된 PRO533 폴리펩티드가 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 PRO533 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의적으로는, 이 항체는 모노클로날 항체이다. 이 항체는 PRO533 폴리펩티드를 과발현하는 세포의 사멸을 유도한다. 또한 이 항체는 바람직하게는 인간으로부터 유래한 것이 아닌 상보성을 결정하는 영역(CDR)의 잔기와 인간의 외곽구조 영역(FR)의 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 이 항테는 표지된 후 고체 지지체 상에 고정화될 수도 있다. 이 항체는 항체 단편, 단일 사슬 항체 또는 항-이디오타입 항체이다.

본 발명은 PRO533 폴리펩티드의 기능이나 활성들 중 어느 하나 이상을 저해하는 PRO533 폴리펩티드의 아고니스트(작용물질) 및 길항제를 제공한다. 항-PRO533(항-FGF-19) 항체가 아고니스트 또는 길항제이다.

또한 본 발명은 대상 화합물과 PRO533이 충분히 상호 작용을 할 수 있는 조건과 시간에서 이들 둘을 접촉시키는 것을 포함하는 본래의 PRO533 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법을 제공한다. 대상 화합물 또는 PRO533 폴리펩티드는 고체 지지체 상에 고정화된다. 고정화 성분은 검출가능한 표지를 가진다.

본 발명은 PRO533 폴리펩티드 또는 상기한 아고니스트 또는 길항제와 제약학적으로 허용가능한 담체가 포함된 조성물을 제공한다. 이 조성물은 치료학적으로 유효한 양의 항체 길항제를 포함한다. 이 조성물은 활성 성분, 예를 들어 항체 또는 세포 독성제 또는 화학 치료제를 더 포함할 수 있다. 조성물은 무균 상태의 것이 바람직하다.

본 발명은 항-PRO533 항체 를 코딩하는 핵산, 벡터 및 상기 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 항체를 코딩하는 핵산에 의하여 형질 전환된 숙주 세포를 항체가 발현될 수 있는 조건하에서 배양하고, 세포 배양액으로부터 항체를 회수하여 항-PRO533 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 PRO533을 함유하고 있다고 생각되는 세포들을 항-PRO533 항체에 노출시켜서 세포에 항체를 결합시킴으로써 PRO533 폴리펩티드가 존재하는지를 결정할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 포유류로부터 얻어진 시험용 조직 세포 샘플과, (b) 같은 세포 형태의 공지의 대조용 정상 조직 세포 샘플에 들어 있는 PRO533을 코딩하는 유전자의 발현도를 측정하는 것을 포함하는(시험용 샘플에서 발현율이 더 높다면 시험용 조직 세포를 취한 그 포유류에 종양이 있다고 확인됨), 포유류의 종양을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 항-PRO533 항체를 포유류로부터 얻은 시험용 조직 세포 샘플에 접촉시키고, (b) 항-PRO533 항체와 시험용 샘플 중의 PRO533 폴리펩티드간에 형성되는 복합물을 검출하는 것을 포함하는, 포유류의 종양을 진단하는 방법을 제공한다. 검출은 정량적일 수도 있고 정성적일 수도 있는데, 동일한 세포 형태의 공지의 정상 조직 세포(대조용 샘플)에서 복합물 형성되는 것과 비교 관측함으로써 행한다. 항체는 표지를 갖는 것이 바람직하다. 복합물의 형성은 예를 들어 광학 현미경, 흐름 혈구계측기(flow cytometry), 형광계수기 기타 당업계에 공지된 방법에 의해 관측될 수 있다.

본 발명은 적당한 패키지에 담겨진 항-PRO533 항체와 담체(예: 완충액)를 포함한 암 진단 키트 및 방법을 제공한다. 이 키트에는 바람직하게는 PRO533을 검출하기 위한 항체를 사용하기 위한 설명서가 포함된다.

또한 본 발명은 PRO533 폴리펩티드를 과발현하는 세포를 유효량의 PRO533 발현 및(또는) 활성을 저해하는 제제에 노출시키는 것을 포함하는 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 이러한 저해제로서 바람직한 것은 항-PRO533, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 또는 리보자임 분자, 또는 삼중 나선 분자이다. 이 저해제(예: 항-PRO533 항체)는 세포의 사멸을 유도한다. 종양 세포는 방사선 처리되고(되거나) 세포 독소제 또는 화학 치료제에 노출될 수 있다.

본 발명은 용기; 용기 상의 표지; 및 이 용기 내에 함유된 활성 성분을 함유하는 조성물을 포함한 제품을 제공한다(여기서, 조성물은 PRO533이 과발현되는 것을 특징으로 하는 증상을 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있고, 이 조성물 중의 활성 성분은 PRO533 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 저해하는 제제일 수 있다). 활성 성분은 항-PRO533 항체일 수 있다.

바람직한 실시태양의 상세한 설명

1. 정의

"유전자 증폭" 및 "유전자 복제"란 용어는 양자 같은 의미로 혼용될 수 있는 것으로, 특정 세포 또는 세포주 내에서 유전자 또는 유전자 단편의 카피가 여러개 형성되는 것을 의미한다. 복제된 영역(증폭된 DNA의 스트레치)을 "증폭부(amplicon)"라고 지칭된다. mRNA의 생성량, 즉 유전자 발현율은 특정 발현 유전자의 카피수에 비례하여 증가하기도 한다.

"종양"이란 악성이든 양성이든, 그리고 모든 암 이전 단계이든 암 단계의 세포 및 조직이든 관계없이 모든 종양 세포의 성장 및 증식을 의미한다.

"암" 및 "암성"이란 과도한 세포 성장으로 특징지워지는 포유류의 생리적 증상을 의미한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 여기에 국한되는 것은 아니다. 더 자세히는 유방암, 전립선압, 결장암, 판상 세포 암, 소세포 폐암, 비 소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선암종, 신장암, 음문암, 갑상선암, 간암종, 기타 여러 두부와 목에 관련된 암 등이 포함된다.

"처치"란 병리 과정의 발전을 막거나 병리 과정을 변경하려는 의도로 하는 행위를 말한다. 따라서, "처치"란 치료는 물론 예방적 행위을 말한다. 처치가 필요한 사람이란 이미 질병에 걸린 사람 뿐만 아니라 질병의 예방이 필요한 사람을 말한다. 종양(암) 처치에 있어서, 치료제가 종양 세포의 병리적 과정을 직접 감소시키거나 종양 세포를 타 치료제(예: 방사선 및(또는) 화학치료제)에 더 민감해지도록 한다.

"병리적 과정"이란 환자가 치유되는 것에 관한 모든 현상을 말한다. 비정상적인, 과도한 세포 성장, 신진 대사는 이웃 세포의 정상적인 기능을 방해하고, 사이토킨 또는 기타 분비 상물을 비정상적인 양으로 방출케 하며, 염증 또는 면역 반응 등을 억제하거나 강화시키는 것을 포함한다.

"포유류"란 인간, 가축, 농장용 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물(예: 개, 말, 고양이, 염소 등)을 포함한 포유 동물을 말한다. 바람직하게는 인간을 말한다.

"장기" 투여란 초기 치료 효과를 장기간 지속시키기 위하여 연속적인 방식으로 제제를 투여하는 것을 말한다. "간헐적" 투여란 중단 없이 연속적으로 투여하는 것을 말하는 것이 아니고 주기적으로 투여하는 것을 말한다.

"담체"란 일정한 투여량 및 농도로 포유류에 노출되었을 때 독성이 없는, 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제를 말한다. 흔히 생리학적으로 허용가능한 담체는 수용성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예에는 포스페이트, 시트레이트 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코브산을 포함한 항산화제; 저분자량(잔기가 약 10개 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 기타 글루코스, 만노스, 덱스트린과 같은 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제, 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염 형성 짝이온; 및(또는) TWEEN계 상품, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 플루로닉스계 상품과 같은 비이온계 계면활성제가 포함된다.

"조합하여" 투여한다는 것은 동시에 또는 순서대로 연속하여 투여하는 것을 말한다.

"세포 독소제"란 세포의 기능을 저해하거나 방지하여 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 방사성 동위원소(예: I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰및 Re¹⁸⁶), 화학치료제, 세균성, 곰팡이성, 식물성 또는 동물성 효소 활성 독소와 같은 독성 물질이나 그 단편을 포함하는 의미로 사용된다.

"화학 치료제"란 암 치료에 유용한 화합물을 말한다. 예를 들면, 아드리마니신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노사이드("Ara-C"), 싸이클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 씨톡신, 탁쏘이드(예: 파슬리탁셀; Taxol, 브리스톨 마이어 스큅 온콜로지, 프린세톤, 뉴저지주), 독세탁셀(예: 상표명 탁소테레, 롱쁠랑 로러, 안토니, 프랑스), 톡소테레, 메토트렌세이트, 시스플라틴, 메팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 에스페라마이신(미국특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 기타 관련 질소 겨자(nitrogen mustard)가 포함된다. 또한 탁소시펜과 오나프리스톤과 같이 종양에 대해 호르몬 활동을 저해하거나 조절하는 역할을 하는 호르몬 제제도 포함된다.

"성장 저해제"란 세포, 특히 여기에 정의된 유전자들 중 어느 하나를 시험관내 또는 생체내에서 과발현하는 암 세포의 성장을 저해하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 즉, S 기에서 유전자를 과발현하는 세포의 백분율을 크게 줄이는 것을 말한다. 성장 저해제의 예로는 세포 생활사(S기 이외)의 진행을 막는 물질(예: G1 및 M기에서 멈추게 하는 물질)이 포함된다. 전통적인 M1기 방지제로는 빈카스(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 저해제(예: 독소루비신, 에피루비신, 에톱사이드 및 블레오마이신)이 포함된다. G1기 유도제는 S기로 흘러가게도 하는데, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로에타민, 시스플라틴, 메토트렌세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C가 포함된다. 이에 대한 더 자세한 정보는 The Molecular Basis of Cancer, 멘델슨 앤드 이스라엘 편찬, 제1장, 무라카미 "세포사 조절, 종양 유전자 및 항종양제", 특히 13면을 참조하면 얻을 수 있다.

"독소루비신"이란 안쓰라싸이클린계 항생제이다. 정확한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타세네디온이다.

"사이토킨"이란 세포간 매개자로서 타 세포에 대하여 역할을 하는 하나의 세포 집단에서 방출되는 단백질을 일반적으로 일컫는 말이다. 사이토킨의 예로는 림포킨, 모노킨 및 폴리펩티드 호르몬이 포함된다. 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬과 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구 인슐린; 자궁 이완 인자; 전구 자궁 이완 인자; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 황체 형성 호르몬(LH)와 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 호르몬; 섬유아세포 성장 호르몬; 플로랙틴, 태반성 락토젠; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러종 저해 물질; 쥐 생식선 자극 호르몬 관련 펩티드; 저해제; 활성화제; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 쓰롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환성 성장 인자(TGF); 인슐린 류 성장 인자-I 및 -II; 에리쓰리포이에틴(EPO); 골 유도성 인자; 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론류; 대식세포-CSF(MCSF)와 같은 콜로니 자극 호르몬(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨류, TNF-α 또는 -β와 같은 종양 괴사 인자 및 LIF와 키트 리간드(KL)을 포함한 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 천연 공급원으로부터, 재조합 세포 배양으로부터, 천연 서열 사이토킨과 생물학적으로 활성이 등가인 물로부터 얻은 단백질도 포함된다.

"PRO533 폴리펩티드". "PRO533 단백질" 및 "PRO533"이란 천연 서열의 PRO533과 그 변이체도 포함하는 개념이다. PRO533은 인간의 조직이나 다른 조직으로부터 얻을 수도 있고, 재조합 기법 또는 합성 방법에 의하여 얻을 수도 있다.

"천연 서열 PRO533"이란 천연계에서 얻은 PRO533과 아미노산 서열이 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 천연 서열 PRO533은 천연계에서 분리하거나 재조합 기법 또는 합성 방법에 의하여 얻을 수 있다. "천연 서열 PRO533"은 천연 발생성 절단형 또는 분비형(예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생성 변이체(예: 선택적으로 스플라이스된 형태) 및 천연 발생성 대립 형질 변이체를 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서의 천연 서열 PRO533은 도 1(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 23 내지 216(또는 1 내지 216)를 포함하는 성숙 또는 전장의 천연 서열 PRO533이다.

"PRO533 변이체"는 도 1(SEQ ID NO: 1)에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 PRO533 폴리펩티드의 잔기 23 내지 216의 아미노산 서열과 80% 이상 서열이 동일한, 활성 PRO533인 천연 서열 PRO533 이외의 모든 것을 의미한다. PRO533 변이체에는 도 1(SEQ ID NO: 1)의 서열 중 내부 영역은 물론 N-말단 또는 C-말단에서 1 이상의 아미노산 잔기가 부가, 삭제된 것을 포함한다. 통상적으로는, PRO533 변이체는 도 1(SEQ ID NO: 1)의 잔기 23 내지 216의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일성이 있다.

PRO533과의 "아미노산 서열 퍼센트 동일성"이란 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 퍼센트 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 보존적 치환을 서열 동일의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO533 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 본원에서 사용된 퍼센트 동일성 값은 Methods in Enzymology, 266: 460-480면 (1996); hppt://balst.wust/edu/blast/README.html의 WU-BLAST-2에 의해 얻어진다. WU-BLAST-2는 여러 변수를 사용하는데, 이들 중 대부분은 디폴트 값으로 정해져 있다. 조작 변수는 다음의 값들이다: 오버랩 스팬 = 1. 오버랩 분율 = 0.125, 단어 역치수(T) = 11. HSP S 및 HSP S2 변수는 역동적 인 값으로서 검색되는 서열에 대한특정 데이타 베이스의 서열 및 조성의 조합에 달려있다. 그러나, 이 값들은 민감도가 증가되도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 퍼센트 동일성은 일치하는 잔기 수를 정렬된 영역에서 "보다 긴" 서열의 전체 잔기 수로 나눔으로써 결정된다. "보다 긴" 서열은 정렬된 영역(정렬을 최대화하기 위하여 WU-BLAST-2에 의해 삽입된 갭은 무시됨)에서 대부분의 실제 잔기를 갖는 것을 말한다.

"양성"이란 상기와 같이 서열 비교를 함에 있어서, 서열들이 동일하지는 않지만 비슷한 성질을 갖는 것을 말한다(예: 보존적 치환 때문). 퍼센트 양성은 BLOSUM 62 매트릭스에서 양성치를 갖는 잔기의 분율을 상기에 정의된 보다 긴 서열에서의 전체 잔기 수로 나눔으로써 결정된다.

마찬가지 방법으로, PRO533 폴리펩티드을 코딩하는 서열에 관한 "핵산 서열 퍼센트 동일성"은 PRO533 코딩 서열에서의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오타이드 잔기의 비율로 정의된다. 퍼센트 동일성은 디폴트 값으로 정해진 변수(오버랩 스팬과 오버랩 분율은 각각 1과 0.125)로 WU-BLAST-2의 BLAST 모듈에 의해 결정된다.

"분리된"이란 자연 환경의 구성 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 수거된 폴리펩티드를 의미한다. 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 일반적으로 방해하는 물질로서 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 회전컵 서열결정기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 수 있다. 분리된 폴리펩티드는 PRO 폴리펩티드 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 분리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"분리된" PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예: DNA49435)은 이 핵산 분자가 PRO533을 코딩하는 핵산의 천연 공급원에서 통상 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 분리된 PRO533을 코딩하는 핵산 분자 (예: DNA49435)는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 분리된 PRO533을 코딩하는 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO533을 코딩하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 분리된 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는, PRO533 폴리펩티드를 통상 발현하는 세포에 포함된 PRO533 폴리펩티드 핵산 분자를 포함한다.

"조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서(enhancer)를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프리서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용한다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 하나의 항-PRO 폴리펩티드 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-PRO533 폴리펩티드 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다.

혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자라면 쉽게 결정할 수 있는 것으로서, 일반적으로 탐침 길이, 세척 온도 및 염류 농도에 따라 실험적으로 계산되는 것이다. 일반적으로, 탐침이 길수록 적당한 어닐링을 위해서 더 높은 온도가 요구되고, 탐침이 짧을수록 더 낮은 온도가 요구된다. 통상적으로 혼성화는 상보적 가닥이 융해점 아래의 조건에 존재할 때 변성된 DNA가 재연합(reanneal)하는 능력에 좌우된다. 탐침과 혼성가능한 서열간의 상동성이 높게 요구되는 경우에는 상대적으로 온도를 더 높혀야 한다. 그 결과, 상대적 온도가 더 높아지면 반응 조건은 더 엄격해지는 것이고, 온도가 낮으면 덜 엄격해지는 것이다. 혼성화 반응의 엄격성에 관한 더 자세한 정보는 오수벨(Ausubel) 등의 Current Protocols in Molecular Biology, 윌리 인터출판사(1995)를 참조할 수 있다.

"엄격한 조건" 또는 "매우 엄격한 조건"이란 (1) 이온 강도가 낮고 세척 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 나트륨 도데실 술페이트를 50 ℃에서 사용하는 것; (2) 42 ℃에서 0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)이 함유된 50 % (vol/vol) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성제를 혼성화시에 사용하는 것; (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6/8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨) 및 0.1 % SDS로 42 ℃에서 세척하는 것, 및 50 % 포름아미드의 완충액을 사용하여 55 ℃에서 혼성화한 후, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격 세척을 수행하는 것이다.

"중간 정도의 엄격한 조건"이란 샘부룩 등의 Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, 뉴욕; 콜드 스프링 하버 출판사(1989)에 기재된 바와 같고, 세척액 및 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 강도 및 SDS 비율)의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 전단변형시킨 변성 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 철야 인큐베이션한 후 필터를 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.

"에피토프 태그"란 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO533 폴리펩티드를 함유한 키메라 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공할 만큼 충분한 잔기를 가지면서도 융합될 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 만큼은 충분히 짧아야 한다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 상당히 독특해서 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차 반응하지는 않는다. 적당한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개의 아미노산 잔기를 가지고 8 내지 50 아미노산 잔기(바람직하게는, 약 10 내지 20 아미노산 잔기) 사이에 있다.

"임뮤노아드헤진(immunoadhesin)"이란 면역글로부린 일정 영역의 이펙터 기능이 있는 이종 단백질의 결합 특이성을 결합시키는 항체류 분자를 말한다. 구조적으로는, 상기 임뮤노아드헤진은 항체의 결합 부위와 항원 인식 부위와는 다른 결합 특이성을 가진 아미노산 서열과 면역글로부린 일정 영역 서열의 융합을 포함한다. 임뮤노아드헤진 분자의 아드헤진 부분은 적어도 수용체 결합 부위 또는 리간드를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 임뮤노아드헤진 내의 면역글로부린 일정 영역 서열은 IgG-1, -2, -3 또는 -4, IgA(IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 면역글로부린으로부터 얻을 수 있다.

"활성을 갖는" 또는 "활성"은 특정 천연 또는 PRO533 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO533 폴리펩티드의 형태(들)을 의미한다. 바람직하게는, 활성이란 서유아세포 성장 인자 수용체 4(FGFR 4)에 높은 친화도로 결합하는 능력을 말한다.

스크린 분석에 의하여 확인될 수 있는 항체 또는 기타 분자의 "생물학적 활성"이란 상기에서 정의된 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 형성하거나, 그렇지 않으면 표적 종양 세포와의 상호 관계를 방해할 수 있는 능력을 말한다. 다른 바람직한 생물학적 활성이란 표적 종양 세포를 사멸시키는 세포독소능을 말한다.

"면역학적 특성"이란 PRO533 폴리펩티드의 1 이상의 에피토프와의 면역학적 교차 반응성을 말한다. "면역학적 교차 반응성"이란 후보 폴리펩티드가 공지의 활성 PRO533 폴리펩티드에 대해 발생한 폴리클로날 항혈청과 이 활성을 갖는 PRO533 폴리펩티드의 정성적 생물학적 활성을 경쟁적으로 저해할 수 있는 것을 말한다. 그러한 항혈청은 염소나 토끼에 주사하는 통상적인 방법으로 만들 수 있다. 면역학적 교차 반응성은 바람직하게는 "특이성"을 의미하는데, 이는 면역학적으로 교차 반응성이 있는 분자(예: 항체)의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 EBAF-2에 대한 결합 친화도가 다른 어떠한 천연 폴리펩티드에 대한 결합 친화도보다 상당히 높은(바람직하게는 약 2배 이상, 더 바람직하게는 약 4배 이상, 더 바람직하게는 약 8배 이상, 가장 바람직하게는 8배보다 훨씬 더 이상)것을 말한다.

"길항제"란 매우 넓은 의미로 쓰이는데, 천연 PRO533 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 막거나, 저해하거나 중화시키는 분자를 말한다. 마찬가지로, "아고니스트"도 매우 넓은 의미로 쓰이는데, 천연 PRO533 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비슷한 활성을 갖는 분자를 말한다. 적당한 아고니스트 또는 길항제 분자에는 아고니스트 또는 길항체 항체 또는 항체 단편, 천연 PRO533 폴리펩티드의 변이체의 단편 또는 아미노산 서열, 펩티드, 작은 유기 분자 등이 포함된다.

"작은 분자"란 약 500 달턴 미만의 분자량을 갖는 것을 말한다.

"항체" 및 "면역글로부린"은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질을 말한다. 항체가 특정 항원에만 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로부린에는 항원 특이성을 결한 항체 및 항체류 분자가 포함된다. 후자의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 농도로 생산되고, 골수종에 의해 증가된다. "항체"는 매우 넓은 의미로 사용되는데, 바람직한 생물학적 활성을 갖는 것이면 2 이상의 본래의 항체로부터 만들어지는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체(예: 이중특이성 항체), 항체 단편도 포함된다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로부린"이란 2개의 동일한 L 사슬과 2개의 도일한 H 사슬로 구성된 150,000 달턴의 헤테로테트라 당단백질을 말한다. L 사슬 각각은 공유 이황 결합에 의해 H 사슬에 연결되어 있는 반면, 많은 이황 결합은 여러 면역글로부린 동형체의 H 사슬 간에 다르다. 각 H 사슬과 L 사슬은 간격진 사슬간 이황 결합을 가지고 있기도 하다. 각 H 사슬은 한쪽 끝에 변이 영역(V_H)과 그 뒤에 여러 불변 영역을 갖는다. 각 L 사슬은 한쪽 끝에 변이 영역(V_L)을 갖고 다른 쪽 끝에 불변 영역을 갖는다. L 사슬의 불변 영역은 H 사슬의 제1 불변 영역과 정렬되고 L 사슬 변이 영역은 H 사슬의 변이 영역과 정렬된다. 특정 아미노산이 L 사슬과 H 사슬의 변이 영역간의 인터페이스를 형성한다고 믿어진다.

"변이"란 항체들마다 변이 영역에서의 특정 부위의 서열이 크게 다른 것을 말하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 특이성의 원인이 된다. 그러나, 변이의 분포는 항체의 변이 영역 전체에 대하여 고르게 일어나는 것은 아니다. L 및 H 변이 영역내의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 고변이 영역이라 불리우는 3 군데에 집중되어 있다. 변이 영역 중 매우 보존적인 부위를 프레임워크(FR)라고 부른다. 천연의 H 사슬과 L 사슬의 변이 영역 각각은 대개는 β-시트 배열을 가지면서 3개의 상보성 결정 영역에 연결되어 있는 4개의 프레임워크 영역을 갖는다. 각 사슬의 상보성 결정 영역은 프레임워크 영역에 의해 다른 사슬의 상보성 결정 영역과 매우 인접하고, 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데에 기여한다[카바트 등, NIH Publ. 제91-3242호, 1: 647-669면(1991) 참조]. 불변 영역은 항원과 항체를 직접 결합하는 데에 관여되지는 않고, 항체 의존성 세포 독성에의 항체 참여와 같은 여러 이펙터 기능을 한다.

"항체 단편"이란 완전한 항체의 일부를 말하는 것으로, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 또는 변이 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab', F(ab')₂및 F_v단편; 다이아보디(diabody); 선형 항체[자파타 등, Protein Eng. 8(10): 1057-1062면(1995) 참조]; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인으로 용해시키면 2개의 동일한 항원 결합 단편(일명 "Fab" 단편, 이들 각 단편은 단일 항원 결합 부위를 가짐)과 "Fc" 단편(명칭으로부터 보아 용이하게 결정화될 수 있는 능력을 가짐)이 얻어진다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 갖는 F(ab')₂단편이 얻어지는데 이들도 역시 항원과 교차 결합할 수 있다.

"F_v"란 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 말한다. 이는 하나의 H 사슬 변이 영역과 하나의 L 사슬 변이 영역이 단단하게 비공유 결합적으로 연결된 이합체로 이루어진다. 각 변이 영역의 3개의 상보성 결정 영역이 V_H-V_L이합체의 표면상에 항원 결합 부위를 이루기 위해 바로 이 배열에 의해 상호 작용을 한다. 총체적으로는, 6개의 상보성 결정 영역이 항체에 대한 항원 결합 특이성을 만든다. 그러나, 변이 영역 한개(또는 항원에 특이적인 3개의 상보성 결정 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다는 친화도가 낮지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.

Fab 단편도 L 사슬의 불변 영역 및 H 사슬의 제1 불변 영역(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체의 힌지(경첩) 영역으로부터 1 이상의 시스테인을 포함하는 H 사슬 CH1 영역의 카르복시 말단에 몇개의 잔기를 부가함으로써 달라진다. Fab'-SH는 불변 영역의 시스테인 잔기가 자유 티올기를 가지는 Fab'를 말한다. F(ab')₂항체 단편은 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한 쌍의 Fab; 단편으로서 만들어진 것을 말한다. 항체 단편의 다른 화학 결합들도 잘 알려져 있다.

