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CN115724985A - 一种cdc平台抗体 - Google Patents

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CN115724985A
CN115724985A CN202110997571.7A CN202110997571A CN115724985A CN 115724985 A CN115724985 A CN 115724985A CN 202110997571 A CN202110997571 A CN 202110997571A CN 115724985 A CN115724985 A CN 115724985A
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赵杰
黄浩旻
朱祯平
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Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
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Abstract

本发明涉及增强CDC的平台技术。具体地，涉及具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或(2)在C末端含有尾片(tail‑piece)元件。本发明的抗体或其片段或融合蛋白通过第309位氨基酸的定点突变或者在C末端添加尾片元件，就可以显著提高本发明抗体或其片段或融合蛋白的CDC性能，进而可以改善已有抗体或其片段或融合蛋白的疗效，治疗多种疾病。

Description

一种CDC平台抗体
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体地，涉及一种补体依赖的细胞毒性(CDC)平台抗体。
背景技术
补体(complement，C)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。早在19世纪末Bordet即证实，新鲜血液中含有一种不耐热的成分，可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用，故称为补体。补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(complement system)。正常情况下，补体是血浆蛋白的组成成分。补体系统的各成分，以无活性的前体存在于血浆中。需要时，再在激活物如抗原-抗体复合物等的作用下，依次被激活，最终发挥作用。根据补体系统各成分的生物学功能，可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体。
补体固有成分可分为以下4类：1、经典激活途径的C1、C2、C4；2、旁路激活途径的B因子、D因子和P因子；3、甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin,MBL)激活途径的MBL和丝氨酸蛋白酶。4、参与共同末端通路的C3、C5、C6、C7、C8、C9。
补体激活过程依据其起始顺序不同，可分为3条途径：1、从C1q-C1r2-C1s2开始的经典途径(classical pathway)，抗原-抗体复合物为主要激活物；2、从C3开始的旁路途径(alternative pathway)，其不依赖于抗体；3、通过甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖基识别的凝集素激活途径(MBL pathway)。上述3条途径具有共同的末端通路，即膜攻击复合物的形成及其溶解细胞效应。
补体的经典激活途径(classical pathway)指主要由C1q与免疫复合体(immunecomplex)结合后，顺序活化C1r、C1s、C4、C2、C3，形成C3转化酶(C4b 2b)与C5转化酶(C4b2b3b)的级联酶促反应过程。它是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。
免疫复合体主要是与抗原结合的IgG、IgM分子。每个C1q分子必须与两个以上免疫球蛋白分子的Fc段结合；游离的或可溶性抗体不能激活补体。参与经典途径活化的补体成分依次为：C1、C4、C2和C3、C5～C9。
经典途径活化过程分为3个主要阶段：1、识别阶段；2、活化阶段；3、膜攻击阶段(攻膜阶段)。补体系统激活过程中，可产生多种生物活性物质，引起一系列生物学效应。补体的生物学效应有：1、增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性；2、增加血管的通透性；3、中和病毒；4、细胞溶解作用；5、免疫反应的调节作用等。
研究表明(参考文献：Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembledat the Cell Surface[J].Science,2014,343(6176):1260-3.)，六聚体是结合C1q并启动经典激活途径的最有效的形式。Genmab基于此原理开发出HexaBody平台(参考文献：JongR,Beurskens F J,Verploegen S,et al.A Novel Platform for the Potentiation ofTherapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamersat the Cell Surface[J].PLOS Biology,2016,14(1):e1002344.)。该平台技术特点是：通过诱导Fc特定位点突变(例如E345R)，增强Fc与Fc之间相互作用，可促进抗体在结合细胞表面抗原之后更易于形成六聚体。形成的六聚体可以有效增强免疫效应功能，特别是提高抗体的补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。然而，现有技术中的方法尚难以令人满意。
因此，本领域仍然需要开发具有良好CDC活性的平台抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CDC平台抗体或其片段或融合蛋白。
在本发明的第一方面，提供了一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：
(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件与尾片(tail-piece)元件通过接头连接。
在另一优选例中，所述靶向预定抗原的结合功能域结合选自下组的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其组合。
