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KR102692543B1 - Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR102692543B1
KR102692543B1 KR1020180129201A KR20180129201A KR102692543B1 KR 102692543 B1 KR102692543 B1 KR 102692543B1 KR 1020180129201 A KR1020180129201 A KR 1020180129201A KR 20180129201 A KR20180129201 A KR 20180129201A KR 102692543 B1 KR102692543 B1 KR 102692543B1
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송은정
김기수
강관엽
조의철
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재단법인 목암생명과학연구소
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Abstract

본 발명은 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편, IDS 효소 및 Fc 영역을 융합시킨 비대칭 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 단백질은 혈관뇌관문(BBB)을 효과적으로 통과하여 IDS 효소를 뇌로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 중추신경계 질환의 치료제로서 사용 가능하며, 특히 리소좀의 축적으로 인한 다양한 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

IDS를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING IDS AND USE THEREOF}
본 발명은 IDS를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 효소 및 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편이 융합된 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
헌터증후군(hunter syndrome, Mucopolysaccharidosis II)은 중추신경계(CNS)에서 발생하는 질환 중 하나로, 이듀로네이트-2-설파타제(IDS)의 돌연변이에 의해 발생하는 질환이다. IDS는 글리코사미노글리칸(GAG)의 분해에 필수적인 효소로, IDS의 활성이 저하되거나 없어질 경우 GAG가 조직과 세포에 축적되어 병증을 일으키게 된다. 현재, 헌터증후군의 치료제로서 헌터라제(Hunterase) 및 엘라프라제(Elaprase)가 사용되고 있으나, 이러한 중추신경계 질환 치료제들은 환자의 정맥내로 약물을 주사한 후에 혈관뇌관문(blood-brain-barrier, BBB)을 통과하지 못하여, 뇌로 치료제의 전달이 제대로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
한편, 뇌혈관 세포는 BBB를 통해 혈액과 뇌 사이의 물질 이동을 제한하여 뇌를 보호하게 된다. 따라서, 체내에서 혈관을 통해 순환하는 항체나 효소 등의 물질들은 일반적으로 BBB를 통과하지 못하여 뇌로의 이동이 제한되기 때문에, 중추신경계(CNS)에서 발생하는 질환에 대한 치료제로서의 적용이 어렵다.
이후에, 트랜스페린 수용체(TfR) 또는 인슐린 수용체(IR) 등 뇌혈관 세포의 표면에 발현되는 단백질을 통해 수용체-매개 트랜스사이토시스(RMT) 방식으로 트랜스페린 또는 인슐린을 뇌로 전달할 수 있다는 것이 밝혀졌고, 이러한 기전을 이용하여 뇌에 치료제를 전달하는 방법이 개발되어 왔다. 최근에는, BBB를 통과할 수 있는 항-TfR 항체를 이용하여 IDS 치료제 등과 같은 여러 물질들을 뇌로 전달시킬 수 있는 기술들이 개발되고 있다(한국공개특허 10-2016-0011198 및 한국공개특허 10-2015-0039798).
따라서, BBB 수용체에 대해 높은 친화도를 가지면서, BBB의 통과 효율이 우수한 IDS 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 10-2016-0011198(2014.05.20) 한국공개특허 10-2015-0039798(2013.08.26)
이에 대해, 본 발명자들은 BBB를 통과할 수 있는 IDS 효소 치료제를 개발하였으며, 구체적으로, 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편, IDS 효소 및 Fc 영역을 융합시킨 비대칭 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편을 포함한 제1 도메인, 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 가지는 단백질을 포함한 제2 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 BBB를 효과적으로 통과하여 IDS 효소 치료제를 뇌로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 중추신경계 질환의 치료제로서 사용 가능하며, 특히 리소좀의 축적으로 인한 다양한 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 상기 융합 단백질은 동물 BBB 수용체와 인간 BBB 수용체에 대해 우수한 교차반응성을 나타내므로, 여러 가지 질병 동물 모델에 적용한 융합 단백질을 임상 연구에 바로 적용할 수 있다는 장점을 갖는다.
도 1은 융합 단백질의 구조 및 작용 메커니즘의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 인슐린 수용체에 결합하는 항체(IR739)의 항체내 돌연변이 도입 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 인슐린 수용체에 결합하는 항체 변이체들(H031, HL009, L016, L113 및 H118)의 CDR3 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 IR739의 인간, 원숭이 및 마우스에서의 교차반응성 평가를 위한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인간 인슐린 수용체 및 마우스 인슐린 수용체에 대한 IR739 및 IR739 변이체들(H031, HL009, L016, L113 및 H118)의 결합친화도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 인슐린 수용체 및 마우스 인슐린 수용체에 대한 IR739 및 융합 단백질들(IDS-IR739, IDS-HL009 및 IDS-H031)의 결합친화도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 IR739의 농도 변화에 따른 인슐린 수용체에 대한 인슐린과 IR739의 상호작용 효과를 비교한 것이다.
