KR20010102514A - 알레르기성 질환 치료용 제이에이케이-3 억제제 - Google Patents

Abstract

알레르기 치료용 JAK-3 키나제의 억제제는 비만 세포 과립감소 및 조정자 방출을 억제한다.

Description

알레르기성 질환 치료용 제이에이케이-3 억제제{JAK-3 inhibitors for treating allergic disorders}

전사의 신호 변환체 및 활성화체(STAT)는 다발성 세포 집단의 시토킨 자극 유전자 발현을 조정하는 다면작용성 전사인자이다[참조문헌: D. A. Levy, Cytokine Growth Factor Rev., 8:81(1997)]. 모든 STAT 프로테인은 DNA 결합 영역, Src 상동 2(SH2) 영역, 및 타겟 유전자 발현의 전사 활성화에 필요한 트랜스액티베이션 (transactivation) 영역을 포함한다. JAK1, JAK2, Tyk 및 JAK3을 포함하여 야누스 키나제(JAK)는 SH2 영역 가까이의 특이성 티로신 잔기에 대한 티로신 인산화 반응을 통해 STAT 프로테인의 세포질 잠복 형태를 활성화함으로써 시토킨 자극 시그널링 이벤트의 개시에 중요한 역할을 하는 세포질 프로테인 티로신 키나제(PTKs)이다 [참조문헌: J. N. Ihle et al., Trends Genet., 11: 69(1995); J. E. Darnell et al., Science, 265: 1415(1994); J. A. Johnston et al., Nature, 370: 1513(1994)]. 티로신 인산화 STAT 프로테인은 특정한 상호 SH2-포스포티로신 상호작용을 통해 이량화하고, 세포질로부터 이들의 촉진제의 반응 원소에 결합함으로써특정 타겟 유전자의 전사를 자극하는 핵으로 전좌시킨다[참조문헌: W. J. Leonard. Nature Medicine, 2: 968(1996); Z. Zhong et al., PNAS USA, 91: 4806(1994) Darnell et al., Science, 264: 1415(1994)].

JAK 패밀리의 4개의 멤버 중에서, JAK3은 JAK3 결핍 마우스의 면역계통의 T세포 구획 뿐만 아니라 B 세포의 정성적 및 정량적 결핍[참조문헌: T. Nosaka et al., Science, 270: 800(1995); D. C. Thomas et al., Science, 270: 794(1995)] 및 JAK3 결핍 환자의 심각한 복합된 면역결핍 현상[참조문헌: R. H. Buckley et al., J. Pediatr., 130: 379(1997)]에 의해 명백한 바와 같이, 림프구양 세포에서 풍부하게 발현되어, 정상적인 림프구 발육 및 기능에 중요한 역할을 한다. 림프구양 세포 이외에도, 단구, 거핵구, 내피세포, 암세포, 및 본 명세서에 기재된 바와 같이, 비만 세포를 포함하여 비림프구양 세포도 JAK3를 발현하나, 이들 림프구양 세포 집단의 JSK3의 생리 기능에 관하여 현재 이용할 수 있는 정보는 없다[참조문헌: D. C. Thomas et al., Curr. Opin. Immunol., 9: 541(1997); J. N. Hile Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci., 351: 159(1996); J. W. Verbsky et al., J. Biol. Chem., 271: 13976(1996)].

JAK-3은 사람 염색체 19p12-13.1에 위치한다. 유전자 암호화 원종양 형성 유전자 및 전사 인자의 클러스터는 또한 이 부위 가까이에 위치한다. JAK-3 발현은 B 세포 전구체 및 성숙한 B 세포에서 입증되었다. JAK-3의 생리적 역할은 마우스의 타겟된 유전자 파괴 연구, 심각한 복합 면역결핍증 환자의 유전적 분석, 및 세포계의 JAK-3의 생화학적 연구를 통해 입증되었다. 넓은 범위의 자극으로, 인터루킨 7및 인터루킨 4를 포함하여 B 세포에서의 JAK-3 활성화를 가져온다. B 세포 마커 CD40는 JAK-3과 구성상 결합하며, CD40의 결찰에 의해 JAK-3 활성화를 가져오는데, CD40로 조절되는 유전자 발현에 대하여 필수적인 것으로 나타났다. JAK-3의 구성상 활성은 v-abl로 변형된 프리 B 세포에서 관찰되었고, 상호 면역침강 (coimmunoprecipitation)은 v-abl 가 V-abl로 유도된 세포 변형에서의 JAK-3을 포함하여 JAK-3과 물리적으로 결합되어 있는 것을 보여준다.

잠재적으로 치명적인 결과를 갖는 아나필랙시스를 포함하여 직접(타입Ⅰ) 과민성 반응으로서 공지된 급성 알레르기 반응은 3개의 주부류의 선염증성 (proinflammatory) 조정자, 즉 미리 형성된 과립과 관련된 생물활성 아민(예: 히스타민, 세로토닌) 및 산 가수분해 효소(예: β- 헥소사미니다제), 새로이 합성된 아라키돈산 대사산물[예: 루코트리인(LT) C₄, 프로스타글란딘 D₂, 및 혈소판 활성화 인자], 및 다수의 선염증성 혈관 작용 시토킨(예: 종양 괴사 인자[TNF]α, 인터루킨-6[IL-6])에 의해 유발된다[참조문헌: R. Malavija et al., J. Biol. Chem. 268:4939(1983); S. J. Galli et al., N. Eng. J. Med., 328: 257(1993)]. 이들 선염증성 조정자는 이들의 고 친화성 세포 표면 IgE 수용체/FcεRI의 항원으로 조정되는 가교를 통해 활성화시에 증감된 비만 세포로부터 방출된다[참조문헌: M. J. Hamany et al., Cellular Signaling, 7: 1535(1995); A. M. Scharenberg et al., Clin. Immunol., G. Marone ed., Basel, Karger(1995) at p.72)]. IgE 수용체/FcεRI는 α, β, 및 동종 이량체 γ쇄를 갖는 다중 결합 수용체이다[참조문헌: U. Blank et al., Nature, 337, 187(1989)]. IgE 수용체/FcεRI의 β 및 γ서브유닛은 이들의 SH2 영역을 통해 프로테인 티로신 키나제(PTK) 및 PTK 기질과 상호작용하는 ITAMs(ImmunoreceptorTyrosine-basedActivationMotifs)를 포함한다[참조문헌: N. Hirasawa et al., J. Biol. Chem., 270: 10960(1995)]. 항원에 의한 IgE 수용체의 속박은 다발성 PTK의 활성화를 포함하여 생화학적 신호 변환 이벤트의 캐스케이드를 유발한다[참조문헌: S. E. Lavens-Philips et al., Inflamm. Res., 47: 137 (1998)]. PTK의 활성화 및 차후의 이들의 다운스트림 기질의 티로신 인산화 반응은 타입 Ⅰ 과민성 반응의 병리 생리학에 관련되어 있다[참조문헌: K. Moriya et al., PNAS USA 94: 12539(1997) Costello et al., 13: 2595(1996)].

알레르기 치료는 일반적으로 3개의 가능한 성분, 1) 특히 소아의 경우에 매우 상이할 수 있는 알레르겐의 회피 또는 노출 감소, 2) 몇몇 알레르겐에 대해서만 작용하고 자주 효과가 없는 알레르겐 면역요법, 및 3)가장 효과적인 치료인 약물 요법을 목표로 삼고 있다. 알레르기 약물 치료는 비만 세포로부터 히스타민과 같은 화학 제품으로 인한 알레르기의 방출이 방지되거나, 조직에 대한 히스타민의 응답을 정지시켜야 한다. 가장 최근에 이용할 수 있는 약물 치료는 안티히스타민이다. 대개 알레르기 및 천식의 경우에는, 의사는 로라이티딘(Claratin), 펙소페니딘(Allegra) 또는 자피르루카스트(Accolate) 및 질루트론(Zyflo) 등의 루커트리엔 합성 억제제와 같은 제 2 발생 안티히스타민을 처방한다. 기도가 다수의 염증성 세포에 의해 생성된 루코트리엔에 훨씬 더 민감하기 때문에, 안티루코트리엔제는 통상 천식 상태에 훨씬 더 효과적이다.

제 2 발생 안티히스타민이 오래된 것(Benadryl 및 Chlortrimeton)으로서 효과적이지만, 이들은 2개의 잠재적인 문제점을 갖는다. 첫째로, 이들 약물은 체내의 비만 세포에 의해 방출되는 히스타민의 효과를 다만 방해하는데, 이들은 많지만 전부가 아닌 알레르기의 증후의 원인이다. 따라서, 안티히스타민은 가려움, 재채기, 및 코 분비를 감소하는데 매우 효과적이나, 코가 채워지고 상 알레르기 반응을 느리게 하는 것을 제저하지는 않는다. 루코트리엔 등의 히스타민 이외의 다수의 염증성 조정자 및 다수의 혈관 작용 시토킨은 또한 비만 세포 및 호염기성 세포에 의해 방출된다. 이들 염증성 조정자는 안티히스타민에 의해 영향을 받지 않은 채로 있으며, 알레르기 및 천식의 병리 생리학에 상당히 기여한다. 때때로, 안티알레르기 및 염증성 약물의 조합으로 더욱 양호하게 작용하지만, 동시에 이들 조합으로 불리한 부작용을 일으킨다. 둘째로, 훨씬 더 심각한 알레르기 반응(아나필랙시스)에 있어서는, 안티히스타민은 치료 효과를 갖지 않는다.

최근까지는, 천식 치료는 약물 테오필린에 기초하였다. 이 약물은 탁월하고오랜 사용으로 입증되고 보증된 약물이나, 다수의 부작용을 갖고 있었다. 1980년대에, 단시간에 작용하는 베타아드레날린 화합물이 소개되었다. 1990년대에는 천식 치료의 변화로, 천식 환자는 코르토코스테로이드, 크로몰린 및 테오필린을 상이한 조합으로 복용하기 시작했다. 최근에는 3개의 안티루코트리엔 약물, 아콜레이트(Accolate), 지플로(Zyflo) 및 싱걸러(Singulair)가 천식 치료를 위해 미국 시장에 소개되었다. 이러한 약물 치료는 루코트리엔(Zylec)의 방출을 차단하거나 조직에 대한 이들의 효과를 차단한다(Accolate). 각각은 1일 2 내지 4회로 정제 형태로 복용할 수 있다. 루코트리엔 억제제가 알레르기 또는 천식 반응의 초기 상을 억제하지 않더라도, 이들은 폐기능 및 천식 증후를 향상시키고 기관지 과반응성을 줄임으로써 베타 주동근의 요건을 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

치료에 있어서의 상술한 진보에도 불구하고, 최근에 아나필랙시스 및 다른 알레르기 반응을 포함하여 직접(타입 Ⅰ) 과민성 반응을 예방하거나 줄이는데 유용한 치료제 및 치료방법이 요구되고 있다.

본 발명은 JAK-3 티로신 키나제를 억제하기 위한 조성물 및 방법, 및 야누스 키나제 3(JAK3)의 억제제를 투여함으로써 알레르기성 질환의 치료에 관한 것이다.

도 1a∼도 1c에 있어서, 도 1a는 프로테인(블루) 및 접촉(ATP 결합) 부위(옐로)의 분자 표면을 나타내는 JAK3 키나제 영역의 모델이고,

도 1b는 JAK3 키나제 영역의 상동 모델의 리본 대표도(Ca 백본(backbone))이고, WHI-P131 분자는 JAK3의 접촉 부위에서 모델을 채우는 공간으로서 도시된다.

도 1c는 도킹(dock)된 억제제, WHI-P131(그린)를 갖는 JAK3 모델의 접촉 부위의 클로즈업도이다. 잔기 및 억제제는 공간을 채우는 원자로서 나타낸다. 접촉 부위의 용매 노출 개구는 비교적 평면상의 억제제가 JAK3에 인입되어 결합되는 치수를 갖는다. 포켓의 개구는 잔기 Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828, 및 Try904(블루 잔기)로 형성된다. 포켓 내의 먼 쪽의 깊은 벽은 Leu905(백본 부위), Glu903, Met902, Lys905, 및 Asp967(핑크 잔기)와 일렬로 늘어서 있고, 포켓의 플로어는 Leu905(측쇄부), Val884, Leu956, 및 Ala966(옐로 잔기)로 늘어서 있다. 포켓의 루프를 형성하는 잔기는 Leu828, Gly829, Lsy 830, 및 Gly 831(최상 블루 잔기)를 포함한다. 인사이트(Insight)Ⅱ 프로그램을 이용하여 제조한다.

도 2a∼도 2c에 있어서, 도 2a는 JAK3 상동 모델의 접촉(ATP 결합) 부위의 비어 있는 공간의 모델이다. 그린으로 나타낸 것은 ATP의 결합 부위이고, 디메톡시퀴나졸린 억제제에 대해서는 가장 적당한 결합 부위이다. 그린 키나제 활성 부위영역은 전체 용적이 약 530ų을 나타낸다. 모델링 연구에 따르면, 이 영역에 상당히 결합하는 억제제의 일부 또는 억제제가 530ų미만을 차지하고 결합 부위 영역의 형상에 적합한 분자 치수를 갖는다는 것을 보여준다. 측정가능한 비어 있는 용적을 나타내는 결합 부위 가까이의 다른 영역은 로얄 블루, 핑크, 예로 및 라이트 블루로 나타낸다. 이들 결합 부위는 억제제 분자(로얄 블루)에 대하여 이용할 수 없거나, 용매 분자(핑크, 예로, 라이트 블루)를 차지하기에 충분히 적당히 큰 영역을 나타낸다. 접촉 부위로 도킹된 억제제 WHI-P131을 나타내는 모델은 그린 영역에 겹쳐진 백색이다.

도 2b는 도킹된 퀴나졸린 WHI-P131(다색), WHI-P132(핑크) 및 WHI-P154(엘로)를 갖는 JAK3의 접촉 부위의 모델이다. 각각의 화합물은 WHI-P132(생물학적 분석에서의 JAK3에 대하여 불활성인 것으로 나타남) 이외에는 결합 부위에 일치한다.WHI-P132는 ASp967와의 결합 위치에서 OH기가 부족하다. 페닐환의 C4' 위치에서 OH기를 갖는 WHI-P131 및 WHI-P154는 JAK3의 Asp967와의 유리한 상호작용을 형성할 수 있는데, 이는 이들의 향상된 억제활성에 기여한다.

도 2c는 JAK3 접촉 부위에 대한 결합을 촉진하는데 기초를 두는 디메톡시퀴나졸린 유도체의 특성을 나타내는 다이어그램이다.

도 3a∼도 3b에 있어서, 도 3a는 5개의 상이한 프로테인 티로신 키나제, JAK3(핑크), BTK(레드), SYK(라이트 블루), IRK(다크 블루), 및 HCK(옐로)의 접촉 부위의 보존되지 않은 잔기의 구조 비교를 나타낸다. 도킹된 JAK3 억제제, WHI-P131(백색)의 5Å 이내의 잔기는 봉형 측쇄로서 도시된다. JAK3의 C 알파 백본은 원근법에 의해 엷은 핑크 라인으로서 도시된다. 영역 A∼F는 접촉 부위의 보존되지 않은 잔기를 포함하는 영역에 해당한다(하기의 B 및 실시예 참조). HCK(Sicheri et al., 1997, Nature 385: 602-609) 및 IRK(Hubbard et al., 1997, Nature 372: 746-754)의 결정 구조 좌표, 및 JAK3, BTK(Mahajan et al., 1999, J. Biol. Chem., in press) 및 SYK의 상동 모델은 구조 분석에 사용된다.

도 3b는 8개의 상이한 프로테인 티로신 키나제의 접촉 부위에 있어서의 비보존된 잔기를 나타낸다. 영역 A∼F는 A로 예시된 접촉 부위의 위치를 나타낸다.

도 4a∼도 4b는 IgE 수용체 가교후의 비만 세포에 있어서의 JAK3의 발현 및 활성화를 나타낸다.

도 4a에 있어서, RBL-2H3 비만 세포는 폴리클로널 안티 JAK-3 항체로 염색되고, DNA 특이성 염료 토토-3 뿐만 아니라 플루어레신으로 라벨된 2차 항체로 라벨되어, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에 의해 시각화된다.

도 4b에 있어서, 비만 세포에 있어서 JAK3의 IgE/항원으로 유도된 활성화를 연구하기 위해, RBL-2H3 비만 세포를 모노클로널 안티 DNP IgE로 감작(sensitize)시킨 다음, DNP-BSA로 공격한다. 비만 세포를 항원 공격전이나 30분 후에 노니뎃(Nonidet)-P40 용해 버퍼를 사용하여 용해시키고, 이들 세포 용해물의 JAK3 면역 복합물을 안티포스포티로신(ATP)으로 처리한다. JAK# 키나제의 자가 인산화를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 행한다(레인 1 및 2). 동시에, JAK3 면역 복합물은 또한 ATP 블롯에 있어서의 증가된 티로신 인산화 반응이 면역침강된 JAK3의양의 차이로 인한 것이 아님을 확인하도록 안티 JAK3 면역블롯(레인 3 및 4)에 의해 조사한다.

