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KR102689154B1 - 개질된 기능적 활성을 갖는 fc 돌연변이체 - Google Patents

개질된 기능적 활성을 갖는 fc 돌연변이체 Download PDF

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KR102689154B1
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알렉상드르 퐁뗀
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라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
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Abstract

본 발명은, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성이 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 개질된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택되는 폴리펩티드에 관한 것이다:
(i) 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N 및 394P 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
(ii) 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 379A, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 333G, 339T, 349S, 325S, 334N, 334R, 336T, 340E, 343S, 345G, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 일어나지 않음).
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드의 용도, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

개질된 기능적 활성을 갖는 FC 돌연변이체 {FC MUTANTS WITH MODIFIED FUNCTIONAL ACTIVITY}
본 발명은 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 부모 폴리펩티드의 것과 비교할 때 개질되어 있는 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
항체는 중쇄 및 경쇄의 테트라머로 형성되어 있다. 두 경쇄는 동일하며, 두 중쇄는 동일하고, 디술파이드 가교에 의해 연결되어 있다. 면역글로불린 부류 (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM) 를 결정하는, 5 종의 중쇄가 존재한다 (알파, 감마, 델타, 엡실론, 뮤). 경쇄 그룹은 2 가지 서브 타입을 포함한다: 람다 및 카파.
IgG 는 혈액 및 다른 체액에서 발견될 수 있는 가용성 항체이다. IgG 는 분자량이 대략 150 kDa 인 Y-형상의 당단백질로, 2 개의 중쇄와 2 개의 경쇄로 구성된다. 각 쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 특징으로 한다. 중쇄의 2 개의 카르복시-말단 도메인이 Fc 단편을 형성하는 한편, 중쇄와 경쇄의 아미노-말단 도메인은 항원을 인식하고, Fab 단편으로 공지되어 있다.
Fc 융합 단백질은 주어진 치료 표적에 대한 특이성을 제공하는 단백질 도메인과 항체 Fc 단편의 조합에 의해 생성된다. 예로, 모든 타입의 치료 단백질 또는 그 단편과 Fc 단편의 조합이 있다.
치료 항체 및 Fc 융합 단백질이 현재 류마티스 관절염, 건선, 다발경화증 및 여러 형태의 암과 같은 각종 질병 치료에 사용된다. 치료 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 단일 항원에 대한 동일한 특이성을 나타내는 독특한 항체 세포 생성주로부터 수득된다. 치료적 Fc 융합 단백질, 예를 들어 Etanercept (Enbrel, Amgen 사; Fc 단편에 연결된 TNF 수용체) 또는 Alefacept (Amevive, Biogen Idec 사: 인간 IgG1 의 Fc 부분에 연결된 LFA-3)이 자가면역 질환에 대항하는 의약품으로 사용되거나 개발된다.
항체 및 Fc 융합 단백질이 그들의 효과를 발휘할 수 있도록, Fc 단편은 가능한 최상의 활성을 가져야 한다 (예를 들어, 항체-의존성 세포 독성, 보체 의존성 세포 독성 또는 항체-의존성 세포 포식작용), 즉 이것은 최적화된다. 상기 최적화는 개선된 활성 및/또는 효능 및/또는 감소된 부작용을 갖는 단백질을 수득 가능하게 할 수 있다.
출원인은 이후 개선된 활성을 갖는 특정한 Fc 단편을 개발하였다. 이들 단편은 이들 단편을 포함하는 제품에 개선된 효능이 부여되도록 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 따라서 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성과 관련된 최적화된 특성을 가진 부모 폴리펩티드의 변이체를 제공한다.
본 발명은, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 그 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성이 부모 폴리펩티드의 것과 비교할 때 개질된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 Fc 영역은 하기 중에서 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다: G316D, K326E, N315D, N361H, P396L, T350A, V284L, V323I, P352S, A378V, Y436H, V266M, N421T, G385R, K326T, H435R, K447N, N434K, K334N, V397M, E283G, A378T, F423L, A431V, F423S, N325S, P343S, K290E, S375R, F405V, K322E, K340E, N389S, F243I, T307P, N389T, S442F, K248E, Y349H, N286I, T359A, S383R, K334R, T394P, V259A, T393A, P352L, Q418P, V302A, L398P, F423P, S442P, V363I, S383N, S254F, K320E, G402D, I253F, V284A, A431T, N315H, Y319H, C226Y, F405L, T393I, N434S, R255W, A287T, N286Y, A231V, K274R, V308G, K414R, M428T, E345G, F243L, P247T, Q362R, S440N, Y278H, D312G, V262A, V305A, K246R, V308I, E380G, N276S, K439Q, S267G, F423Y, A231T, K320R, L410R, K320M, V412M, T307N, T366A, P230S, Y349S, A339T, K246E, K274E, A231P, I336T, S298N, L234P, S267N, V263A, E333G, V308A, K439R, K392R, S440G, V397I, I336V, Y373D, K288E, L309P, P227S, V379A, K288R, K320T, V282A, I377T, N421S 및 C261R (넘버링은 EU Index (인덱스) 또는 Kabat 등가물의 것임).
상기 폴리펩티드는, 본 출원서에서 "본 발명의 폴리펩티드"로 불리운다.
보다 구체적으로, 본 발명은, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 부모 폴리펩티드의 것과 비교했을 때 개질된 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M 및 421T 중에서 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (상기 넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 돌연변이 (i) 는 378V, 396L 및 397M 중에서 선택된다. 바람직하게, 폴리펩티드는 또한 248E, 326T, 333G 및 423Y 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 돌연변이 (ii) 는 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된다.
본 출원 전체에 걸쳐, Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등의 등가물에 따른 면역글로불린 중쇄의 넘버링이다 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991). "EU Index 또는 Kabat 등가물" 이란 표현은, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 잔기의 EU 넘버링을 지칭한다. 이는 IMGT 웹사이트 (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html) 에서 찾을 수 있다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은, 적어도 100 개의 공유 결합된 아미노산을 포함하는 서열을 의미한다.
"아미노산"은, 20 개의 천연 아미노산 또는 비천연 유사체 중 하나를 의미한다.
용어 "위치"란, 폴리펩티드의 서열에서의 위치를 의미한다. Fc 영역에 있어서, 위치는 EU Index 또는 Kabat 등가물에 따라 번호가 매겨진다.
용어 "항체"는 그것의 일반적인 의미에서 사용된다. 이는 적어도 하나의 Fc 영역 및 2 개의 가변 영역을 포함하는 테트라머에 해당한다. 항체는 특히 전장 면역글로불린, 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 전적으로 인간 항체를 포함한다. 각 중쇄의 아미노-말단 부분은 약 100 내지 110 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 항원 인식을 담당한다. 각 가변 영역에서, 3 개의 루프가 함께 연결되어 항원과의 결합 부위를 형성한다. 각각의 루프는 상보성 결정 영역 (CDR) 으로 지칭된다. 각 중쇄의 카르복시-말단 부위는 주로 이펙터 작용을 담당하는 불변 영역을 정의한다.
IgG 는 몇 개의 서브-클래스, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 를 갖는다. IgM 서브-클래스는 특히 IgM1 및 lgM2 이다. 따라서, "이소타입"은 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원 특성에 의해 정의된 면역글로불린 서브-클래스 중 하나를 의미한다. 인간 면역글로불린의 공지된 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, lgA2, IgM1, lgM2, IgD 및 IgE 이다.
전장 IgG 는 테트라머이고, 2 개의 동일한 쌍의 2 개의 면역글로불린 쇄로 구성되며, 각 쌍은 경쇄 및 중쇄를 갖고, 각 경쇄는 VL 및 CL 도메인을 포함하고, 각 중쇄는 도메인 VH, Cγ1 (또한 CH1 로 지칭), Cy2 (또한 CH2 로 지칭) 및 Cy3 (또한 CH3 로 지칭) 을 포함한다. 인간 IgG1 에 있어서, "CH1" 란, EU Index 또는 Kabat 등가물에서의, 위치 118 내지 215 를 지칭하고, "CH2" 는 위치 231 내지 340 을 지칭하고, "CH3" 는 위치 341 내지 447 를 지칭한다. IgG 의 중쇄는 또한 IgG1 에 대한 위치 216 내지 230 을 지칭하는 N-말단 가요성 힌지 영역을 포함한다. 하부의 힌지 영역은, EU Index 또는 Kabat 등가물에서 위치 226 내지 230 을 지칭한다.
"가변 영역"은, 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 쇄, 각각을 구성하는 임의의 유전자 VK, Vλ, 및/또는 VH 에 의해 실질적으로 인코딩된 하나 또는 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR) 및 골격부 영역 (FR) 을 포함한다.
