TW202409093A - 融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於融合蛋白之領域，且尤其關於包括濾泡抑素部分之融合蛋白。本發明亦關於製備該等融合蛋白之方法，以及包括該等融合蛋白之醫藥調配物。
Description
本發明係關於融合蛋白之領域且尤其係關於包括濾泡抑素部分之融合蛋白。本發明亦係關於製備該等融合蛋白之方法以及包括該等融合蛋白之醫藥調配物。
濾泡抑素係自分泌醣蛋白，其主要功能在於結合及中和TGF-β超家族之成員及尤其活化素A、活化素B、GDF8 (肌骨素)及GDF11。已知存在若干不同形式，包含315-胺基酸多肽(稱為FST315)及288-胺基酸多肽(稱為FST288)，如圖1中所展示。FST315及FST288皆對活化素(活化素A及活化素B)以及肌骨素(GDF8)具有高親和力。特定而言，濾泡抑素可結合及抑制肌骨素，肌骨素係骨骼肌質量之負調控劑。
已證實，濾泡抑素在某些情況下可作為潛在治療蛋白，包含在治療諸如肌肉營養不良症等肌肉病症時(WO2015/187977及WO2017/152090)。然而，濾泡抑素在治療中之應用遇到許多障礙，此主要係基於難以在活體外表現濾泡抑素且濾泡抑素在活體內具有低穩定性/短半衰期。已嘗試克服該等障礙，且WO2015/187977及WO2017/152090論述了包括融合至免疫球蛋白Fc部分之濾泡抑素多肽之融合蛋白之應用。
仍需要可較易於表現於活體外且在活體內具有改良半衰期或其他有益效應之濾泡抑素肽及融合蛋白。
在第一態樣中，本發明提供一種融合蛋白，其包括：濾泡抑素部分、抗體部分及視情況位於濾泡抑素部分與抗體部分之間之連接體。
在一些實施例中，抗體部分結合白蛋白(例如血清白蛋白(SA))且濾泡抑素部分包括或係天然蛋白質、其功能片段及/或其功能變體。在一些實例中，濾泡抑素部分係選自：a. SEQ ID NO:1；b. SEQ ID NO:2；c. SEQ ID NO:3；d. SEQ ID NO:4；e.包括含有SEQ ID NO.1 - 4中之任一者中289至314個殘基之胺基酸殘基之任何蛋白質；或f.與SEQ ID NO:1 - 4中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列。
在一些具體實例中，融合蛋白包括以下各項或由其組成：
(a) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(b) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(c) i.由SEQ ID NO:3或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(d) i.由SEQ ID NO:4或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(e) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(f) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(g) i.由SEQ ID NO:3 (FST315HBM)或SEQ ID NO:22或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(h) i.由SEQ ID NO:4 (FST288HBM)或SEQ ID NO:25或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(i) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；
(j) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈；或
(k) (a)至(j)中之任一者之功能變體或片段。
在另一態樣中，本發明係關於i)一或多個編碼本發明融合蛋白之經分離多核苷酸；ii)一或多個包括一或多個本發明多核苷酸之選殖或表現載體；以及iii)包括一或多個本發明多核苷酸或一或多個本發明表現載體之宿主細胞。
在又一態樣中，本發明提供產生本發明融合蛋白之製程，其包括在用於產生融合蛋白之適宜條件下培養本發明宿主細胞及分離融合蛋白。
在另一態樣中，本發明係關於包括本發明融合蛋白及一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明融合蛋白或本發明醫藥組合物係用於療法中。
除非另外指示，否則技術術語係根據其常用意義來使用。若賦予某些術語特定含義，則術語之定義將在使用術語之背景中給出。
在提及單數名詞時若使用不定冠詞或定冠詞(例如「一(a、an)」或「該」)，則此術語包含複數個該名詞，除非另外特定陳述。如本文中所使用，術語「包括」不排除其他要素。出於本發明目的，術語「由……組成」可視為術語「包括」之較佳實施例。
本文所用之術語「濾泡抑素」或「FST」係指作為活化素A及B之已知抑制劑之自分泌醣蛋白(UniProt參考號：P19883)。濾泡抑素亦以較低親和力結合至GDF11、GDF8 (肌骨素)、BMP 2、4、6、7、11及15。人類濾泡抑素存在以下兩種主要選擇式剪接形式：較短形式(FST288, 31.6kDa，其結合細胞)及較長循環形式(FST315, 34.8kDa)。FST315係根據SEQ ID NO:1定義且FST288係根據SEQ ID NO:2定義(SEQ ID NO:1及2皆係缺乏N末端分泌信號肽之成熟形式)。FST315及FST288具有4個由二硫鍵(總共18個)、兩個N連接之醣基化位點及一個肝素結合位點之網路穩定之域。FST315在其C末端(稱為酸性尾)具有額外之27胺基酸域(富酸)。該等術語亦涵蓋其功能片段及/或功能變體，例如揭示於Sidis等人，2005中之彼等。若後接有數字(例如FST288)，則此指示蛋白質係濾泡抑素之288形式(始於成熟形式之殘基1)。若後接有數字及字母(例如FST315HBM)，則此指示肝素結合突變體(HBM)形式以及變體類型(此處係濾泡抑素之315形式，始於成熟形式之殘基1，且在殘基K76、K81及K82處包含丙胺酸突變)。活化素係二聚體多肽生長因子且屬TGF-β超家族。活化素可刺激卵巢及胎盤細胞中之激素產生，支持神經元細胞存活，並正面或負面地(端視細胞類型)影響細胞週期進展。在若干組織中，活化素信號傳導係由其相關異源二聚體抑制素拮抗。舉例而言，在自垂體釋放濾泡刺激激素(FSH)期間，活化素促進FSH分泌及合成，而抑制素則防止FSH分泌及合成。活化素亦視為肌肉質量及功能之負調控劑，且活化素拮抗劑可在活體內促進肌肉生長或抵抗肌肉損失。
本文所用之術語「抗體」包含(但不限於)單株抗體、多株抗體及藉由業內已知之重組技術生成之重組抗體。本文所用之術語「抗體」包含任何物種、尤其哺乳動物物種之抗體，例如任何同型之人類抗體，包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE、IgD及產生為此基礎結構之二聚體(包含IgGA1、IgGA2)或五聚體(例如IgM)之抗體以及其經修飾變體；非人類靈長類動物抗體，例如來自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹獼猴；齧齒類動物抗體，例如來自小鼠或大鼠；兔、山羊或馬抗體；駱駝科抗體(例如來自駱駝或美洲鴕，例如Nanobodies
TM)及其衍生物；鳥類抗體，例如雞抗體；或魚類抗體，例如鯊魚抗體。術語「抗體」係指醣基化及無醣基化抗體。另外，本文所用之術語「抗體部分」可係指全長抗體，但更通常意欲提及抗體片段，且更特定地提及其抗原結合片段。抗體片段包括至少一個如業內已知之重鏈或輕鏈免疫球蛋白域並結合至一或多種抗原。本發明抗體片段之實例包含Fab、經修飾Fab、Fab’、經修飾Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-Fv-Fv、scFv及雙scFv片段。該片段亦可為二價抗體、三體、三價抗體、四價抗體、微小抗體、單域抗體(dAb) (例如sdAb)、VL、VH、VHH或駱駝科抗體(例如來自駱駝或美洲鴕，例如Nanobody
TM)及VNAR片段。本發明之抗原結合片段亦可包括連接至一或兩個scFv或dsscFv之Fab，每一scFv或dsscFv結合相同或不同靶(例如一個結合治療靶之scFv或dsscFv及一個藉由例如白蛋白來增加半衰期之scFv或dsscFv)。
本文所用之術語「Fab」係指抗體片段，其包括含有輕鏈之VL (可變輕鏈)域及恆定域(CL)之輕鏈片段以及重鏈之VH (可變重鏈)域及第一恆定域(CH1)。
本文所用之術語「Fab’」類似於Fab，其中Fab部分由Fab’代替。該形式可提供為其聚乙二醇化形式。本發明Fab’之二聚體產生F(ab’)2，其中(例如)二聚合可經由鉸鏈進行。
術語「Fv」係指全長抗體之兩個可變域，例如合作可變域，例如同族對或親和力成熟之可變域，亦即VH及VL對。
本文所用之術語「單鏈可變片段」或「scFv」係指由VH及VL可變域之間之肽連接體穩定之單鏈可變片段。
本文所用之術語「單域抗體」係指由單一單體可變域組成之抗體片段。單域抗體之實例包含VH或VL或VHH或V-NAR。
如本文中所使用，術語「親和力」係指蛋白質或其片段與其受體(如所關注蛋白質係配體)或其配體(若所關注蛋白質係受體)之間之所有非共價相互作用之強度。除非另外指明，否則如本文所使用，術語「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如受體與其配體)之間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示。可藉由業內已知之常用方法(包含彼等闡述於本文中者)來量測親和力。
本文在抗體及抗原結合片段之背景中所用之術語「特異性」意欲係指，抗體僅識別其特異性抗原，或與結合至其非特異性抗原相比抗體對其特異性抗原具有顯著更高之結合親和力，例如結合親和力高至少5、6、7、8、9、10倍。
術語「白蛋白」、「血清白蛋白」或「SA」係指血管及血管外腔室中之大量球蛋白。血清白蛋白之人類形式(HSA)可根據參考號P02768知曉，而小鼠血清等效物提及為P07724。
術語「嵌合」係指其中至少一個重鏈及/或輕鏈抗體序列之第一部分係來自第一物種且重鏈及/或輕鏈抗體序列之第二部分係來自第二物種之抗體。本文之目標嵌合抗體包含含有源自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴，例如狒狒、恒河猴或食蟹獼猴)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。
