[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP7059390B2 - Ａｄｃｃ及びａｄｃｐ活性の改善された定量化のためのシステム及び製品 - Google Patents

Ａｄｃｃ及びａｄｃｐ活性の改善された定量化のためのシステム及び製品 Download PDF

Info

Publication number
JP7059390B2
JP7059390B2 JP2020549787A JP2020549787A JP7059390B2 JP 7059390 B2 JP7059390 B2 JP 7059390B2 JP 2020549787 A JP2020549787 A JP 2020549787A JP 2020549787 A JP2020549787 A JP 2020549787A JP 7059390 B2 JP7059390 B2 JP 7059390B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
cells
target
adcc
effector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020549787A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021518123A (ja
Inventor
トービー、マイケル
ラルマン、クリストフ
Original Assignee
スワール ライフ サイエンス エービー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by スワール ライフ サイエンス エービー filed Critical スワール ライフ サイエンス エービー
Publication of JP2021518123A publication Critical patent/JP2021518123A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7059390B2 publication Critical patent/JP7059390B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、新規な細胞、及び試料において抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を決定するための方法におけるその使用に関する。本発明による細胞は、診断的状況で使用することができるキット又はキットの部品で使用することができる。重要なことに、本発明による細胞は、例えば抗体又はＦｃ融合タンパク質に基づき治療の有効性を決定するために使用することができる。
いくつかのモノクローナル抗体の活性は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを含む宿主媒介性エフェクター細胞機能によって部分的に媒介されることが周知である。抗体は、腫瘍細胞又は炎症を引き起こすリンパ球などの標的細胞上の特定の抗原に向けられる。一旦標的細胞に結合すると、エフェクター細胞のＦｃ受容体部分は、モノクローナル抗体のＦｃ部分に結合し、それによって、エフェクター細胞による標的細胞の死滅をもたらす。
そのようなＡＤＣＣ又はＡＤＣＰプロセスにおける抗体の有効性を定量化するために、抗体の有効性を決定するために使用される、エフェクター細胞、標的細胞及び対照標的細胞を有することが必要である。従来技術では、内在性エフェクター細胞、ヒト対象由来のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びヒト対象由来の標的細胞又は確立された腫瘍細胞系を採取し、それらの標的細胞を試験で使用する。古典的なアッセイでは、標的細胞はクロム装填され、その結果、クロムの放出によって細胞の死滅を決定することができる。この方法は、多くの不利益を被り、例えば、使用されるエフェクター細胞をヒト対象から採取しなければならず、それにより、定量化に使用される細胞に大きな変動性がある。さらに、このように細胞を得るのは難しく、費用がかかる。例えば、ドナー間でかなりの変動がある。さらに、この古典的アッセイの陰性対照について、標的受容体、例えば、リツキシマブに対するＣＤ２０及びトラスツズマブに対するｅｒｂＢ２を発現しない細胞系が使用されるであろう。したがって、例えば、ＣＤ２０を発現しないＴ細胞系が使用されるであろう。そのような陰性対照標的細胞の使用の不利益は、当然ながら、細胞が、標的細胞に対するＣＤ２０発現がないことに加えて多くの点で異なり、優れた対照を構成しないことである。
別の不利益は、これらは、長い、時間のかかるアッセイであり、一晩インキュベートしなければならないことが多いことである。ダイナミックレンジが制限され、感度が悪い。ダイナミックレンジは、最高濃度の薬物において達成可能な最大シグナルと、対照及びゼロ（薬物がない試料）との間の差異である。感度は、少量の抗体によって生成される活性であり、すなわち、検出可能な活性を生成するのに必要な抗体の量が少ないほど、アッセイの感度は高い。別の不利益は、アッセイは不正確なことが多く、これによって、モノクローナル抗体の異なるバリアント間の小さな差異の検出が難しくなることである。
この標準的な定量アッセイに対する１つの改善は、Ｐａｒｅｋｈら（１）によって記載され、改変及び市販された（２）。アッセイでは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子の活性化及びルミノメーターで定量化することができる光放出によってＦｃγＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６）への免疫グロブリンのＦｃ部分の結合に応答するＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子構築物を含有する、組換えエフェクター細胞系が開発されている。これらのエフェクター細胞は、凍結、解凍及び使用の型式で販売されている（３）。これは、はるかに簡便な型式で、ダイナミックレンジがいくらか大きい、はるかに感度が良い方式で定量化することができる、ＡＤＣＣ機構の代替マーカーを使用し、エフェクター細胞を採取する必要がないが、凍結融解細胞を使用するので、標準的な溶解性アッセイを超える改善である。同様に、ＡＤＣＰ活性は、ＮＦＡＴ応答性ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＩＩａ（ＣＤ３２）を発現するエフェクター細胞及び野生型（ＷＴ）標的細胞を使用する同様な方式で定量化することもできる。そのようなＡＤＣＰエフェクター細胞系は市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。抗体のＡＤＣＰ活性を評価するために、これらの細胞をＷＴ標的細胞と一緒に使用することは、ダイナミックレンジが制限され、感度が限られたアッセイをもたらす。
さらに、エフェクター細胞上での抗体のＦｃ部分とＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の相互作用後に活性化される主要転写因子（ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５）に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによってホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子が調節される、新規な組換えエフェクター細胞系が最近記載されており（３）、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されている。さらに、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているものと同じ合成キメラプロモーターによって調節されるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ３２を発現する新規な組換えエフェクター細胞系が本明細書に開示される。ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているキメラプロモーターによって調節されるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ１６又はＣＤ３２を発現する組換えエフェクター細胞は、それぞれ、抗体によって認識される高い一定レベルの特定の抗原を過剰発現する操作された標的細胞と一緒にＡＤＣＣ又はＡＤＣＰアッセイで使用される場合に、ＮＦＡＴ調節性レポーター遺伝子を発現する操作されたエフェクター細胞系と比較して、改善された感度及び改善されたダイナミックレンジを与える。
ＷＯ２０１７／１８６１２１は、免疫応答細胞の機能を改善するための方法、並びに抗原及びＩ型インターフェロンに結合することができる少なくとも１つの受容体を発現する免疫応答細胞に関する。該細胞は、腫瘍又は病原体を死滅させる重要な能力を有し、腫瘍及び感染症を治療するのに使用することができる。
Ｌａｌｌｅｍａｎｄ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１７年号、１～１９ページは、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ又はエタネルセプトによって認識される、高い一定レベルの特定の抗原を過剰発現する新規な標的細胞と一緒に、ＦｃｙＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）のＶ変異体又はＦ変異体及びＦｃｙＲＩＩＩａシグナル伝達に関与する主要転写因子に対する認識配列を組み込むキメラプロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼを発現する新規なＡＤＣＣエフェクター細胞に関し、これらは、ＮＦＡＴ調節性レポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞及び野生型標的細胞と比較して、ＡＤＣＣアッセイにおいて、改善された感度、特異性及びダイナミックレンジを与える。
それにもかかわらず、定量的なＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイをさらに改善したいという要求が常に存在する。特にＡＤＣＰ活性の定量化について、ダイナミックレンジが大幅に改善され、感度が改善されたアッセイを有することが望ましいであろう。
本発明は、１種又は複数の共刺激性分子のエフェクター及び／又は標的細胞における過剰発現に関し、過剰発現は、前記細胞が抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を評価するのに使用される場合に顕著に増強されたダイナミックレンジ及び増大した感度をもたらす。
ＣＤ１３７と同時導入した、又は同時導入していないｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）、並びにＥＲＢＢ２を単独で過剰発現する、又はＥＲＢＢ２及びＣＤ８６を過剰発現する、又はＥＲＢＢ２、ＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＣＤ３に会合したゼータ膜貫通型シグナリング分子と同時導入した、又は同時導入していないｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）及びＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＣＤ２０を単独で過剰発現するか又はＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するかのいずれかのＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＣＤ２０を単独で過剰発現するか又はＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞Ｖ変異体並びにＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用した場合のリツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用した場合のリツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＣＤ２０と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６との両方を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにｅｒｂＢ２を単独で過剰発現するか又はｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するかのいずれかのＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びｅｒｂＢ２を単独で過剰発現するか又はｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６との両方を過剰発現するかのいずれかのＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用した場合のトラスツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８６の両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用した場合のトラスツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＲＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びｅｒｂＢ２と共刺激性分子ＣＤ８６の両方を過剰発現するＨＥＲＫ２９３標的細胞を使用して決定したトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＥＧＦＲ単独又はＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０及びＣＤ８６との両方のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＥＧＦＲ単独又はＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８６の両方のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型Ａ４３１標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型Ａ４３１標的細胞に対する、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８６の両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用した場合のセツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８６の両方を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用した場合のセツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｖ変異体）及び野生型Ａ４３１標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びにＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６との両方を過剰発現するＨＥＲＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞（Ｆ変異体）及び野生型Ａ４３１標的細胞に対する、ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）及びＥＧＦＲと共刺激性分子ＣＤ８６の両方を過剰発現するＨＥＲＫ２９３標的細胞を使用して決定したセツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びに膜結合ＴＮＦα単独又は膜結合ＴＮＦα並びに共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０及びＣＤ８６のいずれかを発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したインフリキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）並びに膜結合ＴＮＦα単独又は膜結合ＴＮＦα並びに共刺激性分子ＣＤ８０及び若しくはＣＤ８６のいずれかを発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したインフリキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｖ変異体）並びに膜結合ＴＮＦα単独又は膜結合ＴＮＦα並びに共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０及びＣＤ８６のいずれかを発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したインフリキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 ＣＤ２８を過剰発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｆ変異体）並びに膜結合ＴＮＦα単独又は膜結合ＴＮＦα及び共刺激性分子ＣＤ８０若しくはＣＤ８６のいずれかを発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用して決定したインフリキシマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。 表１は、４ＰＬプロットの主要なパラメーターとして表される、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞と併せて使用されるＣＤ２０＋＋標的細胞における共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８０とＣＤ８６との過剰発現のＡＤＣＣアッセイに対する効果を示す。 表２は、４ＰＬプロットの主要なパラメーターとして表される、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞と併せて使用されるＥＲＢＢ２＋＋標的細胞における共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８０とＣＤ８６との過剰発現のＡＤＣＣアッセイに対する効果を示す。 表３は、４ＰＬプロットの主要なパラメーターとして表される、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞と併せて使用されるＥＧＦＲ＋＋標的細胞における共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８０とＣＤ８６との過剰発現のＡＤＣＣアッセイに対する効果を示す。 表４は、４ＰＬプロットの主要なパラメーターとして表される、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞と併せて使用されるｍＴＮＦα＋＋標的細胞における共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８０とＣＤ８６との過剰発現のＡＤＣＣアッセイに対する効果を示す。
本発明は、上述の問題を解決し、とりわけ、改善された感度及び／又は改善されたダイナミックレンジを提供するために、従来技術のアッセイの凍結、解凍及び使用のエフェクター細胞及び標的細胞の実質的な改善を提供する。一態様では、問題は、とりわけ、本発明によるベクター及び最終的に細胞中に含まれる操作されたポリヌクレオチド配列の助けによって解決される。
一態様では、本発明は、アッセイにおける改善された感度を提供する、ポリヌクレオチド配列、ベクター及び最終的に操作された細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、アッセイにおける改善されたダイナミックレンジを提供する、ポリヌクレオチド配列、ベクター及び最終的に操作された細胞を提供する。
なおさらなるの態様では、本発明は、アッセイにおける改善された感度及び同時にアッセイにおける改善されたダイナミックレンジを提供する、ポリヌクレオチド配列、ベクター及び最終的に操作された細胞を提供する。
