FR3064007A1

FR3064007A1 - Anticorps pour le traitement de cancers

Info

Publication number: FR3064007A1
Application number: FR1752285A
Authority: FR
Inventors: Céline MONNET
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2018-09-21
Also published as: EP3601342A1; WO2018172286A1; US20200087394A1

Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre au moins un ligand d'un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc mutée par rapport à celle d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent.

Description

Titulaire(s) : LABORATOIRE FRANÇAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES Société anonyme.

Demande(s) d’extension

Mandataire(s) : LAVOIX.

TV ANTICORPS POUR LE TRAITEMENT DE CANCERS.

FR 3 064 007 - A1

Anticorps pour le traitement de cancers

La présente invention concerne l’immunothérapie de cancers.

Arrière-plan technologique de l’invention

L’immunothérapie, thérapie consistant à administrer à des patients des anticorps exogènes, est aujourd’hui largement utilisée pour le traitement de diverses pathologies, notamment des cancers.

Au cours des dernières années, les connaissances concernant la biologie et l’immunologie des cancers n’ont cessé d’évoluer. Il est désormais reconnu que le système immunitaire est impliqué dans les réponses anti-tumorales notamment par reconnaissance des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires. Cette reconnaissance peut avoir pour conséquence un contrôle, voire une élimination tumorale. Cependant, les cellules effectrices de l’immunité possèdent à leur surface des récepteurs appelés points de contrôle immunitaires. Ces récepteurs ont pour but de moduler (inhiber ou activer) la réponse immunitaire notamment, pour maintenir la tolérance du soi. Il est à présent connu que les cellules cancéreuses empruntent ce mécanisme d’échappement pour résister au système immunitaire, notamment en exprimant à leur surface des ligands des récepteurs desdits points de contrôle immunitaires qui entraîneront une inhibition de la réponse de la cellule effectrice immunitaire lors de leur reconnaissance par celle-ci (Pardoll et al., Nat. Rev. Cancer. 12:252-264 (2012)). Une nouvelle approche de l’immunothérapie contre les cancers est alors née pour contre-attaquer ce phénomène d’échappement immunitaire en rétablissant la réponse immunitaire et donc le rejet tumoral. Ainsi, depuis quelques années, des anticorps dirigés contre ces points de contrôle immunitaires sont développés. Les principaux anticorps commercialisés ou en développement visent :

- Cytotoxic T-Lymphocyte Associated antigen 4 (CTLA4) : cela est le cas de l’Ipilimumab (Yervoy®, Bristol Myers Squibb). Cet anticorps monoclonal entraîne le blocage du récepteur CTLA4, point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d’autres termes, l’Ipilimumab bloque la voie d’échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d’inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur CTLA4. Une étude clinique a permis de mettre en évidence pour la première fois que des patients atteints de mélanomes métastatiques traités avec un anticorps anti-CTLA4 (Ipilimumab), voient leur durée de vie augmentée (Hodi et al., N Engl. J. Med.,

363 :711-723 (2010) et 363 :1290 (2010) (erratum) ; Robert et al., N Engl. J. Med.,364 :2517-2526 (2011)) ;

- Programmée! Cell Death Protein 1 (PD1): cela est le cas du Nivolumab (Opdivo®, Bristol Myers Squibb) et du Pembrolizumab (Keytruda®, Merck). Cet anticorps monoclonal entraîne le blocage du récepteur PD1, point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d’autres termes, le Nivolumab bloque la voie d’échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d’inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur PD1. Le Nivolumab semble notamment présenter une activité antitumorale chez des patients dans le cas de carcinomes à cellules rénales métastatiques (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13) : 14301437 (2014)) ; ou

- Lymphocyte Activation Gene 3 (LAG3) (e.g., BMS-986016). LAG3 est un point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T. C’est aujourd’hui la cible de développement d’inhibiteurs, notamment d’anticorps monoclonaux. De façon similaire à CTLA4 et PD1, le blocage de ce récepteur permettrait ainsi de bloquer son effet inhibiteur de la réponse des cellules effectrices, et ainsi activer la réponse immunitaire.

Plus récemment, des anticorps dirigés contre des ligands de points de contrôle immunitaires ont été développés. Les principaux anticorps commercialisés ou en développement visent le ligand de PD1 (Programmed Cell Death Protein 1) présent sur les cellules présentatrices d’antigène, et les cellules tumorales. Par exemple, Atezolizumab/Tecentriq (Genentech/Roche) est un anticorps anti-PDL1 et a été approuvé en mai 2016 pour le traitement de patients ayant développé un cancer de la vessie. Cet anticorps est un lgG1 modifié pour être aglycosylé, sans activités effectrices. Néanmoins à ce jour, une majorité de patients ne répond pas ou peu à ces traitements par anticorps anti-ligand de points de contrôle. De plus, certains patients font face à des réactions de toxicité dans l’organisme après administration du traitement. Il a été par exemple observé chez certains patients, que les anticorps anti-PDL1 induisent des auto-anticorps chez le patient, liés à l’apparition de problèmes par exemple cutanés et hépatiques. Enfin, il a été observé que certains patients deviennent résistants au traitement.

Il existe aujourd’hui un besoin d’optimiser les approches d’immunothérapie utilisées pour bloquer ces points de contrôle immunitaire, ceci notamment pour obtenir un effet clinique plus efficace et/ou moins toxique. En particulier, il existe un besoin d’obtenir des anticorps dirigés contre un ligand de point de contrôle immunitaire, possédant des propriétés effectrices améliorées, et présentant avantageusement une demi-vie améliorée dans l’organisme permettant un effet prolongé anti-tumoral, tout en étant bien tolérés par l’organisme. Notamment, de tels anticorps à demi-vie améliorée peuvent être avantageusement administrés en plus faible dose, avec la même efficacité ou une efficacité supérieure, ce qui permet de limiter les effets secondaires observés chez certains patients.

Résumé de l’invention

La présente invention se rapporte ainsi à un anticorps dirigé contre au moins un ligand d’un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d’un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent. Un tel anticorps est appelé aussi « anticorps anti-ligand >>. Il est adapté pour une utilisation dans le traitement d’un cancer.

L’invention se rapporte également à une composition d’anticorps anti-ligand, ainsi qu’à une composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l’invention (anti-point de contrôle immunitaire ou anti-ligand). Ladite composition peut convenir pour une utilisation dans le traitement de cancers.

La présente invention se rapporte également à des produits contenant :

a) un anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, ou une composition d’anticorps dirigés contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, et

b) un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d’un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, ledit point de contrôle immunitaire étant choisi parmi PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 eta2AR, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers.

L’invention concerne encore :

un anticorps anti-point de contrôle immunitaire pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers en combinaison avec un anticorps anti-ligand ou une composition d’anticorps anti-ligand; et un anticorps anti-ligand ou une composition d’anticorps anti-ligand, pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers en combinaison avec un anticorps anti-point de contrôle immunitaire.

Légende des figures

La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgGI humaine native se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'lgG2 humaine (SEQ ID NO: 7), lgG3 humaine (SEQ ID NO: 8) et lgG4 humaine (SEQ ID NO: 9). Les séquences d'IgGI se réfèrent à l’allotype G1m1,17 (SEQ ID NO: 6) et à l’allotype G1m3 (SEQ ID NO: 10). Le domaine charnière inférieure CH2-CH3 d’IgGI commence à la cystéine 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique.

La figure 2 montre la structure glycannique des formes GO, G0F, G1 et G1 F.