在另一优选例中，所述靶向预定抗原的结合功能域包含下组的结构域：VH、VL、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv或VHH。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件的CH3结构域的C末端包含尾片(tail-piece)元件。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于IgG。
在另一优选例中，所述IgG来源于哺乳动物，较佳地来源于鼠、食蟹猴或人，优选来源于人。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和/或CH3结构域。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于人IgG1。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域。
在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白为单特异性、双特异性、三特异性或多特异性抗体或其片段或融合蛋白。
在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白为二聚体、三聚体或多聚体。
在另一优选例中，所述多聚体为六聚体。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：F、C、W或Y。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括其他位置的氨基酸取代。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括：Fc区位置345位上的谷氨酸残基被精氨酸残基取代(E345R)。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包括选自下组Fc区位置的氨基酸残基取代：
(1)L309W+E345R；
(2)L309Y+E345R；
(3)L309E+E345R；
(4)L309F+E345R；
(5)L309H+E345R；
(6)L309C+E345R；
(7)L309D+E345R；
(8)L309N+E345R；
(9)L309Q+E345R；
(10)L309R+E345R；
(11)L309S+E345R；
(12)L309T+E345R；或
(13)L309K+E345R。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件的氨基酸编号按照EU编号系统。
在另一优选例中，所述尾片元件来源于人IgM。
在另一优选例中，所述尾片元件中包含一个或多个氨基酸的突变。
在另一优选例中，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO.7或8所示。
在另一优选例中，所述抗体或其片段或融合蛋白选自下组：
(a)具有选自下组氨基酸序列抗体或其片段或融合蛋白：
重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1309位置处W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；
重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和在根据EU编号人IgG1309位置处W或Y突变的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；
重链，包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：2所示序列的VL区；或
重链，包含具有如SEQ ID NO：21所示序列的VH区，和具有如SEQ ID NO：31所示序列的重链恒定区；以及，轻链，包含具有如SEQ ID NO：22所示序列的VL区；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗原结合功能和所述CDC活性的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种提高抗体或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗体或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc区和靶向预定抗原的结合功能域，所述方法包括：
(S1a)将一个或多个氨基酸残基中的突变引入到该抗体或其片段或融合蛋白中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(S1b)在Fc区的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ IDNO.7或8所示。
在另一优选例中，所述IgG重链的Fc区中的第309位L突变成选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(S2)比较突变后的抗体或其片段或融合蛋白与突变前的抗体或其片段或融合蛋白的CDC性能。
在另一优选例中，所述(S1a)与(S1b)可以同时、先后或颠倒次序进行。
在另一优选例中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y。
在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为Y且不为W时，将其突变为Y或W。
在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为Y时，将其突变为Y。
在另一优选例中，在步骤(S1a)中，当所述抗体或其片段或融合蛋白中重链Fc区中的309位不为W时，将其突变为W。
在另一优选例中，在步骤(S1a)中，所述突变还包括：将IgG重链的Fc区中的345位突变为R。
在另一优选例中，在步骤(S1a)中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位L突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和
将IgG重链的Fc区中的345位E突变为R。
在本发明的第三方面，提供了一种重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：
(1)在Fc区位置309上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件与尾片(tail-piece)元件通过接头连接。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件的CH3结构域的C末端包含尾片(tail-piece)元件。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于IgG。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件来源于人IgG1。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3结构域。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：F、C、W或Y。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括其他位置的氨基酸取代。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件还包括在Fc区位置345位上的谷氨酸残基被精氨酸残基取代(E345R)。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件包括选自下组Fc区位置的氨基酸残基取代：