도 5a∼도 5d는 와일드형 및 Jak3^-/-비만 세포의 IgE 수용체/FcεRI로 조절된 반응을 나타낸다. 비만 세포를 JAK-3 부재(Jak3^-/-) 및 와일드형(Jak3^+/+) 대조군 마우스의 골수로부터 배양한다. 도 5a1 및 도 5a2는 Jak3^+/+5a1 대 Jak3^-/-5a2 비만 세포에 대한 IgE 수용체 발현의 플로 혈구계산 비교를 나타낸다. 비만 세포에 결합된 IgE는 안티 IgE-FITC 항체(PharMingen Laboratories)로 염색된다. 도 5b는 MTT 분석을 이용하여 결정된 SCF에 대한 Jak3^-/-및 Jak3^+/+의 증식 반응을 도시하는 그래프이다. 도 5c 및 도 5d는 비만 세포의 활성을 나타내는 그래프이다. Jak3^+/+의 비만 세포를 하기 실시예에서 상세히 기재되는 바와 같이 모노클로널 안티 DNP IgE로 감작시킨 다음, DNP-BSA로 공격한다. 동시에, 동일한 방식으로 Jak3^-/-비만 세포를 감작시킨 다음, 항원으로 공격한다. 히스타민(도 5c에 도시) 및 루코트리엔(LT) C₄(5d에 도시) 레벨을 BMMC의 세포 비함유 상청액으로 평가한다. Jak3^-/-비만 세포 및 대조군 Jak3^+/+비만 세포로부터의 자발적인 히스타민 방출량의 값(평균 ±SEM; n=3)은 각각 84.4 ±12.4pg/㎍ 프로테인 및 19.5 ±1.8pg/㎍이다. 골수 비만 세포의 IgE/항원으로 유도된 과립감소는 과립감소 지수로 나타내고, 이 식을 사용하여계산된다. 과립감소 지수 = 항원 공격후의 히스타민 방출량/항원 공격이 없는 자발적인 히스타민 방출량. Jak3^+/+마우스의 비만 세포는 41.9 ±14.2ng LTC₄/10⁶세포수를 방출한다. LTC₄방출량은 대조군의 비율로 나타낸다.

도 6a∼도 6e는 JAK3의 WHI-P131 특이성을 나타낸다. 도 6a∼도 6d에 있어서, JAK3, JAK1 및 JAK3을 적절한 바쿨로바이러스 발현 벡터로 감염된 Sf21 곤충 난소 세포로부터 면역침강되고 WHI-P131로 처리한 다음에, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 시험관 내 키나제 분석을 행한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, JAK의 효소 활성을 10분간의 키나제 분석의 자가 인산화 반응을 측정함으로써 측정한다. 키나제 활성(KA) 레벨은 기준선 활성(%CON)의 비율로서 나타낸다. 도 6e에 32Dc22-IL-2Rβ세포의 EMSAs가 도시된다. WHI-P131(100㎍/㎖) 및 WHI-P154(100㎍/㎖)(그러나, WHI-P132; 100㎍/㎖가 아니다)로 억제된 IL-2는 JAK-3 의존성 STAT 활성을 유발하나 IL-3은 32Dcll-IL-2Rβ세포에서 JAK-1/JAK-2 의존성 활성화를 유발시킨다.

도 7은 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 적절한 바쿨러바이러스 발현 벡터로 감염된 Sf21 곤충 난소 세포로부터 면역침강된 JAK-3, JAK3, SYK, 및 BTK에 대한 WHI-P132 특이성을 나타내고, NALM-6 사람 B-계보 ALL 세포로부터 면역침강된 LYN, 및 HepG2 간종양 세포로부터 면역침강된 IRK를 WHI-P131로 처리한 다음에, 시험관 내에서 키나제 분석을 행한다.

도 8a∼도 8d는 IgE 수용체 가교후에 비만 세포에서 WHI-P131가 JAK3을 방지하나 SYK 활성화를 방지하지 않는 것을 입증한다. RBL-2H3 세포를 모노클로널 안티 DNP IgE로 감작시키고, 비히클(8a) 또는 30WHI-P131(8b)로 처리한 다음에, DNP-BSA로 공격한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 세포를 용해하고, JAK3 면역 복합물을 저온 ATP의 존재하에 키나제 분석을 행한 다음에, ATP 면역블롯(8a 및 8b에서 상부 패널) 및 JAK3 웨스턴 블롯 분석(8a 및 8b에서 하부 패널)을 행한다. IgE 수용체 가교후의 비만 세포에서의 SYK의 활성화를 나타내기 위해, RBL-2H3 세포를 모노클로널 안티 DNP IgE로 감작시키고, 미처리된 채로 두거나(8c) 비히클 또는 30WHI-P131(8d)로 처리한 다음에, DNP-BSA로 공격한다. 지시된 시점에서 세포를 용해하고, SYK 면역 복합물을 저온 ATP의 존재하에 키나제 분석을 행한 다음에, ATP 면역블롯(8c 및 8d에서 상부 패널) 및 SYK 웨스턴 블롯 분석(8c 및 8d에서 하부 패널)을 행한다. C: 기준선 대조군.

도 9는 RBL-2H3 비만 세포의 IgE/항원으로 유도된 활성화에 대한 JAK3 억제제, WHI-P131의 효과를 나타낸다. RBL-2H3 세포를 0.24㎎/㎖ DNP-IgE를 갖는 0.01 ×10⁶/㎖의 세포 밀도에서 22 ×22㎜ 커버슬립에 대하여 하룻밤 동안 배양한다. 도 4의 범례에 기재된 바와 같이, 감작시킨 RBL-2H3 세포를 DNP-BSA로 공격하기 전에 30WHI-P131, 비히클 또는 대조 화합물 WHI-P258 및 WHI-P112로 처리한다. 1시간 동안 DNP-BSA로 자극한 후에, 세포를 15분간 저온 메탄올에 고정시킨 후, 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 PBS를 침투시킨다. 세포를 37℃에서 40분간 모노클로널 항체를 인지하는 알파-튜불린(클론 B-5-1-2, Sigma Chemicals, St. Louis,MO)으로 배양한다. PBS-0.1% 트리톤 X-100로 3회 세정한 후에, 세포를 플루어레신으로 라벨된 2차 항체(Zymed, San Francisco, CA)에 추가로 40분간 배양한다. 세포를 결합되지 않은 항체를 제거하도록 3회 세정한다. 토토-3(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 10분간 커버슬립을 배양하여 DNA 라벨링을 행한다. 과잉 염료를 PBS-0.1% 트리톤 X-100로 세정한다. 상술한 바와 같이, 세포를 벡타실드(Vector laboratories, Inc, Burlingame, CA)를 설치한 후에 MRC 1024 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화한다.

도 10은 비만 세포의 IgE 수용체/FcεRI로 조정된 칼슘 반응에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과를 나타낸다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, IgE로 감작시킨 RBL-2H3 세포를 1시간 동안 1플로-3(Flou-3)에 로딩한다. 그 다음에, 세포를 DNP-BSA 또는 아이오노마이신으로 공격하여, 형광 변화를 기록한다. 세포내 칼슘 가동화에 대한 WHI-P131의 효과를 연구조사하기 위해, IgE로 감작시키고 플로-3에 로딩된 RBL-2H3 세포를 DNP-BSA 또는 아이오노마이신으로 공격하기 전에 3, 12또는 30WHI-P131로 배양한다.

도 11a∼도 11c는 IgE 수용체/FcεRI로 조정된 비만 세포 반응에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과를 나타낸다. 실험과정부분에서 상세히 기술되는 바와 같이, RBL-2H3 세포를 모노클로널 안티 DNP IgE로 감작시키고, WHI-P131, 비히클 또는 대조 화합물로 처리한 다음에, DNP-BSA로 공격한다. 도 11a는 식: β- 헥소사미니다제 방출량, 전체 % = 100 ×(상청액 중의 β- 헥소사미니다제 레벨 / 상청액 +용해화한 펠릿 중의 β- 헥소사미니다제 레벨)을 이용하여 세포 비함유 상청액 및 트리톤 X-100 용해화한 펠릿 중의 β- 헥소사미니다제 레벨을 측정함으로써 평가되는 비만 세포 과립 감소(β- 헥소사미니다제 방출량, 전체 %)를 나타내는 그래프이다. 비히클로 처리된 대조군 RBL-BSA 세포는 DNP-BSA 공격후에 이들의 헥소사미니다제 함량의 45.1 ±3.1%를 방출한다. 도 11b는 LTC₄를 나타내고 도 11c는 세포 비함유 상청액에서 측정된 TNF-α레벨을 나타낸다. 비히클로 처리된 대조군 세포는 11.3 ±1.3pg LTC₄및 160 ±33.0pg TNFα/10⁶비만 세포를 방출한다. LTC₄및 TNFα방출량에 대한 결과는 비히클로 처리된 대조군 비만 세포로부터의 대조군 최대 방출 비율로서 나타낸다. 데이터 포인트는 3∼6개의 개별 실험으로부터 얻은 평균 ±SEM값을 나타낸다. *P<0.01는 스튜던트 테스트(Student's test)에 의해 측정된 것으로서 대조군과 비교된다. *P<0.05 및 *P<0.0001는 스튜던트 테스트에 의해 측정된 것으로서 대조군과 비교된다.

도 12a∼도 12c는 IgE 수용체/FcεRI로 조정된 사람 비만 세포 반응에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과를 나타낸다. 태아간으로 유도된 사람 비만 세포를 세포원심분리하여 카르노이액(carnoy's fixative)에 고정시킨다.

도 12a는 트립타제에 대한 비만 세포 염색(블루)을 나타내는 현미경 사진이다. 태아간으로 유도된 비만 세포를 티로드 버퍼에서 15분간 22E7 안티(FcεRI 항체)의 각종 농도로 자극한다. 몇몇 실험에서는 IgE로 감작시킨 비만 세포를 안티 IgE로 공격함으로써 자극한다. WHI-P131의 효과를 연구조사하기 위해, 비만 세포를자극하기 이전에 WHI-P131의 지시 농도로 배향한다.

도 12b에서, 비만 세포 트립타제 방출량(전체 %)을 ELISA에 의해 세포 비함유 상청액 및 용해화 세포 펠릿의 트립타제 레벨을 측정함으로써 평가한다. 그 결과는 트립타제 방출율(B.1; 대표적인 3개의 개별 실험) 및 트립타제 방출량의 억제율(B.2; N=3)로서 나타낸다. 방출된 평균 자발적인 트립타제는 8.3 ±3.9%이었다. 도 12c에서, LTC₄레벨을 ELISA(N=6)로 세포 비함유 상청액에서 측정한다. 결과는 대조군 비율(N=6)로서 나타낸다. 방출된 대조군 자극 세포는 29.4 ±14ng LTC₄/10⁶세포이었다. 테이터 포인트는 평균 ±SEM값을 나타낸다.

도 13a 및 도 13b는 마우스에 있어서의 JAK3 억제제 WHI-P131의 약물 동력학적 특성을 나타내는 그래프이다. 마우스에 있어서의 WHI-P131의 농도-시간 프로필은 정맥 내[13a] 또는 복강 내[13b] 투여(12.5㎎/㎏; 그룹당 5마리의 마우스)에 의한 것이다. 중앙 분포 용적(Vc), 평가한 최대 플라스마 농도(C_max), 제거 반감기(t_1/2β), 전신 노출 레벨/플라스마 농도-시간 곡선하의 영역(AUC), 및 생물학적 이용 효능을 포함하여, 약물 동력학적 파라미터는 삽입 도표로 나타낸다.

도 14a∼도 14e는 마우스에 있어서의 아니필랙시스에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과를 나타낸다.

도 14a는 마우스(n=12)에 있어서의 알부민 결합된 에반스청(Evans blue) 염료의 피부 일출을 평가함으로써 아나필랙시스와 관련된 혈관 투과성 증강에 대한 WHI-P131의 효과를 나타내는 그래프이다. 플라스마 삼출 지수는 실시예에서 기재되는 바와 같이, WHI-P131로 처리된 마우스 뿐만 아니라 비히클로 처리된 마우스에 대해서도 측정된다. 아나필랙시시에 대한 WHI-P131의 효과를 연구조사하기 위해, IgE로 감작시킨 마우스를 각각 항원 공격 90분전 및 공격 30분전에 10 또는 20㎎/㎏ WHI-P131의 연속적인 2개의 투약량으로 주사한다. 그 다음에, 마우스를 2% 에반스청 염료 중의 100㎍ DNP-BSA로 공격한 다음에, 플라스마 삼출 지수를 측정한다. 데이터 포인트는 평균 ±SEM값을 나타낸다. 데이터는 플라스마 삼출 지수(PBS로 처리된 귀에 대한 광학밀도에 있어서의 회수 증가)로서 나타낸다. 비히믈로 처리된 귀의 평균 OD(620㎚에서)는 IgE/항원 공격전 및 공격후에 각각 0.22 ±0.04 및 0.918 ±0.05이었다.

도 14b는 실시예에서 기재되는 바와 같이, 전신계 아나필랙시스시의 플라스마 일출을 나타내는 사진이다. 도 14b1은 에반스청 염료 단독의 정맥 내 주사후의 대조군 마우스의 풋 패드9foot pad)를 나타낸다. 도 14b2는 DNP-BSA 및 에반스청의 동시 투여후에 비히클로 처리된 마우스의 풋 패드를 나타낸다. 도 14b3은 DNP-BSA 및 에반스청의 동시 투여후에 WHI-P131로 처리된 마우스의 풋 패드를 나타낸다.

도 14c는 비만 세포 과립감소의 조직병리학적 평가 결과를 나타내는 사진이다. WHI-P131로 처리된 마우스 뿐만 아니라 비히클로 처리된 마우스의 항원 공격 1시간 후에 귀를 제거한다. 포르말린에 고정된 귀의 얇은 절편을 아비딘-FITC로 염색한다.

도 14d는 항원 공격후에 분석한 감작시킨 마우스의 혈액 히스타민 레벨을 나타내는 그래프이다. 레트로-오비탈 블리딩으로 혈액을 수집하여, ELISA로 히스타민레벨을 측정한다. 히스타민 레벨은 nM으로 나타낸다. PBS로 처리된 마우스 및 IgE/항원 자극된 마우스의 히스타민 레벨은 각각 493 ±131 및 7527 ±2102nM이었다. 결과는 평균 ±SEM값이다; n=3이다.

도 14e는 마우스에 있어서의 치명적인 아나필랙시스에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과의 연구결과를 나타내는 그래프이다. BALB/c 마우스를 보조 알부민 히드록시드 겔(Reheis Inc., Berkeley, NJ) 200㎕ 중의 100㎎/㎏ 소혈청 알부민으로 감작시키는데, 주어진 항원에 응하여 IgE의 생성을 촉진시킨다. 10일후에, 마우스를 30분 간격을 두고 WHI-P131(45㎎/㎏) 또는 비히클의 2개의 투약량으로 처리한 다음에, 10㎎/㎏ BSA의 정맥 내 주사로 공격한다. 아나필랙시스를 면해 생존한 마우스의 누적 비율은 항우언 도전후의 시간에 따라 나타낸다. 생명표 분석 및 로그 랭크 테스트를 이용한 통계적 비교를 상술한 바와 같이(Uckun et al., 1998, Clin. Cancer Res., 4: 901-912; Uckun et al., 1995, Science, 267: 886-891) 수행한다.

도 15는 JAK3 접촉 부위에 결합을 돕는 퀴나졸린 유도체의 특성을 나타내는 다이어그램이다.

본 발명자들은 IgE/항원으로 유도된 과립 감소 및 조장자 방출이 태아 간세포의 Jak3 유전자의 대상으로 한 파괴에 의해 발생된 JAK3가 없는 마우스의 Jak3^-/-비만 세포에서 실질적으로 감소되는 것을 알아냈다. 또한, 사람 비만 세포 뿐만 아니라 마우스, 래트를 4-(4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린)(WHI-P141)로 치료하면, JAK3의 합리적으로 설계된 잠재적인 특정 억제제, 억제된 과립감소 및 선염증성 조정자는 IgE 수용체/FcεRI 가교후에 방출한다. 이러한 효능 있는 JAK3 억제제를 투여하면, 마우스에 있어서의 비만 세포 괴립감소 및 전신 뿐만 아니라 피부의 치명적인 아나필랙시스의 발육을 방지한다. 그리하여, JAK3는 시험관 내 및 생체 내에서 IgE 수용체/FcεRI로 조절된 비만 세포 반응에 중요한 역할을 한다.

JAK3 억제제로 치료하면, 알레르기 반응 및 아나필랙시스를 감소시키고/거나 방지한다. JAK3 억제로 감소되거나 억제된 과립 감소 및 선염증성 조정자 방출을 가져온다. 따라서, 특정 억제제를 갖는 JAK를 대상으로 하면, 비만 세포로 조정된 알레르기 반응에 대한 새롭고 효과적인 치료 및 예방법을 제공한다.

본 발명은 비만 세포(시험관 내 또는 생체 내)를 유효량의 JAK-3 억제제와 접촉시킴으로써 비만 세포 활성화 또는 과립 감소를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 비만 세포 활성화 또는 과립 감소가 관련되고 비만 세포 활성화 또는 과립 감소의 억제가 이러한 치료의 요구시에 포유동물(예: 사람)에게 JAK-3 억제제를 투여함으로써 요구되는 병리를 치료하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 약물 치료, 바람직하게는 직접 과민성 반응 등의 비만 세포 활성화 또는 과립 감소와 관련된 상태를 치료하는데 사용하기 위해 JAK-3를 억제하는데 효과적인 물질을 제공한다. 본 발명은 또한 비만 세포 활성화 또는 과립감소와 관련된 상태의 치료용 약물을 제조하기 위한 JAK-3을 억제하는 물질의 용도를 제공한다.