改善された感度は、それ自体、実質的に改善されたＥＣ５０及びＬＬＯＱ（定量下限）に現れる。特に、本発明は、当技術分野で公知の技法と比較して少なくとも約１０倍である、増大した感度（ＥＣ５０として測定される）又はＬＬＯＱのために、細胞系及び最終的にキットにおけるその使用を提供する。したがって、感度又はＬＬＯＱは、当技術分野で公知の技法と比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍又は少なくとも約１００倍増大する。同様に、本発明は、当技術分野で公知の技法と比較して少なくとも約１０倍である増大したダイナミックレンジのために、細胞系及び最終的にキットにおけるその使用を提供する。したがって、ダイナミックレンジは、当技術分野で公知の技法と比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍又は少なくとも約１００倍である。当技術分野で公知の技法の例は、Ｂｈａｖｉｎ Ｓ．Ｐａｒｅｋｈ，Ｂ．Ｓ．ら、ｍＡｂｓ、２０１２、４（３）、３１０～３１８ページ、又は例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４、４１４、６９～８１ぺージに見出すことができる。
本発明は細胞に関する。特に、本発明は、本発明による１種又は複数のベクターを含む細胞に関する。ベクターはエピソームでもよく、又は前記細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。細胞は任意の起源のものでもよく、特に哺乳動物細胞でもよい。本発明による細胞は、例えば、ジャーカット、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ－１、ＨＥＫ２９３、ＤＴ－４０及びＭＳＢ－１などの当技術分野で公知の任意の細胞系のものでもよい。本発明は、細胞における１種又は複数の共刺激性分子の過剰発現に関し、過剰発現は、前記細胞が抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を評価するのに使用される場合に増強されたダイナミックレンジ及び増大した感度をもたらす。共刺激性分子は、抗体によって認識される特定の抗原を保有する標的細胞で内在的に発現しているか又は過剰発現している場合に、リガンドとして働くことができる。本発明の一実施形態では、標的細胞は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、治療抗体に認識される高い一定レベルの特定の抗原を過剰発現するように操作されている。共刺激性分子は、エフェクター細胞で内在的に発現しているか又は過剰発現している場合に、共刺激性受容体として働くことができる。本発明の一実施形態では、エフェクター細胞は、以前に記載されているように（１、２）ＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子の活性化によって、又はＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子に操作的に連結された、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターの活性化によって、標的細胞で発現している特定の抗原に結合している抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答する、低親和性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６Ａ）Ｖ若しくはＦ変異体又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）Ｈ又はＲ変異体のいずれかを過剰発現するように操作されている。
本発明の別の態様では、エフェクター細胞は、以前に記載されているように（１、２）ＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子の活性化によって、又はＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子に操作的に連結された、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターの活性化によって、標的細胞で発現している特定の抗原に結合している抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答する、例えば、高親和性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又は例えば、低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ１（ＣＤ３２）又は低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ２（ＣＤ３２）又は低親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいずれかを過剰発現するように操作されている。
標的細胞で過剰発現している共刺激性分子は、エフェクター細胞で内在的に発現しているか又は過剰発現している共刺激性受容体（単数又は複数）と相互作用し、エフェクター細胞におけるＦｃγＩＩＩａ又はＦｃγＩＩ受容体との抗体のＦｃ部分の相互作用を強め、ＦｃγＩＩＩａ又はＦｃγＩＩ受容体に連結したレポーター遺伝子の顕著に増強された発現をもたらす。これは、結果として、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、それぞれ、ＦｃγＩＩＩａ受容体応答性レポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞を、又はそれぞれ、本明細書に記載の若しくは市販されているＦｃγＩＩ応答性レポーター遺伝子を発現するエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣ又はＡＤＣＰアッセイのダイナミックレンジ及び感度の顕著な増大があり、前記標的細胞は、抗体によって認識される特定の抗原に加えて、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を含む１種又は複数の共刺激性分子を発現する。
ＩＣＯＳ－Ｌ（誘導性共刺激物質リガンド）などの他の共刺激性分子も標的細胞で発現させて、エフェクター細胞で内在的に発現しているか又は過剰発現しているＩＣＯＳ受容体とのその相互作用後に、それぞれＡＤＣＣ又はＡＤＣＰアッセイにおいて、ＦｃγＩＩＩａ又はＦｃγＩＩ受容体のいずれかに連結したレポーター遺伝子の発現を強めることができることが理解されたい。本発明のさらなる実施形態では、標的細胞においてＣＤ８０及びＣＤ８６のダウンレギュレーションを防止するために、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）などの免疫チェックポイント受容体は、ゲノム編集を使用して、エフェクター細胞において特に無効化される。本発明のさらなる実施形態ではＦｃγＲＩＩＩａ関連免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）シグナリング、及びＦｃγＩＩＩａ受容体に連結したレポーター遺伝子の増強された発現を強めるために、ＣＤ３ゼータ鎖膜貫通型シグナリング分子（ＣＤ２４７）がＡＤＣＣエフェクター細胞で過剰発現している。
一態様では、本発明は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）又はＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）の１つ又は複数が、エフェクター細胞で構成的に発現しているか又は過剰発現しているかのいずれかである、エフェクター細胞として示され得る細胞に関する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ及び／又はＣＤ２７８Ｌの１つ又は複数が、標的細胞で構成的に発現しているか又は過剰発現しているかのいずれかである、標的細胞として示され得る細胞に関する。
本発明は、キット又はキットの部品にも関する。キットは、
ｉ） ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ機構においてエフェクター細胞として働くことができ、１種又は複数の共刺激性分子が内在的に発現しているか又は過剰発現している、本発明による細胞、
ｉｉ） ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ機構において標的細胞として働くことができ、１種又は複数の共刺激性分子の発現が増強されている、本発明による細胞、
ｉｉｉ） 抗体が特異的である内在性標的が無効化されている（突然変異している）、標的細胞を含むことができる。
キットは、同じ標的が増強されており、すなわち、その結果、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように標的が過剰発現しており、且つ１種又は複数の共刺激性分子の発現が増強されている標的細胞も含む。
標的は、原理上は、関連する抗体が結合することができるいかなる標的でもよい。一態様では、標的はＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの１つ又は複数でもよい。
キットは、１つ又は複数のバイアル、例えば、２つ以上のバイアルなどを含むこともできる。一態様では、キットは、細胞ｉ）の混合物を細胞ｉｉ）の混合物とともに含む１つのバイアルを含むことができる。そのような例では、キットは、２つのバイアルを含み、第２のバイアルは前述のｉｉｉ）の細胞を含む。したがって、一例では、キットは、２つのバイアルを含み、１つのバイアルは、エフェクター細胞ｉ）及び問題の抗体が特異的に増強／過剰発現される標的を有する標的細胞ｉｉ）を含む。第２のバイアルは、したがって、標的細胞ｉｉｉ）を含み、標的が無効化されているか、若しくは標的／受容体が欠失しているか、又はさもなければ、非機能性であり得、若しくは任意の手段によって問題の抗体へのその結合能力が失われている。
本発明の一態様では、キットの１つのバイアルは、Ｅ：Ｔ比として本明細書で言及される最適な比で、細胞ｉ）の混合物を細胞ｉｉ）の混合物とともに含み、Ｅは、上記のパラグラフｉ）の細胞（エフェクター細胞）を示す。Ｔは、上記のｉｉｉ）の細胞（標的細胞）を示す。最適なＥ：Ｔ比は、本明細書及び実験部分でさらに記載する。
本発明によるキット及び方法では、エフェクター細胞ｉ）と標的細胞ｉｉ）との間の関係について見出されたものと同じＥ：Ｔ比が、エフェクター細胞ｉ）及び標的細胞ｉｉｉ）に対して使用される。
これらの特色は本発明によって得られ、本発明は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているようにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ１６Ａ（Ｖ又はＦ変異体）を発現する組換えエフェクター細胞、又は本明細書に記載のようにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ３２（Ｈ又はＲ変異体）を発現するエフェクター細胞、又はＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているようにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結された、若しくは本明細書に記載のようにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に連結された、高親和性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、若しくは低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ１（ＣＤ３２）、若しくは低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ２（ＣＤ３２）、若しくは低親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいずれかを過剰発現するように操作されたエフェクター細胞、又はＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＩＣＯＳを含む１種若しくは複数の共刺激性受容体を内在的に発現するか若しくは過剰発現する、市販されているＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ１６Ａ若しくはＣＤ３２を発現するエフェクター細胞が、抗体によって特異的に認識される抗原を発現し、且つＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３２Ｌ又はＩＣＯＳＬを含む１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する標的細胞と併せて使用され、前記細胞が抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を評価するのに使用される場合に、増強されたダイナミックレンジ及び増大した感度をもたらす。
したがって、本発明は、下流のプロモーターに作動可能に連結したｃｉｓ作用性制御配列を含むポリヌクレオチドに関し、ここで、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５の１つ又は複数は、前記ｃｉｓ作用性調節配列に結合することができる。本発明の一態様では、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５はすべて前記ｃｉｓ作用性調節配列に結合することができる。
プロモーターは、例えば、ルシフェラーゼでもよい酵素又は蛍光タンパク質などの第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結され得る。
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、例えば、少なくとも約７５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などの又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよく、配列番号１は、
Figure 0007059390000001
である。
一態様では、本発明によるポリヌクレオチドは、人工の操作されたポリヌクレオチドである。
一態様では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい。
さらなる態様では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性、例えば、少なくとも約９６％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９７％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性など有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい。
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター構築物にも関する。ベクター構築物は、プラスミド又はウイルスベクターでもよい。
本発明の一態様では、ベクター構築物は、配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むことができ、本明細書で開示される１種又は複数の共刺激性分子の発現のためのタンパク質をコードすることができる１種又は複数のヌクレオチド配列をさらに含む。
ベクター構築物は、したがって、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、例えば、少なくとも約７５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができ、配列番号１は、
Figure 0007059390000002
である。
一態様では、ベクター構築物は、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができる。
さらなる態様では、ベクター構築物は、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性、例えば、少なくとも約９６％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９７％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性など有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができる。
さらに、本発明は、本発明によるベクターを含む細胞にも関する。特に、本発明は、本発明によるベクターを含む操作された細胞に関する。ベクターはエピソームでもよく、又は前記細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。本発明の一態様では、細胞は、第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現することができる。本発明のなおさらなる態様では、細胞は組換え体でもよい。
本発明の一態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（配列番号１）を有するベクターを含む細胞は、エフェクター細胞でもよい。先に言及したように、ベクター又はベクター構築物は、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、例えば、少なくとも約７５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができ、配列番号１は、
Figure 0007059390000003
である。
一態様では、ベクター構築物は、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができる。
さらなる態様では、ベクター構築物は、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性、例えば、少なくとも約９６％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９７％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性など有するヌクレオチド配列を含むか又はそれらから成ってもよい、ポリヌクレオチドを含むことができる。
本発明の一態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（配列番号１）を有するベクターを含む細胞は、エフェクター細胞でもよく、ベクターは、本明細書で開示される１種又は複数の共刺激性分子の発現のためのタンパク質をコードすることができる１種又は複数のヌクレオチド配列をさらに含む。例示的且つ非限定的な例は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）又はＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）の１つ又は複数であり、これらは、エフェクター細胞で（例えば、細胞表面で）構成的に発現していてもよく、又は過剰発現していてもよい。
したがって、本発明の一態様では、細胞はエフェクター細胞であり、例えば、ルシフェラーゼでもよい酵素又は蛍光タンパク質を発現する遺伝子などのレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ１６Ａを発現することができる。
或いは、本発明による細胞はエフェクター細胞であり、例えば、ルシフェラーゼでもよい酵素又は蛍光タンパク質を発現する遺伝子などのレポーター遺伝子に機能的に連結されたＣＤ３２を発現することができる。
本発明の一態様では、本発明による細胞、エフェクター細胞は、さらに、１種又は複数の共刺激性受容体を内在的に発現するか又は過剰発現する。原理上は、そのような共刺激性受容体は、任意の適切な受容体でもよく、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、及びＩＣＯＳの１つ又は複数でもよい。さらに、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）又はＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）の１つ又は複数は、エフェクター細胞で構成的に発現していてもよく、又は過剰発現していてもよい。