(1)L309W+E345R；
(2)L309Y+E345R；
(3)L309E+E345R；
(4)L309F+E345R；
(5)L309H+E345R；
(6)L309C+E345R；
(7)L309D+E345R；
(8)L309N+E345R；
(9)L309Q+E345R；
(10)L309R+E345R；
(11)L309S+E345R；
(12)L309T+E345R；或
(13)L309K+E345R。
在另一优选例中，所述重链Fc区元件的氨基酸编号按照EU编号系统。
在另一优选例中，所述尾片元件来源于人IgM。
在另一优选例中，所述尾片元件中包含一个或多个氨基酸的突变。
在另一优选例中，所述尾片元件的序列如SEQ ID NO.7或8所示。
在本发明的第四方面，提供了一种分离的核酸分子，所述的核酸分子编码如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白，或如本发明的第三方面所述的重链Fc区元件。
在本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如本发明的第四方面所述的核酸分子。
在本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第五方面所述的表达载体。
在本发明的第七方面，提供了一种如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如本发明的第三方面所述的重链Fc区元件的制备方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如本发明的第六方面所述的宿主细胞，从而表达所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件；
(b)分离并纯化(a)所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件。
在本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明的第一方面中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
在本发明的第十方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白、或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物、或如本发明的第九方面所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤及其它赘生性恶性疾病。
在本发明的第十一方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明的第一方面所述的抗体或其片段或融合蛋白、如本发明的第九方面所述的药物组合物或如本发明的第八方面所述的免疫偶联物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了含有Fc段309位定点突变(L309 E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗体对Raji细胞的CDC活性。
图2显示了含有Fc段309位定点突变(L309 E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)的抗体对Daudi细胞的CDC活性。
图3显示了含有Fc段309位定点突变(L309 F/C/W/Y)的抗体和Fc段末端改造(Pep及Pep-CS)的抗体对Daudi细胞的CDC活性。
图4显示了OKT10-Hu-IgG1及其突变体对Daudi细胞的CDC活性。
图5显示了50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1抗体对食蟹猴CD38的结合能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，改造抗体重链恒定区Fc的L309位和/或在抗体重链恒定区的Fc段融合人IgM的tail-piece，能够显著增强抗体的免疫效应功能，特别是提高抗体的补体依赖的细胞毒性(CDC)。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。
本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，“尾片(tail-piece)元件”、“TP元件”可以互换使用，均指来自IgM的tail-piece序列，优选来源于人IgM。本发明的TP元件可包含任何合适的氨基酸序列。所述TP元件可以是在天然存在的抗体中被发现的tail-piece，或者可选择地，其可以是在长度和/或组成上与天然tail-piece相异的经修饰的tail-piece序列。所述的修饰可以是一个或多个氨基酸的突变，例如将IgM的tail-piece中的半胱氨酸突变成丝氨酸。
在本发明的一个具体实施例中，TP元件的序列如SEQ ID NO.7或8所示。
应理解，可以将TP元件与重链Fc区的C末端直接融合。或者，可以在TP元件与重链Fc区之间提供短的接头序列。
如本文所用，术语“接头”是指Fc区和TP元件之间的短的接头序列，优选为柔性接头。合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。
抗体或其片段或融合蛋白
本发明的抗体或其片段或融合蛋白是一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
应理解，本发明的抗体或其片段或融合蛋白的重链Fc区元件中第309位的特定CDC增强型突变可与其他提高抗体性能(如CDC、特异性、亲和力等)的技术结合，例如与E345R突变结合。较佳地，本发明中的抗体或其片段或融合蛋白的重链Fc区元件包含突变组合L309W+E345R时，具有意外的明显增强CDC的作用。
如本文所用，术语“CDC平台抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的抗体或其片段”“本发明的融合蛋白”“本发明的抗体或其片段或融合蛋白”可以互换使用，均指本发明第一方面所述的CDC功能增强的抗体或其片段或融合蛋白。应理解，所述术语还包括本发明抗体或其片段或融合蛋白的活性片段，所述活性片段既保留了抗原结合活性，还保留了第309位的特定突变和/或TP(tail-piece)元件。