본 발명은 이들의 제조에 유용한 공정 및 중간체는 물론, 후술하는 바와 같이, 일반식(Ⅰ)의 신규 화합물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어 "억제"는 측정가능한 양으로 줄이거나 완전히 방지하는 것을 말한다.

용어 "처리"는 직접 과민성 반응에 의해 징후를 보이거나 상기 반응으로 앓고 있는 포유동물의 직접 과민성 반응 또는 급성 알레르기 반응을 특성화하는 하나 이상의 증후를 억제하거나 방해하는 것을 말한다.

야누스 패밀리 프로테인 티로신 키나제의 멤버인 JAK는 비만 세포에서 풍부하게 발현되는 것으로 밝혀지고, 이의 효소 활성은 IgE 수용체/FcεRI 가교에 의해 향상된다. IgE/항원으로 유도된 과립감소 및 조정자 방출은 배 간세포의 Jak3 유전자의 대상 파괴에 의해 생성되는 JAK 비함유 마우스의 Jak^-/-비만 세포로 실질적으로 감소된다.

IgE/항원으로 유도된 과립 감소 및 조장자 방출이 태아 간세포의 Jak3 유전자의 대상으로 한 파괴에 의해 발생된 JAK3가 없는 마우스로부터 Jak3^-/-비만 세포에서 실질적으로 감소되는 것을 알아냈다. 또한, 사람 비만 세포 뿐만 아니라 마우스, 래트를 4-(4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린)(화합물 1)로 치료하면, JAK3의 잠재적인 특정 억제제, 억제된 과립감소 및 선염증성 조정자는 IgE 수용체/FcεRI 가교후에 방출한다. 이러한 효능 있는 화합물 1의 유효한 비만 세포 억제 플라스마 농도는 비독성 투약량 레벨에서 생체 내에서 달성된다.

이러한 효능 있는 JAK3 억제제를 생체 내에 투여하면, 마우스에 있어서의 비만 세포 괴립감소 및 전신 뿐만 아니라 피부의 치명적인 아나필랙시스의 발육을 방지한다.

그리하여, JAK3는 시험관 내 및 생체 내에서 IgE 수용체/FcεRI로 조절된 비만 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 따라서, 일반식(Ⅰ)의 특정 억제제를 갖는 JAK를 대상으로 하면, 비만 세포로 조정된 알레르기 반응에 대한 새롭고 효과적인 치료 기준 및 예방 프로그램을 제공한다.

JAK-3을 억제하는 방법은 시험관 내에서 행해질 수 있다. 이러한 시험관 내 방법은 알레르겐에 대한 세포 반응과 관련된 생물학적 공정을 연구하여 새로운 치료제를 확인하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 생체 내에서 행해질 수 있다. 이러한 방법은 알레르겐에 대한 노출로 인한 포유동물(예: 사람)에 있어서의 급성 병리 상태를 처리할 뿐만 아니라 알레르겐에 대한 세포와 관련된 생물학적 공정을 연구하는데 유용하다.

비만 세포 활성화와 관련된 알레르기 질환으로는 알레르기성 비염(고초열), 알레르기성 담마진(hives), 혈관부종, 알레르기성 천식 및 아나필랙시스, 즉 "아나필랙시스 쇼크" 등의 타입Ⅰ직접 과민성 반응을 들 수 있다. 이들 질환은 JAK-3 활성의 억제, 예를 들면 JAK-3 억제제의 투여에 의해 치료되거나 예방된다.

본 발명에 따라, JAK-3 억제제는 예방적으로, 즉 급성 알레르기 반응의 발증 이전에 투여될 수 있거나, 또는 JAK-3 억제제는 반응의 발증후에 또는 두 시기에 투여될 수 있다.

바람직한 실시형태에 있어서, JAK-3 억제제는 비만 세포, 호산구, T 세포, 및 B 세포 등의 염증성 반응을 유발하는 세포를 타겟으로 한다. 화합물은 타겟 잔기에 대한 컨쥬게이션에 의해 타겟된다. 유용한 타겟 잔기는 특히 비만 세포 항원이나 CD48 또는 SCF 수용체 등의 세포 표면 리간드를 결합하는 리간드이다. 그리하여, 안티 CD48 항체 또는 SCF 리간드는 JAK3을 비만 세포에 운반하는 JAK3 억제제 컨쥬게이트에 유용한 타겟 잔기이다.

또한, 항체 B43(B 세포를 결합), TXU(T 세포를 결합), GMSCF(호산구에 대하여 수용체를 결합) 또는 안티 CD13 항체(비만 세포를 결합)가 유용하다.

본 발명의 화합물:

본 발명의 방법에 유용한 JAK-3 억제제로는 JAK-3의 활성을 억제할 수 있는 모든 화합물을 들 수 있는데, 예를 들면 하기 실시예에 기재된 테스트와 유사한 표준 테스트를 이용하여, JAK-3을 억제하는 화합물의 능력을 어떻게 측정하는가가 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 방법에 유용한 JAK-3 억제제,

는 일반식(Ⅰ)

{상기식에서, X는 HN, R₁₁N, S, O, CH₂또는 R₁₁CH이고,

R₁₁는 수소, (C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₄)알카노일이며,

R₁-R₈는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로이고, 이들이 부착되어 있는 페닐환과 함께 R₁-R₅의 2개의 인접 기는 임의로 예를 들면 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성하는 축합환을 형성할 수 있으며, 또한, R₁-R₅의 2개의 인접 기에 의해 형성된 환은 임의로 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로에 의해 치환될 수 있고, 단 R₂-R₅중의 하나 이상이 OH이고,

R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, 또는 R₉및 R₁₀은 함께 메틸렌디옥시를 형성한다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염(단, 단 R₂-R₅중의 하나 이상이 OH이다.)을 포함한다.

달리 지적되지 않으면, 하기 정의가 사용된다. 할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도이고, 알킬, 알카노일 등은 직선형 기 및 분기형 기를 나타내지만, "프로필" 등의 각각의 라디칼은 직쇄형 라디칼 만을 포함한다. "이소프로필" 등의 측쇄형 이성질체는 구체적으로 언급되며, (C₁-C₄)알킬로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 및 sec-부틸을 들 수 있고, (C₁-C₄)알콕시로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시 및 sec-부톡시를 들 수 있으며, (C₁-C₄)알카노일로는 아세틸, 프로파노일 및 부타노일을 들 수 있다.

화합물의 특정 그룹은 R₁-R₈가 각각 독립적으로 수소, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 할로겐, 또는 히드록시이고, 단R₂-R₅중의 하나가 OH인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.

또 하나의 화합물의 특정 그룹은 R₉및 R₁₀이 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, 할로, 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, 또는 R₉및 R₁₀은 함께 메틸렌디옥시를 형성하는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.

바람직한 JAK-3 억제제로는 4-(4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(P131), 4-(3'-브로모-4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(P154), 4-(3'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(P180) 및 4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(P97) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 들 수 있다.

JAK3 억제제의 2차 생성:

후술하는 JAK-3 결합을 모델링하는 모델 방법을 이용하여, 당해 기술분야의 숙련가는 JAK-3 결합 포켓을 피트하여, 효능 있는 억제 활성을 갖는 것으로 예기되는 다수의 바람직한 JAK-3 억제제를 제조할 수 있다.

화합물은 도 15에 도시된 바와 같이 결합 포켓에 피트되어 이를 채워 접촉 잔기와의 상호작용을 위한 영역을 제공하도록 디자인된다. JAK-3 키나제 활성 부위에 피트하여 이를 타겟으로 하도록 디자인된 본 발명의 제 2 발생 화합물은 JAK-3 키나제 잔기와 유리하게 상호작용하도록 예기된다. 이러한 본 발명의 화합물은 하기에 도식으로 특히 표 2에 나타낸다. 이들 화합물을 제조하기 위한 합성 도식은 도식 3A-3D에 나타낸다.

(표 2)

제 2 생성 퀴나졸린은 타겟 JAK 키나제 활성 부위를 디자인한다. 모든 화합물은 JAK3 키나제 잔기와 유리하게 상호작용하는 것으로 예측된다. NA=사용 불가능

도식 3A: 퀴나졸린 유도체 Q1-Q4의 합성

바람직한 치환반응은 R3'=H, Br, Oh, R4'=H, OH, H, Br, R5'=OH, R6'=H,CH₂OH, NH₂, NO₂, n¹=1-3이고, 단 R₃, R₄, R₅가 OH인 것이다. 바람직하게느, 페닐환에 대한 1-3 치환반응이다.

도식 3B: 퀴나졸린 유도체 Q5-Q8의 합성

R5'=Br, R6'=OH, CH₂OH, NH₂, NO₂, n¹=1-3이 바람직하다.

도식 3C: 퀴나졸린 유도체 Q9-Q13의 합성

바람직하게는, R5'=Br, OH, CH₂OH, NH₂또는 NO₂이다.

도식 3D: 퀴나졸린 유도체 Q14-Q17의 합성

바람직하게는, R5'=Br, R7'=OH, CH₂OH, NH₂또는 NO₂, n¹=1-3이다.

적절한 JAK-3 억제제로는 또한 JAK-3에 대한 항체, 및 JAK-3 발현 및 합성을 억제하는 안티센스(antisense) 올리고핵산염을 들 수 있다.

JAK-3을 억제하는 화합물은 약제학적 조성물로서 제형화되어, 선택된 투여 루트, 즉 경구적 또는 비경구적, 정맥 내, 근육 내, 국소적 또는 피하 루트에 적합한 각종 제형으로 환자 등의 포유류 숙주에 투여될 수 있다.

따라서, JAK-3 억제제는 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 같은 약제학적으로 허용가능한 비히클과 혼합하여 전신으로, 예를 들면 경구로 또는 흡입법 또는 통기법으로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 셸 젤라틴 캡슐로 밀봉될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 또는 환자 다이어트의 음식물과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구용 치료 투여를 위해, JAK-3 억제제는 하나 이상의 부형제와 혼합되어 섭취가능한 정제, 구강용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. JAK-3 억제제는 미세 불활성 분말형 담체와 혼합될 수 있고 피검자에 의해 흡입될 수 있거나 통기될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 0.1% JAK-3 억제제를 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 비율은 물론 변화될 수 있고, 편의상 주어진 단위 투약량 형태의 중량의 약 2% 내지 60%일 수 있다. 이러한 치료상 유용한 조성물에 있어서의 JAK-3 억제제의 양은 유효 투약량 레벨이 얻어지도록 된 것이다.

정제, 트로키, 환약, 캡슐 등은 또한 하기 성분을 함유할 수 있다. 트래거캔스 고무, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제, 인산디칼슘 등의 부형제, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 등의 윤활제, 및 수크로스, 프룩토스, 락토스 또는 아스파르탐 등의 감미제 또는 페퍼민트, 동록유, 체리향 등의 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 투약량 형태가 캡슐이면, 상기 종류이외에도 식물유 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 액체 담체를 함유할 수 있다. 여러가지 다른 물질이 코팅으로서 존재할 수 있거나, 그렇지 않으면 고체 단위 투약량 형태의 물리적 제형을 변경할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환약 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 슈거 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스 또는 프룩토스, 방부제로서 메틸파라벤 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향기 등의 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 단위 투약량 형태를 제조하는데 사용되는 물질은 사용된 양으로 약제학적으로 허용가능하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, JAK-3 억제제는 지속 방출형 제제 및 장치로 혼입될 수 있다.

JAK-3 억제제는 주입 또는 주사에 의해 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. JAK-3 억제제의 용액은 임의로 비독성 계면활성제와 혼합된 물로 제조될 수있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 트리아세틴 및 이들의 혼합물, 및 오일로 제조될 수 있다. 보관 및 사용에 대한 통상적인 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 함유한다.

주입 또는 주사용으로 적합한 약제학적 투약량 제형으로는 무균 주사가능하거나 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제제용으로 적합하고 임의로 리포솜으로 캡슐화되는 JAK-3 억제제를 포함하는 무균 수용액 또는 분산액 또는 무균 분말을 들 수 있다. 모든 경우에 있어서, 최종 투약량 제형은 무균 유체이어야 하고 제조 및 보관 조건하에 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 식물유, 비독성 글리세릴에스테르, 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면 리포솜의 생성, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지 또는 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물의 활동 예방은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 다수의 경우에는, 등장제, 예를 들면 슈거, 버퍼 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들면 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴의 조성물에서 사용함으로써 일어날 수 있다.

무균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기에서 나열한 각종 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요량의 JAK-3 억제제를 혼입한 후, 여과 살균함으로써 제조된다. 무균 주사가능한 용액의 제조용 무균 분말의 경우에는, 바람직한 제조방법은진공건조 및 동결건조기술로, 이는 미리 살균 여과된 용액에 존재하는 추가의 요구된 성분 이외에 유효성분인 분말을 수득한다.

국소 투여용으로, JAK-3 억제제는 순수 형태, 즉 이들이 액체로 사용될 수 있다. 그러나, 고체 또는 액체일 수 있는 피부 의학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여, 일반적으로 이들을 조성물 또는 제형화제로서 피부에 투여하는 것이 바람직하다.

유용한 고체 담체로는 탤크, 클레이, 미소결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등의 분할된 고체를 들 수 있다. 다른 고체 담체로는 비독성 중합체 나노입자, 미소입자를 들 수 있다. 유용한 액체 담체로는 물, 알콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드를 들 수 있고, JAK-3 억제제는 임의로 비독성 계면활성제의 도움으로 유효 레벨로 용해되거나 분산될 수 있다. 방향제 및 추가의 향균제 등의 보조제는 주어진 용도에 특성을 최적화하도록 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 붕대를 함침시키는데 사용되는 흡수제 패드 및 다른 드레싱으로 사용되거나, 펌프형 또는 에어로졸 스프레이를 사용하여 감염된 영역에 스프레이될 수 있다.

합성 중합체, 지방산, 산염 및 에스테르, 지방족 알콜, 및 변성 셀룰로스 또는 변성 무기물질 등의 증점제도 또한 사용자의 피부에 직접 사용하기 위해 퍼짐성 페이스트, 겔, 연고, 소프 등을 형성하도록 액체 담체와 함께 사용될 수 있다.

JAK-3 억제제를 피부에 가할 수 있는 유용한 피부 의학적 조성물의 예로는 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 문헌[참조: Jacquet et al.(U.S.Pat. No. 4,608,329), Geria(U.S. Pat. No.4,992,478), Smith et al.(U.S. Pat.No.4,559,157), and Wortzman(U.S. Pat. No.4,820,508)]을 들 수 있다.

일반식(Ⅰ)의 화합물의 유용한 투약량은 동물 모델에 있어서 이들의 시험관 내 활성 및 생체 내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 디른 동물에 있어서의 유효 투약량을 사람으로 외삽하는 방법은 당해 기술분야, 예를 들면 미국 특허 제4,938,949호에 공지되어 있다.

일반적으로, 로션 등의 액체 조성물 중의 JAK-3 억제제의 농도는 약 0.1∼25중량%, 바람직하게는 약 0.5∼10중량%일 것이다. 겔 또는 분말 등의 반고체 또는 고체 조성물의 농도는 약 0.1∼25중량%, 바람직하게는 약 0.5∼2.5중량%일 것이다.

치료용으로 요구되는 JAK-3 억제제의 양은 선택된 특정 염 뿐만 아니라 투여 루트, 처료 상태 특성 및 환자의 연령 및 상태에 따라 변화할 것이며, 궁극적으로 전속 의사 또는 임상의의 재량일 것이다.

일반적으로, 그러나, 적당한 투약량은 약 0.5 내지 약 100㎎/㎏, 예를 들면 3 내지 약 50㎎/㎏ 수용자 체중/day 등의 약 10 내지 약 75㎎/㎏ 체중/day, 바람직하게는 6 내지 90㎎/㎏/day, 가장 바람직하게는 15 내지 60㎎/㎏/day의 범위일 것이다.

JAK-3 억제제는 편의상 예를 들면, 단위 투약량 형태에 대하여 유효성분 5 내지 1000㎎, 바람직하게는 10 내지 750㎎, 가장 바람직하게는 50 내지 500㎎을 함유하는 단위 투약량 형태로 투여된다.

전형적으로, JAK-3 억제제는 약 0.5 내지 약 75, 바람직하게는 약 1 내지50, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 30의 피크 플라스마 농도를 달성하도록 투여되어야 한다. 이는 예를 들면 임의로 염수 중의 JAK-3 억제제의 0.05 내지 5% 용액의 정맥 내 주사에 의해 달성될 수 있거나, 또는 JAK-3 억제제 약 1-100㎎을 함유하는 큰 알약으로서 경구적으로 투여될 수 있다. 바람직한 혈액 레벨은 약 0.01-50㎎/㎏/hr을 제공하는 연속 주입 또는 JAK-3 억제제의 약 0.4-15㎎/㎏을 함유하는 간헐적인 주입에 의해 유지될 수 있다.

