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CN107074969A - 嵌合受体及其在免疫治疗中的应用 - Google Patents

嵌合受体及其在免疫治疗中的应用 Download PDF

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CN107074969A
CN107074969A CN201580048652.5A CN201580048652A CN107074969A CN 107074969 A CN107074969 A CN 107074969A CN 201580048652 A CN201580048652 A CN 201580048652A CN 107074969 A CN107074969 A CN 107074969A
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ala
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Younum Therapeutics Inc
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Abstract

本发明公开了嵌合受体，其包含对免疫球蛋白分子(Ig)的Fc部分具有亲和力和特异性的胞外结构域(即Fc结合结构域)；跨膜结构域；至少一个共刺激信号传导结构域；和包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质信号传导结构域。本发明还提供编码这种嵌合受体的核酸和表达所述嵌合受体的免疫细胞。这样的免疫细胞可以用于增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和/或用于增强基于抗体的免疫治疗(例如癌症免疫治疗)。

Description

嵌合受体及其在免疫治疗中的应用
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119，本申请要求2014年9月9日提交的美国专利申请号62/047,916的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
发明背景
癌症免疫治疗，包括基于细胞的治疗、抗体治疗和细胞因子治疗，用于激发攻击肿瘤细胞的免疫应答，同时保护正常组织。它是治疗多种不同类型的癌症的有希望的选择，因为其具有逃避药物抗性的遗传和细胞机制的潜力，并靶向肿瘤细胞，同时保留正常组织。T淋巴细胞可以发挥主要的抗肿瘤作用，这已被同种异体造血干细胞移植(HSCT)对于血液恶性肿瘤的结果所证明，其中T细胞介导的移植物抗宿主病(GvHD)与疾病复发负相关，并且去除免疫抑制或输入供体淋巴细胞可导致复发。Weiden等人，N Engl J Med.1979；300(19)：1068-1073；Porter等人，N Engl J Med.1994；330(2)：100-106；Kolb等人，Blood.1995；86(5)：2041-2050；Slavin等人，Blood.1996；87(6)：2195-2204；和Appelbaum,Nature.2001；411(6835)：385-389。
基于细胞的治疗可能涉及具有倾向于针对癌细胞的反应性的细胞毒性T细胞。Eshhar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.；1993；90(2)：720-724；Geiger等人，JImmunol.1999；162(10)：5931-5939；Brentjens等人，Nat.Med.2003；9(3)：279-286；Cooper等人，Blood.2003；101(4)：1637-1644；和Imai等人，Leukemia.2004；18：676-684。一种方法是表达嵌合抗原受体，该受体具有与一个或多个T细胞活化信号传导结构域融合的抗原结合结构域。通过抗原结合结构域对癌抗原的结合，导致T细胞被活化并引发细胞毒性。灌注表达嵌合受体的自体T淋巴细胞的临床试验的最近结果，提供了证明其临床潜力的有力证据。Pule等人，Nat.Med.2008；14(11):1264-1270；Porter等人,N Engl J Med；2011；25；365(8):725-733；Brentjens等人,Blood.2011；118(18):4817-4828；Till等人,Blood.2012；119(17):3940-3950；Kochenderfer等人,Blood.2012；119(12):2709-2720；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013；5(177):177ra138。
基于抗体的免疫疗法，例如单克隆抗体、抗体-融合蛋白和抗体药物偶联物(ADC)，被用于治疗多种不同疾病，包括许多类型的癌症。这样的治疗可以取决于对细胞表面分子的识别，这些细胞表面分子在需要消除的细胞(例如，靶细胞，例如癌细胞)上相对于正常细胞(例如，非癌细胞)是差异表达的。基于抗体的免疫治疗与癌细胞的结合，可以通过各种不同的机制导致癌细胞死亡，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或来自抗体-药物偶联物(ADC)有效载荷的直接细胞毒性活性。
发明概述