在本说明书中，除非另外指定，否则将EU编号系统用于提及抗体结构域中的残基。该系统最初由Edelman等于1969年设计，并详细描述于如下文献中：Kabat等，1987(Edelman等,1969；“The cova1ent structure of an entireγG immunoglobulin molecule,”PNASBiochemistry第63卷pp78-85。Kabat等,1987；Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA。)。当将位置编号和/或氨基酸残基赋予特定抗体同种型时，其旨在适用于任何其它抗体同种型的相应的位置和/或氨基酸残基，这是本领域技术人员己知的。例如在天然存在的人IgG1、IgG3和IgG4中的位置309上发现的野生型残基是亮氨酸残基，在天然存在的IgG2中发现的野生型残基是缬氨酸残基。当提及来源于IgM或IgA的尾部的氨基酸残基时，根据本领域的常规实践，给出的位置编号是天然存在的IgM或IgA中的残基的位置编号。
应理解，本发明还提供了一种构建CDC平台抗体或其片段或融合蛋白的方法，即构建本发明抗体或其片段或融合蛋白的方法，所述方法如本发明第二方面所述。通过本发明的构建CDC平台抗体或其片段或融合蛋白的方法，可以提高靶向预定抗原的抗体或其片段或融合蛋白的CDC活性。
在本发明中，本发明的抗体或其片段或融合蛋白包含的靶向预定抗原的结合功能域可以靶向不同的抗原靶点，所述靶向预定抗原的结合功能域结合可以选自下组的抗原分子：CD38、CD3、CD47、CD19、CD20、HER2、EGFR、CD123、Glypican-3、CD25、Trop-2、EpCAM、或其组合。
以CD38为例，优选地，本发明抗CD38抗体的序列如专利申请CN202010805420.2中所述，本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗原的结合功能域进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗原的结合功能域的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。
在本发明中，本发明抗体或其片段或融合蛋白还包括其保守性变异体，指与本发明抗体或其片段或融合蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0003234601220000111
Figure BDA0003234601220000121
本发明中，术语“抗”和“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface PlasmonResonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明的抗体或其片段或融合蛋白可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
编码核酸和表达载体
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明中，术语“表达载体”是指携带表达盒用于表达特定目的蛋白或其他物质的载体，如质粒、病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、噬菌体、酵母质粒或其他载体。例如包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体，所述表达载体包括但并不限于：病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。所述表达载体较佳地包括pDR1、pcDNA3.4(+)、pDHFR或pTT5。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的多核苷酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F或293E细胞。
药物组合物和应用
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为4-8，较佳地pH约为5-7，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的双功能抗体或其片段或融合蛋白可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双功能抗体或其片段或融合蛋白的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双功能抗体或其片段或融合蛋白(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的双功能抗体或其片段或融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的双功能抗体或其片段或融合蛋白、或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，术语“有效量”是指本发明的药物组合物施用受试者后，在治疗的个体中产生预期效果的量或剂量，该预期效果包括个体病症的改善。术语“受试者”包括但不限于哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠和小鼠等。
本发明的主要优点包括
(1)本发明提供了一种新的增强CDC的技术。该技术有潜力将缺失或仅有有限的CDC毒性的抗体药物转化成为有CDC增强型的抗体药物。运用该技术，可以直接改造很多现成的作用于不同的靶点/靶细胞的抗体。运用该技术，可以改善已有抗体的疗效，治疗多种疾病。
(2)通过第309位氨基酸的定点突变，就可以显著提高本发明抗体或其片段或融合蛋白的CDC性能。此外，本发明第309位的特定CDC增强型突变可与其他提高抗体性能(如CDC、特异性、亲和力等)的技术结合，例如与E345R突变结合。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例中使用的蛋白表达和纯化方法说明如下：
将目的基因构建到表达载体pcDNA3.4中，利用PEI(Polyethylenimine)将构建好的表达载体或表达载体的组合转入FreeStyleTM293-F Cells细胞(后文简称HEK293F，购自Thermo Fisher Scientific)中以表达抗体或重组蛋白，HEK293F细胞在Free Style 293Expression Medium(购自Thermo Fisher Scientific)中培养5天后收取细胞上清，然后用Protein A亲和层析纯化抗体，用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。
以下实施例中使用的ELISA检测方法说明如下：
