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KR20040066712A - 인간 성장 호르몬의 결합체 - Google Patents

인간 성장 호르몬의 결합체 Download PDF

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Publication number
KR20040066712A
KR20040066712A KR1020030015108A KR20030015108A KR20040066712A KR 20040066712 A KR20040066712 A KR 20040066712A KR 1020030015108 A KR1020030015108 A KR 1020030015108A KR 20030015108 A KR20030015108 A KR 20030015108A KR 20040066712 A KR20040066712 A KR 20040066712A
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KR
South Korea
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growth hormone
human growth
peg
kda
conjugate
Prior art date
Application number
KR1020030015108A
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김영민
정성엽
김경배
황인숙
임창기
권세창
이관순
Original Assignee
한미약품 주식회사
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Publication date
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Abstract

본 발명은 인간 성장 호르몬(hGH)의 아미노산 서열 중 특정 잔기를 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)로 화학적 수식을 시켜 생체내에서 잔류 시간의 증가 및 항원성의 감소 등의 효과를 지니는 동시에 생물학적 활성을 높은 수준으로 유지할 수 있는 PEG-인간 성장 호르몬 결합체에 관한 것이다.

Description

인간 성장 호르몬의 결합체{THE CONJUGATE OF HUMAN GROWTH HORMONE}
인간 성장 호르몬은 뇌하수체 전엽에서 분비되는 당화되어 있지 않은 펩타이드 호르몬으로서, 인체 여러 조직의 수용체에 결합하여 다른 성장 인자의 분비를 촉진하거나 또는 직접 작용하여 인체 여러 부위의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 사람의 뇌하수체에서 추출한 성장 호르몬이 뇌하수체성 난장이증의 치료에 효과가 있음이 밝혀진 후, 인간 성장 호르몬의 수요가 폭발적으로 증가하였으나 인간의 뇌하수체로부터 성장 호르몬을 추출 정제하는 경우 그 양이 매우 제한적이며, 사망한 인간의 뇌하수체로부터 추출한 인간 성장 호르몬을 투여 받은 어린이가 성장 호르몬 추출시 오염된 바이러스에 의해 치명적인 신경계 질환(Creutsfelt-Jacob Disease)에 의해 사망한 이후 미국 식품의약국(FDA)에서는 사망한 사람의 뇌하수체로부터 추출 정제한 호르몬의 사용을 금지시켰다(Science,234, 22(1986)).
제넨텍(Genentech)사에 의해 유전자 재조합의 기법으로 대장균에서 생합성된 인간 성장 호르몬이 FDA로부터 희귀 의약품으로 허가를 받은 후, 일라이 릴리(Eli Lilly)사, 덴마크의 노르디스크(Nordisk)사 등에 의해 재조합 인간 성장 호르몬이 상업화되어 판매되고 있다. 현재에는 성장 호르몬 결핍증 및 터너 증후군(Turner syndrome)으로 인한 왜소증 치료와 성인의 성장 호르몬 결핍증, 만성 신장 부전(Chronic Renal Insufficiency, CRI)등의 치료에 사용되고 있으나, 골다공증(Osteoporosis), 상처, 화상 및 불임 등에 대해서도 임상시험이 행해지고있으므로 인간 성장 호르몬을 적용하는 질환이 크게 늘어날 것으로 보인다. 인간 성장 호르몬은 환자에게 1주일에 3번, 또는 매일 1회 피하 주사로 투여되어야 적절한 혈청 수준을 유지할 수 있다. 인간 성장 호르몬을 만성적으로 수용하는 환자에 대해, 빈번한 피하 주사로 인한 투여는 환자의 삶의 질을 저하시키고, 복합병(항체 형성 내지 불균등한 기관 성장(differential organ growth) 등과 같은 복합병의 문제를 야기할 수 있다(Haffner D., Schaefer, F., Girard, J., Ritz, E. and Mehls,J. Clin. Invest,O.93, 1163(1994)).