척추 동물로부터 얻어진 항체(면역글로부린)의 "L 사슬"은 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 카파형과 람다형으로 구분된다.

H 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로부린도 몇개의 군, 크게 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉜다. 이들 중 일부는 다시 소그룹으로 나나뉜다(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2). 면역글로부린의 여러 군에 상응하는 H 사슬의 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ이다. 이러한 면역글로부린의 서브유닛 구조와 3차원 구조는 잘 알려져 있다.

"모노클로날 항체"란 실질적으로 균질성의 항체 군으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 천연적으로 발생 가능한 약간의 돌연변이를 제외하고는 해당 군을 이루는 각 항체가 동일한 것을 말한다. 모노클로날 항체는 매우 특이성이 높고, 단일의 항원 부위를 갖는다. 또한, 여러 결정자(에피토프)에 대해 여러 항체를 포함하는 통상의(폴리클로날) 항체와는 달리 각 모노클로날 항체는 항원에 대해 단일의 결정자를 갖는다. 이러한 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로부린으로 오염되지 않은 상태에서 하이브리도마 배양에 의해 만들어진다는 점에서 유리한 점이 있다. 수식어구 "모노클로날"이란 실질적으로 균질인 항체 군으로부터 얻어진다는 것을 말하고, 어떤 다른 특정 방법에 의해 항체를 생산하는 것이 필요하다는 점을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 콜러 등, Nature, 256:495(1975)에 기재된 하이브리도마 배양법 또는 미국특허 제4,817,567호에 기재된 재조합 DNA법에 의해 만들어진다. 또한 "모노클로날 항체"는 클락슨 등, Nature, 352: 624-628면(1991) 및 마르크스 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597면(1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.

모노클로날 항체는 구체적으로는 H 사슬 및(또는) L 사슬의 일부가 특정 항체 그룹 또는 서브그룹에 속하거나 특정 종으로부터 유도된 항체의 해당 서열과 동일하거나 유사하고, 나머지 부분은 다른 항체 그룹 또는 서브그룹에 속하거나 다른 종으로부터 유래된 항체(바람직한 생물학적 활성을 갖는다면 이러한 항체의 단편도 포함)의 해당 서열과 동일하거나 유사한 것을 포함한다[미국특허 제4,816,567호 및 모리슨 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국판 81: 6851-6855면(1984) 참조].

인간으로부터 유래된 것인 아닌(예컨대, 쥐로부터 유래된) 항체의 "인간화"형태란 인간으로부터 유래되지 않은 면역글로부린의 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로부린, 면역글로부린 사슬 또는 그 단편(예: Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 항원 결합 서열)을 포함한다. 대부분, 인간화 항체는 환자의 상보성 결정 영역으로부터 얻어진 잔기가 인간이 아닌 종(항체 공급자: 그 예로는 바람직한 특이성, 친화도 및 수용성을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼)의 상보성 결정 영역으로부터 얻어진 잔기로 치환된 인간의 면역글로부린을 말한다. 예를 들면, 인간 면역글로부린의 Fv FR 잔기는 인간이 아닌 종의 해당 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 환자에게서나 도입된 상보성 결정 영역 또는 프레임워크 서열에서도 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형으로 인해 항체의 성능을 개선하고 최대화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 (거의) 모든 상보성 결정 영역이 인간이 아닌 종의 면역글로부린에 해당하고 (거의) 모든 FR 영역이 인간의 면역글로부린 서열인 것인 적어도 1개, 일반적으로는 2개의 변이 영역 거의 모두를 포함한다. 최적으로는, 인간화 항체는 면역글로부린(전형적으로는 인간 면역글로부린)의 불변 영역의 일부를 최소한 포함하기도 한다. 더 자세한 것은 존스 등, Nature, 321: 522-525면(1986); 라이치만 등, Nature, 332: 323-329면(1988); 프레스타, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596면(1992)를 참조하면 된다. 인간화 항체에는 항원 결합 영역이 대상 항원으로 짧은 꼬리 원숭이를 면역화함으로써 제조된 항원으로부터 유도한 항체(상표명 PRIMATIZED)가 포함된다.

"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 V_H및 V_L을 포함한다. 이들 영역은 단일 폴리펩티드 사슬내에 존재한다. 바람직하게는 Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 갖도록 하는 V_H와 V_L사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv에 관해서는 스프링거-벨라그 출판사의 출판물인 The Pharmaclology ofMonoclonal Antibodies, 113: 269-315면(1994)을 참조하면 될 것이다.

"다이아보디"란 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 말하는데, 동일한 폴리펩티드 사슬(V_H- V_L) 내에서 L 사슬 변이 영역에 연결된 H 사슬 변이 영역을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2 영역이 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 영역들이 다른 사슬의 상보적 영역과 강제적으로 짝을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 만든다. 이에 대해 더 자세한 것은 유럽특허 제404,097호, 국제특허공개공보 제93/11161호 및 홀링거 등, Proc. Natl.Acad.Sci. 미국판 90: 6444-6448(1993)을 참조할 수 있다.

"분리된" 항체란 자연 환경의 구성 요소로부터 확인되고 분리되고(되거나) 회수된 것을 말한다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 일반적으로 방해하는 물질로서 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로리법에 의해 측정했을 때 95 중량%, 바람직하게는 99 중량%가 되도록, (2) 회전컵 서열결정기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 수 있다. 분리된 항체는 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에 존재하는 항체를 포함한다. 그러나, 통상 분리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"표지"란 표지된 항체를 수득할 수 있도록 항체에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것이다(예: 방사성 표지 또는 형광 표지). 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형에 대해 촉매 작용을 할 수도 있다.

"고체 상"이란 본 발명의 항체에 부착할 수 있는 매질을 말한다. 고체 상의 예로는 일부 또는 전부가 유리(예: 동공이 조절된 유리), 다당류(예: 아가로스), 폴리아크릴아마이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 말한다. 한 실시태양에서는 고체 상은 검정 플레이트를 포함하고, 다른 실시태양에서는 정제 컬럼(예: 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 불연속 입자로 된 불연속 고체 상도 포함된다.

"리포솜"이란 포유류에게 의약(예: PRO533 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체 그리고 임의적으로는 화학치료제)을 전달하는 데에 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 소낭을 말한다. 리포솜의 구성은 생체막에서의 지질 배열과 유사하게 통상적으로는 이중층 구조이다.

"임뮤노아드헤신"은 면역글로부린의 불변 영역의 이펙터 기능을 갖는 이종 단백질("아드헤신")의 결합 특이성을 결합시키는 항체류 분자를 말한다. 구조적으로는, 임뮤노아드헤신은 바람직한 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열(항체의 항원 인식 및 결합 부위는 아님)과 면역글로부린의 불변 영역 서열이 융합된 것이 포함된다. 임뮤노아드헤신 분자의 아드헤신 부위는 통상적으로 최소한 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 임뮤노아드헤신의 면역글로부린 불변 영역의 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4, IgGA(IgGA-1, IgGA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 면역글로부린으로부터 얻어질 수 있다.

2. 본 발명의 조성물 및 방법

a. 전장 PRO533

본 발명은 새로이 동정되고 분리된 PRO533(UNQ334)라는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 특히, 실시예에 기재된 바와 같이 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 동정하고 분리하였다. 별도의 발현 단계로부터 얻어진 단백질들의 경우 PRO 번호는 다를 수 있으나 UNQ 번호는 동일하다. 그러나, 간명하게 하기 위해 본 명세서에는 상기에서 정의된 PRO533에 포함되는 천연의 동질체 및 변이체 뿐만 아니라 DNA49435에 의해 코딩되는 단백질을 그 출처와 제조방법에 상관없이 "PRO533"이라 명명할 것이다.

WU-BALST-2 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용한 결과, 전장의 천연 PRO533 서열(SEQ ID NO: 1, 도1 참조)과 쥐의 섬유아세포 성장 인자-15간의 서열 동일성은 53%이었다. 따라서, 본 발명의 PRO533은 새로이 동정된 섬유아세포 성장 인자 그룹이고 그러한 폴리펩티드의 전형적인 활성을 지니는 것으로 믿어진다. 바람직하게는 상기 활성에는 FGFR4에 대하여 높은 친화도로 선택적 결합을 할 수 있는 능력이 포함된다.

DNA49435는 태아의 망막 라이브러리로부터 분리하였다. 도 2는 PRO533을 코딩하는 cDNA를 나타내는데, 이는 길이가 2137 bp이고 216 아미노산의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. GenBank로 Blast 비교를 한 결과, 이는 신규 단백질이고 FGF 그룹의 알려진 구성원들과는 상당한 상동성을 가짐이 확인되었다. FGF 그룹과 정렬시킨 결과, 이 신규의 구성원은 비록 단백질의 길이에 있어서는 다른 FGF와 약간의 상동이 있으나 다른 구성원과 다소 분명하게 관련성이 있는 것으로 확인되었다(20% 동일성, 도 11 참조). FGF 그룹의 일부 구성원들은 전통적인 시그날 서열이 없다. 그러나, DNA49435는 약 아미노산 잔기 1-22에서부터 그러한 서열을 갖는다.

방사 하이브리드 맵핑법에 의해 염색체를 조사한 결과 염색체 11Q13.1임이 확인되었다. 인시투 분석(In situ analysis) 결과에 의하면, 태아의 피부, 연골, 망막 내면, 태아의 소장, 태반 융모, 탯줄 뿐만 아니라 성인의 담즙낭 상피(도 8 참조)에 대해서도 발현됨이 확인되었다. DNA49435는 다중 노턴 블로팅 분석에 의해서는 분명히 검출될 수 없으나 RT-PCR에 의해서는 일부 조직에서 검출가능하다. 흥미롭게도 일부 암 세포주에 대한 조사 결과, 결장 선암주 SW480은 DNA49435의 신호가 매우 크게 상승하였다.

DNA49435가 공지의 FGF 수용체의 사실상의 리간드인지 확인하기 위하여, 결합성 연구를 수행하였다. N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그를 가진 재조합 단백질로서 DNA49435를 만들었다. C-말단을 His로 태그시킨 단백질은 바쿨로바이러스에 감염된 세포로부터 분비되었는데, 이는 이 단백질이 실제로 기능성 시그날 서열을 함유하는 것을 지시한다. 정제된 DNA49435의 N-말단 서열은 잔기 25, 분할 지점의 2 C-말단으로 시작한다. 4개의 공지된 FGF 수용체(IIIc 슬플라이스 형태)의 세포외 영역(ECD)은 IgG Fc 융합체로 발현되었다. FGF4R에 결합되었다(다른 FGFR에 대해서는 결합되지 않았음; 도 9A-C). N-말단과 C-말단 에피토프 태그된형태는 FGFR4로 결합 시험을 한 결과 비슷한 결과를 나타내었다. ECD의 영역 3의 C 말단에서 다른 스플라이스 형태는 FGF 수용체 1-3으로 기재된 바 있다[델, 케이. 알. 및 윌리암스, 엘. 티., J. Biol. Chem. 267: 21225-29면(1992); 존슨, 디. 이. 등, Mol. Cell. Biol. 11: 4627-34(1991); 무르구에, 비. 에스. 등 Cancer Res. 54: 5206-11(1994); 페레즈-카스트로, 에이. 브이 등, Genomics 30: 157-62(1995) 참조]. DNA49435는 FGFR3(IIIb) 또는 FGFR2(IIIb) 중 어느 것과도 결합하는 것으로 보이지는 않는다. FGFR4에 대한 결합은 헤파린 의존성이 있고, 헤파린의 농도가 100ng/ml일 때 가장 결합이 최대로 일어난다 (도 10). DNA49435 결합은 100배의 과량 FGF-1과 경쟁되고, FGF4(200pM)에 대해서는 높은 친화도로 결합하지만, FGF-2에 대해서는 경쟁을 적게한다(FGFR4와는 더 낮은(2nM) 친화도로 결합함)[오르니쯔 등, 디. 엠. 등, J. Biol. Chem. 271:15292-97(1996) 참조]. DNA49435가 세포의 증식에 미치는 영향을 FGFR4를 발현하는 것으로 이미 보고된 바 있는 진핵세포주 K563, NIH 3T3 섬유아세포를 포함한 몇가지 세포주로 조사하였다[암스트롱, 이. 등 Cancer Res. 52:2004-7면(1992); 페타넨, 제이. 등, Embo. J. 10: 1347-54면(1991) 참조]. FGF-1과 일부 다른 FGF들을 대조 실험하였다. DNA49435는 유사 분열 촉진능이 없었다.

DNA49435(FGF-19)는 성장 인자의 FGF 그룹의 새로운 구성원이다. 다른 구성원과 마찬가지로, DNA49435는 FGF 그룹의 구성원의 리간드의 하나이다. 최근의 FGF 그룹의 구성원들 일부는 그 결합 특이성이 측정되었다. 그러나, 결합성이 측정된 여러 구성원들의 경우 결합성은 하나의 FGFR에 대해 특이성이 있는 것으로 나타나지 않았다. 보고된 유일한 예외는 FGF-7(케라티오사이트 성장 인자, KGF)이다. 이는 FGFR2의 IIIb 스플라이스 변이체인 KGFR과 유일하게 결합하는 것으로 보인다. 여러 공지의 FGF 구성원들은 FGFR4과 결합할 수 있다[오르니쯔, 디. 엠., J. Biol. Chem., 271:15292-97면; 론, J. Biol. Chem. 268: 5388-94(1993); 바인니카 등, Embo. J. 11: 4273-80(1992) 참조]. 그러나, 이들 FGF 각각은 다른 FGFR에 결합하기도 한다. 결합의 친화도는 높으며 헤파린 요구성이다. 흥미롭게도, 다른 FGF 구성원에 영향에 대해 연구가 많이 되어 있은 3T3 섬유아세포 주를 포함한 몇몇 세포주와 인간의 포피 섬유아세포는 FGF-19에 대한 유사 분열 촉진성을 보이지 않는다. FGF4에 대한 DNA49435의 독특한 특이성을 나타낸다. 그 결과는 각 FGFR에 의해 유도된 시그날 트랜스덕션 과정이 다르다고 하는 일부 보고와 합치하는데, 이는 FGFR4 시그날이 훨씬 덜 분열 촉진성이라는 것을 시사한다. [Shaoul, E. et al., Oncogene 10: 1553-61(1995); Vainikka, S. et al., J. Biol. Chem. 271: 1270-73(1996); Vainikka, S. et al., J. Biol. Chem. 269: 18320-26(1994); Wang, J. et al., Mol. Cell. Biol. 14: 181-88(1994) 참조] 이렇게 상대적으로 유사분열 촉진성이 결핍된 것은 FGFR4는 그렇지 않지만 FGF4의 세포외 영역과 FGFR1의 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체가 BaF3 세포의 생존과 성장을 유도하는 것과 같이 세포내 영역 의존성인 것으로 보인다. [Ornitz, D.M. et al., J. Biol. Chem., 271: 15292-97(1996); Wang, J.K. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 181-88(1994) 참조] 이들 보고는 세포주 내에서 각 수용체가 과발현되는 것으로 믿는다. 지금까지는 FGFR4에 대해 특이성을 갖는 리간드가 없는 것으로 알려져 있었다. 대조적으로, DNA49435는 복합 1차 세포 시스템 및 동물 모델에서 FGFR4의 기능을 분석할 수 있도록 하는 신규한 시약으로 역할할 수 있다. 이러한 유사 분열 촉진능의 명백한 결핍에도 불구하고, FGFR4 및 여러 인간의 암, 특히 유방암의 상승 조절 또는 증폭과 관련한 수많은 보고들이 있었다[Abass, S.A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 1160-66(1997); Johnston, C.C. et al., Biochem. J. 306: 609-16(1995); McLeskey, S.W. et al., Cancer Res. 54: 523-30(1994); Penault-Llorca, F. et al., Int. J. Cancer 61: 170-76(1995); Ron. D. et al., J. Biol. Chem. 268: 5388-94(1993) 참조]. FGFR4(FGFR1-3은 아님)은 암세포 유동성과 관계될 수 있는 막 교란 반응을 매개할 수 있다[Johnson, C.L. et al., Biochem. J. 306: 609-16(1995) 참조]. SW480 결장 선암 세포에서의 DNA49435가 매우 높다는 것은 자가 시그날 과정에 FGFR4가 관여한다는 것을 반영한다.

각 FGF 리간드마다 상대적으로 특이한 역할이 있을 수 있는 반면 FGFR들에 의한 더 넓은 의미의 역할도 있는 것으로 제안된다. FGFR1 또는 FGFR2가 결핍된 마우스는 배(胚)가 치사되는 증상을 겪는다[Arman, E. et al., Proc. Natl. Sci. 미국판 95: 5082-87(1008); Ciruna, B. et al., Development 124: 2829-41(1997); Deng, C. et al., Genes Dev. 8: 3045-57(1994) 참조]. FGFR3가 결핍된 마우스는 내귀 결함 및 귀먹음 뿐만 아니라 심한 뼈 성장 결합을 보인다[Colvin, J.S. et al., Nat. Genet. 12: 390-97(1996); Deng, C. et al., Cell 84: 911-21(1996) 참조]. FGFR4이 결핍된 마우스의 표현형은 아직 보고된 바 없다. FGF-5 결핍 마우스는 털이 길고, 래트 앙고라는 돌연 변이가 일어나는데 이는 FGF-5 대립 유전자가결핍되어 있기 때문이다[Herbert, J. et al., Cell 78: 1017-25(1994) 참조]. FGF06 결핍 마우스는 건강하나 근육 재생산에 문제가 있다[Fiore, F. et al., Int. J. Dev. Biol. 41: 639-42(1997); Floss, T. et al., Genes Dev. 11: 2040-51(1997) 참조]. 표피 세포 성장 및 상처 치유에 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 성장 인자의 하나인 FGF-7/KGF가 파괴되어도 부분적으로 "헝클어진" 털을 갖는 결핍 쥐가 만들어진다[Guo, L. et al., Genes Dev. 10:165-75(1996) 참조]. 각 FGF의 기능은 시험관 내 시스템에서 비생리적 반응을 이끌어낼 수 있는 능력 및 유전자 파괴 실험에서 다른 FGF 구성원들의 보상 효과 가능성 때문에 이해하기 힘들다. FGFR은 뼈 발달에 특히 중요한 역할을 한다고 보여진다. 뼈 또는 두개골 발생에 있어서의 유전적 결함은 FGFR1-3을 항시적으로 활성화시키는 돌연변이와 연관되어 있다[Webster, M.K. & Donoghue, D.J., Trends Genet. 13: 178-182(1997); Wilkie, A.O., Mol. Genet. 6: 1647-56(1997) 참조]. FGFR4의 특이적 리간드의 하나인 DNA49435가 태아의 연골에서 발현되는 것은 연골 또는 뼈 발달에 있어서의 FGFR4에 대하여 어떠한 역할을 한다는 가능성을 시사한다. FGF-19 내지 11q13에 대한 염색체 맵팅 뿐만 아니라 태아의 망막 및 연골에서의 DNA49435의 발현은 골다공증, 유리체 망막 형성 이상증, 근육 이완증 및 인대 이완증의 희귀한 결함의 하나인 골다공증-가성신경교종에 대한 후보 유전자임을 시사한다[Frontali, M. et al., J. Med. Genet. 22: 35-47(1985); Gong, Y.M. et al., Am. J. Hum. Genet. 59: 146-51(1996); Johnson, M.L. et al., Am. J. Hum. Genet. 60: 1326-32(1997); Somev, M., J. Med. Genet. 25: 543-49(1988) 참조]. FGF-3 및 FGF-4도 11q 12에맵핑되지만 이러한 결함의 원인으로 보이지는 않는다. 그러나, 11 q13은 FGF 구성원들의 덩어리를 함유한 곳으로 보여진다.

DNA49435는 쥐 FGF-15와 거의 비슷하다(53% 동일성)[McWhirtov, J.R. et al., Development 124: 3221-32(1997) 참조]. 이는 일반적으로 관찰되는 마우스와 인간의 FGF간의 관련성(FGF1-8에 대해서 81 내지 99%)보다는 상당히 낮다. 그러나 FGF8/17/18(54-63%) 또는 FGF 11/12/13/14/15(66-72%)와 같은 FGF 그룹내의 서브그룹 구성원들간의 관련성과는 대체로 일치한다. 쥐 FGF-15는 항상성 선택자 (Hox) 전사 인자 PbX1의 하류 타겟으로 확인되었고, 이는 신경 발달에 역할을 하는 것으로 보여진다. 태아의 일부 조직에서 발현되고 특이한 수용체 특이성을 갖는 FGF 그룹의 신구성원으로서 DNA49435는 발생학적 패턴화에 직접적으로 역할하여 독특한 치료능을 갖는 것으로 여겨진다.

b. PRO533 변이체

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO533 폴리펩티드 외에, PRO533 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. PRO533 변이체는 PRO533 DNA에 적합한 뉴클레오타이드를 도입시켜 변화시키고/시키거나 목적 PRO533 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 당업계의 숙련가는 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막의 앵커링 특성 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO533 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO533 폴리펩티드 또는 PRO533 폴리펩티드의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO533 폴리펩티드에 대하여 PRO533 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 행할 수 있다(즉, PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈을 치환, 결실 또는 삽입할 수 있다). 임의로는, 변이는 PRO533 폴리펩티드의 1 이상의 도메인 내에 있는 1 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써도 가능하다. 목적하는 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실시킬 수 있는 아미노산을 결정하는 것은 PRO533 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하여 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 가능하다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 류신을 세린으로 치환하는, 즉 아미노산을 보존적으로 치환한 것일 수 있다. 삽입 또는 결실은 1 내지 5 개의 아미노산에서 할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 삽입, 결실 또는 치환시키고 하기 실시예에서 설명되는 시험관내 분석법으로 생성 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.

변이체는 올리고뉴클레오타이드 매개 (부위 특이적) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법 [Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 목적하는 PRO533 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 작기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다. 또한, 알라닌은 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creghton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환으로도 적당한 양의 변이체를 얻지 못하면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

c. PRO533의 변이화

PRO533 폴리펩티드의 공유 결합 변이는 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변이의 유형에는 PRO533 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO533 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 제제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO533 폴리펩티드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO533 폴리펩티드를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제의 예로는 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리시클릭산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질이 포함된다.

변이화의 다른 방법은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기에 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화하거나, 프롤린 및 리신을 하이드록실화하거나, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기를 인산화하거나, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기를 메틸화하거나[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민을 아세틸화하거나, C-말단 카르복실기를 아미드화하는 것이 포함된다.

본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO533 폴리펩티드를 공유결합 변이화하는 다른 방법으로는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴에 변화를 가하는 것이 포함된다. "천연 글리코실화 패턴에 변화를 가한다"는 것은 천연 서열 PRO533 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고(시키거나) 천연 서열 PRO533 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.

PRO533 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 천연 서열 PRO533 폴리펩티드에 1 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환함으로써 이루어질 수 있다(O-연결 글리코실화 부위의 경우). 임의로는 PRO533 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA에 변화를 가함으로써(특히, 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써) 변화시킬 수도 있다.

PRO533 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 방법에 의해서도 가능한데, 이는 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적 방법으로 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

PRO533 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적 또는 효소적 방법에 의해, 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈을 치환시킨으로써 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)].

본 발명의 PRO533 폴리펩티드의 공유결합 변이의 또 다른 유형으로는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 및 동 제4,179,337호에 기재된 방식이 포함되는데, 이는 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO533 폴리펩티드를 연결시키는 것이다.

또한, 본 발명의 PRO533 폴리펩티드는 다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO533 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로도 변이화할 수 있다.

한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO533 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO533 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 PRO533 폴리펩티드가 존재함으로써 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO533 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다.

여러 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진(Herpes simplex) 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]을 포함한다.

다른 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO533 폴리펩티드와 면역글로부린 또는 면역글로부린의 특정 영역의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2가 형태의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역을 포함할 수 있다. Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 한 변이 영역을 PRO533 폴리펩티드의 가용성(막간 영역에 삭제되거나 불활성화된 것) 형태로 치환하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 면역글로부린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로부린 융합체를 제조하는 것에 대해서는 미국특허 제5,428,130호(1995.6.27자 등록)를 참조할 수 있다.

D. PRO533의 제조

하기의 설명은 주로 PRO533 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환된 또는 형질감염된 세포를 배양하여 PRO533을 생산하는 방법에 관한 것이다. 물론, 이 기술분야에 잘 알려진 별도의 방법을 이용하여 PRO533을 제조할 수 있음이 예견되어진다. 예를 들어, PRO533서열 또는 이의 부분들을 고체상(solid phase) 기술을 이용한 직접 펩티드 합성으로 생산할 수 있다[참고, 예를 들어 Stewart et al., Solid-Phase Pepteide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA(1969); Merrifield,J.Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154(1963)]. 실험실적 단백질 합성은 수동적으로 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들어, 응용바이오시스템 펩티드 합성기(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(Foster City, CA)를 제조자의 지시대로 이용하여 달성할 수 있다. PRO533의 여러 부분들을 따로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법으로 결합하여 전장 PRO533을 생산할 수 있다.

i. PRO533을 코딩하는 DNA의 단리

PRO533을 코딩하는 DNA는 PRO533 mRNA를 가지고 이를 검출가능한 양으로 발현하는 것으로 믿어지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 PRO533 DNA는 실시예에 기술된 바와 같이, 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. PRO533을 코딩하는 유전자는 또한 게놈 라이브러리 또는 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 얻을 수도 있다.

