[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR101521674B1 - 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101521674B1
KR101521674B1 KR1020107022013A KR20107022013A KR101521674B1 KR 101521674 B1 KR101521674 B1 KR 101521674B1 KR 1020107022013 A KR1020107022013 A KR 1020107022013A KR 20107022013 A KR20107022013 A KR 20107022013A KR 101521674 B1 KR101521674 B1 KR 101521674B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peg
double
growth hormone
molecular weight
stranded
Prior art date
Application number
KR1020107022013A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110014564A (ko
Inventor
웨이동 조우
샤오진 랴오
리 선
린종 장
큉송 루
시예 셴
리샨 양
데팡 장
후이후앙 린
핑 장
Original Assignee
바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드 filed Critical 바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드
Publication of KR20110014564A publication Critical patent/KR20110014564A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101521674B1 publication Critical patent/KR101521674B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

본 발명은 단일 부위에서 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜에 의해 수식된 높은 생물학적 활성을 나타내는 성장 호르몬(GH) 및 이의 제조 방법을 제공한다. PEG-부착된 GH는 정상 GH보다 더 높은 생물학적 활성 및 더 긴 반감기를 나타낸다. PEG-부착된 GH를 포함하는 조성물은 성장 또는 발달 장애, 예컨대, GH 결핍증, 터너 증후군 등의 치료에 있어서 유용하다.