「人類化」抗體係含有衍生自非人類抗體之序列之嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體係如下人類抗體(受體抗體)：其中來自受體超變區之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、雞或非人類靈長類動物)超變區[或互補決定區(CDR)] (供體抗體)之具有期望特異性、親和力及活性之殘基代替。在大部分情況下，人類(受體)抗體在CDR外部(亦即在框架區(FR)中)之殘基另外由相應非人類殘基代替。此外，人類化抗體可包括受體抗體或供體抗體中不存在之殘基。實施該等修飾以進一步改良抗體性質。人類化減小了人類中之非人類抗體之免疫原性，由此有利於施加抗體以治療人類疾病。人類化抗體及若干用以生成其之不同技術在業內已眾所周知。除非另外指示，否則HVR殘基(CDR殘基)及可變域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat來編號。
術語「抗體」亦係指可替代人類化生成之人類抗體。舉例而言，可產生轉基因動物(例如小鼠)，該等轉基因動物在免疫後能夠在不產生內源性鼠類抗體之情況下產生完整人類抗體譜。在活體外獲得人類抗體/抗體片段之其他方法係基於顯示技術，例如噬菌體顯示或核糖體顯示技術，其中使用至少部分地人工生成或來自供體之免疫球蛋白可變(V)域基因組庫之重組DNA庫。用於生成人類抗體之噬菌體及核糖體顯示技術在業內已眾所周知。亦可自使用所關注抗原離體免疫之經分離人類B細胞來生成人類抗體且隨後融合以生成然後可篩選最佳人類抗體之雜交瘤。
本文所用之術語「功能變體」係指已相對於參考序列進行修飾但保留該參考序列之至少一種生物功能之胺基酸序列。舉例而言，FST之功能變體保留參考FST蛋白之至少一種生物活性，例如結合及抑制活化素A及B。
如本文中所使用，術語「序列一致性」或「一致性」係指在兩個多核苷酸或多肽序列之比對中匹配位置(相同核酸或胺基酸殘基)之數量。藉由比較比對時之序列來確定序列一致性以最大化重疊及一致性且同時最小化序列間隙。特定而言，端視兩個序列之長度，可使用諸多數學整體或局部比對演算法中之任一者來確定序列一致性。用於確定核酸或胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以業內熟知之各種方式來達成，例如使用可在網際網路網頁(例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上獲得之可公開獲得之電腦軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。出於本文目的，核酸或胺基酸序列一致性%值係指使用成對序列比對程式EMBOSS Needle生成之值，該程式使用Needleman-Wunsch演算法創建兩個序列之最佳整體比對，其中將所有搜尋參數設定為預設值，亦即評分矩陣= BLOSUM62，空位開放= 10，空位擴展= 0.5，末端空位罰分=假，末端空位開放= 10及末端空位擴展= 0.5。
在本說明書通篇中，術語「經分離」意指，抗體、抗原結合片段、多肽或多核苷酸視情形可存在於不同於其可在自然界中所存在者之物理環境中。術語「經分離」核酸係指自其天然環境分離或以合成方式產生之核酸分子。經分離核酸可包括合成DNA (例如藉由化學處理產生)、cDNA、基因體DNA或其任何組合。
術語「核酸」及「多核苷酸」或「核苷酸序列」可互換使用且係指由單體核苷酸構成或包括其之任何分子。核酸可為寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可為DNA或RNA。
如本文所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包含呈自複製核酸結構之載體以及納入引入其之宿主細胞基因體中的載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文中所使用，術語「醫藥上可接受」意指由管理機構或公認藥典(例如歐洲藥典(European Pharmacopeia))批準用於動物及/或人類中。術語「賦形劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑、載劑及/或媒劑。
術語「治療有效量」係指在投與受試者以用於治療疾病時足以達成該疾病治療之量。
如本文中所使用，術語「治療(treatment、treating)」及諸如此類係指獲得期望藥理學及/或生理學效應。效應可在完全或部分地預防其疾病或症狀方面具有預防性及/或可在部分或完全治癒該疾病及/或歸因於該疾病之不良效應方面具有治療性。治療由此涵蓋哺乳動物、尤其人類中之任何疾病治療，且包含：(a)預防疾病發生於可易患疾病但尚未診斷為患有疾病之受試者(亦即人類)；(b)抑制疾病，亦即阻止其發生；及(c)減輕疾病，亦即使疾病消退。
現將針對特定非限制性態樣及其實施例並參照某些圖及實例來闡述本發明。
本發明藉由提供納入抗原結合抗體部分(例如抗原結合部分)之新濾泡抑素融合蛋白來解決經改良濾泡抑素肽及融合蛋白之需要，該等融合蛋白較易於表現於活體外且在活體內具有改良之半衰期或其他有益效應。
本發明係基於發明者之以下吃驚發現：與先前已知之包括Fc部分之基於濾泡抑素之融合蛋白相比，納入抗原結合部分之基於濾泡抑素之融合蛋白展現優良蛋白質表現及較高單體級分產率。特定而言，本發明融合蛋白所展示之表現含量係FST-Fc融合蛋白之至少1.5倍。本發明融合蛋白不僅具有高於FST-Fc融合蛋白之相對表現，且亦其達成極高之單體級分(亦即正確摺疊之可用融合蛋白)產率(至少1.5倍於FST-Fc融合體)。
本發明之主要目標/態樣係包括以下各項或由其組成之融合蛋白：a.濾泡抑素部分、b.抗體部分及視情況c.位於濾泡抑素部分與抗體部分之間之連接體。
在整個本發明中，濾泡抑素部分包括或係天然濾泡抑素蛋白。其較佳係其成熟形式，亦即缺乏N-分泌信號序列，因僅需要此序列來自細胞產生/分泌。或者，其係其功能片段。該濾泡抑素部分係例如 FST288蛋白(SEQ ID NO.2)或FST315蛋白(SEQ ID NO.1)。亦可使用其任何中間體形式，例如包括SEQ ID NO.1 - 4中任一者之289至314個殘基之任何濾泡抑素部分，只要其具有功能性，亦即其保留FST之至少一種生物活性。儘管不限制，但較佳地濾泡抑素部分之任何中間體形式始於SEQ ID NO:1之殘基1。作為非限制性實例，功能性FST片段可為FST291 (亦即包括SEQ ID NO.1之殘基1至291)或FST303 (亦即包括SEQ ID NO.1之殘基1至303)。在另一替代情形下，本發明之濾泡抑素部分(亦即其天然或功能片段)係功能變體，例如其可具有一或多種突變，例如在肝素結合位點(HBS)中之突變。作為非限制性實例，一或多個突變位點可選自相對於SEQ ID NO:1編號之K76、K81及/或K82 (作為實例可參見序列22及25)。一或多種突變可包括丙胺酸(A)代替離胺酸(K) (產生選自K76A、K81A及/或K82A之突變)。作為另一非限制性實例，可使用肝素結合突變體(「HBM」，在本文中替代地稱為「(HBM)」或「HBSM」)，例如FST288HBM (SEQ ID NO:4)、FST291HBM、FST303HBM或FST315HBM (SEQ ID NO:3)，其中該突變體包括三重突變K76A、K81A及K82A。
特定地，本發明融合蛋白包括濾泡抑素部分，該濾泡抑素部分：a)包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或由其組成，b)包括SEQ ID NO.1 - 4中任一者之289至314個殘基或由其組成，或c)包括與SEQ ID NO.1 - 4中任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。
不期望受限於任何理論，本發明者假設，本發明融合蛋白較野生型濾泡抑素在活體內展現較大穩定性及/或效能，因為本發明融合蛋白中之抗體部分能夠結合例如至個體中之游離HSA，由此延長該融合蛋白之半衰期。
因此，在整個本發明中，抗體部分較佳地結合白蛋白，且較佳地結合血清白蛋白(SA)，例如小鼠、大鼠、食蟹獼猴(cyno)或人類SA。更佳地，抗體部分結合人類HSA。該抗體部分可為嵌合、人類化或人類抗體部分。較佳地，本發明融合蛋白之抗體部分係抗體之抗原結合片段(在本文中替代地稱為抗原結合部分)。較佳地，該抗原結合部分係選自Fab、Fab’或F(ab’)2。在一替代情形下，本發明融合蛋白之抗體部分係選自Fab、Fab’或F(ab’)2且包括能夠結合蛋白質A之人類VH3域。
在一個實施例中，本發明融合蛋白之抗體部分包括：輕鏈可變區，其包括含有SEQ ID NO:13之CDR-L1、含有SEQ ID NO:14之CDR-L2及含有SEQ ID NO:15之CDR-L3；及重鏈可變區，其包括含有SEQ ID NO:16之CDR-H1、含有SEQ ID NO:17之CDR-H2及/或含有SEQ ID NO:18之CDR-H3。
在一替代實施例中，本發明融合蛋白之抗體部分包括：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列或由其組成；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列或由其組成。
SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6代表稱為「CA645」之抗白蛋白抗體之重及輕可變鏈(如WO2013/068571中所揭示)。如下文實例中所證實，本發明者已令人吃驚地發現，分別包括SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6之重及輕可變鏈之FST-Fab融合蛋白較易於產生及純化。
在整個本發明之上下文中，融合蛋白視情況在濾泡抑素部分與抗體部分之間包括連接體。在連接體存在時，作為非限制性實例，其可選自由以下組成之群：SGGGGS (SEQ ID NO:7)、SGGGGSSGGGGS (SEQ ID NO:19)、GGGGS (SEQ ID NO:20)及GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:21)。
應理解，在產生融合蛋白時，存在使任何部分彼此融合之以下兩種選擇：C末端融合或N末端融合。如下文實例中所展示，本發明者已令人吃驚地發現，與任何其他類型之融合(例如使抗體部分融合至濾泡抑素部分之N末端部分)相比，在濾泡抑素部分之C末端中融合抗體部分可進一步改良所得融合蛋白之表現。特定而言，與基於Fc之已知濾泡抑素融合蛋白相比，本發明之C末端融合蛋白(亦即抗體部分直接或經由連接體融合於濾泡抑素之C末端中)展現優良表現及較高單體蛋白產率。然而，儘管C末端融合蛋白會達成最高表現含量，但熟習此項技術者可考慮融合至濾泡抑素之N末端之抗體部分，此乃因其(例如)達成之表現含量為基於Fc之濾泡抑素融合蛋白之約1.5倍。