용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 제 1 면역글로불린 불변 영역 도메인 (CH1) 을 제외한 항체의 불변 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 는 IgG1 불변 영역의 2 개의 마지막 도메인 (CH2 및 CH3) 및 이들 도메인의 N-말단 가요성 힌지를 나타낸다. 인간 IgG1 에 있어서, Fc 영역은 그의 카르복시-말단, 즉 EU Index 또는 Kabat 등가물에서와 같이 번호매겨진 위치 226 내지 447 에서의 잔기까지의 잔기 C226 에 해당한다. 사용된 Fc 영역은 EU Index 또는 Kabat 등가물에서 위치 216 내지 226 에 위치된 상부 힌지 영역의 부분을 추가로 포함할 수 있다; 이 경우에, 사용된 Fc 영역은 EU Index 또는 Kabat 등가물에서와 같이 번호매겨진 위치 216 내지 447, 217 내지 447, 218 내지 447, 219 내지 447, 220 내지 447, 221 내지 447, 222 내지 447, 223 내지 447, 224 내지 447 또는 225 내지 447 의 잔기에 상응한다. 바람직하게, 이 경우에, EU Index 또는 Kabat 등가물에서 번호 매겨진 바와 같이 사용된 Fc 영역은 위치 216 내지 447 에서의 잔기에 해당한다.
바람직하게, 사용된 Fc 영역은 서열 SEQ ID NO: 1 내지 10 중에서 선택된다.
"부모 폴리펩티드"는 레퍼런스 폴리펩티드를 의미한다. 상기 부모 폴리펩티드는 천연 또는 합성 기원의 것일 수 있다. 본 발명의 문맥 내에서, 부모 폴리펩티드는 "부모 Fc 영역"으로 불리우는 Fc 영역을 포함한다. 이 Fc 영역은 야생형 그룹 Fc 영역 군, 그의 단편 또는 돌연변이체 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게, 부모 폴리펩티드는 인간 Fc 영역, 바람직하게 인간 IgG1 의 Fc 영역을 포함한다. 부모 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역과 비교할 때 Fc 영역 (예, Fc 돌연변이체) 에서의 아미노산의 기존의 개질 을 포함할 수 있다. 유리하게, 부모 폴리펩티드 부모는 단리된 Fc 영역 (즉, 그 자체의 Fc 단편), 단리된 Fc 영역으로부터 유래된 서열, 항체, Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 또는 Fc 접합체이며, 이 목록은 비제한적이다. "단리된 Fc 영역으로부터 유래된 서열"은, scFC (단쇄 Fc) 또는 멀티머 Fc 와 같이 함께 연결된 적어도 2 개의 단리된 Fc 영역들을 포함하는 서열을 의미한다. "Fc 영역을 포함하는 융합 단백질"은 Fc 영역에 융합된 폴리펩티드 서열을 의미하며, 상기 폴리펩티드 서열은 바람직하게 임의 항체의 가변 영역, 그의 리간드에 대한 수용체의 결합 서열, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨 및 케모카인 중에서 선택된다. "Fc 접합체"는 Fc 영역과 접합 파트너의 화학적 커플링의 결과인 화합물을 의미한다. 접합 파트너는 단백질성 또는 비단백질성일 수 있다. 커플링 반응은 일반적으로 Fc 영역 및 접합 파트너 상의 작용기를 이용한다. 각종 결합기가 접합체의 합성에 적합한 것으로 선행 기술에서 공지되어 있다: 예를 들어, 호모- 또는 헤테로2작용성 결합기가 익히 공지되어 있다 (catalogue of the Pierce Chemical Company, 2005-2006, technical section on cross-linking agents, pages 321-350 참조). 적합한 접합 파트너 중에서, 치료 단백질, 표지, 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 독소 및 그의 활성 단편을 언급할 수 있다. 적합한 독소 및 그 단편은 특히 디프테리아 독소, 외독소 A, 리신, 아브린, 사포린, 젤로닌, 칼리케마이신, 아우리스타틴 E 및 F, 및 머탄신을 포함한다.
유리하게도, 부모 폴리펩티드 - 및 그에 따라 본 발명의 폴리펩티드 - 는 Fc 영역으로 이루어진다.
유리하게도, 부모 폴리펩티드 - 및 그에 따라 본 발명의 폴리펩티드 - 는 항체이다.
마지막으로, 바람직하게, 부모 폴리펩티드 - 및 그에 따라 본 발명의 폴리펩티드 - 는 트랜스제닉 동물의 우유에서 생성된 폴리펩티드이다.
"돌연변이"는, 폴리펩티드의 서열에서 적어도 하나의 아미노산의 변경, 특히 부모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산의 변경을 의미한다. 수득한 돌연변이된 폴리펩티드는 변이체 폴리펩티드이다; 이것이 본 발명의 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드와 비교할 때 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 바람직하게, 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실이다. "치환"은 부모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 의미한다. 예를 들어, 치환 N434S 는 변이체 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서는 위치 434 에서 아스파라긴이 세린으로 대체된 변이체를 지칭한다. "아미노산의 삽입" 또는 "삽입"은, 부모 폴리펩티드 서열에서의 특정 위치에서의 아미노산의 첨가를 의미한다. 예를 들어, 삽입 G>235-236 는 위치 235 과 236 사이에서 글리신의 삽입을 나타낸다. "아미노산의 결실" 또는 "결실"은 부모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서의 아미노산의 결실을 의미한다. 예를 들어, E294del 는, 위치 294 에서 글루탐산의 결실을 나타낸다. 바람직하게, 하기의 명명이 돌연변이에 사용된다: "434S" 또는 "N434S", 이는 부모 폴리펩티드가 변이체에서 세린에 의해 대체된 위치 434 에서의 아스파라긴을 포함하는 것을 지시한다. 치환들의 조합이 존재하는 경우, 바람직한 포맷은 하기이다: "259I/315D/434Y" 또는 "V259I/N315D/N434Y". 이는 변이체에서 위치 259, 315 및 434 에서 3 개의 치환이 존재한다는 것을 지시하며, 부모 폴리펩티드의 위치 259 에서의 아미노산, 즉 발린이 이소류신으로 대체되고, 부모 폴리펩티드의 위치 315 에서의 아미노산, 즉 아스파라긴이 아스파르트산으로 대체되고, 부모 폴리펩티드의 위치 434 에서의 아미노산, 즉 아스파라긴이 티로신으로 대체된 것을 지시한다.
본 발명의 폴리펩티드는 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖고, 이는 부모 폴리펩티드의 것과 비교할 때 개질되어 있다.
"Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성"이란, 특히 이펙터 작용을 의미한다. Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성은 따라서 특히 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포 포식작용 (ADCP), 세포내이입 활성, 사이토킨 분비, 또는 이들 활성 중 적어도 2 종의 조합을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에서 고려 중인 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성은, ADCC, CDC 및 그 조합 중에서 선택된다. 이 기능적 활성은, 실시예에 기재된 것과 같이 선행 기술에 익히 공지되어 있는 방법을 이용하여 평가될 수 있다 (특히, 실시예의 목록 4.4 및 4.5 참조).
본 발명의 폴리펩티드의 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성은, 부모 폴리펩티드의 것과 비교할 때 증가 또는 감소된다.
제 1 변형에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 증가된 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교하여 적어도 2, 바람직하게는 5 초과, 바람직하게는 10 초과, 바람직하게 15 초과, 바람직하게 20 초과, 바람직하게 25 초과, 바람직하게 30 초과의 비율로 증가된 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는다.
제 2 변형에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 감소된 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교하여 적어도 2, 바람직하게 5 초과, 바람직하게 10 초과, 바람직하게 15 초과, 바람직하게 20 초과, 바람직하게 25 초과, 바람직하게 30 초과의 비율로 감소된 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은, C1q 보체, FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) 및 FcgRIIb (CD32b) 중에서 선택된, Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해 개질된 친화성을 가진다. C1q 보체는 CDC 활성과 관련된다. FcgRIIIa 수용체 (CD16a) 는 ADCC 에 관여한다; 이것은 위치 158 에서 V/F 다형성 (polymorphism) 을 나타낸다. FcgRIIa 수용체 (CD32a) 는 혈소판 활성화 및 포식 작용과 관련된다; 이것은 위치 131 에서 H/R 다형성을 나타낸다. 마지막으로, FcgRIIb 수용체 (CD32b) 는 세포 활성의 저해와 관련된다.
바람직하게, 상기 돌연변이된 Fc 영역은 하나 이상의 FcR 에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 바람직하게, 친화성은, 부모 Fc 의 것과 비교하면, 2 이상, 바람직하게 5 초과, 바람직하게 10 초과, 바람직하게 15 초과, 바람직하게 20 초과, 바람직하게 25 초과, 바람직하게 30 초과의 비율로 증가된다. 즉, FcR 에 대한 돌연변이된 Fc 영역의 친화성은 부모 폴리펩티드의 것보다 더 크다. 대안적으로, 상기 돌연변이된 Fc 영역은 적어도 하나의 FcR 에 대해 감소된 친화성을 가진다. 바람직하게, 친화성은, 부모 Fc 의 것에 비해, 적어도 2, 바람직하게 5 초과, 바람직하게 10 초과, 바람직하게 15 초과, 바람직하게 20 초과, 바람직하게 25 초과, 바람직하게 30 초과의 비율로 감소된다. 즉, FcR 에 대한 돌연변이된 Fc 영역의 친화성은 부모 폴리펩티드의 것보다 낮다.
Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcR 친화성은, 선행 기술에 익히 공지되어 있는 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 표면 플라즈마 공명 (SPR) 을 이용하여 친화성 (Kd) 를 결정할 수 있다. 대안적으로, 숙련자는 적합한 ELISA 어세이를 수행할 수 있다. 적합한 ELISA 어세이는, 부모 Fc 와 돌연변이된 Fc 의 결합력을 비교가능하게 한다. 돌연변이된 Fc 및 부모 Fc 에 특이적인 검출된 신호가 비교된다. 결합 친화성은, 전체의 폴리펩티드 또는 그의 단리된 Fc 영역을 평가하는지 여부와 관계 없이 무심하게 측정될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 돌연변이된 Fc 영역은 부모 폴리펩티드의 비교하면 1 내지 20 개의 돌연변이, 바람직하게 2 내지 20 개의 돌연변이를 포함한다. "아미노산의 1 내지 20 개의 개질" 에 의하면, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 이것은 부모 폴리펩티드에 대해 1 내지 15 개의 돌연변이, 바람직하게 2 내지 15 개의 돌연변이, 바람직하게 1 내지 10 돌연변이, 2 내지 10 개의 돌연변이를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 378V, 396L 및 397M 중에서 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 231V, 248E, 286I, 286Y, 290E, 298N, 308A, 315D, 316D, 326E, 333G, 334N, 334R, 336T, 352S, 361H, 366A, 378T, 396L, 397M, 412M, 421T, 423Y 및 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은, EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 은 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 378V, 396L 및 397M 중 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 248E, 316D, 326E, 333G, 378T, 396L 및 421T 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 증가된 ADCC 및 CDC 기능적 활성을 갖는 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역이 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다:
(i) 378V, 396L 및 397M 중에서 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 248E, 316D, 326E, 333G, 378T, 396L 및 421T 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 돌연변이 378V;
(ii) 298N 및 336T 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 378V, 396L 및 397M 중에서 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 231V, 286I, 286Y, 290E, 315D, 334N, 352S, 361H, 366A, 378T, 397M, 412M, 421T 및 423Y 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 증가된 ADCC 기능적 활성을 갖는 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 378V, 396L 및 397M 중에서 선택된 하나의 돌연변이;
(ii) 231V, 286I, 286Y, 298N, 290E, 315D, 334N, 336T, 352S, 361H, 366A, 378T, 397M, 412M, 421T 및 423Y 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 돌연변이 378V;
(ii) 248E, 308A, 334R, 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 증가된 CDC 기능적 활성을 갖는 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 한다:
(i) 돌연변이 378V;
(ii) 248E, 308A, 334R, 447N 중 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 하기 조합 중에서 선택된 돌연변이의 조합을 포함한다:
K320E/T394P/G402D
K290E/K320E/T350A/P396L
T359A/S383R/V397M.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 C1q 보체에 대한 개선된 친화성을 가지며, 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포하하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 378V, 378T, 396L, 421T, 334R 및 326E 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 361H, 290E, 316D, 248E, 410R, 421T, 334R, 394P, 307P, 447N, 378V, 284L, 421T, 396L, 286I, 315D 및 397M 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 FcgRIIIa 수용체 (CD16a) 에 대한 개선된 친화성을 갖고, 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 378V, 326E, 397M, 334N 및 396L 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y 및 298N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 FcgRIIa 수용체 (CD32a) 에 대한 증가된 친화성을 갖고, 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 378V, 326E, 397M, 307N, 394P, 326T, 396L 및 334N 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 316D, 334R, 334N, 323I, 231V, 246R, 336T, 378T, 286Y, 286I, 352S, 383R, 359A, 421T, 361H, 315D, 366A, 290E, 307P 및 439R 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 돌연변이 (ii) 는 316D, 334R, 334N, 323I, 231V, 246R, 336T, 378T, 286Y, 286I, 352S, 383R, 359A, 421T, 361H, 366A, 290E, 307P 및 439R 로부터 선택된다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 FcgRIIb 수용체 (CD32b) 에 대해 증가된 친화성을 갖고, 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하며, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 326E, 326T, 378V, 397M, 352L, 394P, 396L 및 421T 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 316D, 334R, 248E, 334N, 418P, 231V, 320E, 402D, 359A, 383R, 421T 및 361H 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 증가된 CDC 활성을 갖고, 2 개의 돌연변이의 적어도 한 조합을 포함하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 378V, 378T, 396L, 421T, 334R 및 326E 중 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 361H, 290E, 316D, 248E, 410R, 421T, 334R, 394P, 307P, 447N, 378V, 284L, 421T, 396L, 286I, 315D 및 397M 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 증가된 ADCC 활성을 갖고, 2 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
i) 378V, 326E, 397M, 334N 및 396L 중 선택된 하나의 돌연변이; 및
ii) 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y 및 298N 중 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 3 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 하기를 포함한다:
(i) 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N 및 394P 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
(ii) 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된 적어도 2 개의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 적어도 2 개의 돌연변이 (ii) 는 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P, 및 447N 중에서 선택된다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 4 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이 (i) 및 상기 기재된 바와 같은 적어도 3 개의 돌연변이 (ii) 를 포함하고, 넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 것이고, 단, 돌연변이 (i) 은 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않는다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이된 Fc 영역은 5 개의 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함하고, 상기 조합은 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이 (i) 및 상기 기재된 바와 같은 적어도 4 개의 돌연변이 (ii) 를 포함하고, 넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 가 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않는다.
본 발명의 추가 주제는 본 발명의 폴리펩티드의 조성물이고, 그들의 Asn297 글리코실화 부위 상에서의 상기 정제된 폴리펩티드는 65% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 더욱 바람직하게는 40% 미만의 푸코실화 비율을 갖는 N-글리칸을 갖는다. 바람직하게, 상기 정제된 폴리펩티드는, 그들의 Asn297 글리코실화 부위 상에서, 짧은 쇄, 낮은 시알릴화, 비개재적 (non-intercalary) 말단 만노오스 및/또는 비개재적 말단 N-아세틸글루코사민을 가진 바이안테너리 (biantennary) 유형의 글리칸 구조를 갖는다.
더욱 바람직하게, 상기 정제된 폴리펩티드는 G0+G1+G0F+G1F 형태에 대해 60% 초과의 함량을 갖고, G0F+G1F 형태에 대해서는 50% 미만의 함량을 가진다.
더욱 바람직하게, 상기 정제된 폴리펩티드는 G0+G1+G0F+G1F 형태에 대해 60% 초과의 함량을 갖고, 푸코오스 함량은 65% 미만이다.
더욱 바람직하게, 상기 정제된 폴리펩티드는 G1F+G0F 형태에 대해 40% 미만의 함량을 가진다.
본 발명의 추가 주제는, (i) 본 발명의 폴리펩티드, 또는 앞선 문단에서 기재된 것과 같은 조성물 및 (ii) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 추가 주제는, 의약품으로서 사용하기 위한 앞서 기재된 바와 같은 조성물 또는 본 발명의 폴리펩티드이다.
전술한 바와 같이, 유리하게는 부모 폴리펩티드- 및 그에 따라 본 발명의 폴리펩티드 - 는 항체이다. 이 경우, 항체는 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균류 항원, 독소, 막-결합 또는 순환 사이토킨, 및 막 수용체에 대항하여 지시될 수 있다.
항체가 종양 항원에 대항하여 지시되는 경우, 이것은 암 치료에 사용하기에 특히 적합하다. "암"이란, 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 임의의 생리학적 상태이다. 암의 예는 특히 암종, 림프종, 모세포종, 육종 (지방육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 수막종, 선암종, 흑색종, 백혈병 및 악성 림프성 병변 (이 목록은 포괄적인 것은 아님) 을 포함한다.
항체가 바이러스 항원에 대항하여 지시되는 경우, 이것은 특히 바이러스 감염 치료에 사용되기에 적합하다. 바이러스 감염은 특히 HIV, 레트로바이러스, 콕사키 바이러스, 천연두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 로타바이러스 또는 B 또는 C 형 간염 바이러스 (이 목록은 포괄적인 것은 아님) 에 의한 감염이다.
항체가 독소에 대항하여 지시되는 경우, 이것은 특히 박테리아 감염, 예를 들어 파상풍 독소, 디프테리아톡신, 탄저균 (Bacillus anthracis) 독소로의 감염 치료에, 또는 보툴린 독소, 리신 독소, 시가 독소 (이 목록은 포괄적인 것은 아님) 으로의 감염 치료에 사용하기에 특히 적합하다.