라이브러리는 관심있는 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 식별하도록 설계된 프로브(PRO533에 대한 항체 또는 약 20 내지 80 염기의 올리고뉴클레오티드 등)으로 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은, 삼부르크[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 바와 같은 표준적인 방법을 이용하여 수행될 수 있다. PRO533을 코딩하는 유전자를 단리하는 별도의 방법은 PCR 방법을 이용하는 것이다[Sambrook et al., 상기 참조; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press, 1995)].

하기의 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 거짓 양성 결과가 최소화되도록 충분한 길이이어야 하고, 충분히 명확해야 한다. 이 올리고뉴클레오티드는 스크리닝하는 라이브러리내 DNA에 혼성화될 때 검출될 수 있도록 바람직하게는 표지한다. 표지방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있고,³²P-표지된 ATP와 같은 방사능표지, 바이오틴화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 온화한 엄격성 및 고도의 엄격성(stringency) 조건을 포함하는 혼성화 조건은 삼부루크(상기 참조)에 제공된다.

이러한 라이브러리 스크리닝 방법으로 동정된 서열은 기탁된 서열, 및 진뱅크(GenBank)와 같은 공용 데이터베이스 또는 기타 사적 서열 데이터베이스에서 이용할 수 있는 공지의 서열과 비교 및 정렬시킬 수 있다. 분자의 특정 부위내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성(아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)은 동일성을 측정하기 위하여 다양한 알고리즘을 사용하고 있는 BLAST, BLAST2, ALIGN, DNAstar, 및 INHERIT와 같은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용한 서열 정렬을 통하여 결정될 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 본문에서 처음으로 공개되는 유추된 아미노산 서열을 이용하여 스크리닝하여 얻을 수 있고, 필요하면 cDNA로 역전사되지 않은 프로세싱 중간체 mRNA 및 전구체를 검출하기 위하여 삼부르크 등에서 기술된 통상적인 프라이머 연장 방법을 이용하여 스크리닝 할 수 있다.

ii. 숙주세포의 선별 및 형질전환

PRO533 생산용으로 본문에 기술된 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염시키고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별 또는 소망하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적당하도록 개질된 통상적인 영양 배지에서 숙주세포를 배양한다. 배지, 온도, pH, 등과 같은 배지 조건은 숙련된 당업자에 의해 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실질적 기술은 서적[Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler. ed. (IRL Press, 1991) 및 삼부르크(상기참조)]에서 발견할 수 있다.

형질감염의 방법은 숙련된 평균 당업자에게 공지이다(예를 들어, CaPO₄및 전기투과). 사용된 숙주세포에 따라 이러한 세포에 적당한 표준적인 기술을 이용하여 형질전환을 수행한다. 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리(삼부르크 등(상기 참조)에 기술됨) 또는 전기투과가, 실질적인 세포벽 막을 갖는 원핵세포 또는 기타 세포에 일반적으로 사용된다. 사우 등(Shaw et al., Gene, 23:315(1983)) 및 국제 공개 WO89/05859(1989.6.29 공개)에 기술된 바와 같이, 아그로박테리윰 투메파시엔(Agrobacterium tumefaciens)으로의 감염이 특정 식물 세포의 형질전환을 위하여 사용된다. 이러한 세포벽을 갖지 않는 포유동물 세포를 위하여는, 그라함(Graham and van der Eb. Virology, 52: 456-457(1978))의 염화칼슘 침전법이 사용될 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템의 형질전환의 일반적 특성이 미국 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 효모내로의 형질전환은 반 솔린젠(Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977) 및 히시아오(Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829(1979)) 등의 방법에 따라 전형적으로 수행된다. 그러나, 핵 미세주입, 전기투과, 전체 세포와 박테리아 원형질체 융합, 또는 폴리캐티온(polycations)(예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴)과 같은 DNA를 세포내로 도입하는 기타의 방법이 사용될 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는 다양한 기술에 대하여는 권 등의 서적[Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537(1990)] 및 만소르 등의 논문[Mansour et al., 336:348-352(1988)] 참조.

벡터내에 DNA를 클로닝 또는 발현시키는데 적합한 숙주세포로는 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 등이 포함된다. 적당한 원핵생물로는, 그람음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어E. coli와 같은 장내세균과 같은 유박테리아 등이 있으나 이에 국한되지 않는다.E. coliK12 종 MM294 (ATCC 31,446);E. coliX1776 (ATCC 31,537);E. coli종 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635) 등과 같은 다양한E. coli종이 대중에게 이용가능하다.

원핵생물 이외에, 섬유상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물체가 PRO533 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 및 발현 숙주이다. 사카로미체스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 보통 사용되는 저류 진핵 숙주 미생물이다.

글리코실화 PRO533의 발현을 위하여 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 초파리 S2와 같은 곤충 세포 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 뿐만 아니라 식물 세포 등이 있다. 유용한 포유동물 숙주세포주의 예로는 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포 등이 있다. 더욱 특이한 예로는 SV-40(COS-7, ATCC CRL 1651)로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배 신장 세포주(현탁 배양액에서 성장하도록 서브클로닝된 293 또는 293세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1977); 차이니즈 햄스터 오버리 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 쥐 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251(1980)); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 쥐 유방암(MMT 060562, ATCC CCL 51) 등이 있다. 적당한 숙주세포의 선택은 당업계의 기술내라고 여겨진다.

iii. 복제가능한 벡터의 선택 및 사용

PRO533을 코딩하는 핵산(cDNA 또는 게놈 DNA)을 복제가능한 클로닝(DNA의 증폭)용 또는 발현용 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적당한 핵산 서열이 다양한 방법에 의해 벡터내에 삽입될 것이다. 일반적으로 이 기술분야에서 공지인 기술을 이용하여 적당한 제한 효소 부위에 삽입된다. 벡터 성분들은 일반적으로 신호서열, 복제 개시점, 하나 이상의 마커 유전자, 인헨서 엘리먼트, 프로모터 및 전사 종결서열을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 이들 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적당한 벡터의 제조는 당업자에게 공지인 표준적인 연결기술(ligation technique)을 이용한다.

PRO533은 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 및 직접 재조합적으로 생산될 수 있다. 일반적으로 신호서열은 벡터의 성분일 수 있고, 또는 벡터내에 삽입되는 PRO533 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 신호서열일 수 있다. 효모 분비를 위하여 이 신호서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더(Sacchromyces 및 Kluyveromyces α-인자 리더, 후자는 미국특허 제5,010,182호에 기재됨), 또는 에시드 포스파타제 리더, C. albicans 글루코아밀라제 리더(EP 362,179, 1990년 4월 4일 공개), 또는 WO90/13646(1990.11.15일 공개)에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 동일 또는 관련 종의 분비 폴리펩티드의 신호 서열 및 바이러스성 분비 리더와 같은 포유동물 신호서열을 사용하여 단백질을 분비시킬 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대하여 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점이 그람 음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 원점이 효모에 적합하며, 다양한 바이러스의 원점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, BPV)이 포유동물 세포내 클로닝 벡터에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택가능한 마커라고도 불리는 선택 유전자(selection gene)를 함유한다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 다른 독소(예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린)에저항성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구적 결손을 보상하는 단백질, (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 결정적인 영양소를 공급하는 단백질(예를 들어, Bacilli용 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자) 코딩한다.

포유동물 세포를 위한 적당한 선택가능한 마커의 예는 DHFR 또는 티미딘 키나제와 같은, PRO533 코딩 핵산을 취할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것들이다. 야생형 DHFR를 사용할 경우, 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216(1980)에 기술된 바와 같이 제조 및 전파됨). 효모에서 사용되기 위한 적당한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7내에 존재하는 trp1 유전자이다[Stinchcomb et al, Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)]. trp1 유전자는 트립토판에서 생장하는 능력이 결여된 효모 변이종[예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics, 85:12(1977)]에 대한 선택 마커를 제공한다.

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하기 위하여 PRO533 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 잘 알려져 있다. 원핵 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터로는 β-락타마제, 및 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., Nature, 275:615(1978); Goeddel et al., Nature, 281:544(1979)], 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp)프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057(1980); EP 36,776] 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터[deBoer et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA: 80, 21-25(1983) 등이 있다. 박테리아 시스템에 사용되기 위한 프로모터들은 또한 PRO533을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주와의 사용을 위한 적당한 프로모터 서열의 예들은 3-포스포글리세레이트 키나제[Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073(1980)], 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 기타 당분해 효소[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900(1978)] 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의한 전사 조절의 추가적 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 기타 효모 프로모터들은 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 에시드 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해적 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 부위이다. 효모 발현에 사용되기 위한 적당한 벡터 및 프로모터는 EP73,657에 더 설명된다.

포유동물 숙주세포내 벡터로부터 PRO533 전사는 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스(UK 2,211,504, 1989년 7월 5일 공개), 아데노바이러스(아데노바이러스 2 등), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 세포확대 바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터(예를 들어, 액틴 프로모터, 이뮤노글루부린 프로모터)에서 얻은 프로모터, 그리고, 열쇼크 프로모터에서 얻은(단, 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 양립가능함) 프로모터에 의해 조절된다.

고등 진핵생물에 의한 PRO533을 코딩하는 DNA의 전사는 벡터내에 인헨서를 삽입하면 증가할 것이다. 인헨서는 DNA의 시스-작용 인자로서, 일반적으로 10 내지 300 bp이고, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알루민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 많은 인헨서 서열이 알려져 있다. 그러나, 일반적으로, 진핵세포 바이러스로부터의 인헨서를 이용할 것이다. 예로는, 복제 원점(bp 100-270)의 늦은 쪽상(late side)의 SV40 인헨서, 세포확대 바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 원점의 늦은 쪽상의 폴리오마 인헨서 및 아데노바이러스 인헨서 등이 있다. 이 인헨서는 PRO533 코딩 서열에 대하여 5' 또는 3' 위치에서 벡터내로 잘려들어갈 것이고, 바람직하게는 프로모터의 5' 부위에 위치할 것이다.

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 응집된 세포들)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA의 안정화를 위해 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 공통적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 통상적으로는 5' 또는 때때로 3'의 비해독 부위로부터 이용가능하다. 이들 부위는 PRO533을 코딩하는 mRNA의 비해독 부위내 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양으로 PRO533를 합성하는데 응용하기에 적합한 여전히 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포가 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625(1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46(1979); EP 117,060; 및 EP 117,058]에 기술되어 있다.

iv. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 본문에 제공되는 서열에 기초하여 적당하게 표지된 프로브를 이용하여, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205(1980)], 도트 블롯팅(DNA 분석) 또는 인시투(in situ) 혼성화에 의해 시료내에서 직접 측정될 수 있다. 별법으로, 특정 듀플렉스(DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함)를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 그 다음 이 항체는 표지될 것이고, 듀플렉스가 표면상에 부착된 곳에서 검사를 수행하여, 표면상에 듀플렉스의 형성시 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있게 될 수 있다.

별법으로, 유전자 산물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위하여, 세포 또는 세포 섹션의 면역조직학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 검사와 같은 면역학적 방법으로 유전자 발현을 측정할 수 있다. 면역조직학적 염색 및(또는) 시료 액체의 검사에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 편리하게 항체는 PRO533 폴리펩티드의 천연서열에 대하여 또는 본문에 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대하여 또는 PRO533 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외부 서열에 대하여 제조할 수 있다.

v. 폴리펩티드의 정제

세포 배양물로부터 또는 숙주 세포 용혈물로부터 PRO533의 형태들을 회수할 수 있다. 만일 막 결합된 것이라면, 적당한 세제 용액(예, 트리톤-X100) 또는 효소적 절단으로 막으로부터 유리시킬 수 있다. PRO533의 발현에 사용된 세포들은 다양한 물리적 및 화학적 수단(냉동-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용혈제 등)으로 파괴시킬 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO533을 정제하는 것이 요구될 수 있다. 하기의 방법은 적당한 정제 방법의 예이다; 이온 교환 칼럼상에서의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지(DEAE 등) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 술페이트 침전, 예를 들어 세파덱스 G-75를 이용한 젤 투과; IgG와 같은 오염원을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼, 및 PRO533의 에피토프-태그된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 이 기술분야에 공지이고 예를 들어 서적[Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 공정 및 생산되는 특정 PRO533의 성질에 의존적일 것이다.

E. PRO533 및(또는) 항-PRO533 항체의 용도

1. PRO533의 일반적 용도

PRO533을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(또는 이들의 상보서열)은 염색체 및 유전자 맵핑에서의 혼성화 프로브로서의 용도 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서의 용도를 포함하는, 이 기술 분야 또는 분자생물학 분야에서 다양한 응용성을 갖는다. PRO533 핵산은 또한 본문에 기술된 재조합 기술에 의해 PRO533 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.

전장 천연 PRO533(SEQ ID NO: 1) 유전자, 또는 그의 부분은 그 전장 유전자를 단리하기 위한, 또는 도1에 공개한 PRO533(SEQ ID NO: 1)과 원하는 서열 상동성을 갖는 다른 유전자(예를 들어, 다른 종으로부터의 PRO533 또는 천연적으로 생성된 PRO533 변이체를 코딩하는 것들)을 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 유용할 것이다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 80염기일 것이다. 바람직하게는 이 길이가 약 20 내지 약 50 염기이다. 혼성화 프로브는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열로부터 유도되거나 또는 천연 서열 PRO533의 프로모터, 인헨서 엘리먼트 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유도될 수 있다. 예로서, 스크리닝 방법은, 공지의 DNA 서열을 이용하여 약 40 염기의 선택된 프로브를 합성하고 이를 이용하여 PRO533의 코딩 부위를 단리하는 것을 포함할 것이다. 부가적으로, 도5에 기술된 프로브는 혼성화 프로브로서 사용될 수도 있다. 혼성화 프로브는 방사능 뉴클레오티드(예,³²P 또는³⁵S) 또는 효소적 표지(예, 아비딘/바이오틴 커플링 시스템을 통하여 프로브에 커플링된 알칼린 포스파타제)를 포함하는 다양한 표지에 의해 표지화될 수 있다. 본 발명의 PRO533 유전자의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브가 인간 cDNA, 게놈 DNA, 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용되어 이러한 라이브러리의 어떤 것들이 프로브와 혼성화되는 지를 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에 더욱 상세히 설명된다.

이 프로브는 근접하게 연관된 PRO533 서열의 동정을 위한 서열의 푸울을 생성하기 위한 PCR 기술에 사용될 수도 있다.

PRO533을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 PRO533을 코딩하는 유전자의 맵핑을 위한 또는 유전적 질환을 갖는 개인의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브의 제조에 사용될 수 있다. 본문에 제공되는 뉴클레오티드 서열은 인시투 혼성화, 알려진 염색체 마커에 대한 연관 분석 및 라이브러리를 갖고 혼성화 스크리닝을 수행하는 것과 같은 공지의 기술을 이용하여 염색체 및 염색체의 특정 위치에 맵핑될 것이다.

PRO533이 FGF4 수용체(FGFR4)에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 이 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자들을 동정하는 시험에 사용될 수 있다. 이러한 방법으로, 수용체 리간드 결합 상호작용의 억제제들을 동정할 수 있다. 이러한 결합 상호작용에 관여하는 단백질들은 또한 이 결합 상호작용의 억제제 또는 자극제인 펩티드 또는 소분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 스크리닝 시험은 천연의 PRO533 또는 PRO533에 대한 수용체의 생물학적 활성을 닮은 선두적 화합물을 찾도록 디자인될 수 있다. 이러한 스크리닝 시험은 화학적 라이브러리를 고도로 완벽하게 스크리닝받을 수 있도록 하는 검사를 포함하여 소분자 드럭 후보를 동정하기에 특히 적합할 수 있다. 예상되는 소분자는 합성 유기 화합물또는 합성 무기 화합물을 포함한다. 이 시험은 단백질-단백질 결합 시험, 생화학적 스크리닝 시험, 면역시험 및 세포 기초한 시험등을 포함하는 당업계에 잘 특징화된 다양한 형태로 수행될 수 있다.

PRO533 또는 이의 개질된 형태를 코딩하는 핵산은 또한 트랜스제닉 동물 또는 "녹아웃" 동물의 생성에 사용될 수도 있고, 이어서 이 트랜스제닉 동물 또는 녹아웃 동물들은 치료적으로 유용한 약을 개발 및 스크리닝하는데 유용하다. 트랜스제닉 동물(예, 마우스 또는 래트)는 트랜스유전자를 함유하는 세포를 갖는 동물이다(이 트랜스유전자는 이 동물 또는 조상 또는 태생전 동물(예 배생성 단계)에게 도입된다). 트랜스유전자는 세포의 게놈안에 삽입되어 있는 DNA이고, 이로부터 트랜스제닉 동물이 발생한다. 일 실시태양에서는 PRO533를 코딩하는 cDNA를 이용하여 확립된 기술에 따라 PRO533를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하고, 이 게놈 서열을 이용하여 PRO533를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 쥐 또는 래트와 같은 동물을 생성하는 방법은 당업계에 통상적인 것이 되었고, 예를 들어 미국특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기술되어 있다. 전형적으로, 조직 특이적 인헨서를 이용하여 PRO533을 코딩하는 트랜스유전자를 특정 세포로 표적화시키곤 한다. 배발생단계에서 동물의 생식선에 도입된 PRO533를 코딩하는 트랜스유전자의 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하여 PRO533를 코딩하는 DNA의 증가된 발현의 영향을 검사할 수 있다. 이러한 동물들은 과발현과 관련된 병리상태를 예방할 것으로 생각되는 약을 위한 검사용 동물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 약으로 동물을 처리하고, 트랜스유전자를 가지고 처리하지 않은 동물과 비교하여 감소된 병리 상태의 발생률은 약이 병리상태에 치료적으로 개입하는 것을 강력히 나타낼 것이다.

PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 유전자 치료에 사용될 수 있다. 유전자 치료에의 응용에서는, 예를 들어 결함있는 유전자의 대체를 위하여, 치료적으로 효과적인 유전적 산물의 생체내 합성을 달성하기 위하여, 유전자를 세포내로 도입시킨다. "유전자 치료"란 하나의 치료로 지속적인 효과가 달성되는 통상적인 유전자 치료, 및 치료적으로 효과적인 DNA 또는 mRNA의 한 번 또는 반복된 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여 모두를 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내 특정 유전자의 발현을 억제하는 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막에 의한 제한된 흡수에 의해 야기되는 세포내 낮은 농도에도 불구하고, 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포내로 수입되어서 억제제로서 활동하는 것이 이미 알려져 있다.[Zamecnik et al., Proc. Natil. Acad, Sci. USA 83, 4143-4146(1986)]. 이 올리고뉴클레오티드는 그의 흡수를 향상시키기 위하여 개질될 수 있다(예를 들어, 음으로 하전된 포스포디에스테르기를 비하전된 기로 치환하는 것).

살아 있는 세포내로 핵산을 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이 기술은 생체외에서 배양된 세포로 전달할 것인지 또는 생체내에서 의도하는 숙주의 세포내로 전달할 것인지에 따라 달라진다. 생체내 포유동물 세포내로 핵산을 전달하는데 적합한 기술로는 리포좀의 사용, 전기투과, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등이 있다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스성(전형적으로 레트로바이러스) 벡터로의 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개된 형질감염을 포함한다(Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993)). 어떤 경우에는, 세포 표면 막 단백질 특이적 또는 표적 세포 특이적 항체, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드와 같은, 표적 세포로 표적화하는 물질과 함께 핵산을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀을 사용하는 경우, 엔도사이토시스와 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 이용하여 표적화 및(또는) 흡수를 용이하게 할 수 있다(예를 들어, 특정 세포 유형에 작용하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편들, 순환에서 내재화(internalization)를 거치는 단백질에 대한 항체, 세포내 정착을 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질). 수용체 매개되는 엔도사이토시스 기술은 예를 들어 우 등(Wu et al.)의 문헌[J. Biol. Chem. 262, 4429-4432(1987)] 및 와그너 등(Wagner et al.)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414(1990)]에 기술된다. 유전자 표지 및 유전자 치료 프로토콜에 대한 요약에 대하여는 앤더슨 등(Anderson et al.)의 문헌[Science 256, 808-813(1992)] 참조.

본 발명의 항-PRO533 항체는 다양한 응용성을 갖는다. 예를 들어, 항-PRO533 항체는 PRO533를 위한 진단적 검사에 사용될 수 있다(예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청내 그 발현을 검출). 경쟁적 결합 검사, 직접 또는 간접적 샌드위치 검사 및 이종 또는 동종상에서 수행되는 면역침전 검사[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp 147-158]와 같은, 이 기술분야에 공지인 다양한 진단적 검사 기술이 사용될 수 있다. 진단적 검사에 사용되는 항체는 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 검출가능한 부분은 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 부분은³H,¹⁴C,³²P,³⁵S, 또는¹²⁵I와 같은 방사능 동이원소, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시퍼라제와 같은 화학적 발광 화합물, 또는 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소일 수 있다. 항체를 검출가능한 부분과 결합시키는 당업계에 공지인 임의의 방법이 사용될 수 있고, 이 방법들은 헌터 등[Hunter et al., Nature, 144:945(1962)], 데이비드 등[David et al., Biochemistry, 13:1014(1974)], 페인 등[Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219(1981)] 및 니그렌[Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407(1982)]에 의해 기술된 방법을 포함한다.

항-PRO533 항체는 또한 재조합 세포 배양물 또는 천연적 소스로부터 PRO533를 친화적 정제하는데 유용하다. 이 과정에서, 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여, PRO533에 대한 항체를 적합한 지지체(예를 들어 세파덱스 수지 또는 여과지) 상에 고정시킨다. 고정된 항체에 정제시킬 PRO533를 함유하는 시료를 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합하고 있는 PRO533를 제외하고 시료내 모든 물질을 실질적으로 제거할 적당한 용매로 지지체를 세척한다. 마지막으로 항체로부터 PRO533를 유리시킬 또다른 적합한 용매로 이 지지체를 세척한다.

FGF는 유사분열물질로서 또는 비유사분열물질로서 작용할 수 있다. 이들 인자들은 과립막 세포, 부신피질 세포, 연골세포, 근원세포, 각막 및 맥관 내피세포(소 또는 인간), 맥관 평활근세포, 렌즈, 망막 및 전립선 상피 세포, 과돌기신경교세포, 성상세포, 및 골아세포를 유도하는, 2배엽체 중배엽-유래 및 신경관-유래의 다양한 세포에 대한 유사분열물질이다.

FGF의 비유사분열물질적 작용은 상처 부위로의 세포의 이동 촉진 (주화성;chemotaxis), 새로운 혈관 형성의 개시(맥관형성), 신경 재생 및 생존의 조절(향신경성), 내분비 기능의 조절, 및 특정 세포내 단백질 발현, 세포외 기질 생산 및 세포 생존의 자극 또는 억제를 포함한다. 참고[Baird, A. Bohlen. P., Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1):369-418(1990)]. 이러한 특성들은 FGF의 상처 치료, 신경 복구, 측부 혈관 형성 등을 촉진하기 위한 치료적 접근에의 응용에 대한 기초를 제공한다. 예를 들어, 심장병 및 수술에서 심근층 손상을 최소화하기 위하여 FGF가 제안된 적이 있다(미국특허 제3,378,437호).

FGF 군은, 발생 도중에 분화된 표현형을 촉진 또는 억제하는 능력, 맥관형성적 및 향신경성 효과의 매개, 및 세포 이동의 조절을 포함하는 역활을 가지고, 중배엽 및 신경외배엽 기원의 세포에 다양한 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. [Goldfarb, M., Cytokine Growth Factor Rev. 7: 311-25(1996); Naski, M.C. 및 Ornitz, D.M., Front. Biosci. 3: D781-94(1998); Slavin, J.Cell Biol. Int. 19: 431-44(1995)]. DNA49435의 인시투 분석은 태아 피부, 연골조직, 태아 각막의 내부 및 성인 담낭 상피(도 8) 및 태아 소장, 태반 융모 및 재대(도시 생략)에서 발현되는 것을 보였다. DNA49435는 여러 조직에서 RT-PCR에 의해 명확히 검출되지 않았다(도시 생략). 또한 DNA49435 양이 췌장 아데노암종 세포주 SW480에서 상승하여 PRO533 길항제가 췌장암의 치료에 치료적 효과를 가질 수 있다는 것이 확실하다.

DNA49435가 코딩하는 PRO533은 섬유아세포 성장인자 수용체-4(FGFR4)에 대하여 독특하게 결합하는 특이성을 가지고, 이 특성은 알려진 GFG군에서 유일한 것이다. FGFR-4 신호전달은 실질적으로 비유사분열물질적인 것으로 제안된다. 독특한 결합 특성 때문에, PRO533은 복합적 1차 세포 시스템 및 동물 모델에서 FGFR4 기능을 검사 및 분석하는 시약으로서 사용될 수 있다. FGFR4의 상승적 조절 및 증폭은 다양한 인간의 암, 특히 유방암과 연관성을 나타내었다. [Abass, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metal. 82:1160-66(1997); Johnston, C.L. et al., Biochem. J. 306: 609-16(1995): McLeskey, S.W. et al., Cancer Res. 54: 523-30(1994); Penault-Llorca, F. et al., Int. J. Cancer 61:170-76(1995); Ron, D.R., J. Biol. Chem. 268: 5388-94(1993)]. FGFR1 내지 3이 아니고 FGFR4는 암세포 이동과 관련이 있을 수 있는 막 러플링(ruffling) 반응을 매개할 수 있다는 것이 밝혀졌다[Johnston, C.L., Biochem. J. 306: 609-16(1995)]. SW480 췌장 아데노암종에서 DNA49435의 다량 발현은 자기분비적 신호전달에서 FGFR4의 조절적 효과를 반영한다.