JAK-3 억제제는 편의상 1회분 투약량으로 존재될 수 있거나, 또는 적절한 간격, 예를 들면 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 서브 투약량/day으로투여되는 분할된 투약량으로 존재될 수 있다. 서브 투약량 자체는 또한 예를 들면 취입기의 다중 흡입 또는 눈에 다수의 방울을 가하는 것과 같은 다수의 분리된 느슨하게 간격진 투여법으로 분할될 수 있다.

본 발명은 하기의 비한정적인 실시예에 의해 설명될 것이다.

실시예 1: JAK-3 키나제 영역에 대한 상동 모델의 구조

삼차원 좌표의 JAK3 키나제 영역이 현재 공지되어 있지 않기 때문에, JAK3의 구조 모델이 JAK3 억제제의 도킹 분석에 필요하다. JAK3의 상동 모델을 참고로서 공지된 상동 키나제 영역을 이용함으로써 구성한다.

JAK3 상동 모델의 디자인은 처음에 젠뱅크(GenBank; National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)의 JAK3(Swiss-Prot #P52333, Univ. of Geneva, Geneva, Switzerland)의 프로테인 시퀀스를 얻고, 몇몇 원형 좌표[공지된 키나제 구조, HCK(Sicheri et al., 1997, Nature 385, 602-609), FGFR(Mohammadiet al., 1996,; Mohammadi et al., 1997), 및 IRK(Hubbard, 1997, EMBO J.16, 5572-5581)]에 관하여 JAK3 키나제 영역에 대한 가장 적당한 시퀀스 배열을 결정함으로써 수행된다. 이는 처음에 최선의 전체적 구조 비교를 제공하도록 인사이트Π프로그램(Molecular Simulation Inc, 1996, San Diego, CA)을 이용하여 HCK, FGFR, 및 IRK의 키나제 영역의 Cα좌표를 겹침으로써 달성된다. 그 다음에 시퀀스는 이들의 구조의 겹침에 의거하여 배열된다(아미노산 시퀀스는 이들의 Cα위치가 서로에 대하여 공간적으로 관련되면 함께 배열된다.). 배열은 다른 프로테인 시퀀스와 다른 프로테인에서 루프로서 이러한 특성을 조절한다. 구조 겹침은 인사이트Π프로그램의 상동 모듈 및 실리콘 그래픽스INDIGO2 컴퓨터(Silicon Graphics, Mountain View, CA)를 이용하여 행해진다.

시퀀스 배열은 수동으로 행해지고 각각의 겹쳐진 Cα위치에 대한 시퀀스 변화 프로필을 산출한다. 시퀀스 변화 프로파일은 다른 3개의 프로테인을 갖는 JAK3 키나제의 연속적인 배열에 관한 기준으로서 제공된다. 이 절차에 있어서, JAK3의 시퀀스는 프로그램으로 혼입되어, 상술한 시퀀스 변화 프로파일에 의거한 3개의 공지의 키나제 프로테인과 배열된다.

다음에, 3D 좌표 세트는 원형으로서 HCK의 3D 좌표 및 인사이트Π내의 상동 모듈을 이용하여 JAK3 키나제 시퀀스에 지정된다. 시퀀스 삽입이 일어나는(루프없이 HCK에 관하여) 루프 영역에 대한 좌표는 컴퓨터 프로그램에 의해 자동적으로 생성되어 제한된 수의 가능성으로부터 선택되어, 프로그램 CHAIN(Sack, 1988)을 이용하는 더욱 이상적인 기하 형태로 수동으로 조절된다.

최종적으로, JAK3 키나제 영역의 구조된 모델은 모델 빌딩시에 도입된 입체 스트레인이 경감될 수 있도록 X-PLOR 프로그램(Brunger, 1992)을 이용하여 에너지 최소화된다. 모델은 불리한 입체 접촉에 대하여 스크린되고, 필요하다면 이러한 측쇄는 로타머(rotamer) 라이브러리 데이터베이스를 이용하거나 각각의 측쇄를 수동으로 회전시킴으로써 리모델링된다. 상동 모델 구조를 위한 절차는 구조 원형으로서 JAK3 모델을 이용하여 JAK1(SWISS-PROT #P23458) 및 JAK2(Genbank #AF005216)에 대하여 반복된다. 그 다음에, JAK1, JAK2, 및 JAK3의 에너지 최소화된 상동 모델은 JAK/디메톡시퀴나졸린 복합물의 모델링 연구를 위해, 디메톡시퀴나졸린 화합물의 에너지 최소화된 구조 모델과 함께 사용된다.

도 1a 및 도 1b는 키나제 영역의 JAK3 상동 모델을 나타내는데, 이는 접촉(ATP 결합) 부위 가까이의 힌지 영역에 의해 연결되는 N-터미널 로브 및 C-터미널 로브로 구성된다. 접촉 부위는 키나제 영역의 중앙 영역에 위치된 포켓으로, 이는 N 및 C 로브 사이의 계면의 2개의 β-시트에 의해 형성된다. 접촉 부위의 개구는 접촉가능한 용매이고, ATP의 결합을 촉진시킨다. 소분자 억제제는 또한 ATP 결합을 억제함으로써 PTK 활성의 감쇠를 가져오는 접촉 부위에 결합할 수 있다.

JAK3 모델의 분석은 사변형 포켓(도 1c)으로서 설명될 수 있는 접촉 부위의 특정한 특성을 나타낸다. 포켓의 개구는 잔기 Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 및 Tyr904(도 1c에서 블루 잔기)로 형성된다. 포켓 내의 먼 쪽의 깊은 벽은 Leu905(측쇄부), Glu903, Met902, Lys905, 및 Asp967(핑크 잔기, 도 1c)와 일렬로 늘어서 있다. 포켓의 플로어는 Leu905(측쇄부), Val884,Leu956, 및 Ala966(옐로 잔기)로 늘어서 있다. 포켓의 루프를 형성하는 잔기는 Leu828, Gly829, Lsy830, 및 Gly831(최상 블루 잔기, 도 1c)를 포함한다. 도 1c 및 도 2a는 JAK3 모델의 접촉 부위가 8Å ×11Å ×20Å의 대략적인 치수 및 약 533ų의 이용가능한 결합 용적을 갖는다는 것을 나타낸다. 모델에 따르면, 결합 영역의 용매 노출된 개구는 분자가 약간의 평면성을 포함한다면 억제제가 인입되어 결합한다. Asp1017은 접촉 부위에 결합된 퀴나졸린의 3' 또는 4' OH기와 수소 결합을 형성할 수 있고, Leu955는 또한 JAK3에 대한 결합을 향상시키는 퀴나졸린의 페닐환에 대한 C5' 및 C6'의 퀴나졸린환 질소 친수성 치환체와 상호작용할 수 있다. Met952와의 입체장애는 C2에서 비수소 치환체의 첨가를 저지한다. 포켓에서 억제제의 용적을 예를 들면 약 200ų-500ų, 225-350ų의 용적으로 증가시키는 변형은 더욱 효능 있는 화합물을 제공할 것이다.

JAK3 키나제 영역의 대부분의 접촉 부위 잔기가 다른 PTK에 관하여 보존되지만, 소수의 특정 변화가 관찰된다(도 3). 이들 차이는 SYK의 Glu 및 JAK3의 Pro906으로 변화하는 BTK, IRK, 및 HCK/LYN(영역 A, 도 3a)의 알라닌 잔기를 포함한다. 영역 B에서, 티로신 잔기는 JAK3(Tyr904), BTK, 및 LYN에서 보존되나, HCK에서 Phe(이는 억제제 결합에 관련된 HCK와 LYN 사이의 다만 겉보기 잔기 차이이다), SYK에서 Met, IRK에서 Leu로 변화한다. 영역 C는 BTK, IRK, 및 HCK/LYN에서 보존되나, JAK3에서 Leu905 및 SYK에서 Ala로 변화하는 메티오닌 잔기를 나타낸다. 영역 D는 SYK 및 IRK에서 보존되나, BTK에서 Thr로, LYN 및 HCK에서 훨씬 더 작은 잔기,Ala로 변화하는 JAK3의 Met902를 나타낸다. 포켓의 뒤쪽 벽에 위치하고 포켓 볼륨의 중심을 향해 돌출하는 이 Met902 잔기는 결합 포켓의 형상에 상당히 영향을 미킬 수 있다. 이 위치에서, Met902 측쇄의 연장된 형태는 BTK(Thr) 및 HCK/LYN(Ala) 등의 작은 잔기를 갖는 다른 키나제에 관하여, 포켓의 뒤쪽 벽 및 힌지 영역을 정렬시키는 잔기를 갖는 억제제의 근접한 접촉을 방해할 수 있다.

영역 E의 Ala966은 HCK/LYN에서 보존되나, IRK에서 Gly로, BTK 및 SYK에서 더욱 더 친수성을 지닌 잔기 Ser로 변화한다. 억제제 위치에서 더 멀리 떨어져 있는 영역 F은 접촉 부위를 최소한 보존하는 영역이고 JAK3의 Asp12, BTK의 Asn, SYK의 Lys, IRK의 Ser, 및 HCK/LYN의 Asp를 포함한다(도 3). 티로신 키나제 사이의 이러한 잔기 동일성 차이는 JAK3 키나제 영역의 선택적 억제제를 디자인하기 위한 기준으로서 제공한다.

JAK3은 JAK1 및 JAK2에서 글리신으로 변화하는 결합 부위에 Ala1016을 포함한다. JAK3의 약간 더 큰 알라닌 잔기는 큰 표면 접촉 및 억제제와의 소수성 상호작용을 제공할 수 있다.

실시예 2: JAK3 키나제 영역의 상동 모델을 이용하는 도킹 절차

JAK3/디메톡시퀴나졸린 복합물의 모델링은 프로그램 인사이트Π내의 도킹 모듈 및 키나제 영역 결합 부위로 억제제를 자동으로 도킹하기 위한 프로그램의 유연성 스위트(suite)를 이용하여 행해진다. 각각의 억제제 화합물에 대한 에너지 최소화된 모델은 JAK3의 접촉 부위의 상동 모델 좌표로 도킹된다. 각각의 화합물은 HCK/퀘르세틴 결정 구조(Sicheri et al., 1997, Nature, 385: 602-609)의 퀘르세틴위치에 의거하여 JAK3 키나제 영역으;ㅣ 활성 부위로 도킹된다.

도킹 절차 개시전에 JAK3에 수소가 생성되어, JAK3 및 이의 억제제 모델에 퍼텐셜이 지정된다. 인사이트Π프로그램의 도킹 방법은 도킹된 구조를 조사하여 평가하도록 CVFF 포스 필드 및 몬트 카를로(Monte Carlo) 서치 전략을 이용한다. 수용체의 벌크에 관한 좌표가 고정유지되지만, 결합 부위의 제한된 영역의 좌표는 억제제와의 가장한 상호작용으로서 평가됨에 따라 조정된다. 이 결합 영역은 억제제와 4.5Å 떨어진 존(zone)으로서 형성되어, 억제제를 수용하도록 이 존내의 잔기를 에너지학적으로 유리한 위치로 시프트시키고/시키거나 회전시킨다.

어셈블리가 프로테인 및 이의 억제제 분자를 포함하도록 형성된 후에, 도킹 계산이 고정된 도킹 모드를 이용하여 행해진다. 소수성 및 수소 결합 상호작용을 어림하여 이루어진 계산은 JAK3 접촉 부위의 각각의 화합물의 최선의 5개의 도킹 위치를 확인하는데 사용된다. 각각의 화합물의 여러가지 도킹 위치는 억제제와 프로테인 사이의 판 데르 발스의 상호작용, 친유성, 수소 결합을 고려하여, 루디(Ludi; Bohm, 1994) 스코어링 절차를 이용하여 평가된다. 여러가지의 상이한 PTK의 접촉 부위 잔기의 비교는 HCK, IRK(Hubbard, 1997, EMBOJ. 16: 5572-81)의 키나제 영역의 결정 구조 좌표 및 JAK1, JAK2, JAK3, BTK(Mahajan et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 15, 5304-5311) 및 SYK(Mao, 미공개된 데이터)의 모델을 수동으로 겹침다음에, JAK3에 유일한 활성 부위의 특성을 확인함으로써 행해진다(도 3).

컴퓨터 도킹 절차는 잠재적인 억제제가 어떻게 잘 JAK3의 접촉 부위에 피트되어 결합되는지 예측하여, 키나제 억제를 가져오는데 사용된다(도 2b). ㄷ;메톡시퀴나졸린 화합물 WHI-P258(4-(페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린)은 퀴나졸린 잔기에 2개의 메톡시기를 포함하나 다른 환 치환체는 포함하지 않는다. JAK3 키나제 영역의 상동 모델을 이용하는 분자 모델링 연구는 WHI-P258이 JAK3의 접촉 부위에 피트되나, 아마도 제한된 수소 결합 상호작용으로 인해 매우 단단하게 결합하지 않은 것을 제시한다. JAK3의 접촉 부위의 키 잔기인 Asp967은 이러한 분자가 OH기 등의 수소결합 공여기를 포함한다면, 접촉 부위에 결합하는 분자와 수소결합을 형성할 수 있다. 그러나, WHI-P258은 OH기를 포함하지 않으므로, Asp967와 같이 유리하게 상호작용하지 않는다. 본 발명자들은 WHI-P258의 페닐환의 4' 위치의 OH기 존재가 Asp967와의 부가된 상호작용으로 JAK3에 대하여 더 강한 결합을 가져오는 것을 가정했다. 일련의 디메톡시퀴나졸린 화합물은 이 가정을 테스트하도록 디자인되어 합성된다.

화합물에 대한 분자 체적의 평가는 표 1에 주어진다. JAK3의 접촉 부위에 대한 결합에 관련되는 것으로 관찰되는 디자인된 디메톡시퀴나졸린 화합물의 구조 특성 요약은 도 2c에 나타낸다. 표 1의 화합물의 대략적인 분자 체적은 JAK3 키나제의 530ų결합 부위로 피트되기에 충분히 작은 252ų내지 307ų의 범위이다. 표 1은 또한 JAK3 접촉 부위에 도킹되는 화합물에 대한 평가된 결합 상수(예: K_i값)을 포함하는 분자 모델링 연구 결과를 리스트한다. 도킹 연구에서 평가된 화합물은 페닐환의 상이한 위치에 유사한 작용기의 치환을 포함한다.

(표 1)

퀴나졸린과 JAK3 키나제 활성 부위의 예측된 상호작용 및 JAK3 키나제에 대한 측정된 억제값(IC₅₀값)

표 1에 리스트된 화합물의 에너지 최소화된 모델의 형태는 페닐환 및 퀴나졸린환계 사이에 약 4-18°의 이면각을 갖는 비교적 평면상이다. 이 형태는 화합물이 JAK3의 접촉 부위로 훨씬 더 용이하게 피트하도록 한다. 리스트된 화합물 모두는환 질소(N1)를 포함하는데, 이는 JAK3의 힌지 영역에서 Leu905의 NH와 수소결합을 형성할 수 있다. Ni가 양성자 첨가되면, NH는 그 대신에 JAK3의 Leu905의 카보닐기와 상호작용할 수 있다. 페닐환의 4'위치의 OH기 존재는 JAK3의 접촉 부위에 대한 결합을 위해 특히 중요한 것으로 예측된다. 표 1에 나타낸 WHI-P131(K_i=2.3로 평가됨), WHI-P154(K_i=1.43로 평가됨), WHI-P971(K_i=0.6로 평가됨)은 향상된 결합에 기여하는 JAK3의 Asp967과의 수소결합을 형성할 수 있는 페닐환의 4' OH기를 포함하기 때문에, JAK3에 대한 유리한 결합 및 강력한 JAK3 억제 활성을 갖는 것으로 예측된다. 비교에 의해, WHI-P132의 2' OH기는 우측 배향 상태로 있지 않아 Asp967과 상호작용하고, 아마도 퀴나졸린환 질소와 분자내 수소결합을 형성하므로, JAK3의 접촉 부위에 대하여 상당히 낮은 WHI-P132의 친화성에 기여한다.

비교적 큰 브롬 치환체(WHI-P97, WHI-P154)는 분자가 결합 부위에 피트될 수 있다면 결합 부위의 분자 표면적을 증가시킬 수 있다. WHI-P154 및 WHI-P97의 모델링은 페닐환이 분자의 축합환 기에 관하여 약간 경사진다면 브롬기를 수용하기에 충분한 공간이 있음을 보여준다.

실시예 3: JAK-3 억제제의 화학적 합성 및 특성조사

모델링 연구로부터 얻어진 결과는 WHI-P131, WHI-P154 및 WHI-P97이 유효한 JAK3-억제활성을 나타낸다는 가설을 더욱 상기시켰다. 이러한 가설을 시험하여 상기한 JAK3 상동 모델에서 예상되는 유용성을 확증하기 위하여, 본 발명자들은 WHI-P131, WHI-P154, WHI-P97 및 표1에 열거된 다른 디메톡시퀴나졸린 화합물을 합성하였다.

퀴나졸린 유도체의 화학적 합성.

반응식 1에 보인 공지의 과정을 이용하여, 모든 WHI 화합물의 합성을 위한 통상의 출발물질인 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린(1)을 제조하였다.