類似地，應理解，當在一個多肽(在本文中係FST部分)與抗體部分(在本文中較佳係Fab、Fab’或F(ab’)2)之間產生融合蛋白時，存在使任何部分彼此融合之以下兩種選擇：使多肽(在本文中係FST)融合至抗體部分之重鏈或融合至抗體部分之輕鏈。
因此，在本發明融合蛋白之一較佳實施例中，抗體部分連結至濾泡抑素部分之C末端部分。若連接體存在，則抗體部分較佳地經由連接體連結(或偶聯)至濾泡抑素部分之C末端部分(換言之，抗體部分連結(或偶聯)至濾泡抑素部分之C末端部分，且在兩個部分之間存在連接體)。在一實例中，融合蛋白包括(自N末端至C末端)濾泡抑素部分、連接至濾泡抑素部分之C末端之連接體及然後抗體部分中連接至連接體之游離末端(通常係連接體之C末端)之重鏈。
在一些具體(但不限制)實例中，本發明融合蛋白包括以下各項或由其組成：
(a) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(b) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(c) i.由SEQ ID NO:3或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(d) i.由SEQ ID NO:4或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(e) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(f) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(g) i.由SEQ ID NO:3 (FST315HBM)或SEQ ID NO:22或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(h) i.由SEQ ID NO:4 (FST288HBM)或SEQ ID NO:25或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(i) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；
(j) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈；或
(k) (a)至(i)中之任一者之功能變體或片段。
或者，若較佳地使用N末端融合，則本發明提供i.由SEQ ID NO.1 - 4中之任一者或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之濾泡抑素部分；ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315多肽之N末端；及iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；及視情況濾泡抑素部分與Fab重鏈之間之連接體。在一些具體實例中，融合蛋白可由SEQ ID NO:28、29、30或31或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列以及由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈來定義。
已證實，整個本發明融合蛋白之表現含量係野生型FST或FST-Fc融合蛋白之表現含量之至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或更高。亦證實，其達成之單體蛋白總產率係FST-Fc融合體之單體蛋白總產率之至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少6倍。
在進行該對比時，較佳地進行同類比較，舉例而言，FST315-Fab融合蛋白應與FST315-Fc融合蛋白進行比較；及/或FST288-Fab融合蛋白應與FST288-Fc融合蛋白進行比較。
另外，如實例中所突出顯示，其在血清中之存在時間段長於野生型FST (本發明融合蛋白為6天或更長，與之相比野生型FST為1天)。
在另一態樣中，本發明提供編碼整個本發明融合蛋白之經分離多核苷酸或其功能變體或片段。本發明之經分離多核苷酸可包括合成DNA (例如藉由化學處理產生)、cDNA、基因體DNA或其任何組合。
因此，本文中提供編碼整個本發明融合蛋白之經分離多核苷酸，其中融合蛋白包括濾泡抑素(FST)部分、抗體部分及視情況位於濾泡抑素部分與抗體部分之間之連接體。熟習此項技術者應理解，該(等)多核苷酸序列進一步包括編碼N末端分泌信號序列之核酸序列。尤其端視表現融合蛋白之宿主細胞來選擇該序列。
分子生物之標準技術可用於製備編碼本發明融合蛋白之DNA序列。期望DNA序列可完全或部分使用寡核苷酸合成技術合成。若適當，可使用定點誘變及聚合酶鏈式反應(PCR)技術。 應理解，需要至少兩個經分離多核苷酸來編碼本發明融合蛋白。實際上，至少一個經分離多核苷酸編碼FST部分、融合至FST部分之抗體部分及其間之可選連接體，且另一經分離多核苷酸編碼補充融合至FST部分者之剩餘抗體部分。作為一非限制性實例，一個多核苷酸編碼FST部分、連接體及抗HSA-Fab部分之重鏈且一個多核苷酸編碼抗HSA-Fab部分之輕鏈。
在一些具體(但不限制)實例中，編碼本發明融合蛋白之經分離多核苷酸包括以下各項或由其組成：
(a) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(b) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(c) i.由SEQ ID NO:3或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(d) i.由SEQ ID NO:4或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288HBM多肽；
ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST288HBM多肽之C末端；及
iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(e) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(f) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(g) i.由SEQ ID NO:3 (FST315HBM)或SEQ ID NO:22或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST315多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(h) i.由SEQ ID NO:4 (FST288HBM)或SEQ ID NO:25或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽變體；
ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至FST288多肽變體之C末端；
iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至連接體之游離末端；及
iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；
(i) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；
(j) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈；或
(k) (a)至(i)中之任一者之功能變體或片段。
或者，若較佳地使用N末端融合，則本發明提供編碼融合蛋白之多核苷酸序列，該融合蛋白包括以下各項或由其組成：i.由SEQ ID NO.1 - 4中之任一者或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之濾泡抑素部分；ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至FST315多肽之N末端；及iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈；及視情況濾泡抑素部分與Fab重鏈之間之連接體。在一些具體實例中，本發明提供編碼融合蛋白之多核苷酸序列，該融合蛋白由SEQ ID NO:28、29、30或31或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列以及由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈來定義。
在一些具體(但不限制)實例中，經分離多核苷酸包括以下各項或由其組成：(i)編碼濾泡抑素部分之SEQ ID NO:36、37、38、39、57或58或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；(ii)編碼抗體部分之重鏈CDR之SEQ ID NO:48、49及50或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；(iii)編碼抗體部分之輕鏈CDR之SEQ ID NO:51、52及53及(iv)編碼連接體(假設連接體存在)之SEQ ID NO:42、54、55或56。
在其他具體(但不限制)實例中，經分離多核苷酸包括以下各項或由其組成：(i)編碼濾泡抑素部分之SEQ ID NO:36、37、38、39、57或58或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；(ii)編碼抗體部分之重鏈之SEQ ID NO:40或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；(iii)編碼抗體部分之輕鏈之SEQ ID NO:41或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；及(iv)編碼連接體(假設連接體存在)之SEQ ID NO:42、54、55或56。
在其他具體(但不限制)實例中，經分離多核苷酸包括以下各項或由其組成：(i)編碼融合至FST部分之Fab重鏈部分及其間之可選連接體之SEQ ID NO:43、44、45、46、59、60、61、62、63、64、65或66或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列；及(i)編碼Fab輕鏈之SEQ ID NO:41。