用相应的重组蛋白包被微孔板，用含有1％牛血清白蛋白的PBST(PBST为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)封闭微孔板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的微孔板中，室温孵育半小时。洗板后加入适当稀释的HRP(HorseradishPeroxidase)标记的羊抗人抗体(Fc specific，购自Sigma)，室温孵育半小时。洗板后每孔加入100μL以TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)为底物的显色液，室温孵育1～5min。加50μL终止液(2M H2SO4)终止反应。读板机(SpectraMax 190)读取OD450。用GraphPadPrism7进行作图和数据分析，并计算EC50/IC50。
以下实施例中使用的理化性质检测方法说明如下：
HPLC-SEC
抗体是高分子量蛋白质，具有高度复杂的二级和三级结构。由于翻译后修饰、聚集和降解等变化，抗体在生物化学和生物物理特性方面是异质的。当通过分离技术分析三特异性抗体时，通常会观察到变体、聚集体和降解片段，它们的存在可能会损害安全性和有效性。在生产和存储抗体的过程中容易出现聚集体、降解片段和不完整组装的分子。本发明使用高效液相色谱-尺寸排阻色谱(High-performance liquid chromatography-sizeexclusion chromatography，HPLC-SEC)检测样品中上述杂质的含量。聚集体的分子量要大于单体，因此相应峰的保留时间较短；降解片段或不完整组装分子的分子量要小于单体，因此相应峰的保留时间较长。HPLC-SEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相配制方法如下：取适量20mM磷酸二氢钠母液，用20mM磷酸氢二钠调节PH至6.8±0.1；进样量：20μg；色谱柱为TSK G3000SWXL，规格为7.8×300mm 5μm；流速0.5mL/min，洗脱时间30min；柱温25℃，样品室温度10℃；检测波长214nm。
本发明的抗体序列：
表1.抗体序列
Figure BDA0003234601220000151
Figure BDA0003234601220000161
Figure BDA0003234601220000171
Figure BDA0003234601220000181
Figure BDA0003234601220000191
*其中，X＝E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、K、W、Y。
实施例1抗人CD38单克隆抗体(50G12)的制备
50G12-Humanized(后文称作50G12-Hu-IgG1)是抗CD38人源化单克隆抗体，其重链和轻链氨基酸序列来自于CN202010805420.2中的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(即本发明中的SEQ ID NO：5和6)。50G12-Hu-IgG1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：1和2。50G12-Hu-IgG1重链恒定区为人IgG1(氨基酸序列如SEQ ID NO：3)，轻链恒定区为人Kappa(氨基酸序列如SEQ ID NO：4)。在此，将50G12-Hu-IgG1重链和轻链的编码基因分别命名为50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC。将50G12-Hu-IgG1-HC和50G12-Hu-IgG1-LC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为50G12-Hu-IgG1。
实施例2抗体重链恒定区Fc段的改造
根据文献(Rowley T F,Peters S J,Aylott M,et al.Engineered hexavalentFc proteins with enhanced Fc-gamma receptor avidity provide insights intoimmune-complex interactions[J].Communications biology,2018,1(1):1-12.)可知，人IgG1单克隆抗体在L309(Eu numbering scheme)突变成半胱氨酸(简写为C)并且在Fc末端融合人IgM的tail-piece之后会容易生成六聚化的抗体复合体。这表明，人IgG1 L309C突变和人IgM的tail-piece具有促进人IgG1形成六聚体的潜力。
1、Fc段309位的定点突变
在此，本实施例对50G12-Hu-IgG1重链基因L309位进行了定点突变，将L309分别突变成(E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)，产生了一系列突变体，然后按照上述方法表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为50G12-Hu-IgG1-L309X(X表示E/F/H/C/D/N/Q/R/S/T/K/W/Y)。
测定CDC的方法描述如下：Raji和Daudi细胞购自ATCC(American Type CultureCollection)，并按照ATCC推荐方法进行常规培养和传代。在RPMI-1640(Gibco；货号：11835-030)中加入人血清(澳赛尔斯；货号：PB022-C)，使人血清终浓度为5％；用此培养基重悬对数生长期的Raji/Daudi细胞，然后接种至96孔板中(Corning；货号：CLS3599)，每孔接种50μL细胞悬液(含10万个细胞)；将待测抗体进行梯度稀释，然后加入上述接种细胞的96孔板中，每孔50μL；混匀之后，置于细胞二氧化碳细胞培养箱中孵育2.5小时；在96孔板中加入CCK-8(Dojindo，货号：CK04)，每孔20μL，继续孵育2小时；用SpectraMax190(MolecularDevices)读取96孔板的OD450；用GraphPad Prism7进行数据分析和作图，计算IC50。
CDC活性越强，细胞活力越低，OD450也越低。图1和图2结果均显示，与母本抗体50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有显著增强的CDC。其中IsotypeControl为与靶点不相关的人IgG1单克隆抗体。
2、Fc段末端的改造
在此，通过基因工程将IgM的tail-piece(氨基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQID NO：7)，该段短肽简称为Pep)的编码序列连接到50G12-Hu-IgG1重链基因的末端，并将该重链基因命名为50G12-Hu-IgG1-Pep-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：9)。为避免表达过程中抗体分子之间形成二硫键，将两条tail-piece中的半胱氨酸突变成丝氨酸(突变后tail-piece的氨基酸序列：PTLYNVSLVMSDTAGTSY(SEQ ID NO：8)，该段短肽简称为Pep-CS)，并将该重链基因命名为50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：10)。将50G12-Hu-IgG1-Pep-HC和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS-HC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体分别与50G12-Hu-IgG1-LC基因组合后表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS。