La figure 3 montre les vecteurs d’expression contenant la chaîne lourde (CH) de l’antiPDL1 muté sur le fragment Fc, et la chaîne légère (CL) non modifiée de l’anticorps antiPDL1 considéré. La figure 3A illustre les vecteurs IGG1AV-WT et IGG1D-WT, tandis que la figure 3B illustre les vecteurs IGG1A-WT et pCEP4.

« IGG1AV-WT >> correspond au vecteur d’expression codant pour l’avelumab ; « IGG1DWT >> correspond au vecteur d’expression codant pour le durvalumab ; et « IGG1A-WT >> correspond au vecteur d’expression codant pour l’atezolizumab.

Description détaillée

Caractéristique des anticorps

La présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire (anticorps anti-ligand), possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d’un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent.

L’anticorps anti-ligand de point de contrôle immunitaire permet la liaison à la cellule cible tumorale. Par exemple, en se liant au ligand présent sur les cellules tumorales (par exemple PD-L1), il permet le recrutement, via la région Fc mutée (qui présente une fonction effectrice), de cellules immunitaires effectrices. Cela aboutit à une cytotoxicité directe sur les cellules tumorales.

La présente invention se rapporte de préférence à un anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, ledit anticorps possédant une région Fc mutée par rapport à celle d’un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent, ladite région Fc mutée comprenant au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421 T, 434Y et 434S ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R,

230S, 230T, 230L, 231V, 234P, 241 L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T,

248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N,

267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T,

288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P,

312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V,

333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A

352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T,

379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S,

423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431 T, 434K, 434Y, 434S, 435R,

436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).

Selon un premier mode de réalisation, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).

Selon le paragraphe précédent, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention peut également comprendre une mutation additionnelle choisie parmi 361 D, 428L, 307A, 382V, 259I, 256N et 383N.

Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend les combinaisons de mutations choisies parmi N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y, N315D/N361D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428L/N434Y,

T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y, V259I/N315D/N434Y et

T256N/A378V/S383N/N434Y.

Selon un second mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, ledit anticorps possédant une région Fc mutée par rapport à celle d’un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent, ladite région Fc mutée comprenant au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421T ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I,

243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S,

349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T,

378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41 OR, 412M, 414R, 421T,

421 S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431 T, 434K, 434S, 435R,

Plus préférentiellement selon ce second mode, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 326E, 397M, 334N, 396L, 434Y et 434S ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 316D, 330V, 362V, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y, 298N, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).

Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 378V, 326E, 397M, 334N et 396L ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y et 298N, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).

Selon le paragraphe précédent, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention peut également comprendre une mutation additionnelle choisie parmi 333G, 352S, 423Y, 315D, 412M et 366A.

Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend les combinaisons de mutations choisies parmi 248E/378V, 333G/378T/397M,

396L/421T/378V, 396L/421T, 316D/326E/378V, 298N/378V, 336T/378V,

334N/352S/397M/378V, 286I/378V/423Y, 315D/361H/396L, 231V/378V,

378T/397M/412M, 286Y/352S/378V, 290E/366A/378V, 286I/396L/421T et

334N/352S/397M.

De préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations selon le premier mode de réalisation, et au moins une combinaison selon le second mode de réalisation.

Ainsi, de préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y et N315D/N361D/A378V/N434Y, ainsi qu’une combinaison de mutations choisie parmi 248E/378V, 333G/378T/397M, 396L/421T/378V, 396L/421T, 316D/326E/378V, 298N/378V, 336T/378V, 334N/352S/397M/378V, 286I/378V/423Y, 315D/361H/396L, 231V/378V, 378T/397M/412M, 286Y/352S/378V, 290E/366A/378V, 286I/396L/421T et 334N/352S/397M.

Alternativement, de préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y et

N315D/N361D/A378V/N434Y, ainsi que l’une des mutations suivantes : V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R ou V302R.

Par « anticorps >> on entend un tétramère fait de deux chaînes lourdes de 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d’environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light) liées par des ponts disulfures infra et intercaténaires et identiques entre elles. Ce tétramère comprend au moins deux régions variables à l’extrémité N-terminale de chaque chaîne (dites VL pour les chaînes légères et VH pour les chaînes lourdes) et une région constante en extrémité C-terminale dite Fc, constituée d’un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines pour la chaîne lourde appelés CH1, CH2, CH3 et éventuellement CH4.

Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures au niveau des CH2 et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure entre le CH1 et le CL. La région qui détermine la spécificité de l’anticorps pour l’antigène est portée par les parties variables, ce sont ces parties qui sont responsables de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une Région Déterminant la Complémentarité (ou CDR). Quant aux parties constantes, elles se lient de préférence aux récepteurs Fc (FcR) des cellules effectrices. L’assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où

- la base du Y correspond à la région constante Fc, ou fragment Fc : elle est reconnue par les récepteurs Fc afin de médier les fonctions effectrices de l’anticorps, et

- les extrémités des bras du Y correspondent à l’assemblage respectif de la région variable d’une chaîne légère et de la région variable d’une chaîne lourde, lesdites extrémités constituant la région Fab et déterminant la spécificité de l’anticorps pour l’antigène.

Il existe cinq types de chaînes lourdes (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), qui déterminent les classes d'immunoglobulines (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Le groupe de la chaîne légère comprend deux sous-types, lambda et kappa. Les chaînes légères kappa et lambda sont partagées par toutes les classes et sous-classes. Chez l’homme, la proportion de kappa et lambda produite se situe dans un rapport de 2 pour 1.

Les IgG sont les immunoglobulines les plus abondantes dans le sérum (75-80% Des anticorps circulants). Elles sont présentes sous forme de monomères et présentent une demi-vie de 21 jours.

Il existe quatre types de chaînes lourdes gamma, ce qui détermine quatre sous-classes d’IgG (lgG1 pour gammal, lgG2 pour gamma2, lgG3 pour gamma3 et lgG4 pour gamma4). Ces quatre sous-classes diffèrent par des nombres et des positions variables des ponts disulfures (Basic and Clinical Immunology, 8ème édition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 et Chapitre 6).

Les quatre sous-classes des IgG humaines se distinguent également au niveau de leur activité biologique, malgré des structures très homologues (plus de 95% d’homologie de séquence pour les régions Fc).

Les anticorps comprennent notamment les immunoglobulines pleine longueur, les anticorps monoclonaux, les anticorps multi-spécifiques, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps entièrement humains.

Le terme Fc ou région Fc ou fragment Fc désigne la région constante d'un anticorps de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (CH1-CL). Ainsi Fc fait référence aux deux derniers domaines (CH2 et CH3) de région constante d'IgG, et à la charnière flexible N-terminale de ces domaines. Pour une lgG1 humaine, la région Fc comprend les domaines CH2 et CH3 ainsi que la région charnière inférieure entre CH1 et CH2. Ainsi, la région Fc correspond au résidu C226 jusqu’à son extrémité carboxy-terminale, soit les résidus de la position 226 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat. Les domaines analogues pour d’autres sous-classes d’IgG peuvent être déterminés à partir de l’alignement des séquences d’acides aminés des chaînes lourdes ou des fragments de chaînes lourdes des sous-classes d’IgG avec elle d’une lgG1 humaine (voir figure 1). La région Fc utilisée peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, située entre les positions 216 à 226 selon l’index EU ou équivalent dans Kabat ; dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, la région Fc utilisée est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, la région Fc de l’anticorps parent a pour séquence SEQ ID NO : 1. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal.