항체가 사이토킨에 대항하여 지시되는 경우, 이것은 특히 염증성 및/또는 자가면역 질환 치료에 사용되기에 적합하다. 염증성 및/또는 자가면역 질환은 특히 혈전성 혈소판 자반병 (TTP), 이식편 또는 이식 거부, 이식편대숙주 질환, 류마티스 관절염, 전신성 홍반 루프스 (SLE), 상이한 유형의 경화증, 1차 쇼그렌 증후군 (또는 Gougerot-Sjoegren 증후군), 자가면역 다발신경병증, 예컨대 다발경화증, 제 1 형 당뇨병, 자가면역성 간염, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 통풍성 관절염, 체강 질병, 크론병, 만성 하시모토 갑상선염 (갑상선 기능 항진증), 애디슨병, 자가면역 간염, Basedow 질병 (갑상선 기능 항진증), 궤양성 대장염, 혈관염, 예컨대 ANCA (AntiNeutrophil Cytoplasmic Autoantibodies; 항중성구 세포질 자가항체)-관련 전신 혈관염, 자가면역 혈구감소증 및 성인 및 어린이에서의 기타 혈액 합병증, 예컨대 자가면역 급성 또는 만성 저혈소판증, 자가면역 용혈성 빈혈, 신생아의 용혈성 질병 (HDN), 냉 응집성 질환, 자가면역 후천성 혈우병; 굿파스쳐 증후군, 막성 신장병, 자가면역 피부 수포 장애, 난치성 무력증, 혼합 저온 글로불린혈증, 건선, 청소년 만성 관절염, 염증성 근염, 피부 근육염 및 소아 항인지질 증후군을 포함하는 어린이 전신 자가면역 장애, 결합 조직 질병, 자가면역 폐 염증, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 말이집탈락 다발신경병증 (CIDP), 자가면역 갑상선염, 볼염, 중증 근무력증, 자가면역 안구 염증성 질환, 신경염 (Devic 질병), 경피증, 천포창, 인슐린 저항성을 통한 당뇨병, 다발근육염, 베르메르 빈혈, 사구체신염, 베르너 질병, 호튼병, 결절다발동맥염 (PAN) 및 Churg-Strauss 증후군, Still 질병, 위축성 다모증, 베체트병, 단클론성 감마병증, 베게너 육아종증, 루푸스, 출혈성 직장 결장염, 건선성 관절염, 사코이드증 콜라겐성 결장염, 포진피부염, 가족성 지중해열, IgA 침착을 동반한 라 사구체 신염, Lambert-Eaton 근무력증 증후군, 교감 신경계, Fiessinger-Leroy-Reiter 증후군 및 혈관-뇌수막염 증후군을 포함한다.
기타 염증성 질환, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 급성 패혈 관절염, 애쥬번트 관절염, 알레르기성 뇌척수염, 알레르기성 비염, 알레르기성 혈관염, 알레르기, 천식, 죽상경화증, 만성 박테리아 또는 바이러스 감염에 의한 염증, 만성 폐색성 폐질환 (COPD), 심장병, 뇌염, 장 염증성 질환, 염증성 골용해, 급성 및 지연 과민성 반응과 관련된 염증, 종양 관련 염증, 말초신경 병변 또는 말이집탈락 질병, 화상 및 허혈증과 같은 조직 외상와 관련된 염증, 수막염으로 인한 염증, 다발성 기관 장애 증후군 (MODS), vP 섬유증, 패혈증 및 패혈성 쇼크, 스티븐스-존슨 증후군, 미분화 관절염 및 미분화 척추관절병증이 또한 포함된다.
본 발명의 한 특정 구현예에서, 자가면역 질환은 특발성 저혈소판 자색반병 (ITP) 및 만성 염증성 말이집탈락 다발신경병 (CIDP)이다.
본 발명의 추가 주제는, 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 개질되어 있는, Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖고, Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 Fc 영역에서 하기 중에서 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함한다:
G316D, K326E, N315D, N361H, P396L, T350A, V284L, V323I, P352S, A378V, Y436H, V266M, N421T, G385R, K326T, H435R, K447N, N434K, K334N, V397M, E283G, A378T, F423L, A431V, F423S, N325S, P343S, K290E, S375R, F405V, K322E, K340E, N389S, F243I, T307P, N389T, S442F, K248E, Y349H, N286I, T359A, S383R, K334R, T394P, V259A, T393A, P352L, Q418P, V302A, L398P, F423P, S442P, V363I, S383N, S254F, K320E, G402D, I253F, V284A, A431T, N315H, Y319H, C226Y, F405L, T393I, N434S, R255W, A287T, N286Y, A231V, K274R, V308G, K414R, M428T, E345G, F243L, P247T, Q362R, S440N, Y278H, D312G, V262A, V305A, K246R, V308I, E380G, N276S, K439Q, S267G, F423Y, A231T, K320R, L410R, K320M, V412M, T307N, T366A, P230S, Y349S, A339T, K246E, K274E, A231P, I336T, S298N, L234P, S267N, V263A, E333G, V308A, K439R, K392R, S440G, V397I, I336V, Y373D, K288E, L309P, P227S, V379A, K288R, K320T, V282A, I377T, N421S 및 C261R (넘버링은, EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링임).
바람직하게, 본 발명의 주제는 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 개질된, Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성을 갖고 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 2 개의 돌연변이의 적어도 하나의 조합을 도입하는 단계를 포함하며, 이때 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N 및 394P 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
(ii) 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P, 및 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 돌연변이 (ii) 는 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P, 및 447N 중에서 선택된다.
본 발명의 추가 주제는 수용체 C1q, FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) 및 FcgRIIb (CD32b) 중에서 선택된 Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나와 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 결합을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 Fc 영역에서 하기 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함한다: G316D, K326E, N315D, N361H, P396L, T350A, V284L, V323I, P352S, A378V, Y436H, V266M, N421T, G385R, K326T, H435R, K447N, N434K, K334N, V397M, E283G, A378T, F423L, A431V, F423S, N325S, P343S, K290E, S375R, F405V, K322E, K340E, N389S, F243I, T307P, N389T, S442F, K248E, Y349H, N286I, T359A, S383R, K334R, T394P, V259A, T393A, P352L, Q418P, V302A, L398P, F423P, S442P, V363I, S383N, S254F, K320E, G402D, I253F, V284A, A431T, N315H, Y319H, C226Y, F405L, T393I, N434S, R255W, A287T, N286Y, A231V, K274R, V308G, K414R, M428T, E345G, F243L, P247T, Q362R, S440N, Y278H, D312G, V262A, V305A, K246R, V308I, E380G, N276S, K439Q, S267G, F423Y, A231T, K320R, L410R, K320M, V412M, T307N, T366A, P230S, Y349S, A339T, K246E, K274E, A231P, I336T, S298N, L234P, S267N, V263A, E333G, V308A, K439R, K392R, S440G, V397I, I336V, Y373D, K288E, L309P, P227S, V379A, K288R, K320T, V282A, I377T, N421S 및 C261R (넘버링은, EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링임).
바람직하게, 본 발명의 주제는 수용체 C1q, FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) 및 FcgRIIb (CD32b) 중에서 선택된, Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대한 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 결합을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 2 개의 돌연변이의 적어도 하나의 조합을 도입하는 단계를 포함하며, 상기 조합은 하기 중에서 선택된다:
(i) 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N 및 394P 중에서 선택된 하나의 돌연변이; 및
(ii) 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이 (넘버링은 EU Index 또는 Kabat 등가물의 넘버링이고, 단, 돌연변이 (i) 는 돌연변이 (ii) 와 동일한 아미노산 상에서 발생하지 않음).
바람직하게, 돌연변이 (ii) 는 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P 및 447N 중에서 선택된다.
본 출원에 기재된 서열은 하기와 같이 요약될 수 있다:
Figure 112017106127852-pct00001
본 발명은 하기 실시예를 판독하면 더 잘 이해될 것이다.
실시예
실시예 1:본 발명의 돌연변이된 Fc 영역을 가진 폴리펩티드의 동정 및 이 폴 리펩티드의 특징분석
I. 재료 및 방법
1. 인간 Fc 영역의 뱅크 구축
아미노산 226-447 (EU Index 또는 Kabat 등가물) 을 인코딩 (encoding) 하는 인간 Fc 유전자, 즉 동종이형 (allotype) G1m1.17 을 갖고, 인간 IgG1 의 중쇄로부터 유래된, Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1) (Poul MA et al, Eur J. Immunol 25 (7): 2005-2009, 1995) 를, 표준 PCR 프로토콜에 따라 BamHI / EcoRI 단편으로서 파아지미드 벡터 (phagemid vector) pMG58 (pMG58_Fc226) 에 클로닝하였다. 여러개의 완전히 무작위된 뱅크를, 저-정확도 (fidelity) 인간 DNA-폴리머라아제 (뮤타아제) 를 이용하여 전체의 표적 서열에서 균질하게 랜덤 돌연변이를 도입시키는 MUTAGEN™ 방법 (WO02/038756) 을 적용하여 제조하였다. 3 개의 상이한 뮤타아제 (pol β, pol η 및 pol ι) 을, 상이한 조건 하에서 이용하여, 상보적인 돌연변이 프로파일을 생성했다. 이들 인간 폴리머라아제를 앞서 기술한 바와 같이 제조 및 정제하였다 (Mondon et al. J. Biotechnol 21: 76-82 (2007), Emond et al. Protein Eng Des SeI 21:267-274, (2008)).