Description

이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도{DOUBLE-STRANDED POLYETHYLENE GLYCOL MODIFIED GROWTH HORMONE, PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF}
본 발명은 생물학적 제제 기술 분야, 구체적으로 높은 생물학적 활성을 나타내는 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-수식된 성장 호르몬(GH), 이의 제조 방법 및 약학 분야에서 상기 수득된 PEG-부착된 GH의 용도에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬(HuGH)은 인간 전방 뇌하수체에 의해 분비되는 단백질 호르몬이고, 이의 전구체는 217개의 아미노산 잔기로 구성되고, 이때 처음 26개 아미노산 잔기는 신호 펩티드를 구성하고, 나머지 191개 아미노산 잔기는 성숙 분자를 구성한다. 2개의 분자내 이황화 결합(Cys79와 Cys191, 및 Cys208과 Cys215)이 존재하고, 상기 분자는 글리코실화되지 않은 분자로서, 그의 분자량은 22 kD이다. HuGH의 서열은 서열번호 1(NCBI: P01241, AAA72260)에 기재되어 있다(Denoto F M, et al., Human growth hormone DNA sequence and mRNA structure: possible alternative splicing. Nucleic Acids Res., 9: 3719-3730, 1981; Roskam W, et al., Molecular cloning and nucleotide sequence of the human growth hormone structural gene. Nucleic Acids Res., 7: 305-320, 1979; Martial J A, et al., Human growth hormone: Complementary DNA cloning and expression in bacteria. Science, 205: 602-607, 1979; Chen E Y, et al., The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomics, 4: 479-497, 1989). HuGH의 일차 기능은 세포, 기관 또는 뼈의 성장 촉진을 포함하고, 신체의 동화작용과 밀접하게 관련되어 있다(Iglesias P, et al., Recombinant human growth hormone therapy in malnourished dialysis patients: a randomized controlled study. Am. J. Kidney Dis., 32(3): 454-463, 1998; Neely E K, Use and abuse of human growth hormone. Annu. Rev. Med., 45:407-410, 1994). 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 HuGH(rHuGH)가 20년 이상의 기간에 걸쳐 임상적으로 사용됨으로써 rHuGH의 임상적 효능 및 안전성이 입증되었다.
많은 연구로부터 얻은 결과는 rHuGH가 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 동화작용 장애, 내인성 GH 결핍 왜소증, 터너 증후군 및 성인 GH 결핍증의 치료에 있어서 상당한 치료 효과를 보일 뿐만 아니라 노화 방지 요법에서도 상당한 효과를 보임을 입증한다. 현재, rHuGH는 왜소증의 치료에 있어서 유일하게 효과적인 약물이다. 2001년 3월까지, rHuGH의 임상적 연구에 들어가도록 FDA에 의해 승인받은 치료는 하기 치료를 포함한다: 중증 화상의 질소 보유 집중 치료, 단기 장 증후군의 치료(단독으로 투여되거나 글루타민과 병용 투여됨), AIDS 관련 성장 정지의 치료 등. 현재, 시판에 대해 승인받은 rHuGH의 증상은 하기 증상을 포함한다: 청소년기 내인성 GH 결핍 왜소증, 터너 증후군 관련 왜소증, 청소년기 자발적 또는 기관 GH 결핍 왜소증, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 조숙 성장 장애, AIDS 관련 이화작용 장애, 만성 신부전 관련 성장 지연 및 성인 GH 결핍증 등.
폴리에틸렌 글리콜은 불활성, 무독성 및 생분해성을 나타내는 유기 중합체이고 생물공학 및 약학 분야에서 중요하다. PEG 수식 기법은 공유결합을 통해 PEG를 활성 단백질에 부착시키는 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 부착(PEG-부착) 후, 단백질의 성질은 유의하게 개선될 수 있다(예를 들어, 약물 대사 반감기의 연장, 면역원성의 감소, 안전성의 증가, 치료 효능의 개선, 투약 빈도의 감소, 약물 가용성/수용성의 증가, 단백질분해에 대한 내성의 증가, 약물 제어 방출의 촉진 등)(문헌(Inada et al., J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990; Delgado, et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992; Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993) 및 미국 특허 제4179337호(Davis et al.)). 미국 특허 제4179337호에는 PEG가 단백질, 예컨대, 효소 또는 인슐린에 부착된 후, 단백질의 면역원성은 감소되고, 동시에 단백질의 활성도 감소되었지만, 수식된 단백질은 원래의 정상 단백질의 활성을 일정 비율로 보유한다고 개시되어 있다. 이러한 효과는 G-CSF(문헌(Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992)), IL-2(문헌(Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987)), TNF-α(문헌(Tsutsumi et al., Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994)), IL-6(문헌(Inoue et al., J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994)) 및 CD4-IgG(문헌(Chamow et al., Bioconj. Chem., 5, 133, 1994))에서도 발견되었다.
미국 특허 제5824784호에는 말단에서 알데하이드 기를 가진 PEG 수식기를 사용하여 고정된 부위(단백질의 N-말단 아미노산)에서 1개의 PEG에 의해 수식된 PEG-G-CSF를 수득하였다고 개시되어 있다. N-하이드록시석신이미드(NHS) 활성화에 의해 합성된 PEG-NHS 수식기는 G-CSF에서 라이신의 ε-아미노기와 아미도 결합을 형성할 수 있다. PEG-NHS는 높은 화학적 활성을 나타내지만 그의 선별성은 낮기 때문에 고정된 부위에서 1개의 PEG에 의해 수식된 생성물을 수득하는 것은 어렵다. 다수의 PEG에 의해 수식된 생성물에 비해 1개의 PEG에 의해 수식된 생성물은 더 균질하기 때문에 분리 및 정제에 있어서 유리하므로, 질 조절이 용이하고 대규모 제조에 있어서 배치(batch) 사이의 안정성이 보장된다.
현재, PEG-부착된 치료 단백질 약물의 일부 종류, 예컨대, PEG-부착된 아데노신 데아미네이즈(아다겐(Adagen).RTM, 에존 파마슈티칼스(Enzon Pharmaceuticals)), PEG-부착된 L-아스파라기네이즈(온캡스파(Oncapspar).RTM, 에존 파마슈티칼스), PEG-부착된 인터페론-α2b(PEG-인트론(Intron).RTM 쉐링-플로우(Schering-Plough)), PEG-부착된 인터페론-α2a(페가시스(Pegasys), 로슈(Roche)), 및 PEG-부착된 과립구 콜로니-자극 인자(뉼라스타(Neulasta).RTM, 암젠(Amgen))가 임상적으로 사용되고 있다. 약물의 PEG 부분(또는 PEG 자체)의 생체내 대사는 이미 명확히 이해되어 있고, PEG는 임의의 부작용을 나타내지 않는 우수하고 안전한 약물 수식기임이 입증되어 있다.
단백질 약물에 부착될 수 있는 PEG는 일반적으로 PEG의 말단에 있는 1 또는 2개의 말단 기가 화학적으로 활성화되어 부착될 약물의 1개 이상의 작용기에 대한 활성을 보이는 적절한 작용기를 보유하여 상기 1개 이상의 작용기와 안정한 공유결합을 형성할 수 있도록 유도체화될 필요가 있다. 예를 들어, PEG는 단백질 펩티드 쇄 내의 Lys 잔기의 ε-NH2에 부착될 수 있거나 단백질 펩티드 쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-NH2에 부착될 수 있다. 단백질을 수식하기 위해 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜의 일반적인 3종의 형태가 존재한다: 직쇄 분자(유럽 특허 제0593868호; 문헌(Yu-Sen Wang et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002); 문헌(Yu-Sen Wang et al., Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000)), U-형 분지쇄 분자(유럽 특허 제0809996호) 및 Y-형 분지쇄 분자(중국 특허 제1243779C호; 유럽 특허 제1496076호). 유럽 특허 제0809996호에는 IFN-α의 PEG-부착이 기재되어 있다.
일반적으로 당분야에서는 대다수의 단백질들의 성질이 PEG 수식 후 하기 변화를 겪을 것이라고 생각된다: 1) 면역원성 및 항원성 감소, 2) 주기 반감기의 연장, 3) 가용성의 증가, 4) 단백질분해에 대한 단백질의 내성 증가, 5) 생물학적 이용성의 증가, 6) 독성의 감소, 7) 열안정성 및 기계적 안정성의 증가, 8) 등전점, 전기영동적 거동 및 동적 성질의 변화 등. 뿐만 아니라, 가장 중요한 점 중 하나는 PEG 부착이 단백질의 세포 활성을 감소시킬 것이라는 점인데, 이것은 주로 최종 생성물 내로 도입되는 기(PEG를 포함함), 및 PEG와 수식될 단백질 사이의 결합에 기인하고, 발생된 부-생성물뿐만 아니라 커플링의 조건과도 관련되어 있다. 미국 특허출원 공개 제2004/0223950 A1호(Doris Brugger et al.)에는 상이한 부위들 중 한 부위에서 단일 이중-가닥 UPEG에 의해 단일-수식된 인터페론-α2a의 수식 생성물들이 유의하게 상이한 시험관내 항-바이러스 활성을 보이고, 이때 Lys31 부위에서 UPEG에 의해 단일-수식된 수식 생성물은 가장 높은 특이적 활성을 보이는 반면, Lys121 부위에서 UPEG에 의해 단일-수식된 생성물은 가장 낮은 특이적 활성을 보이고, 이들 사이의 차이는 5배 이하일 수 있다고 개시되어 있다.
중국 특허출원 공개 제1477126A호(Li, Weihua et al.)에는 PEG-수식된 GH의 제조 방법이 개시되어 있다. pH 6.5 내지 7.0에서 분지쇄 PEG(mPEGn-NHS)에 의한 GH의 수식 반응을 수행하는 것이 바람직하고, 단일 부위에서 분지쇄 PEG에 의해 단일-수식된 정제된 GH의 생물학적 활성은 뇌하수체가 제거된 래트를 사용하여 측정하였다. 결과는 PEG-커플링된 GH(이때, PEG는 분자량이 40 kD인 이중-가닥 PEG-NHS임)는 매일 주사된 동량의 GH에 필적할만한 체중 증가 효과를 보임을 입증한다.
본 발명은 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는, 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법을 제공한다:
a) pH가 6.0 이상, 바람직하게는 7.0 이상, 바람직하게는 8.0 이상, 바람직하게는 9.0 이상, 바람직하게는 9.5 이상, 바람직하게는 10.0 이상, 가장 바람직하게는 10.5인 용액 중에서, U-형 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG를 GH, 바람직하게는 HuGH와 접촉시키되, 바람직하게는 상기 이중-가닥 PEG에 대한 상기 GH의 몰비가 약 1:2가 되도록 하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 적절한 농도의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 바람직하게는 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계로서, 이때 생성물이 2개의 밴드를 보이거나 보다 낮은 겉보기 분자량의 1개의 밴드를 주로 보이는, 단계;
c) 상기 2개의 밴드에서, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 분리하고 회수하는 단계; 및
d) 경우에 따라, 바람직하게는 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피와 같은 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 I로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG인, 제조 방법을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010063582830-pct00001
상기 식에서,
Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
X1 및 X2는 독립적으로 연결 기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 n은 1 내지 10의 정수이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 II로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG인, 제조 방법을 제공한다:
[화학식 II]
Figure 112010063582830-pct00002
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 III으로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG이고, 상기 Y-형 분지쇄 PEG의 평균 총 분자량이 약 26 내지 60 kD, 바람직하게는 40 kD인, 제조 방법을 제공한다:
[화학식 III]
Figure 112010063582830-pct00003
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법으로서, 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 IV로 표시되는 U-형 분지쇄 PEG이고, 상기 U-형 분지쇄 PEG의 평균 분자량이 약 26 내지 66 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD인, 제조 방법을 제공한다:
[화학식 IV]
Figure 112010063582830-pct00004
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬이고;
n 및 n'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
n+n'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 이중-가닥 PEG-부착된 GH의 제조 방법을 제공한다:
a) pH가 9.0 또는 10.5인 용액 중에서, 하기 화학식 III으로 표시되는 이중-가닥 PEG에 대한 HuGH의 몰비가 약 1:2가 되도록 상기 PEG를 상기 GH와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 PEG의 평균 총 분자량이 약 40 kD인, 단계:
화학식 III
Figure 112010063582830-pct00005
[상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m+m'는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다];
b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 PEG에 의해 수식된 생성물을 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계로서, 이때 상기 생성물이 2개의 밴드를 보이는, 단계; 및
c) 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 및 마크로캡 SP 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택된 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 분리하고 회수하는 단계.
또한, 본 발명은 전술된 방법에 따라 제조된 PEG-부착된 GH를 제공하고, 이때 상기 GH는 천연 공급원으로부터 추출된 GH 또는 재조합 생명공학기술에 의해 수득된 재조합 GH, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가진 GH이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 전술된 방법에 따라 제조되고 분자량이 62 kD인 하기 화학식 VII로 표시되는 PEG-부착된 GH를 제공한다:
[화학식 VII]
Figure 112010063582830-pct00006
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m+m'는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다.