태아 연골조직에서 특정 FGFR4-리간드인 PRO533의 발현은 또한 연골조직 또는 골 발생에서 FGF19의 역활의 가능성을 보인다. DNA49435의 염색체 11q13에의 맵핑과 연골조직 및 태아 망막에서의 발현은 PRO533 코딩 DNA가 골다공증-가상신경교종 증후군(골다공증으로 특징지워지는 희귀한 질병), 비트레오레티날 디스플라시아, 근이완증 및 인대이완증에 대한 후보 유전자임을 제안하고 있다. [Frontali, M. et al., Am. J. Med. Genet. 22:35-47(1985): Gong, Y. et al., Am. J. Hum. Genet. 59: 146-51(1996); Johnson, M.L. et al., Am. J. Hum. Genet. 60:1326-32(1997); Somer. J. et al., J. Med. Genet. 25: 543-49(1988)].

2. 종양 조직 및 세포주에서 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 증폭

본원 발명은 부분적으로 PRO533을 코딩하는 유전자가 1차 폐 종양에서 증폭됨을 발견한데 기초하고 있다. 원핵 및 진핵 유기체의 게놈은 상충하게 보이는 두가지의 요건을 가져야 한다. 하나는 여러 세대를 거쳐 안정적인 유전을 보증하기 위하여 유전 정보로서의 DNA를 그 원래의 형태로서 보존 및 전파하는 것이다. 한편, 세포 또는 유기체는 지속적인 환경적 변화에 적응할 수 이어야 한다. 적응 기작으로는 유전 물질의 정량적 또는 정성적 변화를 포함할 수 있다. 정성적 변화는 코딩서열의 변화로 구조적 및(또는) 기능적으로 상이한 단백질을 만드는 DNA 돌연변이를 포함한다. 유전자 증폭은 정량적 변화이고, 이에 의해 완전한 코딩 서열(즉, 유전자)의 실제적인 수가 증가하여 전사를 위해 이용가능한 주형의 수가 증가하고, 해독가능한 전사체의 수가 증가하여 결국 증폭되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양이 증가한다.

유전자 증폭의 현상 및 현상을 나타내는 기작이 다수의 원핵 및 진핵 배양 시스템에서 실험실적으로 연구되어 왔다. 유전자 증폭의 가장 잘 밝혀진 예로는 세포독성 드럭 메토트렉세이트(MTX)의 다양한 농도를 함유하는 배지에서의 진핵세포의 배양이 있다. MTX는 폴릭 에시드 유사체로서 디히드로폴레이트 환원제(DHFR) 효소를 차단하여 DNA 합성을 방해한다. 낮은 농도의 MTX에의 초기 노출 도중, 대부분(99.9%)의 세포가 사망할 것이다. 소수의 세포가 살아 남고, 이들은 DHFR-RNA 및 단백질을 생산을 증가시켜 MTX의 농도가 증가하여도 성장할 수 있다. 이러한 과생산의 기본은 하나의 DHFR 유전자의 증폭이다. 이 유전자의 추가적인 복제물은 작고, 여분의 염색체(double minutes)의 형태로의 염색체 외의 복제물로서 또는 삽입된 염색체 복제물로서 발견된다.

세포독성 드럭(박테리아에서는 항생제 및 진핵세포에서는 화학치료제) 및 종양성 형질전환에 대한 저항성을 가지도록 개발하는데 있어서 유전자 증폭이 가장 흔히 발견된다. 자연적 현상으로서 또는 바이러스성 또는 화학적(환경적)손상에 기인한 진핵세포의 형질전환은 일반적으로 그 세포의 유전물질의 변화와 관련이 된다. 인간 악성종양들에서 관찰되는 가장 흔한 유전자 변화중 하나는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 정지기(G1)에서 복제기(S1)로의 세포의 전이를 조절하고 DNA 손상이 있는 경우 이 전이를 억제한다. 환언하면, 불능의 p53 돌연변이의 주된 결과중 하나는 DNA 손상(즉 유전적 변화)의 축적 및 전파이다. 종양세포에서 유전자 변화의 공통적 유형으로는 점 돌연변이, 증폭 및 총체적이고 구조적인 변화(예. 전좌) 등이 있다.

DNA 서열의 증폭은 DHFR 실험 시스템에서 설명한 바와 같이, 특정의 기능적 요구를 나타낼 수 있다. 따라서, 악성종양들에서 특정 종양유전자의 증폭은 악성 형질전환 및 형질전환된 표현형의 유지 과정에서 이들 유전자가 원인적인 역활을한다는 쪽으로 지적된다. 이러한 가설은 최근 연구에서 지지를 얻다. 예를 들어, bcl-2 단백질은 비-호즈킨(non-Hodgkin's) 림프종의 특정 유형에서 증폭되는 것으로 발견되었다. 이 단백질은 세포자멸사를 억제하고 종양세포의 계속적인 축적을 가져온다. 성장인자 수용체의 유전자군의 멤버들이 다양한 암유형에서 증폭되는 것이 발견되었고, 이러한 발견은 이들 수용체의 과발현으로 이용가능한 성장인자의 제한적인 양에 종양세포가 영향을 덜 받도록 할 수 있다는 것을 암시한다. 예로는, 재발성 전립선 암에서 안드로겐 제거 치료 도중 안드로겐 수용체의 증폭 및 유방암에서 성장인자 수용체 동종체 ERB2의 증폭 등이 있다. 최근에 세포내 신호에 관련된 유전자 및 세포주기 증가 조절은 악성 형질전환 도중 증폭을 겪을 수 있다. 이것의 예로 다양한 상피 종양 및 림프구 종양에서 bcl-1 및 ras 유전자의 증폭이 있다.

이들 초기의 연구들은 이 접근법으로 악성 형질전환에 중요한 유전자를 동정할 수 있으므로 종양에서 증폭된 DNA 서열의 동정의 가능성을 보여준다. ERB2의 경우는 또한, 형질전환시키는 단백질은 종양 치료에 대한 새롭고 특이한 표적일 수 있으므로, 치료적 견지에서 가능성을 보여준다.

증폭된 유전자 서열을 증명하기 위하여 수개의 상이한 기술을 사용할 수 있다. 암세포로부터 제조한 염색체 실의 고전적인 세포유전학적 분석은 총체적인 구조적 변화(전좌, 결손, 전위 등)를 동정하는데 적합하다. 증폭된 유전자 부위가 복제 개수가 많은 큰 부위를 포함하거나 또는 염색체외 물질로서 존재한다면, 증폭된 유전자 부위만을 볼 수 있다. 세포유전학이 특정 종양과 특정 염색체 변화와의일관적인 관련성을 보여주는 일차적인 기술인 반면, 다루기쉬운 DNA 서열의 동정 및 단리에는 부적절하다. 더 최근에 개발된 비교 게놈 혼성화(CGH) 기술은 종양에서 유전자 증폭의 다양한 현상을 설명하였다. 종양 DNA 및 정상 DNA를 중간기(metaphase)의 정상 세포 상에 동시에 혼성화시키고, 종양세포에서 증가된 빈도로서 존재하는 DNA서열에 대한 이미지 분석으로 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다(WO 93/18,186: Gray et al., Radiation Res. 137, 275-289[1994]). 스크리닝 방법으로서, 이 유형의 분석은 다양한 인간 종양에서 자주 발생하는 많은 수의 증폭단위(증폭된 DNA의 범위)를 보여주었다. 증폭된 DNA 범위를 동정하는데는 비록 CGH가 고전적인 세포유전학적 분석에 비하여 더 민감하지만, CGH는 표준 분자 유전학적 기술에 의하여 증폭단위(amplicon)내 코딩서열의 빠른 동정 및 단리는 허용하지 않는다.

유전자 증폭을 검출하는 가장 민감한 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 기초한 분석이다. 이들 분석은 매우 소량의 종양 DNA를 출발물질로서 이용하고, 정교하게 민감하며, 추후 분석(예. 서열분석)을 할 수 있고 많은 부피의 쓰루풋(throughput) 분석에 적합한 DNA를 제공한다.

상기한 검사법은 상호 배타적이지 않고 종양내 증폭을 동정하기 위하여 종종 조합하여 사용된다. 세포유전학적 분석 및 CGH가 증폭된 부분의 전체 게놈을 검사하는 스크리닝 방법을 나타내는 반면, PCR-계 검사법은 코딩 서열(즉, 증폭된 부위의 유전자)의 최종 동정에 가장 적합한다.

본 발명에 따르면, 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 간암, 신장암,췌장암, 비장암, 흉선암, 고환암, 난소암, 자궁암 등을 포함하는 다양한 1차 암 또는 암 세포주로부터의 DNA와 건강한 공여자로부터의 DNA의 푸울을 비교하여, 증폭된 유전자를 정량적 PCR에 의해 동정해 왔다(S. Gelmini et al., Clin. Chem. 43, 752[1997]). 정량적 PCR은 TaqMan 기계(ABI사)를 이용하여 수행하였다. 유전자 특이적 프라머 및 형광발생적 프로브는 DNA의 코딩 서열에 기초하여 설계되었다.

1차 인간 폐 종양 세포는 일반적으로 아데노암종, 편평상피세포 암종, 큰 세포 암종, 논-스몰 세포 암종, 스몰 세포 암종, 및 기관지 폐포성 암종로부터 일반적으로 유도되고, 예를 들어, SRCC724(편평상피 세포 암종, 약어 "SqCCa"), SRCC725(비-소세포 암종, 약어 "NSCCa"), SRCC726(아데노암종, 약어"AdenoCa"), SRCC727 (아데노암종), SRCC728(편평상피세포 암종), SRCC729(아데노암종), SRCC730(아데노/편평상피세포 암종), SRCC731(아데노암종), SRCC732(편평 세포 암종), SRCC733(아데노암종), SRCC734(아데노암종), SRCC735(기관지 폐포성 암종, 약어 "BAC"), SRCC736(편평세포 암종), SRCC738(편평세포 암종), SRCC739(편평세포 암종), SRCC740(편평세포 암종), SRCC740(폐 세포 암종, 약어 "LCCa").

3. 조직 분포

본문에서 유전자 증폭 검사의 결과는 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정하는 것과 같은 추가적인 연구에 의해 확인될 수 있다.

전술한 바와 같이, 다양한 조직에서 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본문에 제공되는 서열에 기초하여 적합하게 표지된 프로브를 이용한, 통상적인 서던 블롯팅, 노던 블롯팅(mRNA의 전사를 정량화하기 위해)(Thomas, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 77:5201-5205[1980]), 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 인시투 혼성화에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, 특정 듀플렉스(DNA듀플렉스, RNA듀플렉스, 및 DNA-RAN 혼성 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스 등)를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다.

별법으로, 다양한 조직에서의 유전자 발현은, 조직 섹션의 면역조직학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 세포배양물 또는 체액 검사에 의해 측정하여 유전자 산물의 발현을 직접적으로 정량화할 수 있다. 면역조직학적 염색 및(또는) 시료 액체의 검사에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 통상적으로 PRO533 폴리펩티드 천연 서열에 대하여 또는 본문에 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대하여 또는 PRO533 DNA에 융합되어 있고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외부 서열에 대하여 항체를 제조할 수 있다. 항체를 생산하는 일반적인 기술 및 노던 블롯팅 및 인시투 혼성화에 대한 특별한 프로토콜이 이하 제공된다.

4. 염색체 맵핑

소정의 유전자의 증폭이 기능적으로 적절하다면, 종양의 생존에 중요하지 않은 이웃하는 게놈 부위보다 이 유전자가 더욱 증폭될 것이다. 이를 시험하기 위하여, 예를 들어 방사능-혼성화 분석에 의해 유전자를 특정 염색체에 맵핑할 수 있다. 이어서 증폭 정도를 동정된 부위에서 측정하고 이웃하는 게놈 부위에서의 양과 비교한다. 유전자가 맵핑된 이 게놈 부위에서의 선택적이고 바람직한 증폭은 관찰된 유전자 증폭이 종양 성장 또는 생존을 촉진한다는 가능성과 일치한다. 염색체 맵핑은 프레임워크(framework) 및 에피센트럴(epicentral) 맵핑을 모두 포함한다. 더욱 상세하게는 예를 들어 문헌[Stewart et al., Genome Research 7, 422-433(1997)] 참조.

5. 항체 결합 연구

유전자 증폭 연구는, 종양(암) 세포에서 PRO533 폴리펩티드의 영향을 억제하기 위한 항-PRO533 항체의 능력을 시험하는 항체 결합 연구에 의해 더욱 확실해질 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날, 단일클론, 인간화(휴머나이즈드), 2특이적 및 이종접합 항체 등이 있고 이들의 제조는 후술될 것이다.

항체 결합 연구는 경쟁적 결합 검사, 직접 및 간접적 샌드위치 검사, 및 면역침전검사와 같은 임의의 공지의 방법으로 수행될 수 있다.[Zola, Monoclonal Antibodies; A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc., 1987)]

경쟁적 결합 검사는 제한적인 양의 항체에 대하여 표지된 표준이 시험 시료 분석물과 경쟁하는 능력에 의존적이다. 시험 시료내 표적 단백질(종양 세포내 증폭된 유전자에 의해 코딩됨)의 양은 항체에 결합하게 되는 표준의 양에 역으로 비례한다. 결합하게 되는 표준의 양 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 불용해화시켜서, 항체에 결합한 표준 및 분석물을 비결합된 상태로 남아 있는 표준 및 분석물로부터 편리하게 분리할 수 있다.

샌드위치 검사는 검출할 단백질의 상이한 면역적 부위(또는 에피토프)에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 검사에서, 시험 시료 분석물은 고체상 지지물에 고정된 제1 항체에 결합한 후, 이 분석물에 제2 항체가결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성한다. 미국특허 제4,376,110호 참조. 제2항체는 그자체가 검출가능한 부분으로 표지될 수 있거나(직접적 샌드위치 검사) 또는 검출가능한 부분으로 표지된 항-면역글로부린 항체를 이용하여(간접적 샌드위치 검사) 측정될 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 검사의 한 예는 검출가능한 부위가 효소인 ELISA 검사이다.

면역조직화학을 위한 종양 시료는 신선하거나 냉동되거나 또는 피라핀에 심어져 있을 수 있고 예를 들어 포르말린과 같은 방부제내에 고정되어 있을 수 있다.

6. 세포-기초한 종양 검사.

종양에 대한 세포-기초한 검사 및 동물 모델은 유전자 증폭 검사에서의 발견들을 확인하기 위하여 사용될 수 있고, 나아가 본문에서 동정된 유전자들 사이의 관계 및 종양 세포 성장의 발생 및 발병학을 이해하기 위하여 사용될 수 있다. 종양 또는 암의 발생 및 발병학에서 본문에서 동정된 유전자 산물의 역활은 본문에서 유전자를 증폭시킨다고 동정된 1차 종양 세포를 이용하여 시험할 수 있다. 이러한 세포들은 예를 들어, 상기 열거한 폐암세포들을 포함한다.

또다른 접근법에서, 특정 종양에 관계된 것으로 알려진 세포유형의 세포를 본문의 cDNA로 형질감염시키고, 이들 cDNA 들이 과도한 성장을 유도하는 능력을 분석한다. 적합한 세포들로는 예를 들어, B104-1-1 세포주(neu원시종양유전자로 형질감염된 NIH-3T3 세포주) 및 ras-형질감염된 NIH-3T3 들과 같은 안정된 종양 세포주 들이 있고, 이들은 원하는 유전자로 형질감염시킬 수 있고 종양생성적 성장을 모니터할 수 있다. 그다음 이러한 형질감염된 세포주는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물이 형질전환된 세포에 세포정지적 또는 세포독성적 활성을 발휘하거나 또는 이들이 항체-의존적 세포적 세포독성(ADCC)를 매개함으로써, 이들이 종양발생적 세포 성장을 억제하는 능력을 시험하는데 사용될 수 있다. 본문에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 형질전환된 세포는 나아가 암치료를 위한 드럭 후보를 동정하는데 사용할 수 있다.

또한, 비록 안정적인 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉 동물(하기하는 바와 같은)에서 종양으로부터 유도된 1차 배양물을 사용하여 세포-기초한 검사를 할 수 있다. 트랜스제닉 동물들로부터 연속적인 세포주를 유도하는 기술은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642-648[1985])참고).

7. 동물 모델

본문에서 동정된 유전자의 종양 발생 및 발병학에서의 역할을 더욱 잘 이해하고 항체 및 천연 폴리펩티드의 다른 길항제(예. 소분자 길항제)를 포함하는 치료제 후보의 효험을 시험하기 위하여, 알려진 다양한 동물 모델을 사용할 수 있다. 이러한 모델의 생체내 특성은 이들 모델이 인간 환자에서의 반응을 특히 예측가능하게 할 수 있다. 종양 및 암(예. 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비-재조합적 및 재조합적(트랜스제닉) 동물을 포함한다. 비재조합적 동물 모델은 예를 들어 설취류(쥐과 동물 모델)을 포함한다. 이러한 모델은 종양 세포를 표준적인 기술(예를 들어 피하적 주사, 꼬리 정맥 주사, 췌장 이식, 복막내 이식, 이식, 신피막하 이식 또는 오르토핀 이식(예. 결장 조직내로 결장암 세포를 이식함), 참고 PCT 공개 번호 WO97/33551, 1997년 9월 18일 공개 등)로 동생성(syngenic) 쥐에 도입시켜 생성할 수 있다.

종양적 연구에서 가장 많이 사용되는 동물 종의 하나는 면역결핍된 쥐, 특히 누드쥐이다. 무형성증(aplasia)을 갖는 누드쥐가 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있다는 관찰은 이러한 목적으로 누드쥐의 광범위한 사용을 가져왔다. 체세포 열성nu유전자를 많은 수의 누드쥐의 먼 동종 스트레인(예를 들어, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL 등 포함)에 도입하였다. 또한, 누드쥐 이외에 유전적 면역결핍을 가지는 다양한 다른 동물을 사육하고 종양 이종이식에 수혜자로서 사용하였다. 더욱 자세하게는 예를 들어 문헌[The Nude Mouse in Oncology Research. E. Boven and B. Winograd. eds. CRC Press. Inc. 1991]참조.

이러한 동물에게 도입되는 세포는 상기 열거한 임의의 종양 세포주 및 예를 들어 B104-1-1 세포주(neu 원시종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질전환된 NIH-3T3 세포; Caco-2(ATCC HTB-37); 적당히 잘 분화된 등급 II 인간 결장 아데노암종 세포주, HT-29(ATCC HTB-38)와 같은 공지의 종양/암 세포주로부터 또는 종양 및 암으로부터 유도될 수 있다. 종양 또는 암세포 시료는 수술을 받는 환자로부터 표준적인 조건(예를 들어, 냉동 및 액체 질소에서 저장, Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689-696[1983])을 이용하여 얻을 수 있다.

다양한 방법을 이용하여 종양 세포를 누드쥐와 같은 동물에게 도입할 수 있다. 쥐의 피하 공간(s.c.)이 종양 이식에 매우 적당하다. 종양은 고체 블록으로서, 트로카(trochar)의 사용에 의한 니들 바이옵시(needle biopsy)로서, 또는 세포 현탁액으로서 이식될 수 있다. 고체 블록 또는 트로카 이식을 위하여는 적당한 크기의 종양 조직 단편이 s.c. 공간으로 도입된다. 세포 현탁액은 1차 종양으로부터 또는 안정적인 종양 세포주로부터 신선하게 제조되고 피하적으로 주사된다. 종양 세포는 또한 피하 이식체로서 주사될 수도 있다. 이 위치에서, 접종물은 피하 연결조직의 하부와 s.c. 조직과의 사이에 놓여진다. [Boven and Winograd, 상기참조]

유방암의 동물 모델은 본질적으로 드레빈 등(Drebin et al. PNAS USA 83, 9129-9133(1986))에 의해 기술된 바와 같이, 예를 들어 래트 신경암종 세포(이로부터 neu 암유전자가 처음으로 단리되었다) 또는 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드쥐에 이식시켜 생성할 수 있다.

유사하게, 결장암의 동물 모델도 결장 암세포를 동물(예. 누드쥐)에 전달시키고 이들 동물에서 종양의 발생을 가져오게 함으로써 생성할 수 있다. 누드쥐에 인간 결장암의 오르토토픽(orthotopic) 이식체 모델이 예를 들어 왕 등(Wang et al., Cancer Res. 54, 4726-4728 (1994)) 및 투 등(Too et al., Cancer Res. 55. 681-684(1995))에 의해 기술되어 있다. 이 모델은 안티캔서사(AntiCancer, Inc. San Diego, California)가 판매하는 소위 등록상표 "METAMOUSE"에 기초하고 있다.

동물에서 생성된 종양을 제거하여 실험실적으로 배양할 수 있다. 실험실적 배양물로부터 얻어진 세포를 동물에 전달시킬 수 있다. 이러한 종양은 추후의 시험 또는 드럭 스크리닝에서 표적으로 삼을 수 있다. 별법으로, 이러한 전달로부터 생성된 종양을 단리하고, 전달전 세포로부터 및 1회 이상의 전달 후 단리된 세포로부터의 RNA를 원하는 유전자의 차등적 발현에 대하여 분석할 수 있다. 이러한 전달기술은 공지의 모든 종양 또는 암세포주를 가지고 수행할 수 있다.

예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 쥐의 화학적으로 유도된 섬유육종이고(DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720[1977]), 이들은 다양한 제제의 항종양 활성 연구를 위한 매우 조절가능한 모델 시스템을 제공한다(Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023-4032[1987]). 요약하면, 종양세포를 생체외 세포 배양물에서 증식시킨다. 동물에 주사하기 전에, 세포주를 세척하고 완충액중에 약 10×10⁶내지 10×10⁷세포/ml의 세포 농도로 현탁시킨다. 이어서 세포 현탁액 100 내지 100μl로 동물을 피하적으로 감염시키고, 종양이 나타나도록 1 내지 3주 둔다.

또한, 가장 완전히 연구된 실험적 종양의 하나인, 쥐의 루이스 폐(3LL) 암종을 연구적 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델에서 효율성은 폐의 스몰 세포 암종(SCCL)으로 진단된 인간 환자 치료에서의 유익한 효과와 상호연관된다. 이 종양은 감염된 쥐로부터의 종양 단편 또는 배양액중에 유지시킨 세포를 주사할 때 정상 쥐에 도입될 수 있고(Zupi et al., Br. J. Cancer 41, suppl. 4. 309[1980]), 증거들은 하나의 세포의 주사에 의해서도 종양이 시작될 수 있고, 감염된 종양 세포의 매우 높은 비율이 생존한다는 것을 보여준다. 이 종양 모델에대한 추가적 정보를 위하여는 자카르스키(Zacharski, Haemostasis 16, 300-320[1986])참조.

종양이 이식된 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 치료전 및 후의 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전통적으로 이식된 종양의 크기는 2차원 또는 3차원에서 슬라이드 칼리퍼(caliper)로서 측정한다. 2차원에 국한된 측정은 종양의 크기를 정확하게 반영하지 못하므로, 이것은 일반적으로 수학적 공식을 이용하여 해당하는 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 후보 드럭의 치료적 효과는 치료-유도된 성장 지연 및 특이적 성장 지연으로서 더 잘 설명될 수 있다. 종양 성장을 기술하는데 있어서 또다른 중요한 변수는 종양 부피의 배가 시간이다. 종양 성장을 계산하고 기술하기 위한 컴퓨터 프로그램(예. 6회 국제 면역 결핍 동물에 대한 워크삽(Wu and Sheng eds. Basel. 1989, 301)에서 Rygaard 및 Spang-Thomsen. Proc.에서 보고한 바와 같은 프로그램)을 또한 이용할 수 있다. 그러나, 처리 후 괴사 및 부종 반응은 적어도 초기에는 실제로 종양 크기의 증가를 가져올 수 있다. 따라서, 이들 변화는 형태학적 방법 및 플로우 사이토메트릭(혈구계산적) 분석의 조합으로 주의깊은 모니터가 필요하다.

트랜스제닉 동물을 생산하는 표준적인 기술을 이용하여 재조합(트랜스제닉) 동물 모델은 관심있는 동물의 게놈내로 본문에서 동정된 유전자의 코딩 부분을 도입하여 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로서 삼을 수 있는 동물들로는 쥐, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 피그 및 인간 이외의 영장류(예. 개코원숭이, 침팬치 및 원숭이) 들이 있으나 제한적이지는 않다. 이러한 동물들에 트랜스유전자를 도입하는 당업계 공지의 기술로는 전핵 미세주입(Hoppe and Wanger, 미국특허 제4,873,191호); 생식선으로 레트로바이러스 매개된 유전자 전이(예.Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615[1985]); 배 스템세포에서 유전자 타겟팅(Thompson et al., Cell 56, 313-321[1989]); 배의 전기투과(Lo. Mol. Cell Biol. 3, 1803-1814[1983]); 정자 매개의 유전자 전이(Lavitrano et al., Cell 57, 717-73[1989]). 리뷰를 위하여 예를 들어 미국특허 제4,736,866호 참조.

본 발명의 목적을 위하여, 트랜스제닉 동물은 그 세포의 일부만이 트란스유전자를 가지는 것들(모자이크 동물)도 포함한다. 트랜스유전자는 하나의 트란스유전자로서 또는 연쇄형(head-to-head 또는 head-to-tail tandems)으로서 삽입될 수 있다. 트랜스 유전자의 특정 세포타입으로 선택적인 도입은 예를 들어 라스코 등(Lasko et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89, 623-636(1992))의 기술을 따라 가능하다.

트랜스제닉 동물에서 트랜스유전자의 발현은 표준적인 방법으로 모니터될 수 있다. 예를 들어, 서던블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 트랜스 유전자의 삽입을 확인할 수 있다. 그다음 mRAN의 발현양을 인시트 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 추가적으로 이 동물들을 종양 또는 암 발생의 징후에 대하여 검사한다.