도 8은 인슐린의 농도 변화에 따른 인슐린 수용체에 대한 인슐린과 IR739의 상호작용 효과를 비교한 것이다.
도 9는 마우스 혈액내에서 IR739의 반감기를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 혈액내에서 IDS 및 IDS-HL009의 반감기를 나타낸 것이다.
도 11은 IR739의 뇌흡수 효율을 나타낸 것이다.
도 12는 IR739 변이체들(H031, HL009, L113 및 H118)의 뇌흡수 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 융합 단백질들의 뇌흡수 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 측면은 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편을 포함한 제1 도메인; 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 가지는 단백질을 포함한 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “인슐린 수용체“란, 인슐린을 수송할 수 있는 세포 상에 발현된 막횡단 수용체 단백질을 의미한다. 이때, 인슐린 수용체는 혈관뇌관문(BBB) 수용체의 하나로 작용할 수 있다. 상기 혈관뇌관문 수용체는 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-R), 트랜스페린 수용체, 저밀도 지단백질 수용체, 글루코스 수송체 1(Glut1) 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자(HB-EGF)등을 포함하며, 이들은 BBB를 횡단하여 분자를 수송할 수 있거나 또는 투여된 외인성 분자를 수송하기 위해 사용될 수 있는 세포외 막횡단 수용체 단백질이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 인간 인슐린 수용체의 세포외 도메인(ECD)에 결합하여 BBB를 통과할 수 있으므로, 융합된 IDS를 뇌로 전달할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란, 특정 항원과 면역학적 반응성을 가지는 면역글로불린(Ig) 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할의 단백질 분자를 의미하며, 전체 항체(whole antibody) 및 항체 단편(antibody fragment)을 모두 포괄하는 개념을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “이듀로네이트-2-설파타제(IDS)”란, 리소좀 글리코사미노글리칸(GAG)의 분해에 필수적인 효소를 의미한다. IDS에 돌연변이가 발생하거나 IDS의 활성이 저하 또는 비활성되는 경우, 대부분의 조직과 세포에 GAG가 축적되어 병증을 일으킬 수 있다. 이때, 상기 IDS는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 Fc 영역을 더 포함할 수 있으며, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역(CH)에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역은 이형이합체일 수 있으며, 상기 이형이합체 Fc 중 어느 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 가질 수 있다. 상기 놉 또는 홀 구조는 Fc 영역의 CH3에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “Fc 영역”이란, 불변 영역의 일부분을 내포하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 상기 Fc 영역은 통상 항체 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3를 포함한다. 또한, 상기 Fc 영역은 야생형 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인은 인슐린 수용체에 결합하는 항체의 Fab 또는 scFv 영역일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “Fab”란, 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역과 중쇄의 가변 영역 및 CH1 영역을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "scFv"란, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것으로, "경쇄의 가변 영역(VL)-링커-중쇄의 가변 영역(VH)"으로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
상기 제1 도메인은 CDR을 포함하며, 상기 CDR은 특정 항원에 대한 결합 특이성을 부여하며, 상기 CDR의 세트(CDR1, CDR2, CDR3)는 항원에 대한 결합 부위를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2; 서열번호 5, 7, 8 및 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2; 서열번호 6, 8, 10 및 11의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2; 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2; 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인의 C-말단이 Fc 영역의 N-말단에 결합된 제1 단량체는 서열번호 12, 14, 16 및 17의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 중쇄; 및 서열번호 13, 15, 18 및 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 경쇄를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 제2 도메인의 C-말단이 Fc 영역의 N-말단에 결합된 구조를 가질 수 있으며, 상기와 같이 결합된 제2 단량체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제1 도메인과 Fc 영역은 링커를 통해 결합될 수 있다. 또한, 상기 제2 도메인과 Fc 영역은 링커를 통해 결합될 수 있다. 상기 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 5 내지 20개 아미노산으로 이루어진 단일쇄 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 상기 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 글리신 및 세린으로 이루어질 수 있으며, (G4S)n(n은 1 내지 5의 경우)의 링커일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 링커는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 이합체 Fc 영역 중 어느 하나의 N-말단에 제1 도메인의 C 말단이 결합되고, 이합체 Fc 영역 중 다른 하나의 N-말단에 제2 도메인의 C 말단이 결합된 비대칭적 구조를 가질 수 있다. 상기 융합 단백질은 비대칭적 구조를 가짐으로써, 2가 항체가 분해 경로로 치우칠 가능성이 높다는 문제점을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 상기 용어 “인간 항체”는 면역글로불린 서열로부터 구조 및 CDR 영역이 유도되는 가변 영역을 가지는 온전한 항체를 의미하며, “인간화 항체”는 마우스와 같은 비인간 항체의 면역글로블린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체를 의미하며, “키메라 항체”는 마우스, 랫트, 토끼, 염소 또는 인간과 같은 다른 포유동물 조합 유래의 항체를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법, 예를 들어, 놉-인-홀(knob-in-hole)(Ridgway et al, Protein Engineering, 617-621 (1996)), 파지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991)), 융합 방법(Kohler 및 Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)) 및 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 파지 항체 라이브러리 방법 및 놉-인-홀 방법을 이용하여, IDS가 융합된 융합 단백질(IDS-IR739, IDS-HL009 및 IDS-H031)을 제작하였다. 상기 융합 단백질들은 인슐린 수용체에 결합하여 수용체-매개 트랜스사이토시스(receptor mediated transcytosis, RMT) 방식을 통해 BBB를 통과할 수 있으며, IDS가 융합된 융합 파트너 부위가 뇌의 표적에 작용할 수 있다(도 1).