1.1. MUTAGEN™ 방법으로의 돌연변이유발
MUTAGEN™ 방법은 출원 WO02/038756 에 기재되어 있다.
요약하면, 인간 Fc 유전자 (Fc 유전자) 를, 5' 프라이머 MG_619: 5'-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3' (SEQ ID NO: 11) 및 3' 프라이머 MG_621: 5'-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(SEQ ID NO: 12) 를 이용하여, 뮤타아제로 복제하였다. 모델로서 0.6 ㎍ 의 pMG58_Fc226 플라스미드 (야생형 Fc 영역 또는 선택된 변이체), 프라이머 MG_619 및 MG_621 (각각 250 nM) 및 적합한 복제 버퍼 (하기 참조) 를 함유하는 혼합물을 5 분 동안 95℃ 에서 처리하고, 즉시 4℃ 로 냉각시켜, DNA 가닥을 변성시켰다. polβ 의 경우, 복제 버퍼는, 50 mM Tris HCl pH 8.8, 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM DTT 및 1% (v/v) 글리세롤이었다. pol η (또는 pol η 및 pol ι) 에 대한 복제 버퍼는 25 mM Tris HCl pH 7.2, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM DTT 및 2.5 % (v/v) 글리세롤이었다. 변성 단계 후, 돌연변이성 복제물을, 50 μM ATP / dCTP, 100 μM dTTP / dGTP, 및 1 ㎍ 의 pol β 또는 100 μM 의 dNTP 및 1 ㎍ 의 pol η (또는 pol η 및 pol ι, 1 ㎍ 의 각 뮤타아제) 를 첨가함으로써 수득하였다. 복제 반응을 2 시간 동안 37℃ 에서 행하였다. 복제 생성물을 후속해서 Microcon 컬럼 (Millipore) 에서 농축하고, 탈염시켰다.
1.2. 선택적 증폭 및 돌연변이된 단편의 클로닝
이전에 수득한 복제 생성물을, 꼬리 (tail) 프라이머로 선택적 PCR 로써 증폭시켰다. 프라이머 (MG_619 MG_621) 는, 뮤타아제에 의해 합성된 DNA 단편들의 특이적 증폭을 허용하는 모델에 비상보적인 꼬리로 고안하였다. 복제 생성물의 한 분획을, PCR 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 10 pmol 의 5' 및 3' 프라이머, 200 pM 의 dNTPs 및 1.25 U 의 백금 Taq DNA 폴리머라아제 (Invitrogen) 를 함유하는 혼합물에 첨가하였다. PCR 사이클은 다음과 같다: 제 1 사이클 94℃ 에서 2 분, 64℃ 에서 10 초, 75℃ 에서 30 초, 94℃ 에서 1 분, 이어서 30 회의 선택적인 사이클: 94℃ 에서 20 초 및 75℃ 에서 30 초.
증폭된 복제 생성물을 BamHI 및 EcoRI 로 절단시킨 1% (w / v) 의 아가로오스 겔 상에서 정제하고, pMG58 벡터에 클로닝하였다. 리게이션 혼합물을, E. Coli XL1-Blue 전기천공적격 (electrocompetent) 세포에서 형질전환시키고, 100 ㎍/ml 의 암피실린 및 1% (w/v) 글루코오스가 첨가된 고체 2YT 배지 (16 g/l 펩톤, 10 g/l 효모 추출물, 5 g/l NaCl, 15 g/l 아가) 위에 확산시켰다 (spread). 성장 후, 콜로니 수를 측정하여, 뱅크 크기를 어림잡고, 뱅크 당 적어도 48 개의 클론을, PCR 및 신속 DNA 시퀀싱에 적용했다. 세포를, 15% 글리세롤를 함유하는 2YT 배지에서 재현탁하고, -80℃ 에서 냉동 보관하였다.
1.3. Mut3　뱅크의 구축
제 1 뱅크는 야생형 Fc 유전자 상 pol β 를 이용하여 수득하고, 이는 3.2x106 개의 클론 (Mut1.1 로 지칭) 를 함유했다. 상기 제 1 뱅크의 DNA 를 이용하여 제 2 및 제 3 뱅크를 각각 pol β (3.8x106 개의 클론, Mut1.2) 및 pol η 및 i (3.0x106 개의 클론, Mut1.3) 를 이용하여 생성했다. 2 가지 누적된 복제 단계를 갖는 상기 전략은, 돌연변이 비율 증가를 허용했다. 제 4 뱅크를, 야생형 Fc 유전자 (1.0x106 개의 클론, Mut1.4) 상에서 pol η 단독으로 수득했다. 마지막으로, 이들 4 개의 뱅크를 비례하여 혼합하여, 1.1x107 개의 상이한 클론에 상당하는 Mut1 이라 불리우는 마지막 뱅크를 수득했다.
이어서, 2 개의 상이한 뱅크를, FcRn 수용체 상에 단리된 단일 및 이중 돌연변이체의 DNA 풀을 이용하여 구축했다. 제 1 뱅크를, pol β (1.9x107 클론, Mut2.1) 을 이용하여 수득하고, 제 2 뱅크는 pol η (1x106 클론, Mut2.2) 으로 수득했다. 마지막으로, 이들 2 개의 뱅크를, 비례 혼합시켜, Mut2 로 불리우는 마지막 뱅크, 즉 2x107 개의 상이한 클론을 수득했다.
다양한 4.7x107 개의 클론을 갖는 새로운 뱅크를 야생형 Fn 유전자 상 pol β 를 이용해 수득했다.
마지막으로, 뱅크 Mut1, Mut2 및 새 뱅크를, 비례적으로 혼합하여, Mut3 으로 불리우는 최종의 뱅크, 즉 7.8x107 개의 상이한 클론을 수득하였다.
Mut3 뱅크는 최종적으로 Fc 당 평균 2.2 개의 돌연변이된 아미노산을 갖는 상 (phase) 에서 3x107 개의 돌연변이된 클론을 함유했다.
1.4. Mut4sel 뱅크의 구축
Fc 변이체 뱅크를, Mut3 뱅크 Mut3 (평균 Fc 당 1.6 개의 돌연변이된 아미노산) 으로부터 선택된, C1q 및/또는 CD16aV 와의 개선된 결합을 가진 36 개의 클론으로부터 구축하였다. Mut4 뱅크를, pol β 및 pol η 폴리머라아제 (pol β 의 복제 버퍼에서) 의 등몰 혼합물을 이용하여 수득했다. Mut4 뱅크는 Fc 당 평균 2.6 개의 돌연변이된 아미노산 및 상 에서 (in phase) 77% 의 클론인 다양한 1.3x107 클론을 가진다.
상기 뱅크를, 베타-락타마아제의 유전자와의 융합을 통해 암피실린 배지 상에서 코딩 서열 (ORF) 의 선택을 허용하는 Fc 를 위해 개발된 선택 벡터, pMG93 벡터에서 클로닝하였다. 이 구축을, 비억제성 (non-suppressive) 박테리아 HB2151 에서 형질전환하였는데, 상기는 균주 내 종결 코돈으로 공지된 TAG 코돈의 제거를 허용하였다. 이 뱅크의 클론을 ORF 의 선택을 행하도록 소량의 암피실린을 함유하는 아가 배지의 접시에서 저밀도로 플레이팅하여 확산시키고, 이때 생존 클론을 회수하여 동결시켰다. 500 Petri 접시 (120x120) 에서 확산 플레이팅으로, 전체 뱅크 Mut4 의 커버링을 가능하게 했다. 그에 따라 선택된 뱅크는 Mut4sel 로 지칭되고, 이는 상에서 92% 클론을 함유하고, 즉 상에서 1x107 개의 돌연변이된 클론을 함유하고, Fc 당 평균 2.5 개의 돌연변이된 아미노산을 가진다. 이어서, Mut4sel 뱅크를 XL1-Blue 박테리아에서 파아지미드 pMG58 에서 서브-클로닝하여, 표적 상에 "파지 디스플레이" 에 의한 선택을 가능하게 하였다.