用上述方法检测50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的CDC。不同之处在于，此处使用
Figure BDA0003234601220000212
Luminescent CellViability Assay(Promega，货号：G7572，简称CTG)检测细胞活力。在一些孔的细胞中加入Triton X-100(0.1％)以充分裂解细胞，该组细胞加入CTG后产生的信号为基底值。没有经过抗体处理的细胞在加入CTG后产生的信号为最大值。CDC按照如下公式计算：细胞毒性(％)＝(最大值-实验值)/(最大值-基底值)×100。用GraphPad Prism7进行数据分析和作图，如图3所示。计算EC50，如表2所示。
表2.本发明抗体的CDC活性
Figure BDA0003234601220000211
CDC越强，EC50越小，Top(曲线高平台的高度)越高。图3和表2结果显示，与母本抗体50G12-Hu-IgG1相比，50G12-Hu-IgG1-L309F/C/W/Y具有显著增强的CDC活性，其中50G12-Hu-IgG1-L309F/Y的CDC弱于50G12-Hu-IgG1-L309C/W。50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS具有相近的CDC，并且它们的CDC与50G12-Hu-IgG1-L309C/W基本相当。50G12-Hu-IgG1-L309C/W、50G12-Hu-IgG1-Pep和50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大于99，这说明这些抗体在高浓度时，能够充分裂解靶细胞。
实施例3抗体突变体的聚集体分析
用HPLC-SEC测定上述优选抗体突变体的纯度。结果如下：
表3.本发明优选抗体突变体的纯度
Figure BDA0003234601220000221
HPLC-SEC的测定结果显示，50G12-Hu-IgG1-L309F/W/Y和
50G12-Hu-IgG1-Pep-CS的主峰比例均大于98％，这说明它们尺寸异质性小，具有较高的纯度。此外，50G12-Hu-IgG1-L309C和50G12-Hu-IgG1-Pep的主峰比例分别为79.7％和74.0％，两者纯度低于80％，图谱中显示这两种抗体中存在较多的聚集体。
实施例4抗人CD38单克隆抗体OKT10的改造
1、OKT10人源化单克隆抗体的制备
OKT10是抗人CD38单克隆抗体，由小鼠杂交瘤产生。其重链可变区和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：19和20)来自NCBI GenBank(ABA42888.1和ABA42887.1)。
由上海生工生物工程有限公司合成编码上述可变区的DNA。对OKT10的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则分别确定OKT10重链和轻链的抗原互补决定区和框架区。OKT10重链CDR的氨基酸序列为H-CDR1：RSWMN(SEQ ID NO：11)、H-CDR2：EINPDSSTINYTTSLKD(SEQ ID NO：12)和H-CDR3：YGNWFPY(SEQ ID NO：13)，轻链CDR的氨基酸序列为L-CDR1：KASQNVDTNVA(SEQ ID NO：14)、L-CDR2：SASYRYS(SEQ ID NO：15)和L-CDR3：QQYDSYPLT(SEQ ID NO：16)。
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将鼠源OKT10重链可变区与人IgG胚系序列进行同源性比较，选择IGHV3-48*01为重链CDR移植模板，将鼠源OKT10重链CDR移植入IGHV3-48*01骨架区，并在H-CDR3之后加入WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：17)作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将鼠源OKT10轻链可变区与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV1-16*01为轻链CDR移植模板，将鼠源OKT10轻链CDR移植入IGKV1-16*01的骨架区，并在L-CDR3之后加入FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：18)作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一些框架区的氨基酸位点进行回复突变(回复突变就是将人源框架区的某些氨基酸突变成鼠源框架区同一位置的氨基酸，回复突变的位点一般对维持抗体的结构和/或亲和力是至关重要的)。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。
优选的，对于CDR移植重链可变区，将第28位的T回复突变为D。对于CDR移植轻链可变区，将第36位的F回复突变为Y，第46位的S回复突变为A。
上述带有回复突变位点的重链可变区和轻链可变区分别定义为OKT10人源化的重链可变区(氨基酸序列如SEQ ID NO：21)和轻链可变区(氨基酸序列如SEQ ID NO：22)。由上海生工生物工程有限公司合成编码上述人源化的重链和轻链可变区的DNA。将合成的人源化重链可变区与人IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：3)相连，获得全长的人源化重链基因，命名为OKT10-Hu-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：23)；将人源化轻链可变区与人Kappa链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：4)相连，获得全长的人源化轻链基因，命名为OKT10-Hu-LC(氨基酸序列如SEQ ID NO：24)。
将OKT10-Hu-HC和OKT10-Hu-LC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为OKT10-Hu-IgG1。
2、OKT10-Hu-IgG1突变体的制备
在此，对OKT10-Hu-IgG1重链基因L309位进行了定点突变，分别突变成W或Y，突变基因再分别与OKT10-Hu-LC组合，表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-L309Y。在此，通过基因工程将Pep-CS的编码序列连接到OKT10-Hu-IgG1重链基因的末端，并将该重链基因命名为OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS-HC(氨基酸序列如SEQ ID NO：25)，与OKT10-Hu-LC组合后按照上述方法表达并纯化抗体，所得抗体命名为OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS。