상기 RMT 방식으로 BBB를 통과하는 항체는 BBB 수용체에 대한 친화도가 매우 중요하다. 구체적으로, 상기 친화도가 적정 수준보다 낮으면, BBB에 대한 결합 효율이 낮아진다는 문제점이 있다. 반면, 친화도가 적정 수준보다 높으면, BBB 통과 후 치료제가 방출되는 속도가 낮아져 BBB 통과 효율이 떨어지게 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 인슐린 수용체에 대한 인슐린의 결합은 억제하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중추신경계(CNS)"란, 신체 기능을 제어하는 신경 조직의 복합체를 지칭하며, 뇌 및 척수를 포함한다. 상기 중추신경계 질환이란 CNS에 영향을 미치고/미치거나 CNS에 병인이 있는 질환 또는 장애를 지칭한다. 상기 질환의 구체적인 예는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 및 뇌암을 포함할 수 있다. 상기 리소좀 축적병의 구체적인 예는 헌터증후군, 테이-삭스 병, 니만-피크 병, 폼페병, 크라베병, 고쉐병, 파브리병, 월만병, 모르쿠오 증후군, 멘케스 증후군, 갈락토시알리도시스, 당원축적 질환, 판코니-비켈 증후군, 레쉬 니한 증후군 및 젤웨거 증후군 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제형은 상술한 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 막 투과성을 향상시킬 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 개체의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 비경구 투여시 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여시 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 또한, 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체"란, 상기 약학 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"이란, 상기 약학 조성물을 이용하여 질환을 차단하거나, 질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료"란, 상기 약학 조성물을 이용하여 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 측면은 인슐린 수용체에 결합하는 항체를 Fc 영역에 결합하여 제1 단량체를 제조하는 단계; 이듀로네이트-2-설파타제(IDS)를 이형이합체 Fc 영역에 결합하여 제2 단량체를 제조하는 단계; 및 상기 제1 단량체 및 제2 단량체를 혼합하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역(CH)에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2; 서열번호 5, 7, 8 및 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2; 서열번호 6, 8, 10 및 11의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2; 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2; 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 단량체의 Fc 영역의 CH3이 놉 구조를 갖는 경우, 상기 제2 단량체의 CH3은 홀 구조를 갖거나, 상기 제1 단량체의 Fc 영역의 CH3이 홀 구조를 갖는 경우, 상기 제2 단량체의 CH3은 놉 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 IDS는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 단량체가 서열번호 12, 14, 16 및 17의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 중쇄 및 서열번호 13, 15, 18 및 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 경쇄를 포함하고, 상기 제2 단량체가 서열번호 20의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-IR739는 서열번호 12 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-HL009는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-H031은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-H118은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-L016은 서열번호 12 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 IDS-L113은 서열번호 12 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 제1 단량체, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 단량체를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. IR739 항체 제작
항 IR 항체를 제조하기 위해 인간 합성 scFv 라이브러리(MIDAS, MOGAM)를 이용하였다. 인간 IR을 5 μg/ml의 농도로 코팅한 튜브에 MIDAS의 파지 라이브러리를 넣고 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. 0.05% tween20이 첨가된 PBS 버퍼로 4회 세척한 후, 1% BSA/0.1 M 글리신(pH 2.0) 버퍼로 실온에서 10분 동안 처리하여 IR에 결합된 파지를 용출하였다. 용출한 파지를 70 μl의 2 M Tris-HCl(pH 9.0)로 중화시키고, 미리 배양한 9 ml의 대장균(E. Coli, XL1-Blue)에 30분 동안 감염시켰다. 파지를 감염시킨 XL1-Blue에 SB(super broth) 배지, 테트라사이클린 및 카르베니실린을 넣고 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, 헬퍼 파지를 넣었다. 1시간 더 배양하고, 100 ml까지 배지를 넣어 37℃에서 밤새 배양하였다.