인간 성장 호르몬의 반복 주입과 관련된 문제를 해결하기 위해, 인간 성장 호르몬의 생물학적 활성을 유지하면서 생체내 잔류기간을 증가시키기 위한 여러 연구가 진행되었다. 그 중 인간 성장 호르몬을 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드와 같은 생체 적합성(biocompatibility) 및 생분해성 중합체 매트릭스 내에 캡슐화하여 1주일 이상에 걸쳐 생체내에서 방출하는 서방 방출(sustained release)형 조성물로 제조하는 연구가 시도되어 여러 가지 생분해성 중합체의 조합과 캡슐화 연구가 진행되었고, 제넨텍(Genentech)사는 뉴트로핀 데폿(Nutropin Depot)이라는 상품명으로 이를 판매하고 있다. 그러나 이들 조절 방출 장치는 인간 성장 호르몬을 과량으로 투여해야 하며, 생체내에서 종종 초기에는 많이 방출되고 그 후에는 적게 방출되며, 이들 조절 방출 장치 내에서의 인간 성장 호르몬의 농도가 높아지면 호르몬 분자가 수일후에 응집되어 생물학적 활성이 감소되고 생체내에서 면역원이 되는 단점을 가진다.
인간 성장 호르몬을 비롯한 단백질 의약품의 생체내 잔류기간을 증가시키기위해 단백질과 PEG와 같은 합성 고분자와 결합시키는 방법이 시도되었다. 단백질 의약품을 합성 고분자와 결합시키면 단백질 분자의 표면 특성을 변화시켜서 물 또는 유기용매에 대한 용해도를 증가시킬 수 있으며, 생체 적합성을 증가시켜 면역 반응성을 감소시키며, 생체내에서의 안정성을 증가시키며, 장관 시스템, 신장, 비장 또는 간에 의한 소실(clearance)이 보다 천천히 이루어질 수 있다. 단백질의 분자량이 작을 경우 장관 시스템 또는 신장에서 여과되어 소실되는데 PEG와 같은 고분자를 결합시키면 이를 방지하게 된다(Knauf, M. J. et al,J. Biol. Chem. 263, 15064(1988)). 따라서, 단백질 의약품에 고분자를 수식하는 것은 용액 내에서의 단백질 분자의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 단백질의 내인성(intrinsic) 표면 특성을 효과적으로 보호할 수 있어 비특이적 단백질 흡착을 방지할 수 있다. 이에 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드 또는 단백질에 PEG를 결합시켜 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며 체내에서의 면역 반응을 감소시키는 효과에 대한 연구가 진행되었으며, 이는 미국 특허 제 4,179,337 호(1996년 존속기간 만료)에서 처음 보고되었다. 단백질과 PEG가 결합되었을 때 상기와 같은 장점으로 인하여 부작용이 많이 감소하는 것은 사실이지만, 동시에 PEG와 결합한 후에는 그 단백질의 생체 활성도가 무척 감소한다는 단점을 나타낸다.