1.5. Mut5 뱅크의 구축
Fc 변이체의 뱅크를, Mut4sel 뱅크 (Fc 당 평균 2.4 개의 돌연변이된 아미노산) 으로부터 선택된, FcgR 수용체 중 하나 및/또는 C1q 와의 개선된 결합을 가진 42 개의 클론으로부터 구축하였다. Mut5 뱅크를, 낮은 돌연변이율을 얻도록, 폴리머라아제 pol β 를 단독으로 이용하여 수득하였다. 마지막으로, 수득된 Mut5 뱅크는 상에서 95% 클론이며 Fc 당 평균 3.1 개의 돌연변이된 아미노산을 갖는 1.2x107 개의 클론을 함유하였다. 이 뱅크의 양호한 품질은 Mut4 뱅크에 필요한 ORF 의 선택을 요구하지 않는다.
2. Fc 뱅크의 파아지 디스플레이 발현 및 개선된 변이체의 선택
선택 단계에서, 뱅크 Mut3, Mut4sel 및 Mut5 를, M13 박테리오파지의 표면 상에서 표준 절차에 따라 발현시켰다 (Smith GP, Science 228: 1315 (1985)). pMG58 벡터에 클로닝된 발현될 뱅크를 함유하는 E. coli XL1-Blue 박테리아를, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 테트라사이클린 및 1 % (w/v) 글루코오스가 첨가된 60 ml 의 2YT 배지에서 30℃ 에서 배양했다. 이어서, 세포를 보조 파아지 M13 (M13K07, Biolabs, 박테리아 / 파아지 비 = 1:3) 로 37℃ 에서 20 분간 감염시키고, Fc-파아지의 생성을 밤새 26 ℃ 에서 230 rpm 2YT/암피실린/글루코오스 (0.5 mM IPTG 및 50 ㎍ 카나마이신/ml 와 함께) 에서 계속했다. 다음날, 파아지를 표준 절차에 따라 PEG6000 으로 침전시키고, pH 7.4 에서 1 ml 의 PBS 버퍼 중 재현탁하고, XL1-Blue 세포를 감염시킴으로써 적정하였다.
2.1 사용된 재조합 단백질:
C1q 보체는 시중에서 입수가능하다 (Calbiochem).
CD16a 는 위치 158 에서 Fc 와의 결합측에서 V/F 다형성을 갖는 활성자 수용체이다. CD16aV 에 대해서 친화성이 개선되어 있다.
CD16aV 는 시중에서 입수가능하다 (R&D system).
CD16aF 는 PX'Therapeutics 에 의해 생산되었다.
CD32a 는 위치 131 에서, Fc 와의 결합측에서 H/R 다형성을 갖는 활성자 수용체이다. CD32aH 에 대해서 친화성이 개선되어 있다.
CD32aR 는 시중에서 입수가능하다 (R&D system).
CD32aH 는 PX'Therapeutics 에 의해 생산되었다. CD32b 는 CD32aR 보다 IgG1 에 대한 친화성이 더 낮은 억제제 수용체이다. 이것은 시중에서 입수가능하다 (R&D system).
2.2. 고체 상 선택 (solid phase selection):
고체 상 선택을 위해, PBS / 5 % 탈지 우유 (skim milk)/ 0.1 % Tween 20 에서 희석된 Fc-파아지를, 500ng/웰의 CD16aV, 비오티닐화 CD16aV, 비오티닐화 CD16aF, 비오티닐화 C1q, 비오티닐화 CD32aR 또는 비오티닐화 CD32b 로 앞서 코팅하고 PBS 에서 5 % 탈지 우유로 블록킹한 8 웰의 Maxisorp 플레이트 (1-4x1011 파아지 / 웰, 최종 100 ㎕) 에서 인큐베이션하였다. 2 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션 후, 웰을 PBS/0.1 % Tween 20 으로 8 회, 및 PBS 로 2 회 세정하였다. CD32aR 및 CD32b 상 선별을 위해, 역-선택 라운드를 또한 수행했다: Maxisorp 플레이트 상 고정된 표적 상에서 결합 단계 이전에, Fc-파아지를 경쟁적 수용체를 가진 8 웰 상에서 동일한 방식으로 사전-인큐베이션하였다. 이어서, 제 1 표적에 대해 오직 비결합된 Fc 파아지를 앞서 기재된 바와 같은 제 2 표적을 함유하는 웰로 옮겼다. 선택된 파아지를, 지수 성장 상 (2x150㎕/well, 20 min. 37℃, 교반 없이) 에서 XL1-Blue 박테리아로 감염시켜 용리하였다. 감염된 박테리아를 고체 2YT/암피실린/글루코오스 배지 상에서 확산 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 15% 글리세롤을 가진 2YT 배지에서 재현탁하고,다음 선택 라운드때까지 -80℃ 에서 동결 보관하였다.
2.3. 액체 상 선택:
액체 상 선택을 위해, 4x1011 파아지를 우선 비오티닐화 CD16aV (250 nM), 비오티닐화 CD16aF (1000 nM), 또는 비오티닐화 C1q (250nM) 와 함께 1 시간 동안 주위 온도에서 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다. PBS 중 5% 탈지 우유로 앞서 차단된 스트렙타비딘으로 코팅된 자석 비즈 (Dynal) 를 이어서 30 분 동안 주위 온도에서 파아지에 첨가했다. 파아지-비즈 복합체를, 자석을 이용하여 PBS/0.1% Tween 20 로 10 회 세정했다. 파아지-비즈 복합체를 이용하여, 고체 2YT/암피실린/글루코오스 배지 상에 확산 플레이팅된 지수 성장 중인 5 ml 의 XL1-Blue 박테리아를 감염시켰다. 다음날, 세포를 15% 글리세롤 함유 2YT 배지에서 재현탁하고, 다음 선택 라운드때까지 -80℃ 에서 동결 보관했다.
2.4. 뱅크로부터의 선택:
Mut3　뱅크:
액체 상 선택을 위해, 6 라운드를 3 개의 비오티닐화 표적에 대해서 수행했다: CD16aV, CD16aF 및 C1q (DL6A, DL6B 및 QL6A 로 지칭되는 클론). 고체 상 선택 라운드에 있어서, 6 라운드를 3 개의 표적에 대해 수행했다: CD16aV, 비오티닐화 CD16aV 및 비오티닐화 C1q (DS6A, DS6B 및 QS6A 로 지칭되는 클론).
Mut4sel　뱅크:
선택 라운드를 오로지 고체 상에서 수행했다: 비오티닐화 CD16aV 에 대해 3 선택 라운드, 비오티닐화 C1q 에 대해 3 라운드, 비오티닐화 CD32aR 에 대해서 3 라운드 (제 3 라운드에 있어서 CD32b 상 +/- 결핍) 및 비오티닐화 CD32b 상 3 라운드 (제 3 라운드에 있어서, CD32aR 상 3 +/-), (A3A, G3A, J3A/B 및 K3A/B 로 지칭되는 클론).
Mut5　뱅크:
선택 라운드를, 앞서와 같이 수행했다: 비오티닐화 CD16aF 상에서의 3 회의 선택 라운드, 비오티닐화 C1q 상에서의 3 회의 라운드, 비오티닐화 CD32aR 상에서의 3 회의 라운드, 비오티닐화 CD32b 상에서의 3 회의 라운드, 비오티닐화 CD32aR 상에서의 2 라운드, 및 비오티닐화 CD32b 상에서의 결핍을 갖는 2 회의 라운드 및 비오티닐화 CD32b 상에서의 2 라운드 및 비오티닐화 CD32aR 상에서의 2 개의 결핍 라운드 (클론은 N3A, O3A, P3A, Q3A, P4B 및 Q4B 로 지칭).
이어서, 선택을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.
2.5. pMGM05　벡터에서 풀 클로닝 (Pool cloning):
선택 라운드 후 선택된 클론을 직접 진핵생물 벡터 pMGM05-CD20 (pCEP4 InvitroGen) 내 혼합물 (조건 당 약 104 개의 클론) 에 옮기고, 이때 상기는 항-CD20 항체의 VH 가변 쇄 및 Fc 단편에 대해 pMG58 파아지미드와 동일한 클로닝 부위를 함유했다. 이러한 구축은 Fc 에서 2 개의 아미노산의 돌연변이 (aa224 및 225, HT 가 GS 로 변경) 및 Fc 의 C-말단에서 EFAAA 서열의 첨가를 도모하였으나, 매우 많은 수의 클론의 신속한 테스트를 가능하게 하였다. 이들 돌연변이가 상이한 수용체에 대한 IgG-WT 의 결합을 개질하지 않는다는 점이 초기에 확인되었다. 이후, 양성 대조군이 이 시스템에서 그 확인을 위해 클로닝되었다:
- IgG1-S239D, I332E, Xencor (C1) 에 의한 항-CD19 XmAb5574 항체로부터 유래: CD16a 에 대한 양성 대조군;
- IgG1-G236A, Xencor (C4) 로부터 유래: CD32aH/R 에 대한 양성 대조군;
- IgG1-K326W, E333S, Abgenix/Genentech (C3) 로부터 유래: C1q 에 대한 양성 대조군; 및
- IgG1-S267E, L328F, Xencor (C5) 에 의한 항-CD19 XmAb5574 항체로부터 유래: CD32b 에 대한 양성 대조군.