在一相關態樣中，本發明提供包括編碼整個本發明融合蛋白之多核苷酸之選殖或表現載體。應理解，熟習此項技術者可選擇雙基因載體(包括兩個表現盒，一個表現盒編碼FST部分、融合至FST部分之抗體部分及其間之可選連接體，且另一表現盒編碼剩餘抗體部分)或兩個不同載體(一個載體編碼FST部分、融合至FST部分之抗體部分及其間之可選連接體且另一載體編碼剩餘抗體部分)。
可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者所熟知。為此，可參照(例如) 「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編輯), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing製作之Maniatis手冊。
在一相關態樣中，本發明提供宿主細胞，其包括編碼本發明融合蛋白之多核苷酸序列或包括一或多種編碼本發明融合蛋白之多核苷酸之選殖或表現載體。
任何適宜宿主細胞/載體系統可用於編碼本發明融合蛋白之多核苷酸序列的表現。可使用細菌(例如大腸桿菌(
E. coli))及其他微生物系統或亦可使用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表現系統。適宜哺乳動物宿主細胞包含CHO、骨髓瘤或雜交瘤細胞。在一實施例中，宿主細胞包括(例如已經其轉變)：(1)包括兩個表現盒之載體，一個表現盒編碼FST部分、融合至FST部分之抗體部分及其間之可選連接體且另一表現盒編碼剩餘抗體部分；或(2)第一載體，其包括編碼包括FST部分、融合至FST部分之抗體部分及其間之可選連接體或由其組成之胺基酸序列之核酸；及第二載體，其包括編碼包括剩餘抗體部分或由其組成之胺基酸序列之核酸。
用於選殖或表現編碼融合蛋白之載體的適宜宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需醣基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見Charlton, Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ, 2003, pp. 245-254，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦可為用於編碼融合蛋白之載體之適宜選殖或表現宿主，包含醣基化途徑已「人類化」從而產生具有部分或完全人類醣基化模式之抗體的真菌及酵母菌菌株(參見Gerngross等人，2004；Li等人，2006)。或者，可在本發明中使用適宜類型之哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO細胞)，包含CHO-S、CHO-K1細胞、dhfr- CHO細胞，例如可與DHFR可選標記物一起使用之CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞或可與麩醯胺酸合成酶可選標記物一起使用之CHO-K1細胞或CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包含淋巴球性細胞系，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。可使用本發明之經分離多核苷酸序列或表現載體來穩定轉變或轉染宿主細胞。
在一相關態樣中，本發明提供一種產生本發明融合蛋白之製程，其包括本發明之宿主細胞在用於產生該融合蛋白之適宜條件下培養。本發明製程可進一步包括回收包括融合蛋白之細胞培養液(CCF)之步驟(收穫步驟)，換言之收穫融合蛋白之步驟。在收穫後，可例如使用蛋白質A層析及其他層析/過濾步驟來純化融合蛋白。該等製程進一步視情況包括將經純化融合蛋白調配成例如具有蛋白質濃度諸如濃度10 mg/ml或更高、例如50 mg/ml或更高之調配物之步驟。無任何限制地，調配物可為液體調配物、凍乾調配物或噴霧乾燥調配物。在所有該等步驟中，可使用標準製程。
在另一態樣中，本發明提供一種純化本發明融合蛋白之製程，其包括：
i. 將包括本發明融合蛋白之經淨化細胞培養液加載於預先經緩衝液平衡之蛋白質A層析管柱上，使融合蛋白結合至管柱，
ii. 使用與步驟i.之平衡緩衝液相同之洗滌緩衝液洗層析管柱，以去除雜質，
iii. 使用洗脫緩衝液在鹼性條件下洗脫結合至管柱之融合蛋白，
iv. 使用酸性洗脫緩衝液進一步洗脫任何剩餘結合之融合蛋白，
v. 中和來自步驟iii.及iv.之洗脫液，以獲得經中和試樣，
vi. 將該等經中和試樣遞送至其他純化步驟以獲得經純化融合蛋白。
在一個非限制性實例中，步驟i.及ii.之平衡/洗滌緩衝液係乙酸鈉緩衝液，濃度為或約為30mM至或至約70mM (例如約30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或70 mM)且pH介於約5.5至約6.5之間(例如pH為或約為5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5)。在另一非限制性實例中，步驟iii.之洗脫緩衝液係基於甘胺酸之緩衝液(例如甘胺酸/NaOH緩衝液)，濃度為或約為30mM至或至約70mM (例如約30、35、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65或70 mM)且pH介於約8.0至約9.0之間(例如pH為或約為8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0)。在又一非限制性實例中，步驟iv.之酸性洗脫緩衝液係檸檬酸鹽緩衝液，濃度為或約為50mM至或至約200mM (例如約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mM)且pH介於約1.5至約2.5之間(例如pH為或約為1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5)。在另一非限制性實例中，步驟v.之中和係在介於7.0與9.0之間(例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0)之pH實施。通常使用Tris或Tris/HCl實施中和。本發明者發現，本發明融合蛋白不僅結合至蛋白質A，且亦能夠在鹼性條件下洗脫。與之相比，游離Fab在鹼性條件下保持緊密結合至蛋白質A。此特徵提供關於下游製程之若干潛在優點。首先，藉由不使用酸性洗脫條件，可避免共洗脫游離Fab，因Fab保持緊密結合至蛋白質A。另外，FST-Fab不長時間暴露於強酸性pH。最後，鹼性洗脫與後續層析步驟相容，意味減少試樣操縱且由此可增加產率及回收率。
作為一具體(但不限制)實例，本文提供產生融合蛋白之製程，該融合蛋白包括經由可選SGGGGS連接體在C末端與Fab重鏈(VH-CH1)之N末端連接之濾泡抑素部分(例如FST315、FST315HBM、FST288或FST288HBM)。共表現FST-Fab重鏈與Fab輕鏈(LC)且藉由分子間二硫鍵連結重鏈及輕鏈。
在又一態樣中，本發明提供包括整個本發明融合蛋白及一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。通常藉由混合具有期望純度之活性成分(在本文中係本發明融合蛋白)與一或多種可選醫藥上可接受之載劑以乾燥調配物或水溶液形式來製備醫藥組合物。
可使用任何適宜之醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑來製備醫藥組合物(例如參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編者) Mack Publishing Company，1997年4月)。通常，醫藥組合物無菌且在製造及儲存條件下穩定。醫藥組合物可調配為溶液(例如鹽水、右旋糖溶液或緩衝溶液或其他醫藥上可接受之無菌流體)、微乳液、脂質體或其他適於容納高產物濃度之有序結構(例如微顆粒或奈米顆粒)。載劑可包含(但不限於)緩衝劑；抗氧化劑；防腐劑；親水性聚合物；胺基酸；單醣、二醣及其他碳水化合物；螯合劑；成鹽相對離子；及/或非離子表面活性劑。
較佳地，將該醫藥組合物調配為溶液，更佳地調配為視情況經緩衝之溶液。亦可將補充活性化合物納入本發明之醫藥組合物中。在一實施例中，醫藥組合物係適用於靜脈內或皮下投與之組合物。該等醫藥組合物係僅實例性的且並不限制適用於其他投與途徑之醫藥組合物。本文所述之醫藥組合物可包裝成單一單位劑型或呈多劑型形式。
本發明之融合蛋白或醫藥組合物可使用業內已知之多種方法中之一或多者藉由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應視所期望結果而變化。用於本發明之融合蛋白或醫藥組合物之投與途徑之實例包含靜脈內、肌內、真皮內、眼內、腹膜腔內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑(例如藉由注射或輸注)。或者，本發明之融合蛋白或醫藥組合物可經由經腸途徑(例如局部、表皮或黏膜投與途徑)投與。若產物用於注射或輸注，則其可採用油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式且其可含有其他試劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，本發明之融合蛋白或醫藥調配物可以乾燥形式提供，且在與適當無菌液體一起使用之前重構。亦可製備適於在注射之前在液體媒劑中製成溶液或懸浮液之固體形式。
在調配後，本發明之融合蛋白或醫藥調配物可直接投與受試者。
在另一態樣中，本文提供用於療法中之本發明之融合蛋白或醫藥組合物。或者，本文提供治療需要治療之受試者之方法，該方法包括投與治療有效量之本發明之融合蛋白或醫藥組合物。在另一替代態樣中，本發明提供本發明之融合蛋白或醫藥組合物之用途，其用以製造用於療法中之藥劑。
「治療有效量」將端視蛋白質或其活性片段、疾病及其嚴重程度以及擬治療受試者之年齡、體重等有所變化。
在整個本發明之上下文中，「受試者」通常係指哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)家養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。更佳地，受試者係人類。
應注意，上文所提及之實施例圖解說明而非限制本發明，且熟習此項技術者將能夠在不背離本發明及尤其申請專利範圍之範圍之情況下設計諸多替代實施例。
胺基酸序列之闡述
*SEQ ID No 22-31 中之 X 代表 「 任何胺基酸 」
| 名稱 | 序列 | SEQ ID NO |