本発明は、標的細胞にも関する。さらに、標的細胞は、抗体によって特異的に認識される抗原を発現する。本発明の一態様では、標的細胞は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３２Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ又はＩＣＯＳＬの１つ又は複数などの１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する。さらに、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ及び／又はＣＤ２７８Ｌの１つ又は複数は、標的細胞で構成的に発現していてもよく、又は過剰発現していてもよい。
本発明のさらなる実施形態では、ＣＤ２８のダウンレギュレーション、ひいては標的細胞に対するＣＤ８０及びＣＤ８６の過剰発現の効果の打ち消しを防止するために、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）などの免疫チェックポイント受容体は、ゲノム編集を使用して、エフェクター細胞において特に無効化される。本発明のさらなる実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ関連ＩＴＡＭシグナリング及びＦｃγＩＩＩａ受容体に連結したレポーター遺伝子の増強された発現を強めるために、３つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するゼータシグナリング分子（ＣＤ２４７）に会合している膜貫通ＣＤ３が、ＡＤＣＣエフェクター細胞で過剰発現している。好ましい実施形態では、アッセイの正規化をもたらすために、組換えエフェクター細胞は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものと異なるルシフェラーゼの構成的生成のための構築物をさらに有する。例えば、レポーター遺伝子構築物がホタルルシフェラーゼを生成する場合は、構成的生成は、第２のルシフェラーゼ、例えば、ウミシイタケルシフェラーゼのものでもよい（４）。第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化される第１のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１８９６５８に記載されている。アッセイを行う場合、実施例により詳細に記載されるように、レポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、次いで試薬を加えて、その特定のルシフェラーゼをクエンチし、その結果、任意のその後の読み取りは構成的構築物からのルシフェラーゼを読み取るだけであり、これを、次いで正規化の目的に使用することができる。
任意のルシフェラーゼの構成的発現を使用する利点は、結果がエフェクター細胞の喪失又はエフェクター細胞による標的細胞の死滅の影響を受けず、結果が血清のマトリックス効果の影響も受けないことである。これらのすべては、他の（第２の）ルシフェラーゼの構成的発現の測定値を使用して得られた正規化によって補正することができる。これらの利点のどれも、そのような正規化を使用しない従来技術のアッセイの手順では得ることができない。
本発明の好ましい実施形態では、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、標的細胞は、インビボで測定されるものと同じタイプの標的細胞から生成されるが、一方で抗体が特異的である抗原が無効化されるか（陰性対照）、又は一方でその発現が一定に増強される（陽性対照）。従来技術のアッセイは、陽性対照用に、組換え体ではなく、抗体が特異的である可変量の抗原を発現する野生型標的細胞のみを使用し、陰性対照用に、抗体が特異的である抗原を構成的に発現しない天然細胞を使用する。例えば、ＣＤ２０アッセイでは、ＣＤ２０を構成的に発現しないＴ細胞が陰性対照として使用される。陽性対照については、野生型Ｂ細胞が標的として使用される。
抗体が特異的である抗原が無効化された組換え標的細胞を使用することによって、Ｔ細胞が天然標的細胞と非常に異なり、これらの違いが結果にいくらか影響を及ぼすので、大幅に改善された陰性対照が手に入れられる。例えば、これは、Ｅ：Ｔ比が変化するにしたがって標的細胞の数が増加するので、異種性エフェクター細胞（Ｅ）標的細胞（Ｔ）比（Ｅ：Ｔ比）曲線が完全にゼロになることを防止することができる。この問題は、モノクローナル抗体によって認識される特定の抗原をコードする遺伝子が無効化された組換え標的細胞を使用することによって解決される。
本発明のさらに好ましい特色は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように抗体が特異的である抗原の増強された一定の発現を有する組換え標的細胞が、ＣＤ８０又はＣＤ８６などの１種又は複数の共刺激性分子で同時導入され、それによって、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰアッセイについて得られる、はるかに大きなダイナミックレンジ及び増強された感度を可能にすることである。
さらに、共刺激性分子ＣＤ８０とＣＤ８６及び特定の抗原は、野生型細胞の場合のように細胞が増殖するにつれて又は培養条件の機能に応じて変動しない、高い一定レベルで発現し、したがって、改善されたアッセイ精度をもたらす。これによって、測定される候補抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性のわずかな差異の検出が可能になる。組換え標的細胞の別の利点は、ヒト対象由来の標的細胞の採取若しくは培養又は研究室における標的細胞系の培養のいずれかよりもはるかに大きな使いやすさのために、凍結、解凍及び使用の型式で提供することができることである。そのような組換え細胞を使用して、正常な個体又はインビトロで培養された細胞から得られた標的細胞中に本質的に存在するであろう変動性を回避し、したがって、野生型細胞は、成熟段階、細胞周期のフェーズ又は培養条件に応じて、目的の抗原の可変的発現を有するであろう。組換え陽性対照の使用は、この変動性を排除する。
本発明のさらに好ましい特色は、標準的な技法を使用して別々に凍結したエフェクター細胞のバイアル及び標的細胞のバイアルを含む、解凍及び使用型式である。解凍すると、エフェクター細胞と標的細胞とを最適なＥ：Ｔ比で混合し、解析される漸増濃度の抗体の存在下で、マルチウェル白色側面マイクロタイタープレート中で、適切な時間にわたってインキュベートする。次いで、二重ルシフェラーゼ基質を使用して、ルミノメーターにおいて、抗体誘導性ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）活性及び構成的ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）発現をマイクロタイタープレートの同じウェル中で順次定量化する。結果は、以下の実施例に示すように、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表され、４－パラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態として提示される。
本発明のさら好ましい特色は、リツキシマブなどの特定のモノクローナル抗体に最適なＥ：Ｔ比でエフェクター細胞と標的細胞の両方を含有する単一凍結バイアルであり、その結果、顧客が行わなければならないことは、所望の濃度の薬物を加えること、インキュベートすること、及び読み取りを行うことだけである。特定のモノクローナル抗体に最適なＥ：Ｔ比でエフェクター細胞と陰性対照標的細胞との両方を含有する単一凍結バイアルも供給される。したがって、本発明によれば、Ｅ：Ｔ比は約２４：１から約１：１の範囲である。好ましくは、比は、例えば、約２４：１から約２：１、又は約６：１、若しくは約３：１、若しくは例えば約１．５：１、若しくは約１：１である。そのような型式は、キット又は方法の使用者が、特定のモノクローナル抗体に最適なＥ：Ｔ比及び他のアッセイパラメーターを決定する必要性を取り除く。
本発明のさらなる実施形態では、ＣＤ２０に対する抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性の定量化を容易にするために、共刺激性分子ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６が、ＣＤ２０を発現する細胞で過剰発現している。本発明の好ましい実施形態では、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているもののような、高い一定レベルのＣＤ２０発現を示す標的細胞で過剰発現している。
本発明のさらなる実施形態では、ＨＥＲ２受容体に対する抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性の定量化を容易にするために、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６が、ＥＲＢＢ２を発現する細胞で過剰発現している。本発明の好ましい実施形態では、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているもののような、高い一定レベルのＥＲＢＢ２発現を示す標的細胞で過剰発現している。
本発明のさらなる実施形態では、ＥＧＦＲ受容体に対する抗体のＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性の定量化を容易にするために、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６が、ＥＧＦＲを発現する細胞で過剰発現している。本発明の好ましい実施形態では、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６は、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているもののような、高い一定レベルのＥＧＦＲ発現を示す標的細胞で過剰発現している。
本発明のさらなる実施形態では、インフリキシマブ又は任意の他の抗ＴＮＦ－α抗体若しくはＦｃ融合タンパク質、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））などのＡＤＣＣ活性の定量化を容易にするために、共刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６が、膜結合型ＴＮＦα（ｍＴＮＦα）を発現する、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているもののような標的細胞で過剰発現しており、これは、ＴＮＦαアンタゴニストのＡＤＣＣ活性の定量化が、膜結合型ＴＮＦαを発現する標的細胞を必要とするからである。ＴＮＦαは最初に膜結合型であるが、その後に、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）プロテアーゼによって切断される。したがって、膜結合型の切断不可能なＴＮＦαを発現する細胞系を確立するために、部位特異的変異誘発を使用して、プロテアーゼ切断部位を突然変異させた。しかし、細胞表面上で発現する切断不可能なＴＮＦαは、隣接細胞の表面に存在するＴＮＦαＲＩＩ受容体に結合し、細胞死をもたらし、永続的細胞系の確立を難しくする。したがって、そのような障害を取り除くために、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、ゲノム編集を使用してＴＮＦαＲＩＩ受容体を無効化し、陰性対照では、ゲノム編集を使用してＴＮＦαの発現を無効化したが、ＴＮＦαＲＩＩ受容体は無効化しなかった。
一態様では、本発明は、操作された細胞における配列番号１の使用に関する。
別の態様では、本発明は、生物学的アッセイにおける、本明細書で開示されるような、本発明による細胞の使用に関する。
さらに別の態様では、本発明は、診断又は診断法における、本明細書で開示されるような、本発明による細胞の使用に関する。
本発明は、アッセイにおける増強されたダイナミックレンジ及び／又は増大した感度のための、アッセイにおける本発明による細胞の使用にも関する。
一態様では、本発明は、アッセイにおける増強されたダイナミックレンジ及び／又は増大した感度のための、アッセイにおける本発明による細胞の使用に関し、前記細胞は、抗体のＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を評価するために使用される。
定義
本明細書で互換的に使用される用語「無効化されている」又は「突然変異している」は、特定の遺伝子をノックアウトして、細胞の表現型を最終的に変化させることを意味する。実際上、該用語は、遺伝子を非機能性にすることを包含することを意味する。一例は、表面細胞受容体の発現を除去するための、ある特定の遺伝子の無効化であり得る。
「＋＋細胞」に関する用語「＋＋」は、抗原（薬物標的）が過剰発現している標的細胞を意味することが意図される。この術語は本明細書で「Ｔ＋」と互換的に使用される。さらに、この表現が、例えばＣＤ２０＋＋のように受容体又は抗原と一緒に使用される場合、問題の細胞でＣＤ２０が過剰発現していることを意味することが意図される。本発明の範囲を限定することを意図しない一例として、ＣＤ２０の場合には、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているように、発現レベルは、野生型ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞と比較して、ＣＤ２０＋＋標的細胞でおよそ１６倍高まっている。
ｅｒｂＢ２及びＥＲＢＢ２という用語は互換的であり、例えばトラスツズマブによって認識される抗原を示す。
「－／－細胞」に関する用語「－／－」は、抗原（薬物標的）が発現していない、すなわち、問題の抗原／受容体の発現を消すために関連する遺伝子がノックアウトされている（無効化されている）、標的細胞を意味することが意図される。この術語は本明細書で「Ｔ－」と互換的に使用される。したがって、細胞は、特定の抗原をコードする遺伝子が非機能的にされているので、抗体によって認識される検出可能レベルの特定の抗原をもはや発現しない。本発明の文脈において、これは対照標的細胞とみなされ得る。
用語「Ｅ」は、「エフェクター細胞」、特に本発明によるエフェクター細胞を意味することが意図される。用語「エフェクター細胞」は、刺激に活発に応答し、いくらかの変化をもたらす（それを引き起こす）、任意のタイプの任意の細胞を意味することが意図される。そのような一例は、腫瘍細胞を溶解することができる強く生産的な細胞傷害性エフェクター細胞である、サイトカイン誘導性キラー細胞である。さらなる例において、及び本発明の文脈において、エフェクター細胞は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ又はＦＣＧＲ）を前記細胞の表面に有する任意の細胞であって、抗体がそれ自体で標的細胞に特異的に結合することができる細胞を意味することが意図される。
用語「Ｔ」は、「標的細胞」、すなわち、特定のホルモン、抗原、抗体、抗生物質、感作Ｔ細胞又は他の物質と反応する特定の受容体／抗原を有する任意の細胞を意味することが意図される。それに関連して、用語「（Ｔ＋）」は、抗原陽性標的細胞、したがって、その表面で抗原を発現し、抗体の結合を可能にする細胞を意味することが意図される。これに対して、用語「（Ｔ－）」は、抗原陰性標的細胞（対照標的細胞）、したがって、その表面で抗原を発現せず、それにより抗体と反応することができない細胞を意味することが意図される。言い換えれば、抗原－／－細胞（又はＴ－細胞）は、特定の抗原をコードする遺伝子が非機能的にされているので、ＡＤＣＣ活性について試験される抗体によって認識される検出可能レベルの特定の抗原を発現しない。特に、本発明に従って使用される標的細胞は、通常、Ｔ＋細胞として１つの細胞型を用い、Ｔ－細胞として別の細胞型を用いる公知の方法と対照的に、同じタイプの細胞である。言い換えれば、アッセイされる抗体によって認識される特定の抗原を発現しないことを除いては、抗原陽性標的（Ｔ＋）細胞とすべての点で同一の同じ細胞である対照標的細胞である。前述のように、これは、例えば、ＣＤ２０発現Ｂ細胞標的細胞を使用するリツキシマブ活性の定量化のための対照標的細胞として使用されることが多いＴ細胞（Ｔリンパ球）の使用と対照的である。
（例１）
共刺激性受容体ＣＤ２８を過剰発現する、操作されたＣＤ１６応答性エフェクター細胞系の確立
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子に機能的に連結された、ＣＤ１６ＡのＶ変異体又はＦ変異体のいずれかを発現するジャーカット細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２）に、共刺激性受容体ＣＤ２８をコードする遺伝子をトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１２７０２８０）と共にＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２２５４９９１３）を使用して、陽性クローンを濃縮した。ＡＤＣＣ活性化ＦＬ活性がＲＬ活性の構成的発現に対して正規化されることを可能にし、細胞濃度とは関係のない結果を与える、構成的プロモーターの制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）をコードする遺伝子も細胞にトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ２０を過剰発現するＡＤＣＣ標的細胞及びリツキシマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。安定なサブクローンを単離し、これは、以下の例で例示するように、抗体によって特異的に認識される抗原を発現し、且つＣＤ８０及び又はＣＤ８６を含む１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する組換え標的細胞と併せて抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、増強されたＦＬシグナルを発現することを示した。
（例２）
共刺激性受容体ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を過剰発現する、操作されたＣＤ１６応答性エフェクター細胞系の確立
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子に機能的に連結された、ＣＤ１６ＡのＶ変異体又はＦ変異体のいずれかを発現するジャーカット細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２）に、共刺激性受容体ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。一連の一過的トランスフェクション実験の結果は、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を発現するジャーカットエフェクター細胞におけるＣＤ１３７の発現は、ＥＲＢＢ２及び１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて使用した場合に、トラスツズマブを使用するＡＤＣＣアッセイのＦＬシグナルを顕著に増大させたことを示す（図１Ａ）。ＣＤ１３７をコードする遺伝子をＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているエフェクター細胞に安定にトランスフェクトした後、蛍光活性化セルソーティング及びＡｌｅｘａ－４８８コンジュゲート抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体（Ｒ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＦＡＢ８３８Ｇ）を使用して、陽性クローンを濃縮した。ＡＤＣＣ活性化ＦＬ活性がＲＬ活性の構成的発現に対して正規化されることを可能にし、細胞濃度とは関係のない結果を与える、構成的プロモーターの制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）をコードする遺伝子も細胞にトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＥＲＢＢ２を過剰発現するＡＤＣＣ標的細胞及びトラスツズマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。安定なサブクローンを単離し、これは、以下の例で例示するように、抗体によって特異的に認識される抗原を発現し、且つＣＤ８０及び又はＣＤ８６を含む１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する組換え標的細胞と併せて抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、増強されたＦＬシグナルを発現することを示した。