本发明基于嵌合受体的设计，所述嵌合受体包含：对免疫球蛋白(Ig)的Fc部分(例如IgG抗体)具有亲和力和特异性的胞外结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激信号结构域、和包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞质信号传导结构域。表达这种嵌合受体构建物的免疫细胞，将通过例如增强ADCC活性来增强免疫疗法例如基于抗体的免疫疗法的效力。
因此，本发明内容的一个方面的特征在于嵌合受体，其包含(a)结合免疫球蛋白Fc部分(Fc结合结构域)，例如结合IgG的Fc部分的胞外结构域；(b)跨膜结构域；(c)至少一个共刺激信号传导结构域；和(d)包含ITAM的细胞质信号传导结构域。至少一个共刺激信号传导结构域或包含ITAM的细胞质信号传导结构域中的一个，可位于如本文所述的嵌合受体构建物的C末端。在一些实施方案中，含ITAM的细胞质信号传导结构域位于嵌合受体构建物的C末端。在一些实施方案中，(a)是CD16(例如，CD16A或CD16B)的胞外配体结合结构域，和(d)不包含Fc受体的ITAM。在一些实施方案中，(d)是CD3ζ或FcεR1γ的细胞质信号传导结构域。本文所述的任何嵌合受体可以进一步包含(e)铰链结构域，其可以位于(a)的C末端和(b)的N末端。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体构建物的(a)是Fc受体的胞外配体结合结构域，例如Fc-γ受体，Fc-α受体或Fc-ε受体。例如，(a)可以是CD16(例如CD16A或CD16B)，CD32(例如CD32A或CD32B)或CD64(例如CD64A，CD64B或CD64C)的胞外配体结合结构域。在一些实例中，(a)不是CD16的胞外配体结合结构域。在其它实施方案中，(a)是CD32(例如CD32A或CD32B)的胞外配体结合结构域。
在其它实施方案中，(a)是能够结合于Ig分子(例如IgG分子)的Fc部分的非Fc受体的天然存在的蛋白质。例如，(a)可以是蛋白A或蛋白G的全部或部分。或者，(a)可以是结合于IgG分子的Fc部分的抗体片段，其中包括但不限于：单链可变片段(scFv)、或结构域抗体、纳米抗体。
在其它实施方案中，(a)是经设计的(例如非天然存在的)肽，所述肽能够结合于IgG分子的Fc部分的，包括Kunitz结构域肽、小模块免疫药物(SMIP)、adnectin、avimer、亲和体(affibody)、DARPin或anticalin。
替代性地或额外地，(b)的嵌合受体的跨膜结构域可以是单通膜蛋白，包括但不限于：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16(例如CD16A或CD16B)、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32(例如CD32A或CD32B)、CD64(例如、CD64A、CD64B、或CD64C)、VEGFR2、FAS、和FGFR2B.在一些实例中、膜蛋白不是CD8α。跨膜结构域也可以是非天然存在的疏水蛋白片段。
在本文所述的任何嵌合受体构建物中，本文所述的嵌合受体的至少一个共刺激信号传导结构域可以是共刺激分子，例如4-1BB(也称为CD137)、CD28、CD28LL→GG变体、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2。在一些实例中，至少一个共刺激信号结构域不是来自4-1BB。在一些实例中，嵌合受体包含两个共刺激信号结构域，例如CD28和4-1BB，或CD28LL→GG变体和4-1BB。
在本文所述的任何嵌合受体中，铰链结构域可以是来自蛋白质，例如CD8α或IgG。例如，铰链结构域可以是CD8α的跨膜或铰链结构域的片段。在一些实例中，铰链结构域不是CD8α的铰链结构域。在一些实例中，铰链结构域是非天然存在的肽，例如由不同长度的亲水性残基(XTEN)或(Gly4Ser)n多肽组成的多肽，其中n是3-12(含端点)的整数。
在一些实施方案中，本文所述的任何嵌合受体可以进一步在其N末端包含信号肽，例如CD8α的信号肽，其可以包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。
本文所述的嵌合受体的实例，可包含如表3、表4和表5中所示的组分(a)-(e)。在一些实例中，所述嵌合受体包含选自SEQ ID NO：2-30和32-56所示的氨基酸序列，或其排除了参考序列的信号肽的片段。
在具体实施方案中，本文所述的嵌合受体可以包含F158FCGR3A(F158CD16A)或V158FCGR3A变体(V158CD16A)的胞外配体结合结构域。这样的胞外配体结合结构域可分别包含SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。
在其他具体实施方案中，本文所述的嵌合受体可以包含CD8α的铰链和跨膜结构域，其可以包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。
替代性地或额外地，本文所述的嵌合受体可包含4-1BB的共刺激信号传导结构域，其可包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列。
在其它具体实施方案中，本文所述的嵌合受体可以包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域，其可以包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列。