Les séquences représentées en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la région Fc de l’anticorps parent est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10.

De préférence, la région Fc de l’anticorps parent a une séquence correspondant aux positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 11232 de la séquence SEQ ID NO : 6.

Par « fragment Fv >> on désigne le plus petit fragment gardant les propriétés de liaison que possède l'anticorps. Il est en effet constitué uniquement des régions variables de chaîne légère VL et de chaîne lourde VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet.

Par « position >> on entend une position dans la séquence d’acides aminés. Pour la région Fc, les positions sont numérotées selon l'indice de l'UE ou équivalent dans Kabat.

Par « acide aminé » ou « résidu » on entend l’un des 20 acides aminés naturels ou des analogues naturels.

Les termes « points de contrôle immunitaires >> se réfèrent à des récepteurs situés en surface des cellules effectrices de l’immunité capables d’inhiber (points de contrôle immunitaires inhibiteurs) ou de stimuler la réponse immunitaire (points de contrôle immunitaires activateurs) après engagement avec leurs ligands.

Le point de contrôle immunitaire est de préférence choisi parmi GITR, 0X40, PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR.

Par « récepteur activateur >> on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d’une voie de signalisation conduisant à l’activation de la réponse immunitaire. Le point de contrôle immunitaire activateur est choisi de préférence parmi GITR et 0X40.

GITR, également appelé tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 (TNFRSF18) ou activation-inducible TNFR family receptor (AITR), est une protéine dont l’expression est accrue lorsque les cellules T sont activées.

0X40, également appelé CD134 ou Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4), est une protéine qui n’est pas exprimée de façon constitutive sur les cellules T naïves. Elle est exprimée lorsque ces dernières sont activées. Son ligand OX40L, est de même exprimé sur les cellules présentatrices d’antigène activées.

Par « récepteur inhibiteur >> on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d’une voie de signalisation conduisant à l’inactivation de la réponse immunitaire.

De préférence, le point de contrôle immunitaire est inhibiteur. Plus préférentiellement, il est choisi parmi PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR.

PD1 (Programmed cell Death factor 1) est un récepteur inhibiteur de la famille CD28 exprimé à la surface des lymphocytes T et B activés et des Natural Killer. Son rôle est de limiter l’activité des cellules effectrices dans les tissus lymphoïdes secondaires ou les tumeurs, lui conférant ainsi un mécanisme de résistance tumorale important. PD1 inhibe les fonctions lymphocytaires lorsqu’il est engagé avec un de ses ligands, PDL1 (ou B7-H1 ou CD274) ou PDL2. PDL1 est une molécule exprimée à la surface des cellules tumorales. En cas d’exposition chronique au ligand PDL1 (par exemple dans le cas de cancers), l’expression de PD1 à la surface des cellules effectrices est augmentée, ce qui entraîne alors un phénomène d’anergie. Les anticorps anti-PD1 sont utilisés dans le traitement de cancers tels que les cancers du poumon, les cancers du poumon « non à petites cellules >> (NSCLC), les mésothéliomes, les cancers de la vessie, les cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, les cancers de la vessie, les cancers du sein, les cancers de la tête et du cou, les cancers des testicules, les cancers de l’endomètre, les cancers de l’œsophage, les cancers du thymus, les cancers hématologiques, les cancers hématologiques avancés tels que les lymphomes nonhodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës, les tumeurs du cerveau, les glioblastomes, les tumeurs solides, les adénocarcinomes gastriques, les tumeurs des cellules germinales, les carcinomes hépatocellulaires, les mélanomes, les mélanomes métastatiques, les lymphomes, les lymphomes diffus à grandes cellules B (LDGCB), les lymphomes folliculaires les mélanomes non résécable ou métastatiques ou encore les carcinomes de cellules rénales avancés.

CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) est un récepteur inhibiteur exprimé uniquement à la surface des lymphocytes T. Son rôle est de réguler les premières étapes d’activation des lymphocytes T. En effet, 48 heures après activation des lymphocytes T par l’intermédiaire de leur récepteur (TCR ou T Cell Receptor), CTLA4 s’engage avec ses ligands (CD80 ou CD86) qui sont exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (CPA) au niveau des ganglions lymphatiques et parfois des tumeurs. Ceci entraîne une cascade de signalisation conduisant à l’inhibition des lymphocytes T. Les anticorps anti-CTLA4 sont utilisés dans le traitement de cancers tels que le cancer du poumon, les cancers du poumon « à non petites cellules >> (NSCLC), les carcinomes du poumon à petites cellules, les cancers du sein, les cancers du pancréas, les cancers de la prostate, les cancers gastriques, les cancers du rein, les cancers du cou et de la tête, les cancers du foie, les mélanomes métastatiques ou non résécables, les mélanomes cutanés avec atteinte des ganglions lymphatiques, les carcinomes rénaux, les myélomes, les lymphomes, les carcinomes hépatocellulaires, les métastases cérébrales, les tumeurs solides, mésothéliomes, les lymphomes ou encore les mélanomes.

TIM3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) est un récepteur exprimé en surface des lymphocytes T sécréteurs d’IFN y. Un de ses ligands est la galectine-9, qui est une protéine surexprimée dans les cellules tumorales. L’engagement de TIM3 avec la galectine-9 conduit à une inhibition de la réponse immunitaire.

LAG3 (lymphocyte activation gene 3) aussi nommée CD223 est une molécule exprimée en surface des lymphocytes T. Son seul ligand connu est le Complexe Majeur d’Histocompatibilité de type II (CMH II) qui peut être surexprimé dans certains cancers mais aussi par les cellules présentatrices d’antigène (CPA) (macrophages et cellules dendritiques) infiltrées au niveau des tumeurs. L’engagement de LAG3 avec son récepteur entraîne un phénomène d’anergie.

KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptor) est une molécule exprimée en surface des Natural Killers, des lymphocytes T et des CPA. Lorsque KIR se lie à son ligand, le CMH de type I (CMH I), la réponse effectrice des Natural Killers est atténuée au niveau des tumeurs.

BTLA1 (B and T lymphocyte attenuator), aussi appelé CD272, est une molécule exprimée en surface des lymphocytes. Son ligand, la molécule HVEM (herpesvirus entry mediator), est exprimé dans certains types de tumeurs (notamment dans le cas des mélanomes).

Les a2AR sont exprimés dans différents types de cellules effectrices de l’immunité, notamment dans les lymphocytes T, ainsi que dans les cellules endothéliales. Lorsque l’a2AR se lie à son ligand, l’adénosine (qui s’accumule dans les tumeurs), les cellules CD4+ expriment FOXP3 et se différentient ainsi en cellules T régulatrices, ce qui a pour conséquence d’inhiber la réponse immunitaire.

De préférence, le ligand du point de contrôle immunitaire est choisi parmi OX40L, PDL1, PDL2, CD80, CD86, la galectine-9, le CMH II, le CMH I, HVEM et l’adénosine.

Plus préférentiellement, le point de contrôle immunitaire est choisi parmi PD1 et CTLA4. Plus préférentiellement, le point de contrôle immunitaire est PD1. Ainsi, préférentiellement, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l’invention est un anticorps anti-PD1 ou anti-CTLA4. Plus préférentiellement, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l’invention est un anticorps anti-PD1.

De préférence, le ligand est choisi parmi PDL1, PDL2, CD80 et CD86. De préférence, le ligand est PDL1 ou PDL2, préférentiellement PDL1. Ainsi, préférentiellement, l’anticorps anti-ligand selon l’invention est un anticorps anti-PDL1, anti-PDL2, anti-CD80 ou antiCD86. De préférence, l’anticorps anti-ligand selon l’invention est un anticorps anti-PDL1.