| FST315 - 成熟形式 | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW | 1 |
| FST288 - 成熟形式 ( 亦即缺乏N末端分泌 信號肽 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN | 2 |
| FST315HBM - 成熟形式 | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW | 3 |
| FST288HBM - 成熟形式 | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN | 4 |
| Fab 重鏈 (FabHC) | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 5 |
| Fab 輕鏈 (FabLC) | DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQK PGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 6 |
| 實例性連接體 | SGGGGS | 7 |
| FST315HBM-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 8 |
| FST315HBM-FabHC ( 無連接體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 9 |
| FST288HBM-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC | 10 |
| FST288HBM-FabHC ( 無連接體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKACRMNAANKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC | 11 |
| N 末端分泌信號序列 / 肽 | MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA | 12 |
| 輕鏈 CDR1 | QSSPSVWSNFLS | 13 |
| 輕鏈 CDR2 | EASKLTS | 14 |
| 輕鏈 CDR3 | GGGYSSISDTT | 15 |
| 重鏈 CDR1 | GIDLSNYAIN | 16 |
| 重鏈 CDR2 | IIWASGTTFYATWAKG | 17 |
| 重鏈 CDR3 | TVPGYSTAPYFDL | 18 |
| 替代實例性連接體 | SGGGGSSGGGGS | 19 |
| 替代實例性連接體 | GGGGS | 20 |
| 替代實例性連接體 | GGGGSGGGGS | 21 |
| FST315( 變體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW | 22 |
| FST288( 變體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN | 23 |
| FST315( 變體 )-FabHC | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 24 |
| FST315( 變體 )-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 25 |
| FST288( 變體 )-FabHC | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 26 |
| FST288( 變體 )-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 27 |
| FabHC-FST315( 變體 ) | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW | 28 |
| FabHC-FST315( 變體 )- ( 連接體加下劃線 ) | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC SGGGGSGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW | 29 |
| FabHC-FST288( 變體 ) | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN | 30 |
| FabHC-FST288( 變體 )- ( 連接體加下劃線 ) | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC SGGGGSGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKXCRMNXXNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN | 31 |
| FST315-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 32 |
| FST315-FabHC ( 無連接體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 33 |
| FST288-FabHC ( 連接體加下劃線 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN SGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 34 |
| FST288-FabHC ( 無連接體 ) | GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 35 |
實例 材料及方法 濾泡抑素 -Fab 融合蛋白之產生 選殖策略 ：藉由PCR或基因合成來生成對應於濾泡抑素及抗白蛋白抗體(稱為645 Fab)重或輕鏈序列(其間具有或不具有連接體序列)之融合體之DNA區段並使用內部哺乳動物表現載體選殖。亦使用內部哺乳動物表現載體單獨選殖645 Fab之重鏈及輕鏈序列。藉由直接定序使用覆蓋整個開放閱讀框之引子來證實所有表現載體。
CHO 細胞培養 ：將CHOS-XE細胞(Cain等人，2013)之懸浮液預適應於補充有2mM Glutamax之CD CHO培養基(Invitrogen)中。使細胞保持於對數生長期中並以120 RPM在振盪培育器(Kuhner AG)上攪動，且在37℃下於含有8% CO
2之氣氛中培養。
蛋白質表現 ：藉由瞬時轉染CHO-XE細胞系來過度表現濾泡抑素-Fab蛋白。共轉染表現質體對(例如N-fab輕鏈-FST-C與重鏈或FST-C fab重鏈-C與輕鏈)。在即將使用DNA轉染之前，藉由在1500 x g下短暫離心細胞並再懸浮糰粒來將CHO細胞交換至Expi CHO表現培養基(Gibco)中。然後遵循製造商說明書使用ExpiFectamine (Gibco)來轉染細胞。使培養物在37℃下生長前24小時且然後下32℃下生成表現週期之其餘時間，並在190 RPM下於含有8% CO
2之氣氛中振盪。通常在轉染後9-14天藉由在4000 x g下離心且隨後使用0.22µm膜過濾來收穫上清液。藉由蛋白質G-HPLC及藉由SDS PAGE來測定最終蛋白質表現含量。
蛋白質純化 ：使用運行於標準條件下之Mab Select管柱(GE Healthcare)捕獲經瞬時表現之蛋白質內容物。簡言之，使用10管柱體積之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS, pH 7.4)洗滌樹脂，且使用5管柱體積之0.1M檸檬酸鈉(pH 3.1)洗脫結合蛋白(除非在下列實例中另外提及)。使用pH 8.5 TRIS-HCl中和洗脫液並經由運行於標準條件下之0.22µm膜篩析層析(HiLoad 26/60 Superdex 75管柱，GE Healthcare) (此處，使用pH 7.4 PBS作為運行緩衝液來預加載管柱)無菌過濾。使用280 nm下之吸光度、BEH2000分析型UPLC及SDSPAGE(在還原及非還原條件下)評價試樣品質。
對於蛋白質G純化而言，將經淨化上清液加載於平衡於pH 7.4 PBS中之蛋白質G HP (GE Healthcare)管柱上且隨後使用相同緩衝液洗滌。使用0.1M甘胺酸-HCl (pH 3.0)洗脫結合材料。使用2M Tris/HCl (pH8.5)中和酸性洗脫液。藉由280nm下之吸光度量化經純化材料。
粒徑篩析層析 (SEC) ：將試樣注於BEH200 (200Å, 1.7µm, 4.6mm ID x 300mm管柱(Aquity))上並使用0.2M磷酸鹽(pH7)之等梯度梯度在0.35mL/min下展開，其中藉由280nm下之吸光度及多通道螢光(FLR)檢測器(Waters)進行檢測。
SDS-PAGE ：在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析中，藉由將4 x Novex NuPAGE LDS試樣緩衝液(Life Technologies)及100mM N-乙基馬來醯亞胺(Sigma-Aldrich)添加至經純化蛋白質中來製備試樣，且加熱至100℃並保持3min。將試樣加載於10孔Novex 4-20% Tris-甘胺酸1.0mm SDS-聚丙烯醯胺凝膠(Life Technologies)上並在225V之恆定電壓下於Tris-甘胺酸SDS運行緩衝液(Life Technologies)中分離40min。使用Novex Mark12寬範圍蛋白質標準(Life Technologies)作為標準。使用考馬斯迅速染色劑(Coomassie Quick Stain) (Generon)將凝膠染色並在蒸餾水中去色。
藥物動力學量測 ：經由靜脈內投與以10 mg/kg (2 mL/kg IV, 5 mL/kg SC)將FST蛋白投用至C57BL/6小鼠。在7天內每天獲取血樣。生成血清試樣並使用檢測濾泡抑素(包含FST288及FST315)之配體結合分析進行分析。基於個別數據使用Phoenix v8.3來計算藥物動力學參數。
功能活性報告基因細胞分析 ：為量測濾泡抑素蛋白阻斷SMAD2/3信號傳導路徑之刺激物(活化素A/B, GDF8/11)引發性活化之效能，使用HEK-Blue