원심분리하여 배양 배지를 수확하고, 20% PEG 용액으로 파지를 침전시켰다. 원심분리 후, 1% BSA를 첨가한 PBS 용액으로 파지를 회수하였다. 상기 파지가 회수된 용액을 이용하여 마우스 IR이 코팅된 튜브 및 인간 IR이 코팅된 튜브에 교대로 4차까지 패닝(panning) 과정을 반복하였다. 3차 및 4차 파지가 감염된 XL1-Blue 콜로니를 각각 배양하여 파지가 들어있는 배양액을 얻었다. 상기 배양액과 IR이 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA로 인간 및 마우스의 IR에 동시에 결합하는 파지를 발현시키는 XL1-Blue 클론을 선별하였다. 선별한 클론의 플라스미드를 시퀀싱하여 VH 및 VL 서열을 확보하였고, 이를 바탕으로 통상의 IgG 형태를 갖는 항체를 제작하였다.
하기 실험예 1의 교차반응성 평가를 통해, 상기 MIDAS 인간 scFv 라이브러리의 스크리닝을 통해 얻은 항체들 중 인간, 원숭이 및 마우스 IR 모두에 결합하는 항체인 IR739를 선별하였고, 상기와 같이 제작된 IR739의 단백질 서열은 하기 표 1과 같다.
H-chain EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISYGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPSYGTVNHAYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG)
L-chain DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASRDVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDANILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLEYNNLPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)
제조예 2. IR739 항체의 변이체 제작
임의돌연변이유발(random mutagenesis)을 이용하여 LCDR3의 Asn-Asn 서열 및 HCDR3의 Ser-Tyr-Gly-Thr-Val-Asn-His 서열에 돌연변이를 도입하였다(도 2). 돌연변이 도입을 위해서, 해당 서열의 코돈을 NNK 동의코돈(N=A, T, G 또는 C, K=G 또는 T)으로 치환한 프라이머로 IR739의 유전자를 PCR 수행하여 돌연변이 scFv DNA 단편을 제작하였다. 돌연변이 scFv DNA 단편을 연결(ligation)시킨 pCIw 벡터(Promega) 1 μg을 100 μl의 XL1-Blue에 전기천공법으로 형질전환시킨 후, 10 ml의 SB(super broth) 배지에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
10 ml의 헬퍼 파지를 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 테트라사이클린과 카르베니실린이 들어있는 배지 80 ml을 더 넣고 밤새 배양하였다. 돌연변이가 도입된 XL1-Blue의 배양액을 원심분리하여 수확하고, 20% PEG 용액으로 파지를 침전시켰다. 원심분리 후, 1% BSA/0.1 M 글리신(pH 2.0) 버퍼로 실온에서 10분 동안 배양하여 IR에 결합한 파지를 용출하였다. 용출한 파지를 70 μl의 2 M Tris-HCl(pH 9.0)로 중화하고, 미리 배양한 9 ml의 대장균(E. Coli)을 XL1-Blue에 30분 동안 감염시켰다. 파지를 감염시킨 XL1-Blue에 SB 배지, 테트라사이클린 및 카르베니실린을 넣고 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, 헬퍼 파지를 넣었다. 1시간 더 배양하고, 100 ml까지 배지를 넣어 37℃에서 밤새 배양하였다.
원심분리하여 배양 배지를 수확하고, 20% PEG 용액으로 파지를 침전시켰다. 원심분리 후, 1% BSA를 첨가한 PBS 용액으로 파지를 회수하였다. 상기 파지가 회수된 용액을 이용하여 마우스 IR이 코팅된 튜브 및 인간 IR이 코팅된 튜브에 교대로 4차까지 패닝 과정을 반복하였다. 3차 및 4차 파지가 감염된 XL1-Blue 콜로니를 각각 배양하여 파지가 들어있는 배양액을 얻었다. 상기 배양액과 IR이 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA를 통해 IR739 보다 흡광도가 더 크거나 작은 클론을 선별하였다. 선별한 클론을 시퀀싱하여 고유의 서열을 선별하였고(도 3), 클로닝하여 통상의 IgG 형태를 갖는 변이체인 H031, H118, HL009, L016 및 L113을 제작하였다.
제조예 3. 비대칭 융합 항체의 제작
한 쪽 Fab를 IDS로 치환한 IDS 융합 항체(IDS-IR739, IDS-H031, IDS-HL009 및 IDS-8D3)를 제작하기 위해 놉-인-홀(knob-in-hole)을 이모글로불린 중쇄에 도입하였다. 놉(knob)이 도입된 중쇄는 Lys409가 Trp409로 치환되었고, 홀(hole)이 도입된 중쇄는 Asp399 및 Phe405가 각각 Val399 및 Thr405로 치환되었다. 클로닝을 통하여 IR739, HL009 및 8D3의 VH를 홀이 도입된 중쇄의 VH에 치환하고, IDS의 C-말단을 놉이 도입된 중쇄의 CH2의 N-말단에 융합시켰다. 상기 8D3은 트렌스페린 수용체에 대한 항체로, 대조군으로 사용되었다.