在一些实例中，本文所述的嵌合受体不是受体，它包含CD8α的信号肽、F158CD16A或V158CD16A的细胞外结构域，CD8α的铰链和跨膜结构域、4-1BB的共刺激信号结构域的和CD3ζ的细胞质信号传导结构域。在具体实例中，本文所述的嵌合受体不包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明特征在于一核酸(例如DNA分子或RNA分子)，所述核酸包含编码本文所述的任一嵌合受体的核苷酸序列；包含所述核酸的载体(例如，表达载体)；和宿主细胞(例如，免疫细胞，例如天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞)。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体是转座子或含有转座子。
在一些实施方案中，表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞是T淋巴细胞或NK细胞，它们都可以在体外被激活和/或扩增。在一些实例中，T淋巴细胞或NK细胞是从患有癌症的患者(例如，人类患者)分离的自体T淋巴细胞或自体NK细胞。在一些实例中，T淋巴细胞或NK细胞是同种异体T淋巴细胞或同种异体NK细胞。T淋巴细胞可以是同种异体T淋巴细胞，其中内源性T细胞受体的表达已被抑制或消除。替代性地或额外地，T淋巴细胞可在一种或多种选自抗CD3/CD28、IL-2和植物凝集素的试剂存在下被活化。NK细胞可以在一种或多种选自下组的试剂存在下被活化：CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。
在另一方面，本文描述的药物组合物包含(a)本文所述的任何核酸或宿主细胞，和(b)药学上可接受的载体。在一些实例中，所述组合物还可包含含Fc的蛋白质，例如抗体(例如IgG抗体)或Fc融合蛋白。在一些实例中，抗体对癌细胞具有细胞毒性。这样的抗体可以包含与人CD16(FCGR3A)结合的人或人源化的Fc部分。治疗性抗体，包括但不限于：阿达木单抗(Adalimumab)、曲妥珠单抗－美金刚偶联物(Ado-Trastuzumab emtansine)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝利木单抗(Belimumab)、本妥昔单抗(Brentuximab)、卡那单抗(Canakinumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、达利珠单抗(Daclizumab)、地诺单抗(Denosumab)、地努单抗(Dinutuximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、吉妥株单抗(Gemtuzumab)、戈利木单抗(Golimumab)、英利昔单抗(Infliximab)、易普利单抗(Ipilimumab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、阿托株单抗(Obinutuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、利妥昔单抗(Ritutimab)、托西珠单抗(Tocilizumab)、曲妥珠单抗(Tratuzumab)、伏特克单抗(Ustekinumab)、或维多珠单抗(Vedolizumab)。
本文还提供一试剂盒，其包含(a)第一药物组合物，所述第一药物组合物包含本文所述的任一核酸或宿主细胞和药学上可接受的载体；和(b)第二药物组合物，所述第二药物组合物包含含Fc蛋白例如抗体(例如IgG抗体)或Fc融合蛋白(例如本文所述的那些)和药学上可接受的载体。
此外，本发明提供了用于在受试者中增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法。该方法包括：给予需要治疗的受试者(例如，人类癌症患者)有效量的表达本文提供的任何嵌合受体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞，例如天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或其组合。在一些实例中，所述宿主免疫细胞是自体的。在其他实施例中，宿主免疫细胞是同种异体的。任何宿主免疫细胞可以在体外被活化，扩增或兼而有之。
受试者可以通过抗癌抗体进行治疗，所述抗癌抗体可以包括结合于人CD16的人或人源化的Fc部分。所述受试者可以是患有癌症，例如癌(carcinoma)、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病的患者。例如，所述病人可能具有B细胞起源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。B细胞来源的癌症包括但不限于：B-系急性淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
在另一方面，本发明涉及用于增强基于抗体的免疫治疗的功效的方法。该方法包括：将有效量的表达本文提供的任何嵌合受体的宿主细胞，施用于已经用治疗性抗体(例如，本文所述的任何治疗性抗体)治疗或正在治疗的受试者。示例性宿主免疫细胞包括但不限于：天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或其组合。在一些实例中，宿主免疫细胞是自体的。在其他实施例中，宿主免疫细胞是同种异体的。任何宿主免疫细胞可以体外被活化，扩增或兼而有之。
在一些实例中，携带嵌合受体的宿主细胞与含Fc的蛋白质(例如本文所述的那些)共同施用。在一些实例中，携带嵌合受体的宿主细胞在含Fc的蛋白质之前或之后施用。在一些实例中，首先施用携带嵌合受体的宿主细胞，然后逐步施用含Fc的蛋白质以增加浓度，直到观察到治疗反应。