TMTGFβ報告基因細胞(Invivogen)。簡言之，在培養基中基於濃度及預測活性來預稀釋濾泡抑素蛋白及其匹配對照，從而所得抑制曲線具有完整之頂部及底部。隨後以1:3在培養基中進行10點連續稀釋，然後將每一稀釋液之4個重複品以20µL/孔等分於384細胞培養分析板中。將10µl每一刺激物添加至代表濾泡抑素連續稀釋液之孔中以及不含濾泡抑素之孔(代表最高刺激物反應)中。含有匹配體積之培養基之孔代表未治療。將分析板在37℃下培育一小時，然後每孔添加HEK-Blue
TMTGFβ細胞(10,000個細胞/20µL)且將分析板在37℃下進一步培育17小時。將45µL/孔之QUANTI-Blue
TM溶液添加至新384-分析板(稱為目標板)中，然後使用自動化液體處理器將5µL來自分析板之細胞上清液轉移至目標板中。將目標板短暫保持於振盪器上，隨後在37℃下培育一小時。在630nm下於讀板儀上量測每一孔之吸光度值且結合Z因子來計算SMAD2/3活性之濾泡抑素介導之劑量依賴性抑制百分比。
Biacore 結合數據藉由表面電漿共振使用Biacore T200 (Cytiva)來測定融合蛋白與各種靶(參見下文)之結合動力學。對於每一類型之分析而言，使用1:1結合模型並使用Biacore T200評估軟體(3.0版)來測定動力學參數。
為評價與活化素A及活化素B (R&D Systems)之結合，首先經由胺偶合化學將山羊抗人類(ab’)
2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上直至大約5000RU之程度。使用標準多循環動力學方式，每一分析循環包括將FST-Fab捕獲至抗F(ab’)
2表面，隨後注入分析物，且最後使用50mM HCl及5mM NaOH之60s注入實施表面再生。使用於HBS-EP+運行緩衝液(Cytiva)中之3倍連續稀釋以30、10、3.3、1.1、0.367及0.122nM之濃度注入分析物(300s，在25℃下，以30µl/min之流速)，然後監測解離900s。扣除平行空白表面之結合反應，且包含緩衝液空白注入以扣除儀器雜訊及偏移。
為評價與GDF8及GDF11 (R&D Systems)之結合，藉由胺偶合化學將GDF8及GDF11中之每一者固定至CM5感測器晶片之表面以達成大約250RU之固定程度。對於GDF8及GDF11而言，使用單循環動力學方式實施分析，其中在25℃及30µl/min流速下於HBS-EP+運行緩衝液中以遞增濃度(0.8、4、20、100及500nM) (Cytiva)依序進行180s FST-Fab注入，隨後監測解離1800s。扣除平行空白表面之結合反應，且實施一系列緩衝液空白注入以扣除儀器雜訊及偏移。
為評價與白蛋白之結合，首先經由胺偶合化學將山羊抗人類(ab’)
2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上直至大約5000RU之程度。使用標準多循環動力學方式，每一分析循環包括將擬測試融合蛋白捕獲至抗F(ab’)
2表面，隨後注入白蛋白，且最後使用50mM HCl及5mM NaOH之60s注入實施表面再生。使用於HBS-EP+運行緩衝液(Cytiva)中之2倍連續稀釋以100、50、25、12.5、6.3及3.1nM之濃度注入分析物(300s，在25℃下，以30µl/min之流速)，然後監測解離900s。扣除平行空白表面之結合反應且包含緩衝液空白注入以扣除儀器雜訊及偏移。
實例 1.FST-Fab- 與其他融合配偶體相比會達成優良之表現含量及單體產率。比較與不同融合配偶體以不同定向融合之濾泡抑素部分之相對表現含量揭示，在FST部分之C末端融合之FST-Fab構築體最佳(圖2A)。使Fc或ScFv融合至FST之C末端顯著差於在此位置處使用Fab時，前者之表現產物皆減少3.5倍(圖2A)。在FST部分之N末端融合Fab部分導致表現產物之量下降約45%，但優於包括融合至Fc域之FST之融合蛋白。使用野生型HBM序列比較使用在濾泡抑素之C末端融合至Fab之FST288-或FST315對表現之效應的評價僅揭示微小差異(圖2B)。FST315形式之表現低於FST288體融合6%。含有HBSM (HBM)之融合體之對比揭示，表現含量與野生型相比具有7%之中等降低。
各種FST融合體之直接檢驗揭示，融合至FST部分之C末端之Fab部分與其他融合體相比可得到最高值之最終單體產率(圖2C)。FST-Fc融合體在該群組中之單體產率最低，其幾乎比FST-Fab融合體差6倍。在Fab之N末端融合之FST-ScFv及FST分別差大約3及4倍。
實例 2 - FST315(HBM)-Fab 與 FST315WT 相比在小鼠研究中顯示延長之藥物動力學性質以10mg/kg經靜脈內(IV)投與小鼠之FST315WT、FST288WT及FST288-Fab之清除極快，其中平均滯留時間(MRT)分別為1.6小時、2.3小時及5.2小時。與之相比，以10mg/kg經靜脈內投與小鼠之FST315-Fab、FST315(HBM)-Fab及FST288HBM-Fab顯示延長動力學，其中MRT分別為9.3小時、13.1小時及11小時(圖3A及B)。所有藥物動力學參數皆匯總於表1中。
結論：實例2展示，因FST部分與Fab部分之間融合，可大大延長含FST蛋白質之動力學及半衰期。對延長動力學之顯著貢獻亦歸因於濾泡抑素部分之HBM形式中肝素結合位點之突變。
實例 3 - FST315-Fab 、 FST315HBM-Fab 、 FST288-Fab 及 FST288HBM-Fab 對其配體及白蛋白顯示高親和力結合濾泡抑素具有以下4種高親和力配體-活化素A、活化素B、GDF8 (肌骨素)及GDF11。已使用表面血漿共振(SPR)結合方法來證實FST315-Fab、FST315HBM-Fab、FST288-Fab及FST288HBM-Fab與該等配體之結合且證實Kd結合親和力在如表2中所匯總之預期範圍內(文獻可參見Sidis等人，2006)。所有濾泡抑素融合蛋白對其特異性配體之所獲得親和力Kd值與針對野生型、未偶聯FST288WT及FST315WT結合活化素A所闡述之文獻值(分別為23.6pM及28.7pM)完全一致(Sidis等人，2006)。亦藉由SPR證實FST315(HBM)-Fab之Fab域組分之人類白蛋白結合性質且2602pM之值與活性白蛋白結合劑之預期值一致。FST315(HBM)-Fab白蛋白結合之Kd值亦與單獨Fab人類白蛋白結合之先前公開值極為一致(在Adams等人(2016)中引述為2-5nM；提及不同形式之645gL4gH5 Fab)。
結論：實例2強調，FST-Fab部分之預期生物活性得以維持，亦即，兩個部分之間之融合不影響濾泡抑素部分與其各別生物配體或Fab部分與白蛋白之結合活性。
實例 4 - FST315(HBM)-Fab 及 FST288(HBM)-Fab 在報告基因細胞分析中對其配體顯示功能抑制接下來，使用Smad2/3報告基因細胞分析(實施於HEK-Blue
TM-TGFβ商業細胞系中)測試FST315(HBM)-Fab抑制4種配體之功能信號傳導之能力。在大約EC50濃度下使用所有4種配體以誘導刺激報告基因活化，且然後在較大濃度範圍內滴定FST315(HBM)-Fab及FST315WT以生成圖4A中所表示之劑量-反應曲線。所有4種配體之幾何平均IC50數據匯總於表3中。據觀察，在使用配體活化素A及活化素B誘導反應時FST315(HBM)-Fab形式之功效始終為親代FST315WT之3倍，且在採用配體GDF8及GDF11時具有2倍功效。類似地，在較大濃度範圍內滴定FST288(HBM)-Fab及FST288WT以生成針對以其近似EC50濃度使用之所有4種配體之劑量-反應曲線；代表性數據呈現於圖4B中且所有4種配體之幾何平均IC50數據匯總於表3中。與FST315形式之數據不同，FST288(HBM)-Fab分子形式與FST288WT親代分子在所有4種配體中顯示極類似效能。
結論：實例展示，FST315(HBM)-Fab不僅抑制經由Smad2/3報告基因路徑之配體誘導性信號傳導之能力不差於FST315WT蛋白，且亦FST315(HBM)-Fab與FST315WT相比呈現改良功效，從而突出顯示了其在治療環境中之實用性。此與FST288(HBM)-Fab功效形成對比，後者與FST288WT分子極為相當。
實例 5 - 具有人類 VH3 域之 FST-Fab 融合體容許經由蛋白質 A 層析回收製備FST315HBM-Fab融合體(FST-Fab1)，其中FST融合至含有人類VH3域之抗白蛋白F(ab’) (SEQ ID NO. 8之融合蛋白)，此使得能夠實施蛋白質A層析。
製備不包括人類VH3域之兩種替代FST-F(ab’)構築體(FST-Fab2及FST-Fab3)。根據上述方法表現所有構築體並純化。如表4中所展示，在蛋白質A層析後僅回收到含有人類VH3域之FST-Fab1。在蛋白質G層析後能夠回收所有三種融合蛋白。
通常，在酸性條件下洗脫結合至蛋白質A親和捕獲樹脂之蛋白質(參見上文之材料及方法章節)。然而，發明者發現，本發明FST-Fab1在溫和鹼性條件下自蛋白質A有效洗脫，而Fab級分則保持緊密結合。
將FST-Fab 1淨化上清液加載於平衡於50mM乙酸鈉(pH5.8)中之MabSelect (GE Healthcare)管柱上且隨後使用相同緩衝液洗滌。在酸性(0.1M甘胺酸-HCl，pH2.6)或鹼性(50mM甘胺酸-NaOH，pH8.6)條件下洗脫結合材料。然後進行另外酸性剝離(0.1M檸檬酸鹽，pH2.0)。使用2M Tris/HCl (pH8.5)中和酸性洗脫液及剝離池。然後藉由SDS-PAGE及分析型粒徑篩析分析該等洗脫及剝離試樣。
結果展示於圖5中。SDS-PAGE分析展示，在酸性條件下(泳道2)洗脫時，在約50kDa下存在帶，此指示在該等條件下洗脫出在表現期間產生之任何Fab。含有後續剝離之泳道3不含蛋白質，此乃因其皆已藉由酸性洗脫去除。或者，在弱鹼性條件下(泳道4)，不存在Fab帶。Fab不自管柱洗脫直至酸性剝離(泳道5)，其中在約50kDa下存在如在酸性洗脫中可見之帶。
如圖6中所展示，粒徑篩析層析分析展示，僅酸性洗脫池(圖A)具有對應於Fab之峰(「F」)，其不存在於鹼性洗脫池中(圖B)。在酸性洗脫後之剝離中存在極少蛋白質(圖C)，此乃因所有蛋白質幾乎皆已藉由酸性洗脫所洗脫出，而鹼性洗脫後之剝離(圖D)含有對應於Fab之峰。
本發明FST-Fab融合蛋白在弱鹼性條件下自蛋白質A之有效洗脫係此分子之獨特性質。其呈現若干關於下游製程之潛在優點。首先，藉由不使用酸性洗脫條件，可避免Fab之共洗脫，此乃因Fab保持緊密結合至蛋白質A。另外，Fst-Fab並不長時間暴露於苛刻酸性pH。最後，鹼性洗脫與後續層析步驟相容，此意味著可減少試樣操縱且由此可增加產率及回收率。
實例 6 - 穩定細胞系之產生所有先前實例皆係使用瞬時表現之FST融合蛋白來實施(根據上文之材料及方法章節)，此實例著眼於獲得用以產生本發明FST融合蛋白之穩定細胞系。