경쇄 및 홀이 도입된 중쇄를 발현시키는 플라스미드와 놉이 도입되고 IDS가 융합된 CH2-CH3를 발현시키는 플라스미드를 CHO 세포에 동시-형질감염시키고, 37℃에서 10일 동안 배양하였다. 원심분리하여 배양액을 분리한 후, Protein A 컬럼으로 IDS-IR739, IDS-HL009, IDS-H031 및 IDS-8D3을 정제하였다. 1 M L-아르기닌 용액(pH 4)을 사용하여 Protein A 컬럼에서 IDS 융합 항체를 용출하였다. 상기와 같이 제조한 비대칭 융합 항체의 구조를 도 1(왼쪽)에 나타내었다.
실험예 1. 교차반응성 평가
인간, 원숭이 및 마우스의 IR을 각각 과발현시킨 Expi-293 세포를 수확하여 5 x 106 세포/ml로 각각 튜브에 넣은 후, MIDAS 인간 scFv 라이브러리의 스크리닝을 통해 얻은 항체들을 1 μg/ml로 각각 처리하였다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 3% BSA/PBS 버퍼 내 플루오로크롬-표지 항-인간 항체(FITC 접합 항-인간 IgG)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 암실 상태로 배양하고, 원심분리기를 이용하여 3% BSA/1% sodium azide/PBS의 차가운 버퍼로 3회 세척하였다. FACS 기기를 이용하여 분석한 결과, 항체 IR739가 인간, 원숭이 및 마우스의 IR에 모두 결합하는 것을 확인하였다(도 4).
실험예 2. IR에 대한 결합친화도 평가
실험예 2.1. IR739의 결합친화도 평가
IR739의 IR에 대한 결합친화도를 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 분석하였다. 아세테이트(pH 4.0)로 1 μg/ml의 인간 IR 또는 마우스 IR을 CM5 센서 칩에 고정하였다. IR739를 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM 및 1.563 nM의 농도로 인간 IR 또는 마우스 IR이 고정되어 있는 CM5 센서 칩에 흘려주며 결합과 해리를 측정하였다. 측정 조건으로서 유량을 30 μl/분으로 하였고, 결합 시간 및 해리 시간을 각각 120초 및 600초로 하였다. 재생(regeneration)을 위해 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)을 30초 동안 흘려주었다. 인간 IR 및 마우스 IR에 대한 IR739의 결합친화도 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
pH 7.0 Ka(/Ms) Kd(/s) KD(M)
인간 IR 9.595 x 104 14.35 x 10-4 14.96 x 10-9
마우스 IR 9.532 x 104 6.100 x 10-4 6.4 x 10-9
실험예 2.2. IR739 및 IR739 변이체들의 결합친화도 비교
IR739 및 이의 변이체들의 IR에 대한 결합친화도를 비교하기 위해 ELISA를 수행하였다. IR이 5 μg/ml의 농도로 코팅된 ELISA 플레이트를 3% 탈지유로 1시간 동안 차단시킨 후, 다양한 농도의 IR739 및 이의 변이체들을 각 웰에 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였다. IR739 및 변이체를 검출하기 위해서 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 용액으로 발색하였고, 450 nm에서 흡광도를 분석한 결과, H031 및 HL009는 IR739보다 인간 IR과 마우스 IR에 대해 결합친화도가 높았고, L016, H118은 IR739에 비해 낮은 결합친화도를 나타냈다. L113은 IR739와 비슷한 결합친화도를 보였다(도 5).
실험예 2.3. 비대칭 융합 항체의 결합친화도 평가
IDS-HL009의 IR에 대한 결합친화도를 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다. IR이 5 μg/ml의 농도로 코팅된 ELISA 플레이트를 3% 탈지유로 1시간 동안 차단시킨 후, 다양한 농도의 IR739, IDS-IR739, IDS-HL009 및 IDS-H031을 각 웰에 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였다. IR739, IDS-IR739, IDS-HL009 및 IDS-H031을 검출하기 위해서 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였다. TMB ELISA 용액으로 발색하였고, 450 nm에서 흡광도를 분석하였다. 그 결과, IDS-IR739, IDS-H031 및 IDS-HL009는 한 쪽 Fab이 IDS로 치환되어 결합활성(avidity) 효과가 제거되었기 때문에, IR739에 비해 인간 IR과 마우스 IR에 대한 결합친화도가 낮게 나타났다(도 6).