4,5-디메톡시-2-니트로벤조산(3)을 염화티오닐로 처리하고, 암모니아와 반응시켜 4,5-디메톡시-2-니트로벤즈아미드(4)를 얻었다(에프. 노모토 외. Chem. Pharm. Bull., 1990,38,1591-1595). 화합물(4)의 니트로기를 황산구리의 존재하에 수소화붕소나트륨으로 환원하여(씨. 엘. 토마스, Catalytic Process and Proven Catalysts, Academic Press, New York(1970)), 4,5-디메톡시-2-아미노벤즈아미드(5)를 얻고, 이것을 포름산으로 환류하여 고리화하여, 6,7-디메톡시퀴나졸린-4(3H)-온(6)을 얻었다. 화합물(6)을 포스포러스 옥시트리클로라이드로 환류하여 통상의 합성 전구체(7)을 제공하였다.

표 1의 화합물들은 앞서 말한 바와 같이(날라 외. 1998), 반응식 2에 따라 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린(1)로부터 모두 합성되었다. 이 과정에서, 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린(1)(448mg, 2mmol) 및 치환된 아닐린(2.5mmol) 혼합물을 에탄올(20ml) 내에서 가열하여 환류하였다. 이 가열을 4 - 24 시간동안 계속하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 과량의 Et₃N을 첨가하여 용액을 중화시키고, 이 용매를 농축하여 조 생성물을 얻었고, 이것을 DMF로 재결정하였다.

반응식 2. JAK3 억제제의 합성

합성 화합물에 대한 분석 데이터

녹는 점은 보정하지 않았다. DMSO-d₆또는 CDCl₃에서 베리언 머큐리 300 분광계를 사용하여 1H NMR 스펙트럼을 기록하였다. 0 ppm에서 내부 표준으로서 테트라메틸실란(TMS)으로 할 때, 백만 단위당(ppm) 부분적으로 화학전이가 기록되었다. 커플링 상수(J)가 헤르츠 단위로 주어지고, 약어 s,d,t,q 및 m은 일중항, 이중항,삼중항, 사중항 및 다중항을 각각 나타낸다. 적외선 스펙트럼을 니콜렛 PROTEGE 460-IR 분광계상에 기록하였다. 질량 분석 데이타를 피니건 매트 95, VG7070E-HF G.C.system 상에서 HP 5973 질량 선택 측정기(Mass Selection Detecter)로 기록하였다. 용매로 MeOH을 사용하여, BECKMAN DU 7400상에 UV 스펙트럼을 기록하였다. 프리코팅된 실리카 겔 플레이트(Silica Gel KGF; Whitman Inc) 상에서, TLC를 수행하였다. 실리카 겔(200-400메쉬, Whitman Inc.)을 모든 컬럼 크로마토그래피 분리에 사용하였다. 모든 화학약품들은 시약 등급(reagent grade)이고 알드리히 케미컬 컴퍼니(Milwaukee, Wis) 또는 시그마 케미컬(St.Louis, MO)에서 구입하였다.

실시예 4: 비만세포에서의 JAK-3 발현

비만 세포에서의 JAK-3의 발현을 조사하였다.

재료 및 방법:

마우스

찰스 리버 레버러터리(Wilmington, MA)에서 수컷 C57BL/6 및 Balb/c 마이스(6-7 주령)을 구입하였다. 닥터 제이 일레(St. Jude Children's ResearchHospital, Memphis, TN)에서 교배용 JAK3-눌(null)마우스 쌍들을 구입하였다. 이들 동물들은 미국 동물 복지법 및 국립보건원(NIH)의 규정에 따라 병원균이 없는 환경에서 5마리씩 그룹을 이루어 우리에 넣어졌다. 동물들의 관리 및 실험 과정을 국립보건원 가이드라인에 따라 수행하였다.

하이클론(Logan, UT)에서 소 태아 혈청을 입수하였다. 시그마(St. Louis, MO)로부터 히스토패크(Histopaque)-1077, A23187, 소 혈청 알부민, 톨루이딘 블루, 과산화후소, 나프톨 AS-MX 포스페이트, 패스트 블루 RR, 알시안 블루, 항-사람 IgE 및 디메틸설폭사이드(DMSO)을 구입하였다. 케이만 컴퍼니(Ann Arbor, MI)로부터 루코트리엔(LT)C4 ELISA 키트를 구입하였다. 임뮤노테크(Westbrook, ME)로부터 히스타민 ELISA 키트를 구입하였다. 디니트로페닐(DNP)-BSA(웨이 외, 1986, J.Immunol., 137:1993-2000), 모노클로널 항 DNP-IgE(리우 외, 1980, J.Immunol., 124:2728-2737) 및 FcεRIa 체인 항체, 22E7(리스케 외, 1991, J.Biol. Chem, 266:11245-11251)의 제조가 기재되어 있다. 겐짐(Genzyme: Cambrideg, MA)으로부터 재조합 hSCF 및 IL-4를 구입하였다. 케미콘(Temecula, CA)로부터 알칼리 포스페타제 표지된 항-트립타제 항체를 구입하였다. 퀄리티 콘트롤 바이오케미컬(Hopkins, MA)로부터 친화성 정제된 JAK3 및 STAT5 항체를 구입하였다. 업스테이트 바이오테크놀러지사로부터 항-포스포티로신 모노클로널 항체(Mab)을 구입하였다. 칼비오켐(San DIEGO, CA)로부터 사람 IgE을 구입하였다.

비만 세포 배양

RBL-SH3 세포: RBL-SH3 세포는 악터 루벤 피. 시라가니암(분자생물학 및 면역학 실험실, 국립 덴탈 연구원, 국립보건원)으로부터 제공받았다. 이들 세포들을 20% 태아 송아지 혈청으로 보충된 이이글 필수 배지 내에서 75- 또는 150- ㎠ 플라스크에서 단층으로 배양하여 보존하였다.(하마위 외, 1995, Cellular Signalling 7 : 535-544).

마우스 비만 세포:

앞서 설명한 바와 같이, 25% WEHI-3 세포 상청액으로 보충된 배지에서 JAK3-눌(Jak3-/-) 마우스들 및 Jak3+/+ 대조군 마우스들의 골수 시편으로부터 3주 동안 배양하였다.(말라비야 외, 1993, L.Biol. Chem., 268:4939-4944; 말라비야 외, 1994a, J.Immunol., 152:1907-1914). 세포 밀도는 약 염기에서 1x10⁵세포/ml 로 조정하였다. 3 주 후에, 톨루이딘 블루 및 알시안 블루로 착색하여 비만 세포를 특성조사하였다. 비만 세포는 톨루이딘 블루로 착색된 후, 변색성 입자를 보였음에 반해, 알시안 블루는 특이적으로 황산크론드로이틴을 함유하는 비만 세포 입자만 착색하였다.

사람 비만 세포 : 50 ng/ml rhSCF, 2 ng/ml rhIL-4의 존재하에서 사람 태아 간(임신 기간 16-21 주)을 5주 동안 배양하였다(크시아 외, 1997, J.Immumol., 159:2911-2921). 배양 배지는 처음 2주 동안 1주에 한번씩, 그 다음부터는 1주에 2번씩 신선한 배지로 교환하였다., 5주 말에는, 트립다아제 착색을 기초하여, 태아 간 유래 세포 배양액은 70% 이상의 비만세포를 포함하였다(이라니 외, 1989, J.Histochem. Cytochem, 37:1509-1515).

공초점 현미경 :

공초점 레이저 주사 현미경에 이어 일차 및 이차 항체를 가지는 비만세포의 착색을 앞에서 상세히 설명한 바와 같이 수행하였다(우큰 외, 1998, Clin. Cancer RES., 4:901-912). 적당한 일차 및 이차 항체로 착색한 후, 비결합 항체들을 제거하기 위해 이 세포들을 3회 세척하였다. 10분 동안 toto-3(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 커버슬립을 배양함으로써 DNA 표지를 수행하였다. 과량의 염색약은 PBS-0.1%트리톤 X-100으로 세척하였다. 벡타실드(Vectashield)(Vector laboratories, Inc, Burlingame, CA)으로 장착한 후에 MRC 1024 레이저 주사 현미경하에서 세포들을 가시화하였다. 표준 방법(우큰 외, 1998, Clin. Cancer Res., 4:901-912)에 따라 항-JAK3(위트헌 외, 1999, Lymphoma Leukemia, in press) 및 항-튜블린(clone B-5-1-2, 시그마 케미컬, St.Louis, MO) 항체를 사용하였다.

면역복합체 키나제 분석법. 가을의 행렬구더기(armywarm)인 스포도테라 프루지페르다의 낮자세포로부터 유래된 Sf21(IPLB-SF21-AE)세포(베실로브 외, 1999, J.Biol. Chem,. 274:1646-1656)을 인비트로젠으로부터 입수한 후, 10% FBS 및 1.0% 항생제/항균제가 보충된 그레이스 곤충 세포 배지에서 26-28℃로 보존하였다(GIBCO-BRL). 1L 벨코 스피너 플라스크내에서 총 배양액 부피 600ml에서 60-90 rpm, 0.2 - 1.6 x 10⁶/ml에서 현탁액으로 보존하였다.

앞서 설명한 바와 같이, Sf21 세포를 BTK, SYK, JSK1, JSK2 또는 JAK3에 대한 바큐로바이어스 발현벡터로 감염시켰다(마하잔 외, 1999, J.Biol. Chem.,274:1646-1656). 사람 B-계통 백혈병 세포주 NALM-6 및 EBV-형질전환된 림포블라스토이드 B-세포주 KL-2을 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 보존하였다.(우큰 외 , 1996, Science, 273: 1096-1100: 우큰 외, 1995, Science, 267: 886-891). 세포들을 채취하고, 용균하였다(10 mM Tris pH 7.6, 100mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 50 mM NaF, 100mM Na₃VO₄, 50mg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 10mg/ml 아프로토닌, 10mg/ml 루펩틴), 그리고 그 키나제를 보고된 바와 같이 용해질로부터 면역침강하였다(Vassilev et al., 1999, J.Biol. Chem.,.724:1646-1656). 곤충 세포로부터의 면역침강에 사용된 항체들은 다음과 같다: 폴리클로널 래빗 항-BTK 혈청, 폴리클로널 래빗 항-JAK1(HR-785), 캣# sc-277, 폴리클로널 염소 항-JAK2(C-20-G), 캣.#sc-294-G, 폴리클로널 래빗 항-JAK3(C-21), 캣# sc-513, 폴리클로널 래빗 항-SYK(C-21), 캣# sc-929(산타 크루츠 바이오테크놀러지). BTK 및 LYN에 대항하는 항체는 이전에 기술된 바 있다(마하잔 외, 1995, Mol.Cell.Biol.,15:5304-5311; 우큰 외, 1996, Science, 273: 1096-1100; 우큰 외, 1995, Science, 267:886-891: 우큰 외, 1996a, J.Biol.Chem., 271:6396-6397.; 바실레브 외, 1999, J.Biol.Chem., 274:1646-1656; 굿만 외, 1998, J.Biol.Chem., 273:17742-17748). 이들 참고문헌에 기재된 바와 같이, 면역-복합체 키나제 분석을 수행하였다. 키나제 분석은 상술한 참고문헌에서와 같이,시험 화합물에 면역침강된 티로신 키나제를 시험 화합물에 1시간 노출한 후 수행하였다(마하잔 외, 1995, Mol.Cell.Biol.,15:5304-5311; 우큰 외, 1996,Science, 273: 1096-1100). 이전에 기재한 바와 같이, 면역침강물을 웨스턴 블롯 분석하였다(우큰 외, 1995, Science, 273:1096-1100: 우큰 외, 1996a, J.Biol.Chem., 271:6396-6397.; 바실레브 외, 1999, J.Biol.Chem., 274:1646-1656).

인슐린 수용체 키나제(IRK)분석을 위해, 대략 80% 융합으로 성장한 HepG2 헤파토마 세포를 혈청 없는 DMEM으로 1회 세척하고, CO₂배양기내에서 37 ℃에서 3시간동안 굶겼다. 이어서, 세포들을 실온에서 10분동안 인슐린으로 자극시켰다(Eli Lilly, 캣# CP-410;10유닛/ml10 X 10⁶세포). 이 IRK 활성화 단계에 이어서, 세포들을 무혈청 배지로 1회 세척하고, NP-40 완충용액으로 용균하고, IRK로부터 항-IRb 항체로 면역침강하였다.(산타 크루츠, Cat# SC-711, 폴리클로널 IgG). 이 면역 복합체 키나제 분석을 행하기 전에, 이들 비드들을 키나제 완충용액으로 평형화시켰다(30mM Hepes pH 7.4, 30 mM NaCl, 8mM MgCl2, 4 mM MnCl₂). LYN 을 앞서 설명한 바와 같이 NALM -6 사람 백혈병 세포의 전체 세포 용균액으로부터 면역침강하였다(우큰 외, 1995, Science, 267:886-891).

JAK3 면역 복합체 분석에서(굿맨 외, 1998, J.Biol.Chem., 273:17742-17748; 위트헌 외, 1999, Lymphoma Leukemia, in press"; 마하잔 외, 1999, J.Biol.Chem., in press). KL-2 EBV-형질전환된 사람 림포블라스토이드 B 세포(네이티브 JAK3 키나제 분석) 또는 곤충 난소세포(재조합 JAK3 키나제 분석)을 NP-40 용균 완충용액(50mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 100 μM 소듐 몰리브데이트, 8 μg/ml 아프로티닌, 5 μg/ml 로이펩틴, 및 500 μM PMSF)으로 용균하고, 13000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 샘플들을 JAK3에 대해 제조된 항혈청으로 면역침강하였다. 이 항혈청들을 희석하고, 프로틴 A 세파로스 15㎕로 배양하여 면역 복합체를 수집하였다. NP-40 용균 완충용액으로 4회 세척한 후, 이 프로틴 A 세파로스 비드들을 키나제 완충용액(20 nM MOPS, pH 7.0, 10mM MgCl₂)에서 1회 세척하고, 같은 완충용액에서 다시 현탁하였다. 반응은 25μCiγ[³²P]ATP(5000Ci/mMole)과 비표지된 ATP를 5μmM의 최종용액으로 첨가함으로써 개시되었다. SDS 샘플 완충용액에 4 분동안 가열함으로써 반응을 종결하였다. 샘플은 9.5%SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 시험되었고, 표지된 단백질은 오토라디오그래피에 의해 검출될 것이다. 전기영동에 이어, 키나제 겔을 와트만 3M 필터지 상에서 건조시키고, 필름 상에서의 오토라디오그래피와 함께 분자 이미저(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 포스포이미지에 가하였다. 각각의 약물 농도에 대하여, 키나제 활성 인덱스(KA)를 포스포이미저 유닛(PIU)의 키나제 활성을 기준 샘플의 그것과 비교하여 측정하였다. 몇몇 실험에서, 상술한 바와 같은 콜드 키나제 분석을 수행하였다(우큰 외., 1998, Clin, Cancer Res., 4:901-912).

전기영동 이동성 전이 분석법(EMSAs). 시토킨-유도 STAT 활성 상에서의 디메톡신퀴나졸린 화합물을 검사하기 위하여 EMSAs을 수행하였다. 구체적으로는, 32Dc11/IL2Rβ세포(성 쥬드 칠드런즈 리서치 호스피탈의 제임스 일레로부터 입수)을 FBS 로 보충된 RPMI 내에서 8 X 10⁶/ml으로, WHI-P131, WHI-P154 또는 대조군 화합물인 WHI-P132에 대해 최종 농도 1% DMSO 에서 10μg/ml로 노출하고, 이어서 본문에서 기재한 바와 같이, IL2 또는 IL3으로 자극하였다. 세포들을 15분 후에 수집하고 용균 완충용액에서 재현탁하였다(100 mM Tris -HCl pH 8.0, 0.5% NP-40, 10% 글리세롤, 100 mM EDTA, 0.1 mM NaVO3, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 3 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 펩스타틴 A, 1μg/ml 로이펩틴 및 0.2 mM PMSE). 용해질들은 30분 간의 원심분리에 의해 프리클리어(preclear)하였다. 세포 추출물들(대략 10 ㎍)을 폴리(dl-dC) 2 ㎍으로 30분 동안 배양하고, IRF-1 STAT DNA 결합 시퀀스(산타 크르츠 바이오테크놀러지, 산타 크루츠, CA)를 나타내는 폴리 누클레오티드 키나제-32P 표지된 이중 가닥 DNA 올리코뉴클레오티드 1ng으로 30분간 배양하였다. 샘플들을 비-변성 PAGE에 의해 분해하고, 오토라디오그래피에 의해 가시화하였다.

비만 세포의 자극 ;

RBL-2H3 세포들 및 JAK3-/- 또는 JAK3+/+ 마우스들의 골수 비만 세포로부터 배양된 골수 비만 세포(BMMC)을 48-웰 조직 배양 플레이트에서 37 ℃에서 1시간 동안 모노클로널 항-DNP IgE 항체(0.24 mg/ml)에 감작시켰다. RBL-2H3 세포는 플레이트의 고정되도록 된 반면, BMMC 는 현탁하여 사용하였다. 비결합 IgE를 포스페이트로 완충된 염류로 세포를 세척하여 제거하였다. BMMC를 세척한 후에, RPMI-헤페스 버퍼에서 재 현탁하였고, 1 mM 염화칼슘을 함유하는 PIPES-완충 염류을 RBL-2H3 세포의 단일층에 첨가하였다. 이 세포들은 37 ℃에서 30 분 동안 20 ng/ml DNP-BSA으로 자극하였다. 이 플레이트를 4 ℃에서 10분간 200g 에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 보존하였다. RBL-2H3 세포 펠릿을 포스페이트 완충 염류로 세척하고 0.1% Trioton X-100을 함유하는 PIPES 완충 염류로 가용화하였다.