宿主細胞系之轉染：使用DNA雙基因載體質體轉染CHO DG44 (dhfr-)宿主細胞以穩定表現人類FST315(HBM)-645 Fab分子(亦即編碼SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:6)及可選標記物二氫葉酸還原酶(DHFR)。在電穿孔之前將載體線性化。將細胞電穿孔且然後回收於溫度及CO2受控之靜態培育器中之宿主細胞生長培養基中保持24h，然後培養於選擇性培養基中。
回收總共167個微型池並培養於含有胺甲喋呤(methotrexate)之選擇性培養基中。基於抗體效價，在搖瓶培養物中評估70個微型池。基於10天批次之mAb效價，選擇排名居前之24個微型池在AMBR自動化微型生物反應器中進行評價。
選擇最佳之7個微型池(MP)進行單細胞選殖。離心來自每一MP之細胞，並將糰粒再懸浮於PBS中。然後藉由流式細胞術個別地分析每一MP細胞懸浮液。在單細胞選殖後，將基於最高抗體效價之排名居前之54種純系擴增至搖瓶中以供批次評價。
選擇12種高表現純系並以若干分批進料過程在AMBR微型生物反應器系統中使用無動物來源之化學界定培養基進行評估以評估純系細胞生長、抗體效價、比生產力及產物品質。
選擇主要純系，且使用先前確定之最佳分批進料過程在Wave生物反應器及5L搖瓶中實施生產運行。
展示在4種不同純系之兩種不同培養基及分批進料過程中所達成之總產物濃度(參見圖7)。此實例展示，若期望可改良產生本發明FST融合蛋白之產率，應考慮之一個態樣係擬用於其產生之培養基組(基礎培養基以及一或多種進料培養基)。如圖7中所展示，儘管純系156通常係在約1g/L下以小規模產生，但使用基礎培養基A與分批進料過程2 (FB2)之組合可與分批進料過程1 (FB1)相比使效價倍增。作為另一實例，純系51係在約1.2-1.3 g/L下在基礎培養基A (不論一或多種進料培養基如何)存在下產生，但該產量在使用基礎培養基B時降至1g/L以下。
表1 -實例2之藥物動力學參數
*未測定
表2 -實例3之Kd結合親和力(來自Biacore分析)
*不可用
表3 -實例4之IC50數據
表4 -實例5之不同構築體之親和層析後回收率。
**此表中之所有數據皆基於FST-Fab1之蛋白質G回收率結果(視為100%)進行正規化
| FST315 WT | FST315-Fab | FST315 HBM-Fab | FST288 WT | FST288-Fab | FST288 HBM-Fab | |
| CL (mL/h/kg) | 162 | 28.6 | 2.98 | 324 | 592 | 34.2 |
| V ss(L/kg) | 0.26 | 0.25 | 0.039 | 0.78 | ND* | 0.38 |
| T 1/2(h) | 4.0 | 16.3 | 23.1 | 3.7 | 7.8 | 27 |
| MRT 最後(h) | 1.6 | 9.3 | 13.1 | 2.3 | 5.2 | 11 |
| Biacore Kd 值 (pM) | |||||
| 配體 | 活化素 A | 活化素 B | GDF8 | GDF11 | 人類白蛋白 |
| FST315WT-Fab | 200 | 69 | 150 | NA* | NA* |
| FST315HBM-Fab | 11 | 11 | 2300 | 1250 | 2602 |
| FST288WT-Fab | 32 | 71 | 240 | NA* | NA* |
| FST288HBM-Fab | 42 | 50 | 170 | NA* | NA* |
| 濾泡抑素 部分 | 活化素 A | 活化素 B | GDF8/ 肌骨素 | GDF11 | ||||
| IC50 (nM) | 範圍(nM) | IC50 (nM) | 範圍(nM) | IC50 (nM) | 範圍(nM) | IC50 (nM) | 範圍(nM) | |
| FST315HBM-Fab (n=7) | 0.10 | 0.068-0.11 | 0.46 | 0.32-0.62 | 1.40 | 1.23-1.7 | 4.24 | 2.33-12.2 |
| FST315WT (n=4) | 0.31 | 0.26-0.37 | 1.57 | 0.92-2.16 | 3.08 | 1.8-3.93 | 8.37 | 5.44-18.1 |
| FST288HBM-Fab (n=4) | 0.14 | 0.13-0.14 | 0.50 | 0.3-1.17 | 0.45 | 0.32-0.5 | 0.65 | 0.51-0.84 |
| FST288WT (n=4) | 0.14 | 0.13-0.15 | 0.45 | 0.22-1.4 | 0.73 | 0.59-0.82 | 0.77 | 0.64-0.95 |
| 人類VH3域 | 親和層析後回收率(%) | ||
| 蛋白質A | 蛋白質G* | ||
| FST-Fab 1 | 是 | 80 | 100 |
| FST-Fab 2 | 否 | - | 91 |
| FST- Fab 3 | 否 | - | 108 |
參考文獻1. WO2015/187977
2. WO2017/152090
3. Sidis等人，(2005) Endocrinology 146(1):130-136
7. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
8. http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/
9. WO2013/068571
10. 「Current Protocols in Molecular Biology」 (1999) F. M. Ausubel (編輯)，Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing製作之Maniatis手冊
11. Charlton, Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ, 2003, pp. 245-254，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)
12. Gerngross等人，(2004), Nat. Biotech. 22:1409-1414
13. Li等人，(2006) Nat. Biotech. 24:210-215。
14. Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編者) Mack Publishing Company，1997年4月
15. Cain等人，(2013) Biotechnol Prog. 29(3):697-706。
16. Adams等人，(2016) MABS 8(7):1336-1346。
17. Sidis等人，(2006) Endocrinology 147(7):3586-3597
圖 1 ：圖解說明兩個成熟濾泡抑素部分(FST288及FST315；亦即其不含N末端分泌信號序列)之域組織及實例性FST288分子對如何與二硫化活化素連接之同源二聚體形成複合物之示意圖。FST288及FST 315共有4個之域，該等域包含N末端域、FSD1、FSD2及FSD3。FST315亦可結合活化素且具有額外C末端域(殘基289-315)。
圖 2 ：(A)藉由所收穫CHO上清液之蛋白質G HPLC分析來測定濾泡抑素融合蛋白之相對表現含量。相對於FST-Fc表現含量來正規化各值。N-Fab-FST =融合至FST之N末端部分之Fab抗體部分；FST-Fab-C =融合至FST之C末端部分之Fab抗體部分；FST-Fc =融合至FST之C末端部分之Fc抗體部分；FST-ScFv =融合至FST之C末端部分之ScFv抗體部分。(B)具有C末端融合配偶體之FST288、FST315、FSTWT及FST-HBM (或者稱為HBSM) (在圖中分別稱為288融合體、315融合體、WT融合體及HBSM融合體)之相對表現含量。將各值正規化至288融合體之表現。(C)單體之總表現值，相對於FST-Fc表現含量來正規化各值，n=25。圖例與圖2(A)相同。
圖 3 ：(A)經由IV投與途徑以10mg/kg投用至小鼠(n=3隻小鼠/組)之FST315WT、FST315-Fab及FST315HBM-Fab之藥物動力學特徵且監測血清試樣7天；(B)經由IV投與途徑以10mg/kg之投用至小鼠(n=3隻小鼠/組)之FST288WT、FST288-Fab及FST288HBM-Fab之藥物動力學特徵且監測血清試樣7天。源自研究之所有濾泡抑素部分之藥物動力學參數匯總於表1中。
圖 4 ：報告基因細胞分析中經4種主要FST配體-活化素A、活化素B、GDF8 (肌骨素)及GDF11中之任一者刺激之(A) FST315HBM-Fab及FST315WT、(B) FST288HBM-Fab及FST288WT之功能抑制效應。所有濾泡抑素融合蛋白皆劑量依賴性地抑制關於所有4種配體之信號，且代表圖展示4個FST部分針對不同配體之不同功效特徵，其中針對抑制百分比對FST濃度進行繪圖。實施該等實驗多次- FST315HBM-Fab (n=7)、FST315WT (n=4)、FST288HBM-Fab (n=4)及FST288WT (n=4)且所有數據皆匯總於表3中，其中數據呈現為4種配體之IC50及範圍(以nM表示)。
圖 5 ：蛋白質A洗脫及剝離池之SDS-PAGE分析，泳道(1)：分子量標記，泳道(2)：酸性洗脫池，泳道(3)：酸性洗脫後之酸性剝離，泳道(4)：鹼性洗脫池，泳道(5)：鹼性洗脫後之酸性剝離，(M) =全長Fst-Fab單體，(F) = Fab。
圖 6 ：分析型粒徑篩析。(A)：酸性洗脫池，(B)：鹼性洗脫池，(C)：酸性洗脫後之酸性剝離，(D)：鹼性洗脫後之酸性剝離，(M) =全長Fst-Fab單體且(F) = Fab。
圖 7 ：展示分批進料過程中所評價之4種細胞純系之相對表現含量(g/L)之直方圖。在兩種不同培養基(培養基A及B)及兩種不同補料條件(FB1及FB2)中評價純系。藉由CH1 HPLC測定總蛋白質濃度。
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Claims (16)
- 一種融合蛋白，其包括以下或由以下組成： a. 濾泡抑素部分， b. 抗體部分，及視情況 c. 連接體，位於該濾泡抑素部分與該抗體部分之間。