（例３）
ゼータシグナリング鎖を単独で又は共刺激性受容体ＣＤ２８と一緒に過剰発現する、操作されたＣＤ１６Ａ応答性エフェクター細胞系の確立
ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体からのＩＴＡＭシグナリングを最適化するために、したがって、ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジ及び感度を増大させるために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を発現するジャーカットエフェクター細胞、又は例１に記載されるＣＤ２８を過剰発現するエフェクター細胞に、３つのＩＴＡＭ活性化モチーフを含有するＣＤ３に会合した膜貫通ゼータシグナリング分子（ＣＤ２４７）（４）をトランスフェクトした。一連の一過的トランスフェクション実験の結果は、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を発現するジャーカットエフェクター細胞における、ゼータ膜貫通型シグナリング分子の単独での（図１Ｂ）、又はＣＤ２８との過剰発現は、ＥＲＢＢ２を単独で又はＣＤ８６と一緒に過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて使用した場合に、トラスツズマブを使用するＡＤＣＣアッセイのＦＬシグナルを顕著に増大させたことを示す（図１Ｂ）。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、膜貫通ゼータシグナリング分子（ＣＤ２４７）をＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているエフェクター細胞に安定にトランスフェクトした後、蛍光活性化セルソーティング及びＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ２４７モノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ、カタログ番号Ｈ４６－９６８）を使用して、陽性クローンを濃縮した。ＡＤＣＣ活性化ＦＬ活性がＲＬ活性の構成的発現に対して正規化されることを可能にし、細胞濃度とは関係のない結果を与える、構成的プロモーターの制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子も細胞にトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＥＲＢＢ２を過剰発現するＡＤＣＣ標的細胞及びトラスツズマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。前記細胞の使用によって、抗体によって特異的に認識される抗原を発現し、且つＣＤ８０及び／又はＣＤ８６を含む１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する組換え標的細胞と併せて抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために使用する場合に、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度がもたらされた。
（例４）
操作されたＣＤ３２応答性エフェクター細胞系の確立
ＦｃγＲＩＩＡ受容体からのシグナリング、したがって、ＡＤＣＰアッセイのダイナミックレンジ及び感度を最適化するために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規な合成キメラプロモーターによって調節されるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡ受容体をジャーカット細胞にトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及びＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ３２モノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ、カタログ番号ａｂ３０３５６）を使用して、陽性クローンを濃縮した。ＡＤＣＰ活性化ＦＬ活性がＲＬ活性の構成的発現に対して正規化されることを可能にし、細胞濃度とは関係のない結果を与える構成的プロモーターの制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）をコードする遺伝子も細胞にトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ２０を過剰発現する標的細胞及びリツキシマブの存在下でＡＤＣＰ活性について特性評価した。抗体によって特異的に認識される抗原を発現し、且つＣＤ８０及び又はＣＤ８６を含む１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する組換え標的細胞と併せて、抗体のＡＤＣＰ活性を評価するために前記エフェクター細胞を使用することによって、以下の例で例示するＮＦＡＴキメラプロモーターの制御下にあるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡを発現する細胞と比較して、シグナル、ダイナミックレンジ及び感度が増強されたＡＤＣＰアッセイがもたらされた。
（例５）
高い一定レベルのＣＤ２０及び１種又は複数の共刺激性分子を細胞表面で発現する、操作された標的細胞系の確立。
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、高い一定レベルのＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８６）に、共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方をトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及びフィコエリスリン標識化抗ＣＤ８０（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１２７０８０４）又はＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ８６（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１４８０８６３）モノクローナル抗体を使用して、陽性クローンを濃縮した。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣエフェクター細胞及びリツキシマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性評価し、増殖させて、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するＣＤ２０＋＋標的細胞系を生じさせた。
ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアル及びＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するＣＤ２０＋＋標的細胞のバイアルを標準的な技法を使用して別々に凍結した。解凍すると、エフェクター細胞と標的細胞を３：１のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ １６４０培養培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の漸増濃度のリツキシマブの存在下で、９６ウェル白色側面マイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８１）中で４時間インキュベートした。次いで、Ｄｕａｌ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ２２９２０）二重ルシフェラーゼ基質を使用してＦＬ活性を決定し、ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において光放出を定量化し、これを相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表した。結果は、図２Ａに示すように、４－パラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で提示する。図２Ａに付随する表及び表１は、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及び所与の標的細胞に対する４ＰＬプロットの主要なパラメーターの概要を述べる。ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現するＣＤ２０＋＋標的細胞を使用した場合、ＣＤ８０を過剰発現する標的細胞を使用してＡＤＣＣアッセイの最大ＦＬシグナルは増大したが、ＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞の使用と比較して、ダイナミックレンジと感度の両方は低減した。同様に、ＣＤ８６を単独で又はＣＤ８６と一緒に過剰発現させると、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて使用した場合に、ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジ及び感度が低減した（図２Ａ）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するエフェクター細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６を過剰発現するＣＤ２０＋＋標的細胞を使用した場合、最大ＦＬシグナルが増大しないこと及び低減したダイナミックレンジが観察された（図２Ｂ）。さらに、アッセイの感度は、有意に影響を受けなかったか又は低下しなかったかのいずれかであった（図２Ｂ）。
ＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞における共刺激性分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の過剰発現は、ＣＤ２０を単独で過剰発現するＲａｊｉ標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するためのアッセイの感度及びダイナミックレンジを低減させるという観察は、親Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ８０及びＣＤ８６の発現の高い内在レベルとほぼ確実に関係があり（５）、発現レベルをさらにもっと増大させると、エフェクター細胞ＣＤ２８標的細胞のＣＤ８０－ＣＤ８６相互作用のＣＴＬＡ－４モジュレーションをほぼ確実に誘導する（５）。
ＣＤ２０を単独で、又はＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０とＣＤ８６との両方一緒とともに過剰発現する前記Ｒａｊｉ標的細胞は、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジ及び感度が顕著に増強されたＡＤＣＣアッセイをもたらした（図３Ａ）。しかし、最大ＦＬシグナルは、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を用いて観察されるものよりも低かった（図３Ａ）。ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するエフェクター細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６を過剰発現するＣＤ２０＋＋標的細胞を使用した場合、ＣＤ２０＋＋標的細胞を単独で使用して観察されるものと比較して、最大ＦＬシグナルが増大しないこと、並びに低減したダイナミックレンジ及び低減した感度が観察されたが（図３Ｂ）、アッセイのダイナミックレンジと感度の両方は、それにもかかわらず、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用して観察されるものより優れていた（図３Ｂ）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｖ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＦＬシグナルが増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図４Ａ、表１）。ＡＤＣＣアッセイの感度は、わずかに低減したか又は有意に変化しなかったかのいずれかであった（図４Ａ、表１）が、ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジは、未処理の対照試料及びリツキシマブで処理した試料の両方でＦＬシグナルが全体的に増大したことが理由で、ＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞と比較して、ＣＤ８０又はＣＤ８６のいずれかを単独で、又はＣＤ８０と一緒に過剰発現する標的細胞を使用する場合に低減した（図４Ａ、表１）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｆ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８０又はＣＤ８６と一緒にＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞の使用と比較して、ＦＬシグナルが増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図４Ｂ）。しかし、ＡＤＣＣアッセイの感度は、ＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞の使用と比較して、影響を受けなかったか又はわずかに低減したかのいずれかであった（図３Ｂ及び４Ｂ）が、ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジは、未処理の対照試料及びリツキシマブで処理した試料の両方でＦＬシグナルが全体的に増大したことが理由で、ＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞と比較して、ＣＤ２８を過剰発現するエフェクター細胞及びＣＤ８０又はＣＤ８６のいずれかを過剰発現する標的細胞を使用する場合に低減した（図３Ｂ及び４Ｂ）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｖ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ２０を単独で、又はＣＤ８０若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒に過剰発現するＲａｊｉ標的細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジが増強され、感度が顕著に増強されたＡＤＣＣアッセイをもたらした（図３Ａ）。しかし、最大ＦＬシグナルは、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を用いて観察されるものよりも低かった（図３Ａ）。
リツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６とともにＣＤ２０を過剰発現するＲａｊｉ標的細胞と一緒に、例１に記載される、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現し且つＣＤ２８を過剰発現するジャーカットエフェクター細胞を使用することによって、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジ及び感度が増大したＡＤＣＣアッセイがもたらされた（図３Ｂ）。これに対して、アッセイの最大ＦＬシグナルは、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用する場合に、より大きかった（図５Ｂ）。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＣＤ２０を過剰発現する組換えＲａｊｉ標的細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、前記エフェクター細胞及びＣＤ２０を単独で過剰発現する標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＣＤ２０を過剰発現する組換えＲａｊｉ標的細胞と併せて、リツキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴキメラプロモーターの制御下にあるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡを発現するエフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
（例６）
高い一定レベルのｅｒｂＢ２及び１種又は複数の共刺激性分子を細胞表面で発現する、操作された標的細胞系の確立。
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている、高い一定レベルのｅｒｂＢ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ １５７３）に、共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方をトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及びフィコエリスリン標識化抗ＣＤ８０（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１２７０８０４）又はＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ８６（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１４８０８６３）モノクローナル抗体を使用して、陽性クローンを濃縮した。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣエフェクター細胞及びトラスツズマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性評価し、増殖させて、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するｅｒｂＢ２＋＋標的細胞系を生じさせた。
ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアル及びＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するｅｒｂＢ２＋＋標的細胞のバイアルを標準的な技法を使用して別々に凍結した。解凍すると、エフェクター細胞と標的細胞とを４：１のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ １６４０培養培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の漸増濃度のトラスツズマブの存在下で、９６ウェル白色側面マイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８１）中で、６時間インキュベートした。次いで、Ｄｕａｌ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ２２９２０）二重ルシフェラーゼ基質を使用してＦＬ活性を決定し、ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において光放出を定量化し、これを相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表した。結果は、図６から９に示すように、４－パラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で提示する。図に付随する表及び表２は、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋標的細胞に対する４ＰＬプロットの主要なパラメーターの概要を述べる。