별법으로, 본문에서 동정된 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 내부 유전자와 동물의 배세포에 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합(homologous recombination)의 결과로서 본문에서 동정된 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 결함 또는 변형이 있는 "녹아웃" 동물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 이용하여 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 제거하고 다른 유전자(삽입을 모니터하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자)로 치환할 수 있다. 일반적으로, 변형되지 않은 수 킬로베이스의 이웃하는 DNA(5' 및 3' 말단 양쪽)가 벡터내에 포함된다[동종 재조합 벡터에 관한 기재에 대하여는 예를 들어 토마스 및 카페치(Thomas and Capecchi, Cell, 51:503(1987) 참조]. 이 벡터를 배 스템 세포주에 도입시키고(예를 들어 전기투과에 의해), 도입된 DNA가 내부 DNA와 동종적으로 재조합된 세포를 선택한다[예를 들어, Li et al., Cell, 69: 915(1992)참조]. 그 다음 선택된 세포를 동물(예 쥐 또는 래트)의 낭포에 주입하여 응집 키메라를 형성하도록 한다[참조. 예를 들어, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson. ed.(IRL, Oxford, 1987), pp113-152]. 그 다음 키메라 배를 적당한 가임신 수컷 양육 동물에게 이식시키고 배가 자라서 "녹아웃" 동물을 형성하도록 한다. 그 생식 세포내에 동종적으로 재조합된 DNA를 가지는 후손들은 표준적인 방법으로 동정할 수 있고 이를 모든 세포가 동종적으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물로 기른다. 녹아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 상태에 대한 방어 능력 및 PRO533의 부존재로 인한 병리학적 상태의 발생으로 구별할 수 있다.

본문에서 동정된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 효능 및 기타 드럭 후보의 효능을 자연적으로 생성된 동물 종양의 치료에서도 시험할 수 있다. 이러한 연구에 적합한 표적은 고양이 구강 편평세포 암종(SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 매우 침투적이고, 악성인 종양으로 고양이의 가장 흔한 구강 악성종양이고, 이 종에서 보고된 구강 종양의 60%를 넘는다. 비록 낮은 전이율이 단지 이 종양을 갖는 고양이의 생존시간이 짧은 것을 반영하는 것일 수 있으나, 이것은 먼 장소로 전이하는 일이 거의 없다. 주로 고양이 구강의 해부적 구조 때문에 일반적으로 이 종양은 수술할 수 없다. 현재 이 종양을 치료하는 효과적인 치료법이 없다. 연구에 들어가기 이전에, 각 고양이를 완전하게 임상적 검사, 해부하고, 컴퓨터 단층촬영기(CT)로 스캐닝한다. 혀밑 구강 편평세포 종양으로 진단된 고양이는 연구에서 제외한다. 이러한 종양으로 인하여 혀가 마비될 수 있고 처방으로 종양을 죽이더라도 이 동물들은 스스로 먹을 수 없게될 수 있다. 각 고양이를 오랜 기간 동안 반복적으로 처리한다. 처리기간 동안 및 각 후속의 재검사때 매일 종양을 촬영할 것이다. 처리 후 각 고양이를 다시 CT 스캔한다. 그 후 매 8주 마다 CT 스캔 및 흉부 래디오그램을 평가한다. 이 데이터는 대조군 그룹과 비교하여 생존, 반응성 및 독성에서의 차이에 대하여 평가한다. 양성 반응은 종양의 감소, 바람직하게는 생활 질의 향상 및(또는) 생명 연장의 증거를 요구할 수 있다.

또한, 개, 고양이, 개코원숭이의 섬유아육종, 아데노암종, 림프종, 크론드로마, 레이오미오사르코마 등과 같은 기타 자연적 동물 종양도 또한 시험할 수 있다.이들 중에서 개 및 고양이에서의 포유동물 아데노암종은 외관 및 행태가 인간에서의 것과 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 사용은 동물에서 이 유형의 종양의 발생이 희귀하다는데 제한을 받는다.

8. 드럭 후보에 대한 스크리닝 검사

본문에서 동정된 유전자가 코딩하는 폴리펩티드에 결합하거나 그와 복합체를 형성하거나 또는 그렇지 않으면, 코딩된 폴리펩티드가 다른 세포내 단백질과 상호작용하는 것을 방해하는 화합물을 동정하도록 드럭 후보에 대한 스크리닝 방법이 설계된다. 이러한 스크리닝 검사는 화학물질 라이브러리의 높은 쓰루풋 스크리닝을 가능하게 하는 검사를 포함하여 소분자 드럭 후보를 동정하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물(펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로부린 융합체 등) 및 특히 항체(폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편들, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편들의 키메라 또는 인간화된 것들 및 인간 항체 및 항체 단편 등)를 포함한다. 이 검사는 다양한 포멧(예. 단백질-단백질 결합 검사, 생화학적 스크리닝 검사, 면역검사 및 세포 기초한 검사 등, 이들은 당업계에서 잘 밝혀져 있다)으로 수행될 수 있다.

모든 검사는 드럭 후보와 본문에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이들 두 성분들이 상호작용할 수 있기에 충분한 시간 동안 그러한 조건하에서 접촉시키는 것을 요구한다는 점에서 공통적이다.

결합 검사에서, 이 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체가 반응 혼합물에서단리 및 검출될 수 있다. 특정한 실시태양에서는, 본문에서 동정된 유전자가 코딩하는 폴리펩티드 또는 후보 드럭이 공유적 또는 비공유적 부착에 의해 고체상(예. 마이크로타이터 플레이트)에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시켜 수행한다. 별법으로, 고정되어질 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체(예. 모노클로날 항체)를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 잡아둘 수 있다. 이 검사는 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정안된 성분을 고정된 성분(예. 매달린 성분을 함유하는 코팅된 표면)에 첨가하여 수행한다. 반응이 완료될 때, 반응 안된 성분들을 제거하고(예. 세척에 의해) 고체 표면상에 부착된 복합체를 검출한다. 원래 고정 안된 성분들이 검출가능한 표지를 가질 때는, 표면에 고정된 표지의 검출이 복합체의 생성을 나타낸다. 원래 고정안된 성분들이 표지를 갖지 않을 때는, 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 이용하여 복합체 형성을 검출할 수 있다.

만일 후보 화합물이 본문에서 동정된 유전자가 코딩하는 특정 PRO533 단백질과 상호작용은 하나 결합하지는 않는다면, 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 공지의 방법으로 이 단백질과의 상호작용을 검사할 수 있다. 이러한 검사로는 교차연결, 공동-면역침강 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동 정제와 같은 전통적인 방법이 있다. 또한, 세브레이 및 나탄스[Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793(1991)]가 공개한 바와 같이, 단백질-단백질 상호작용은 필드 및 공동 연구자[Fields and Song, Nature(London)340, 245-246(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582(1991)]들이기재하는 효모계 유전적 시스템을 이용하여 모니터할 수 있다. 효모의 GAL4와 같은 많은 전사 활성자들은 물리적으로 분리된 2개의 모듈성 도메인으로 이루어진다(하나는 DNA-결합 도메인이고, 다른 하나는 전사 활성화 도메인으로 기능한다). 상기 간행물에 기재된 효모 발현시스템(일반적으로 "two-hybrid system"이라고 함)은 이 특성의 장점을 가지고, 두개 하이브리드 단백질들(하나는 표적 단백질이 GAL-4의 DNA 결합 도메인과 융합된 단백질이고, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것)을 사용한다. GAL-4 활성화된 프로모터의 제어하의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL-4 활성의 재구성에 의존적이다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니를 β-갈락토시다제에 대한 발색성 기질로 검출한다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 두 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 동정하는 완전 키트(등록상표 MATCHMAKER)가 클론테크(Clontech)로부터 상용가능하다. 이 시스템은 특정 단백질의 상호작용에 중요한 아미노산 잔기를 정확히 지적할 뿐만 아니라, 특정 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인의 맵핑까지도 가능하게 한다.

본문에서 동정된 PRO533-코딩 유전자 및 기타 세포내 또는 세포외 성분들의 상호작용을 방해하는 화합물은 하기와 같이 시험할 수 있다. 일반적으로 반응혼합물은 증폭된 유전자의 산물 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하고, 이들 두 산물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간에서 제조된다. 시험 화합물이 결합을 억제하는 능력을 시험하기 위하여 반응물을 시험 화합물의 존재 및 부재에서 시험한다. 또한, 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가하여 양성 대조군으로서 삼을 수있다. 시험 화합물과 혼합물내에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합(복합체 형성)은 상기 기술한 바와 같이 모니터한다. 대조군 반응에서 복합체가 형성되나 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그 반응 대상물 사이의 상호작용을 방해하는 것을 나타낸다.

9. 종양 치료를 위한 조성물 및 방법.

본문에서 동정된 유전자의 증폭과 관련된 종양의 치료에 유용한 조성물은 항체, 스몰 유기 분자 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 트리플 나선 분자 등과 같은 타겟 유전자 산물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

예를 들어, 안티센스 RNA 및 RNA 분자는 타겟 mRAN와 혼성화하여 mRNA의 해독을 직접 차단하는 작용을 하여 단백질의 해독을 방해한다. 안티센스 DNA가 사용될 경우, 해독 개시 부위, 예를 들어 -10 및 +10 위치의 타겟 유전자 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

리보자임은 특이적으로 RNA 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 타겟 RNA에 서열 특이적으로 혼성화하고, 이어서 엔도뉴클레오리틱 절단을 하여 기능한다. 특이적 리보자임은 공지의 기술로 동정될 수 있는 예상 RNA 타겟내 부위를 절단한다. 더욱 상세하게는 예를 들어 로시(Rossi)의 논문[Curr. Biol. 4:469-471(1994)] 및 PCT 공개 제 WO97/33551호(1997년 9월 18일 공개)를 참조.

전사를 억제하기 위하여 사용되는 트리플 나선 형성내 핵산 분자들은 단일 가닥이고 데옥시뉴클레오티드이어야 한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 후그스틴 염기 쌍 규칙(Hoogsteen base pairing rules)을 통하여 트리플 나선 형성을 촉진하도록 설계되고, 이는 일반적으로 듀플렉스의 한 가닥상에 퓨린 또는 피리미딘의 상당한 길이의 연속이 필요하다. 더욱 상세하게는 예를 들어 PCT 공개 제 WO97/33551호(상기 참조)를 참조.

이들 분자들은 본문에서 논의된 스크리닝 검사법의 임의의 것 또는 임의의 조합에 의해서 (또는) 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 방법으로 동정될 수 있다.

10. 항 PRO533 항체

본 발명은 항 PRO533 항체를 더 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날, 단일클로날, 인간화된, 2-특이적 및 이형접합 항체 등을 포함한다. 본 발명에 따른 유용한 드럭 후보는 본문에서 동정된 증폭된 유전자의 유전자 산물 또는 생산을 억제할 수 있고 (또는) 유전자 산물의 활성을 감소시킬 수 있는 항체 및 항체 단편이다.

10.1 폴리클로날 항체

항-PRO533 항체는 폴리클로날 항체를 함유할 수 있다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 숙련된 당업자에게 공지이다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 동물에게 하나 이상의 면역화제 및 원한다면 보조제를 주사하여 만들 수 있다. 전형적으로 면역화제 및(또는) 보조제는 복수의 피하 주사 또는 복강내 주사에 의해 포유동물내로 주사할 것이다. 면역화제는 PRO533 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화제를 면역시킬려고 하는 포유동물내에서 면역생성적인 것으로 알려진 단백질과 복합시키는 것이 적합할 수 있다. 이러한 면역생성적 단백질의 예로는 키홀 임페트 헤모시아닌(keyhole impet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로부린 및 대두 트립신 억제제 등이 있으나 이에 국한되지 않는다. 사용할 수 있는 보조제의 예로는 프룬드의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미클레이트) 등이 있다. 면역화 방법은 당업계의 당업자에 의해 과도한 실험 없이 선택될 수 있다.

10.2 모노클로날 항체

별법으로, 항-PRO533 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 코흘러 및 밀스테인 등(Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975))에 의해 기술된 것과 같이, 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마법에서, 쥐, 햄스터 또는 기타 적당한 숙주 동물을 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 자극하기 위하여 일반적으로 면역화제로 면역시킨다. 별법으로 림프구는 실험실적으로 면역화될 수 있다.

면역화제는 일반적으로 PRO533 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 인간 유래의 세포가 바람직하다면, 말초혈 림프구("PBLs")가 사용되고, 만일 인간 이외의 포유동물 기원이 바람직하다면, 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용될 수 있다. 이어서 림프구를 적당한 융합제(예. 폴리에틸렌 글리콜)를 이용하여 영속화된(immortalized) 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,(1986) pp59-103]. 영속화된 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설취류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로 래트 또는 쥐 골수종 세포주를 이용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않고 영속화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적당한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소를 결하고 있다면, 하이브리도마용 배양 배지는 HGPRT 결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT배지")을 일반적으로 포함할 것이다.

바람직한 영속화된 세포주는 효과적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포가 항체를 안정적으로 다량 발현시키고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 더욱 바람직한 영속화된 세포주는 쥐과 골수종 세포주이고, 이는 예를 들어 Salk Institute Cell Distribution Center(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 American Type Culture Collection(미국 메릴랜드주 락빌 소재)로부터 얻을 수 있다. 인간 골수종 및 쥐-인간 이종 골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산용으로 또한 기재되어 있다[Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp51-63]

그다음 하이브리도마 세포가 배양된 세포 배양물에서 원하는 PRO533에 대한모노클로날 항체의 존재를 검사할 수 있다. 바람직하게는 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 실험실적 결합 검사법(예. 방사능면역검사(RIA) 또는 효소 링크된 면역흡착제 검사(ELISA))에 의해 측정할 수 있다. 이러한 기술 및 검사법은 당업계에 공지이다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문손 및 폴라드(Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220(1980)의 스캐챠드 분석에 의해 측정할 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 희석 절차를 제한하여 서브클로닝하고, 표준적인 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding, 상기 참조). 이 목적용으로 적당한 배양배지로는 예를 들어, 둘베코의 개질 이글스 배지 및 RPMI-1640 배지 등이 있다. 별법으로, 포유동물에서의 복수증에서와 같이, 하이브리도마 세포는 생체내에서 성장할 수 있다.

서브클론에서 분비하는 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화적 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로부린 정제 방법에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제할 수 있다.

모노클로날 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 방법과 같은 재조합 DNA 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 통상적인 방법(예. 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용)을 이용하여, 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 즉시 단리 및 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포를 이러한 DNA의 바람직한 소스로 삼을 수 있다. 일단 단리되면, 이 DNA를 발현벡터내에 두고 이를 원숭이 COS 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종과 같은, 달리 면역글로부린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포내로 형질감염시켜, 재조합된 숙주세포내에서 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. 예를 들어, 동종의 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인(constant domain)의 코딩 서열로 치환하여[미국 특허 제4,816,678호; Morrison et al., 상기 참조] 또는 비-면역글로부린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로부린 코딩 서열에 공유적으로 연결시킴으로서 DNA를 또한 개질시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로부린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인과 치환되거나 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환하여 키메라 2가 항체를 형성할 수 있다.

항체들은 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로부린 경쇄 및 개질된 중쇄의 재조합적 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄의 크로스링킹을 방지할 수 있도록 일반적으로 Fc 부위 임의의 점에서 절단될 수 있다. 별법으로, 관련된 시스테인 잔기를 또다른 아미노산 잔기로 치환하거나 결손시켜 크로스링킹을 방지할 수 있다.

1가 항체를 제조하는데 실험실적 방법이 또한 적합하다. 항체를 소화하여 이들의 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지인 일상적인 기술을 이용하여 달성할 수 있다.

10.3 인간 및 인간화된 항체

본 발명의 항-PRO533 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더 포함할 수있다. 비인간(예. 쥐과) 항체의 인간화된 형태는 키메라 면역글로부린, 비인간 면역글로부린에서 유도된 서열을 최소한으로 함유하는 기타 면역글로부린 사슬 또는 이의 단편(예. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 항체의 항원-결합 서브서열)이다. 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 부위(CDR)로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 쥐, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로부린(수용자 항체)을 포함한다. 일부의 경우, 인간 면역글로부린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 인간화된 항체는 또한 수용자 항체나 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어디에서도 발견할 수 없는 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 전부를 함유할 수 있다(여기서, CDR 부위의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로부린의 것들에 상응하고 FR 부위의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로부린 컨센서스 서열의 것들이다). 인간화된 항체는 또한 임의로 면역글로부린 불변 부분(Fc), 전형적으로 인간 면역글로부린의 그것의 적어도 일부를 함유할 것이다[Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 322: 323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct Biol., 2: 593-596(1992)].

비인간 항체를 인간화하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 소스로부터 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비인간 아미노산 잔기들은 종종 "수입"잔기라고 부르고, 일반적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 윈터 및 공동 연구자들의 방법에 따라[Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)] 설취류 CDRs 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환하여 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체들은 키메라 항체(미국 특허 제 4,816,567호)이고, 완전한 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되어 있다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 인간 항체이고 약간의 CDR 잔기 및 아마 약간의 FR 잔기가 설취류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된다.

인간 항체는 파지 전시 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지인 다양한 기술을 이용하여도 생성될 수 있다[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581(1991)]. 콜(Cole et al.) 및 보에너(Boerner et al.)의 기술이 또한 인간 모노클로날 항체를 제조하는데 이용될 수 있다[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p 77(1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95(1991)]. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로부린 좌위를 내부 면역글로부린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물(예. 쥐)에게 도입하여 만들 수 있다. 자극시 유전자 재배열, 유사성 및 항체 목록을 포함하는 모든 관점에서 인간에게서 관찰된 것과 근접하게 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이 접근법은 예를 들어 미국특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호,제5,633,425호, 제5,661,016호 및 과학 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-13(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)]에 기재되어 있다.

10.4. 2특이적 항체(bispecific antibodies)

2특이적 항체는 모노클로날이고 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체로서 둘 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 본 경우에서, 하나의 결합 특이성은 PRO533에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

2특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지이다. 전통적으로, 2특이적 항체의 재조합적 생산은 서로 상이한 특이성을 갖는 두 중쇄를 각각 갖는 두개의 면역글로부린 중쇄/경쇄 쌍을 공동 발현시키는 것에 기초한다[Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539(1983)]. 면역글로부린 중쇄 및 경쇄의 무작위 재정렬 때문에 이들 하이브리도마(quadromas)는 10개의 상이한 잠재적인 항체 분자의 혼합물을 생성하지만, 그 중 오직 하나만이 정확한 2특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 성취된다. 유사한 절차가 국제 공개 WO93/08829호(1993년 5월 13일 공개) 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991)]에 공개되어 있다.

원하는 결합 특이성(항원-항체 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로부린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합은 바람직하게는 경첩(CH2 및 CH3) 부위를 적어도 부분적으로 포함하는 면역글로부린 중쇄 불변 도메인으로 이루어진다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 부위(CH1)을 가지는 것이 바람직하다. 면역글로부린 중쇄 융합 및 원한다면, 면역글로부린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터내에 삽입하여 적당한 숙주 유기체내로 공동-형질감염시킨다. 2특이적 항체 생산의 더욱 자세한 설명은 예를 들어, 수레쉬의 논문[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986)]을 참고한다.

10.5 이형접합 항체

이형접합 항체가 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이형접합 항체는 2개의 공유적으로 연결된 항체로 이루어진다. 이러한 항체는 예를 들어, 불필요한 세포에게로 면역 시스템 세포를 타겟하도록[미국 특허 제4,676,980호] 그리고 HIV 감염의 치료용[WO91/00360; WO92/200373; EP 03089]으로 제안되어 왔다. 이 항체는 크로스링킹제에 관한 것들을 포함하는 합성 단백질 화학에서 공지인 방법을 이용하여 실험실적으로 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 면역독성을 디설피드 교환 반응을 이용하여 또는 티오에테르 결합의 형성에 의해 구축할 수 있다. 이 목적을 위하여 적합한 시약의 예로는 이미노티오레이트 및 메틸-4-머캅토부티리미데이트 및 예를 들어 미국특허 제4,676,980호에 공개된 것들을 포함한다.

10.6 작용제 기능 조작

예를 들어 암 치료에서 항체의 효과를 향상시키도록 작용제 기능과 관련하여본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 부위에 도입하여, 이에 의해 이 부위에서의 사슬간 디설피드 결합을 형성하도록 한다. 이렇게 생성된 동종2분자체 항체는 향상된 내부화(internalization) 능력 및(또는) 향상된 보체-매개 세포 치사 및 항체-의존적 세포적 세포독성(ADCC)을 갖는다. 참고[Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195(1992) 및 Shopes. B., J. Immunol. 148:2918-2922(1992)]. 향상된 항-종양 활성을 가지는 동형2분자체 항체는 올프[Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565(1993)]에 기술된 바와 같은 헤테로2기능적 크로스링커를 이용하여도 제조할 수 있다. 별법으로, 항체가 Fc 부위를 이중으로 가지도록 조작하여 향상된 보체 용혈 및 ADCC 능력을 가지도록 할 수도 있다. 참고[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)].

10.7 면역접합체

본 발명은 또한 항체가 세포독성제(예. 화학치료제, 독성(효소적으로 활성인 박테리아, 진균류 식물 또는 동물 기원의 독성물 또는 이들의 단편), 또는 방사능 동위원소(즉, 방사능접합체))와 접합된 것을 함유하는 면역접합체에도 관계된다.

이러한 면역접합체를 제조하는데 유용한 화학치료제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독성 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독성의 비결합 활성 단편, 엑소독성A 사슬(슈도모나스 에루기노사 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파-사르신(alpha-sarcin),Aleurites fordii단백질, 디안틴 단백질,Phytolaca americana단백질(PAPI,PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스 등이 있다. 방사능접합체 항체의 생산을 위하여 다양한 방사능핵을 사용할 수 있다. 예로는²¹²Bi,¹³¹In,⁹⁰Y 및¹⁸⁶Re 이 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티오란(IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체(예. 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예. 디숙시니미딜 수버레이트), 알데히드(예, 글루타렐데히드), 비스-아지도 화합물(예. 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예. 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예. 톨릴-2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예. 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)의 사용으로 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독성은 비테타 등[Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세틱 에시드(MX-DTPA)는 항체에 방사능 뉴클레오티드를 접합시키는 예시적인 킬레이팅제이다. 참고 WO94/11026.

또다른 실시태양에서, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여시킨 후 비결합 접합체를 클리어링제를 이용하여 순환으로부터 제거하고 이어서 세포독성제(예. 방사능뉴클레오티드)와 접합된 리간드(예. 아비딘)을 투여하는 종양 프리타겟팅(pretargetting)에 사용하도록 항체를 "수용체"(예. 스트렙타비딘)에 접합시킬 수있다.

10.8. 면역리포좀

본문에 공개된 항체는 면역리포좀으로 제조될 수도 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지인 방법에 의해 제조된다(예. Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 3688(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980); 및 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호). 향상된 순환 시간을 가지는 리포좀이 미국 특허 제5,013,556호에 공개되어 있다.

특별히 유용한 리포좀은 포스포티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물과의 역상 증발화 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 공극의 필터를 통하여 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 형성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디설피드 상호교환 반응을 통하여 마틴 등[Martin et al., J. Biol. Chem. 257:268-288(1982)]에 기술된 바와 같이 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학치료제(독소루비신 등)가 임의로 리포좀 내에 함유될 수 있다. 참고[Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484(1989)].

F.제약 조성물

PRO533(FGF-19)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 개시된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 기타 입자들을 제약 조성물의 형태로 투여하여 암을 포함하는 종양을 치료할 수 있다.

증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 세포내적이고 전체 항체를 억제제로서 사용하는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션(lipofection) 또는 리포좀을 또한 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포 내로 운반할 수도 있다. 항체 단편을 사용하는 경우, 표적 단백질의 결합 부위에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 다양한 지역의 서열에 기초하여, 표적 단백질의 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적 합성 및(또는) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 마라스코(Marasco) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993)] 참조).

요망하는 정도의 순도를 가지는 폴리펩티드를 당업계에서 전형적으로 사용되는 임의적인 "제약상 허용 가능한" 또는 "생리학상 허용 가능한" 담체, 부형제 또는 안정화제 (이 모두를 "부형제"라 칭함)와 함께 혼합하여, 폴리펩티드 또는 항체의 치료상 제제를 동결건조 제제 또는 수용액으로서 저장용으로 제조한다. 예를 들어, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장제, 비이온성 세제, 항산화제 및 기타 잡다한 첨가제들 (문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16(또는 그 이후)판, A.Osol. Ed. (1980)] 참조)을 첨가할 수 있다. 이러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 투여자에게 비독성이어야 한다.

완충제는 생리학적 조건에 근접하는 범위에서 pH를 유지하도록 돕는다. 완충제는 바람직하게는 약 2mM 내지 약 50mM 범위의 농도에서 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 완충제로는 유기산 및 무기산, 그리고 그 염 모두를 포함한다. 예를 들어, 시트레이트 완충제(예. 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충제(예. 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예. 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제(예. 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예. 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-포타슘 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예. 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제(예. 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예. 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)가 해당된다. 추가적으로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리스(Tris)와 같은 트리메틸아민 염을 사용할 수 있다.

보존제는 미생물의 성장을 지연시키기 위해 첨가하며,0.2% 내지 1% (w/v) 범위의 양으로 첨가한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 보존제로는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 벤즈알코늄 할로겐화물(예. 염화물, 브롬화물, 요오드화물), 헥사메토늄 염화물, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.