실험예 3. IR에 대한 인슐린과 IR739의 경쟁 확인
IR에 대해 IR739와 인슐린이 미치는 상호작용을 확인하기 위해, 경쟁적 ELISA를 수행하였다. IR이 5 μg/ml의 농도로 코팅된 ELISA 플레이트를 3% 탈지유로 1시간 동안 차단시킨 후, 다양한 농도의 IR739 및 비오티닐화 인슐린의 혼합물을 웰에 배치하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였다. IR739를 검출하기 위해서 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였고, 비오티닐화 인슐린을 검출하기 위해서 퍼옥시다아제-접합 스트렙타비딘을 처리하였다.
37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하였고, TMB ELISA 용액으로 발색하였다. 450 nm에서 흡광도를 분석한 결과 IR739의 IR에 대한 결합 양상은 인슐린의 농도 변화에 영향을 받지 않았다. 구체적으로, 인슐린의 농도가 0.6 nM에서 150 nM으로 변화하는 동안 IR739의 농도에 따른 결합 곡선은 변화하지 않았다(도 7). 또한, 인슐린의 IR에 대한 결합 양상 또한 IR739의 농도 변화에 영향을 받지 않았으며, 구체적으로 IR739의 농도가 0.03 nM에서 7 nM으로 변화하는 동안 인슐린의 농도에 따른 결합 곡선은 변화하지 않았다(도 8).
실험예 4. 마우스 혈액 내 약물동태학 평가
실험예 4.1. 마우스 혈액 내 IR739의 약물동태학 평가
마우스 혈액 내에서 IR739의 안정성을 분석하기 위해, 5 mg/kg의 IR739 또는 대조군인 8D3 항체(항-TfR 항체)를 각각 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여 후, 30분, 1시간, 2시간, 6시간 및 24시간에 각각 50 μl의 혈액을 아이-블리딩(eye-bleeding)으로 채취하였다. 혈액을 원심분리하고, 상등액의 항체 농도를 ELISA로 분석하였다. ELISA를 위해서 항-인간 Fab IgG를 ELISA 플레이트에 1 μg/ml로 코팅하고, 3% 탈지유로 차단시킨 후 1/10로 희석한 상등액 50 μl를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, TMB ELISA 용액으로 검출하였다. 10,000 ng/ml 내지 4.5 ng/ml(10,000 ng/ml, 3,333 ng/ml, 1,111 ng/ml, 370 ng/ml, 123 ng/ml, 41.2 ng/ml, 13.7 ng/ml, 4.5 ng/ml)의 IR739로 상기와 동일하게 ELISA를 수행한 결과를 표준으로 하여 농도를 계산하였다. IR739는 약 24시간의 반감기를 가지는 것을 확인하였다(도 9).
실험예 4.2. 마우스 혈액 내 IDS-HL009의 약물동태학 평가
마우스 혈액 내에서 IDS-HL009의 안정성을 분석하기 위해, 5 mg/kg의 IDS, IR739, IDS-HL009 및 IDS-8D3을 각각 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여 후, 30분, 1시간, 2시간, 6시간 및 24시간에 각각 50 μl의 혈액을 아이-블리딩으로 채취하였다. 혈액을 원심분리하고, 상등액의 항체 농도를 ELISA로 분석하였다. ELISA를 위해서 항-인간 Fab IgG를 ELISA 플레이트에 1 μg/ml로 코팅하고, 3% 탈지유로 차단시킨 후 1/10로 희석한 상등액 50 μl를 처리하였다.
37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, TMB ELISA 용액으로 검출하였다. 10,000 ng/ml 내지 4.5 ng/ml(10,000 ng/ml, 3,333 ng/ml, 1,111 ng/ml, 370 ng/ml, 123 ng/ml, 41.2 ng/ml, 13.7 ng/ml, 4.5 ng/ml)의 IR739, IDS-HL009 및 IDS-8D3으로 상기와 동일하게 ELISA를 수행한 결과를 표준으로 하여 농도를 계산하였다. IDS의 농도 측정을 위해서는, 항-IDS IgG를 코팅한 ELISA 플레이트에 비오틴-접합 항-IDS 및 HRP-접합 스트렙타비딘을 이용하여 ELISA를 수행하였다. IDS-HL009는 약 14시간의 반감기를 가지는 것을 확인하였다(도 10).