현재까지 많이 쓰이고 있는 PEG는 단백질 표면의 하나 이상의 자유 라이신(lysine) 잔기와 공유결합을 하여 PEG가 단백질의 표면에 부착되는데, 이때 단백질의 표면중 단백질의 활성과 직접적으로 관계가 있는 부위가 PEG와 결합하면 그 활성이 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로일어나므로 많은 종류의 PEG화된 단백질 결합체들이 혼합물로 존재하게 되고, 결과적으로 원하는 결합체를 순수하게 분리하는 과정이 복잡하고 어려워진다. 예를 들어, 인간 성장 호르몬의 경우 그 표면에 10개의 자유 라이신 잔기가 존재하는데 이 잔기들 중 어느 것과 PEG가 결합하는 경우에 인간 성장 호르몬의 생물학적 활성을 유지하느냐가 최근 연구의 초점이 되고 있다. 제넨텍(Genentech)사의 논문[Clark et al.,The Journal of Biological Chemistry,271, 21969(1996)] 및 국제 공개 공보 제 WO 93/00109 호는 인간 성장 호르몬을 면역 반응 촉진제로 사용할 때 PEG로 수식화된 형태로 사용할 수 있다는 내용을 개시하고 있으며 이미 공지된 다양한 페길레이션(pegylation) 방법(P. McGoff et al.,Chem. Pharm. Bull.,36, 3070(1988); Chamow, S.M. et al.,Bioconjugate Chem.,5, 133(1994); 및 Teh, L.C. and Chapman, G.E.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,150, 391(1988))을 통해 인간 성장 호르몬에 PEG를 결합시켰다. 이때 시험에 사용된 PEG는 분자량이 5,000kDa이었으며 전골수 세포주(premyeloid cell line)인 FDC-P1을 사용한 세포 증식 분석을 통해 인간 성장 호르몬 한 분자당 결합된 PEG 분자의 수가 증가할수록 그 활성이 감소됨을 확인하였다. 미국 특허 제5,766,897호 및 국제 공개 특허 공보 제 WO 00/42175 호는 인간 성장 호르몬과 PEG를 결합시킴에 있어서 PEG가 인간 성장 호르몬의 활성부위와 반응하는 것을 피하기 위하여 PEG-말레이미드를 사용하여 PEG가 시스테인과 선택적으로 반응하도록 하였다. 그러나 이러한 종류의 PEG를 사용하려면 인간 성장 호르몬에 다이설파이드 결합에 관여하지 않은 자유 시스테인 잔기가 있어야 되나 인간 성장 호르몬에 존재하는 4개의 시스테인 잔기는 모두 다이설파이드 결합에 참여하고 있으므로 인간 성장 호르몬에 인위적으로 시스테인 잔기가 삽입된 인간 성장 호르몬 변형체를 사용하여 페길레이션 반응을 수행하였다. 그러나 이러한 방법은 페길레이션 반응에 사용한 인간 성장 호르몬이 천연형이 아니며, 또한 자유 시스테인이 존재하는 단백질을 발현시키고 정제하는 과정이 통상적으로 용이하지 않기 때문에 원료 물질을 수득하기가 어렵다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하기 위해 천연형 인간 성장 호르몬에 하나의 PEG 분자를 아미노 말단에 결합시킨 결합체를 제조 및 분리하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 성장 호르몬의 특정 부위, 구체적으로는 아미노 말단에 PEG 한 분자를 선택적으로 결합시켜 생물학적 활성 저하를 최소화시키면서 인간 성장 호르몬의 안정성 및 체내 잔류 시간을 증가시켜 생체내 활성이 지속되도록 하는 PEG-인간 성장 호르몬 결합체를 제공하는 것이다.
도 1은 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 사진으로 레인 1 내지 5는 각각 표준 단백질, 및 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG-hGH에 관한 것이다.
도 2는 크기 배제 크로마토그래피의 피크를 나타낸 것으로 피크 1 내지 5는 각각 40 kDa, 30 kDa, 20 kDa 및 10 kDa 모노-PEG-hGH, 및 비변형 hGH에 관한 것이다.
도 3a는 비변형 hGH의 펩티드 지도이고 도 3b는 30 kDa 모노-PEG-hGH의 펩티드 지도이다.
도 4는 국제표준품(NIBSC), 비변형 hGH, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa 모노-PEG-hGH를 Nb2 세포에 투여하여 시간에 따른 세포 성장에 관한 것으로 시험관내 활성을 측정한 것이다.
도 5는 용매 대조군, 표준품 hGH, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG-hGH를 뇌하수체가 제거된 랫트에 투여하여 시간에 따른 몸무게 증가에 관한 것으로 생체내 활성을 측정한 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 수용성 PEG 분자 하나를 선택적으로 결합시킨 PEG-인간 성장 호르몬 결합체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 현재 치료용 단백질로 널리 사용되고 있는 인간 성장 호르몬을PEG로 화학적 수식을 시킨 결합체에 관한 것이다. 생체내에서 인간 성장 호르몬이 그 역할을 수행하기 위해서는 목적 세포의 막에 존재하는 인간 성장 호르몬 수용체와 결합을 해야 하며 인간 성장 호르몬과 수용체와의 결합은 인간 성장 호르몬 내에 있는 2군데의 수용체 결합부위에 의해 이루어진다고 알려져 있다(Cunninghum et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3401(1991)). 이때 인간 성장 호르몬의 아미노 말단은 수용체와의 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다(Recent Progress In Hormone Research,48, 253(1992)).