또한, 본 발명은 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는, PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법을 제공한다:
a) pH가 8.0 이상, 바람직하게는 9.0 이상, 바람직하게는 9.5 이상, 바람직하게는 10.0 이상, 가장 바람직하게는 10.5인 용액 중에서, U-형 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG를 GH, 바람직하게는 HuGH와 접촉시키되, 바람직하게는 상기 이중-가닥 PEG에 대한 상기 GH의 몰비가 약 1:2가 되도록 하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 적절한 농도의 SDS-PAGE, 바람직하게는 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계로서, 이때 상기 생성물이 2개의 밴드를 보이는, 단계;
c) 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 분리하고 회수하는 단계로서, 이때 회수된 생성물이 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 주로 포함하는 혼합물이고, 이때 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 함량(SDS-PAGE에 의해 검출됨)이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상인, 단계; 및
d) 경우에 따라, 바람직하게는 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피와 같은 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법으로서, 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 I로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG인, 제조 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure 112010063582830-pct00007
상기 식에서,
Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
X1 및 X2는 독립적으로 연결 기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 n은 1 내지 10의 정수이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 II로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG인, 제조 방법을 제공한다:
화학식 II
Figure 112010063582830-pct00008
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 III으로 표시되는 Y-형 분지쇄 PEG이고, 상기 Y-형 분지쇄 PEG의 평균 총 분자량이 바람직하게는 약 26 내지 60 kD, 가장 바람직하게는 40 kD인, 제조 방법을 제공한다:
화학식 III
Figure 112010063582830-pct00009
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중-가닥 PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법으로서, 이때 상기 이중-가닥 PEG가 하기 화학식 IV로 표시되는 U-형 분지쇄 PEG이고, 상기 U-형 분지쇄 PEG의 평균 분자량이 약 26 내지 66 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD인, 제조 방법을 제공한다:
화학식 IV
Figure 112010063582830-pct00010
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬이고;
n 및 n'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
n+n'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 이중-가닥 PEG-부착된 GH 제제의 제조 방법도 제공한다:
a) pH가 9.0 또는 10.5인 용액 중에서, 하기 화학식 III으로 표시되고 평균 총 분자량이 약 40 kD인 이중-가닥 PEG에 대한 HuGH의 몰비가 약 1:2가 되도록 상기 PEG를 상기 HuGH와 접촉시키는 단계:
화학식 III
Figure 112010063582830-pct00011
[상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬이고;
m+m'는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다];
b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계; 및
c) 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 및 마크로캡 SP 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택된 겔 크로마토그래피를 이용하여 분리하고 정제하는 단계로서, 이때 회수된 생성물 중의, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상인, 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 PEG-부착된 GH 제제를 제공하고, 이때 상기 GH는 천연 공급원으로부터 추출된 GH 또는 재조합 기술에 의해 수득된 재조합 GH, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가진 GH이다. 바람직하게는, PEG-부착된 GH 제제 중의, 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 생성물은 하기 화학식 VII로 표시되고, 상기 PEG-부착된 GH 제제 중의, 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량은 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이다:
화학식 VII
Figure 112010063582830-pct00012
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m+m'는 910이고;
j는 1 내지 12의 정수이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, rHuGH는 인공적으로 합성되거나 원핵 시스템, 예컨대, 이. 콜라이(E. Coli), 진핵 시스템, 예컨대, 효모 피키아(Pichia), 곤충 세포 시스템 및 포유동물 세포 시스템, 예컨대, CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택된 발현 시스템으로부터 발현된다.
또한, 본 발명은, 약학적 유효량의 전술된 PEG-부착된 GH 또는 전술된 PEG-부착된 GH 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 조성물은 바람직하게는 만니톨, 아미노산, 염화나트륨, 아세트산 또는 아세트산나트륨을 포함하고, 상기 아미노산은 바람직하게는 아스파르테이트, 아스파라긴, 라이신 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 GH 치료가 필요한 질환의 치료 또는 노화 방지 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 전술된 PEG-부착된 GH, 전술된 PEG-부착된 GH 제제 또는 전술된 조성물의 용도를 제공하고, 이때 GH 치료가 필요한 질환은 바람직하게는 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 내인성 GH 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 GH 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 전술된 PEG-부착된 GH, 전술된 PEG-부착된 GH 제제 또는 전술된 조성물을 GH 치료가 필요한 질환을 앓는 환자 또는 노화 방지 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, GH 치료가 필요한 질환을 앓는 환자 또는 노화 방지 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 이때 GH 치료가 필요한 질환은 바람직하게는 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 내인성 GH 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 GH 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 pH 8.0에서 40 kD의 YPEG-NHS 또는 40 kD의 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 분리 겔의 농도는 12%이고, 가시화를 위해 은 염색이 이용되었다. 레인 1은 저분자량 마커(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))이고, 레인 2는 pH 8.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 3은 pH 8.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플(적재량: 5 ㎍)이고, 레인 4는 pH 8.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플(적재량: 5 ㎍)이다.
도 2는 다양한 pH에서 40 kD의 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 분리 겔의 농도는 12%이고, 가시화를 위해 은 염색이 이용되었다. 레인 1은 pH 6.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 2는 pH 7.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 3은 pH 8.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 4는 pH 9.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 5는 pH 9.5에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 6은 pH 10.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 7은 pH 10.5에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 8은 저분자량 마커(지이 헬쓰케어)이다. 모든 샘플의 적재량은 5 ㎍이다.
도 3은 다양한 pH에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플들의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 분리 겔의 농도는 12%이고, 가시화를 위해 은 염색이 이용되었다. 레인 1은 pH 6.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 2는 pH 7.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 3은 pH 8.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 4는 pH 9.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 5는 pH 9.5에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 6은 pH 10.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 7은 pH 10.5에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH 샘플이고, 레인 8은 저분자량 마커(지이 헬쓰케어)이다. 모든 샘플의 적재량은 5 ㎍이다.
도 4는 pH 6.0 또는 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 YPEG-NHS 또는 40 kD의 UPEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 분리 겔의 농도는 12%이고, 가시화를 위해 은 염색이 이용되었다. 레인 1은 UPEG-rHuGH U10.5(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 2는 UPEG-rHuGH U10.5(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 3은 UPEG-rHuGH U6.0(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 4는 UPEG-rHuGH U6.0(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 5는 저분자량 마커(지이 헬쓰케어)이고, 레인 6은 YPEG-rHuGH Y10.5(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 7은 YPEG-rHuGH Y10.5(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 8은 YPEG-rHuGH Y6.0(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 9는 YPEG-rHuGH Y6.0(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 10은 rHuGH(적재량: 100 ng)이고, 레인 11은 rHuGH(적재량: 50 ng)이다.
도 5는 pH 6.0 또는 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 UPEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물의 세포 활성의 분석 결과를 보여준다(중복 플레이트).
도 6은 pH 6.0 또는 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 YPEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물의 세포 활성의 분석 결과를 보여준다(중복 플레이트).
도 7은 MALDI-TOF MS에 의해 검출된, pH 6.0, 9.0 또는 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 YPEG-NHS 또는 40 kD의 UPEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물의 분자량을 보여준다. a는 YPEG-rHuGH Y6이고, b는 YPEG-rHuGH Y9이고, c는 YPEG-rHuGH Y10.5이고, d는 YPEG-rHuGH Y6-1이고, e는 UPEG-rHuGH U6이고, f는 UPEG-rHuGH U9이고, g는 UPEG-rHuGH U10.5이고, h는 UPEG-rHuGH U6-1이고, i는 YPEG-NHS 40 kD이고, j는 UPEG-NHS 40 kD이고, k는 단백질 보정 표준물 II(브룩커(BRUKER))이고, l은 rHuGH이고, m은 단백질 보정 표준물 I(브룩커)이다.
도 8은 pH 6.0에서 단일 부위에서 40 kD의 PEG-NHS에 의해 수식된 보다 높은 겉보기 분자량의 정제된 rHuGH 수식 생성물의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과, 및 pH 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 PEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물의 비-환원성 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 분리 겔의 농도는 12%이고 가시화를 위해 은 염색이 이용되었다. 레인 1은 YPEG-rHuGH Y10.5(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 2는 YPEG-rHuGH Y6.0-1(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 3은 UPEG-rHuGH U10.5(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 4는 UPEG-rHuGH U6.0-1(적재량: 2 ㎍)이고, 레인 5는 rHuGH(적재량: 50 ng)이고, 레인 6은 rHuGH(적재량: 100 ng)이고, 레인 7은 저분자량 마커(지이 헬쓰케어)이고, 레인 8은 YPEG-rHuGH Y10.5(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 9는 YPEG-rHuGH Y6.0-1(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 10은 UPEG-rHuGH U10.5(적재량: 10 ㎍)이고, 레인 11은 UPEG-rHuGH U6.0-1(적재량: 10 ㎍)이다.