L’anticorps anti-PDL1 selon l’invention peut comprendre une région variable correspondant à la séquence d’un fragment Fv d’un anticorps anti-PDL1 connu, par exemple l’anticorps atezolizumab, l’anticorps durvalumab, ou l’anticorps avelumab. Ainsi, l’anticorps anti-PDL1 selon l’invention peut comprendre une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l’anticorps atezolizumab, de l’anticorps durvalumab, ou de l’anticorps avelumab.

Les séquences sont les suivantes :

- les séquences VH et VL de l’anticorps atezolizumab sont les séquences SEQ ID NO :11 et 12 respectivement ;

- les séquences VH et VL de l’anticorps durvalumab sont les séquences SEQ ID NO :13 et 14 respectivement ; et

- les séquences VH et VL de l’anticorps avelumab sont les séquences SEQ ID NO :15 et 16 respectivement.

Ainsi, de préférence, l’anticorps anti-PDL1 selon l’invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :11 et un VL de séquence SEQ ID NO :12.

Alternativement, de préférence, l’anticorps anti-PDL1 selon l’invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :13 et un VL de séquence SEQ ID NO :14.

Alternativement, de préférence, l’anticorps anti-PDL1 selon l’invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :15 et un VL de séquence SEQ ID NO :16.

Le terme « anticorps parent >> est utilisé pour définir l’anticorps de référence qui peut être d’origine naturelle ou synthétique. Dans le contexte de la présente invention, l’anticorps parent comprend une région Fc dite « région Fc parente >>. Ladite région Fc parente est choisie parmi le groupe de régions Fc de type sauvage et leurs fragments. Par « type sauvage >> ou WT (pour « wild-type >>), on entend ici une séquence d'acides aminés ou une séquence nucléotidique que l'on trouve dans la nature c'est à dire qui est d'origine naturelle, y compris des variations alléliques, et qui n'a pas été intentionnellement modifiée par des techniques de biologie moléculaire telles que par mutagenèse. Par exemple, les régions Fc de « type sauvage >> se réfèrent notamment à la région Fc de l'IgGI ayant la séquence SEQ ID NO :1 (allotype G1m1,17), la région Fc d'lgG2 ayant la séquence SEQ ID NO : 3, la région Fc d'lgG3 ayant la séquence SEQ ID NO : 4, la région Fc d'lgG4 ayant la séquence SEQ ID NO : 5, et la région Fc d'IgGI ayant la séquence SEQ ID NO :1 (allotype G1m3). Les régions Fc de « type sauvage >> se réfèrent également aux régions Fc correspondant aux séquences SEQ ID NO : 6 à SEQ ID NO : 10. De préférence, l’anticorps parent comprend une région Fc parente qui est une région Fc humaine, de préférence une région Fc d’une lgG1 humaine ou d’une lgG2 humaine. L’anticorps parent peut également comprendre des modifications d'acides aminés préexistantes dans la région Fc (par exemple un mutant Fc) par rapport à des régions Fc de type sauvage.

Par « cellules effectrices immunitaires >>, on entend les cellules qui effectuent le mécanisme immunitaire et expriment un récepteur Fc (FcR). Sont considérées notamment comme cellules effectrices les lymphocytes dont les cellules Natural Killer (NK), les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les mastocytes, les cellules dendritiques dont les cellules de Langerhans et les plaquettes.

Par « mutation >> on entend un changement d’au moins un acide aminé de la séquence d’un polypeptide, notamment un changement d’au moins un acide aminé dans la région Fc de l’anticorps parent. L’anticorps obtenu comprend alors une région Fc mutée par rapport à celle de l’anticorps parent. De préférence, la mutation est une substitution, une insertion ou une délétion d’au moins un acide aminé à une position particulière. Les régions Fc mutées peuvent présenter plusieurs mutations, touchant plusieurs acides aminés, de préférence de deux à dix.

Par «substitution», on entend le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé à une position particulière dans une séquence de l’anticorps parent. Par exemple, la substitution 434S se réfère à un anticorps variant (ou mutant), en l’occurrence un variant pour lequel un acide aminé à la position 434 est remplacé par la sérine. De préférence, le libellé suivant de mutation est utilisé: « 434S >> ou « N434S >>, et signifie que l’anticorps parent comprend l'asparagine en position 434, qui est remplacé par la sérine dans le variant. Dans le cas d'une combinaison de substitutions, le format préféré est le suivant: « 2591/315D/434Y >> ou « V259I/N315D/N434Y >>. Cela signifie qu'il existe trois substitutions dans le variant, en positions 259, 315 et 434, et que l'acide aminé en position 259 de l’anticorps parent, à savoir la valine, est remplacé par l'isoleucine, que l'acide aminé en position 315 de l’anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par l'acide aspartique et que l'acide aminé en position 434 de l’anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par la tyrosine.

Par «délétion d'acides aminés» ou «délétion», on entend la suppression d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l’anticorps parent. Par exemple, E294del ou 294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294.

Par « insertion d'acide aminé » ou « insertion », on entend l'addition d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l’anticorps parent. Par exemple, l’insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236.

Un variant Fc muté selon l’invention peut être généré par toute méthode de mutagenèse bien connue. Par exemple, par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l’acide aminé souhaité. Alternativement, la synthèse de novo de gènes contenant la séquence nucléotidique comprenant les mutations d’intérêt, peut être utilisée.

Tout au long de la présente demande, la numérotation des résidus dans la région Fc est celle de la chaîne lourde d'immunoglobuline selon l'index EU ou équivalent dans Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e éd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, dans le Maryland, 1991). L’expression «index EU ou équivalent dans Kabat» fait référence à la numérotation EU des résidus de l'anticorps humain lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Cela est illustré sur le site IMGT (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).

L’affinité de la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) est augmentée par rapport à celle de l’anticorps parent.

De préférence, cette affinité est améliorée par rapport à celle de l’anticorps parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.

Par « affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) >>, on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l’invention pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) par rapport à l’anticorps parent. Le récepteur FcgRIIIa (CD16a) est impliqué dans l’ADCC et présente un polymorphisme V/F en position 158.

De préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention présente en outre une affinité modifiée par rapport à celle de l’anticorps parent, pour au moins l’un des récepteurs suivants : le complément C1q, FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b). Le complément C1q est impliqué dans l’activité de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Le récepteur FcgRIla (CD32a) est, quant à lui, impliqué dans l’activation plaquettaire et la phagocytose ; il présente un polymorphisme H/R en position 131.

De préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention présente une affinité augmentée par rapport à celle de l’anticorps parent, pour au moins l’un des récepteurs suivants : le complément C1q, FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b). Par « affinité augmentée >> pour un récepteur, on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l’invention pour ledit récepteur par rapport à l’anticorps parent. Dans ce cas, cette affinité est améliorée par rapport à celle de l’anticorps parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.

De préférence, la région Fc mutée de l’anticorps selon l’invention présente en outre une affinité pour le complément C1q augmentée par rapport à celle de l’anticorps parent. Ainsi, de préférence, l’anticorps selon l’invention présente une activité CDC augmentée par rapport à celle de l’anticorps parent.

L'affinité d’un anticorps pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l’affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR). Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté. Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés.