선택 라운드에 의해 단리된, 약 100 개의 클론의 DNA 를, 콜로니 상 PCR 에 의해 시퀀싱하였다. 생물정보학 분석 후, 새로운 돌연변이를 포함하는 클론을, L1-Blue 박테리아에서 -80℃ 에서 동결하고, 서열을 우리의 데이타베이스에 포함시켰다. 결과로서, 158 개의 클론을 Mut3 뱅크로부터 단리하고, 371 개의 클론을 Mut4sel 뱅크로부터 단리하고, 171 개의 클론을 Mut5 뱅크로부터 단리했다.
2.6. HEK293　세포에서 변이체의 생성:
항-CD20 의 경쇄를, pMGM01-CDC20 (pCEP4 InvitroGen) 로 지칭되는 중쇄에 사용된 벡터와 동일한 pCEP4 벡터에 삽입하였다. 24-웰 플레이트에 배양한 HEK293-F FreestyleTM 세포 (Invitrogen) 를, 표준 절차 (Invitrogen) 에 따라 FreestyleTM MAX 시약 (1 ㎕/ml)과 등몰량 (250 ng/ml) 으로의 벡터 pMGM01-CD20 및 pMGM05-CD20 (Fc-WT 및 변이체) 로 동시트랜스펙션하였다. 세포를 무혈청 배지에서 7 일간의 트랜스펙션 후 현탁 배양하고, IgG 를 함유하는 상청액 (1 ml) 를 10 분 간 100 g 에서 세포의 원심분리 후 수확하였다. 상청액에서 분비된 IgG 를, 재조합체 단백질 L (Pierce) 상, 표준물로서 이용된 293-F 세포에서 생성된 정제된 항-CD20 항체와 함께 이용하여 정량화하였다. 상청액 및 PBS/0.05 % Tween-20 에서 단계 희석된 표준 항체를 0.25 ㎍ 단백질 L/well 로 앞서 코팅하고 PBS 에서 5% 탈지 우유로 블로킹한 Maxisorp 면역플레이트 (Nunc) 상에서 검정하였다. 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션 후, 웰을 3 회 PBS/0.05% Tween-20 으로 세정했다. IgG 변이체의 결합을 염소 항-인간 IgG HRP (γ쇄에 대해 특이적임) (Sigma) 의 F(ab')2 단편으로 검출했다. 생성된 IgG 변이체를 표준 곡선을 이용하여 정량화했다 (1-4㎍ / ml).
2.7. 293-F 세포의 상청액에서 생성된 IgG 변이체에 대한 ELISA 검정:
IgG 변이체를, 인간 C1q 보체 및 몇몇의 인간 FcR 에 대한 그들의 결합에 대해서 ELISA 에 의해 검정하였다. Maxisorp 면역플레이트를 0.5 ㎍ C1q 보체 / 웰, 0.05 ㎍ CD32aH / 웰, 0.2 ㎍ CD16aF / 웰 또는 0.1 ㎍ CD16aV / 웰 (PBS 중) 로 코팅했다. 고정 니켈 킬레이트 플레이트 (Nunc) 를 0.1 ㎍ CD32aR/웰 또는 0.4㎍ CD32b/웰 (0.01 M KCl 중) 로 코팅하였다. 밤새 코팅 후, 4℃ 에서, 플레이트를 PBS/0.05% Tween-20 로 2 회 세정하고, PBS/4% BSA 로 2 시간 동안 37℃ 에서 포화시켰다. 이와 병행하여, 상청액을 PBS 중 희석하여 최종 농도 0.5 ㎍ IgG/ml 를 만들고, 2 시간 동안 주위 온도에서 동일한 농도로 염소 항-인간 IgG HRP 의 F(ab')2 단편과 혼합했다. F(ab')2 에 응집된 IgG 를 이어서 1 시간 동안 30℃ 에서 포화 ELISA 플레이트 상에서 약하게 교반하면서 인큐베이션했으며, C1q, CD16aF, CD32aR 및 CD32b (즉, 0.5 ㎍/ml 에서 IgG) 의 경우 전혀 희석하지 않고, CD16aV 및 CD32aH 의 경우 PBS 에서 0.25 ㎍/ml 로 희석하였다. 이어서, 플레이트를 TMB (Pierce) 로 검출하고, 450 nm 에서 흡광도를 판독하였다.
Mut3 뱅크 상 선택:
이 ELISA 검정을 통해, 파아지 디스플레이에 의해 선택된 변이체를 C1q 보체와의 및 상이한 수용체와의 그 결합에 대해 검정하였다. 이들을, 야생형 Fc (Fc-WT) 및 양성 대조군과 비교하여 검정하였다. CD16aV 및/또는 C1q 상 36 개의 양성 클론을 그에 따라 Mut3 뱅크 상에서 선택하고, Mut4 뱅크를 구축하는데 이용하였다.
Mut4sel 뱅크 상 선택:
371 개의 단리된 클론 상 수행된 ELISA 검정으로, 적어도 하나의 FCγR 에 대해 2 보다 높은 비율을 갖는 116 개의 클론 및 C1q 단독에 대해 3 보다 큰 비율을 갖는 17 개의 클론의 동정이 가능해졌고, 즉 이는 관심 133 개의 클론에 상응한다 (표 1).
표 1: 단리된 133 개의 관심 클론
Figure 112017106127852-pct00002
Figure 112017106127852-pct00003
Figure 112017106127852-pct00004
Figure 112017106127852-pct00005
이들 클론 중에서, 47 개의 개선된 클론을 이용하여 Mut5 뱅크를 구축하였다.
이들 결과로부터, 관심 돌연변이를 축적하기 위해 유도 돌연변이유발로써 18 개의 새로운 변이체를 구축하였다 (표 2).
표 2: 레퍼런스 변이체와 비교되는 구축된 18 개의 새로운 변이체
NA = 결정되지 않음
Figure 112017106127852-pct00006
Figure 112017106127852-pct00007
마지막으로, 이들 151 개의 검정된 변이체로부터, 26 개의 관심 변이체를 더 큰 규모의 생산 및 더 구체적인 연구를 위해 선택하였다 (표 3).
표 3: 26 개의 선택된 새로운 변이체
NA: 결정되지 않음
Figure 112017106127852-pct00008
Mut5 뱅크상 선택:
171 개의 단리된 클론 상에서 수행된 ELISA 어세이는 검정된 FcγR 또는 C1q 보체 중 적어도 하나에 대해 2 보다 높은 비율을 가진 87 개의 클론의 동정을 허용하였다 (표 4).
표 4: 2 보다 높은 비율을 가진 87 개의 클론
Figure 112017106127852-pct00009
Figure 112017106127852-pct00010
Figure 112017106127852-pct00011
Figure 112017106127852-pct00012
이들 변이체 중에서, 10 개의 관심 변이체를 선택했다 (표 5).
표 5: 10 개의 변이체
Figure 112017106127852-pct00013
3. 관심 변이체의 생산 및 정제
IgG 변에체를, pCEP4-WT-H-CD20 에서 직접 돌연변이유발에 의해 수득하였다. IgG 대조군, 즉 C1, C3, C4, C5 및 야생형 (WT) 을, G1m3 동종이형 (G1m1,17 과 비교할 때 3 개의 돌연변이가 포함됨: (K214R/)D356E/L358M) 로 생산하였다.
Mut4sel 뱅크 및 야생형으로부터 유래된 26 개의 IgG 변이체를, G1m1,17 동종이형으로 생성하였다. 이들을, F17 배지에서 293-E 세포 (Freestyle Invitrogen) 의 뱃치 (batch) (250-300 ml) 에서 6-7 일 동안 인큐베이션하여 생성했다.
이어서, 원심분리 및 여과를 수행했다.
정제는, Protein A Hi-Trap 에서 수행하고, 25 mM 시트레이트 버퍼, pH = 3.0 으로 용리하고, TBS 또는 PBS 중 멸균 전 중화 및 투석하였다.
10 mg 의 각 IgG 대조군, 즉, C1, C3, C4, C5 및 야생형 (WTG1m3 및 WTG1m1,17) 을 수득하고, 2 ~ 3 mg 의 26 개의 IgG 변이체.
그 특징분석은, 분자량이 유지되고, 글리코실화 프로파일이 모든 변이체에 있어서 유사하다는 점을 나타낸다.
4. 관심 변이체의 어세이
4.1. FcRn 상 결합 어세이
Jurkat-FcRn 세포를, pH = 6.0 에서, 상이한 농도 (0 내지 1000 ㎍/ml) 의 IgG 변이체 및 Rituximab-Alexa 와 인큐베이션하였다.
유세포분석을, 결합된 Rituximab-Alexa 상에서 수행했다.