在本文提供的任何方法中，受试者可以是患有癌症的人类患者，并且治疗性抗体是用于治疗癌症的。在一些实例中，所述癌症是淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌、头颈癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤或甲状腺癌。
还在本发明的范围内的是(a)用于在有需要的受试者(例如人类癌症患者)中增强ADCC活性和/或增强抗体治疗的功效的药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的免疫细胞和药学上可接受的载体，所述免疫细胞表达本文所述的任何嵌合受体构建物；和(b)这样的免疫细胞在用于制备用于所需治疗的药物中的用途。任何药物组合物可进一步包含或与含Fc的治疗剂(例如抗体或Fc融合蛋白)共同使用。
此外，本发明提供了用于制备表达如本文所述的嵌合受体的免疫细胞的方法。该方法包括：(i)提供免疫细胞群；(ii)向所述免疫细胞中引入载体(例如，病毒载体例如慢病毒载体或逆转录病毒载体，转座子或含有转座子序列的载体)或编码本文提供的任何嵌合受体的裸核酸(例如mRNA)；和(iii)在允许嵌合受体表达的条件下，培养所述免疫细胞。这种方法可以进一步包括：(iv)活化所述表达嵌合受体的免疫细胞。在免疫细胞包含T细胞的实例中，T细胞可在抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和植物凝集素中的一种或多种的存在下进行活化。可以对T细胞进行工程化，使得内源性T细胞受体的表达被抑制或消除。在免疫细胞包含天然杀伤细胞的实例中，天然杀伤细胞可在4-1BB配体、抗4-1BB抗体、IL-15、抗IL-15受体抗体、IL-2、IL-12、IL-21和K562细胞中的一种或多种的存在下被活化。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体源自外周血单核细胞(PBMC)。示例性免疫细胞包括但不限于：天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞(例如，PBMC)源自人类癌症患者。在一些实施方案中，免疫细胞衍生自人供体。在一些实施方案中，所述免疫细胞分化于源自人类患者或人类供体的干细胞或干细胞样细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是已构建的细胞系，例如NK-92细胞。
在本文提供的任何方法中，可以通过慢病毒转导、逆转录病毒转导、DNA电穿孔或RNA电穿孔，将载体引入免疫细胞。在其他实例中，可以将编码本文所述的嵌合受体的RNA分子引入免疫细胞中，用于表达。
在下面的描述中，阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据若干实施例的详细描述以及所附权利要求，本发明的其它特征或优点将显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括，以进一步阐明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合这里给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1是显示在T细胞中CD16V-BB-ζ受体表达的图。A：CD16V-BB-ζ受体构建物的示意图。B：显示外周血T淋巴细胞中CD16V-BB-ζ受体表达的图。流式细胞点图显示了，用含有单独GFP(对照)或GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的活化T淋巴细胞中的CD16(B73.1抗体)与GFP或CD3ζ的组合的表达情况。显示了每个象限中阳性细胞的百分比。C：显示来自用单独GFP或用CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞的细胞裂解物的代表性蛋白质印迹的照片。用抗CD3ζ抗体探测膜。
图2显示了T细胞亚群中CD16V-BB-ζ受体的表达。A：用仅含GFP(对照)的载体和含有CD16V-BB-ζ构建物的载体转导的活化CD3+T淋巴细胞。通过流式细胞术，在CD4+和CD8+细胞中测试CD16的表达。点图显示了一个代表性实验的结果。B：用来自3个供体的T淋巴细胞(P＝N.S.)获得的结果的总结(平均值±SD)。
图3显示CD16V-BB-ζ受体的抗体结合能力。A：用含有GFP(对照)或GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的并与利妥昔单抗孵育30分钟的T淋巴细胞；用偶联于藻红蛋白的山羊抗人IgG抗体(GAH IgG)和流式细胞术，显现结合到细胞表面的抗体的量。B：用利妥昔单抗(Rituximab)孵育30分钟的用CD16V-BB-ζ(V158)或CD16F-BB-ζ(F158)转导的Jurkat细胞。该图比较了GFP的平均荧光强度(MFI)和用表达两种受体的细胞获得的GAH IgG的MFI之间的关系。C：在利妥昔单抗存在下，用与钙黄绿素AM橙红标记的Daudi细胞共培养的、用CD16V-BB-ζ模拟转导或转导的Jurkat细胞。在每个点图的右上象限中量化细胞聚集体。D：图C中所示的聚集测定的总结。柱显示3个实验的平均值±SD。在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，用CD16V-BB-ζ转导的Jurkat细胞所测得的聚集性，显著高于在3种其他培养条件下测量的聚集性(在t检验时，P<0.001)。