3、测定OKT10-Hu-IgG1突变体的CDC
用上述实施例中描述的方法测定OKT10-Hu-IgG1及其突变体的CDC。如图4所示。
图4结果显示，与母本抗体OKT10-Hu-IgG1相比，OKT10-Hu-IgG1-L309W、OKT10-Hu-IgG1-L309Y和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS具有显著增强的CDC活性，它们的EC50分别为0.5942nM、5.902nM和1.715nM，它们的高平台分别为99.85、69.84和99.43。OKT10-Hu-IgG1-L309W和OKT10-Hu-IgG1-Pep-CS的Top均大于99，这说明这些抗体在高浓度时，能够充分裂解靶细胞。上述结果表明，在三者之中，OKT10-Hu-IgG1-L309W的CDC最强。
4、测定OKT10-Hu-IgG1对食蟹猴CD38的结合力
Daratumumab是一种已被批准上市的抗人CD38单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：26和27)来自《WHO Drug Information,Vol.24,No.1,2010》。
Isatuximab是另一种已被批准上市的抗人CD38单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：28和29)来自《WHO Drug Information,Vol.29,No.3,2015》。
由上海生工生物工程有限公司合成上述重链可变区和轻链可变区的DNA。将合成的Daratumumab重链可变区基因与人IgG1重链恒定区基因相连，获得全长的重链基因；将Daratumumab轻链可变区基因与人Kappa链恒定区基因相连，获得全长的轻链基因。用上述实施例中描述的方法表达并纯化抗体，所得抗体命名为Daratumumab-IgG1。此外，用相似的实验方法获得抗体Isatuximab-IgG1。
食蟹猴CD38氨基酸序列(SEQ ID NO：30)来自https://www.uniprot.org/uniprot/Q5VAN0，由上海生工生物工程有限公司合成编码食蟹猴CD38胞外段的DNA，在基因末端添加编码多聚组氨酸的编码序列，然后将重组基因构建到表达载体中。用上述实施例中描述的方法表达该重组蛋白，然后利用Ni-NTA亲和层析柱对培养上清中的重组蛋白进行纯化，所得重组蛋白命名为CD38-ECD-Cyno。
用CD38-ECD-Cyno包被微孔板(10ng/孔)，然后用ELISA测定50G12-Hu-IgG1、OKT10-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1对CD38-ECD-Cyno的结合能力。
图5显示，OKT10-Hu-IgG1能够有效结合食蟹猴的CD38，EC50为0.1324nM。50G12-Hu-IgG1、Daratumumab-IgG1和Isatuximab-IgG1均不能识别食蟹猴CD38。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 一种CDC平台抗体
<130> P2021-2106
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Met Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Arg Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 6
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp
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Met Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Arg Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr
1 5 10 15
Ser Tyr
<210> 9
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
450 455 460
Gly Thr Cys Tyr
465
<210> 10
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Thr Tyr
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Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
450 455 460
Gly Thr Ser Tyr
465
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Ser Trp Met Asn
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Ser
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Thr Val Ser Ala
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ile Met Pro Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr
435 440 445
Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Ser Tyr
450 455 460
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 258
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 30
Leu Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg
1 5 10 15
Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His
20 25 30
Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys
35 40 45
Gly Ala Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr
50 55 60
Gln Pro Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr
65 70 75 80
Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val