태아 간 유래 사람 비만 세포를 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 타이로드 완충용액에서 현탁하고, 15분 동안 항-FcεRI 항체 22E7으로 대항(challenge)하였다. 몇몇 실험에서, 태아 간 유래 사람 비만 세포들을 5 x 10⁶/ml의 세포 밀도로 배양 배지에 현탁하였고, 4 ℃에서 3 시간 동안 IgE(150 μg/ml)으로 감작하였다. 감작시킨 후, 세포들을 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 타이로드 완충용액으로 세척하고, 37 ℃에서 30분 동안 마우스 모노클로널 항-사람 IgE(40μg/ml)으로 대항하였다. 시험 화합물의 효과를 조사하기 위해, 대항에 앞서 비만세포들을 지시 농도에서 WHI-P131, WHI-P154, WHI-P111 또는 WHI-P112로 또는 비히클로 1시간 동안 배양하였다.

조정자 방출 분석 : 세포 없는 상청액 및 가용화된 세포 펠릿 내의 히스타민 함유량을 상업적으로 입수가능한 효과 면역분석법을 사용하여 평가하였다(말라비야 외, 1996a, J.Invest. Dermotol, 106:785-789). 루코트리엔(LT)C₄레벨을 면역분석에 의하여 세포없는 상청액내에서 평가하였다(말라비야 외, 1993, J.Biol.Chem., 268:4939-4944). TNFα 레벨을 표준 사이토톡시시티 분석을 사용하여 세포 없는 상청액에서 평가하였다(말라비야 외, 1996, Nature, 381 : 77-80). RBL-2H3 세포에서, β-헥소사미니다제 방출을 전술한 바와 같이, 세포 없는 상청액 및 Triton X-100 사용화된 펠릿에서 평가하였다(오자와 외, 1993, J.Biol.Chem., 268:1749-1756). 트립타제 레벨을 세포 없는 상청액 및 태아 간 유래 사람 비만 세포의 펠릿에서 전술한 바와 같이 정량하였다(크샤 외, 1997, J.Immunol., 159:2911-2921).

증식 분석 : SCF에 대한 비만 세포의 증식성 반응을 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리윰 브로마이드)분석(뵈링어 멘하임 코퍼레이션, 인디아나폴리스, IN)(우큰 외, 1998, Clin. Cancer Res., 4:901-912)를 이용하여 측정하였다. 야생형 및 JAK3 눌 BMMC를 37 ℃에서 96 시간동안 100 ng/ml SCF의 존재 및 부존재하에, 100㎕ 매질에서 0.1 X 10⁵세포/ml의 세포 밀도에서 96-웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 각각의 웰에 10 ㎕의 MTT(최종 농도 0.5 mg/ml)을 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하여 대사적으로 활성인 세포들과 반응함으로써 포르마잔 결정이 형성할 수 있도록 하였다. 이 포르마잔 결정을 0.01N-HCl에서 10% SDS을 함유하는 용액내에서 37 ℃에서 밤새 가용화하였다. 각각의 웰의 흡광도를 540nm의 파장에서의 마이크로플레이트 판독기(Labsystems)에서 측정하였다.

IgE 결합 분석 : RBL-2H3 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 0.24 mg/ml 모노클로널 항-DNP IgE 항체로 배양하였다. 이 세포들을 1% BSA를 함유하고 10 μg/ml 항-IgE-FITC(PharMingan Laboratories)로 표지된 염류로, 4 ℃에서 30분 동안 3회 완전 세척하였다. 배양 후, 이 세포들을 플로우 사이토메트리로 분석하였다.

칼슘 측정 : 상술한 바와 같이 칼슘 고정화 분석을 행하였다(추 외, 1998, Clin. Cancer Res., 4;2967-2976). RBL-SH3 세포에 플루오-3을 장착하고, 상술한바와 같이, WHI-P131의 존재 및 부존재하에서, DNP-BSA로 자극하였다. 칼슘 반응은 도립 현미경(inverted microscope)칼슘 이미징 장치에 의해 측정하였다(Universal Imaging Co. West Chester, PA). 여기(excitation) 파장은 485 nm였고, 검출용 방사파장은 535nm였다. 각 세포들의 형광 이미지를 1프레임/s의 속도에서 CCD72 비디오 카메라(Dage-MTI Inc., Michigan City, IL)로 얻고 컴퓨터로 디지털화하였다.

비만 세포 용해질의 면역 복합체 키나제 분석 및 웨스턴 블롯 분석

RBL-2H3 세포를 상술한 바와 같이, WHI-P131의 존재 및 부존재하에 지시된 시간 동안 자극하였다. 세포들을 채취하고, 용균하였고(10 mM Tris pH 7.6, 100 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 50 mM NaF, 100 mM NaVO₄, 50 mg/ml 페닐메틸설포닐 플로라이드, 10 mg/ml 아프로티닌 및 10 mg/ml 로이펩틴), 키나제를 상술한 바와 같이, 용해질로부터 면역침강하였다(우큰 외, 1995, Science, 267: 886-891; 우큰 외, 1996, Science, 273: 1096-1100). 면역침강에 사용되는 JAK3, STAT5 및 SYK에 대항하는 항체들을 이전에 기술하였다(우큰 외, 1995, Science, 267:886-891; 우큰 외, 1996, Science, 273:1096-1100; 위트헌 외, 1999, Lymphoma Leukemia, in press"; 마하잔 외, 1999, J.Biol.Chem, in press). 면역침장 및 ECL 화학발광 감지 시스템을 사용한 면역블롯팅을 전술한 바와 같이 수행하였다(우큰 외, 1996, Science, 273: 1096-1100).

아나필랙시스 모델 : 마우스에서의 피동 피부 아나필락시에대한 WHI-P131의효과를 조사하기 위하여, BALB/c 마우스의 등면에 30-게이지 바늘을 사용하여 20 ㎕ 부치 내에서 20 ng의 DNP-IgE(좌이) 또는 PBS(우이)을 내피주사하였다(미야지마 외, 1997, J.Clin.Invest., 99:901-914). 20시간 후에, 마우스들을 항체 대항에 앞서, 1시간 간격으로 2회 WHI-P131(10 또는 mg/kg i.p.)으로 처리하였다. 대조 마우스들을 동일 부피의 비히클로 처리하였다. WHI-P131 또는 비히클의 최종 투여후 30분 후에, 마우스들을 200㎕ 2% 에반스청 염료 내에서 100㎍ 항원(DNP-BSA)로 정맥내에 대항하였다. 마우스들을 항원 대항 이후 30 분에, 경부 탈구 되었다. 아나필랙시스-관련 혈관 과침투의 측정으로서, 에반스청 염료의 넘침을 정량하기 위하여, 8mm 피부 시편을 마우스의 귀에서 제거하여 2 ml의 포름아미드에서 잘게 저미고, 수조에서 2시간 동안 80 ℃에서 배양하여 염료를 추출하였다. 흡광도는 620nm에서 읽혔다. 이 데이타는 플라즈마 발산 인덱스로 표시하였다(즉, 620 nm 에서 PBS 처리 귀들에 대한 광학밀도의 증가 배수).

피동 조직 아나필랙시스를 유도하기 위하여, BALB/c 마우스들을 DNP-IgE 50 ㎍으로 정맥내 감작시켰다. 24시간에, 0.5% 에반스청(200㎕)와 함께, DNP-BSA(2 mg)를 정맥내로 투여하였다. 혈관 누수를 보정하기 위하여, 동물들을 항원 대항 후 30 분에, 희생시키고, 이들을 발바닥을 블루 착색 조사하였다. 플라즈마에서의 히스타민 레벨을 항원 대항후 5분에 측정하였다. 마지막으로, 혈액 샘플을 역궤도 정맥관통에 의하여 눈 정맥총으로부터 얻었고, 히스타민 레벨을 상업적 키트를 이용하여 ELISA에 의해 측정하였다(Immunotech, West Brook, ME, 말라비야 외, 1996, Nature, 381: 77-80). 조직 비만 세포 과립감소의 조직병리학적 평가를 위해, 마우스의 귀를 DNP-BSA 주사 후 1시간에 제거하고, 10% 완충 포르말린에서 고정하였다. 처리된 얇은 섹션(3-5 ㎛)을 아비딘-FITC(6.25 μg/ml)로 2 시간 동안 착색하고, PBS로 세척하여 비결합 염료를 제거하고, 완충 글리세롤, 30mM 트리에틸렌디아민, pH 8.6에 장착하였다(말라비야 외, 1994, J.Clin.Invest., 93:1645-1653).

항원 유도 능동 아나필랙시스를 위한 뮤린 모델에서, 마우스들을 200㎕ 수산화알루미늄 겔 내에서 2 mg으로 감작하였다(Reheis Inc., Berkeley, NJ). 10 일 후, 아나필랙시스 쇼크를 200 ㎍BSA를 동물에 정맥내 주사하여 유도하였다.

마우스의 독성 조사

마우스들 내에서의 WHI-P131의 독성 프로파일을 종전에 보고된 바와 같이 검사하였다(우큰 외, 1995, Science, 267:886-891; 우큰 회, 1998, Clin. Cancer Res., 4:901-912). 암컷 BALB/c 마우스들을 사용하였고, 기면병, 청결도 및 치사율을 매일 모니터하였다. 사망시, 검시를 수행하였고, WHI-P131 투여의 독성 효과를 평가하였다. 조직병리학적 연구에서, 조직을 통상의 방법에 따라 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 탈수하고, 파라핀에 끼워넣었다. 6 미크론 조직 절편이 부착된 유리 슬라이드를 제조하고, 헤모톡실린과 에오신(H&E)으로 착색하였다. 여성 BALB/c 마우스들을 10% DMSO가 첨가된 0,2 ml PBS내에서 또는 10% DMSO 단독이 첨가된 PBS(대조 마우스) WHI-P131을 복강내 환약 주입하였다. 처리 기간 전체에 걸쳐서, 진정제나 진통제를 사용하지 않았다. 마우스들의 1일 LD₅₀수치의 측정을 위해 치사율을 매일 모니터하였다. 30일 모니터링 시점까지 생존한 마우스들을죽이고, 임의로 선택한 마우스들로부터 조직을 즉시 채취하고, 10% 중성 완충 포르말린에 보존하였다. 조직 병리학적 평가를 위해 채취된 표준 조직이 포함된다.: 뼈, 골수, 뇌, 맹장, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절,난소, 췌장, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 방광 및 자궁(가능하다면).

약력학적 연구

약력학적 연구에서, 마우스에 꼬리 혈관을 통한 정맥내적으로 또는 복강내로, WHI-P131의 300 μg/마우스(-12.5mg/kg = 34 μmols/kg)의 환약을 주입하였다. 혈액 샘플을 3분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분 및 1시간 및 이들 시간전에, 그리고 WHI-P131 투여 이후 4시간 및 8시간 후에, 역궤도 정맥관통에 의한 눈 정맥총으로부터 얻었다. 모든 채취된 혈액 샘플을 헤파린화하고, 마이크로원심분리기에서 7,000 xg에서 10분간 원심분리하여 혈장을 얻었다. 이 혈장 샘플을 -20 ℃에서 분석시까지 보존하였다. 혈장의 부분표본을 추출 및 HLPC 분석에 사용하였다. 약리동력학적 모델링 및 약리동력학적 지수 계산은 약리동력학적 소프트웨어, WinNonline 프로그램, 버전 1.1(Scientific Consulting Inc., Cary, NC)를 사용하여 수행하였다. 농도 데이타를 1/농도에 의해 측정하였다. 적당한 약리동력학적 모델은 최저 가중 제곱 잔류량, 최저 슈바르츠 임계점(SC), 최저 Akaike 정보 임계점(AIC) 수치, 고정 지수의 최저 표준 오차 및 잔류량의 분산도에 기초하여 선택한다. 제거 반감기는 혈장 농도 프로파일의 최종면의 선형 소급 분석에 의해 추정된다. 농도 시간 곡선(AUG)하에서의 영역은 최초(0 h) 및 최종 샘플링 시간과 플러 C/k (이 때, C는 최종 샘플링의 농도이고, k는 제거율 상수이다)사이의 사다리꼴법칙에 의해 계산된다. 조직 클리어러슨(CL)은 투여량을 AUC로 나눔으로써 결정된다. 정지-상태에서의 분포의 외관부피는 다음 방정식을 시용하려 계산하였다. Vss + 투여량 * AUMC/(AUC)². 생체이용도(F)는 다음 방정식 F(%) = AUCip X 투여량iv/AUCiv X 투여량ip 에 의해 결정된다.

혈장 WHI-P131 레벨의 HLPC 분석

매우 민감한 정량적 HLPC 감지 방법(첸 외, 1998, J.Chromatography B(Biomedical sciences), in press)을 WHI-P131의 약리동력학을 결정하기 위하여 사용하였다. 요약하면, HLPC 시스템은 자동 전자 가스제거기가 장착된 휴렛 패커드(HP) 시리즈 1100, 정량 펌프, 자동샘플, 자동온도조절식 컬럼 구획, 다이오드 어레디 탐지기 및 데이타 분석용 켐스테이션 소프트웨어 프로그램을 가지는 컴퓨터로 구성된다. 휴렛 패커드사(San Fernando, CA)로부터 250 X 4 mm Lichrospher 100, RP-18(5㎛) 분석 컬럼 및 4 x 4 mm Lichrospher 100, RP-18(5㎛) 가드 컬럼을 입수하였다. 이동상으로서, 트리플루오르아세트산(TFA) 0.1% 및 트리에틸아민(TEA)(28:72, v/v)을 함유하는 아세토니트릴/물을 사용하였다. 검측 파장은 340nm로 맞추었다. 피크의 폭, 반응시간 및 슬릿은 0.03분 이상, 0,5초 및 8nm로 조정하였다. WHI-P131 레벨의 평가를 위해, 내부 표준 WHI-P154(50 μM) 10 μL을 100μL 혈장 샘플에 첨가하였다. 추출을 위해, 7 ml 클로로포름을 혈장 샘플에 첨가하고, 이 혼합물을 3 분동안 완전히 와류시켰다. 원심분리에 이어서(300 xg, 5분), 수성층을 아세톤/드라이아이스로 동결시키고, 유기상을 깨끗한 시험관으로 옮겼다. 클로로포름 추출액을 질소의 느리고 일정한 기류 하에서 건조시켰다. 잔류물을 100 μL의 메탄올에서 재구성하였다: 물(9:1) 및 이 용액의 50 μL 약수(aliquot)을 HLPC 분석에 사용하였다. 상기한 크로마토그래피 분리조건하에서, WHI-P131 및 WHI-P154에 대한 체류시간은 각각 5.1분 및 9.5 분 이었다. 체류시간에, WHI-P131과 그 내부 표준 WHI-P143를 블랭크 혈장으로부터의 간섭 피크가 전혀 없었다.

실시예 5: 비만 세포 중의 야누스 키나제의 발현 및 IgE 수용체/FcεRI-매개 활성

도 4a에 보인 바와 같이, JAK3은 RBL-2H3 비만 세포에서 풍부하게 나타난다. 이러한 사실은 본 발명자들로 하여금 IgE 수용체/FcεRI-매개 비만 세포 활성에 있어서 JAK3의 잠재적 관여를 조사할 필요성을 느끼도록 하였다. 모노클로널 항-디니트로페닐 (DNP)-IgE 항체에 의해 이미 감작된 RBL-2H3 비만 세포 상의 IgE 수용체의 IgE와 특이적 항원 DNP-BSA와의 가교는 JAK3의 급속 활성을 가져왔다(도 4b)

IgE 수용체/FcεRI-매개 비만 세포 반응에서 JAK3의 역할을 분명히 하기 위하여, 본 발명자들은 배아 간세포내의 Jak3 유전자의 타켓 파괴에 의해 생성된 야생형 및 JAK3-눌 마우스(Jak3-/-)의 골수로부터 비만세포를 배양하였다.(노사카 외, 1995, Science, 270; 800-802). 동일한 수의 비만 세포(범위 : 10⁶핵형성 골수 세포당 3.5 - 3,9 x 10⁵)를, WEHI-3 상청액(25% v/v)이 보충된 매질 내에서 3주 배양된 후에, JAK3+/+ 및 Jak3-/- 마우스들의 골수 시험편으로부터 구하였다.

JAK3-/- 비만세포는 알시안 블루 및 톨루딘 블루에 대해 전형적인 비만 세포 착색 특성을 보였다(데이타 미도시). JAK3+/+와 JAK3-/- 비만 세포와의 FcεRI 수용체 발현을 비교할 때, JAK3+/+ 및 JAK3-/- 비만 세포가 IgE 수용체/FcεRI와 유사한 레벨을 나타내는 것을 발견하였다(도 5a).