종종 "안정화제"로서 알려진 등장제는 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위하여 존재하며 다가 당 알코올(polyhydric sugar alcohols), 바람직하게는 글리세린, 에리스리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 3가 이상의 당 알코올을 포함한다. 다가 알코올은 기타 성분의 상대적인 양을 고려하여 0.1 내지 25 중량% 사이, 바람직하게는 1 내지 5 중량% 사이의 양으로 존재할 수 있다.

안정화제는 기능 면에서 벌크화제로부터 치료 제제를 용해시키거나 변성 또는 용기 벽에의 부착을 방지하는 것을 돕는 첨가제에 이르기까지의 광범위한 영역의 부형제를 일컫는다. 전형적인 안정화제는 (상기 열거한) 다가 당 알코올; 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 스레오닌 등과 같은 아미노산; 이노시톨과 같은 시클리톨을 포함하여 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등과 같은 유기 당 또는 당 알코올; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, a-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 술페이트와 같은 황 함유 환원제; 저분자량 폴리펩티드(즉, 10 잔기 미만); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로부린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈 일탄당(예. 크실로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스), 이탄당(예. 락토스, 말토스, 수크로스), 삼탄당(예. 라피노스), 다탄당(예. 덱스트란)과 같은 친수성 중합체일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 중량부 당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.

비이온성 계면활성제 또는 세제("침윤제"로도 알려진)가 존재하면 치료 제제를 용해시키는 것을 돕고 또한 교반에 의한 응집에 대해 치료상 단백질을 보호하며, 이는 단백질의 변성을 야기하지 않고 압력받는 전단면에 제제를 노출시킨다. 적합한 비이온성 계면환성제로는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 등록상표 플루로닉(Pluronic) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween-20, Tween-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05mg/ml 내지 약 1.0mg/ml, 바람직하게는 약 0.07mg/ml 내지 약 0.2mg/ml의 범위에서 존재한다.

추가적인 잡다한 부형제로는 벌크화제(예. 녹말), 킬레이트화제(예. EDTA), 항산화제(예. 아스코르브산, 메치오닌, 비타민 E) 및 공동용매(cosolvent)를 포함한다.

여기서 제제는 치료되는 특정 대상을 위해 필요한 경우 둘 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 보완적인 활성을 지니는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 혼합하여 적합하게 존재한다.

유효 성분은 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예. 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합법에 의해 각각 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐과 같은 마이크로캡슐 내에 감싸 제조할 수도 있다. 이러한 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th(또는 그 이후) edition, A.Osal.Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

생체 내 투여에 사용할 제제는 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 쉽게 실행할 수 있다.

서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 항체 돌연변이를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 필름과 같은 성형품 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔(예. 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미합중국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 (예. LUPRON DEPOT(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어)) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자를 방출하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 장시간 잔류하면, 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성 또는 응집됨으로써, 생물학적 활성을 상실하고 면역원성에 가능한 변화를 일으킬 수 있다. 관여된 메카니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 수단을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-술파이드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성이라는 것이 밝혀지면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적합한 첨가제의 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 검정법에 의해 확인된 비-항체 화합물을 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 유사한 방법으로 제제화할 수 있다.

G.치료 방법

본 발명의 항체 및 기타 항-종양 화합물을 사용하여 PRO533을 코딩하는 유전자의 과도발현 및(또는) 활성화를 특징으로 하는 것을 포함하는 다양한 증상을 치료할 수 있음이 예상된다. 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 안티센스 분자 등을 비제한적으로 포함하여 이러한 항체 및 기타 화합물로 치료되는 증상 또는 질환의 예로는 양성 또는 악성 종양(예. 신장(renal)암, 간(liver)암, 신장(kidney)암, 방광암, 유방암, 위암, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 외음암, 갑상선암, 간(hepatic)암; 육종; 신경교아세포종; 및 다양한 머리 및 목 종양); 백혈병 및 임파 악성종양; 뉴론성, 신경교, 성상교세포, 시상하부 및 기타 선, 대식구, 상피, 지질 및 할강 질환과 같은 기타 질환; 및 염증성, 맥관 형성 및 면역학적 질환을 포함한다.

예를 들어 항체와 같은 본 발명의 항종양제는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 포막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로로 일정 시간동안 연속적인 주입에 의해 또는 볼루스로서 정맥 내 투여와 같은 공지 방법에 따라 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여한다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

기타 치료 요법을 본 발명의 항체와 같은 항암제의 투여와 병용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료할 환자는 또한 방사성 치료도 받을 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 화학치료제를 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 화학치료제에 대한 조제 및 용량 계획은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련가의 경험적인 결정에 따라 사용할 수 있다. 그러한 화학치료에 대한 조제 및 용량 계획은 또한 문헌[Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다. 화학치료제는 항체와 같은 항종양제보다 먼저 또는 후에 투여할 수도 있고 또는 동시에 투여할 수도 있다. 항체는 탐옥시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항프로게스테론 화합물과 함께 이러한 분자에 대해 공지된 용량으로 혼합할 수 있다 (EP 616812 참조).

ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 맥관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체와 같은, 기타 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것도 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 본 명세서에 개시된 동일하거나 또는 둘 이상의 상이한 항원에 결합하는 둘 이상의 항체를 환자에게 동시에 투여할 수 있다. 때때로, 하나 이상의 시토킨을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서의 항체를 성장 억제제와 함께 공동 투여한다. 예를 들어, 성장 억제제를 먼저 투여하고, 이어 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려된다. 성장 억제제에 대한 적합한 용량은 현재 사용되는 양이며 성장 억제제와 본 명세서의 항체의 혼합 작용(상승효과)에 의해 낮아질 수 있다.

질병의 예방 또는 치료를 위한 본 명세서의 항체와 같은 항종양제의 적절한 용량은 상기 정의한 바와 같은 치료될 질병의 종류, 질병의 심각성 및 경과, 약제가 예방 목적으로 투여되느냐 치료상 목적으로 투여되느냐, 이전 치료, 환자의 병력 및 약제에 대한 반응 및 담당 의사의 판단에 따라 좌우될 것이다. 약제는 1회에 또는 일련의 치료 동안 적합하게 투여된다.

특정 질환 또는 증상의 치료에 유효할 치료용 폴리펩티드, 항체 또는 그 단편의 양은 질환 또는 증상의 성질에 따라 좌우될 것이며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 가능하다면, 인간에게 시험하기에 앞서 본 발명의 제약 조성물의 용량-응답 곡선을 먼저 생체 외에서, 그 후 유용한 동물 모델 시스템에서 측정하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업계의 상식에 기초하여, 감각 뉴론의 생존을 증진시키는 데 효과적인 제약 조성물은 약 5 및 20 ng/ml 사이, 바람직하게는 약 10 및 20 ng/ml 사이의 국소 치료제 농도를 제공할 수 있다.

피하 투여용 용량 계획은 질병의 종류, 질병의 심각도 및 치료제에 대한 치료대상의 민감성을 포함하는 몇 가지 임상 요인에 따라, 한 달에 한 번 내지 매일에 이르기까지 다양할 수 있다.

예를 들어, 질병의 유형 및 심각도에 따라 약 500ng/kg 내지 100mg/kg (즉 0.0005-100mg/kg)의 항체가 예를 들어 하나 이상의 별도 투여 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량이다. 전형적인 일일용량은 상기 언급한 요소에 따라 약 1㎍/kg 내지 20mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그이상에 걸친 반복 투여의 경우에는 증상에 따라 질병의 증후가 요망되는 정도로 억제될 때까지 치료를 계속한다. 그러나, 다른 용량법도 유용할 수 있다. 통상적인 기술 및 검정법에 의해 치료의 진행을 쉽게 모니터할 수 있다.

당업자라면 이해할 수 있듯이, 본 발명의 제약 조성물의 적당한 용량 및 바람직한 약물 농도는 의도되는 특정 용도에 따라 다양할 수 있다. 적합한 용량 또는 투여 경로는 당업자의 지식 범위 내에서 결정할 수 있다. 동물 실험은 인간 치료에 대한 효과적인 용량을 결정하는 데 있어 신뢰할만한 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 스케일링은 모르덴티.제이.(Mordenti,J.) 및 채플,더블유.(Chappell,W.)의 문헌["The use of interspecies scaling in toxicokinetics",Toxicokinetics and Mew Drug Development,Yacobi 등, Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-96]에 기재된 원칙에 따라 수행할 수 있다.

H.제품

본 발명의 다른 실시태양에서는, 상기 기술한 질환의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 이 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들 수 있다. 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 유효한 조성물이 담겨 있으며 또한 용기는 멸균 접근 포트를 구비할 수 있다(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 유효 물질은 대개 본 명세서에서 확인된 유전자 생성물의 활성과 간섭할 수 있는 항종양제(예. 항체)이다. 용기상의 또는 이와 연관된 라벨은, 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용됨을 나타낸다. 제품은 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용 가능한 완충액을 포함하는 2차 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한 제품은, 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용을 위한 지시문이 기재된 포장 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 기타 물질도 추가로 포함할 수 있다.

I.종양의 진단 및 예후

특정 종양 중에서 과발현된 성장 수용체와 같은 세포 표면 단백질이 약물 후보 또는 종양(예. 암) 치료의 훌륭한 표적이 되는 반면, 종양 세포 중에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 하는 동일한 단백질은 종양의 진단 및 예후에 있어 추가적인 용도를 발견한다. 예를 들어, 종양 세포에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대항하는 항체를 종양의 진단 또는 예후로서 사용할 수 있다.

예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체를 증폭 유전자("마커 유전자 생성물")에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 정성적 또는 정량적으로 검출하는 데 사용할 수 있다. 항체는 바람직하게는 검출 가능한(예. 형광) 라벨을 구비하고 있으며 결합은 광학현미경검사법, 흘림세포계측법, 형광계측법 또는 기타 당업계에 공지된 기술에 의해 모니터할 수 있다. 이들 기술은 증폭된 유전자가 세포 표면 단백질(예. 성장 인자)을 코딩하는 경우 특히 적합하다. 이러한 결합 검정은 상기 5에서 기술된 대로 실질적으로 수행된다.

마커 유전자 생성물에 대한 항체의 결합의 즉석(in situ) 검출은 예를 들어면역형광법 또는 면역전자현미경법에 의해 수행할 수 있다. 이 목적상, 환자로부터 조직학적 표본을 채취하고 바람직하게는 생물학적 표본 상에 항체를 덧씌우는 방법에 의해, 표지한 항체를 표본에 가한다. 이 과정에 의해 또한 검사 조직 내의 마커 유전자 생성물의 분포도 결정할 수 있다. 즉석 검출을 위해 광범위한 조직학적 방법을 용이하게 사용할 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.

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하기 실시예는 예시의 목적상 제공되는 것일 뿐이며 어떠한 식으로도 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에 인용된 모든 환자 및 참조문헌은 그 전체로서 참조로서 포함된 것이다.

실시예

실시예 중에 언급된 상업적으로 구입 가능한 시약들은 달리 나타내지 않은 한 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예 및 명세서를 통해 ATCC 수탁 번호로 확인되는 세포들의 원(source)은 버지니아주 마나싸스의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)이다.

실시예 1

인간 PRO533을 코딩하는 cDNA 클론의 단리

EST 서열 수탁 번호 AF007268, 쥐 섬유아세포 성장 인자(FGF-15)를 사용하여 다양한 공중 EST 데이타베이스(예. GenBank, Dayhoff 등)를 연구하였다. 연구는,EST 서열의 6 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2[Altschul 등, Methods in Enzymology,266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html]를 사용하여 수행하였다. 연구 결과 GenBank EST AA220994를 발견하였으며, 이는 스트래티진(strategene) NT2 뉴론성 전구체 937230으로서 확인되어왔다. AA220994(DNA47412)를 도 6에서 확인하였다.

이 서열에 기초하여, 올리고뉴클레오티드를 합성하여: 1) PCR에 의해 관심 있는 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 확인하고, 2) 프로브로 사용하기 위해 완전한 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하였다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머(각각 *.f 및 *.r로서 표시)는 20 내지 30 뉴클레오티드(전형적으로 약 24) 범위일 수 있으며, 100-1000 bp 길이의 PCR 생성물을 생산하도록 고안한다. 프로브 서열(*.p로 표시)은 전형적으로 40-55 bp(전형적으로 약 50) 길이이다. 완전한 길이의 클론의 원을 위해 몇몇 라이브러리를 스크린하기 위해, 라이브러리로부터의 DNA를, PCR 프라이머쌍을 가지고 오서벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology]에 따라 PCR 증폭에 의해 스크린하였다. 이어 양성 라이브러리를 사용하여, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하나의 PCR 프라이머를 사용하는 생체 내 클로닝 방법에 의해 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.

완전한 길이의 클론의 원을 위해 몇몇 라이브러리를 스크린하기 위해, 라이브러리로부터의 DNA를 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 스크린하였다. 이어 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하나의 PCR 프라이머를 이용하여 PRO533 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.

cDNA 라이브러리를 구축하기 위한 RNA를 인간 태아 망막으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용한 cDNA 라이브러리를 상업적으로 구입 가능한 시약(예. 캘리포니아주 산 디에고 소재 인비트로겐(Invitrogen); 클론테크(Clontech) 등)을 사용하여 표준 방법에 의해 구축하였다. cDNA를 NotI 자리를 함유하는 올리고 dT로 프라임하고, SalI 반키나제 어댑터(hemikinased adaptor)에 평활(blunt)로 연결하고 NotI으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적합한 크기를 선택하고, 고유 XhoI 및 NotI 자리에서 적합한 클로닝 벡터(예. pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 자리를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임; 홀름스(Holmes) 등의 문헌[Sciences, 253:1278-1280 (1991)] 참조) 중으로 지정된 배향으로 클로닝하였다.

cDNA 클론을 전체 시퀀싱하였다. PRO533의 완전한 길이의 뉴클레오티드 서열을 도 1(SEQ ID NO: 1)에 나타내었다. 클론 DNA49435는 뉴클레오티드 위치 459-461에 명백한 번역 개시 자리를 가지는 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다(도 2; SEQ ID NO: 2). 예견된 폴리펩티드 전구체는 216 아미노산 길이이다. 클론 DNA49435-1219를 ATCC에 기탁하였으며, ATCC 기탁 번호 209480호를 배정받았다.

섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factors) 1-4(즉, 각각 아미노산 1-404, 1-408, 1-403 및 1-412)의 세포외 도메인을, 태아 폐 cDNA로부터 Pfu 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 PCR에 의해 단리하였으며(제조자의 지시에 따라), pRK5의 유도체인 진핵생물 발현 벡터 pRK5tkNEO 에서 인간 IgG1의 Fc 지역과 함께 프레임에서 서브클로닝하였다.

완전한 길이의 서열의 BLAST-2 및 FastA 서열 정렬 분석에 근거하여, PRO533은 쥐 섬유아세포 성장 인자-15에 대한 아미노산 서열 일치성을 나타낸다(53%).

상기 과정에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

FGF15.f: ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA (SEQ ID NO: 16)

FGF15.p2: AGACCGGGAGGCGGTGCTTCTCGGATCGGTACACATTGTA (SEQ ID NO: 17)

FGF15.r: CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA (SEQ ID NO: 18)

실시예 2

노던 블롯 분석

인간 조직에서의 PRO533 mRNA의 발현을 노던 블롯 분석으로 검사하였다. 제조자(클론테크)의 지시에 따라 다중 조직 인간 RNA 블롯을 무작위 프라임한 DNA49435 cDNA의³²P-표지 DNA 프로브에 혼성화하였다. 인간 태아 RNA 블롯 MTN(클론테크) 및 인간 성인 RNA 블롯 MTN-II(클론테크)를 DNA 프로브와 함께 배양하였다. 블롯을 42℃에서 60시간 동안 혼성화 완충액(5X SSPE: 2X 덴하르트(Denhardt) 용액: 100mg/mL 변성 전단 연어 정자 DNA; 50% 포름아미드: 2% SDS) 중에서 프로브와 함께 배양하였다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 2X SSC;0.05% SDS 중에서 수 회 세척한 후 50℃에서 0.1X SSC; 0.1% SDS 중에서 30분간 세척하였다. 블롯을 72시간 동안 X-omat(Kodak)에 노출시킨 후 전개하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, PRO533 mRNA 전사물(transcript)을 검출하였다. 결장직장 선암 SW480에서 강한 발현이 나타났다.

실시예 3

인시투 혼성화( in situ Hybridization)

인시투 혼성화는 세포 또는 조직 제제 내에서 핵산 서열의 검출 및 국지화에 있어 강력하고 유용한 기술이다. 이는 예를 들어 유전자 발현 부위를 확인하고, 전사의 조직 분포를 분석하고 바이러스 감염을 확인 및 국지화하고 특정 mRNA 합성에서 변화를 따르고 염색체 맵핑을 돕는 데 있어 유용할 수 있다.

인시투 혼성화는, PRO533 코딩 DNA를 함유하는 플라스미드 벡터로부터의 PCR-생성³³P-표지 리보프로브를 사용하여, 루(Lu) 및 질레트(Gillett)의 문헌[Cell Vision1: 169-176 (1994)]의 프로토콜의 최적 버젼에 따라 수행되었다. 간단히 말하면, 포르말린으로 고정하여 파라핀에 묻은 인간 조직을 절단하고 파라핀을 제거하고 37℃에서 15분간 단백질 분해효소 K(20g/ml)로 단백질을 제거하고 루 및 질레트의 상기 문헌에 의해 기술된 대로 인시투 혼성화를 위해 추가로 처리하였다. [³³-P]-UTP-표지 안티센스 리보프로브를 PCR 생성물로부터 생성하고 55℃에서 일야 혼성화하였다. 슬라이드를 코닥 NTB2 핵 트랙 유화액에 담그고 4주간 노출하였다.

³³ P-리보프로브 합성

6.0㎕(125mCi)의³³P-UTP(아머샴 BF 1002. SA<2000 Ci/mmol)를 고속 진공기로 건조시켰다. 건조된³³P-UTP를 함유하는 각 튜브에 하기 성분들을 첨가하였다:

2.0㎕ 5x 전사 완충액

1.0㎕ DTT (100mM)

2.0㎕ NTP믹스 (2.5mM: 10㎕; 각각 10mM의 GTP, CTP & ATP + 10㎕ H₂O)

1.0㎕ UTP (50μM)

1.0㎕ Rnasin

1.0㎕ DNA 템플리트 (1μg)

1.0㎕ H₂O

1.0㎕ RNA 폴리머라제 (PCR 생성물에 대해 보통 T3=AS, T7=S)

튜브를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1.0㎕ RQ1 DNA 분해효소를 첨가하고 이어 37℃에서 15분간 배양하였다. 90㎕ TE(10mM Tris pH 7.6/1mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고 혼합물을 DE81 종이 상으로 피펫팅하였다. 잔류 용액을 마이크로콘(Microcon)-50 초여과(ultrafiltration) 유닛에 로딩하고 프로그램 10을 사용하여 회전시켰다(6분). 여과 유닛을 제2 튜브 상으로 뒤집고 프로그램 2를 사용하여 회전시켰다(3분). 최종 회수 회전 후, 100㎕ TE를 첨가하였다. 1㎕의 최종 생성물을 DE81 종이 상에 피펫팅하고 6ml의 바이오플루오르(Biofluor) II 중에서 계수하였다.

프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 러닝시켰다. 1-3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk III를 3㎕의 로딩 완충액에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록 상에서 3분간 가열한 후, 겔을 즉시 얼음 상에 두었다. 겔의 웰을 세척하고 샘플을 로딩하고 180-250 볼트로 45분간 러닝시켰다. 겔을 사란(saran) 랩으로 싸고 한 시간 내지 일야동안 -70℃ 냉동기 중에서 강화 스크린으로 XAR 필름에 노출시켰다.

³³ P-혼성화

냉동 부위 전처리.슬라이드를 냉동기로부터 꺼내고 알루미늄 트레이에 두고 실온에서 5분간 해동시켰다. 트레이를 55℃ 인큐베이터에 5분간 두어 응축을 감소시켰다. 슬라이드를 연기 후드 내에서 얼음 상에서 4% 파라포름알데히드 중에서 10분간 고정시키고 실온에서 5분간 0.5 x SSC 중에 세척하였다(25ml 20x SSC + 975ml SQ H₂O). 37℃에서 10분간 0.5μg/ml의 단백질분해효소 K로 단백질을 제거한 후(250ml의 예비가온된 RNA 분해효소가 없는 RNA 분해효소 완충액 중의 12.5㎕의 10mg/ml 원액), 부분을 실온에서 10분간 0.5 x SSC 중에서 세척하였다. 부분을 각각 2분간 70%, 95%, 100% 에탄올 중에서 탈수시켰다.

파라핀에 묻힌 부분의 전처리. 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 슬라이드를 SQ H2O에 두고 각각 5분간씩 실온에서 2 x SSC 중에서 2회 헹구었다. 20μg/ml 단백질분해효소 K(250ml의 RNA 분해효소가 없는 RNA 분해효소 완충액 중 500㎕의 10mg/ml: 37℃, 15분)-인간 태아, 또는 8 x 단백질분해효소 K(250ml RNA 분해효소 완충액 중 100㎕; 37℃, 30분)-포르말린 조직 중에서 이 부분으로부터 단백질을 제거하였다. 이어 전술한 바와 같이 0.5 x SSC 중에서 헹구고 탈수하였다.

예비혼성화:슬라이드를 박스(Box) 완충액(4 x SSC, 50% 포름아미드)-포화 여과지로 안을 댄 플라스틱 상자에 깔았다. 조직을 50㎕의 혼성화 완충액(3.75g 덱스트란 술페이트 + 6ml SQ H₂O)으로 덮고 와류시키고 뚜껑을 느슨히 하여 마이크로웨이브에서 2분간 가열하였다. 얼음 상에서 냉각시킨 후, 18.75ml 포름아미드, 3.75ml 20 x SSC 및 9ml SQ H₂O를 첨가하고, 조직을 잘 와류시키고 42℃에서 1-4시간 동안 배양하였다.

혼성화:슬라이드 당 1.0 x 10⁶cpm 프로브 및 1.0㎕ tRNA(50mg/ml 원액)을 95℃에서 3분간 가열하였다. 슬라이드를 얼음 상에서 냉각하고 슬라이드당 48㎕ 혼성화 완충액을 첨가하였다. 와류 후, 50㎕³³P 믹스를 슬라이드 상의 50㎕ 예비혼성화에 첨가하였다. 슬라이드를 55℃에서 일야 배양하였다.

세척:세척을 실온에서 2 x SSC, EDTA로 2 x 10분간 행한 후(400ml 20 x SSC + 16ml 0.25M EDTA, V_f=4L), 37℃에서 30분간 RNA 분해효소 A 처리하였다(250ml RNA 분해효소 완충액 중 500㎕의 10mg/ml = 20μg/ml). 슬라이드를 실온에서 2 x SSC, EDTA로 2x10분간 세척하였다. 엄격도 세척 조건은 다음과 같았다: 55℃에서 2시간, 0.1 x SSC, EDTA (20ml 20 x SSC + 16ml EDTA, V_f=4L).

DNA49435(FGF 동족체, FGF 수용체 3 리간드)

올리고 A-251G 46머: GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA TCC TGG CCG GCC TCG G (SEQ ID NO: 19)

올리고 A-251H 48머: CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCC CGG GCA TGG TCT CAG TTA (SEQ ID NO: 20)

태아 뇌의 피질 뉴론에서 중간 정도의 발현이 관찰되었다. 태아 망막의 내부면, 및 아마도 현상 수정체(developing lens)에서 발현이 관찰되었다. 태아 피부, 연골, 소장, 태반 융모 및 제대 상에서 발현이 나타났다. 성인 조직에서, 극도로 높은 수준의 발현이 담낭 상피에서 나타났다(도 34 참조). 성인 신장, 위 및 결장 상피 상에서 중간 정도의 발현이 나타났다. 이들 데이타는 연골 및 뼈 성장에서의 이 분자의 잠재적인 역할과 일치한다.

실시예 4

PRO533 및 섬유아세포 성장 인자 수용체의 웨스턴 분석

관심 있는 단백질을 실온에서 1시간 동안 결합 완충액(DMEM 매질, 10mM Hepes, pH 7.4, 0.1% 알부민, 200ng/ml 헤파린) 중에서 상호작용시켰다. 단백질 A 세파로스(파마시아)를 첨가하고(0.01ml) 결합을 30분간 지속시켰다. 단백질 A 세파로스 비드를 모으고 결합 완충액 중에서 2회 세척하였다. 이어 환원 조건 하에서 SDS PAGE에 의해 시료를 분석하였다. 제조자 지시에 따라 항-His 항체(Quiagen), 항-gD 항체 5B6 또는 항-산성 FGF(R&D 시스템)로 웨스턴 블롯 분석을 행하고 ECL(아머샴)으로 규명하였다.

도 9는 FGF 수용체 4에 대한 PRO533의 결합을 나타내는 웨스턴 블롯이다. N-말단 gD 에피토프 태그(B) 또는 C-말단 His8 에피토프 태그(C)로 발현된 FGF1(A) 또는 PRO533(FGF-19)를 수용체-Fc 융합 단백질에의 결합에 대해 시험하였다. 특이적 결합 성분은 상부 1-8열에서 나타난 바와 같다. 9열은 비교를 위해 겔에 직접 로딩한 FGF를 함유한다. 비교를 위해 분자량 마커를 겔의 좌측에 나타내었다.

도 10은 헤파린에 대한 PRO533(FGF-19) 결합의 의존성을 나타내는 웨스턴 블롯이다. N-말단 gD-태그 PRO533(FGF-19)를 지시한 농도의 헤파린의 존재 하에 FGFR4-Fc와 상호작용하게 하였다.