85 90 95
Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala
100 105 110
Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr
115 120 125
Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser
130 135 140
Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly
145 150 155 160
Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys
165 170 175
Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys
180 185 190
Val Gln Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser
195 200 205
Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile
210 215 220
Ser Lys Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp
225 230 235 240
Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser
245 250 255
Gly Ile
<210> 31
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val
325 330 335
Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Ser Tyr
340 345
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (192)..(192)
<223> X=E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、K、W、Y
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Xaa
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (11)

1.一种具有抗原结合活性和CDC活性的抗体或其片段或融合蛋白，其特征在于，所述抗体或其片段或融合蛋白包含靶向预定抗原的结合功能域、和重链Fc区元件，所述重链Fc区元件：
(1)在Fc区位置309位上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
2.一种提高抗体或其片段或融合蛋白的CDC的方法，其中，所述抗体或其片段或融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc区和靶向预定抗原的结合功能域，所述方法包括：
(S1a)将一个或多个氨基酸残基中的突变引入到该抗体或其片段或融合蛋白中，所述突变包括将IgG重链的Fc区中的309位突变为选自下组的氨基酸：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(S1b)在Fc区的C末端融合尾片(tail-piece)元件，所述尾片元件的序列如SEQ IDNO.7或8所示。
3.一种重链Fc区元件，其特征在于，所述重链Fc区元件：
(1)在Fc区位置309上包含选自下组的氨基酸残基：W、Y、E、F、H、C、D、N、Q、R、S、T、或K；和/或
(2)在C末端含有尾片(tail-piece)元件。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码如权利要求1中所述的抗体或其片段或融合蛋白，或如权利要求3所述的重链Fc区元件。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求5所述的表达载体。
7.如权利要求1中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如权利要求3所述的重链Fc区元件的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，从而表达所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件；
(b)分离并纯化(a)所述的抗体或其片段或融合蛋白或所述的重链Fc区元件。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
(a)如权利要求1所述的抗体或其片段或融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1中所述的抗体或其片段或融合蛋白或如权利要求8所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的抗体或其片段或融合蛋白、或如权利要求8所述的免疫偶联物、或如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤及其它赘生性恶性疾病。
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Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9540442B2 (en) * 2012-08-02 2017-01-10 Jn Biosciences Llc Antibodies or fusion proteins multimerized via cysteine mutation and a mu tailpiece
MX2016010951A (es) * 2014-03-05 2016-11-29 Ucb Biopharma Sprl Proteinas de fc multimericas.
MX2016010953A (es) * 2014-03-05 2016-11-29 Ucb Biopharma Sprl Proteinas de fc multimericas.
CA2978501A1 (en) * 2015-03-05 2016-09-09 Ucb Biopharma Sprl Polymeric fc proteins and methods of screening to alter their functional characteristics
GB201511787D0 (en) * 2015-07-06 2015-08-19 Ucb Biopharma Sprl Proteins
CN114075283A (zh) * 2020-08-12 2022-02-22 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途

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