La présente invention se rapporte également à une composition comprenant des anticorps dirigés contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d’un anticorps parent, et ayant une affinité améliorée pour CD16a et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent, dans laquelle lesdits fragments Fc modifiés possèdent sur leur site de glycosylation des N-glycannes, lesdits N-glycannes présentant un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%. Cette composition est appelée « composition selon l’invention >>.

Par taux de fucosylation, on entend le ratio de N-glycannes présents sur les fragments Fc présentant un résidu fucose, par rapport à la quantité totale de N-glycannes des fragments Fc au sein d’une composition d’anticorps.

De manière préférentielle, ladite composition d’anticorps comprend un seul type d’anticorps comprenant une région Fc mutée. En d’autres termes, la composition comprend alors des molécules d’anticorps de séquence identique.

De préférence, la composition d’anticorps selon l’invention est faiblement fucosylée. Par « faiblement fucosylée >> on entend une composition qui comprend des anticorps dont les fragments Fc présentent sur leur site de glycosylation (Asn 297) des N-glycannes présentant un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%. Lesdits Nglycannes présentent de préférence des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes et une faible sialylation. De préférence, la structure glycannique présente des GIcNAc (N-Acétylglucosamine) terminaux non intercalaires. De préférence, la structure glycannique est choisie parmi les formes G0, G0F, G1 et G1F telles que montrées en Figure 2.

Ainsi, de préférence, lesdits N-glycannes présentent des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des GIcNAc terminaux non intercalaires. Plus particulièrement, la composition d’anticorps présente une teneur en acide sialique inférieure à 25%, 20%, 15%, ou 10%, de préférence 5%, 4% 3% ou 2%. Par taux de sialylation, on entend le ratio de N-glycannes présents sur les fragments Fc présentant un résidu d’acide sialique, par rapport à la quantité totale de N-glycannes des fragments Fc au sein d’une composition d’anticorps.

Une composition d’anticorps préférée selon l’invention comprend une teneur supérieure à 60%, de préférence supérieure à 80% pour les formes GO + G1 + G0F + G1F, étant entendu que la teneur des formes G0F + G1F est inférieure à 50%, de préférence inférieure à 40%, de préférence inférieure à 30%. De préférence, les N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1+G0F+G1 F, la teneur en fucose étant inférieure à 65%.

Les anticorps dirigés contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire selon l’invention peuvent être préparés par tout procédé bien connu de l'art antérieur. Une fois leurs acides nucléiques codants obtenus, les anticorps selon l’invention peuvent être préparés par tout procédé connu dans la technique.

Dans un mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être clonées dans des cellules-hôtes puis exprimées. Les séquences nucléiques peuvent également être incorporées dans un vecteur d'expression. Une large variété de lignées de cellules-hôtes appropriées peut être utilisée, y compris, mais sans s'y limiter, des cellules de mammifères, des bactéries, des cellules d'insectes et des levures.

Les cellules-hôtes peuvent être, mais à titre non limitatif, les cellules YB2/0 (ATCC, CRL1662), SP2/0, YE2/0, PERC6, des lignées cellulaires CHO, en particulier CHO-K-1, CHOS, CHO-LecIO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil- 2, Jurkat, Vero, COS-7, HEK en particulier 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5 ou UACC-812. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l’anticorps est exprimé dans la cellule YB2/0.

Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d’organisme transgénique non humain, notamment des cellules d’animaux transgéniques modifiés pour produire l’anticorps dans le lait, ou bien encore des cellules de plantes transgéniques modifiées pour produire l’anticorps. Dans le cas de cellules d’animaux transgéniques modifiés pour produire l’anticorps dans le lait, l’expression de séquences d’ADN codant pour l’anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire selon l’invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et les séquences d’ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L’animal peut par exemple être choisi parmi le mouton, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.

Selon ce mode de réalisation, de préférence, des lgG1 entières anti-PDL1 mutées selon l’invention peuvent être générées par production dans le lait d’un animal transgénique, par exemple une chèvre transgénique, et purification par extraction du lait. Pour cela, la séquence codante de la chaîne lourde et la séquence codante de la chaîne légère sont préparées dans un vecteur d’expression sous contrôle d’un promoteur spécifique des glandes mammaires, par exemple un promoteur de caséine de mammifère, permettant de diriger la production et la sécrétion de l’anticorps dans le lait des glandes mammaires. Un tel procédé est notamment décrit dans la demande EP0741515.

La présente invention se rapporte également à des produits (ci-après « produits selon l’invention >>) contenant :

a) un anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire selon l’invention, ou une composition selon l’invention, et

Cet anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) permet notamment la liaison à la cellule cible immunitaire. Par exemple, en se liant au récepteur présent sur les lymphocytes T infiltrant les tumeurs (par exemple PD1), il empêche la liaison entre PD1 (présent sur les lymphocytes T) et PDL1 (présent sur les cellules tumorales). On parle alors d’un anticorps neutralisant.

L’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) possède un fragment Fc modifié lui conférant une affinité supérieure pour le récepteur FcRn.

Le récepteur FcRn correspondant au « néonatal Fc receptor >> est une protéine composée d’une chaîne lourde codée par le gène FcRn (appelé FCGRT chez l’Homme) et d’une chaîne légère, la molécule de p2-microglobuline. Il peut lier la région Fc des IgG et a pour caractéristique d’augmenter la demi-vie des IgG qui s’y fixent. Le FcRn peut être retrouvé chez différents organismes y compris, sans s’y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes.

Par « affinité supérieure pour le FcRn >> on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l’invention pour le FcRn, par rapport à celle de l’anticorps parent. La capacité de la région Fc mutée de l’invention à se lier à un récepteur FcRn peut être évaluée in vitro par un test ELISA, comme décrit par exemple dans la demande de brevet W02010/106180. L’augmentation de la liaison au FcRn se traduit par une amélioration de la rétention de sérum in vivo et, par conséquent, une augmentation de la demi-vie.

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) (qui présente une affinité supérieure pour le récepteur FcRn) comprend au moins deux mutations, lesdites mutations étant choisies parmi:

(i) une modification choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S et (ii) au moins une modification choisie parmi 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant au moins une combinaison de mutations choisies parmi 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S,

241 L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 284E/378T/396L, 264E/378V/434Y, 345D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant au moins une mutation choisie parmi 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231 T, 241 L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L,

397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421 T, 426Τ, 428L, 433R, 434Υ, 434S et 439R par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant une combinaison de mutations choisies parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y,

345D/330V/361D/378V/434Y,

241L/264E/307P/378V/433R, 264E/386R/396L/434S/439R, 305A/315D/330V/389K/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T,

2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y,

250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/343Y,

315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y,

315D/327V/330V/397M/434Y,

264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S,

264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y,

230L/241 L/243L/264E/307P/378V,

290E/315D/342R/382V/434Y,

226G/315D/330V/434Y, 250A/315D/325S/330V/434Y, 241 L/315D/330V/392R/434Y,

241 L/264E/307P/378W/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K,

230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y,

226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378W/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y,

230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S par rapport audit anticorps parent, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant les combinaisons de mutations choisies parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428L/N434Y,

E294del/T307P/N434Y, T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y,

V259I/N315D/N434Y, V259l/E294Del/N315D/N434Y et T256N/A378V/S383N/N434Y. L’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) peut présenter une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, par rapport à celle de l’anticorps parent.

Par « activité fonctionnelle médiée par la région Fc >> on entend les fonctions effectrices médiées par la région Fc. Sont comprises dans lesdites activités fonctionnelles médiées par la région Fc la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC), la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l’activité d’endocytose, la sécrétion de cytokines ou une combinaison d’au moins deux de ces activités. De préférence, l’activité fonctionnelle médiée par la région Fc considérée dans l’invention est l’ADCC. Cette activité fonctionnelle peut être évaluée par des procédés bien connus de l’art antérieur.