도 9는 pH 6.0에서 단일 부위에서 40 kD의 PEG-NHS에 의해 수식된 보다 높은 겉보기 분자량의 정제된 rHuGH 수식 생성물(Y6-1, U6-1)의 겉보기 분자량, 및 pH 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 PEG-NHS에 의해 수식된 정제된 rHuGH 수식 생성물(Y10.5, U10.5)의 겉보기 분자량을 보여준다(비-환원성 SDS-PAGE에 의해 검출됨). 레인 1은 각각 25 ng의 YPEG-rHuGH Y6-1 + YPEG-rHuGH Y10.5이고, 레인 2는 50 ng의 YPEG-rHuGH Y6-1이고, 레인 3은 50 ng의 YPEG-rHuGH Y10.5이고, 레인 4 및 6은 블랭크(blank)이고, 레인 5는 고분자량 마커(지이 헬쓰케어)이고, 레인 7은 각각 25 ng의 UPEG-rHuGH U6-1 + UPEG-rHuGH U10.5이고, 레인 8은 50 ng의 UPEG-rHuGH U6-1이고, 레인 9는 50 ng의 UPEG-rHuGH U10.5이다.
도 10은 300 ㎍/kg의 rHuGH 및 YPEG-rHuGH(Y10.5) 각각을 게잡이 원숭이에게 단일 피하 주사한 경우 시간에 대한 평균 혈청 약물 농도의 곡선을 보여준다.
본 발명은 높은 생물학적 활성을 나타내는 이중-가닥 PEG-수식된 GH 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 주목할 만한 특징은 반응 조건 및 분리 방법의 최적화 후, 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 GH 중의 낮은 세포 활성 성분의 함량이 유의하게 감소된다는 점에 있다. 분자량이 40 kD인 이중-가닥 PEG의 일례에서, 단일 부위에서 수식된 낮은 세포 활성의 생성물은 이 생성물 및 단일 부위에서 수식된 높은 세포 활성의 생성물이 12% SDS-PAGE에서 2개의 밴드로 완전히 분리되고, 단일 부위에서 수식된 낮은 세포 활성의 생성물의 겉보기 분자량이 단일 부위에서 수식된 높은 세포 활성의 생성물의 겉보기 분자량보다 높다는 점을 특징으로 한다. 뇌하수체가 제거된 래트를 동물 모델로 사용하고 rHuGH를 양성 대조군으로 사용하여, 단일 부위에서 수식된 높은 세포 활성의 생성물의 생체내 생물학적 활성을 문헌(Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 2, Appendix XII P)에 기재된 GH 생체분석에 따라 분석한다. 단일 부위에서 수식된 높은 세포 활성의 생성물은 정상 GH의 생물학적 활성의 1.5배 이상의 활성을 나타냄으로써 정상 GH보다 유의하게 더 높은 생물학적 특이적 활성을 나타내고 게잡이 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 이용한 약동학적 연구에서 정상 GH의 혈청 중 평균 약물 대사 반감기보다 20배 이상 더 긴 혈청 중 평균 약물 대사 반감기를 가짐으로써 장기 효과를 나타냄이 밝혀졌다.
본 발명의 한 실시양태에서, GH에 대한 이중-가닥 PEG-NHS 수식 반응은 pH 8.0에서 수행되고, SDS-PAGE 전기영동을 이용하여 반응 생성물을 분석하고, 가시화를 위해 은 염색을 이용한다. 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 GH 생성물이 이전 보고(문헌(Ross Clark, Kenneth Olson, et al. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996), 문헌(Li, Weihua, Dong Jian et al., Long-term effective growth hormone and the pharmacological composition) 및 중국 특허출원 공개 제1477126A호)와는 상이한 2개의 주요 밴드를 보인다는 것은 놀라운 사실이다. 추가 실험에서, pH 6.0 내지 10.5에서 수행된 이중-가닥 PEG-NHS에 의한 GH의 수식이 연구되었고, 단일 부위에서 수식된 모든 생성물들이 2개의 주요 밴드를 보임이 SDS-PAGE에 의해 확인되었다. pH가 증가함에 따라 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드의 함량도 증가한다. 10.0 이상의 pH에서, 단일 부위에서 수식된 생성물은 실질적으로 보다 낮은 겉보기 분자량의 한 밴드를 보인다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 몇몇 적절한 겔 크로마토그래피 정제 기법을 이용하여 pH 10.5 및 6.0 각각에서 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 정제된 rHuGH를 제조한다. 12% 분리 겔을 이용한 SDS-PAGE를 이용하여 검출하고 가시화를 위해 은 염색을 이용한다. pH 6.0에서 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 정제된 rHuGH는 명확히 2개의 밴드를 보인다. pH 10.5에서 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 정제된 rHuGH는 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드를 주로 보이고, 이의 SDS-PAGE 함량은 80% 이상이다. 미량(0.5%를 초과하지 않음)의 기질 단백질만이 상기 두 경우에서 검출된다. MALDI-TOF MS는 상기 2가지 pH 조건에서 수식된 생성물이 실질적으로 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 GH 생성물임을 확인시켜 준다. 세포 활성 분석은 pH 10.5에서 단일 부위에서 수식된 생성물이 pH 6.0에서 단일 부위에서 수식된 생성물보다 유의하게 더 높은 세포 활성을 나타내고, pH 10.5에서 단일 부위에서 수식된 생성물의 세포 비활성(specific activity)이 pH 6.0에서 단일 부위에서 수식된 생성물의 세포 비활성의 약 2배임을 보여준다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, pH 6.0에서 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 정제된 수식 생성물로서 보다 높은 겉보기 분자량을 가진 정제된 수식 생성물은 Q 세파로스 FF 크로마토그래피 정제 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피 정제 등에 의해 제조된다. MALDI-TOF MS 검출은 PEG-수식된 rHuGH가 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 생성물임을 확인시켜 주고, 세포 활성 분석은 상기 생성물의 세포 비활성이 pH 10.5에서 단일 부위에서 수식된 정제된 (보다 낮은 겉보기 분자량을 가진) rHuGH의 세포 비활성보다 유의하게 낮음을 보여준다. pH 10.5에서 단일 부위에서 수식된 정제된 rHuGH의 세포 비활성은 pH 6.0에서 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 세포 비활성의 3배 이하이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, rHuGH를 양성 대조군으로 사용하는, 문헌(Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P)에 기재된 GH의 생체분석에 따라, 뇌하수체가 제거된 래트를 사용하는 방법을 이용하여 pH 10.5에서 단일 부위에서 40 kD의 PEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH의 수식 생성물의 생체내 생물학적 활성을 분석한다. rHuGH는 매일 1회씩 총 6회 투여된다. 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 생성물은 rHuGH의 6회 투여의 합계와 동일한 투여량으로 1회 투여된다. 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH는 rHuGH보다 유의하게 더 높은 생물학적 활성을 나타내고 이의 생물학적 특이적 활성은 rHuGH의 생물학적 특이적 활성의 1.5배 이상까지 도달할 수 있다. 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 약효는 장기 효과이다. 게잡이 원숭이의 약동학적 연구는 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 약물 대사 반감기가 정상 재조합 GH의 약물 대사 반감기보다 20배 이상 더 연장됨을 보여준다.
본 발명은 분지쇄(U-형 분지쇄 및 Y-형 분지쇄) PEG 유도체를 사용하여 GH를 수식한다. 본 발명에서 사용되는 Y-형 분지쇄 PEG 유도체는 신규 분지쇄 PEG 유도체이고, 이의 구조는 직쇄 PEG 또는 U-형 분지쇄 PEG와 상이하고 Y-형 분지쇄 PEG 유도체와 U-형 분지쇄 PEG 유도체의 주요 차이는 본 발명의 Y-형 PEG 유도체의 2개 PEG 분지쇄가 N 원자를 통해 서로 연결되어 있는 반면, U-형 PEG 유도체의 2개 PEG 분지쇄는 C 원자를 통해 서로 연결되어 있다는 점에 있다. U-형 또는 Y-형 PEG를 사용한 수식은 단백질 또는 펩티드의 N-말단 자유 α-아미노 또는 Lys 잔기의 측쇄의 ε-아미노에서 주로 일어난다. Y-형 PEG 유도체는 하기 화학식 I로 표시된다:
화학식 I
Figure 112010063582830-pct00013
상기 식에서,
Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고;
j는 1 내지 12의 정수이며;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
X1 및 X2는 독립적으로 연결 기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 n은 1 내지 10의 정수이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, Y-형 PEG 유도체의 Pa 및 Pb는 하기 화학식 II에 나타낸 바와 같이 동일하거나 상이한 PEG일 수 있다:
화학식 II
Figure 112010063582830-pct00014
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다. 바람직하게는, PEG의 평균 총 분자량은 약 26 내지 60 kD, 가장 바람직하게는 40 kD이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 VI의 PEG-부착된 GH를 제공한다:
[화학식 VI]
Figure 112010063582830-pct00015
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500이고;
Ri는 H, 치환되거나 비치환된 C1-C12 알킬, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고;
F는 치료제 또는 기질의 아미노, 하이드록실 또는 하이드로설파이드 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 하이드록실, 카복실, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라지드, 말레이미드 및 피리딘 다이설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이다. 본 발명의 한 실시양태에서, Y-형 PEG 유도체 분자(YPEG-NHS)의 구조는 하기 화학식 III으로 표시된다:
화학식 III
Figure 112010063582830-pct00016
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, U-형 PEG 유도체 분자(UPEG-NHS)의 구조는 하기 화학식 IV로 표시되고, 상기 PEG의 평균 분자량은 약 26 내지 66 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD이다:
화학식 IV
Figure 112010063582830-pct00017
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬이고;
n 및 n'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
n+n'는 바람직하게는 600 내지 1500, 가장 바람직하게는 910이다.
본 발명의 한 실시양태에서, YPEG 또는 UPEG에 의해 수식된 GH를 수득하기 위해, 활성화된 YPEG 및 UPEG 유도체, 예컨대, PEG 석신이미딜 에스터(YPEG-NHS)의 PEG 부분을 친핵 치환을 통해 단백질의 아미노(-NH2)에 공유결합시키고, 상기 -NH2는 단백질의 N-말단 α-NH2 및 라이신 잔기의 ε-NH2를 포함한다. GH 및 YPEG-NHS로부터 YPEG-GH를 생성하는 반응식은 다음과 같다:
Figure 112010063582830-pct00018
GH 및 UPEG-NHS로부터 UPEG-GH를 생성하는 반응식은 다음과 같다:
Figure 112010063582830-pct00019
바람직하게는, PEG의 평균 총 분자량은 약 26 내지 66 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD이다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PEG-부착된 GH는 하기 화학식 VII로 표시된다:
화학식 VII
Figure 112010063582830-pct00020
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬, 바람직하게는 C1-C4 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이고;
j는 1 내지 12의 정수이고;
m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
m+m'는 바람직하게는 600 내지 1500이다.
상기 화학식에서, Y-형 분지쇄 PEG는 단일 부위에서 GH 분자에 부착되어 있다. m 및 m'는 동일하거나 상이할 수 있는 정수이다. 상기 화학식에서 YPEG-GH의 분자량은 중합의 정도 m 및 m'에 달려 있다. m+m'가 바람직하게는 600 내지 1500인 경우, YPEG의 상응하는 평균 분자량은 약 26 내지 약 66 kD이다. m+m'가 바람직하게는 795 내지 1030인 경우, YPEG의 상응하는 평균 분자량은 약 35 내지 약 45 kD이다. m+m'가 특히 바람직하게는 885 내지 1030인 경우, YPEG의 상응하는 평균 분자량은 약 39 내지 45 kD이다. m+m'가 가장 바람직하게는 910인 경우, YPEG의 상응하는 평균 분자량은 약 40 kD이다. m'에 대한 m의 비율은 0.5 내지 1.5, 바람직하게는 0.8 내지 1.2일 수 있다.
경우에 따라, 본 발명의 GH는 천연 공급원으로부터 추출될 수 있거나 재조합 생명공학기술에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 GH는 천연 공급원으로부터 추출되거나 재조합 생명공학기술에 의해 수득된, 서열번호 1의 서열을 가진 HuGH이다. 보다 바람직하게는, HuGH는 rHuGH이다. GH는 인공적으로 합성될 수 있거나, 이. 콜라이와 같은 원핵 시스템으로부터 발현될 수 있거나, 피키아 파스토리스와 같은 효모 시스템으로부터 발현될 수 있거나, 곤충 세포 시스템 또는 CHO와 같은 포유동물 세포 시스템으로부터 발현될 수 있다. 천연 또는 재조합 GH의 제조 방법 및 GH 및 PEG-수식된 생성물의 활성 시험은 당분야에 잘 공지되어 있다.
GH와 유사하게, 본 발명의 YPEG-GH 및 UPEG-GH는 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 동화작용 장애 및 성인 GH 결핍증의 치료, 및 노화 방지 치료를 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 YPEG-GH 및 UPEG-GH는 약학적 유효량의 YPEG-GH 또는 UPEG-GH 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적 유효량의 본 발명의 PEG-부착된 GH 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 투여량 또는 농도에서 상기 담체와 접촉되는 세포 또는 포유동물에 대해 독성을 나타내지 않는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 일반적으로, 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충제이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제, 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 저분자량의 폴리펩티드(10개 이하의 잔기를 가진 폴리펩티드), 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐 피롤리돈, 아미노산, 예컨대, 글리신, 아스파르테이트, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 모노사카라이드, 예컨대, 글루코스 및 만노스, 다른 사카라이드, 예컨대, 다이사카라이드 및 덱스트린 등, 킬레이터, 예컨대, EDTA, 당 알코올, 예컨대, 만니톨 및 소르비톨, 염 형성 반대-이온, 예컨대, 나트륨, 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(TWEEN), PEG 및 플루로닉스(PLURONICS)를 포함한다. 부형제는 바람직하게는 멸균된 것이고 일반적으로 유해 물질을 함유하지 않는다. 상기 조성물은 관용적인 멸균 기법을 이용하여 멸균할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 조성물은 만니톨, 아미노산, 염화나트륨, 아세트산 및 아세트산나트륨을 추가로 포함하고, 이때 상기 아미노산은 바람직하게는 라이신, 아스파르테이트, 아스파라긴 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GH 치료가 필요한 질환의 치료 및 노화 방지 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 PEG-부착된 GH 또는 본 발명의 PEG-부착된 GH를 포함하는 조성물의 용도를 또한 제공한다. 바람직하게는, GH 치료가 필요한 질환은 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 내인성 GH 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 GH 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 더 상세히 기재될 것이지만 하기 실시예의 임의의 실시예 또는 조합이 본 발명의 범위 및 실시양태를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다. 당업자라면 본 개시내용과 당분야의 선행 기술을 조합하여 특허청구범위에 의해 한정된 범위를 명확히 이해할 수 있다.