图4显示了CD16V-BB-ζ和CD16V-BB-ζ受体结合于曲妥珠单抗和人IgG的相对能力。用曲妥珠单抗或人IgG孵育用CD16V-BB-ζ(V158；黑色符号)或CD16F-BB-ζ(F158；白色符号)转导的Jurkat细胞30分钟。该图比较了GFP的平均荧光强度(MFI)与用表达任一受体的细胞所获得的偶联于PE的山羊抗人(GAH)IgG的MFI之间的关系(对于曲妥珠单抗和IgG两者，P<0.0001)。
图5表明，与CD16V-BB-ζ受体结合的免疫球蛋白可诱导T细胞活化、溶胞颗粒的胞吐作用和细胞增殖。A：用包含GFP(对照)或GFP和CD16V-BB-ζ的载体所转导的T淋巴细胞，在没有IL-2的情况下，在涂有利妥昔单抗的微量滴定板中培养48小时；通过流式细胞术测量CD25的表达。B：A中所示的测试结果的总结，柱显示了GFP+细胞中的CD25表达(来自3个供体的T细胞的实验的平均值±SD)；在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，用CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞中的CD25表达，显著高于其他实验条件(P≤0.003)。C：用含有GFP(对照)或GFP和CD16V-BB-ζ的载体所转导的来自4个供体的T淋巴细胞，如A那样(n＝3)或与Daudi细胞一起(n＝3)培养4小时；通过流式细胞术测量CD107a染色。柱显示6个实验的平均值±SD；在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，用CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞中的CD107a表达，显著高于其他实验条件(P<0.0001)。D：单独培养的模拟对照(mock)或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞，或与Daudi细胞一起或不与Daudi细胞一起并与利妥昔单抗一起培养长达4周。符号表示与输入细胞数目相比的细胞回收百分比(来自3个供体的T细胞的实验的平均值±SD)。
图6显示了体外CD16V-BB-ζ T淋巴细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。A：在相应抗体存在下，由模拟对照或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞所介导的针对癌细胞系的细胞毒性的代表性实例。每个符号表示一式三份培养物的平均值(对于所有3个比较，通过配对t检验，P<0.01)。全套数据如图7所示。B：在与或不与利妥昔单抗(“Ab”)的情况下，模拟或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞对来自患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的原发细胞的细胞毒性。每个柱(对于每个患者具有不同的阴影)对应于在2：1E：T比例下一式三份的4小时测定中所测定的平均(±SD)的细胞毒性。使用CD16V-BB-ζ T细胞和抗体时的细胞毒性，显著高于在任何其他3种条件下所测量的细胞毒性(通过t检验，P<0.0001)；使用模拟转导的T细胞，添加抗体可增加细胞毒性(P＝0.016)；所有其他比较：P>0.05。C：在间充质基质细胞(MSC)存在下，在1：2的E：T比例下24小时后，对图B中测试的相同CLL样品的细胞毒性。每个柱对应于两次测试的平均值。与单独抗体(P＝0.0002)或单独细胞(P<0.0001)相比，CD16V-BB-ζ T细胞加抗体的细胞毒性显著更高；单用抗体的细胞毒性,显著高于单用细胞的细胞毒性(P＝0.0045)。
图7显示了4小时体外细胞毒性测定的累积结果。对照或CD16V-BB-ζ T淋巴细胞与所示细胞系一起，并且与非反应性人免疫球蛋白(“No Ab”)或相应抗体(“Ab”)共培养。这是用于Daudi和Ramos的利妥昔单抗，用于MCF-7、SKBR-3和MKN-7的曲妥珠单抗，用于CHLA-255、NB1691、SK-N-SH和U-2OS的hu14.18K322A。显示了与在无T细胞和/或抗体的情况下培养的肿瘤细胞相比，在2:1比率(对于CHLA-255为4:1)下的细胞毒性。结果对应于T淋巴细胞的一式三次重复实验的平均(±SD)细胞毒性，其中对于NB1691和SK-BR-3，T淋巴细胞来自3个供体；对于其他细胞系，T淋巴细胞来自1个供体；Daudi的结果，是来自2个供体的一式三次测量和来自4个额外供体的T淋巴细胞的单次测量的平均(±SD)细胞毒性。当不存在T细胞的情况下加入培养物中时，利妥昔单抗、曲妥单抗或hu14.18K322A的平均细胞毒性小于10％。