실시예 5

유전자 증폭

이 실시예는 PRO533-코딩 유전자가 특정 인간의 폐, 암의 게놈에서 증폭됨을 보인다. 증폭은 유전자 생성물의 과발현과 연관되며, 이는 PRO533 단백질이 폐암 및 기타 암과 같은 특정 암에서 치료상 간섭에 대한 유용한 표적물임을 나타낸다. 치료제는 예를 들어 PRO533 폴리펩티드에 대한 쥐-인간 키메라, 인간화 또는 인간 항체와 같은 PRO533-코딩 유전자의 길항제의 형태를 취할 수 있다.

스크린을 위한 출발 물질은 다양한 암으로부터 단리된 게놈 DNA이었다. DNA는 예를 들어 형광측정법으로 정확히 정량화된다. 음성 대조군으로서, 건강한 개인에서의 유전자 카피에 대한 검정 대조군으로서 풀(pool)하여 사용한 10명의 정상적이고 건강한 개인의 세포로부터 DNA를 단리하였다 (나타내지 않음). 5' 뉴클레아제 검정(예. TaqMan™) 및 실시간 정량적 PCR (예. ABI Prizm 7700 Sequence Detection System™ (캘리포니아주 포스터 시티 소재, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division.))을 사용하여 특정 암에서 잠재적으로 증폭되는 유전자를 찾아내었다. 그 결과를 사용하여 DNA 코딩 PRO533이 스크린한 1차 폐 또는 결장 암 또는 암 세포주 또는 유방암 세포주 중 임의의 것에서 과표현되는지 여부를 결정하였다. 표 1에 나타난 유형 및 단계의 종양을 가지는 개인으로부터 1차 폐암을 얻었다. 표 1에 열거된 1차 종양 및 실시예에 걸쳐 언급된 1차 종양 및 세포주의 지명에 사용한 약자를 앞서 설명하였다.

타크만(Taqman™)의 결과를 델타() CT 단위로 보고하였다. 1 단위는 1 PCR 사이클 또는 정상과 비교하여 약 2배의 증폭에 해당하며, 2 단위는 4배, 3 단위는 8배에 해당하는 등이다. 프라이머를 사용하여 정량화하였으며, 고유한 핵산 서열을 가장 함유할 듯하며 가장 인트론을 스플라이싱-아웃하지 않았을 듯한 PRO533으로부터 유도화된 타크만(Teqman™) 형광 프로브가 프로브 및 프로브 유도화를 위해 바람직하다(예. 3-비번역 지역). PRO533 유전자 증폭에 사용한 프라이머 및 프로브의 서열(정방향, 역방향 및 프로브)은 하기와 같았다:

DNA49435.tm.f

5'GGGACGTGCTTCTACAAGAACAG-3' (SEQ ID NO: 21)

DNA49435.tm.r

5'-CAGGCTTACAATGTTATGATCAGACA-3' (SEQ ID NO: 22)

DNA49435.tm.p

5'-TATTCAGAGTTTTCCATTGGCAGTGCCAGTT-3' (SEQ ID NO: 23)

5' 뉴클리아제 검정 반응은, 실시간으로 증폭을 모니터하기 위해 Taq DNA 폴리머라제 효소의 5' 엑소뉴클리아제 활성을 이용하는 형광 PCR을 기초로 하는 기술이다. 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘(amplicon)을 생성한다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브를 고안하여 2 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출한다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 연장 가능하지 않으며 리포터 형광 안료 및 급냉 형광 안료로 표지된다. 리포터 안료로부터의 임의의 레이져-유도 방사는, 두 안료가 프로브 상에 존재하여 둘이 함께 가까이 위치할 때 급냉 안료에 의해 급냉된다. 증폭 반응 동안, TAQ DNA 폴리머라제 효소는 템플리트-의존 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 중에서 해리되고 방출된 리포터 안료로부터의 신호는 제2 형광단의 급냉 효과가 없다. 합성되는 각 신규 분자에 대해 1 분자의 리포터 안료를 방출하고, 비급냉 리포터 안료의 검출은 데이타의 정량적 해석의 근거를 제공한다.

5'뉴클레아제 과정을 ABI 프리즘 7700TM 서열 검출(ABI Prism 7700TM Sequence Detection)과 같은 실시간 정량 PCR 장치 상에서 실행한다. 시스템은 열순환기(thermocycler), 레이져, 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 시스템은 열순환기 상에서 96-웰 포맷 중 샘플을 증폭시킨다. 증폭 동안, 모든 96 웰에 대해 섬유 광학 케이블을 통해 레이져-유도 형광 신호를 실시간으로 모으고 CCD에서 검출한다. 시스템은 기구를 작동시키고 데이타를 분석하는 소프트웨어를 포함한다.

5'뉴클레아제 분석 데이타는 초기에는 Ct. 또는 발단 사이클로서 표현된다. 이는 리포터 신호가 형광의 배경 수준 이상으로 축적되는 사이클로서 정의된다.Ct 값을, 암 DNA 결과를 정상 인간 DNA 결과에 비교할 때 핵산 샘플 중에서의 특정 대상 서열의 출발 카피의 상대적인 수의 정량적인 척도로서 사용한다.

표 1은 본 발명의 PRO533 화합물을 스크린하는 데 사용된 다양한 1차 종양의 단계, T 단계 및 N 단계를 기술한다.

1차 폐 및 결장 종양 프로필

1차 종양	단계	T 단계	N 단계
인간 폐 종양 SqCCA (SRCC724) [LT1]	IB	T1	N1
인간 폐 종양 NSCCa (SRCC725) [LT1a]	IA	T3	N0
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC726) [LT2]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC727) [LT3]	IB	T1	N2
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC728) [LT4]	IIB	T2	N0
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC729) [LT6]	IV	T1	N0
인간 폐 종양 Adeno/SqCCa (SRCC730) [LT7]	IB	T1	N0
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC731) [LT9]	IIB	T2	N0
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC732) [LT10]	IA	T2	N1
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC733) [LT11]	IB	T1	N1
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC734) [LT12]	IIA	T2	N0
인간 폐 종양 BAC (SRCC735) [LT13]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC736) [LT15]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC737) [LT16]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC738) [LT17]	IIB	T2	N1
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC739) [LT18]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 SqCCa (SRCC740) [LT19]	IB	T2	N0
인간 폐 종양 LCCa (SRCC741) [LT21]	IIB	T3	N1

DNA 제조:

배양 세포주, 1차 종양, 정상 인간 혈액으로부터 DNA를 제조하였다. 제조자의 지시 및 하기 기술에 따라 정제 키트, 완충액 세트 및 프로테아제(모두 Quinagen)를 사용하여 단리를 수행하였다.

세포 배양물 용해:

세포를 세척하고 팁 당 7.5 x 10⁸의 농도에서 트립신처리하고 4℃에서 5분간 1000rpm에서 원심분리하여 펠릿화한 후 1/2 부피의 PBS 재원심분리로 다시 세척하였다. 펠릿을 3회 세척하고 현탁 세포를 모아 PBS로 2x 세척하였다. 이어 세포를 10mL PBS로 현탁하였다. 완충액 C1을 4℃에서 평형시켰다. 퀴아겐(Quiagen) 프로테아제=19155를 6.25ml 저온 ddH₂O 중으로 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 하였으며 4℃에서 평형시켰다. 퀴아겐 RNA 분해효소 A 원액 (100mg/ml)을 200μg/ml의 최종 농도까지 희석함으로써 10mL의 G2 완충액을 제조하였다.

이어 완충액 C1(10mL, 4℃) 및 ddH2O(40mL, 4℃)를 10mL의 세포 현탁액에 첨가하고 뒤집어 혼합하고 얼음 상에서 10분간 배양하였다. 베크만 스윙 버켓 로터에서 2500rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 세포 핵을 펠릿화하였다. 상청액을 버리고 핵을 와류시키며 2mL 완충액 C1(4℃에서) 및 6mL ddH₂O에 현탁하였으며, 이어 2500rpm에서 15분간 4℃에서 2차 원심분리하였다. 이어 팁당 200㎕를 사용하여 핵을 잔류 완충액 중으로 재현탁하였다. 부드럽게 와류시키며 G2 완충액(10ml)를 현탁 핵에 첨가하였다. 완충액 첨가가 완료된 후, 30초간 격렬하게 와류시켰다. 퀴아겐 프로테아제(200㎕, 상기와 같이 제조)를 첨가하고 50℃에서 60분간 배양하였다. 용혈액(lysate)이 투명해질 때까지 배양 및 원심분리를 반복하였다(예. 추가로 30-60분간 배양, 3000xg에서 10분간 4℃에서 펠릿화).

고체 인간 종양 샘플 제조 및 용해:

종양 샘플을 칭량하고 50ml 원추형 튜브에 넣어 얼음에 두었다. 처리는 제제 당 250mg 조직 이하로 한정하였다(1 팁/제제). 6.25ml 저온 ddH₂O 중으로 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 하여 프로테아제 용액을 신선하게 제조하고 4℃에서 저장하였다. DNA 분해효소 A를 희석하여 최종 농도를 200mg/ml로 함으로써(100mg/ml 원액으로부터) G2 완충액(20ml)을 제조하였다. 에어로졸을 흡입하지 않기 위해 라미나-플로우 TC 후드 중에서 폴리트론의 큰 팁을 사용하여 종양 조직을19ml G2 완충액 중에서 60초간 균질화하였으며 실온에 두었다. 샘플 사이에, 2L ddH₂O 및 이어 G2 완충액(50ml) 중에서 각각 2 x 30초간 회전시켜 폴리트론을 세척하였다. 조직이 발생기 팁 상에 여전히 존재한다면 기구를 분해하여 세척한다.

퀴아겐 프로테아제(상기와 같이 제조, 1.0 ml)를 첨가하고 이어 와류 및 50℃에서 3시간 배양하였다. 용혈액이 투명해질 때까지 배양 및 원심분리를 반복하였다(예. 추가로 30-60분간 배양, 3000 x g에서 10분간 4℃에서 펠릿화).

인간 혈액 제조 및 용해:

표준 전염성 시약 프로토콜을 사용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하고 팁당 10ml 샘플 중으로 시트르산을 첨가하였다. 6.25ml 저온 ddH₂O 중으로 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 하여 퀴아겐 프로테아제를 신선하게 제조하고 4℃에 저장하였다. RNA 분해효소 A를 희석하여 100mg/ml 원액으로부터 최종 농도를 200μg/ml로 함으로써 G2 완충액을 제조하였다. 혈액(10ml)을 50ml 원추형 튜브에 넣고 10ml C1 완충액 및 30ml ddH₂O (양자 모두 4℃로 미리 평형시킴)를 첨가하고, 뒤집어 성분들을 혼합하고 얼음 상에 10분간 두었다. 베크만 스윙 버켓 로터로 2500rpm에서 4℃에서 15분간 핵을 펠릿화하고 상청액을 버렸다. 와류하며, 핵을 2ml C1 완충액(4℃) 및 6ml ddH₂O(4℃) 중으로 현탁하였다. 펠릿이 백색이 될 때까지 반복하여 와류시켰다. 이어 200㎕ 팁을 사용하여 핵을 잔류 완충액 중으로 현탁하였다. 부드럽게 와류시키며 G2 완충액(10ml)을 현탁 핵에 첨가하고, 이어 30초간 격렬하게 와류시켰다. 퀴아겐 프로테아제를 첨가하고(200㎕) 50℃에서 60분간 배양하였다. 용혈액이 투명해질 때까지 배양 및 원심분리를 반복하였다(예. 추가로 30-60분간 배양, 3000 x g에서 10분간 4℃에서 펠릿화).

투명해진 용혈액의 정제:

(1)게놈 DNA의 단리

게놈 DNA를 10ml QBT 완충액으로 평형시켰다(맥시 팁 제제 당 1 샘플). QF 용출 완충액을 50℃에서 평형시켰다. 샘플을 30초간 와류시킨 후 평형화된 팁 상에 로딩하고 중력으로 흘렸다. 팁을 2 x 15ml QC 완충액으로 세척하였다. DNA를 15ml QF 완충액(50℃)을 가지고 30ml 실란화, 가압살균된 30ml 코르텍스 튜브 중으로 용출하였다. 이소프로판올(10.5ml)을 각 샘플에 첨가하고 튜브를 파라핀으로 덮어, DNA가 침전될 때까지 반복하여 뒤집어 혼합하였다. SS-34 로터에서 15,000rpm으로 10분간 4℃에서 원심분리하여 샘플을 펠릿화하였다. 펠릿 위치를 표시하고 상청액을 버리고 10ml 70% 에탄올(4℃)을 첨가하였다. SS-34 로터에서 10,000rpm으로 10분간 4℃에서 원심분리시켜 샘플을 재펠릿화하였다. 펠릿 위치를 표시하고 상청액을 버렸다. 이어 튜브를 건조 랙 중 그들 편에 두고 샘플이 과도하게 건조되지 않게 주의하면서 37℃에서 10분간 건조시켰다.

건조 후, 펠릿을 1.0ml TE (pH 8.5) 중에 녹이고 50℃에서 1-2 시간 두었다. 용해가 계속될 때 샘플을 일야 4℃에 두었다. 이어 튜베르큘린 시린지 상의 26 게이지 바늘로 DNA 용액을 1.5ml 튜브로 이전시켰다. DNA를 전단하기 위해 이전을 5x 반복하였다. 이어 샘플을 50℃에서 1-2시간 두었다.

게놈 DNA의 정량 및 유전자 증폭 검정에 대한 준비:

각 튜브 중의 DNA 수준을 베크만 DU640 분광광도계에서 0.1ml 석영 큐벳을 사용하여 1:20 희석(5㎕ DNA + 95㎕ ddH₂O)으로 표준 A260, A280 분광광도법으로 정량하였다. A260/A280 비율은 1.8-1.9 범위였다. 이어 각 DNA 샘플을 TE(pH 8.5) 중에서 약 200ng/ml로 추가로 희석하였다. 원 물질이 고농축되었다면(약 700ng/㎕) 재현탁될 때까지 물질을 50℃에 수 시간 두었다.

이어 하기와 같이 변형된 제조자의 지침을 사용하여 희석 물질(20-600 ng/ml) 상에서 형광측정 DNA 정량을 수행하였다. 이는 호퍼 다이나 퀀트 (Hoeffer DyNA Quant) 200 형광측정기를 약 15분간 덥혀 수행하였다. 획스트(Hoechst) 안료 작업 용액(#H33258, 10㎕, 사용 전 12시간 이내 제조)을 100ml 1 x TNE 완충액으로 희석하였다. 2ml 큐벳을 형광측정 용액으로 채워 기계 내에 두고 기계를 0으로 하였다. pGEM 3Zf(+)(2㎕, 롯트 #360851026)을 2ml의 형광측정 용액에 첨가하여 200 단위에서 보정하였다. 이어 추가의 2㎕의 pGEM 3Zf(+) DNA를 시험하고 계기 눈금을 400+/-10 단위에서 확인하였다. 이어 각 샘플의 수치를 3회 이상 읽었다. 3 샘플이 서로에 대해 10% 이내인 것으로 나타나면 그 평균을 취하고 이 값을 정량화 수치로서 사용하였다.

이어 형광측정에 의해 결정된 농도를 사용하여 각 샘플을 ddH₂O 중 10ng/㎕로 희석하였다. 이는 모든 템플리트 샘플 상에서 단일 TaqMan 플레이트 검정에 대해 동시에 수행되었으며 충분한 물질을 사용하여 500-1000 검정을 시행하였다. 샘플 시험은, 단일 플레이트 상에서 템플리트 대조군 없이 정상 인간 DNA를 가지고Taqman™ 프라이머 및 B-액틴 및 GAPDH 프로브로 3회 반복하였다. 시험 DNA로부터 정상 인간 DNA를 뺀 CT 값이 +/- 1 CT인 경우 희석 샘플을 사용하였다. 희석된 로트-품질의(lot-qualified) 게놈 DNA를 -80℃에서 1.0ml 분액으로 저장하였다. 유전자 증폭 검정에서 후속적으로 사용할 분액은 4℃에서 저장하였다. 각 1ml 분액은 8-9 플레이트 또는 64 시험을 하기에 충분하다.

유전자 증폭 시험:

본 발명의 PRO533 화합물을 하기 1차 종양에서 스크린하였고 얻어진Ct값을 표 2에 보고하였다.

DNA49435의 다양한 폐 1차 종양 모델에 대한 △Ct값

1차 종양	△Ct값
LT1	-0.05
LT1a	1.02
LT2	-0.17
LT3	0.78
LT4	0.14
LT6	-0.02
LT7	1.04
LT9	0.80
LT10	0.79
LT11	1.09
LT12	0.76
LT13	0.91
LT15	0.50
LT16	1.66
LT17	1.32
LT18	0.34
LT19	1.67
LT21	0.92

논의 및 결론:

다양한 폐 종양에서의 DNA49435(PRO533)에 대한Ct값을 표 2에 보고하였다. 이는 유전자 카피의 배가를 나타내므로 1보다 큰Ct값을 증폭 평가에 대한 출발값으로서 전형적으로 사용하였다. 표 2는 DNA49435의 증폭이 1차 폐 종양 LT1a, LT7, LT11, LT16, LT17 및 LT19에서 발생했음을 나타낸다. 이들 종양의Ct값은 1.02, 1.04, 1.09, 1.66, 1.32 및 1.67이었다. 이는 정상 조직과 비교하여 유전자 카피에 있어 각각 약 2.0, 2.1, 2.1, 3.2, 2.5 및 3.2 배의 증가를 나타낸다. DNA49435(PRO533)의 증폭이 다양한 종양에서 나타나기 때문에 종양의 형성 또는 성장과 연관된 것으로 보인다. 그 결과, DNA49435(PRO533)에 의해 암코딩되는 단백질에 대한 길항제(예. 항체)가 암 치료에 있어 유용할 것으로 기대될 것이다.

실시예 6

혼성화 프로브로서의 PRO533의 용도

하기 방법은 PRO533을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.

전장 또는 성숙 PRO533의 코딩 서열(도 1, SEQ ID NO: 1)을 포함하는 DNA를 프로브로서 사용하여 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서의 상동 DNA(PRO533의 자연발생 변이체를 코딩하는 것 등)를 스크린하였다.

혼성화 및 라이브러리 DNA를 함유하는 필터의 세척은 하기 고엄격도 조건 하에서 수행한다. 50% 포름아미드, 5x SSC. 0.1% SDS, 0.1% 소듐 피로포스페이트,50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 2x 덴하르트 용액 및 10% 덱스트란 술페이트 용액 중에서 방사성 표지된 PRO533-유도 프로브를 42℃에서 20시간 동안 필터에 혼성화시켰다.

이어 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 완전한 길이의 천연 서열 PRO533을 코딩하는 DNA와 요망되는 서열 일치도를 가지는 DNA를 확인할 수 있다.

실시예 7

이. 콜라이( E.coli )에서의 PRO533의 발현

이 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의한 글리코실화되지 않은 형태의 PRO533의 제조를 예시한다.

선택된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO533을 코딩하는 DNA 서열(SEQ ID NO: 1)을 초기에 증폭한다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 자리에 상응하는 제한 효소 자리를 함유해야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 암피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하는 pBR322(E.coli로부터 유도; 볼리바(Bolivar) 등의 문헌[Gene,2:95 (1977)] 참조)이다. 벡터를 제한 효소로 자르고 탈인산화한다. 이어 PCR 증폭된 서열을 벡터 내로 결찰한다. 벡터는 바람직하게는, 항생제 내성 유전자를 위해, trp 프로모터, 폴리히스(polyhis) 리더(처음 6 STII 코돈, 폴리히스 서열 및 엔테로키나제 절단 자리 포함), PRO533 코딩 영역, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 함유할 것이다.

이어 삼부르크 등의 문헌에 기술된 방법을 사용하여 결찰 혼합물을 사용하여선택된 E.coli 균주를 형질전환시킨다. LB 플레이트에서 성장할 수 있는 능력에 의해 형질전환체를 확인하고 이어 항생제 내성 콜로니를 선택한다. 제한 분석 및 DNA 시퀀싱에 의해 플라스미드 DNA를 단리 및 확인할 수 있다.

선택된 클론은 항생제를 보충한 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 일야 성장시킬 수 있다. 이어 일야 배양물을 사용하여 큰 규모의 배양을 접종할 수 있다. 이어 세포를 원하는 광학 밀도까지 성장시키며 그 동안 발현 프로모터가 켜진다.

세포를 수 시간 더 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수확할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 시약을 사용하여 원심분리에 의해 얻어진 세포 펠릿을 용해시킬 수 있으며, 이어 단백질의 단단한 결합을 허용하는 조건 하에서 금속 킬레이트화 컬럼을 사용하여, 용해된 PRO533 단백질을 정제할 수 있다.

실시예 8

포유 동물 세포에서 PRO533의 발현

이 실시예는 포유 동물 세포에서 재조합 발현에 의한 잠재적으로 글리코실화된 형태의 PRO533의 제조를 예시한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 발행된 EP307,247 참조)를 발현 벡터로서 사용한다. 임의적으로, 삼부르크 등의 문헌에 기술된 것과 같은 결찰 방법을 사용하여 선택된 제한 효소로 PRO533 DNA를 pRK5에 결찰시켜 PRO533 DNA를 삽입시킨다. 생성된 벡터를 pRK5-PRO533이라 한다.

일 실시태양에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 태아 송아지 혈청 및 임의적으로 영양 성분 및(또는) 항생제를 보충한 DMEM과 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에서 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 성장시켜 융합시킨다. 약 10μg의 pRK5-PRO533 DNA를 VA RNA 유전자(문헌[Thimmappaya 등, Cell,31:543 (1982)] 참조)를 코딩하는 약1μg의 DNA와 혼합하고 500㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 0.227M CaCl₂중에 용해시킨다. 이 혼합물에 500㎕의 50mM HEPES(pH 7.35), 280mM NaCl, 1.5mM NaPO₄를 적가하고 25℃에서 10분간 침전을 형성시킨다. 침전을 현탁하고 293 세포에 첨가하고 37℃에서 약 4시간동안 침전시킨다. 배양 배지를 흡인시키고 PBS 중의 20% 글리세롤 2 ml를 30초간 첨가한다. 이어 293 세포를 혈청이 없는 배지로 세척하고 신선 배지를 첨가하고 세포를 약 5일간 배양한다.

트랜스펙션 후 약 24시간 후에, 배양 배지를 제거하고 200μCi/ml³⁵S-시스테인 및 200μCi/ml³⁵S-메티오닌을 함유하는 배양 배지(단일) 또는 배양 배지들로 대체한다. 12시간 배양 후, 컨디셔닝한 배지를 수집하고 스핀 필터 상에 농축하여 15% SDS 겔 상으로 로딩한다. 처리한 겔을 건조시키고 선택된 시간 동안 필름에 노출시켜 PRO533 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 트랜스펙션된 세포를 함유하는 배양액을 추가로 배양할 수 있으며(혈청이 없는 배지에서) 선택된 생물학적 검정으로 배지를 시험한다.

다른 기술에서는, 솜파리락(Somparyrac) 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci.,12: 7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 PRO533을 일시적으로293세포로 도입할 수 있다. 293 세포를 스피너 플라스크 중에서 최대 밀도로 성장시키고 700μg의 pRK5-PRO533 DNA를 첨가한다. 세포를 먼저 원심분리하여 스피너 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전을 세포 펠릿 상에서 4시간 동안 배양한다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척하고 조직 배양 배지, 5μg/ml 소 인슐린 및 0.1μg/ml 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크 중으로 재도입한다. 약 4일 후, 콘디셔닝한 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 잔해를 제거한다. 이어 발현된 PRO533을 함유하는 샘플을 농축하고 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

본 명세서에 기재된 다양한 FGFR-Fc 융합 단백질을 혈청이 없는 배지에서 293 세포 중에 일시적으로 발현시켰으며 단백질 G 컬럼으로 정제하였다. gD 시그널 서열 및 에피토프 타게(tage) 및 N-말단에 융합된 제네나제(genenase) 절단 자리(MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLPG)를 가진 발현 벡터 pRK-gD-FGF-19로 융합 단백질로서 혈청이 없는 배지 중에서 293 세포에서 DNA49435를 일시적으로 발현시켰다.

다른 실시태양에서, PRO533은 CHO 세포에서 발현될 수 있다. CaPO₄또는 DEAE-덱스트란 같은 공지 시약을 사용하여 pRK5-PRO533을 CHO 세포로 트랜스펙션할 수 있다. 전술한 바와 같이, 세포 배양액을 배양할 수 있으며, 배지를,³⁵S-메티오닌과 같은 방사능 표지를 함유하는 배양 배지(단독) 또는 배지로 치환할 수 있다.PRO533 폴리펩티드의 존재를 결정한 후, 배양 배지를 혈청이 없는 배지로 대체할 수 있다. 바람직하게는, 배양액을 약 6일간 배양한 후 컨디셔닝한 배지를 수확한다. 이어 발현된 PRO533을 함유하는 배지를 임의의 선택 방법으로 농축 및 정제할 수 있다.

에피토프-표지한 PRO533도 숙주 CHO 세포 중에서 발현될 수 있다. PRO533를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입물을, PCR을 통해 폴리-히스 태그와 같은 선택된 에피토프 표지를 가진 프레임 내에서 바큘로바이러스 발현 벡터 중으로 융합할 수 있다. 이어 안정한 클론의 선택을 위해 폴리-히스 표지된 PRO533 삽입물을, DHFR과 같은 선택 마커를 함유하는 SV40 유도 벡터 중으로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 SV40 유도 벡터로 트랜스펙션시킬 수 있다(전술한 바와 같이). 상기한 바와 같이, 표지를 하여 발현을 확인할 수 있다. 이어 발현된 폴리-His 표지된 PRO533을 함유하는 배양 배지를 Ni²⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피와 같은 임의의 선택 방법에 의해 농축 및 정제할 수 있다.