따라서, JAK3 결핍은 비만세포 상의 IgE 수용체 발현에 영향을 미치지 않는다. 완전히 분화된 비만 세포는 기능성 c-키트 수용체 및 리간드, 간세포 지수(SCF), 비만 세포의 트리거 증식에 의한 c-키트 수용체의 활성을 나타낸다.(드보락 외, 1994, Am. J. Pathol. 144: 160-170). 본 발명자들은 MTT 분석법을 사용하여 SCF에 대한 JAK3-/- 대 JAK3+/+ 비만세포의 증식성 반응을 비교하였다. 0.1 X 10⁵세포/ml의 세포밀도에서, JAK3-/- 및 JAK3+/+ 비만세포를 37 ℃에서 96시간동안, 100 ng/ml SCF의 존재 또는 부존재하에서 배양하였다. SCF 배양의 마지막에, JAK3+/+ 및 JAK3-/- 비만 세포의 배양으로부터 거의 동일한 세포수를 얻었다(도 5B). 따라서, JAK3 결핍은 SCF에 대한 비마 세포의 시험관내 증식성 반응에 영향을 주지 않는다.

비만 세포 반응에서 JAK3의 잠재적 역할을 더욱 측정하기 위하여, 본 발명자들은 JAK3+/+ 및 JAK3-/- 비만 세포로부터의 감염성/알러지 매체의 IgE 수용체/페리 매개 해리를 비교하였다. JAK3+/+ 및 JAK3-/- 마우스의 곳루세포로부터 배양된 비만세포들은 항-DNP 모노클로널 IgE로 감작디었고, DNP-BSA로 대항되었다. 미리형성한 과립-관련 히스타민, 비만 세포 과립감소을 위한 마커의 방출은 세포 없는상청액 및 세포 펠릿내의 히스타민 함유량을 비교함으로써 측정하였다. 새로 합성된 배개체의 방출에 대한 표지로서 작용하는, 아라키돈산 대사산물 LTC₄의 방출은 세포없는 상청액의 LTC₄레벨을 측정함으로써 추정하였다. JAK3-/- 비만 세포와 JAK3+/+비만 세포의 세포 히스타민 함유량이 동일하다 하더라도, JAK3-/- 비만세포들은 JAK3+/+ 비만 세포에 의해 방출되는 히스타민 량의 대략 절반을 방출하였다(도 5c). IgE 수용체/FcεRI가교 후의 LTC₄방출(도 5d) 역시 실질적으로 JAK3-/-비만 세포의 감소였다. 이 결과는 JAK3이 IgE 수용체/FcεRI 매개 비만 세포 반응에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 시험관내 결과에 일치하게, BSA-감작된 Jak3-/- 마우스들(N=3)어느 것도 본 발명자들의 능동 조직 아나필랙시스(ASA) 모델(Amir and English, 1991)에서 복강내로 주사되는 200 ㎍ BSA에 의한 재대항에 대한 부작용을 보인 반면, 모든 BSA-감작 JAK3+/+ 마우스들(N=5)은 동일한 실험 조건하에서(데이타 미도시), BSA 재대항 이후 10분 이내에 심한 아나필랙시스 반응을 나타내었다. 이로서, 이들 실험들은 비만 세포의 IgE 수용체/FcεRI-매개 활성이 IgE 수용체/FcεRI-결합에 반응하는 다면적 생물학적 비만 세포 및 비만 세포-매개 과민반응에 중요한 생화학적 JAK3-활성 신호를 자극한다는 선례없는 증거를 제공하였다.

실시예 6: JAK-3 활성에 대한 디메톡시 퀴노잘린의 효과

본 발명자들은 우선, KL2 EBV-형질전환된 사람 림포블라스토이드 B 세포주로부터 면역침강된 사람 JAK3의 효소활성에 대한 합성된 디메톡시퀴나졸린 화합물의 영향을 비교하기 위하여 면역 복합체 키나제 분석법을 사용하였다. 0.6 μM 내지2.3 μM에 이르는 매우 유사한 추정 Ki 값을 가지고, 미크로몰농도에서 유의적인 JAK3 억제활성을 가지는 것으로 예측된(이것은 25 μM 내지 72 μM에 이르는 추정 Ki값을 가지는 다른 화합물에 대해서는 그렇지 않다)WHI-P131, WHI-P154 및 WHI-P97은 투여량-의존 방식으로 JAK3을 억제하였다. 측정된 IC50 값은, WHI-P131에 대해서는 9.1μM, WHI-P97에 대해서는 11.0μM, WHI-P154에대해서는 27.9 μM, 다른 모든 디메톡시퀴나졸린 화합물(표1)에 대해서는 300 μM 이상이었다. WHI-P131 및 WHI-P154는 버큘로바이러스 벡터 발현시스템에서 발현된 재조합 뮤린 JAK3에 대하여 시험되었고, 또한 각각 23.3μg/ml(~ 78 mM, 도 6a) 및 48.1 μg/ml(~ 128 μM, 도 6b)의 IC50 값을 가지고, 투여량-의존적인 방식으로 억제하였다. 재조합 JAK3을 억제하기 위한 WHI-P131 및 WHI-P154의 능력은 4개의 독립적인 실험에서 활증되었다. 이들 키나제 분석 결과는 상기한 본 발명자들의 모델링 연구와 일치한다.

중요하게도, WHI-P131 및 WHI-P154는 면역 복합체 키나제 분석에서, 재조합 JAK1 또는 JAK2에 대항하는 어떠한 탐지가능한 억제활성을 보이지 않았다(도 6c & d). 32Dc11/IL2Rβ 세포에서의 시토킨-유도 STAT 활성에 대한 영향을 조사하기 위하여, 전기영동 이동성 전이 분석법(EMSAs)을 수행하여, 이들 디메톡시퀴나졸린 화합물의 JAK3 특이성을 확인하였다. 도 6e에 보인 바와 같이, WHI-P131(10 μg/ml = 26.6 μM) 및 WHI-P154(10μg/ml = 26.6 μM)(그러나 대조 화합물 WHI-P132에서는 그러하지 않고, 10 μg/ml = 33.6 μM)은 IL-2에 의한 자극 이후, JAK3- 의존 STAT 활성을 억제하였으나, 이들은 IL-3에 의한 자극 이후, JAK1/JAK2-의존 STAT활성에는 영향을 미치지 않았다. 모델링 연구는 이 민감한 JAK3 특이성은 부분적으로는 JAK3의 촉매 지점에 존재하고 JAK1 및 JAK2에서 글리신으로 변화하는 알라닌 잔기(Ala966)에 기인할 수 있음을 암시한다. 결합 디메톡시퀴나졸린 화합물의 페닐링 근처에 위치한 알라닌 기는 페닐기에 보다 큰 소수성 접촉을 제공할 수 있고, 이로서, JAK1 및 JAK2내의 결합 지점의 영역 내의 보다 작은 글리신 잔기와 비교하여, 더 높은 친화성을 부여할 수 있다.

실시예 7: JAK-3 억제제의 특이성

JAK3 억제제의 이 새로운 디메톡시퀴나졸린 류에 대한 비-야누스 계열 단백질 티로신 키나제의 활성을 조사하도록 고안된 시험을 위해 WHI-P131 화합물을 선택하였다. JAK3에 대한 WHI-P131의 억제 활성은 특이적이었는데, 이는 ZAP/SYK 계열 티로신 키나제 SYK, TEC 계열 티로신 키나제 BTK, SRC 계열 티로신 키나제 LYN, 및 수용체 계열 티로신 키나제 IRK를 포함하여, 350 μM정도의 높은 농도에서도 다른 단백질 티로신 키나제의 효소활성에 영향을 주지 않았기 때문이다(도 7).

이들 PTK의 구조 분석은 HCK(시세리 외, 1997)(이것은 LYN에 대한 동종 모델로서 작용하였다) 및 IRK(허버드, 1997)의 결정 구조를 이용하여 수행하였고, JAK3, BTK 및 SYK의 동종 모델을 구성하였다. 이 분석은 WHI-P131의 특이성이 기여할지도 모르는 상이한 티로신 키나제들의 촉매 결합 지점내에 몇몇 비보존 잔기가 위치하였음을 밝혔다. 도킹된 억제제에 가장 가깝게 위치한 이러한 잔기는 JAK3 내의 Ala966(도 5의 영역 E)으로, 이것은 WHI-P131의 소수성 페닐고리와 가장 바람직한 분자표면접촉을 제공할 수 있다. LYN이 JAK3(Ala966) 내에 보존되는 Ala 잔기를 WHI-P131을 함유함에도 불구하고, WHI-P131이 LYN을 억제하지 않는다는 사실은 다른 요소들(잔기 상이성)가 이들 선택성에 기여함을 암시한다. 티로신 키나제의 촉매 지점에서의 다른 비보존 잔기들은 영역 A 내지 F(도 5a)에 보여진다. 잔기들, 특히 결합 억제제와 직접 접촉하는 잔기들 내의 이들 상이점은 JAK3에 대한 WHI-P131의 관찰된 특이성에 중요한 역할을 한다.

실시예 8: 시험관내 비만 세포 반응에 대한 JAK3 억제제의 효과

래트 점막 비만 세포 주 RBL-2H3를 JAK3- 특이적 티로신 키나제 억제제 WHI-P13`로 처리하면, IgE 수용체 가교 후에 JAK3 활성을 폐기한다(도 8a & b). 분명히, WHI-P131은 IgE 수용체/FcεRI 가교 이후에 RBL-2H3 비만 세포에서의 SYK 활성을 막지 않았다(도 8c & d). 따라서, WHI-P131-처리 비만 세포 내의 JAK3 억제제의 어떠한 생물학적 결과도 불균형한 SYK 활성에 기여할 수 없었다.

비만 세포에서의 JAK3 억제의 생물학적 결과를 해명하기 위한 체계적 노력으로서, 본 발명자들은 JAK3 억제제 WHI-P131이 비만 세포에대한 IgE 수용체/FcεRI-매개 활성을 막을 수 있는지를 결정하기 위해 조사하였다. 비만세포의 IgE 수용체/FcεRI-매개 활성은, 막 접힘, 미소관 형성 및 액틴 중합(Apgar, 1997)으로 인하여 표지된 세포가 퍼지는 명확한 형태적 변경이 일어나기 때문에, 본 발명자들은 공초점 레이저 주사 현미경(Ghosh dhl, 1998)을 사용하여, RBL-2H3 비만 세포의 형태 및 표면 토포그래피(tophgraphy)의 활성-관련 변형에 대한 WHI-P131의 영향을 평가하였다. 비자극된 RBL-2H3 비만 세포의 거대다수(95%)가 분기 연장을 가지는 방추형태 및 수직방향의 미소관 덩어리를 나타내었다(도 9a). IgE/항원을 이용한IgE 수용체/FcεRI를 가교함에 의한 RBL-2H3 비만 세포의 활성화는, 극적인 세포 전개(spreading) 반응을 유도하였고, 세포의 93%은 세포질 전체를 통하여 일반화된 미소환 구성을 가지는 납작한 형태를 가졌다(도 9b). 30 μM의 농도에서 JAK3 억제제 WHI-P131을 2시간 배양하는 것은(다만, JAK3 억제 활성을 가지즌 비치환 부모 디메톡시퀴나졸린 화합물인 WHI-P258은 그러하지 아니하다), IgE/항원-유도 비만 세포 활성을 막고, 이는 전개반응의 두드러진 감소(23% 납작해짐, 58% 방추형) 및 미소관 구성(도 9c)에 의해 자명하다. WHI-P131와는 달리, 브로모-치환 대조 디메톡시퀴나졸린 화합물 WHI-P112는 JAK3을 억제하지 않고, 항원 유도 비만 세포의 전개반응 또는 미소관 구성상에 전혀 유의적인 영향을 가져올 수 없었다.(도 9g & h). 동시에, 본 발명자들은 이들 실험 조건하에서, RBL-2H3 세포들의 생존능력(트리판 블루 염료 배제 시험에 의해 예측된 바와 같이)에 대한 이 화합물의 영향을 시험하고, 이들이 300 μM 농도까지 세포 생존능력에 영향을 미치지 않음을 발견하였다.

실시예 9: 칼슘 고정화에 대한 효과

칼슘 유입이 IgE 수용체/FcεRI-매개 비만 세포 활성화의 최초 과정 중 하나이므로(밀라드 외, 1989; 하마위 외, 1995), 본 발명자들은 칼슘 이온 고정화가 JAK3 억제제인 WHI-P131에 의해 영향을 받는지 여부도 조사하였다. RBL-2H3 세포들을 IgE에 의해 감작하였고, DNP-BSA에의 감작에 앞서 Fluo-3을 장착하였다. 세포간 칼슘 이온 농도는 자극 이후 2-3분 이내에 최대치에 도달하였고(도 10), 이는 이전에 발견한 사실에 일치하는 것이다(밀라드 외, 1989; 웡 외, 1992). 대조적으로, RBL-2H3 세포가 30 μM WHI-P131의 존재하에, DNP-BSA로 감작되었을 때, 칼슘 반응은 없어졌다.(도 10). 따라서, JAK3은 비만 세포에서 IgE 수용체/FcεRI-매개 활성 및 칼슘 고정화에 필수적이다. 대조적으로 아이노마이신 유도 비특이적 비만세포 칼슘 반응은 WHI-P131에 의해 영향받지 않앗다(도 10).

실시예 10: 비만 세포 과립감소 및 조정자 방출

IgE 수용체/FcεRI-매개 비만 세포 활성 및 과립감소에 있어서 JAK3의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 JAK3의 억제제인 WHI-P131 및 WHI-P154의 영향을 조사하였다. JAK3을 억제하지 않는 WHI-P111 및 WHI-P112는 대조군으로 포함하였다. RBL-2H3 비만 세포를 시험 화합물 또는 비히클의 농도를 증가시키면서 또는 항원(DNP-BSA)으로 대항하기 전에 1시간 동안 미리 배양하였다. IgE/항원을 이용하여 RBL-2H3 비만 세포를 자극하자 유의적인 양의 β-헥소사미니다제(총 세포 함유량 중 45.1±3.1%), LTC₄(11.3±1.3 pg/10⁶세포) 및 TNFa(160±33.0 pg/10⁶세포)가 방출되었다. 양 JAK3 억제제, WHI-P131 및 WHI-P154는 새롭게 합성된 아라키돈산 대사산물 LTC₄의 방출(도 11b) 과 프로감염 시토킨 TNFa(도 11c) 뿐 아니라, 비만 세포의 과립감소 및 미리 형성된 과립-관련 β-헥소사미니다제(도 11a)의 방출을, 30 μM이상에서 억제가 완성될 정도로 투여량-의존적인 방식으로 방해하였다. 이들 JAK3 억제제와는 달리, JAK3 억제 활성이 부족한 대조 디메톡시퀴나졸린 유도체 WHI-P111 및 WHI-P112는 IgE 수용체/FcεRI 가교 이후에 비만 세포 과립감소 또는 매개체 방출을 방해하지 않았다.(도 11a-c).

RBL-2H3 에 대한 WHI-P131의 효과는 약제의 존재에 의존하였고, 약제의 사전배양의 비가역적 조직병리학적 효과에 기인하였는데, 이는 WHI-P131 덩어리가 항원 대항에 앞서 세포의 반복적 세척에 의해 제거되었을 때, 약제의 억제효과가 유의적으로 감소하였기 때문이다(데이타 미도시). 래트 비만 세포수 RBL-2H3를 이용한 결과들과 마찬가지로, JAK3 억제제 WHI-P131에 의한 처리는 마우수 골수 비만 세포로부터 히스타민 및 LTC₄의 IgE 수용체/FcεRI-매개 방출을 눈에 띄게 감소시켰다.(데이타 미도시).

다음에, 사람 비만 세포로부터의 IgE 수용체/FcεRI 과립감소 및 매개체 방출에 대한 WHI-P131의 효과를 조사하였다. 태아 간 유래 사람 비만 세포를 SCF 및 IL-4의 존재하에서, 5 주 동안 배양하였다. IgE-감작된 사람 비만 세포를 비히클 또는 증가되는 농도를 가지는 WHI-P131에 30분 동안 노출하였다. 사람 비만 세포는 그 분비 과립(도 12a)에서 비만 세포 특이적 프로테아제 β-트립타제를 보존하고, 과립감소에 의한 β-트립타제의 방출은 사람 비만 세포 활성을 위한 특이적 표지이다(호간 및 슈왈츠, 1997, Methods, 13:43-52). 태아 간 유래 사람 비만 세포의 FcεRI 수용체를 항-IgE로 가교시키고, 그 생성된 비만 세포의 과립감소(즉, β-트립타제)(크시아 외, 1997, J.Immunol, 159:2911-2921) 및 LTC₄방출(말라비야 외, 1993, J.Biol.Chem., 268:4939-4944)을 정량하였다. WHI-P131은 IgE/항원 자극 사람 비만 세포 LTC₄(도 12c) 뿐 아니라, β-트립타제(도 12b)을 방출을 투여량-의존 방식으로 방해하였다.

유사한 실험에서, 새롭게 합성된 매개체 WHI-P189의 분비(LTC₄방출)가 비치환 디메톡시퀴나졸린 WHI-P258보다 훨씬 더 유효한 것과 같이, β-헥사사미니다제 방출에 의한 측정에서와 같이, WHI-P180은 IgE/항원 유도 비만 세포 과립감소을 억제하였다(첸 외, 1999, Pharmac. Res., 16: 117-122)

이로부터, 이들 시험관 내 JAK3 억제제 연구는 비만 세포 내 JAK3이 IgE 수용체/FcεRI-매개 반응의 열쇠라는 것을 Jak3-/- 비만 세포를 시용하여 유전적인 증거를 확증 및 연장할 수 있는 생화학적 증거를 제공하였다.