- 如請求項1之融合蛋白，其中該濾泡抑素部分包括或係天然蛋白質、其功能片段及/或其功能變體。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該濾泡抑素部分包括以下或由以下組成： a. SEQ ID NO:1 b. SEQ ID NO:2 c. SEQ ID NO:3 d. SEQ ID NO:4 e.包括含有SEQ ID NO.1 - 4中任一者中289至314個殘基之胺基酸殘基之任何蛋白質；或 f.與SEQ ID NO.1 - 4中任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該抗體部分結合白蛋白。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該抗體部分係嵌合、人類化或人類抗體部分。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該抗體部分係： a)選自Fab、Fab’或F(ab’)2之抗原結合部分或 b)選自Fab、Fab’或F(ab’)2且進一步包括能夠結合蛋白質A之人類VH3域之抗原結合部分。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該抗體部分包括以下或由以下組成： a.輕鏈可變區，其包括至少一個選自以下之CDR：包括SEQ ID NO:13之CDR-L1、包括SEQ ID NO:14之CDR-L2及/或包括SEQ ID NO:15之CDR-L3；及重鏈可變區，其包括至少一個選自以下之CDR：包括SEQ ID NO:16之CDR-H1、包括SEQ ID NO:17之CDR-H2及/或包括SEQ ID NO:18之CDR-H3；或 b.重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列或由其組成；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列或由其組成。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包括連接體在該濾泡抑素部分與該抗體部分之間且其中該連接體係選自由以下組成之群：SGGGGS (SEQ ID NO:7)、SGGGGSSGGGGS (SEQ ID NO:19)、GGGGS (SEQ ID NO:20)及GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:21)。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中： a)該抗體部分連結至該濾泡抑素部分之C端部分，或 b)若連接體存在，則該抗體部分藉由該連接體連結至該濾泡抑素部分之C端部分。
- 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包括以下或由以下組成： (a) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽； ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該FST315多肽之C端；及 iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (b) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽； ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該FST288多肽之C端；及 iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (c) i.由SEQ ID NO:3或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315HBM多肽； ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該FST315HBM多肽之C端；及 iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (d) i.由SEQ ID NO:4或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288HBM多肽； ii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該FST288HBM多肽之C端；及 iii.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (e) i.由SEQ ID NO:1或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽； ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至該FST315多肽之C端； iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該連接體之游離末端；及 iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (f) i.由SEQ ID NO:2或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽； ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至該FST288多肽之C端； iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該連接體之游離末端；及 iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (g) i.由SEQ ID NO:3 (FST315HBM)或SEQ ID NO:22或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST315多肽變體； ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至該FST315多肽變體之C端； iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該連接體之游離末端；及 iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (h) i.由SEQ ID NO:4 (FST288HBM)或SEQ ID NO:25或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之FST288多肽變體； ii.由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21定義之連接體，其偶聯至該FST288多肽變體之C端； iii.由SEQ ID NO:5或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab重鏈，其偶聯至該連接體之游離末端；及 iv.由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (i) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列，及由SEQ ID NO:6或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列定義之Fab輕鏈； (j) SEQ ID NO:8、9、10、11、24、25、26、27、32、33、34或35及由SEQ ID NO:6定義之Fab輕鏈；或 (k) (a)至(j)中之任一者之功能變體或片段。
- 一種經分離之多核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項之融合蛋白。
- 一種選殖或表現載體，其包括一或多個如請求項11之多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包括： a.一或多個如請求項11之多核苷酸，或 b.一或多個如請求項12之表現載體。
- 一種產生如請求項1至10中任一項之融合蛋白之方法，其包括如請求項13之宿主細胞在用於產生該融合蛋白之適宜條件下培養及分離該融合蛋白。
- 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至10中任一項之融合蛋白及一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
- 如請求項1至10中任一項之融合蛋白或如請求項15之醫藥組合物，其用於療法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2856216C (en) | 2011-11-11 | 2021-01-12 | Ucb Pharma S.A. | Albumin binding antibodies and binding fragments thereof |
| BR112016004355A2 (pt) * | 2013-08-30 | 2017-10-17 | Aprilbio Co Ltd | constructo de fusão de parte efetora de fab anti-soroalbumina e método de preparação do mesmo |
| MA51075A (fr) | 2014-06-04 | 2020-10-14 | Acceleron Pharma Inc | Procédés et compositions pour traiter des troubles à l'aide de polypeptides de follistatine |
| WO2016154601A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Acceleron Pharma Inc. | Follistatin-related fusion proteins and uses thereof |
| JP2019509735A (ja) | 2016-03-04 | 2019-04-11 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療における組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質及び使用 |
| GB201811368D0 (en) * | 2018-07-11 | 2018-08-29 | Ucb Biopharma Sprl | Antibody |
-
2023
- 2023-06-14 WO PCT/EP2023/065930 patent/WO2023242251A1/en unknown
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