[실시예]
실시예 1
U-형 또는 Y-형 분지쇄 PEG에 의한 rHuGH의 수식
UPEG-NHS 및 YPEG-NHS(평균 분자량: 40 kD, 동등한-암(arm); 로트 번호 각각 ZZ004P182 및 ZZ004P167; 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드(Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)) 각각의 200 mg을 측량하여 2 ml의 2 mM HCl(광동 광후아 케미칼 팩토리 컴파니 리미티드(Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.))에 각각 용해시켰다. 50 mg의 rHuGH(시아멘 아모이톱 바이오테크 컴파니 리미티드(Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.)) 및 50 mM 붕산-보락스 완충제(pH 8.0)(시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드(Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.))를 최종 총 반응 부피 10 ml까지 각각 첨가하였다. 반응 시스템에서, rHuGH의 최종 반응 농도는 5 mg/ml이었고, PEG-NHS에 대한 rHuGH의 반응 몰비는 약 1:2이었다. 10℃ 미만의 온도에서 진탕하면서 2시간 동안 항온처리를 수행하고, 빙초산(산토우 실롱 케미칼 컴파니 리미티드(Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.))을 첨가하여 pH를 4.0 미만이 되게 함으로써 반응을 중단시켰다. SDS-PAGE용 샘플을 취하고, 가시화를 위해 은 염색을 이용하였다. SDS-PAGE 결과는 도 1에 나타나 있다. 도 1의 SDS-PAGE 결과로부터, pH 8.0에서 수식 생성물이 2개의 주요 밴드를 보이고, UPEG-NHS 및 YPEG-NHS에 의해 수식된 샘플들이 동일한 SDS-PAGE 전기영동 특징을 보임을 알 수 있다.
실시예 2
다양한 pH에서 U-형 및 Y-형 분지쇄 PEG에 의한 rHuGH의 수식
UPEG-NHS 및 YPEG-NHS(평균 분자량: 40 kD, 동등한-암; 로트 번호 각각 ZZ004P182 및 ZZ004P167; 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드) 각각의 200 mg을 측량하여 2 ml의 2 mM HCl(광동 광후아 케미칼 팩토리 컴파니 리미티드)에 각각 용해시켰다. 50 mg의 rHuGH(시아멘 아모이톱 바이오테크 컴파니 리미티드) 및 상응하는 완충제를 최종 총 반응 부피 10 ml까지 각각 첨가하였다. pH 6.0, 7.0 또는 8.0에서의 반응을 위해 상응하는 pH의 10 mM PBNa 완충제(시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드)를 사용하였고, pH 9.0, 9.5, 10.0 또는 10.5에서의 반응을 위해 상응하는 pH의 50 mM 보락스 완충제(시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드)를 사용하였다. 반응 시스템에서, rHuGH의 최종 반응 농도는 5 mg/ml이었고, PEG-NHS에 대한 rHuGH의 반응 몰비는 약 1:2이었다. 10℃ 미만의 온도에서 진탕하면서 2시간 동안 항온처리를 수행하고, 빙초산(산토우 실롱 케미칼 컴파니 리미티드)을 첨가하여 pH를 4.0 미만이 되게 함으로써 반응을 중단시켰다. SDS-PAGE용 샘플을 취하고, 가시화를 위해 은 염색을 이용하였다. 겔 가시화 시스템(모델 번호: FR-200, 상하이 푸리 사이언스 앤드 테크놀로지 컴파니 리미티드(Shanghai FURI Science & Technology Co., Ltd.))을 이용하여 전기영동 결과를 분석하였다. SDS-PAGE 전기영동 결과는 도 2 및 도 3에 나타나 있고, 겔 가시화 시스템의 분석 결과는 하기 표 1에 기재되어 있다. 전기영동 결과로부터, pH 6.0 내지 9.5에서 수식된 생성물들은 명백히 2개의 주요 밴드를 보이고, 반응 pH가 증가함에 따라 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드의 함량도 상응하게 증가함을 알 수 있다. pH 10.0 및 10.5에서 수식된 생성물들은 실질적으로 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드를 보인다. UPEG-NHS 및 YPEG-NHS에 의해 수식된 샘플들은 동일한 SDS-PAGE 전기영동 특징을 보인다.
Figure 112013026833011-pct00063
실시예 3
pH 6.0, 9.0 또는 10.5에서 단일 부위에서 U-형 또는 Y-형 분지쇄 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 제조, 세포 활성 및 분자량
1. 수식
UPEG-NHS 및 YPEG-NHS(평균 분자량: 40 kD, 동등한-암; 로트 번호 각각 ZZ004P182 및 ZZ004P167; 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드) 각각의 1200 mg 샘플 3개를 측량하여 12 ml의 2 mM HCl(광동 광후아 케미칼 팩토리 컴파니 리미티드)에 각각 용해시켰다. 300 mg의 rHuGH(시아멘 아모이톱 바이오테크 컴파니 리미티드) 및 50 mM 보락스 완충제(pH 10.5), 50 mM 붕산/보락스 완충제(pH 9.0) 또는 10 mM PBNa(pH 6.0)(시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드)를 최종 총 반응 부피 60 ml까지 각각 첨가하였다. 반응 시스템에서, rHuGH의 최종 반응 농도는 5 mg/ml이었고, PEG-NHS에 대한 rHuGH의 반응 몰비는 약 1:2이었고, 반응 pH는 각각 10.5, 9.0 및 6.0이었다. 10℃ 미만의 온도에서 진탕하면서 2시간 동안 항온처리를 수행하였고, 빙초산(산토우 실롱 케미칼 컴파니 리미티드)을 첨가하여 pH를 4.0 미만이 되게 함으로써 반응을 중단시켰다. SDS-PAGE용 샘플을 취하고, 가시화를 위해 은 염색을 이용하였다.
2. 정제
2.1. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 정제
rHuGH의 PEG 수식 샘플을 초정제수를 사용하여 3회 희석하고, 희석된 샘플의 pH를 NaOH 또는 HCl로 9.0으로 조절하였다.
2.1.1. rHuGH의 PEG 수식 샘플(pH 6.0)의 Q 세파로스 FF 크로마토그래피 정제
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리(Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory))은 φ18 mm x 400 mm이고, 컬럼 층의 부피(CV)는 61 ml이다. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 재생시키고, 5 CV의 20 mM 붕산/보락스 - 17 mM NaCl(pH 9.0, 용액 A)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 초정제수로 희석된 PEG-수식된 rHuGH 샘플을 3 ml/분의 유속으로 적재하고, 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 제1 피크가 완전히 검출될 때까지 용액 A를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출을 수행한 후, 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 100 mM NaCl(pH 9.0, 용액 B)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 이어서, 제3 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 200 mM NaCl(pH 9.0, 용액 C)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 제2 피크로부터 얻은 샘플을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 20 mM 붕산/보락스(pH 9.0)로 교체하였다.
2.1.2. rHuGH의 PEG 수식 샘플(pH 9.0 또는 10.5)의 Q 세파로스 FF 크로마토그래피 정제
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리)은 φ18 mm x 400 mm이고, Q 세파로스 FF 팩킹 물질(지이 헬쓰케어)의 팩킹 사양은 φ18 mm x 240 mm이고, 1 CV는 61 ml이다. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 재생시키고, 5 CV의 20 mM 붕산/보락스 - 17 mM NaCl(pH 9.0, 용액 A)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 초정제수로 희석된 PEG-수식된 rHuGH 샘플을 3 ml/분의 유속으로 적재하고, 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 제1 피크가 완전히 검출될 때까지 용액 A를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출을 수행한 후, 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 40 mM NaCl(pH 9.0, 용액 B)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 이어서, 제3 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 100 mM NaCl(pH 9.0, 용액 C)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하고, 제4 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 200 mM NaCl(pH 9.0, 용액 D)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 제3 피크로부터 얻은 샘플을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 20 mM 붕산/보락스(pH 9.0)로 교체하였다.
2.2. DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 정제
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리)은 φ18 mm x 400 mm이고, DEAE 세파로스 FF 팩킹 물질(지이 헬쓰케어)의 팩킹 사양은 φ18 mm x 235 mm이고, 1 CV는 60 ml이다.
DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 재생시키고, 3 CV의 20 mM 붕산/보락스(pH 9.0, 용액 A)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. Q 세파로스 FF로 정제된 PEG-rHuGH 샘플을 3 ml/분의 유속으로 적재하고, 3 CV의 용액 A를 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하고, 6 CV의 20 mM 붕산/보락스 - 30 mM NaCl(pH 9.0, 용액 B)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 제1 피크 및 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 100 mM NaCl(pH 9.0, 용액 C)을 사용하여 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 제2 피크로부터 얻은 샘플을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 mM PBNa(pH 8.5)로 교체하고 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 적절히 농축하였다.
2.3. Q 세파로스 FF 크로마토그래피를 사용한 정련된 정제
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리)은 φ25 mm x 400 mm이고, Q 세파로스 FF 팩킹 물질(지이 헬쓰케어)의 팩킹 사양은 φ25 mm x 200 mm이고, 1 CV는 98 ml이다.
Q 세파로스 FF 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 재생시키고, 3 CV의 5 mM PBNa(pH 8.5, 용액 A)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. DEAE 세파로스 FF로 정제된 PEG-rHuGH 샘플을 6 ml/분의 유속으로 적재하고, 3 CV의 용액 A를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 제1 피크가 완전히 검출될 때까지 5 mM PBNa - 90 mM NaCl(pH 8.5, 용액 B)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하고, 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 5 mM PBNa - 300 mM NaCl(pH 8.5, 용액 C)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 제1 피크로부터 얻은 샘플을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 3 mM NaAc/HAc - 7 mM NaCl - 5 mM Lys(pH 5.0)으로 교체하고, 만니톨을 최종 농도 45 mg/ml까지 보충하였다. 샘플을 0.2 ㎛ 여과를 통해 멸균하였다. SDS-PAGE 전기영동용 샘플을 취하고, 가시화를 위해 은 염색을 이용하였다. 남은 샘플을 -70℃에서 저장하였다. pH 6.0에서 수식된 수식 생성물을 Y6 또는 U6으로서 명명하고, 이때 보다 높은 겉보기 분자량의 밴드를 Y6-1 또는 U6-1로서 명명한 반면, 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드를 Y6-2 또는 U6-2로서 명명하였다. pH 9.0에서 수식된 수식 생성물을 Y9 또는 U9로서 명명하고, pH 10.5에서 수식된 수식 생성물을 Y10.5 또는 U10.5로서 명명하였다.
SDS-PAGE 결과는 도 4에 나타나 있다. 전기영동 결과로부터, pH 6.0에서 수식된 수식 생성물은 2개의 밴드를 명확히 보이지만, pH 10.5에서 수식된 수식 생성물은 80% 이상의 SDS-PAGE 함량으로 보다 낮은 겉보기 분자량의 밴드를 주로 보임을 알 수 있다.
3. 세포 활성
GH 국립 표준물을 대조군으로 사용하고 HuGH 의존성 래트 림프종 세포주 Nb2-11을 사용하여 PEG-rHuGH 샘플 각각의 세포 활성을 분석하였다.
Nb2-11 세포를 5 x 104 세포/ml의 최종 농도까지 희석하였다. GH 국립 표준물(로트 번호: 35-20002, 1 mg/ml/튜브, 3 IU/튜브, 국립 약품 및 생물학적 제품 규제 협회로부터 구입됨)을 100 ng/ml(0.0003 IU/ml)까지 예비-희석하고, 분석될 각각의 PEG-rHuGH 샘플을 예비-실험의 결과에 따라 0.0003 IU/ml까지 예비-희석하였다. 예비-희석을 기초로 하여, 샘플 각각을 1.5배 구배 희석 후 분석하였다. 샘플의 활성을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
Figure 112010063582830-pct00022
상기 식에서,
C1은 표준물의 절반-효과 양과 동등한, 분석될 샘플의 희석 배율이고;
C2는 절반-효과 표준물의 희석 배율이고;
D1은 분석될 샘플의 예비-희석 배율이고;
D2는 표준물의 예비-희석 배율이다.
분석 방법
(1) 대수증식기의 세포을 취하여 반복적으로 피펫팅하고 원심분리하고 세척하였다. 세포를 희석제에 재현탁하고 5 x 104 세포/ml의 농도로 조절하였다.
(2) 분석될 예비-희석된 샘플 각각은 세포 플레이트(96-웰 플레이트, 코닝) 상에서 각각 중복 구배 희석되었고(총 10 구배), 구배 각각에 대해 중복 웰을 만들었다(50 ㎕/웰). 양성 대조군을 동일한 방식으로 8 구배로 만들었다. 희석제를 음성 대조군으로 사용하였다.