L’activité fonctionnelle médiée par la région Fc est en particulier diminuée par rapport à celle de l’anticorps parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.

La région Fc mutée de l’anticorps b) selon l’invention a de préférence une affinité diminuée pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) choisi parmi le complément C1q et les récepteurs FcgRIIIa (CD16a), FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b).

Les récepteurs de la région Fc impliqués sont :

- C1q qui est impliqué dans l’activité CDC,

- le récepteur FcgRIIIa (CD16a) qui est lui impliqué dans l’ADCC et présente un polymorphisme V/F en position 158,

- le récepteur FcgRIla (CD32a) qui est quant à lui impliqué dans l’activation plaquettaire et la phagocytose, il présente un polymorphisme H/R en position 131, et

- le récepteur FcgRIIb (CD32b) qui est impliqué dans l’inhibition de l’activité cellulaire.

Lorsque l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, il permet la neutralisation de la liaison entre le point de contrôle et son ligand (par exemple PD1 et PDL1), sans présenter d’activité effectrice. Il permet ainsi le blocage du point de contrôle immunitaire.

De préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc ayant au moins la mutation de!294.

De préférence, selon un autre mode de réalisation, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) est aglycosylé. Par exemple, il peut être muté sur l’asparagine 297 par un acide aminé empêchant la glycosylation, tel que l’alanine. Ainsi, de préférence, l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) possède une région Fc mutée présentant la mutation N297A par rapport à l’anticorps parent.

De préférence, les produits selon l’invention contiennent :

a) un anticorps dirigé contre PDL1 selon l’invention, ou une composition selon l’invention comprenant des anticorps dirigés contre PDL1, et

b) un anticorps dirigé contre PD1, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d’un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers.

L’anticorps dirigé contre PD1 (anticorps b) est tel que décrit ci-avant et de préférence présente au moins la mutation del294.

De préférence, lorsque l’anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) est un anticorps anti-PD1, il comprend une région variable correspondant à la séquence d’un fragment Fv d’un anticorps anti-PD1 connu, par exemple l’anticorps nivolumab ou l’anticorps pembrolizumab. Ainsi, l’anticorps anti-PD1 selon l’invention peut comprendre une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l’anticorps nivolumab ou de l’anticorps pembrolizumab.

Les séquences sont les suivantes :

- les séquences VH et VL de l’anticorps nivolumab sont les séquences SEQ ID NO :17 et 18 respectivement ; et

- les séquences VH et VL de l’anticorps pembrolizumab sont les séquences SEQ ID NO :19 et 20 respectivement.

Ainsi, de préférence, l’anticorps anti-PD1 selon l’invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :17 et un VL de séquence SEQ ID NO :18.

Alternativement, de préférence, l’anticorps anti-PD1 selon l’invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :19 et un VL de séquence SEQ ID NO :20.

L’invention concerne également une méthode de traitement de cancers, qui comprend l’administration à un patient d’un anticorps anti-ligand (de préférence anti-PDL1) selon l’invention, ou d’une composition selon l’invention (de préférence une composition d’anticorps anti-PDL1).

Toute voie d’administration est envisagée, notamment des voies parentérales, telles que la voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, topique, ou par voie mucosale, par exemple par inhalation. Les voies entérales (orale, rectale) et intrathécale sont également possibles. De préférence, la voie intraveineuse est utilisée.

Les anticorps selon l’invention sont généralement formulés au sein de compositions pharmaceutiques comprenant des excipients pharmaceutiquement acceptables.

L’invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l’invention, ou une composition selon l’invention, ou des produits selon l’invention et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Par « composition pharmaceutique », on entend une composition possédant des propriétés curatives ou préventives à l’égard des maladies humaines ou animales.

L’invention a également pour objet l’utilisation d’un anticorps anti-ligand (de préférence anti-PDL1) selon l’invention, ou d’une composition selon l’invention (de préférence d’anticorps anti-PDL1), ou de produits selon l’invention, ou d’une composition pharmaceutique telle que décrite au paragraphe précédent, pour traiter les cancers.

Les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous toute forme galénique adaptée en fonction de la voie d’administration choisie.

De préférence, elles contiennent un excipient pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines, ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables.

Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de microorganismes, comme les bactéries et les champignons.

Les dispersions selon l’invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.

L’excipient pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption.

Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un excipient stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art.

Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.

Indications

Le système immunitaire reconnaît normalement les cellules tumorales comme des éléments étrangers, ce qui a pour conséquence d’entraîner une réponse immunitaire antitumorale. Cependant, il arrive que les cellules cancéreuses mettent en place des stratégies d’échappement au système immunitaire ; elles ne sont alors plus reconnues ou éliminées par le système immunitaire. Les points de contrôle immunitaires exprimés en surface des cellules effectrices de l’immunité constituent une voie importante de l’échappement tumoral. En effet, ces molécules, lorsqu’elles sont inhibitrices (ce qui est le cas par exemple pour PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 et a2AR), ont pour fonction d’atténuer la réponse immunitaire lorsqu’elles sont engagées avec leurs ligands qui sont souvent exprimés par les cellules tumorales.

Par « cancer >> on entend toute condition physiologique caractérisée par une prolifération cellulaire anormale.

Les anticorps selon l’invention, les compositions selon l’invention, les produits et la composition pharmaceutique selon l’invention, sont ainsi utilisés pour traiter différents types de cancers. Des exemples de cancers incluent notamment des cancers du poumon « non à petites cellules >> (NSCLC), des mélanomes non résécables ou métastatiques, des carcinomes des cellules rénales avancés, des cancers de la vessie, les cancers du rein, des mélanomes, des cancers du poumon, des lymphomes, des mésothéliomes, des cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, des cancers du sein, des cancers gastriques, des cancer de la tête et du cou, des tumeurs du cerveau, des glioblastomes, des tumeurs solides, des cancers de l’endomètre, des cancers de l’œsophage, des adénocarcinomes gastriques, des tumeurs des cellules germinales, des cancers des testicules, des carcinomes hépatocellulaires, des cancers du thymus, des lymphomes diffus à grande cellules B (LDGCB), des cancers hématologiques, des cancers hématologiques avancés (tels que les lymphomes non hodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës), les astrocytomes, les mélanomes de l’uvée, les sarcomes solides, les cancers de l’épithélium ovarien, les cancers péritonéaux primaires, les cancers des trompes de Fallope, des cancers du col de l’utérus, des cancers de l’anus, des cancers ovariens, des cancers urogénitaux, des cancers urothéliaux, des cancers génito-urinaires, des néoplasmes urogénitaux, des tumeurs thoraciques, des carcinomes adrénocorticaux, des cancers biliaires, des lymphomes folliculaires, des cancers du pancréas, des cancers de la prostate, des métastases cérébrales, des cancers du foie, des adénocarcinomes cervical, des tumeurs stromales gastro3064007 intestinales, des cancers du cerveau métastatiques, des carcinomes des cellules de Merkel, le sarcome synovial, les fibrosarcomes, cette liste n’étant pas exhaustive.

L’invention est maintenant illustrée par les exemples qui suivent, qui ne sont nullement limitatifs.