본 발명에 유용한 인간 성장 호르몬은 포유동물로부터 추출되거나, 화학적으로 합성된다. 또한 유전자 재조합 기법을 이용하여 인간 성장 호르몬을 코딩하는 DNA로 형질전환된 원핵 또는 진핵 생물로부터 수득할 수도 있는데, 숙주로서 대장균 또는 효모를 이용하는 경우에는 인간 성장 호르몬 발현 산물은 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함(위치 -1)할 수 있다.
본원에서는 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 상기와 같이 메티오닌을 추가적으로 포함하는 것을 인간 성장 호르몬 유사체라고 한다.
본 발명에 사용되는 PEG 중합체 분자는 수용성 PEG 중합체 중에서 선택될 수 있으며, 통상적으로 PEG 중합체로 단백질을 화학적으로 수식할 때 PEG의 활성화 기에 따라 라이신 잔기의 ε-아미노기, 시스테인 잔기 또는 히스티딘 잔기에 결합할 수 있다. 그러나 이들 활성화 기를 갖는 PEG 중합체들을 이용하면 인간 성장 호르몬에 1개 이상의 PEG 분자가 결합을 한다. 이렇게 여러 부위에 결합한 PEG 분자들은 인간 성장 호르몬 및 이의 수용체의 결합을 구조적으로 방해하여 그 활성을 상실할 수 있다.
그러므로 한 분자의 인간 성장 호르몬에 한 분자의 PEG만 결합하도록 하기 위해 선택되는 본 발명의 PEG 중합체는 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않도록 수성이어야 하며 인간 성장 호르몬의 아미노 말단의 α-아미노기에 특이적으로 결합할 수 있도록 단일 반응 알데히드기를 가져야 한다. 또한 PEG 중합체의 분자량은 제한되지 않으나, 2 내지 100 kDa이 바람직하고, 10 내지 40 kDa이 특히 바람직하다. PEG는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다.
PEG는 인간 성장 호르몬을 결합시키기 위해 환원제의 존재하에서 인간 성장 호르몬과 알콕시-PEG-알데히드를 반응시키는 페길레이션 반응을 수행한다. 바람직하게는, 알콕시-PEG-알데히드가 메톡시-PEG-알데히드이고, 환원제는 NaCNBH3이다. 페길레이션 반응을 수행한 후 SDS-PAGE을 통해 PEG와 인간 성장 호르몬이 결합했는지 여부를 확인할 수 있다.
그런 다음, 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체를 수득하기 위해, 먼저 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 겉보기 전하의 차이로 아미노 말단에 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체 및 이와 동일한 겉보기 전하를 가지는 것을 분리해 낸다.
상기의 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리된 것을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 폴리-PEG-인간 성장 호르몬 결합체로부터 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체만을 분리한다.
모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체에서 PEG가 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 특이적으로 결합했는지를 확인하기 위해 펩타이드 지도를 작성하여 이미 공지(Journal of chromatography A,808, 121(1998);Analytical Biochemistry,122, 348(1982); 및Biotechnology and Applied Biochemistry,10, 326(1988) 참조)된 인간 성장 호르몬의 펩타이드 지도의 피크 패턴과 비교하여 PEG의 위치를 확인한다. 즉 PEG가 결합된 경우에는 프로테아제에 의해 절단된 단백질의 HPLC 피크 패턴은 비변형 인간 성장 호르몬을 동일한 프로테아제로 절단한 경우와는 다르다. 이러한 차이는 프로테아제 절단체중 어느 한 곳에 PEG의 결합함에 기인한 것이며 그 피크 패턴의 차이를 보면 PEG의 결합 여부와 결합 위치를 확인할 수 있다. 프로테아제는 트립신(trypsin), 서브틸리신(subtilisin) 또는 엔도프로테인아제 글루-시(endoproteinase Glu-C)를 이용할 수 있으며, 트립신이 바람직하다.