(3) 세포를 100 ㎕/웰의 밀도로 첨가하고 CO2 항온처리기 내에 배치하고 37℃에서 약 70시간 동안 항온처리하였다. 알라마블루(AlamarBlue)(상표명) 용액(바이오소스(BioSource))을 30 ㎕/웰의 밀도로 첨가하고 1분 동안 진탕하면서 블렌딩하였다. 37℃의 CO2 항온처리기 내에서 5시간 동안 항온처리를 수행하였다. 실온에서 5분 동안 진탕한 후, 플레이트를 판독하였다(여기된 광 파장, 530 nm; 방출 광 파장, 590 nm).
(4) 4-파라미터 회귀 방법을 이용하여 표준물 및 분석될 샘플의 도표를 작성하였다. 분석될 샘플 각각의 역가를 표준물 및 분석될 샘플의 도표의 방정식에 따라 계산하였다.
세포 활성의 결과는 하기 표 2 및 도 5 및 6에 나타나 있다. 샘플 각각에 대해 중복 샘플을 분석하였다. pH 6.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(Y6)의 세포 비활성은 1.08 x 10-1 IU/mg이고, pH 9.0에서 수식된 생성물(Y9)의 세포 비활성은 1.66 x 10-1 IU/mg이고, pH 10.5에서 수식된 생성물(Y10.5)의 세포 비활성은 2.09 x 10-1 IU/mg이고, 이때 Y10.5의 세포 비활성은 Y6의 세포 비활성의 약 2배이다. pH 6.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(U6)의 세포 비활성은 8.85 x 10-2 IU/mg이고, pH 9.0에서 수식된 생성물(U9)의 세포 비활성은 1.42 x 10-1 IU/mg이고, pH 10.5에서 수식된 생성물(U10.5)의 세포 비활성은 1.82 x 10-1 IU/mg이고, 이때 U10.5의 세포 비활성은 U6의 세포 비활성의 약 2배이다. 수식 반응의 pH가 증가함에 따라, 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 생성물(2개의 주요 밴드)의 세포 활성도 상응하게 증가한다.
Figure 112013026833011-pct00064
4. MALDI-TOF MS에 의해 측정된 분자량
오토플렉스(Autoflex) III TOF/TOF 질량 분광계(브룩커, 독일 소재)를 사용한 MALDI-TOF MS 방법을 이용하여 PEG-rHuGH 샘플 각각의 분자량을 측정하였다. 신아핀산(SA, C11H12O5, 분자량 224.22, 로트 번호: 2006 236870 002, 브룩커)을 매트릭스로서 사용하였고, 브룩커로부터 구입한 단백질 보정 표준물 I(파트 번호 206355) 및 단백질 보정 표준물 II(파트 번호 207234)를 단백질 분자량 표준물로서 사용하였고, 분석 소프트웨어는 플렉스어날리시스(flexAnalysis) 버전 3.0.54.0.이었다. 결과는 도 7에 나타나 있다.
pH 6.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(Y6), pH 9.0에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(Y9) 및 pH 10.5에서 YPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(Y10.5)는 모두 단일 부위에서 YPEG에 의해 수식된 rHuGH의 이론적 분자량(YPEG-NHS의 분자량은 40 kD ± 10%임)과 일치하는 62012 달톤 ± 10% 범위 내의 MS 분자량을 갖는데, 이는 Y6, Y9 및 Y10.5가 단일 부위에서 YPEG에 의해 수식된 rHuGH 수식 생성물임을 시사한다. pH 6.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(U6), pH 9.0에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(U9) 및 pH 10.5에서 UPEG-NHS에 의해 수식된 rHuGH(U10.5)는 모두 단일 부위에서 UPEG에 의해 수식된 rHuGH 수식 생성물의 이론적 분자량(UPEG-NHS의 분자량은 40 kD ± 10%임)과 일치하는 62012 달톤 ± 10% 범위 내의 MS 분자량을 갖는데, 이는 U6, U9 및 U10.5가 단일 부위에서 UPEG에 의해 수식된 rHuGH 수식 생성물임을 시사한다.
실시예 4
pH 6.0에서 단일 부위에서 U-형 또는 Y-형 분지쇄 PEG에 의해 수식된 보다 높은 겉보기 분자량의 rHuGH 수식 생성물(Y6-1, U6-1)의 제조, 세포 활성 및 분자량 분석
1. 수식
UPEG-NHS 및 YPEG-NHS(평균 분자량: 40 kD, 동등한-암; 로트 번호 각각 ZZ004P182 및 ZZ004P167; 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드) 각각의 1200 mg 샘플 2개를 측량하여 12 ml의 2 mM HCl(광동 광후아 케미칼 팩토리 컴파니 리미티드)에 각각 용해시켰다. 300 mg의 rHuGH(시아멘 아모이톱 바이오테크 컴파니 리미티드) 및 10 mM PBNa(pH 6.0)(시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드)를 최종 총 반응 부피 60 ml까지 각각 첨가하였다. 반응 시스템에서, rHuGH의 최종 반응 농도는 5 mg/ml이었고, PEG-NHS에 대한 rHuGH의 반응 몰비는 약 1:2이었고, 반응 pH는 6.0이었다. 10℃ 미만의 온도에서 진탕하면서 2시간 동안 항온처리를 수행하고, 빙초산(산토우 실롱 케미칼 컴파니 리미티드)을 첨가하여 pH를 4.0 미만이 되게 함으로써 반응을 중단시켰다.
2. 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 보다 높은 겉보기 분자량의 생성물(Y6-1, U6-1)의 정제
2.1. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 정제
PEG(pH 6.0)에 의해 수식된 rHuGH 샘플을 초정제수를 사용하여 3회 희석하고, NaOH를 사용하여 pH를 9.0으로 조절하였다.
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리)은 φ25 mm x 500 mm이었고, Q 세파로스 FF 팩킹 물질(지이 헬쓰케어)의 팩킹 사양은 φ25 mm x 310 mm이었고, 1 CV는 152 ml이었다. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 재생시키고, 5 CV의 20 mM 붕산/보락스 - 17 mM NaCl(pH 9.0, 용액 A)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 초정제수로 희석된 PEG-수식된 rHuGH 샘플을 6 ml/분의 유속으로 적재하고, 제1 피크가 완전히 검출될 때까지 용액 A를 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 이어서, 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 100 mM NaCl(pH 9.0, 용액 B)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하고, 제3 피크가 완전히 검출될 때까지 20 mM 붕산/보락스 - 200 mM NaCl(pH 9.0, 용액 C)을 사용하여 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 제2 피크로부터 얻은 샘플을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 5 mM NaAc/HAc(pH 4.5)로 교체하였다.
2.2. 마크로캡 SP 크로마토그래피 정제
크로마토그래피 컬럼(산하이 진후아 크로마토그래피 이퀴프먼트 팩토리)은 φ12 mm x 300 mm이고, 마크로캡 SP 팩킹 물질(지이 헬쓰케어)의 팩킹 사양은 φ12 mm x 180 mm이고, 1 CV는 20 ml이다. 마크로캡 SP 크로마토그래피 컬럼을 0.5 M NaOH를 사용하여 1 ml/분의 유속으로 제자리에서 30분 동안 세정하고, 3 CV의 ddH2O를 사용하여 1 ml/분의 유속으로 용출하고, 3 CV의 1 M NaCl을 사용하여 1 ml/분의 유속으로 재생시키고, 5 CV의 5 mM NaAc/HAc(pH 4.5, 용액 A)을 사용하여 1 ml/분의 유속으로 용출하였다. Q 세파로스 FF로 정제된 PEG-rHuGH 샘플을 1 ml/분의 유속으로 적재하고, 3 CV의 용액 A를 사용하여 1 ml/분의 유속으로 용출하고, 5 mM NaAc/HAc - 100 mM NaCl(pH 4.5, 용액 B)을 5 CV로 사용하여 0 내지 30%의 구배로 1 ml/분의 유속으로 용출하고, 용액 B를 10 CV로 사용하여 30 내지 45% 구배로 용출한 후, 제1 및 제2 피크가 완전히 검출될 때까지 5 mM NaAc/HAc - 1 M NaCl(pH 4.5, 용액 C)을 사용하여 1 ml/분의 유속으로 용출하였다. 용출액을 280 nm에서 검출하였다(AKTA 베이직100, 지이 헬쓰케어). 30 내지 45% 용액 B의 구배로 용출하는 동안 5번째 CV와 8번째 CV 사이의 용출액을 표적 샘플로서 모았다. 표적 샘플의 완충 시스템을 5 K 한외필터(밀리포어, 폴리에테르설폰 물질)를 사용한 한외여과를 통해 3 mM NaAc/HAc - 7 mM NaCl - 5mM Lys(pH 5.0)으로 교체하고, 만니톨을 45 mg/ml의 최종 농도까지 보충하였다. 샘플을 0.2 ㎛ 여과를 통해 멸균하였다. SDS-PAGE 전기영동용 샘플을 취하고 가시화를 위해 은 염색을 이용하였다. 남은 샘플을 -70℃에서 저장하였다. 샘플 번호는 U6-1 및 Y6-1이었다. SDS-PAGE 전기영동의 결과는 도 8에 나타나 있고, SDS-PAGE 전기영동의 겉보기 분자량 결과는 도 9에 나타나 있다.
10 ㎍ PEG-rHuGH 샘플을 적재하는 경우, 1개 초과의 부위에서 수식된 생성물이 소량으로 PEG-rHuGH 샘플 각각에서 검출되었고, 샘플 각각 중의 기질 단백질(rHuGH)의 함량은 0.5%를 초과하지 않았고(도 8), 이때 주요 밴드의 함량은 80% 이상이다. SDS-PAGE 전기영동에 의해 측정된 PEG-rHuGH 샘플 각각의 겉보기 분자량은 1개의 주요 밴드를 보이고, 이때 Y6-1의 겉보기 분자량은 Y10.5의 겉보기 분자량보다 명백히 더 높고, U6-1의 겉보기 분자량은 U10.5의 겉보기 분자량보다 명백히 더 높다(도 9).
3. MALDI-TOF MS에 의해 검출된 분자량
오토플렉스 TOF/TOF 질량 분광계(브룩커, 독일 소재)를 사용한 MALDI-TOF MS 방법을 이용하여 PEG-rHuGH 샘플 각각의 분자량을 측정하였다. 검출 방법은 실시예 3에 기재된 방법과 동일하다. 결과는 도 7에 나타나 있다.
Y6-1 및 U6-1의 MS 분자량은 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 rHuGH의 이론적 분자량(YPEG-NHS 및 UPEG-NHS의 분자량은 40 kD ± 10%임)과 일치하는 62012 달톤 ± 10%의 범위 내에 있는데, 이는 Y6-1 및 U6-1 둘다가 단일 부위에서 PEG에 의해 수식된 생성물임을 시사한다.
4. 세포 활성 분석
GH 국립 표준물을 대조군으로서 사용하고 HuGH 의존성 래트 림프종 세포주 Nb2-11을 사용하여 PEG-rHuGH 샘플 각각의 세포 활성을 분석하고, Y6-1과 Y10.5의 세포 활성 차이 및 U6-1과 U10.5의 세포 활성의 차이를 비교하였다. 분석 방법은 실시예 3에 기재된 방법과 동일하다. 결과는 하기 표 3에 나타나 있다(샘플 각각에 대해 3회 반복).
Y10.5의 평균 세포 비활성은 2.08 x 10-1 IU/mg이고, Y6-1의 평균 세포 비활성은 5.50 x 10-2 IU/mg이고, U10.5의 평균 세포 비활성은 2.28 x 10-1 IU/mg이고, U6-1의 평균 세포 비활성은 5.00 x 10-2 IU/mg이다. Y10.5/U10.5의 평균 세포 비활성은 Y6-1/U6-1의 평균 세포 비활성보다 명백히 더 높고, Y6-1/U6-1의 평균 세포 비활성의 3배까지 도달할 수 있다.
Figure 112013026833011-pct00065
실시예 5
YPEG-rHuGH(10.5) 및 UPEG-rHuGH(U10.5)의 생체내 생물학적 활성 분석
뇌하수체가 제거된 래트를 동물 모델로 사용하여, YPEG-rHuGH(Y10.5) 및 UPEG-rHuGH(U10.5)의 생체내 동물 성장 촉진 생물학적 활성을 문헌(Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P)에 기재된 GH 생체분석에 따라 분석하였다. 즉, 1회 투여로부터 1주일 후 뇌하수체가 제거된 래트(내인성 GH가 없음)의 성장 및 발달에 대한 효과를 관찰하였다.
국립 약품 및 생물학적 제품 규제 협회의 실험 동물 센터에 의해 제공된 위스타 래트(SPF 등급, 수컷, 26 내지 28일령, 체중 60 내지 80 g)(동물 인증 번호: SCXK(Jing)2005-0004)를 사용하였다. 실험 개시 2 내지 3주 전, 래트의 뇌하수체를 무균 상태에서 수술로 제거한 후, 래트를 S-2 실험실에 정상적으로 배치하여 추가 실험을 위해 회복시켰다. 뇌하수체가 제거된 적격의 래트를 선택하여 체중에 따라 10마리의 래트로 구성된 10개의 군으로 균등하게 나누었다. 구체적으로, 상기 군은 다음과 같다: 음성 대조군(블랭크 용매 군); 양성 대조군 rHuGH(국립 약품 및 생물학적 제품 규제 협회에 의해 제조된 GH 국립 표준물, 3 IU/㎎/튜브); 1일 당 1회씩 6회 연속 투여된 저 투여량 군(2.7 IU/kg), 중간 투여량 군(5.3 IU/kg) 및 고 투여량 군(10.7 IU/kg); 시험 샘플 Y10.5의 저 투여량 군(2.7 IU/kg), 중간 투여량 군(5.3 IU/kg) 및 고 투여량 군(10.7 IU/kg); 표준물이 투여되는 제1일에 1회 단일 투여되는 시험 샘플 U10.5의 저 투여량 군(2.7 IU/kg), 중간 투여량 군(5.3 IU/kg) 및 고 투여량 군(10.7 IU/kg). Y10.5 및 U10.5를 3 IU/mg의 추정된 역가에 따라 제제화하였다. 투여는 0.5 ml를 동물의 목에 피하 주사함으로써 수행하였다. 음성 대조군은 1일 당 1회 총 6회 투여된 용매뿐이었다. 양성 대조군에서 마지막 투여로부터 24시간 경과 후 래트를 희생시키고, 체중 및 경골 성장판의 폭을 측정하였다. 문헌(Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P)에 기재된 GH 분석 및 문헌(Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XIV)에 기재된 생물학적 분석을 위한 통계 방법에 따라 데이터를 처리하였다.
YPEG-rHuGH(Y10.5)의 생물학적 역가는 5.0 IU/mg이고, UPEG-rHuGH(U10.5)의 생물학적 역가는 5.2 IU/mg이고, 상기 역가 둘다 정상 rHuGH의 1.5배보다 더 높다. YPEG-rHuGH(Y10.5) 또는 UPEG-rHuGH(U10.5)의 단일 투여는 동물에서 신체 성장을 촉진하기 위한 보다 높은 생물학적 활성, 및 매일 주사된 rHuGH의 합계보다 더 긴 약효를 나타낸다.
실시예 6
게잡이 원숭이에서 YPEG-rHuGH(Y10.5)의 혈청 약물 대사 반감기
체중이 3.24 내지 5.48 kg인 6마리(3마리 암컷 및 3마리 수컷)의 게잡이 원숭이를 선택하였다(광시 베이하이 유 퀴 익스페리먼트 애니멀 테크놀로지 컴파니 리미티드, 동물 인증 번호: SCXK(Gui)2005-0005). 실험은 3마리의 게잡이 원숭이로 구성된 2개의 군을 포함하였다: 300 ㎍/kg의 YPEG-rHuGH(Y10.5)를 단일 투여로 피하 주사한 1개의 군(2마리 수컷, 1마리 암컷) 및 300 ㎍/kg의 rHuGH(사이젠(Saizen), 레보레이토리스 세로노 에스.에이.(Laboratoires Serono S.A.), 스위스 소재)를 단일 투여로 피하 주사한 다른 군(1마리의 수컷, 2마리의 암컷). 투여 후, 주사한 쪽과 반대쪽에 위치한 뒷다리로부터 정맥혈을 규칙적으로 채취하고, 혈청을 분리하였다. 알 앤드 디(R&D)로부터 구입한 HuGH ELISA 키트를 사용하여 ELISA를 통해 혈중 약물 농도를 분석하고, 혈중 약물 농도의 곡선을 작도하여 약물 대사 반감기를 계산하였다. 결과는 도 10에 나타나 있다.
300 ㎍/kg의 양으로 YPEG-rHuGH(Y10.5)를 게잡이 원숭이에개 피하 주사한 후, 혈청 중의 약물 농도의 시간-대-피크는 8 내지 24시간이다. 약물은 서서히 제거되었다. 혈청 중의 평균 약물 대사 반감기는 41.33시간이다. 300 ㎍/kg의 rHuGH(사이젠)를 게잡이 원숭이에게 피하 주사한 후, 혈청 중의 약물 농도의 시간-대-피크는 1 내지 2시간이고, 농도는 24시간까지 투여 전 수준으로 감소한다. 약물 제거는 YPEG-rHuGH(Y10.5)보다 명확히 더 빠르다. 혈청 중의 평균 약물 대사 반감기는 1.80시간이다. YPEG-rHuGH(Y10.5)의 혈청 중의 평균 약물 대사 반감기는 rHuGH의 혈청 중의 평균 약물 대사 반감기의 20배 보다 더 길다.
<110> Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. <120> Double-stranded polyethylene glycol modified growth hormone, preparation method and application thereof <130> P2007466C <140> PCT/CN2008/000674 <141> 2008-04-03 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