图8表明CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的细胞毒性是强大的、特异性的，并且不受未结合的IgG的影响。A：在非反应性人免疫球蛋白(“No Ab”)或hu14.18K322A抗体(“Ab”)下，与神经母细胞瘤细胞系NB1691共培养24小时的CD16V-BB-ζ T淋巴细胞。结果对应于一式三份实验的平均(±SD)细胞毒性。即使在1:8的E:T比例(P＝0.0002)下，与单用CD16V-BB-ζ T细胞相比，CD16V-BB-ζ细胞加上hu14.18K322A抗体的细胞毒性仍然显著更高。B：在利妥昔单抗或非反应性抗体曲妥珠单抗或hu14.18K322A存在下，在2：1的E：T比例下，与B细胞淋巴瘤细胞系Daudi共培养的模拟对照或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞。结果对应于一式三份实验的平均(±SD)细胞毒性(“对照”结果是每种抗体的一式三份实验的汇总)。利妥昔单抗的细胞毒性显著高于所有其他实验条件下的细胞毒性(对于所有比较，P<0.0001)。C：在各种不同浓度的免疫治疗抗体和竞争性未结合的IgG(同时加到抗体中)存在下，表达CD16V-BB-ζ T的淋巴细胞，在8:1的E:T比例下，对肿瘤细胞系的细胞毒性。符号对应于每种抗体浓度的至少三次测量的平均值(±SD)。对于每个细胞系，细胞毒性没有统计学差异，不管存在的未结合的IgG的量。
图9显示了表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞，在体内发挥抗肿瘤活性。用3×105带有荧光素酶标记Daudi细胞，对NOD-SCID-IL2RGnull小鼠进行腹腔注射。从第4天开始，每周一次，共4周，用利妥昔单抗(150μg)进行腹膜内注射。在4只小鼠中，没有给予其它治疗，而在其它5只小鼠中，第一次利妥昔单抗注射后，接着在第5天和第6天在腹膜内注射表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞(1×107ip；n＝5)；其他2组4只小鼠各自接受腹膜注射RPMI-1640(替代利妥昔单抗)然后接受CD16V-BB-ζ T淋巴细胞，或腹膜注射仅RPMI-1640培养基(“对照”)。A：肿瘤生长的体内成像的结果。每个符号对应于一个生物发光测量；线连接一只小鼠中的所有测量。B：对于每个实验条件，显示代表性小鼠(每组2只)。以增强的灵敏度处理第3天的腹部图像，以显示在CD16V-BB-ζ+利妥昔单抗组的小鼠中肿瘤的存在。当生物发光达到5×1010光子/秒时，将小鼠安乐死。C：不同治疗组中小鼠的总体存活率比较。
图10证实了表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞在体内发挥抗肿瘤活性。用3×105带有荧光素酶标记NB1691细胞，对NOD-SCID-IL2RGnull小鼠进行腹腔注射。从第5天开始，每周一次，共4周，腹膜内注射Hu14.18K322A抗体(25μg)。在4只小鼠中，没有给予其他治疗；而在另外4只小鼠中，在第一抗体注射后接着在第6天和第7天腹膜内注射表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞(1×107ip；n＝4)；其他2组4只小鼠各自接受腹膜注射RPMI-1640(代替抗体)然后接受CD16V-BB-ζ T淋巴细胞，或腹膜注射仅RPMI-1640培养基(“对照”)。A：肿瘤生长的体内成像的结果。每个符号对应于一个生物发光测量；线连接一只小鼠中的所有测量。B：对于每个实验条件的所有小鼠的图像。当生物发光达到1×1010光子/秒时，将小鼠安乐死。C：不同治疗组中小鼠的总体存活率比较。
图11显示了表达CD16V-BB-ζ和CD16F-BB-ζ受体的T淋巴细胞之间的功能差异。A：流式细胞点图显示了，在CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ转导的T淋巴细胞中，CD16(用B73.1抗体检测)和绿色荧光蛋白(GFP)的表达。显示了每个象限中阳性细胞的百分比。B：分别在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hu14.18K322A存在下，与Daudi、SK-BR-3或NB1691一起培养的用CD16V或CD16F受体转导的T淋巴细胞。所有抗体以0.1μg/mL使用。符号表示与输入细胞数相比的细胞回收百分比(3次实验的平均值±SD)；对于所有3种培养物(Daudi，P＝0.0007；SK-BR-3，P＝0.0164；NB1691，P＝0.022)，通过配对t检验，培养物第1-3周的细胞计数是显著不同的。C：在各种浓度的利妥昔单抗存在下，由表达CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ受体的T淋巴细胞所介导的抗Daudi细胞的抗体依赖性细胞毒性。每个符号表示在8：1(左)或2：1(右)的E：T比例下，一式三份培养物的平均值±SD。具有CD16V-BB-ζ的T细胞的细胞毒性，显著高于具有CD16F-BB-ζ的T细胞的细胞毒性(P<0.001，对于任一种E：T而言)。
图12显示本研究中使用的CD16嵌合受体的示意图。
图13显示具有不同信号传导结构域的CD16V受体的表达。流式细胞点图显示了，在用含单独的绿色荧光蛋白(GFP)(对照)或不同的CD16V构建物的载体所转导的活化的T淋巴细胞中，与GFP组合的CD16表达情况(用3G8抗体检测)。示出了每个象限中阳性细胞的百分比。