본 발명에서 기술한 모노-PEG-인간 성장 호르몬의 생물학적 활성을 측정하기 위해 이미 여러 문헌(Baldwin et al.,Acta Endocrinologica.,119, 326(1988); Clark et al.,J. Biol. Chem.,271(36), 21969(1996); 및 Bozzola et al.,J. endocrinol. Invest.,21, 768(1998))에서 공지된 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, Nb2 세포주를 가지고 세포 증식 분석을 하여 시험관내의 활성을 측정하거나, 비변형 인간 성장 호르몬에 비해 생체내 활성이 지속적으로 유지되는지를 알기 위해 랫트를 이용한 몸무게 증가 시험을 통해 그 활성이 지속됨을 확인할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 의한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1 : 재조합 인간 성장 호르몬의 제조
재조합 인간 성장 호르몬은 본 발명자들이 이미 대한민국 특허청에서 특허를 득한 대한민국 특허 제316347호의 방법에 따라 제조하였다. 본 발명에 사용된 인간 성장 호르몬은 천연형 형태(native form)이다.
실시예 2: 아미노 말단에 PEG화된 인간 성장 호르몬 결합체 제조
100 mM 인산칼륨 완충 용액(pH 6.0)에 인간 성장 호르몬 5 ㎎을 넣어 최종 부피 5 ㎖가 되도록 3개를 준비한 후, 평균 분자량 10, 20, 30, 가지달린 40 kDa인 4가지 활성화된 메톡시-PEG-알데히드(Shearwater사, 미국)를 인간 성장 호르몬:메톡시-PEG-알데히드의 몰비가 1:4가 되도록 상기 용액에 각각 넣어 주었다. 상기 반응 용액에 환원제인 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20 mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 18시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 인간 성장 호르몬에 반응하지 않은 PEG를 불활성화시키기 위해 에탄올아민을 최종농도가 50 mM이 되도록 넣어 주었다.
반응하지 않은 PEG를 분리하기 위해 세파덱스 G-25 컬럼(Pharmacia사)을 이용하였다. 먼저 2 CV(column volume)의 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)의 완충 용액으로 컬럼을 평형화시킨 후 반응 혼합물을 점적하였다. 파장 260 nm의 자외부 흡광계로 검출하며 동일한 완충 용액으로 용출하면 크기가 더 큰 PEG로 수식된 인간 성장 호르몬이 먼저 용출되어 나오고 반응하지 않은 PEG는 후에 용출되므로 이를 제거하였다.
실시예 3: 아미노 말단에 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 분리
실시예 2로부터 얻은 용출 용액으로부터 PEG로 수식된 인간 성장 호르몬을 더욱 순수하게 분리, 정제하기 위해 다음을 수행하였다. 3 ㎖의 폴리왁스 엘피(PolyWAX LP, Polywax Inc., 미국) 컬럼을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충 용액으로 평형화시켰다. PEG화된 반응 혼합물을 1㎖/분의 유속으로 컬럼상에 부하시킨 후, 5 CV, 즉 15 ㎖의 평형 완충 용액으로 세척하였다. 10 CV(30mL)의 1M NaCl 완충 용액으로 를 30분 동안 0에서 100%까지 자동 농도 구배 방법을 사용한 염 농도 구배 방법을 이용하여, 트리-, 디-, 모노-PEG-인간 성장 호르몬 순서로 용출시켰다.
더욱 순수한 모노-PEG 인간 성장 호르몬을 분리하기 위해 상기에서 수득한 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체 용출 분획을 가지고 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 10 mM 인산나트륨 완충 용액(pH 7.0)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200(Superdex 200, Pharmacia사)에 상기 용출액을 농축하여 점적하였으며, 동일한 완충 용액으로 용출하였다. 유속은 1 ㎖/분으로 흘려주었다. 트리-, 디-PEG-인간 성장 호르몬은 모노-PEG-인간 성장 호르몬보다 용출 시간이 상대적으로 빠르므로 이를 제거하여 순수한 모노-PEG-인간 성장 호르몬만을 수득하였다.