ｅｒｂＢ２を過剰発現する前記細胞が、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用された場合は、ＡＤＣＣアッセイの最大ＦＬシグナル及びダイナミックレンジの増大は、ｅｒｂＢ２とＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞を使用する場合に最も顕著であった（図６Ａ）。ＦＬシグナル及びダイナミックレンジの増大は、ｅｒｂＢ２を単独で過剰発現する細胞と比較して、ｅｒｂＢ２及びＣＤ８０又はｅｒｂＢ２及びＣＤ８０とＣＤ８６とを過剰発現する標的細胞を使用しても観察された（図Ａ、表１）。共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６の過剰発現もアッセイの感度を増大させた。感度の最大の増大は、ｅｒｂＢ２及びＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用して観察され、続いてｅｒｂＢ２及びＣＤ８０を発現する標的細胞であったが、ｅｒｂＢ２及びＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞をした場合は、感度のわずかな増大しか観察されなかった（図６Ａ、表２）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するジャーカットエフェクター細胞は、ｅｒｂＢ２とＣＤ８０との両方又はｅｒｂＢ２及びＣＤ８６を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが顕著に増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図６Ｂ）。ＡＤＣＣアッセイの感度は、ｅｒｂＢ２とＣＤ８０との両方を過剰発現する標的細胞を使用しても増大したが、ｅｒｂＢ２及びＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用する場合に低下した（図６Ｂ）。
ｅｒｂＢ２を単独で、又はＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方一緒とともに過剰発現する、前記ＨＥＫ２９３標的細胞は、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジ及び感度が顕著に増強されたＡＤＣＣアッセイをもたらした（図７Ａ）。最大ＦＬシグナルは、ｅｒｂＢ２及びＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞が、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価することになった場合にも、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ標的細胞を用いて観察されたものと比較して、増大した（図７Ａ）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｆ変異体エフェクター細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ｅｒｂＢ２を単独で、又はＣＤ８０若しくはＣＤ８６と一緒に過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用することによって、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが顕著に増強されたＡＤＣＣアッセイがもたらされた（図７Ｂ）。ＡＤＣＣアッセイの感度は、ｅｒｂＢ２とＣＤ８０との両方を過剰発現する標的細胞を使用しても増大したが、ｅｒｂＢ２とＣＤ８６の両方を発現する標的細胞を使用する場合には増大しなかった（図７Ｂ）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｖ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６とを一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＣＤ２８を過剰発現するジャーカットエフェクター細胞及びｅｒｂＢ２を単独で過剰発現する標的細胞の使用と比較して、ＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度が増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図８Ａ、表２）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｆ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８６と一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが増大したが、感度が低減したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図８Ｂ）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｖ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、図９Ａに示すように、ＣＤ８６と一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現するＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用するＡＤＣＣと比較して、ＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度が増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｆ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８６と一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用するＡＤＣＣと比較して、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが増大したが、感度が低減したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図９Ｂ）。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、該エフェクター細胞及び標的ＥＲＢＢ２を単独で過剰発現する細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にｅｒｂＢ２を過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴキメラプロモーターの制御下にあるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡを発現するエフェクター細胞及び野生型ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
（例７）
高い一定レベルのＥＧＦＲ及び１種又は複数の共刺激性分子を細胞表面で発現する、操作された標的細胞系の確立。
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている高い一定レベルのＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ １５７３）に共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方をトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及びフィコエリスリン標識化抗ＣＤ８０（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１２７０８０４）又はＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ８６（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１４８０８６３）モノクローナル抗体を使用して、陽性クローンを濃縮した。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣエフェクター細胞及びセツキシマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性評価し、増殖させて、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するＥＧＦＲ＋＋標的細胞系を生じさせた。ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアル及びＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するＥＧＦＲ＋＋標的細胞のバイアルを標準的な技法を使用して別々に凍結した。解凍すると、エフェクター細胞と標的細胞とを４：１のＥ：Ｔ比で混合し、９６ウェル白色側面マイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８１）中で、ＲＰＭＩ１６４０培養培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の漸増濃度のセツキシマブの存在下で、６時間インキュベートした。次いで、Ｄｕａｌ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ ２２９２０）二重ルシフェラーゼ基質を使用してＦＬ活性を決定し、ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において光放出を定量化し、これを相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表した。結果は、図１０から１３に示すように、４－パラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で提示する。図に付随する表及び表３は、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋標的細胞に対する４ＰＬプロットの主要なパラメーターの概要を述べる。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、前記標的細胞を使用した場合に、ＡＤＣＣアッセイの最大ＦＬシグナル及びダイナミックレンジは、ＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞を使用する場合に最も顕著であった。ＦＬシグナル及びダイナミックレンジの増大は、ＥＧＦＲを単独で過剰発現する細胞と比較して、ＣＤ８０又はＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用しても観察された（図１０Ａ、表３）。共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６の過剰発現もアッセイの感度を増大させたが、ＣＤ８０とＣＤ８６との両方一緒の過剰発現は、アッセイの感度を低下させた（図１０Ａ、表３）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＡＤＣＣエフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＥＧＦＲとＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞を使用することによって、ＥＧＦＲを単独で過剰発現する標的細胞の使用と比較して、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが増大したＡＤＣＣアッセイがもたらされたが、アッセイの感度は有意に変化しなかった（図１０Ｂ）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方一緒とともにＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用することによって、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジが顕著に増強され、感度が増強されたＡＤＣＣアッセイがもたらされた。これに対して、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を用いて観察される最大ＦＬシグナルは、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞並びにＥＧＦＲ及び１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する標的細胞を用いて観察されるものより大きかった（図１１Ａ、表３）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＡＤＣＣエフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＣＤ８６と一緒にＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用することによって、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、感度が増強されたが、ダイナミックレンジは変化しなかったＡＤＣＣアッセイがもたらされた。これに対して、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を用いて観察される最大ＦＬシグナルは、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞並びにＥＧＦＲ及び１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する標的細胞を用いて観察されるものより大きかった（図１１Ｂ）。
ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、例１に記載される、ＣＤ１６ＡのＶ変異体を発現し且つ共刺激性受容体ＣＤ２８を過剰発現する組換えジャーカットエフェクター細胞を使用することによって、ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されている内在レベルのＣＤ２８を発現するジャーカットエフェクター細胞及びＥＧＦＲを単独で過剰発現する標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが顕著に増大したＡＤＣＣアッセイがもたらされた（図１１Ａ及び１２Ａ、表３）。ＡＤＣＣアッセイの感度も、ＣＤ８０又はＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用する場合に、内在レベルのＣＤ２８を発現するエフェクター細胞の使用と比較して増大したが、ＥＧＦＲ及びＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞を使用する場合は、ほんのわずかしか増大しなかった（図１２Ａ、表３）。
ＣＤ８６と一緒にＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、例１に記載される、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現し且つ共刺激性受容体ＣＤ２８を過剰発現するジャーカットエフェクター細胞を使用することによって、ＥＧＦＲを単独で過剰発現する標的細胞と比較して、ＦＬシグナルが増大し、ダイナミックレンジが増大し、感度が増大したＡＤＣＣアッセイがもたらされた（図１０Ｂ＆１２Ｂ）。
例１に記載される、共刺激性受容体ＣＤ２８を過剰発現するＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用することによって、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、ダイナミックレンジが増強されたＡＤＣＣアッセイがもたらされた。アッセイの感度は、ＥＧＦＲとＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方との両方を過剰発現する標的細胞を使用しても増大した（図１３Ａ）。これに対して、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を用いて観察される最大ＦＬシグナルは、ＥＧＦＲ及び１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現するＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞を用いて観察されるものより大きかった（図１３Ａ、表３）。
例１に記載される、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現し且つＣＤ２８を過剰発現するＡＤＣＣエフェクター細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ＣＤ８６と一緒にＥＧＦＲを過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を使用することによって、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイと比較して、感度が増大したが、ダイナミックレンジは変化しなかったＡＤＣＣアッセイがもたらされた。これに対して、ＮＦＡＴ応答性エフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を用いて観察される最大ＦＬシグナルは、例１に記載されるＣＤ２８を過剰発現するＡＤＣＣ Ｆ変異体エフェクター細胞及びＥＧＦＲ及びＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を用いて観察されたものより大きかった（図１１Ｂ）。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＥＧＦＲを過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、前記エフェクター細胞及びＥＧＦＲを単独で過剰発現する標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
例３に記載されている、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にＥＧＦＲを過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、セツキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴキメラプロモーターの制御下にあるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡを発現するエフェクター細胞及び野生型Ａ４３１標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
（例８）
高い一定レベルのｍＴＮＦα及び１種又は複数の共刺激性分子を細胞表面で発現する、操作された標的細胞系の確立。