그 결과는, 모든 IgG 변이체에 있어서 FcRn 에 대한 결합의 어떠한 손실도 나타내지 않았다.
4.2 항원에 대한 결합 어세이
Raji 세포를, 1 ㎍/ml 로 IgG 변이체와 15 분간 4℃ 에서 인큐베이션하였다.
결합된 IgG 를, PE 항-인간 IgG 2차 항체와의 결합 (15 분 동안 4℃ 에서) 에 의해 검출하였다.
그 결과는, 항원 인지가 Fc 상 상이한 돌연변이에 의해 저하되지 않는다는 점을 나타낸다.
모든 IgG 변이체는 IgG-WT 대조군과 마찬가지로 세포 상 CD20 에 결합하였다.
4.3 CD16aV/F 에 대한 ELISA 결합 어세이
정제된 항체를, 2.6 목록에 기재된 프로토콜과 동일한 프로토콜에 따라 CD16F 및 CD16aV 와의 결합에 대한 ELISA 로 상이한 농도로 항체를 희석하여 검정하였다.
4.4. ADCC 활성 어세이
NK 세포를, 상이한 농도의 IgG 변이체 (0.005 내지 5000 ng/ml) 의 존재 하에서, CD20 을 발현하는 표적 Raji 세포와 함께 인큐베이션하였다.
용해된 표적 세포에 의해 방출된 세포내 LDH 의 수준을 측정하였다.
인간 NK 세포를, Miltenyi 에 의해 개발된 음성 고갈 기술을 이용하여 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 정제하였다. ADCC 어세이는 상이한 농도의 항-CD20 항체의 존재 하에서, CD20 항원을 발현하는 표적 Raji 세포와 NK 세포의 인큐베이션을 포함하였다. 16 시간의 인큐베이션 시간 후, 항-CD20 항체에 의해 유도된 세포독성을, 세포 상청액 내 세포내 락테이트 데히드로게나아제 (LDH) 를 정량함으로써 측정하였다. 특정 세포용해의 결과는, 항체 농도의 함수로서 세포용해 백분율로서 표시된다. EC50 값 (IgG-WT 에 의해 유도된 세포용해 최대치의 50% 를 유도하는 항체 농도) 및 Emax 값 (최대 세포용해 퍼센트) 를, GraphPad PRIS 소프트웨어를 이용하여 산출했다.
그 결과를 표 6 및 7 에 나타낸다.
표 6: ADCC 어세이의 결과
Figure 112017106127852-pct00014
표 7a: ADCC 어세이의 결과
Figure 112017106127852-pct00015
Figure 112017106127852-pct00016
표 7b: ADCC 어세이의 결과
Figure 112017106127852-pct00017
표 7c: ADCC 어세이의 결과 (EC50 대신 EC45)
최상의 변이체는 A3A-184A 및 G3A-103 이다.
4.5. CDC 활성 어세이
CD20 항원을 발현하는 표적 Raji 세포를, 보체 공급원으로서 토끼 혈청 (Cedarlane, 1/10 희석) 의 존재 하에서 상이한 농도의 항-CD20 항체 (0 내지 5000 ng/ml) 와 함께 인큐베이션하였다. 37℃ 에서 1 시간의 인큐베이션 시간 후, 세포용해된 표적 세포에 의해 상청액으로 방출된 LDH 의 수준을, 색체적으로 측정하고 (Roche Applied Sciences 에 의한 세포독성 검출 키트) 항체-매개 보체 의존성 세포 독성을 정량하는데 이용하였다. 그 결과는, 세포용해 % 로서 표시한다. EC50 (50% 최대 세포용해를 유도하는 항체수) 및 Emax (최대 세포용해%) 를, GraphPad PRISM 소프트웨어를 이용하여 산출했다.
그 결과를 표 8 및 9 에 나타낸다.
표 8 : CDC 어세이 결과
Figure 112017106127852-pct00019
표 9a: CDC 어세이 결과
Figure 112017106127852-pct00020
표 9b: CDC 어세이 결과
하기의 표 10 은 서브-그룹으로 분류된 일부 변이체로 수득한 결과를 제공한다.
Figure 112017106127852-pct00022
표 10
하기 표 11 은 본 발명의 일부 가능한 변이체를 제공한다:
Figure 112017106127852-pct00023
표 11
SEQUENCE LISTING <110> LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES <120> FC MUTANTS WITH MODIFIED FUNCTIONAL ACTIVITY <130> BFF140583 <160> 12 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG1 G1m1,17 <400> 1 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG2 <400> 2 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG3 <400> 3 Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG4 <400> 4 Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 5 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG1 G1m3 <400> 5 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG1 G1m1,17 <400> 6 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 7 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG2 <400> 7 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 8 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG3 <400> 8 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 245 250 255 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG4 <400> 9 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 10 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of IgG1 G1m3 <400> 10 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MG_619 <400> 11 agtactgact ctacctagga tcctgcccac cgtgc 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MG_621 <400> 12 actgctcgat gtccgtacta tgcggccgcg aattc 35

Claims (39)

  1. 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고, Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성이 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 적어도 2배의 비율로 증가된 폴리펩티드로서, 상기 Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성이 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 및 이들 활성의 조합 중에서 선택되고, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 1 에서 하기 (1) ~ (20)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 돌연변이 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
    (1) K248E 및 A378V;
    (2) E333G, A378T 및 V397M;
    (3) P396L, N421T 및 A378V;
    (4) P396L 및 N421T;
    (5) G316D, K326E 및 A378V;
    (6) S298N 및 A378V;
    (7) I336T 및 A378V;
    (8) K334N, P352S, V397M 및 A378V;
    (9) N286I, A378V 및 F423Y;
    (10) N315D, N361H 및 P396L;
    (11) A231V 및 A378V;
    (12) A378T, V397M 및 V412M;
    (13) N286Y, P352S 및 A378V;
    (14) K290E, T366A 및 A378V;
    (15) N286I, P396L 및 N421T;
    (16) K334N, P352S 및 V397M;
    (17) V308A, K334R, A378V 및 K447N;
    (18) K248E, K334R 및 A378V;
    (19) K326T;
    (20) T359A, S383R 및 V397M,
    (넘버링은 EU Index의 넘버링임).
  2. 제 1 항에 있어서, Fc 영역에 의해 매개되는 기능적 활성이 부모 폴리펩티드의 것과 비교시 5 배 초과, 또는 10 배 초과, 또는 15 배 초과, 또는 20 배 초과, 또는 25 배 초과, 또는 30 배 초과의 비율로 증가된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이된 Fc 영역이 C1q 보체 및 FcgRIIIa (CD16a) 수용체 중에서 선택된 Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해 개선된 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이된 Fc 영역이 부모 폴리펩티드와 비교시 2 내지 10 개의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 단리된 Fc 영역, 단리된 Fc 영역으로부터 유래된 서열, 항체, 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, Fc 영역으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서, 트랜스제닉 동물의 우유에서 생성된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물의 정제된 폴리펩티드가 그들의 Asn297 글리코실화 부위 상에서, 65% 미만, 또는 50% 미만, 또는 40% 미만의 푸코실화율을 가진 N-글리칸을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물의 정제된 폴리펩티드가 그들의 Asn297 글리코실화 부위 상에서, 비개재적 말단 만노오스 및/또는 말단 N-아세틸글루코사민을 갖는, 단쇄 및 낮은 시알릴화를 수반하는 바이안테너리 유형의 글리칸 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물의 정제된 폴리펩티드는 G0+G1+G0F+G1F 형태에 대해 60% 초과의 함량을 갖고, G0F+G1F 형태는 50% 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물의 정제된 폴리펩티드는 G0+G1+G0F+G1F 형태에 대해 60 % 초과의 함량을 갖고, 푸코오스 함량은 65% 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물의 정제된 폴리펩티드는 G1F+G0F 형태에 대해 40 % 미만의 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. (i) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드로서, 정제된 폴리펩티드가 그들의 Asn297 글리코실화 부위 상에서, 65% 미만, 또는 50% 미만, 또는 40% 미만의 푸코실화율을 가진 N-글리칸을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 및 (ii) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품으로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
  16. 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균류 항원, 독소, 막-결합 또는 순환 사이토킨 및 막 수용체 중에서 선택된 항원에 대항하여 지시되는 제 7 항에 기재된 항체.
  17. 제 16 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, 종양 항원에 대항하여 지시되는 항체.
  18. 제 16 항에 있어서, 바이러스 감염 치료에 사용하기 위한, 바이러스 항원에 대항하여 지시되는 항체.
  19. 제 16 항에 있어서, 박테리아 감염 치료에 사용하기 위한, 박테리아 독소에 대항하여 지시되는 항체.
  20. 제 16 항에 있어서, 염증 및/또는 자가면역 질환 치료에 사용하기 위한, 사이토킨에 대항하여 지시되는 항체.
  21. 제 9 항에 있어서, 의약품으로서 사용하기 위한 조성물.
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