모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 농도 및 순도는 쿠마시(Coomassie)-염색 SDS-PAGE 젤 및 크기 배제 크로마토그래피(고압 액체 크로마토그래피)를 사용하여 측정하고, 비어-람버트(Beer-Lambert) 법칙에 따라 280nm에서 단백질 농도를 측정하였다(Bollag et al.,Protein MethodsChapter 3, press in Wiley-Liss). 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체 각각의 겉보기 분자량은 약 40 kDa, 62 kDa, 80 kDa 및 150 kDa 이었다.
도 1은 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 SDS-PAGE 젤 사진이다. 젤은 Bio-Rad사에서 구입한 15 % 크라이테리온 젤(criterion gel)을 사용하였다. 레인 1은 분자량 표준 단백질(인비트론사의 벤치마커, 아래 밴드부터 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 및 220kDa) 3.0 ㎍, 레인 2 내지 5는 각각 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG화된 인간 성장 호르몬 결합체 10㎍이다. 각각의 레인에서 볼 수 있듯이 인간 성장 호르몬에 수식된 PEG의 크기가 커질수록 젤상에서의 이동거리가 짧아지며, 모노-PEG-인간 성장 호르몬 이외의 단백질은 없는 단일 밴드를 나타내므로 상기에서 준비된 것이 매우 높은 순도임을 확인하였다.
도 2는 각 시료의 크기 배제 크로마토그램 분석 결과를 나타낸 것이다. HPLC기기(휴렛팩커드 HP1101)을 이용하여 100 mM 인산나트륨(pH 6.9) 및 20% 에탄올의 혼합물로 구성된 완충 용액으로 분석 컬럼(바이오셉 SEC-S3000, 피노메덱스사)을 평형화시킨 후, 동일한 완충 용액을 0.6 ㎖/분의 속도로 흘려주며 214nm에서 흡광도 신호를 모니터한 것이다. 비변형 인간 성장 호르몬, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa 모노-PEG-인간 성장 호르몬의 리텐션(retention) 시간은 각각 9.79분, 8.45분, 7.61분, 7.08분, 6.59분으로 분자량이 커짐에 따라 점점 빨리 용출되었다. 또한 각각의 PEG로 수식된 인간 성장 호르몬을 함유하는 피크는 단일 피크를 가지며 이는 PEG-인간 성장 호르몬의 분리된 분획들이 상당한 순도를 가짐을 확인할 수 있다.
실시예 4: 펩티드 지도화
상기 실시예 3에서 제조된 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 PEG 결합 부위가 아미노 말단임을 확인하기 위해 비변형 인간 성장 호르몬 및 30kDa 모노-PEG화된 인간 성장 호르몬 결합체의 펩티드 지도를 작성한 후 피크를 비교하였다. 이미 인간 성장 호르몬의 펩티드 지도의 피크는 여러 문헌에서 자세하게 기술되어 있어 이를 참조하였다(Journal of chromatography A,808, 121(1998);Analytical Biochemistry,122, 348(1982); 및Biotechnology and Applied Biochemistry,10, 326(1988)). 상기 실시예에서 제조된 30 kDa 모노-PEG-인간 성장 호르몬 및 비변형 인간 성장 호르몬을 0.5M Tris-HCl(pH7.0) 완충 용액 중 농도가 2 ㎎/㎖의 되도록 준비하였다. 상기와 같은 완충 용액중 1 ㎎/㎖ 트립신(로슈사, 스위스) 30 ㎕를 각각의 상기 성장 호르몬 용액 1 ㎖과 혼합하여 37℃ 항온조에서 4시간 동안 반응시켜 각각의 단백질을 절단하였다. 단백질 절단물을 바이닥(Vydac) 218TP C4 컬럼(4.6x250mm, 5㎛ 입자 크기, 300Å 소공 크기)에 주입하고. 0.1% 트리플루오로아세트산 내의 아세토니트릴 선형 기울기를 사용한 HPLC에 의해 펩티드 지도화하였다.