IgE 수용체/FcεRI 가교 이후의 조정자 방출 뿐 아니라, 비만 세포 과립감소을 억제하기 위한 JAK3 억제제인 WHI-P131의 능력은 본 발명자들에게 항-알러지제로서 이 화합물의 유효성을 평가하도록 하였다.

실시예 11: 시험관 내 비만 세포 반응에 대한 JAK3 억제제의 효과

WHI-P131은 0.5 mg/kg 내지 250 mg/kg에 이르는 복강내 단일 환약으로는 마우스에 유독하지 않았다. WHI-P131으로 처리된 50 마리의 마우스 어느 것도 30일 관찰기간 동안 부작용을 일으키거나 독성으로 인해 사망하지 않았다. 특히, 본 발명자들은 시험된 투여량 레벨에서, 호중구감소증, 임파구감소증, 또는 빈혈과 같은 혈액과 관련한 부작용을 겪지 않았다. 30일 째에 선택적으로 사망한 WHI-P131 처리 마우스들의 내부기관에는 조직병리학적 병변이 발견되지 않았고, 비장과 림프절 내의 골수 형성부전 또는 림프세포 소모가 없었다. 따라서, WHI-P131 의 최대 내성 용량(MTD)은 250 mg/kg에 도달하지 않았다. 본 발명자들은 이러서 마우스 내의 WHI-P131의 약력학적 특징을 조사하였다. 두 부분의 약력학적 모델이 다음의 WHI-P131의 단일 비독성 12,5 mg/kg 환약의, 정맥내(i,v)(도 13a) 및 복강내(i.p.)(도13b) 투여에 의해 얻어진 약력학적 데이타에 일치하였다.

WHI-P131의 예상 최대 혈정 농도(Cmax)은 i.v. 투여에서는 85.6 μM였고, i.p. 투여에서는 57.7 μM였는데, 이것은 WHI-P131이 시험관내에서 비만 세포 반응을 없애는 30 μM의 타깃 유효 농도보다 높은 것이다. WHI-P131은 0.01 시간의 흡수 반감기로서 i.p.투여한 후의 급속한 흡수력(예상 생체활용도 : 94.4%)을 보였고, 최대 혈정 WHI-P131 농도에 도달하기 위한 시간은 0.17 시간이었다. WHI-P131은 또한 β-반감기가 i.v.투여 이후에 2.1 시간, i.p. 투여 이후에 1.9 시간으로 급속한 제거율을 가졌다.

실시예 12: 뮤린 모델의 아나필랙시스

이들 연구들은 본 발명자들로 하여금 WHI-P131의 유효 비만 세포 억제 혈정 농도가 이 유효 JAK3 억제제의 비독성 투여량을 마우스들에 넣음으로써 생체내에서도 성취될 수 있다는 가설을 세우도록 하였다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 아나필랙시스 뮤린 모델 내의 WHI-P131의 효과를 결정하였다. 히스타민이나 루코트리엔 같이, 비만 세포 매개체에 의해 유도되는 혈관 침투성의 증가는 아나필랙시스를 보증한다(오에트겐 외, 1994 Nature, 367:370 : 미야지마 외, 1997, J.Clin.Invest., 99:901-914).

따라서, 혈관 침투성에 대한 JAK3 억제제 WHI-P131의 효과는 우선 피동 피부 아나필랙시스의 적절히 특성화된 뮤린 모델에서 조사하였다(미야지마 외, 1997,J.Clin.Invest., 99:901-914). 조직적으로 투여된 에반스청 염료의 넘침(extravasation)의 의해 측정된 바와 같이, WHI-P131은 25 mg/kg 비독성 투여량 레벨에서 70%로 항원 특이적 IgE로 사전감작된 마우스들에서, IgE/항원 유도 혈정 배출(exudation)을 억제하였다(도 14a).

이어서, 피동 조직 아나필랙시스에 대한 WHI-P131의 효과를 마우스에 대해 조사하였다(Amir and English, 1991, Eur, J.Pharmacol., 203; 125-127: 오에트겐 외, 1994, Nature, 370 : 367-370: 미야지마 외, 1997, J.Clin.Invest., 99:901-914). 마우스들을 50 ㎍의 항 DNP-IgE로 정맥내로 감작하였다. 24시간 이후, 혈관 침투성의 증가를 기록하기 위해 약제 또는 비히클 처리된 동물을 0.5% 에반스청 염료의 존재하에 2 mg의 DNP-BSA로 조직적으로 대항시켰다. 항원 대항 후 30분 후에, 발판을 블루 착색함으로써 혈장 삼출을 평가하였다.(오에트겐 외, 1994, Nature, 370:367-379). 비히클 처리된 대조 마우스들을 항원 대항 후 발판에서 표시된 블루 착색을 보였으나, JAK3 억제제 WHI-P131으로 전처리된 마우스들에서는 유의적인 블루 착색이 보이지 않았다(도 14b).

귀의 조직 절편에서의 비만 세포의 과립감소 역시 애비딘(avidin)-FITC 착색후 이들의 형광세기를 조사함으로써 평가되었다. 애비딘은 결합 조직 비만 세포의 과립내에서 주요 프로테오글리칸인 헤파린에 결합한다(말라비야 외, 1994, J.Clin.Invest., 93:1645-1653). 착색된 비만 세포의 형광세기는 헤파린의 양에 비례하고 따라서, 과립감소은 형광세기를 감소시킨다. IgE/항원 대항은 과립감소와 연관된 헤파린의 소모와 일치하여, 대조 마우스들의 애비민-FITC 착색 조직 비만 세포의 형광세기를 눈에 띄게 감소시키는 반면, WHI-P131 전처리된 마우스들로부터의 비만 세포에 대해서는 형광세기의 감소가 보이지 않았다.(도 14c). 활성 비만세포로부터 방출된 주요한 혈관수축 작용 매개체가 히스타민이고, 사람 및 설치동물에서의 조직 아나필랙시스가 혈액 히스타민 레벨의 유의적인 증가와 관련있기 때문에(오에트겐 외, 1994, Nature, 370;367-370; 미야지마 외, 1997, J.Clin.Invest., 99:901-914), 이들의 혈장 히스타민 레벨을 결정하기 위하여 항원 대항 후 5분 후에 마우스들로부터 혈액 샘플을 얻었다(말라비야 외, 1006a, J.Clin.Invest, Deermatol, 106:785-789). 예상한 바와 같이, 항원 대항은 혈장 히스타민 레벨을 눈에 띄게 증가시켰으나, JAK3 억제제 WHI-P131의 전처리는 실질적으로 이러한 히스타민 반응을 감소시켰다(도 14d). 이러한 결과는 WHI-P131이 비만 세포의 과립감소을 생체 내에서 방해함으로써 피동적인 피부 및 조직 아나필랙시스를 막을 수 있음을 입증한다.

WHI-P131의 효율은 IgE/항원-유도 활성 조직 아나필랙시스 모델에서 시험하였다. 이러한 목적으로, 마우스들에게 우선 BSA-특이적 IgE 반응을 나타내기 위하여 수산화알루미늄 겔 내의 BSA를 주사하였다. 10일 후, 아나플락시스를 유도하기 위하여 이들 항원들로 이들 BSA-감작 마우스들을 재대항하였다. 항원 대항 전에 WHI-P131로 처리된 15 마리의 BSA-감작 마우스들 중 8마리(53%)가 아나필랙시스의 증상없이 생존하였고, 반면, 12마리의 대조군 마우스들 중 12마리(100%)는 항원 대항 이후 45 분 이내에 아나필랙시스를 보였다(log-rank 시험에 의해 P<0.0001 ; 도 14E).

결론

요컨데, 상술된 연구는 야누스 계열 프로틴 티로신 키나제의 일원인 JAK3이IgE/수용체-매개 비만 세포 반응에 있어서 중심적 역할을 한다는 실험적 증거를 제공한다. 더우기, 이 데이타는, JAK3의 유효하고 특이적인 억제제인 WHI-P131 [4,(4'-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린]으로 비만 세포 내의 JAK3을 타게팅하는 것이 시험관내 비만 세포 과립감소 및 알러지 매개체의 방출을 없애며, 생체 내에서, 비독성 투여량 수준에서 태아 아나필랙시스 쇼크를 포함한 IgE 수용체/FcεRI 매개 아나필랙시스 반응을 방지한다는 것을 입증한다.

키메라 수용체 및 키메라 JAK 를 사용한 연구는 JAK가 명령적 시토킨 수용체에 의한 신호 전달의 통로로서 주요하게 작용한다는 것을 입증한다.(넬슨 외, 1996, Mol.Cell.Biol., 16:369-375). 최근의 연구는 개개의 JAK 역시 명확한 기능을 가지고, 선택적으로 특이적 기질을 인식함으로써 특유의 신호를 진행시킬 수도 있음을 암시한다(엔도 외, 1997, Nature, 387:921-924; 위트헌 외, 1999, Lymphoma Leukemia, in press"). 야누스 키나제 JAK3은 림프구의 발달, 활성화 및 시토킨 반응성에 중요한 역할을 하는 것으로 보여졌다(일레 및 케르, 1995, Trends Gene, 11:69-74; 노사카 외, 1995, Science, 270:800-802). 이 연구는 JAK3 기능에 대한 지식을 확장하고, JAK3이 비만 세포에서 높은 친화성의 IgE 수용체의 완전한 신호 능력을 위하여 필수적이고 풍부하지 않은 기능을 갖는 다는 것을 밝힌다. 종전에는 알려지지 않았던 이러한 JAK3의 기능은 JAK3 억제제를 이용한 비만 세포 매개 알러지반응을 위한 예방 프로그램 뿐 아니라 새롭고 효과적인 치료법에 대한 기초를 제공한다. IgE 수용체/FcεRI 매개 반응에서의 Syk의 공지의 기능에 관하여 여기 및 종전의 보고(코스텔로 외, 1996, Oncogene, 13:2595-2605; 올리버 외, 1994,J.Biol.Chem. 269:29697-29703)들에서 제공된 데이타에 기초하면, JAK3 및 Syk가 비만 세포 매개 과민반응의 개시를 도와주는 것일 수 있다.

흥미롭게도, SYK 역시 IL-2, IL-3과 같은 시토킨 및 JAK/STAT 경로를 활성화시키는 것으로 역시 알려져 있는 GMCSF에 의해 활성화되고, STAT를 인산화할 수 있다.(마츠다와 히라노, 1994, Blood, 83: 3457-3461). 마찬가지로, JAK3은 인슐린 수용체 기질 단백질 IRS1 및 IRS2 의 인산화에 의해 Syk 기질 PI3-키나제의 기능을 조절할 수 있다(존스톤 외, 1995, J.Biol.Chem., 270:28527-30; 야마우치 외, 1998, J.Biol.Chem. 273: 15719-15726). 크로스토크(crosstalk)에 대한 또 다른 가능한 메카니즘은 Sam68, 즉 SYK 기질 PLCγ, PI3-키나제, Grb2 및 Cbl과 연관되는 Src 기질과 JAK3의 상호작용을 통한 것일 것이다(인 외, 1995, J.Biol.Chem. 270:20497-502; 후사키 외, 1997, J.Biol.Chem. 272:6214-6219; 데케르트 외, 1998, J.Biol.Chem., 273:8867-8874).

이 연구는 비만 세포에서의 PTK의 역할에 대한 종전의 연구(블랭크 외, 1989, Nature, 337:187-189; 올리버 외, 1994, J.Biol.Chem. 269:29697-29703; 하마위 외, 1995, Cellular Signalling 7:533-544; 샤렌버그 외, 1995, EMBO J., 14:3385-3395; 코스텔로 외, 1996 Oncogene, 13:2595-2605)를 확장하고, 알러지 질환의 치료에서 PTK 억제제의 치료적 유효성을 지지하는 새로운 증거를 제공한다. 생체 내 유효성 및 조직 독성이 없는 점때문에, 결합 포켓 모델에 적합한 WHI-P131 및 구조적 유도체는 최초의 JAK3-특이적 PTK 억제제일 뿐 아니라, 시험관 내 및 생체내 비만 세포 기능을 조절하기 위한 최초의 PTK 억제제이기도 하며, 임상적으로비만 세포 매개 과민반응에 대한 새롭고 유효한 치료법을 제공한다.

Claims (14)

1. 일반식(Ⅰ)

   {상기식에서, X는 HN, R₁₁N, S, O, CH₂또는 R₁₁CH이고, R₁₁는 수소, (C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₄)알카노일이며,

   R₁-R₈는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로이고, 이들이 부착되어 있는 페닐환과 함께 R₁-R₅의 2개의 인접 기는 임의로 예를 들면 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성하는 축합환을 형성할 수 있으며, 또한, R₁-R₅의 2개의 인접 기에 의해 형성된 환은 임의로 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로에 의해 치환될 수 있고,

   R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는(C₁-C₄)알카노일이거나, R₉및 R₁₀은 함께 메틸렌디옥시 또는 할로를 형성하거나, 또는 R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는 JAK-3 티로신 키나제를 접촉시키는 것을 포함하는 JAK-3 티로신 키나제 활성을 억제하기 위한 방법.
2. JAK-3 키나제 활성화가 관련되고 JAK-3 키나제 활성화의 억제가 요구되는 병리 치료 필요시에 JAK-3 억제제를 포유동물에 투여함으로써 병리를 치료하는 것을 포함하는 치료 방법.
3. 제 2 항에 있어서, JAK-3 억제제가 일반식(Ⅰ)

   {상기식에서, X는 HN, R₁₁N, S, O, CH₂또는 R₁₁CH이고, R₁₁는 수소, (C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₄)알카노일이며,

   R₁-R₈는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로이고, 이들이 부착되어 있는 페닐환과 함께 R₁-R₅의 2개의 인접 기는 임의로 예를 들면 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성하는 축합환을 형성할 수 있으며, 또한, R₁-R₅의 2개의 인접 기에 의해 형성된 환은 임의로 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로에 의해 치환될 수 있고,

   R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉및 R₁₀은 함께 메틸렌디옥시 또는 할로를 형성하거나, 또는 R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 치료 방법.
4. JAK-3 티로신 키나제 억제제의 치료상 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 직접 과민성 반응을 치료하기 위한 방법.
5. 제 4 항에 있어서, JAK-3 티로신 키나제 억제제가 일반식(Ⅰ)

   {상기식에서, X는 HN, R₁₁N, S, O, CH₂또는 R₁₁CH이고, R₁₁는 수소, (C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₄)알카노일이며,

   R₁-R₈는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로이고, 이들이 부착되어 있는 페닐환과 함께 R₁-R₅의 2개의 인접 기는 임의로 예를 들면 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성하는 축합환을 형성할 수 있으며, 또한, R₁-R₅의 2개의 인접 기에 의해 형성된 환은 임의로 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, (C₁-C₄)알킬티오, 또는 할로에 의해 치환될 수 있고,

   R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉및 R₁₀은 함께 메틸렌디옥시 또는 할로를 형성하거나, 또는 R₉및 R₁₀은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, JAK-3 억제제가 일반식(Ⅱ)

   {상기식에서, R₃'는 H 또는 할로이고,

   R₄'는 H 또는 OH이며,

   R₅'는 OH이고,

   R₆'는 H, OH, NO₂, NH₂, CH₂OH이며,

   R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉' 및 R₁₀'은 함께 메틸렌디옥시 또는 할로를 형성하거나, 또는 R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, JAK-3 억제제가 일반식(Ⅲ)

   {상기식에서, R₅'는 OH이고,

   R₆'는 할로이며,

   R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉' 및 R₁₀'은 함께 메틸렌디옥시를 형성하거나, 또는 R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, JAK-3 억제제가 일반식(Ⅳ)

   {상기식에서, R₅'는 할로, OH, NH₂, NO₂, CH₂OH이며,

   R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉' 및 R₁₀'은 함께 메틸렌디옥시를 형성하거나, 또는 R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, JAK-3 억제제가 일반식(Ⅴ)

   {상기식에서, R₅'는 할로이고,

   R₇'는 할로, OH, NH₂, NO₂, CH₂OH이며,

   R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₄)알킬, (C₁-C₄)알콕시, 할로 또는 (C₁-C₄)알카노일이거나, R₉' 및 R₁₀'은 함께 메틸렌디옥시를 형성하거나, 또는 R₉' 및 R₁₀'은 각각 독립적으로 프로드러그 유도체일 수 있다.}의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, JAK-3 억제제가 4-(4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린,4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실페닐)-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(3'-브로모-4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(3'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상인 방법.
11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JAK-3 억제제가 타겟으로 하는 방출을 위해 리간드, 바람직하게는 항체에 컨쥬게이트되는 방법.
12. 제 2 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 병리 또는 직접 과민성 반응은 아나필랙시스, 알레르기성 비염, 알레르기성 담마진, 혈관부종, 알레르기성 천식, 또는 곤충 물림, 음식물, 약물 또는 화분에 대한 알레르기성 반응인 방법.
13. 제 2 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 치료는 상기 병리 또는 직접 과민성 반응을 예방하는 것을 포함하는 방법.
14. JAK-3 억제제의 치료상 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 비만 세포로 조정된 알레르기성 반응을 억제하기 위한 방법.