Claims (47)

  1. a) pH가 6.0 이상인 용액 중에서, U-형 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG를 인간 성장 호르몬과 접촉시키는 단계;
    b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 비-환원 조건 하에서 적절한 농도의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 분석하는 단계로서, 이때 상기 생성물이 2개의 밴드를 나타내는 단계;
    c) 상기 2개의 밴드에서, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 분리하고 회수하는 단계; 및
    경우에 따라, 회수된 생성물을 정제하는 단계
    를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-부착된 성장 호르몬의 제조 방법으로서,
    이때 U-형 분지쇄 이중-가닥 PEG는 하기 화학식 IV의 화합물이거나, Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG는 하기 화학식 III의 화합물인, 제조 방법:
    화학식 IV
    Figure 112014116136917-pct00066

    [상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    n 및 n'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
    n+n'는 600 내지 1500이고;
    U-형 분지쇄 PEG의 평균 분자량은 26 내지 66 kD이다]
    화학식 III
    Figure 112014116136917-pct00067

    [상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
    j는 1 내지 12의 정수이고;
    Y-형 분지쇄 PEG의 평균 총 분자량은 26 내지 60 kD이다].
  2. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 7.0 이상인, 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 8.0 이상인, 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 9.0 이상인, 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 9.5 이상인, 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 10.0 이상인, 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (a)의 pH가 10.5인, 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    성장 호르몬 대 이중-가닥 PEG의 몰비가 1:2인, 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (b)에서의 SDS-PAGE가 12% SDS-PAGE인, 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    R 또는 R'가 메틸인, 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    m+m'가 600 내지 1500인, 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    m+m' 또는 n+n'가 910인, 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    U-형 분지쇄 이중-가닥 PEG 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG의 평균 총 분자량이 40 kD인, 제조 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    U-형 분지쇄 이중-가닥 PEG 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG가 동등한-암(arm)을 가진 것인, 제조 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    회수된 생성물을 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는, 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    겔 크로마토그래피가 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피인, 제조 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    인간 성장 호르몬이 천연 공급원으로부터 추출되거나 재조합 생명공학기술에 의해 수득되는, 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    인간 성장 호르몬이 서열번호 1의 서열로 구성되는, 제조 방법.
  19. a) pH가 9.0 또는 10.5인 용액 중에서, 하기 화학식 III의 이중-가닥 PEG를 서열번호 1의 서열로 구성된 인간 성장 호르몬과 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 성장 호르몬 대 이중-가닥 PEG의 몰비가 1:2인, 단계;
    b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 비-환원 조건 하의 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계로서, 이때 상기 생성물이 2개 밴드를 나타내는, 단계; 및
    c) 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피를 이용하여 분리하고 회수하는 단계
    를 포함하는 PEG-부착된 성장 호르몬의 제조 방법:
    화학식 III
    Figure 112014116136917-pct00068

    [상기 식에서,
    m+m'는 910이고;
    이중-가닥 PEG의 평균 총 분자량은 40 kD이고;
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    j는 1 내지 12의 정수이다]
  20. a) pH가 8.0 이상인 용액 중에서, U-형 또는 Y-형 분지쇄 이중-가닥 PEG를 인간 성장 호르몬과 접촉시키는 단계;
    b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 비-환원 조건 하의 적절한 농도의 SDS-PAGE에서 분석하는 단계로서, 이때 상기 생성물이 2개의 밴드를 나타내는, 단계; 및
    c) 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 분리하고 회수하는 단계로서, 이때 회수된 생성물이 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물을 함유하는 혼합물이고, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 70% 이상인, 단계; 및
    를 포함하고, 경우에 따라, 정제 단계를 포함하는 PEG-부착된 성장 호르몬 제제의 제조 방법으로서,
    이때 Y-형 분지쇄 PEG는 하기 화학식 III의 화합물이거나, U-형 분지쇄 PEG는 하기 화학식 IV의 화합물인, 제조 방법:
    화학식 III
    Figure 112014116136917-pct00069