인간 성장 호르몬은 트립신에 절단될 수 있는 부위가 20개가 존재하므로 이론적으로 21개의 피크가 형성될 수 있으나, 트립신에 의해 절단이 실제로 모든 부위에서 일어나지 않으며 컬럼의 해상도의 차이에 의해 모든 피크가 형성되지 않는다. 그러나 아미노 말단을 포함하는 피크는 여러 문헌에서 잘 정의되어 있어서(Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,7(2),173(1989)) 그 차이를 확인할 수 있다.
도 3에서 보는 바와 같이 비변형 인간 성장 호르몬의 펩티드 지도상의 24분경에 용출되는 피크(T1)가 모노-PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 펩티드 지도에는 존재하지 않음을 알 수 있다. T1 피크는 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 해당하는 피크인데, 이는 시료가 컬럼을 통과할 때 그 피크의 용출 시간이 변화했기 때문이며 이러한 결과는 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 PEG 분자가 결합했음을 의미한다.
실험예 1: 시험관내 활성 측정
아미노 말단 모노-PEG-인간 성장 호르몬의 시험관내 활성도 측정은 인간 성장 호르몬 의존성 유사 분열을 하는 세포인 랫트 노드 림포마(Rat node lymphoma) 세포주인 Nb2(ECACC) 세포(ECACC, European Collection of Cell Cultures, ECACC #97041101)를 이용하여 시험관내 분석을 하였다. 분석을 위해 사용할 세포를 배양하기 위해 핏셔 배양액(Fisher`s medium)에 10 % 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 0.075 % NaCO3, 0.05 mM 2-메르캅노에탄올 및 2 mM 글루타민을 첨가하여 세포를 배양한 후, 분석을 위해서 10 % 소 태아 혈청을 제외한 동일한 배양액에서 24시간 동안 다시 배양하였다. 분석용 배양액에서 배양된 세포의 수를 세어 약 20,000개의 세포를 96 well plate의 각 well에 넣은 후 상기 실시예 3에서 분리한각각의 아미노 말단에 모노-PEG화된 인간 성장 호르몬, 대조군인 국제 표준품(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) 및 비변형 인간 성장 호르몬(HM-hGH)을 각각 희석하여 농도별로 첨가한 후 48시간 동안 37℃, CO2배양기에서 배양하였다. 이 후 세포의 성장 정도(각 well의 세포 수)를 측정하기 위해 세포 염색약인 cell titer 96 Aqueous One Solution(promega사, 미국)을 각 well에 25 ㎕씩 넣은 후, 4시간 동안 배양하였다. 이 후 490nm에서 흡광도를 측정하여 각 시료의 역가를 계산하였다. 도 4에 시험관내 활성 실험 결과를 나타내었다. 도 4에서 볼 수 있듯이 시험에 사용한 모든 시료는 인간 성장 호르몬 감수성 세포의 성장을 촉진시키는 것으로 보아 모두 활성이 있는 것으로 나타났다.
하기 표 1에서 보는 바와 같이 PEG에 의해 수식된 인간 성장 호르몬은 그 활성도가 수식되지 않은 것에 비하여 떨어짐을 확인할 수 있다. 특히 수식된 PEG의 크기가 클수록 그 활성도가 점차 떨어짐을 알 수 있고 30K의 PEG가 비변형 인간 성장 호르몬의 활성도의 약 9.8 %를 갖는 것으로 나타났다.