실험예 5. 뇌흡수(Brain uptake) 평가
실험예 5.1. IR739의 뇌흡수 효율 평가
IR739의 뇌흡수 효율을 분석하기 위해서 음성 대조군 IgG(항-메소텔린(MSLN) IgG), 8D3 및 IR739를 5 mg/kg으로 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 이때, 항 메소텔린 IgG를 음성 대조군, 8D3을 양성 대조군으로 사용하였다. 1시간 및 24시간 후에 각각 3마리의 마우스에서 관류(perfusion)시킨 후 뇌를 적출하였다. 뇌 100 mg당 1 ml의 용해 버퍼를 넣고 분쇄한 후 13,000 rpm으로 원심분리 하였다. 항-인간 Fab IgG를 1 μg/ml로 코팅하고, 3% 탈지유로 차단시킨 후 상등액 50 μl를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, TMB ELISA 용액으로 검출하였다. 1,000 ng/ml 내지 0.45 ng/ml(10,00 ng/ml, 333 ng/ml, 111 ng/ml, 37.0 ng/ml, 12.3 ng/ml, 4.12 ng/ml, 1.37 ng/ml, 0.45 ng/ml)의 항-MSLN IgG, 8D3 및 IR739로 상기와 동일하게 ELISA를 수행한 결과를 표준으로 하여 농도를 계산하였다. IR739는 8D3에 비해 낮은 효율로 뇌에 흡수되었으나, 항-MSLN IgG에 비해서 높은 효율로 뇌에 흡수되었다(도 11).
실험예 5.2. IR739 변이체의 뇌흡수 효율 평가
IR739 변이체들의 뇌흡수 효율을 분석하기 위해서 항-MSLN IgG, 8D3, IR739, H031, HL009, L113 및 H118을 5 mg/kg으로 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 1시간 및 24시간 후에 각각 3마리의 마우스에서 관류시킨 후 뇌를 적출하였다. 뇌 100 mg당 1 ml의 용해 버퍼를 넣고 분쇄한 후 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 항-인간 Fab IgG를 1 μg/ml로 코팅하고, 3% 탈지유로 차단시킨 후 상등액 50 μl를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, TMB ELISA 용액으로 검출하였다. 1,000 ng/ml 내지 0.45 ng/ml(10,00 ng/ml, 333 ng/ml, 111 ng/ml, 37.0 ng/ml, 12.3 ng/ml, 4.12 ng/ml, 1.37 ng/ml, 0.45 ng/ml)의 항-MSLN IgG, 8D3, IR739, H031, HL009, L113 및 H118로 상기와 동일하게 ELISA를 수행한 결과를 표준으로 하여 농도를 계산하였다. 분석 결과 변이체들 중에서는 HL009가 IR739에 비해 높은 뇌흡수 효율을 보였고, H031, L113 및 H118은 IR739 보다 낮은 뇌흡수 효율을 보였다(도 12).
실험예 5.3. IDS-HL009의 뇌흡수 효율 평가
IDS-HL009의 뇌흡수 효율을 분석하기 위해서 IDS-HL009를 5 mg/kg으로 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 1시간 및 24시간 후에 각각 3마리의 마우스에서 관류시킨 후 뇌를 적출하였다. 뇌 100 mg당 1 ml의 용해 버퍼를 넣고 분쇄한 후 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 항-인간 Fab IgG를 1 μg/ml로 코팅하고, 3% 탈지유로 차단시킨 후 상등액 50 μl를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Fc IgG를 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 0.05% tween20/PBS 용액으로 3회 세척하고, TMB ELISA 용액으로 검출하였다. 1,000 ng/ml 내지 0.45 ng/ml(10,00 ng/ml, 333 ng/ml, 111 ng/ml, 37.0 ng/ml, 12.3 ng/ml, 4.12 ng/ml, 1.37 ng/ml, 0.45 ng/ml)의 IDS-HL009로 상기와 동일하게 ELISA를 수행한 결과를 표준으로 하여 농도를 계산하였다. IDS-HL009는 IDS, IDS-IR739 및 IDS-H031에 비해 높은 뇌흡수 효율을 보였다(도 13).