    [상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    m 및 m'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
    j는 1 내지 12의 정수이고;
    Y-형 분지쇄 PEG의 평균 총 분자량은 26 내지 60 kD이다]
    화학식 IV
    Figure 112014116136917-pct00070

    [상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    n 및 n'는 중합의 정도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고;
    n+n'는 600 내지 1500이고;
    U-형 분지쇄 PEG의 평균 분자량은 26 내지 66 kD이다]
  21. 제20항에 있어서,
    (a)의 pH가 9.0 이상인, 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    (a)의 pH가 9.5 이상인, 제조 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    (a)의 pH가 10.0 이상인, 제조 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    (a)의 pH가 10.5인, 제조 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    성장 호르몬 대 이중-가닥 PEG의 몰비가 1:2인, 제조 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    SDS-PAGE가 12% SDS-PAGE인, 제조 방법.
  27. 제20항에 있어서,
    단일 부위에서 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 80% 이상인, 제조 방법.
  28. 제20항에 있어서,
    단일 부위에서 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 90% 이상인, 제조 방법.
  29. 제20항에 있어서,
    겔 정제가 겔 크로마토그래피에 의해 수행되는, 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    겔 크로마토그래피가 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피인, 제조 방법.
  31. 제20항에 있어서,
    R 또는 R'가 메틸인, 제조 방법.
  32. 제20항에 있어서,
    m+m'가 600 내지 1500인, 제조 방법.
  33. 제20항에 있어서,
    m+m' 또는 n+n'가 910인, 제조 방법.
  34. 제20항에 있어서,
    U-형 분지쇄 PEG 또는 Y-형 분지쇄 PEG의 평균 총 분자량이 40 kD인, 제조 방법.
  35. 제20항에 있어서,
    U-형 분지쇄 PEG 또는 Y-형 분지쇄 PEG가 동등한-암(arm)을 가진 것인, 제조 방법.
  36. a) pH가 9.0 또는 10.5인 용액 중에서, 하기 화학식 III의 이중-가닥 PEG를 인간 성장 호르몬과 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 성장 호르몬 대 이중 가닥 PEG의 몰비가 1:2이고, 인간 성장 호르몬은 서열번호 1의 서열로 구성되고, 상기 이중-가닥 PEG의 평균 총 분자량이 40 kD인, 단계:
    b) 단계 a)에서 수득된, 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 비-환원 조건 하의 12% SDS-PAGE에서 분석하는 단계; 및
    c) 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된 생성물을 Q 세파로스 FF 크로마토그래피, DEAE 세파로스 FF 크로마토그래피 또는 마크로캡 SP 크로마토그래피를 이용하여 분리하고 회수하는 단계로서, 이때 단일 부위에서 상기 이중-가닥 PEG에 의해 수식된, 회수된 생성물 중에서 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 70% 이상인, 단계
    를 포함하는 PEG-부착된 성장 호르몬 제제의 제조 방법:
    화학식 III
    Figure 112014116136917-pct00071

    [상기 식에서,
    m+m'는 910이고;
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    j는 1 내지 12의 정수이다]
  37. 제36항에 있어서,
    단일 부위에서 이중-가닥 PEG에 의해 수식된, 회수된 생성물 중에서 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 80% 이상인, 제조 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    단일 부위에서 이중-가닥 PEG에 의해 수식된, 회수된 생성물 중에서 보다 낮은 겉보기 분자량의 생성물의 SDS-PAGE 함량이 90% 이상인, 제조 방법.
  39. 제20항에 있어서,
    인간 성장 호르몬이 천연 공급원으로부터 추출되거나 재조합 생명공학기술에 의해 수득되는, 제조 방법.
  40. 제20항에 있어서,
    인간 성장 호르몬이 서열번호 1의 서열로 구성되는, 제조 방법.
  41. 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 내인성 성장 호르몬 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 성장 호르몬 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 치료하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 또는 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 제제의 약학적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  42. 제41항에 있어서,
    만니톨, 아미노산, 염화나트륨, 아세트산 및 아세트산나트륨을 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 제42항에 있어서,
    아미노산이 아스파르테이트, 아스파라긴, 라이신 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  44. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 또는 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 제제의 치료 유효량을 인간을 제외한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 성장 호르몬 치료 또는 노화 방지 치료가 필요한 질환을 앓는, 인간을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 성장 호르몬 치료가 필요한 질환은 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 내인성 성장 호르몬 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 성장 호르몬 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  45. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 또는 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 PEG-부착된 성장 호르몬 제제의 약학적 유효량을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 인간을 제외한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 성장 호르몬 치료 또는 노화 방지 치료가 필요한 질환을 앓는, 인간을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 성장 호르몬 치료가 필요한 질환은 왜소증, 화상, 상처, 골절, 출혈성 궤양, 신부전, AIDS, 내인성 성장 호르몬 결핍 왜소증, 터너 증후군, 동화작용 장애 및 성인 성장 호르몬 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    조성물이 만니톨, 아미노산, 염화나트륨, 아세트산 및 아세트산나트륨을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    아미노산이 아스파르테이트, 아스파라긴, 라이신 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
KR1020107022013A 2008-04-03 2008-04-03 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도 KR101521674B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2008/000674 WO2009121210A1 (zh) 2008-04-03 2008-04-03 双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110014564A KR20110014564A (ko) 2011-02-11
KR101521674B1 true KR101521674B1 (ko) 2015-05-19

Family

ID=41134798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107022013A KR101521674B1 (ko) 2008-04-03 2008-04-03 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9840546B2 (ko)
EP (1) EP2272875B1 (ko)
JP (1) JP5458416B2 (ko)
KR (1) KR101521674B1 (ko)
CN (1) CN101809038B (ko)
AU (1) AU2008353850B2 (ko)
BR (1) BRPI0822530B1 (ko)
CA (1) CA2720306C (ko)
DK (1) DK2272875T3 (ko)
ES (1) ES2453946T3 (ko)
MX (1) MX2010010953A (ko)
PL (1) PL2272875T3 (ko)
PT (1) PT2272875E (ko)
RU (1) RU2488598C2 (ko)
WO (1) WO2009121210A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0822530B1 (pt) 2008-04-03 2022-03-22 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por peg), hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu uso, preparação de hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu método de preparação e composição
US10047623B2 (en) * 2014-12-17 2018-08-14 United Technologies Corporation Compliant seal assembly and method of operating
CN107446908A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 湖南华腾制药有限公司 分支型聚乙二醇修饰的l‑门冬酰胺酶及其制备方法
CN114539384B (zh) * 2020-11-19 2024-09-06 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用
CN114740108B (zh) * 2022-03-28 2023-07-14 天津键凯科技有限公司 一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法
CN115845079B (zh) * 2022-11-24 2023-07-18 武汉禾元生物科技股份有限公司 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
RU2158603C2 (ru) * 1994-05-31 2000-11-10 Амген Инк. Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
MX9605082A (es) * 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
CA2395254C (en) * 1999-12-24 2010-05-11 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
US7026440B2 (en) * 2001-11-07 2006-04-11 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
HUP0500997A2 (en) * 2001-11-20 2007-11-28 Pharmacia Corp Chemically-modified human growth hormone conjugates
AU2003221291A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-22 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophilic polymer derivate with y type branch and preparation method of it medical composite comprising above compound
CN1477126A (zh) 2002-07-22 2004-02-25 长春金赛药业有限责任公司 长效生长激素及药物组合物
MXPA05005178A (es) * 2002-11-15 2005-07-22 Hoffmann La Roche Isomeros posicionales del interferon alfa 2a (ifn) pegilado con una porcion de polietilenglicol grande (peg).
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US20050281778A1 (en) * 2003-03-28 2005-12-22 Myung-Ok Park Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
JP2011507913A (ja) * 2007-12-29 2011-03-10 バイオスティード ジーン エクスプレッション テック． カンパニー リミテッド Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用
BRPI0822530B1 (pt) 2008-04-03 2022-03-22 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por peg), hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu uso, preparação de hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu método de preparação e composição

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER

Also Published As

Publication number Publication date
DK2272875T3 (da) 2014-03-31
WO2009121210A1 (zh) 2009-10-08
JP2011516429A (ja) 2011-05-26
EP2272875A1 (en) 2011-01-12
PT2272875E (pt) 2014-04-28
MX2010010953A (es) 2011-04-21
AU2008353850A1 (en) 2009-10-08
CA2720306A1 (en) 2009-10-08
EP2272875A4 (en) 2011-08-31
RU2010136327A (ru) 2012-05-10
US20110028388A1 (en) 2011-02-03
US9840546B2 (en) 2017-12-12
PL2272875T3 (pl) 2014-06-30
BRPI0822530A2 (pt) 2020-08-18
BRPI0822530B1 (pt) 2022-03-22
AU2008353850B2 (en) 2014-08-21
EP2272875B1 (en) 2014-01-15
CA2720306C (en) 2016-03-15
JP5458416B2 (ja) 2014-04-02
ES2453946T3 (es) 2014-04-09
CN101809038B (zh) 2013-10-30
KR20110014564A (ko) 2011-02-11
CN101809038A (zh) 2010-08-18
RU2488598C2 (ru) 2013-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101405019B (zh) 一种治疗肿瘤的药物及其应用
KR100593143B1 (ko) 에리트로포이에틴 컨쥬게이트
RU2485134C2 (ru) Интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение препарата и его применение
US9867869B2 (en) Insulin derivatives for diabetes treatment
CZ298597B6 (cs) Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid
KR101521674B1 (ko) 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도
JP2011507913A (ja) Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用
KR100507796B1 (ko) 생체내 반감기가 증가된 ｐｅｇ-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
KR101483814B1 (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도
KR101104574B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도
CN105085657A (zh) 一种干扰素突变体及聚乙二醇衍生物
RU2607527C2 (ru) Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения
RU2575796C2 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение
KR20040066712A (ko) 인간 성장 호르몬의 결합체
CN101385858A (zh) 纯化的peg化人生长激素缀合物及其药物制剂

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180502

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190508

Year of fee payment: 5