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されている高い一定レベルの膜結合型の切断不可能なＴＮＦα（ｍＴＮＦα）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ １５７３）に共刺激性分子ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方をトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング及びフィコエリスリン標識化抗ＣＤ８０（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１２７０８０４）又はＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ８６（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、カタログ番号２１４８０８６３）モノクローナル抗体を使用して、陽性クローンを濃縮した。安定なクローンを単離し、ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣエフェクター細胞及びインフリキシマブの存在下で、ＡＤＣＣ活性について特性評価し、次いでサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性評価し、増殖させて、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するｍＴＮＦα標的細胞系を生じさせた。ＷＯ２０１８／０６５４０１に開示されているｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアル及びＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現するｍＴＮＦα＋＋標的細胞のバイアルを標準的な技法を使用して別々に凍結した。解凍すると、エフェクター細胞と標的細胞とを６：１のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ １６４０培養培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の漸増濃度のインフリキシマブの存在下で、９６ウェル白色側面マイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８１）中で、６時間インキュベートした。次いで、Ｄｕａｌ Ｇｌｏ二重ルシフェラーゼ基質を使用してＦＬ活性を決定し、ルミノメーターにおいて光放出を定量化し、これを相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表した。結果は、図６から９に示すように、４－パラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態として提示する。図に付随する表及び表４は、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦα＋＋標的細胞に対する４ＰＬプロットの主要なパラメーターの概要を述べる。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＡＤＣＣ Ｖ変異体エフェクター細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、前記標的細胞を使用した場合は、ＡＤＣＣアッセイの最大ＦＬシグナル及びダイナミックレンジは、ＣＤ８０及びＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用する場合に最も顕著であった。ＦＬシグナル及びダイナミックレンジの増大は、ｍＴＮＦαを単独で過剰発現する細胞と比較して、ＣＤ８０又はＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用しても観察された（図１４Ａ、表４）。共刺激性分子ＣＤ８０の過剰発現は、アッセイの感度も増大させたが、ＣＤ８６又はＣＤ８０及びＣＤ８６同時の過剰発現はこれを増大させなかった（図１４Ａ、表４）。
ＷＯ２０１８／０６５４０１で以前に開示されているＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現するＡＤＣＣエフェクター細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために、ｍＴＮＦαを発現し、且つ１種又は複数の共刺激性分子を過剰発現する標的細胞を使用することによって、ＦＬシグナル及びダイナミックレンジが増大したＡＤＣＣアッセイがもたらされ、この増大は、ＣＤ８６を過剰発現する標的細胞を使用する場合に最も顕著であった（図１４Ｂ）。ＦＬシグナル及びダイナミックレンジの増大は、ｍＴＮＦαを単独で過剰発現する細胞と比較して、ＣＤ８０を過剰発現する標的細胞を使用しても観察された（図１４Ｂ）。共刺激性分子ＣＤ８０の過剰発現は、アッセイの感度をわずかに低下させた。感度の低下は、ｍＴＮＦαとＣＤ８６との両方を過剰発現する標的細胞でより顕著であった（図１４Ｂ）。
例１に記載される組換えジャーカットエフェクター細胞Ｖ変異体における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にｍＴＮＦαを発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、共刺激性分子ＣＤ８０を過剰発現する標的細胞の場合は、ＦＬシグナルが増大し、感度がわずかに増大したＡＤＣＣアッセイをもたらしたが、ＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にｍＴＮＦαを過剰発現する標的細胞を使用した場合は、アッセイの感度が低減した（図１７Ａ、表４）。ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジは、未処理の対照試料とインフリキシマブで処理した試料との両方でＦＬシグナルが全体的に増大したことが理由で、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６とを過剰発現する標的細胞を使用する場合に、内在レベルのＣＤ２８を発現するエフェクター細胞の使用と比較して、ｍＴＮＦαとＣＤ８０との両方を発現する標的細胞を使用した場合に有意に影響を受けなかったか又はｍＴＮＦα及びＣＤ８６若しくはｍＴＮＦα及びＣＤ８０とＣＤ８６との両方を発現する標的細胞を使用した場合に低下したかのいずれかであった（図１７、表４）。
例１に記載される、ＣＤ１６ＡのＦ変異体を発現する組換えジャーカットエフェクター細胞における共刺激性受容体ＣＤ２８の過剰発現は、ＣＤ８０又はＣＤ８６と一緒にｍＴＮＦαを発現するＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＣ活性を評価するために使用した場合に、ｍＴＮＦαを単独で発現する標的細胞の使用と比較して、ＦＬシグナルが増大したＡＤＣＣアッセイをもたらした（図１７Ｂ）。これに対して、アッセイの感度は有意に影響を受けず、ＡＤＣＣアッセイのダイナミックレンジは、未処理の対照試料とインフリキシマブで処理した試料との両方でＦＬシグナルが全体的に増大したことが理由で、ＣＤ８６を過剰発現する標的細胞使用する場合に、内在レベルのＣＤ２８を発現するエフェクター細胞の使用と比較して、低下した（図１７Ｂ）。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ｍＴＮＦαを発現し、且つＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方を過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、前記エフェクター細胞及びｍＴＮＦαを単独で過剰発現する標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
例４に記載される、ＣＤ３２ＡのＨ－１３１変異体を発現するエフェクター細胞は、ＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ８０とＣＤ８６との両方と一緒にｍＴＮＦαを過剰発現する組換えＨＥＫ２９３標的細胞と併せて、インフリキシマブのＡＤＣＰ活性を評価するために使用した場合に、ＮＦＡＴキメラプロモーターの制御下にあるＦＬレポーター遺伝子に機能的に連結されたＦｃγＲＩＩＡを発現するエフェクター細胞及びｍＴＮＦα標的細胞を使用するＡＤＣＰアッセイと比較して、増強されたＦＬシグナル、ダイナミックレンジ及び感度を示した。
特定の実施形態では、本発明は以下の項目にも関する。
項目：
１．ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞。
２．抗体が特異的である内在性標的が無効化されている組換え標的細胞。
３．抗体が特異的である標的の発現が増強されている組換え標的細胞。
４．ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＣＲＥＢ及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞、
抗体が特異的である内在性標的が無効化されている組換え標的細胞（従属項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３及びＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）、
及び
抗体が特異的である標的の発現が増強されている組換え標的細胞。（従属項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３＆ＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）
を含む、キット。
特定の実施形態では、本発明は以下の条項にも関する。
条項：
１．ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞。
２．抗体が特異的である内在性標的が無効化されている組換え標的細胞。
３．抗体が特異的である標的の発現が増強されている組換え標的細胞。
４．配列番号１に開示されているヌクレオチド配列を含む、ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ及びＳＴＡＴ５に結合する制御配列。
５．ＮＦ－ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＣＲＥＢ及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞、
抗体が特異的である内在性標的が無効化されている組換え標的細胞（従属項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３及びＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）、
及び
抗体が特異的である標的の発現が増強されている組換え標的細胞（従属項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３及びＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）
を含む、キット。
さらに、さらに特定の実施形態では、本発明は以下の注記にも関する。
注記：
１．ＣＤ２８をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
２．ＣＤ１３７をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
３．ＣＤ２４７をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
４．ＣＤ８０をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
５．ＣＤ８６をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
６．ＣＤ１３７Ｌをコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
７．ポリヌクレオチド配列番号１を含むベクター構築物。
８．プラスミド又はウイルスベクターである、条項１から７までに記載のベクター。
９．注記１から８までのいずれかに記載のベクターの１つ又は複数を含む細胞。
１０．哺乳動物細胞である、条項９に記載の細胞。
１１．前記ベクターがエピソームであるか又は前記細胞のゲノム中に組み込まれている、注記１から８までに記載の細胞。
１２．第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、注記１から１１までのいずれかに記載の細胞。
１３．ジャーカット、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ－１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ－４０又はＭＳＢ－１である、注記１から１２までのいずれかに記載の細胞。
１３．ｉ） 注記９から１３までのいずれかに記載の細胞、
ｉｉ） 抗体が特異的である内在性標的が無効化されている（突然変異している）細胞、
及び
ｉｉｉ） 抗体が特異的である標的の発現が増強されている細胞
を含む、キット。
１４．ｉｉ）の標的細胞において無効化されている標的が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの１つ又は複数を含む、注記１４に記載のキット。
１５．ｉｉｉ）の標的細胞において増強されている標的が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの１つ又は複数を含む、注記１５に記載のキット。
１６．２つのバイアルを含む、注記１４から１６までのいずれかに記載のキット。
１７．ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が最適なＥ：Ｔ比で１つの同じバイアル中に存在する、注記１４から１６までのいずれかに記載のキット。
１８．ｉ）の細胞とｉｉｉ）の標的細胞との間の比（Ｅ：Ｔ比）が約２４：１から約２：１の範囲、又は例えば約６：１、若しくは例えば約３：１、若しくは例えば約１．５：１である、注記１４から１６までのいずれかに記載のキット。
さらに別の態様では、本発明は以下のパラグラフに関する。
１．１種又は複数の共刺激性分子をコードするベクター構築物を含む細胞。
２．ベクター構築物が、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１に記載の細胞。
３．ベクター構築物が共刺激性分子ＣＤ２８をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、パラグラフ１に記載の細胞。
４．ベクター構築物が共刺激性分子ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、パラグラフ１に記載の細胞。
５．ベクター構築物が共刺激性分子ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）をコードするポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１に記載の細胞。
６．ベクター構築物が共刺激性分子ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１に記載の細胞。
７．共刺激性分子が、ＣＤ２８、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢ）及びＩＣＯＳの１つ又は複数から選択される受容体である、パラグラフ１から６までのいずれかに記載の細胞。
８．１種又は複数の共刺激性分子が細胞で構成的に発現しているか又は過剰発現している、パラグラフ１から７までのいずれかに記載の細胞。
９．ＣＤ１６Ａ又はＣＤ３２をさらに発現する、パラグラフ１から８までのいずれかに記載の細胞。
１０．ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）が特に無効化されている、パラグラフ１から９までのいずれかに記載の細胞。
１１．初代細胞又は細胞系である、パラグラフ１から１０までのいずれかに記載の細胞。
１２．例えば、ジャーカット、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ－１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ－４０又はＭＳＢ－１などの動物細胞系である、パラグラフ１から１１までのいずれかに記載の細胞。
１３．前記ベクターがエピソームであるか又は前記細胞のゲノム中に組み込まれている、パラグラフ１から１２までのいずれかに記載の細胞。
１４．第１のレポータータンパク質をさらに発現する、パラグラフ１から１３までのいずれかに記載の細胞。
１５．第１のレポータータンパク質が、例えばルシフェラーゼなどの酵素又は蛍光タンパク質である、パラグラフ１から１４までのいずれかに記載の細胞。
１６．第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、パラグラフ１から１５までのいずれかに記載の細胞。
１７．抗体又はＦｃ融合タンパク質によって認識される抗原をさらに発現する、パラグラフ１から１６までのいずれかに記載の細胞。
１８．抗体又はＦｃ融合タンパク質によって認識される抗原をさらに過剰発現する、パラグラフ１から１７までのいずれかに記載の細胞。
１９．ｉ） 抗体のＦｃ領域に結合し、１種若しくは複数の共刺激性分子を発現するか又は１種若しくは複数の共刺激性分子を過剰発現することができる、パラグラフ１から１８までのいずれかに記載のエフェクター細胞（Ｅ）、
ｉｉ） 前記抗体が特異的である内在性標的／抗原が無効化されている（突然変異している）標的細胞（Ｔ－）であって、その結果、標的／抗原が細胞によって発現されないか又は非機能的形態で発現される、標的細胞（Ｔ－）、及び
ｉｉｉ） 前記抗体が特異的である標的の発現が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ及び（ＣＤ２７８Ｌ）ＩＣＯＳＬを含む１種又は複数の共刺激性分子と一緒に増強されているか又は過剰発現している、標的細胞（Ｔ＋）
を含む、キット。
２０．ｉｉ）の細胞及び細胞ｉｉｉ）が、ｉｉ）の細胞がアッセイされる抗体又は薬物によって認識される特定の抗原を発現しないことを除いては、すべての点で同一の全く同じ細胞である、パラグラフ１９に記載のキット。
２１．標的／抗原がＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの１つ又は複数である、パラグラフ１９から２０までのいずれか１つに記載のキット。
２２．２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が最適なＥ：Ｔ比で１つの同じバイアル中に存在する、パラグラフ１９から２１までのいずれかに記載のキット。
２３．ｉ）のエフェクター細胞とｉｉｉ）の標的細胞との間の比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１から約２：１の範囲、又は約６：１、若しくは約３：１、若しくは約１．５：１である、パラグラフ１９から２２までのいずれかに記載のキット。
２４．治療用抗体の抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を定量化するための方法であって、
ａ） 抗体を含有する得られた試料を、エフェクター細胞ｉ）及びパラグラフ１９のｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ） エフェクター細胞ｉ）及び薬物標的が無効化されたパラグラフ１９のｉｉ）に記載の細胞ｉｉ）の存在下で得られたシグナルをパラグラフ１から１８までのいずれか１つに記載のエフェクター細胞ｉ）及びパラグラフ１９のｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから引くステップ、
ｃ） ａ）及びｂ）で測定されたシグナル相関に基づいてＡＤＣＣ活性を決定するステップ
を含む、方法。
２５．治療用抗体の抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性を定量化するための方法であって、
ａ） 抗体を含有する得られた試料をエフェクター細胞ｉ）及びパラグラフ１９のｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ） エフェクター細胞ｉ）及び薬物標的が無効化されたパラグラフ１９のｉｉ）に記載の細胞ｉｉ）の存在下で得られたシグナルをパラグラフ１から１８までのいずれか１つに記載のエフェクター細胞ｉ）及びパラグラフ１９のｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから引くステップ、
ｃ） ａ）及びｂ）で測定されたシグナル相関に基づいてＡＤＣＰ活性を決定するステップ
を含む、方法。
［参考文献］
Figure 0007059390000004
＜２２３＞人工的