농도(ng/㎖) ED50 Specific activity(U/㎎) 비변형 hGH에 대한 상대적 활성 (%)
비변형 hGH 100 0.171 5.85E+06 -
NIBSC 100 0.130 5.02E+06 88.9
10kDa 모노-PEG-hGH 100 0.75 1.33E+06 22.7
20kDa 모노-PEG-hGH 100 1.453 6.88 11.8
30kDa 모노-PEG-hGH 100 1.739 5.75 9.8
40kDa 모노-PEG-hGH 100 2.150 4.65E+05 7.8
실험예 2: 생체내 활성 측정
뇌하수체가 제거된 5주령의 수컷 랫트(hypsectomized Sprague Dawley rat, SLC사, 일본)를 이용한 몸무게 증가 시험을 통해 아미노 말단 PEG-인간 성장 호르몬 결합체의 생체내 활성도를 측정하였다. 용매 대조군과 비변형 인간 성장 호르몬, 그리고 각각의 PEG-인간 성장 호르몬 결합체를 랫트의 경배부 피하에 아래의 표 1과 같은 투여농도 및 용량으로 26G 주사기(1 ㎖, ㈜한국백신)로 투여하였다. 투여 전 및 투여 16시간 이후 체중을 측정하였고 최종 투여 24시간 이후에 에테르 마취로 치사시켜 육안적으로 뇌하수체의 잔존유무를 검사하여 뇌하수체의 잔존물이 관찰된 개체의 결과는 제외시켰다.
그룹 투여약물 성별 동물수 투여용량 투여방법
1 용매대조군 M 5 PBS(0.5ml) 1회/하루, 4일간 투여
2 표준품 hGH(S1) M 5 240 mIU(120㎍/회) 1회 투여
3 표준품 hGH(S2) M 5 60 mIU(30㎍/회) 1회/하루, 4일간 투여
4 10kDa 모노-PEG-hGH M 5 240 mIU(120㎍/회) 1회 투여
5 20kDa 모노-PEG-hGH M 5 240 mIU(120㎍/회) 1회 투여
6 30kDa 모노-PEG-hGH M 5 240 mIU(120㎍/회) 1회 투여
7 40kDa 모노-PEG-hGH M 5 240 mIU(120㎍/회) 1회 투여
각 시료의 투여 후 몸무게 증감의 결과는 도 5에 나타내었다. 표준품으로 사용한 비변형 인간 성장 호르몬은, 단 1회 투여하였을 경우(S1) 투여 후 하루동안만 몸무게의 증가가 다소 있었으며 지속적인 활성은 없는 것으로 나타났으나 비변형 표준품을 하루에 1회씩 4일간 매일 투여하였을 때(S2)는 투여기간 동안 몸무게의 증가가 관찰되었다. 이와 같은 결과는 비변형 인간 성장 호르몬이 지속적으로생체내 활성을 갖기 위해서는 매일 투여해야 함을 잘 나타내고 있다. PEG-인간 성장 호르몬 결합체를 1회 투여하였을 경우 투여 후 3일까지 지속적으로 몸무게가 증가됨을 알 수 있었으며 3일 이 후 몸무게 증가율이 둔화됨을 볼 수 있었다. 또한 인간 성장 호르몬에 수식된 PEG의 크기가 클수록 몸무게의 증가율이 더 커짐을 알 수 있다. 이러한 결과는 단일 PEG 분자의 결합이 생체 내에서 단백질의 활성을 지속 가능하게 하여 단백질의 치료학적 측면을 극적으로 변화시킬 수 있음을 잘 나타내고 있는 것이다.
본 발명에 따른 PEG-인간 성장 호르몬 결합체는 인간 성장 호르몬 또는 그의 유사체의 아미노 말단에 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 것으로서 생체내에서의 잔류 시간 증가 및 항원성의 감소 등의 효과를 나타내고, 또한 생물학적 활성을 높은 수준으로 유지할 수 있다.

Claims (5)

  1. 인간 성장 호르몬 또는 그의 유사체의 아미노 말단에만 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 결합된 PEG-인간 성장 호르몬 결합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    아미노 말단인 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine)인 결합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    인간 성장 호르몬의 아미노 말단인 아미노산의 α-아미노기에 PEG가 결합됨을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    PEG가 2kDa 내지 100 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 결합체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    PEG가 10kDa 내지 40 kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 결합체.
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