실시예 9

이스트에서 PRO533의 발현

하기 방법은 이스트 중에서의 PRO533의 재조합 발현을 기술한다.

먼저, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO533의 세포내 생산 또는 분비를 위해 이스트 발현 벡터를 구축한다. PRO533를 코딩하는 DNA 및 프로모터를 선택된 플라스미드 중의 적합한 제한 효소 자리에 삽입하여 PRO533의 세포내 발현을 의도한다.분비를 위해, PRO533을 코딩하는 DNA를, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO533 신호 펩티드 또는 기타 포유동물 신호 펩티드, 또는 예를 들어 이스트 알파-인자 또는 전화효소 분비 신호/리더 서열, 및 PRO533의 발현을 위한 링커 서열(필요하다면)을 코딩하는 DNA와 함께 선택 플라스미드 중으로 클로닝할 수 있다.

이어 이스트 균주 AB110과 같은 이스트 세포를 상기한 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 이스트 상청액을, 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루 염색액으로 염색하여, 분석할 수 있다.

이어 이스트 세포를 원심분리에 의해 발효 배지로부터 제거한 후 선택 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축함으로써 재조합 PRO533을 단리 및 정제할 수 있다. 선택 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 PRO533을 함유하는 농축물을 추가로 정제할 수 있다.

실시예 10

바큘로바이러스-감염 곤충 세포에서의 PRO533의 발현

하기 방법은 바큘로바이러스-감염 곤충 세포 중에서의 PRO533의 재조합 발현을 기술한다.

PRO533을 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 이러한 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로부린 태그(IgG의 Fc 지역과 같은)를 포함한다. pVL1393(Novagen)과 같은 상업적으로 구입 가능한 플라스미드로부터 유도된 플라스미드를 포함하여 다양한 플라스미드를사용할 수 있다. 간단히, PRO533을 코딩하는 서열 또는 PRO533의 코딩 서열의 요망 부분[막횡단 단백질의 세포외 지역을 코딩하는 서열 또는 세포외 단백질인 경우 성숙 단백질을 코딩하는 서열과 같은]을, 5' 및 3' 지역에 상보적인 프라이머로 PCR에 의해 증폭시킨다. 5' 프라이머는 인접(선택된) 제한 효소 자리를 포함할 수 있다. 이어 생성물을 그러한 선택된 제한 효소로 자르고 발현 벡터 내로 서브클로닝한다.

리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 상업적으로 구입 가능)을 사용하여 상기 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (Pharmingen)을 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)("Sf9") 세포(ATCC CRL 1711) 중으로 공동-트랜스펙션함으로써 재조합 바큘로바이러스를 생성한다. 28℃에서 4-5 일간 배양 후, 방출된 바이러스를 수확하고 추가 증폭을 위해 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현을 오레일리(O'Reilley) 등의 문헌[Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford Universit Press(1994)]에 기재된 바와 같이 수행한다.

이어 예를 들어 하기와 같이 Ni²⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해 발현된 폴리-his 표지 PRO533을 정제할 수 있다. 루퍼트(Rupert) 등의 의해 문헌[Nature,362: 175-179 (1993)]에 기술된 대로 재조합 바이러스 감염 Sf9 세포로부터 추출물을 제조한다. 간단히, Sf9 세포를 세척하고, 초음파용 완충액(25mL Hepes, pH 7.9; 12.5mM MgCl₂; 0.1mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4M KCl) 중에 재현탁하고 얼음 상에서 20초간 2회 초음파처리하였다. 초음파 처리액을 원심분리하여 투명하게 하고 상청액을 로딩 완충액(50mM 포스페이트, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8) 중에 50배 희석하고 0.45μm 필터를 통해 여과하였다. Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼(퀴아겐으로부터 상업적으로 구입 가능)을 베드 부피 5mL로 제조하고 25mL의 물로 세척하고 25mL의 로딩 완충액으로 평형시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5mL로 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 로딩 완충액으로 기저선 A₂₈₀까지 세척하고 이 점에서 분획 수집을 시작하였다. 다음, 컬럼을 2차 세척 완충액(50mM 포스페이트; 300mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. 다시 A₂₈₀기저선에 도달한 후, 컬럼을 2차 세척 완충액 중 0 내지 500mM 이미다졸 구배로 전개하였다. 1mL 분획을 수집하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제에 Ni²⁺-NTA-공액된 웨스턴 블롯(퀴아겐)으로 분석하였다. 용출된 His₁₀-표지 PRO533을 함유하는 분획을 풀(pool)하고 로딩 완충액에 대하여 투석하였다.

별법으로는, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 포함하여 공지된 크로바토그래피 기술을 사용하여 IgG 표지된(또는 Fc 표지된) PRO533을 정제할 수 있다.

바큘로바이러스 감염된 Sf9 곤충 세포 중에서 PRO533(UNQ334)을 발현시켰다. 발현은 실제 0.5-2 L 규모로 수행되었으나, 이는 더 많은(예. 8L) 제조를 위해 쉽게 규모를 키울 수 있다. PRO533를 IgG 구조물(면역부착;immunoadhesin)로서 발현할 수 있으며, 이 중 단백질 세포외 부분은 경첩, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 IgG1 연속 지역 서열에 융합하거나 및(또는) 폴리-His 표지 형태이었다. C 말단 연장 GHHHHHHHH를 포함시켜 DNA49435를 His-표지 형태로 발현시켰다.

PCR 증폭에 이어, 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터(pb.PH.His.c)로 서브클로닝시키고 리포펙틴(Lipofectin; Gibco BRL)을 사용하여 벡터 및 바큘로골드(Baculogold) 바큘로바이러스 DNA(Pharmingen)를 105 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda; "Sf9") 세포(ATCC CRL 1711) 중으로 공동 트랜스펙션시켰다. pb.PH.His는 상업적으로 구입 가능한 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393(Pharmingen)의 변형이며, 변형된 폴리링커 지역이 His 태그 서열을 포함한다. 10% FBS(Hyclone)이 보충된 힝크(Hink) TNM-FH 배지 중에서 세포를 성장시켰다. 세포를 28℃에서 5일간 배양하였다. 상청액을 수확하고 이어 약 10의 감염 다양성(MOI)에서 10% FBS이 보충된 힝크(Hink) TNM-FH 배지 중에서 Sf9 세포를 감염시켜 첫번째 바이러스 증폭에 사용하였다. 28℃에서 3일간 세포를 배양하였다. 상청액을 수확하고, 히스티딘 표지 단백질에 대해 25mL의 Ni-NTA 비드(퀴아겐), IgG 표지 단백질에 대해 25mL의 단백질-A 세파로즈 CL-4B 비드(파마시아)에 대해 1m의 상청액의 결합을 뱃치시킨 후 SDS-PAGE 분석을 하여 쿠마시 블루 염색에 의해 농도를 아는 단백질 표준과 비교함으로써 바큘로바이러스 발현 벡터 중에서의 구조물의 발현을 측정하였다.

첫번째 바이러스 증폭 상청액을 사용하여 약 0.1의 MOI에서 ESF-921 배지(발현 시스템 LLC)에서 성장한 Sf9 세포의 스피너(spinner) 배양액(500ml)을 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일간 배양하였다. 상청액을 수확하고 여과하였다. 뱃치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 필요에 따라 반복하여 스피너 배양물이 확실히 발현되게 하였다.

트랜스펙션된 세포로부터의 컨디셔닝된 배지(0.5 내지 3L)를 원심분리에 의해 수확하여 세포를 제거하고 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 폴리-His 표지 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼(퀴아겐)을 사용하여 단백질 구조물을 정제하였다. 정제 전에, 컨디셔닝된 배지에 이미다졸을 첨가하여 농도를 5mM로 하였다. 컨디셔닝된 배지를, 20mM Hepes, pH7.4, 0.3M NaCl 및 5mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 평형시킨 6ml Ni-NTA 컬럼 상으로 4℃에서 4-5ml/분의 유속으로 펌프하였다. 로딩 후, 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 0.25M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어 상당히 정제된 단백질을 25ml G25 수퍼파인(파마시아) 컬럼으로 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨, pH6.8을 함유하는 저장 완충액 중으로 탈염하고 -80℃에 저장하였다.

실시예 11

PRO533(UNQ334)의 FGF 수용체 4에 대한 결합 실증

대조군 C-말단 His8 에피토프 단백질과 같이, 실시예 8에서 기술한 바와 같이 PRO533을 C-말단 His8 에피토프 표지 형태로 바큘로바이러스 중에서 발현시켰다. FGF 수용체 1-4 및 TIE1 수용체의 세포외 도메인을 Fc 융합 단백질로서 발현시켰다. 단백질을 결합 완충액(DMEM 배지 + 10mM Hepes pH 7.4 + 0.1% 알부민 + 200ng/ml 헤파린) 중에서 실온에서 1시간 상호작용하게 하였다. 단백질 A 세파로즈(파마시아)를 첨가하고(0.01ml) 결합을 30분간 지속하였다. 단백질 A 세파로즈 비드를 모으고 결합 완충액 중에서 2회 세척하였다. 이어 샘플을 환원 조건 하에서 SDS PAGE에 의해 분리하였다. 제조자에 의해 권장되는 바와 같이 항-His 항체(퀴아겐)로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 특이적 결합 성분은 도 9의 상부 1-8열에 지시된 바와 같다. 9열은 비교를 위해 겔 상에 직접 로딩한 PRO533-His(UNQ334-His)를 함유한다. 비교를 위해 분자량 마커의 위치를 겔의 좌측에 나타내었다.

결과는 FGF 수용체 4(FGFR4-Fc)에 대한 높은 특이적 결합을 증명한다. 대부분의 FGF 리간드가 둘 이상의 FGF 수용체에 결합하기 때문에 이러한 결과는 매우 중요하다.

실시예 12

PRO533에 결합하는 항체의 제조

이 실시예는 PRO533에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 예시한다.

모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 고딩(Goding)의 문헌에 기술되어 있다. 사용 가능한 면역원은 정제된 PRO533, PRO533을 함유하는 융합 단백질 및 세포 표면에서 재조합 PRO533을 발현하는 세포를 포함한다. 면역원의 선택은 당업자에 의해 부적절한 실험 없이 가능하다.

Balb/c와 같은 쥐를, 완전한 프로인드 보조액(Freund's adjuvant) 중에 유화된 PRO533 면역원으로 면역화시키고 1-100㎍의 양으로 피하 또는 복강내로 주사한다.별법으로는, 면역원을 MPL-TDM 보조액t(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) 중에 유화시키고 동물의 뒷발 패드에 주사한다. 이어 면역화된 쥐를 10 내지 12일 후에 선택된 보조액 중에 유화된 추가의 면역원으로 부스트한다. 그 후, 수 주 간, 쥐를 추가의 면역화 주사로 부스트할 수도 있다. 리트로-오비탈 출혈(retro-orbital bleeding)에 의해 쥐로부터 혈청 샘플을 주기적으로 얻어 ELISA 검정으로 시험하여 항-PRO533 항체를 찾을 수 있다.

적합한 항체 적정량을 찾은 후, 항체에 "양성"인 동물을 PRO533의 최종 정맥 주사로 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 쥐를 희생시키고 비장 세포를 수확한다. 이어 ATCC No. CRL 1597로부터 입수 가능한 P3X63AgU.1과 같은 선택된 쥐 골수종 세포주에 비장 세포를 융합시킨다(35% 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합에 의해 하이브리도마 세포가 생성되며 이어 이 세포를 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96웰 조직 배양 플레이트 중에 심어 비융합 세포, 골수종 혼성체 및 비장 혼성체의 번식을 억제할 수 있다.

PRO533에 대한 반응성에 대해 하이브리도마 세포를 ELISA에서 스크린할 것이다. PRO533에 대한 요망되는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당업계의 기술 범위 내이다.

양성 하이브리도마 세포를 동유전자형 Balb/c 쥐에 복강내 주사하여 항-PRO533 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생산할 수 있다. 별법으로는, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병 중에 성장시킬 수 있다. 복수에서 생산된 모노클로날 항체의 정제는 암모늄 술페이트 침전법을 사용하고 이어 겔배제 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다. 별법으로는, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합에 근거하여 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

* * * *

물질의 기탁

하기 물질은 미합중국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불레바드 10801 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다:

물질 ATCC 기탁 번호 기탁일

DNA49435-1219 209480 1997년 11월 21일

이 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약)의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년간 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위로 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위에 속한다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명으로 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술한 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 청구범위의 범위에 속할 것이다.

본 발명은 섬유아세포 성장 인자와 상동성(homology)을 갖는 것을 특징으로 하는 신규의 DNA의 동정 및 확인, 신규 폴리펩티드의 재조합 생산에 관한 것이다. 구체적으로는, 섬유아세포 성장 인자군 중의 신규 인자{여기서는 FGF-19(PRO533)로 명명됨}의 동정, 분리, 특성 규명과 함께 그 용도에 관한 것이다. 특히, 종양 및(또는) FGF-19 변화에 의해 특징지워지는 기타 증상을 진단하고 예방하기 위한 조성물 및 진단 및 예방 방법에 관한 것이다.

<110> Genentech Inc. Botstein, David A. Goddard, Audrey Gurney, Austin L. Hillan, Kenneth J. Lawrence, David A. Roy, Margaret Ann <120> Fibroblast Growth Factor-19 <130> P1219R1-PCT <140> PCT/US98/25190 <141> 1998-11-25 <150> US 60/066,840 <151> 1997-11-25 <150> US 09/158,342 <151> 1998-09-21 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro 20 25 30 His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr 35 40 45 Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala 50 55 60 Asp Gly Val Val Asp Cys Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu 65 70 75 80 Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser 85 90 95 Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110 Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp 115 120 125 Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu 130 135 140 Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro 145 150 155 160 Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu 165 170 175 Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu 180 185 190 Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val 195 200 205 Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys 210 215 <210> 2 <211> 2137 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gctcccagcc aagaacctcg gggccgctgc gcggtgggga ggagttcccc gaaacccggc 60 cgctaagcga ggcctcctcc tcccgcagat ccgaacggcc tgggcggggt caccccggct 120 gggacaagaa gccgccgcct gcctgcccgg gcccggggag ggggctgggg ctggggccgg 180 aggcggggtg tgagtgggtg tgtgcggggg gcggaggctt gatgcaatcc cgataagaaa 240 tgctcgggtg tcttgggcac ctacccgtgg ggcccgtaag gcgctactat ataaggctgc 300 cggcccggag ccgccgcgcc gtcagagcag gagcgctgcg tccaggatct agggccacga 360 ccatcccaac ccggcactca cagccccgca gcgcatcccg gtcgccgccc agcctcccgc 420 acccccatcg ccggagctgc gccgagagcc ccagggaggt gccatgcgga gcgggtgtgt 480 ggtggtccac gtatggatcc tggccggcct ctggctggcc gtggccgggc gccccctcgc 540 cttctcggac gcggggcccc 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tccatcgatg gggaactcac ttcctttgga 1440 aaaattctta tgtcaagctg aaattctcta attttttctc atcacttccc caggagcagc 1500 cagaagacag gcagtagttt taatttcagg aacaggtgat ccactctgta aaacagcagg 1560 taaatttcac tcaaccccat gtgggaattg atctatatct ctacttccag ggaccatttg 1620 cccttcccaa atccctccag gccagaactg actggagcag gcatggccca ccaggcttca 1680 ggagtagggg aagcctggag ccccactcca gccctgggac aacttgagaa ttccccctga 1740 ggccagttct gtcatggatg ctgtcctgag aataacttgc tgtcccggtg tcacctgctt 1800 ccatctccca gcccaccagc cctctgccca cctcacatgc ctccccatgg attggggcct 1860 cccaggcccc ccaccttatg tcaacctgca cttcttgttc aaaaatcagg aaaagaaaag 1920 atttgaagac cccaagtctt gtcaataact tgctgtgtgg aagcagcggg ggaagaccta 1980 gaaccctttc cccagcactt ggttttccaa catgatattt atgagtaatt tattttgata 2040 tgtacatctc ttattttctt acattattta tgcccccaaa ttatatttat gtatgtaagt 2100 gaggtttgtt ttgtatatta aaatggagtt tgtttgt 2137 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro His Val 20 25 30 His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser 35 40 45 Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly 50 55 60 Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile 65 70 75 80 Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val 85 90 95 Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln 100 105 110 Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly 115 120 125 Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser 130 135 140 Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu 145 150 155 160 Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp 165 170 175 Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr 180 185 190 Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg 195 200 205 Ser Pro Ser Phe Glu Lys 210 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 4 Asn Gly Arg Ala 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752 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> unsure <222> (11)..(14) <223> unknown base <400> 5 aaatctgccg nttngaaatg gcactgccag tcgaaaactc tgaatatgtn caacttctag 60 atgtttcttc ctaaagctaa acagaacgtg gactcaggac tgttcttgta gaagcacgtc 120 ccccacgctg caggtaccac agcccctggc agcagtgaag aggcccgggc atggtctcag 180 ttacttctca aagctgggac tcctcacggc ctccagtccg gtgacaagcc caaatgggtc 240 catgctgtcg gtctccaggg gcgaagagaa catgtcagat tccaagtggc ccctgaggtc 300 ctcaggctcc tctgggacca tgggcagcat gggcaggaaa tgagagagtg gaagaaagcc 360 tctgttcttg tacagctgcc gctgtttggc actgctcagg ganaccggga agcggtgctt 420 ctcggatcng tacacattgt anccntctgg gcggatctcc tcctcnaaac acantctccc 480 ccgagtnctg aaactgcaaa aaaaaaggca ctctgacnat ccccnttgga naggaaaacn 540 ggtccncatg aactttgtct ncaaantgtc cnggtggccn cnacatnaac tcccataaac 600 ccccttgcat ttttaaacat actcctgatg tcacccnttc ttttaattat aaaaanaacc 660 taaatattta nttttaaaan aaatttcttn agggncgcca ttggtcccct ttttccccct 720 tnggagccaa caatgtnccn gaaccgattn aa 752 <210> 6 <211> 371 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttcgaggagg agatccgccc agatggctac aatgtgtacc gatccgagaa gcaccgcctc 60 ccggtctccc tgagcagtgc caaacagcgg cagtgtacaa gaacagaggc tttcttccac 120 tctctcattt cctgcccatg ctgcccatgg tcccagagga gcctgaggac ctcaggggcc 180 acttggaatc tgacatgttc tcttcgcccc tggagaccga cagcatggac ccatttgggc 240 ttgtcaccgg actggaggcc gtgaggagtc ccagctttga gaagtaactg agaccatgcc 300 cgggcctctt cactgctgcc aggggtgtgg tacctgcagc gtgggggacg tgcttctaca 360 agaacagtcc t 371 <210> 7 <211> 1824 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 7 ctgtcggagc agtaactctg tgcgccccac gccacaagcg cccagttgct ttgtgggttg 60 tgcctgccct gcgcctgcaa cttgagtccc cgccgcatcg cagtctccgc gccacctttg 120 taacggcctt caggaccccg aggtgtcatg gcgagaaagt ggaacgggcg tgcggtggcc 180 cgagccctgg tcctggccac tctgtggctg gctgtgtctg ggcgtcccct ggcccagcaa 240 tcccagtctg tgtcagatga agatccactc tttctctacg gctggggcaa gattacccgc 300 ctgcagtacc tgtactccgc tggtccctat gtctccaact gcttcctccg aatccggagc 360 gacggctctg tggactgcga ggaggaccaa aacgaacgaa atttgttgga 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actttgggag ccttgaagga tggtcttagg attacgaatt ccagctgact acgtagcttc 1320 ccccttttcc acttataaat gtcagatgga agtgaccctt agctgagtgc atagccaagc 1380 tgccacttat gccccaggag cttgtctctg tcccatgacc ccagatttcc aggacctgga 1440 tctgctcctc tgacctttcc cagagttcac ctgggctctc caaccccaga gcaggtagct 1500 tatgagccat ccagttgtgt ccccagctcc tggctctcag ttctggtcac caaacattgt 1560 gaatcaacgt gtctgctgcc tgtgtcaacc tggatccctc atttacaaac aagattagga 1620 agccccaaat tctccagtgg cagctgggga actgtggagt cctttccccg gcacttacgt 1680 ggcagcatga tatttataag taatttattg tgtgtgtgtc ttctattttc ttactttatt 1740 tatgccccag atcatattta tgtacatgac ttgttttcta cattaaaaag gagttggttt 1800 gtatcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1824 <210> 8 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro 20 25 30 His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr 35 40 45 Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala 50 55 60 Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His 85 90 95 Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu 100 105 110 Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro 115 120 125 Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu 145 150 155 160 Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro 165 170 175 Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu 180 185 190 Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala 195 200 205 Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys 210 215 <210> 9 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr 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Cys Arg Val Gly 85 90 95 Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser 100 105 110 His Glu Ala Asn Met Leu Ser Val Leu Glu Ile Phe Ala Val Ser Gln 115 120 125 Gly Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met 130 135 140 Ser Lys Lys Gly Lys Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys 145 150 155 160 Lys Phe Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 165 170 175 Ala Ile His Arg Thr Glu Lys Thr Gly Arg Glu Trp Tyr Val Ala Leu 180 185 190 Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lys Pro 195 200 205 Gln His Ile Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lys Gln Ser Glu Gln 210 215 220 Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Asn Pro Pro 225 230 235 240 Ser Pro Ile Lys Ser Lys Ile Pro Leu Ser Ala Pro Arg Lys Asn Thr 245 250 255 Asn Ser Val Lys Tyr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Gly 260 265 <210> 11 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Ser Cys Phe His Ile 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Homo sapiens <400> 13 Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cys Pro 20 25 30 Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile Leu Leu Ser 35 40 45 Lys Val Arg Leu Cys Gly Gly Arg Pro Ala Arg Pro Asp Arg Gly Pro 50 55 60 Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu Phe Cys Arg Gln Gly 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser Ile Gln Gly Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Thr Ser Ser Phe Thr His Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg 100 105 110 Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn 115 120 125 Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg 130 135 140 Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln Arg Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp 165 170 175 Lys Glu Gly Gln Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala 180 185 190 Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu 195 200 205 Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala 210 215 220 Pro 225 <210> 14 <211> 252 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Val Lys Pro Val Pro Leu Phe Arg Arg Thr Asp Phe Lys Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Asn His Lys Asp Leu Phe Phe Leu Arg Val Ser Lys Leu Leu 20 25 30 Asp Cys Phe Ser Pro Lys Ser Met Trp Phe Leu Trp Asn Ile Phe Ser 35 40 45 Lys Gly Thr His Met Leu Gln Cys Leu Cys Gly Lys Ser Leu Lys Lys 50 55 60 Asn Lys Asn Pro Thr Asp Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Arg Leu 65 70 75 80 Tyr Cys Arg Gln Gly Tyr Tyr Leu Gln Met His Pro Asp Gly Ala Leu 85 90 95 Asp Gly Thr Lys Gly Asp Ser Thr Asn Ser Thr Leu Phe Asn Leu Ile 100 105 110 Pro Val Gly Leu Arg Val Val Ala Ile Gln Gly Val Lys Thr Gly Leu 115 120 125 Tyr Ile Thr Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Pro Ser Glu Leu Phe 130 135 140 Thr Pro Glu Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val 145 150 155 160 Ile Tyr Ser Ser Met Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp 165 170 175 Phe Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ala Met Lys Gly Asn Arg Val 180 185 190 Lys Lys Thr Lys Pro Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu Glu Val 195 200 205 Ala Met Tyr Arg Glu Pro Ser Leu His Asp Val Gly Glu Thr Val Pro 210 215 220 Lys Pro Gly Val Thr Pro Ser Lys Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ile Met 225 230 235 240 Asn Gly Gly Lys Pro Val Asn Lys Ser Lys Thr Thr 245 250 <210> 15 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp 20 25 30 Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser 35 40 45 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 50 55 60 His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln 85 90 95 Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg 100 105 110 Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val 115 120 125 Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 130 135 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160 Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys 165 170 175 Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr 180 185 190 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala 195 200 205 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> ZN_FING <222> (1)..(26) <223> Artificial sequence <400> 16 atccgcccag atggctacaa tgtgta 26 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> ZN_FING <222> (1)..(40) <223> Artificial sequence <400> 17 agaccgggag gcggtgcttc tcggatcggt acacattgta 40 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> ZN_FING <222> (1)..(22) <223> Artificial sequence <400> 18 ccagtccggt gacaagccca aa 22 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> ZN_FING <222> (1)..(46) <223> Artificial sequence <400> 19 ggattctaat acgactcact atagggcgga tcctggccgg cctcgg 46 <210> 20 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Leu Leu 50 55 60 Pro Gly 65

Claims (2)

1. FGFR-4에는 결합하나 FGFR 1-3에는 결합하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 도 2의 약 464-466 부터 약 1109-1111 까지의 뉴클레오티드 위치의 서열(SDQ ID NO: 2)을 가지는 핵산의 상보체에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA를 포함하는 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
2. 시험 DNA 분자를 도 2의 1부터 약 826까지 및 약 1199부터 약 2137까지의 핵산 잔기의 서열(SEQ ID NO: 2)을 가지는 PRO533-코딩 DNA 분자(a) 또는 상기 (a)에 상보적인 DNA 분자(b)와 엄격한 조건 하에서 혼성화함으로써 생산되는, FGFR-4에는 결합하나 FGFR 1-3에는 결합하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 약 20-80 이상의 뉴클레오티드를 가지는 단리된 핵산 분자.