Claims (20)

  1. １種又は複数の共刺激性分子をコードするベクター構築物を含む細胞であって、
    前記ベクター構築物が、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列を含み、
    前記ベクター構築物が、共刺激性分子ＣＤ２８、共刺激性分子ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、共刺激性分子ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）及び共刺激性分子ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）から選択される１つ若しくは複数をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、又は共刺激性分子が、ＣＤ２８、ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢ）及びＩＣＯＳの１つ又は複数から選択される受容体である、細胞。
  2. 前記１種又は複数の共刺激性分子が前記細胞で構成的に発現しているか又は過剰発現している、請求項１に記載の細胞。
  3. ＣＤ１６Ａ又はＣＤ３２をさらに発現する、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）が特異的に無効化されている、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞。
  5. 初代細胞又は細胞株である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の細胞。
  6. ジャーカット、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ－１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ－４０及びＭＳＢ－１からなる群から選択される動物細胞株である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の細胞。
  7. 前記ベクター構築物がエピソームであるか又は前記細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の細胞。
  8. 第１のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
  9. 前記第１のレポータータンパク質が、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質である、請求項８に記載の細胞。
  10. 前記第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項８または９に記載の細胞。
  11. 抗体又はＦｃ融合タンパク質によって認識される抗原をさらに発現するか又は過剰発現する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞。
  12. ｉ） 抗体のＦｃ領域に結合し、１種若しくは複数の共刺激性分子を発現するか又は１種若しくは複数の共刺激性分子を過剰発現することができる、請求項１から１１までのいずれか一項に記載する細胞である、エフェクター細胞（Ｅ）、
    ｉｉ） 該抗体が特異的である内在性標的／抗原が無効化されており（突然変異している）、その結果、該標的／抗原が該細胞によって発現されないか又は非機能的形態で発現される、標的細胞（Ｔ－）、及び
    ｉｉｉ） 該抗体が特異的である該標的の発現が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ及び（ＣＤ２７８Ｌ）ＩＣＯＳＬを含む１種又は複数の共刺激性分子と一緒に増強されているか又は過剰発現している、標的細胞（Ｔ＋）
    を含む、キット。
  13. ｉｉ）の前記細胞及び前記細胞ｉｉｉ）が、ｉｉ）の前記細胞が、アッセイされる前記抗体又は薬物によって認識される特定の抗原を発現しないことを除いては、すべての点で全く同一の同じ細胞である、請求項１２に記載のキット。
  14. 前記標的／抗原がＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの１つ又は複数である、請求項１２又は１３に記載のキット。
  15. ２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）の前記細胞が最適なＥ：Ｔ比で１つの同じバイアル中に存在し、ｉ）の前記エフェクター細胞とｉｉｉ）の前記標的細胞との間の該比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１から約２：１の範囲、又は約６：１、若しくは約３：１、若しくは約１．５：１である、請求項１２から１４までのいずれか一項に記載のキット。
  16. 治療用抗体の抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を定量化するための方法であって、
    ａ） 抗体を含有する試料を、請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ＋）と接触させるステップと、
    ｂ） 請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ－）の存在下で得られたシグナルを、請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ＋）の存在下で得られたシグナルから引くステップと、
    ｃ） ａ）及びｂ）で測定されたシグナル相関に基づいて該ＡＤＣＣ活性を決定するステップと
    を含む、方法。
  17. 治療用抗体の抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性を定量化するための方法であって、
    ａ） 抗体を含有する試料を、請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ＋）と接触させるステップ、
    ｂ） 請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ－）の存在下で得られたシグナルを、請求項１２のｉ）に記載のエフェクター細胞（Ｅ）及び請求項１２のｉｉｉ）に記載の標的細胞（Ｔ＋）の存在下で得られたシグナルから引くステップ、
    ｃ） ａ）及びｂ）で測定されたシグナル相関に基づいて該ＡＤＣＰ活性を決定するステップ
    を含む方法。
  18. 生物学的アッセイにおける、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の細胞の使用。
  19. アッセイにおける増強されたダイナミックレンジ及び／又は増大した感度のための、該アッセイにおける請求項１から１１までのいずれか一項に記載の細胞の使用。
  20. 前記細胞が抗体のＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を評価するために使用される、請求項１９に記載の使用。
JP2020549787A 2018-03-19 2019-03-14 Ａｄｃｃ及びａｄｃｐ活性の改善された定量化のためのシステム及び製品 Active JP7059390B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18162485 2018-03-19
EP18162485.9 2018-03-19
PCT/EP2019/056403 WO2019179871A1 (en) 2018-03-19 2019-03-14 SYSTEM AND PRODUCTS FOR IMPROVED QUANTIFICATION OF ADCC and ADCP ACTIVITY