Exemple 1 : Production des variants d’IqGI anti-PDL1 selon l’invention en cellules

YB2/0

A/ Construction des variants Fc :

Chaque mutation d’intérêt dans le fragment Fc a été insérée indépendamment dans un vecteur d’expression contenant la chaîne lourde anti-PDL1 (contenant la partie variable de l’anticorps anti-PDL1 atezolizumab, durvalumab ou avelumab, et la partie constante de région Fc wild-type) par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l’acide aminé souhaité. Avantageusement, quand les mutations à insérer sont proches sur la séquence du Fc, elles sont ajoutées via un même oligonucléotide. Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR, contenant la chaîne lourde entière de l’anti-PDL1 muté sur le fragment Fc, a été purifié sur gel d'agarose 1% (w/v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d’expression eucaryote (HK-Gen EFSS, voir figure 3) qui contient également la chaîne légère non modifiée de l’anticorps anti-PDL1 considéré.

B/ Production des variants sous forme d’Ig entière dans YB2/0 :

Les variants Fc peuvent être préparés dans un format lgG1 entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-PDL1. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps peuvent être réalisées selon les techniques décrites dans l’exemple 1 de la demande W02001/77181 afin de produire et sélectionner des anticorps caractérisés par un faible taux de fucosylation au niveau de leur site de glycosylation Asn 297 sur le Fc.

Les combinaisons de mutations suivantes sont de préférence sélectionnées pour produire les anti-PDL1 dans YB2/0 :

Variant

Mutations

C6A69	T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y
C6A78	T256N/A378V/S383N/N434Y
T5A74	N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y
C6A74	V259I/N315D/N434Y
C6A60	P230S/N315D/M428L/N434Y
T5A74A	N315D/N361 D/A378V/N434Y

Tableau 1 : Mutant d’IqGI anti-PDL1 sélectionnés, notamment selon la méthode décrite dans la demande WQ2010/106180

Exemple 2 : Production des variants d’IqGI anti-PDL1 selon l’invention en cellules

CHOS ou HEK, ou dans le lait d’animaux transgéniques

Les combinaisons de mutations suivantes sont de préférence sélectionnées :

Variant	Mutations
G3A-103	K248E, A378V
J3A-28	E333G, A378T, V397M ¹⁰
J3B-118A	P396L, N421T, A378V
J3B-118	P396L, N421T
A3A-105D	G316D, K326E, A378V
A3A-14	S298N, A378V
G3A-95	I336T, A378V
A3A-184A	K334N, P352S, V397M, A378\P
J3B-23	N286I, A378V, F423Y
K3B-01	N315D, N361H, P396L
G3A-43	A231V, A378V
J3A-06	A378T, V397M, V412M
J3A-16	N286Y, P352S, A378V
O3A-05	K290E, T366A, A378V
Q3A-39	N286I, P396L, N421T
A3A-184	K334N, P352S, V397M

Tableau 2 : Mutants d’IqGI anti-PDL1 sélectionnés selon la méthode décrite dans la demande WQ2016/177984

Avantageusement, les mutants peuvent contenir les mutations du variant T5A-74, C6A74, ou T5A-74A telles que présentées dans le tableau 1 et les mutations d’un variant listé en tableau 2.

Alternativement, les mutants peuvent contenir les mutations du variant T5A-74, C6A-74, ou T5A-74A tel que présentées dans le tableau 1 et l’une des mutations suivantes : V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R ou V302R.

2-1/ Production des variants sous forme d’Ig entière dans CHO ou HEK

Les variants Fc, produits par mutagenèse dirigée selon la méthode de l’exemple 1-A, peuvent être préparés dans un format lgG1 entière dans une lignée cellulaire CHOS (vecteur bicistronique HK-Gen EFSS) ou HEK (en utilisant le vecteur pCEP4 monocistronique, un vecteur contenant la chaîne légère et l’autre vecteur similaire contenant la chaîne lourde mutée, voir figure 3) avec la spécificité anti-PDL1. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps peuvent être réalisées selon les techniques bien connues et par exemple décrites dans la demande WO2016/177984 (exemple 2.6 dans HEK).

2-2/ Production des variants sous forme d’Ig entière dans le lait d’animal transgénique

Les lgG1 entières anti-PDL1 mutées peuvent également être générées par production dans le lait d’un animal transgénique, par exemple une chèvre transgénique, et purification par extraction du lait. Pour cela, la séquence codante de la chaîne lourde et la séquence codante de la chaîne légère sont préparées dans un vecteur d’expression sous contrôle d’un promoteur spécifique des glandes mammaires, par exemple un promoteur de caséine de mammifère, permettant de diriger la production et la sécrétion de l’anticorps dans le lait des glandes mammaires. Un tel procédé est notamment décrit dans la demande EP0741515.

Exemple 3 : Méthode permettant la caractérisation de la liaison au FcgRIIIa, de la liaison antigènique et de la liaison au FcRn des variants d’IqGI anti-PDL1 selon l’invention

Les tests de liaison au FcgRIIIa, au ligand PDL1 et au FcRn sont réalisés selon les méthodes décrites dans la demande W02010/106180. Brièvement, les liaisons des lgG1 au FcgRIIIa, au ligand PDL1 et au FcRn sont mesurées par un test ELISA classique.

Pour cela des immunoplaques Maxisorp sont revêtues avec des antigènes PDL1 (pH = 7.4) ou des FcRn (pH = 6.0). Ensuite, les solutions d’IgG 1 anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1 sont ajoutées dans chaque puits avec une concentration finale de

0,5pg d’IgG/mL pendant 1h à 37°C, puis sont mises en contact avec des F(abj2 d’IgG HRP de chèvre anti-humaine pendant 1h à 37°C. Les tgG1 liées sont détectées après révélation au TMB par mesure de l’absorbance à 450 nm.

Pour la liaison au FcgRIIIa, des immunoplaques Maxisorp sont revêtues avec des FcgRIIIa et saturée en PBS-BSA 4%. Ensuite, les solutions d’IgGI anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1 avec une concentration finale de 0,5pg d’IgG/mL sont mises en contact avec des F(abj2 d’IgG HRP de chèvre anti-humaine à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante, sous faible agitation. Les IgG agrégées aux F(abj2 sont ensuite incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées pour le FcgRIIIa. Les plaques sont ensuite révélées avec TMB (Pierce) et les absorbances sont lues à 450 nm.

Exemple 4 : Méthode permettant de tester l’activité ADCC des variants d’IgGI antiPDL1 selon l’invention

Des cellules NK sont incubées avec des cellules eucaryotes tumorales humaines (telles que les lignées A431 et A549) exprimant PDL1, en présence de différentes concentrations (0.005 à 5000 ng/ml) d’IgGI anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1. Le niveau de lactate déshydrogénase (LDH) intracellulaire libéré par les cellules cibles lysées est mesuré.

Des cellules NK humaines sont purifiées à partir de sang périphérique de donneurs volontaires sains par la technique de déplétion négative développée par Miltenyi. Le test ADCC comprend l'incubation de cellules NK avec des cellules eucaryotes cibles exprimant l'antigène PDL1, en présence de différentes concentrations d'anticorps antiPDL1. Après 16 heures d'incubation, la cytotoxicité induite par les anticorps anti-PDL1 est mesurée en quantifiant dans les surnageants cellulaires la LDH intracellulaire libérée par les cellules cibles lysées.

Cette méthode peut être efficacement utilisée pour évaluer l’augmentation de l’activité ADCC des anticorps sélectionnés dans le cadre de la présente demande.