실험예 6. IDS-HL009의 특성 평가
IDS 및 IDS-HL009의 특성을 분석하기 위해 96-웰 플레이트(black)에 10 ng/ml IDS 또는 10 μl IDS-HL009와 100 mM 4-메틸움벨리페릴 α-L-이도피라노시듀로닉산-2-설페이트(4MU-α-IdopyraA-2) 20 μl를 넣고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. Pi/Ci 용액(pH 4.5) 20 μl를 넣어서 반응을 정지시키고, 25 μg/ml의 재조합 인간 α-L-이듀로니다제(iduronidase) 10 μl를 넣었다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 0.25 M 소듐 카보네이트/바이카보네이트(pH 10.0) 200 μl를 넣고 형광을 측정하였다(흡광: 355 nm/방출: 460 nm). 4-메틸움벨리페론을 표준으로 하여 활성을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
IDS IDS-HL009
nmol/min/μg 51.4 13.0
nmol/min/pmole 3,084 2,105
% of IDS 68.3
상기 표 3에 나타난 바와 같이, IDS-HL009의 IDS 활성은 단백질의 μg을 기준으로 했을 때 IDS : IDS-HL009 = 51.4 : 13.0 nmol/min을 나타내고, 단백질의 mole을 기준으로 했을 때 IDS : IDS-HL009 = 3,084 : 2,105 nmol/min을 나타내었다. 상기 결과를 통해, 단백질의 mole 기준 시, IDS-HL009는 IDS의 약 70% IDS 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
<110> MOGAM INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH <120> FUSION PROTEIN COMPRISING IDS AND USE THEREOF <130> FPD/201810-0013 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 of fusion protein <400> 1 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 of fusion protein <400> 2 Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 of fusion protein <400> 3 Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 of fusion protein <400> 4 Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 of fusion protein <400> 5 His Pro Ser Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 of fusion protein <400> 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Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 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Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain of fusion protein <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Arg Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly 450 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of fusion protein <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ile Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Pro Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 16 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain of fusion protein <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly 450 <210> 17 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain of fusion protein <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Thr Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly 450 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of fusion protein <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Asn Val Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 19 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of fusion protein <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 20 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IDS-Fc region of fusion protein <400> 20 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser 180 185 190 Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg 195 200 205 Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu 210 215 220 Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn 225 230 235 240 Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile 245 250 255 Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg 260 265 270 Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg 275 280 285 Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile 290 295 300 Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp 305 310 315 320 Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe 325 330 335 Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu 340 345 350 Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro 355 360 365 Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr 370 375 380 Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro 385 390 395 400 Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His 405 410 415 Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro 420 425 430 Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro 435 440 445 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 450 455 460 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 465 470 475 480 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 485 490 495 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 500 505 510 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 530 535 540 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 545 550 555 560 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 565 570 575 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 580 585 590 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 595 600 605 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 610 615 620 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 625 630 635 640 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 645 650 655 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 660 665 670 Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 675 680 685 Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 690 695 700 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 705 710 715 720 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 725 730 735 Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 740 745 750 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 755 760 765 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 770 775 <210> 21 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IDS <400> 21 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser 180 185 190 Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg 195 200 205 Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu 210 215 220 Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn 225 230 235 240 Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile 245 250 255 Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg 260 265 270 Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg 275 280 285 Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile 290 295 300 Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp 305 310 315 320 Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe 325 330 335 Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu 340 345 350 Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro 355 360 365 Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr 370 375 380 Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro 385 390 395 400 Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His 405 410 415 Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro 420 425 430 Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro 435 440 445 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 450 455 460 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 465 470 475 480 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 485 490 495 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 500 505 510 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 515 520 525 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25

Claims (19)

  1. 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편을 포함한 제1 도메인;
    이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 활성을 가지는 단백질을 포함한 제2 도메인; 및 Fc 영역을 포함하며,
    상기 제1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2; 서열번호 5, 7, 및 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2; 서열번호 6, 8, 10 및 11의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Fc는 이형이합체인 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 인슐린 수용체에 결합하는 항체의 Fab 또는 scFv 영역인 것인, 융합 단백질.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역(CH)에서 유래된 것인, 융합 단백질.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 이형이합체 Fc 중 어느 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 갖는, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 도메인의 C-말단이 상기 Fc 영역의 N-말단에 결합된, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2 도메인의 C-말단이 상기 Fc 영역의 N-말단에 결합된, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 인슐린 수용체와 인슐린의 결합을 억제하지 않는, 융합 단백질.
  12. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 중추신경계 질환은 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 리소좀 축적병은 헌터증후군, 테이-삭스 병, 니만-피크 병, 폼페병, 크라베병, 고쉐병, 파브리병, 월만병, 모르쿠오 증후군, 멘케스 증후군, 갈락토시알리도시스, 당원축적 질환, 판코니-비켈 증후군, 레쉬 니한 증후군 및 젤웨거 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  15. 인슐린 수용체에 결합하는 항체 단편을 Fc 영역에 결합하여 제1 단량체를 제조하는 단계;
    이듀로네이트-2-설파타제(IDS)를 Fc 영역에 결합하여 제2 단량체를 제조하는 단계; 및
    상기 제1 단량체 및 제2 단량체를 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 항체 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2; 서열번호 5, 7, 및 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2; 서열번호 6, 8, 10 및 11의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 융합 단백질의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서,
    상기 제1 단량체의 Fc 영역의 CH3이 놉 구조를 갖는 경우, 상기 제2 단량체의 CH3은 홀 구조를 갖거나,
    상기 제1 단량체의 Fc 영역의 CH3이 홀 구조를 갖는 경우, 상기 제2 단량체의 CH3은 놉 구조를 갖는, 융합 단백질의 제조방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 IDS는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질의 제조방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 제1 단량체가 서열번호 12, 14, 16 및 17의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 중쇄 및 서열번호 13, 15, 18 및 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 경쇄를 포함하고,
    상기 제2 단량체가 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질의 제조방법.
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