图14显示，与具有不同信号传导性质的CD16V受体相比，CD16V-BB-ζ引起更高的T细胞活化、增殖和细胞毒性。A：通过流式细胞术获得的与Daudi细胞和利妥昔单抗(0.1μg/mL)共培养48小时后表达不同嵌合受体的T淋巴细胞中的CD25平均荧光强度(MFI)相对于绿色荧光蛋白(GFP)MFI的作图。使用CD16V-BB-ζ的CD25表达，显著高于由CD16V-ζ/CD16V-FcεRIγ或不具有信号转导能力的CD16V(“CD16V-截短型”)所激发的CD25表达(P<0.0001，通过线性回归分析)。B：分别在利妥昔单抗、曲妥株单抗和hu14.18K322A存在下，与Daudi、SK-BR-3或NB1691细胞一起培养用各种不同CD16V受体所转导的T淋巴细胞。所有抗体以0.1μg/mL使用。符号表示与输入细胞数相比的细胞回收百分比(3次实验的平均值±SD)；通过对所有3种培养物的配对t检验，使用CD16V-BB-ζ受体的1-3周细胞培养物的细胞计数，比所有其他受体的细胞计数显著更高(P<0.0001)。C：分别在利妥昔单抗、曲妥株单抗和hu14.18K322A存在下，表达各种不同CD16V受体的T淋巴细胞或模拟转导的T细胞，针对Daudi、SK-BR-3和NB1691的ADCC。符号是在所示的E：T比例下三份培养物的平均值±SD。CD16V-BB-ζ受体的细胞毒性显著高于那些使用所有其他受体的细胞毒性(在所有比较中，通过t检验，P<0.0001)，而模拟转导的或用CD16V截短型受体转导的淋巴细胞，相互之间的细胞毒性没有显著差异(P>0.05)；对于Daudi(P＝0.006)和SK-BR-3(p＝0.019)而言，CD16V-FcεRIγ的细胞毒性显著高于CD3-ζ；表达任一受体的淋巴细胞,与模拟转导的或用CD16V截短型转导的淋巴细胞相比，具有更高的细胞毒性(对于所有比较，P<0.01)。
图15显示了通过mRNA电穿孔进行CD16V-BB-ζ受体的表达。A：活化的T淋巴细胞使用CD16V-BB-ζmRNA或不使用mRNA(对照)进行电穿孔；24小时后，通过流式细胞术测试CD16的表达。B：在利妥昔单抗存在下，测试模拟对照或CD16V-BB-ζ电穿孔的T细胞对Ramos细胞系的细胞毒性。符号显示平均值±SD表示的百分比细胞毒性(n＝3；P<0.01，对于在所有E：T比率下比较)。
图16显示了Rituxan与表达和不表达SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的Jurkat细胞的结合情况。在没有mRNA(图A)或编码SEQ ID NO：1所示的嵌合受体mRNA(图B)存在下，对Jurkat细胞进行电穿孔，与Rituxan孵育，用PE标记的山羊抗人抗体染色以检测结合的Rituxan，并通过流式细胞术分析。在图A和B中，将相同的象限门应用于每组数据，并且显示每个象限中的细胞百分比，其中右上象限表示Rituxan阳性细胞。在图C中，将细胞数进行作图，其作为模拟电穿孔细胞(无填充)和用编码SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的mRNA电穿孔的细胞(灰色)的Rituxan染色的函数。
图17显示了，在Rituxan和靶Daudi细胞存在下，在表达或不表达SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的Jurkat细胞上CD25的存在情况。在没有mRNA(图A)或编码SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的mRNA的存在下(图17B)，对Jurkat细胞进行电穿孔，随后与Rituxan和靶Daudi细胞一起温育。用PE标记的抗CD7抗体，对细胞染色以分开Jurkat细胞，用APC标记的抗C25抗体染色检测CD25表达，并通过流式细胞术分析。CD7阳性细胞显示在图A和B中，并且相同的象限门应用于每组数据。示出了每个象限中细胞的百分比，右上象限代表CD25阳性细胞。图C显示来自相同实验的数据的直方图。对CD7阳性细胞的数目进行作图，其作为模拟电穿孔细胞(无填充)和用编码SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的mRNA电穿孔的细胞数(灰色)的CD25染色的函数，其中作为CD25染色的函数进行作图。
图18显示在Rituxan和靶Daudi细胞存在下，在表达或不表达SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的Jurkat细胞上CD69的存在情况。在没有mRNA(图A)或编码SEQ ID NO：1的mRNA存在下(图B)，对Jurkat细胞进行电穿孔，随后与Rituxan和靶Daudi细胞一起孵育。用PE标记的抗CD7抗体对细胞染色以分开Jurkat细胞，用APC标记的抗C69抗体检测CD69表达，并通过流式细胞术分析。CD7阳性细胞显示在图A和B中，并且相同的象限门应用于每组数据。示出了每个象限中细胞的百分比，右上象限代表CD69阳性细胞。图C显示来自相同实验的数据的直方图。对于模拟电穿孔细胞(无填充)和用编码SEQ ID NO：1所示的嵌合受体的mRNA电穿孔的细胞(灰色)，将CD7阳性细胞的数目作为CD69染色的函数进行作图。
图19显示嵌合受体的代表性抗CD3ζ蛋白质印迹分析。Jurkat细胞在不用mRNA(泳道1)或用编码以下嵌合受体的mRNA进行电穿孔：SEQ ID NO：1(泳道2)、SEQ ID NO：3(泳道3)、SEQ ID NO：10(泳道4)、SEQ ID NO：11(泳道5)、SEQ ID NO：14(泳道6)、SEQ ID NO：2(泳道7)、SEQ ID NO：4(泳道8)、SEQ ID NO：5(泳道9)、SEQ ID NO：7(泳道10)、SEQ ID NO：8(泳道11)、SEQ ID NO：9(泳道12)或SEQ ID NO：6(泳道13)。收集细胞，裂解，并通过使用抗CD3ζ抗体的Western印迹分析进行分析。在用嵌合受体mRNA电穿孔的所有细胞的裂解物中，检测嵌合受体蛋白。
发明详述