Exemple 5 : Effet anti-tumoral des variants d’IgGI anti-PDL1 selon l’invention sur des modèles in vivo

Un modèle de tumeur in vivo peut être utilisé pour analyser l’effet des variants anti-PDL1 sur la survie des animaux. Au jour 0, des souris nude C57BL/6 reçoivent des injections intraveineuses de cellules leucémiques C4198-GFP. Les souris sont ensuite séparées en 3 groupes. Aux jours 1, 4 et 7, les souris sont traitées avec du PBS (véhicule) ou avec 10mg/kg d’IgGI anti-PDL1 parent (référence) ou de variant anti-PDL1 à raison de 200pL par injection intrapéritonéale. Les souris sont observées deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (76 jours) et à terme, le taux de survie des souris est mesuré. Ce protocole peut ainsi permettre de confirmer, in vivo, l’avantage d’utiliser un anticorps anti-PDL1 modifié pour présenter une liaison au CD16a et/ou une activité ADCC améliorée, par rapport à un anticorps parent non modifié.

Exemple 6 : Effet anti-tumoral de la combinaison des variants d’IgGI anti-PDL1 et anti-PD1 selon l’invention sur des modèles in vivo

1- Génération d’un modèle d’étude reproductif d’une situation pathologique chez l’homme

Un modèle de souris humanisée (humanized tumor mouse model (HTM)) peut être utilisé pour analyser l’effet de la combinaison des variants anti-PDL1 (tels que décrits en exemples 1 ou 2) et anti-PD1 (i.e. variant del294 ou N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y ou E294del/T307P/N434Y ou V259I/N315D/N434Y ou V259l/E294Del/N315D/N434Y ou N297A, notamment comprenant les VH et VL du nivolumab ou du pembrolizumab tel que décrit dans la description ci-avant) sur la survie des animaux.

Ce modèle est caractérisé par le développement d’un système immunitaire mature humain et la croissance de cellules de cancers humaines qui ont été au préalable cotransplantées avec les cellules souches hématopoïétiques humaines.

Brièvement, des souris NOD-scid IL2Rynull (NSG) peuvent être obtenues, par exemple auprès des Laboratoires Jackson, puis hébergées dans un établissement spécialisé sans pathogène. Les nouveau-nés seront irradiés (1 Gy) pendant leurs 48 premières heures de vie et 3 heures plus tard transplantées par injection intra-hépatique avec 2,5x10⁵ cellules CD34+ humaines isolées à partir de sang du cordon ombilical (CB) en présence de cellules tumorales 3x10⁶ C4198-Luc (exprimant la luciférase pour un suivi en bioluminescence).

2- Méthode pouvant être utilisée pour tester l’activité de la combinaison d’anticorps

Dès que la tumeur est visible par bioluminescence (IVIS), les souris HTM sont traitées avec 20 mg/kg d’une combinaison de variants anti-PD1 et anti-PDL1 tous les 3 jours par voie intraveineuse.

Le suivi de l’efficacité du traitement est réalisé en bioluminescence, la survie des animaux ainsi que la survie en absence de tumeurs sont monitorées. Des prélèvements sanguins sont réalisés au cours de l'étude afin de s'assurer de l'efficacité de la combinaison d’anticorps sur la survie.

Conclusion :

Le modèle murin HTM peut être avantageusement utilisé pour évaluer in vivo l’avantage de combiner :

- les effets cytotoxiques d’un anticorps anti-PDL1 modifié pour présenter une liaison au CD16a et/ou une activité ADCC améliorée,

- les effets neutralisants d’un anticorps anti-PD1 dans le cadre d’un traitement anti10 tumoral.

Claims

REVENDICATIONS

1. Anticorps dirigé contre un ligand d’un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d’un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l’anticorps parent.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421 T, 434Y et 434S ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R,

230S, 230T, 230L, 231V, 234P, 241 L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T,

248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N,

267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T,

288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P,

312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V,

333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A

352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T,

379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S,

423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431 T, 434K, 434Y, 434S, 435R,

436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
3. Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421 T; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I,

243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A,

263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L,

286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A,

308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E,

323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S,

349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T,

378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I,

394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41 OR, 412M, 414R, 421T,

421 S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431 T, 434K, 434S, 435R,

436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
4. Anticorps selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S; et ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
5. Anticorps selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes:

i) une mutation choisie parmi 378V, 326E, 397M, 334N et 396L ; et ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y et 298N, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n’a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
6. Anticorps selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il a une affinité améliorée par rapport à celle de l’anticorps parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
7. Composition comprenant des anticorps selon l’une des revendications 1 à 6, lesdits fragments Fc modifiés possédant sur leur site de glycosylation des N-glycannes, caractérisés en ce que lesdits N-glycannes présentent un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%.
8. Composition selon la revendication 7, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, et des N-acétylglucosamines terminaux non intercalaires.
9. Composition selon l’une des revendications 7 ou 8, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1+G0F+G1 F, la teneur des formes G0F+G1F étant inférieure à 50%.
10. Composition selon l’une des revendications 7 ou 8, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1+G0F+G1 F, la teneur en fucose étant inférieure à 65%.
11. Composition selon la revendication 9 ou 10, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits Nglycannes présentent une teneur inférieure à 40% pour les formes G1F+G0F.
12. Anticorps selon l’une des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que le ligand du point de contrôle immunitaire est choisi parmi PDL1, OX40L, PDL2, CD80, CD86, la galectine-9, le CMH II, le CMH I, HVEM et l’adénosine, de préférence le ligand est PDL1.
13. Anticorps selon l’une des revendications 1 à 6 ou 12 ou composition selon l’une des revendications 7 à 12, caractérisée en ce que l’anticorps est un anti-PDL1 comprenant une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l’anticorps atezolizumab, de l’anticorps durvalumab, ou de l’anticorps avelumab, et de préférence un VH de séquence SEQ ID NO :11 et un VL de séquence SEQ ID NO :12, ou un VH de séquence SEQ ID NO :13 et un VL de séquence SEQ ID NO :14, ou un VH de séquence SEQ ID NO :15 et un VL de séquence SEQ ID NO :16.
14. Produits contenant :

a) un anticorps selon l’une des revendications 1 à 6, 12 ou 13, ou une composition d’anticorps selon l’une des revendications 7 à 13, et

b) un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d’un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, ledit point de contrôle immunitaire étant choisi parmi PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 eta2AR, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers.
15. Produits selon la revendication 14 caractérisés en ce que le ligand de point de contrôle immunitaire selon a) est PDL1 et en ce que le point de contrôle immunitaire selon b) est PD1, et de préférence l’anticorps b) anti-PD1 comprend un VH de séquence SEQ ID NO :17 et un VL de séquence SEQ ID NO :18, ou bien comprend un VH de séquence SEQ ID NO :19 et un VL de séquence SEQ ID NO :20.
16. Anticorps selon l’une des revendications 1 à 6, 12 ou 13, ou composition d’anticorps selon l’une des revendications 6 à 13, ou produits selon la revendication 14 ou 15, caractérisés en ce que les anticorps parents comprennent un fragment Fc parent qui est un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d’une lgG1 humaine ou d’une lgG2 humaine.
17. Composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps selon l’une des revendications 1 à 6, 12 ou 13, ou une composition selon l’une des revendications 6 à 13, ou des produits selon l’une des revendications 14 ou 15, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
18. Anticorps selon l’une des revendications 1 à 6, 12 ou13, ou composition selon l’une des revendications 6 à 13, produits selon la revendication 14 ou 15, ou composition pharmaceutique selon la revendication 17, pour son utilisation dans le traitement des cancers.

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