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021518123A JP2021518123A (ja) 2021-08-02
JP7059390B2 true JP7059390B2 (ja) 2022-04-25

Family

ID=61827487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020549787A Active JP7059390B2 (ja) 2018-03-19 2019-03-14 Ａｄｃｃ及びａｄｃｐ活性の改善された定量化のためのシステム及び製品

Country Status (6)

Country Link
US (1) US12025620B2 (ja)
EP (1) EP3749785B1 (ja)
JP (1) JP7059390B2 (ja)
KR (1) KR102593359B1 (ja)
ES (1) ES2955588T3 (ja)
WO (1) WO2019179871A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015179833A1 (en) 2014-05-23 2015-11-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating antibody resistance
WO2016040441A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Unum Therapeutics Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
WO2017186121A1 (zh) 2016-04-26 2017-11-02 科济生物医药（上海）有限公司 一种改善免疫应答细胞功能的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2262905B1 (en) 2008-03-04 2015-02-25 Centre National De La Recherche Scientifique Cell, method and kit for conducting an assay for neutralizing antibodies
US11280790B2 (en) 2016-10-04 2022-03-22 Svar Life Science Ab System and products for improved quantification of ADCC activity
KR20190118164A (ko) 2017-01-30 2019-10-17 유넘 테라퓨틱스 인크. 개선된 항체-커플링된 t 세포 수용체 구축물 및 그의 치료 용도
CA3053640A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Unum Therapeutics Inc. Co-use of anti-bcma antibody and antibody-coupled t celll receptor (actr) in cancer therapy and b cell disorders
KR20190137137A (ko) 2017-04-07 2019-12-10 사바 라이프 사이언스 에이비 자동화된 면역-분석 플랫폼들에 대한 분석을 위한 세포-기반 분석들의 적응을 위한 시스템

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015179833A1 (en) 2014-05-23 2015-11-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating antibody resistance
WO2016040441A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Unum Therapeutics Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
WO2017186121A1 (zh) 2016-04-26 2017-11-02 科济生物医药（上海）有限公司 一种改善免疫应答细胞功能的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Immunology Research, 2017, Article ID 3908289

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021518123A (ja) 2021-08-02
EP3749785B1 (en) 2023-06-21
WO2019179871A1 (en) 2019-09-26
KR20200131865A (ko) 2020-11-24
US12025620B2 (en) 2024-07-02
KR102593359B1 (ko) 2023-10-24
EP3749785A1 (en) 2020-12-16
US20210072256A1 (en) 2021-03-11
ES2955588T3 (es) 2023-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6929368B2 (ja) Ａｄｃｃ活性の改良された定量のためのシステム及び製品
JP2022023062A (ja) Ｔ細胞依存性二重特異的抗体をアッセイするための方法
CN107646038B (zh) 用于检测抗cd3同二聚体的基于细胞的测定
Cheng et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies
KR102659574B1 (ko) 모듈 폴리펩타이드 라이브러리 및 이의 제조 및 사용 방법
KR20160107304A (ko) 이중특이적 cd3 및 cd19 항원 결합 작제물
Battin et al. BTLA inhibition has a dominant role in the cis-complex of BTLA and HVEM
KR20190137137A (ko) 자동화된 면역-분석 플랫폼들에 대한 분석을 위한 세포-기반 분석들의 적응을 위한 시스템
US20220348657A1 (en) Bioassay for t-cell co-stimulatory proteins containing fc domains
WO2018167481A1 (en) Method of selecting for antibodies
JP2022528804A (ja) 抗体力価試験
JP7059390B2 (ja) Ａｄｃｃ及びａｄｃｐ活性の改善された定量化のためのシステム及び製品
KR20230022964A (ko) 키메라 항원 발현 면역 세포의 시험관내 종양 살해 활성을 결정하기 위한 세포-기반 검정
KR20230051677A (ko) 메소텔린 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
Stopforth et al. Detection of experimental and clinical immune complexes by measuring SHIP-1 recruitment to the inhibitory FcγRIIB
CN109072236A (zh) 用于生产分泌蛋白质的哺乳动物细胞
US20190359937A1 (en) Chimeric receptors, biosensor host cells and methods/uses thereof
CN115103857A (zh) 表达免疫调节分子的细胞和表达免疫调节分子的系统
US20220291203A1 (en) Methods of measuring cell-mediated killing by effectors
WO2022127882A1 (zh) 筛选靶向CD47-SIRPα免疫检查点的候选药物的方法和试剂盒
US20240109978A1 (en) Chimeric antigen receptor (car) spacer modifications enhance car t cell functionality
Willmott Developing novel biosensors for monitoring antibody production in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells
TW202411256A (zh) 抗meEGFR抗體、其抗原結合片段及其用途
KR20220003079A (ko) 검정
CN115867352A (zh) 抗α4β7抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20201116

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20201116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211126

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220222

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220401

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220413

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7059390

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150