基于抗体的免疫疗法用于治疗多种不同疾病，其中包括许多类型的癌症。这样的疗法通常取决于识别在需要消除的细胞(例如，靶细胞，例如癌细胞)上相对于正常细胞(例如，非癌细胞)存在差异表达的细胞表面分子(Weiner等人Cell(2012)148(6)：1081-1084)。几种基于抗体的免疫治疗，已经在体外显示了促进抗体依赖性细胞介导的针对靶细胞(例如癌细胞)的细胞毒性，并且某种程度上，通常认为这也是体内作用机制。ADCC是细胞介导的先天免疫机制，由此免疫系统的效应子细胞，例如天然杀伤(NK)细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜酸性粒细胞，会主动裂解被特异性抗体识别的靶细胞(例如癌细胞)。
本文所述的嵌合受体将具有许多优点。例如，通过结合Fc的细胞外结构域，本文所述的嵌合受体构建物可以结合于抗体或其他含Fc分子的Fc部分，而不是直接结合于特异性靶抗原(例如癌抗原)。因此，表达本文所述的嵌合受体构建物的免疫细胞，将能够诱导被抗体或其他含Fc分子所结合的任何类型的细胞发生细胞死亡。
本发明提供了能够结合含Fc的分子(例如抗体或Fc融合蛋白)的嵌合受体、表达所述嵌合受体的免疫细胞、以及使用所述免疫细胞增强针对靶细胞(例如癌细胞)的ADCC效应的方法。如本文所用，嵌合受体是指可以在宿主细胞表面上表达、并且包含能够结合于含有Fc部分的靶分子的胞外结构域和一个或多个用于触发表达所述嵌合受体的免疫细胞的效应子功能的细胞质信号传导结构域的非天然存在的分子，其中嵌合受体的至少两个结构域衍生自不同的分子。
含Fc的分子(例如抗体蛋白)可以结合到靶标，例如靶细胞(例如癌细胞)表面上的细胞表面分子、受体或碳水化合物。表达能够结合这种含Fc的分子的受体(例如本文所述的嵌合受体分子)的免疫细胞，可识别靶细胞结合的抗体，并且该受体/抗体结合可刺激免疫细胞以执行效应子功能，例如释放细胞毒性颗粒或表达细胞死亡诱导分子，从而导致被含Fc的分子识别的靶细胞发生细胞死亡。
术语“约”或“大约”是指处于由本领域一般技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在可接受的标准偏差内。或者，“约”可以表示可高达给定值的±20％，优选高达±10％，更优选高达±5％，和更优选高达±1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在值的一个数量级内，优选在2倍内。除非另有说明，否则在本申请和权利要求中描述了特定值，术语“约”是隐含的，并且在上下文中意味着在特定值的可接受的误差范围内。
在本发明的上下文中，只要其涉及本文所述的任何疾病病症，术语“治疗(treat)”，“治疗(treatment)”等指减轻或缓解与所述病症相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种病症的进展。在本发明的含义内，术语“治疗”还表示阻止、延迟发作(即，疾病的临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，对于癌症，术语“治疗”可以指消除或减少患者的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。
如本文所用，应用于剂量或量的术语“治疗有效的”是指化合物或药物组合物(例如，包含免疫细胞例如T淋巴细胞和/或NK细胞的组合物)的量，其含有本发明的嵌合受体并任选地进一步包含肿瘤特异性细胞毒性单克隆抗体或其他包含Fc部分的抗肿瘤分子(例如，由结合肿瘤表面受体的配体(例如细胞因子、免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc-部分或含Fc的DNA或RNA组成的复合分子)，其在施用于有需要的受试者时足以产生所需活性。在本发明内容的上下文中，术语“治疗有效的”是指化合物或药物组合物的量足以延迟通过所述方法治疗的病症的表现，延缓进展，缓解或减轻至少一种症状。注意，当施用活性成分的组合时，所述组合的有效量可以包括或可以不包括每种成分如果单独施用时的有效量。
与本发明的组合物联用的短语“药学上可接受的”是指这样的组合物的分子实体和其它成分，它们是生理上可耐受的，并且当施用于哺乳动物(例如人)时通常不产生不利的反应。优选地，如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别地用于人的。
如本文所用，术语“受试者或对象”是指任何哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人。
如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。
I.嵌合受体
本文所述的嵌合受体包含：对免疫球蛋白Fc部分具有结合亲和力和特异性的胞外结构域(“Fc结合物”)、跨膜结构域、至少一个共刺激信号结构域和包含ITAM的胞质信号结构域。嵌合受体被配置为：当在宿主细胞上表达时，胞外配体结合结构域位于细胞外以结合靶分子(例如抗体或Fc融合蛋白)，而共刺激信号传导结构域和含ITAM的细胞质信号传导结构域位于细胞质中以用于触发激活和/或效应子信号传导。在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体构建物从N末端至C末端包含Fc结合物、跨膜结构域、至少一个共刺激信号传导结构域和含有ITAM的细胞质信号传导结构域。在其它实施方案中，本文所述的嵌合受体构建物从N末端至C末端包含：Fc结合物、跨膜结构域、含ITAM的细胞质信号传导结构域和至少一个共刺激信号结构域。
本文所述的任何嵌合受体可以进一步包含铰链结构域，其可以位于Fc结合物的C末端和跨膜结构域的N末端。替代性地或额外地，本文所述的嵌合受体构建物可以含有两个或更多个共刺激信号结构域，其可以彼此连接或被含ITAM的细胞质信号传导结构域分开。嵌合受体构建物中的胞外Fc结合物、跨膜结构域、共刺激信号结构域和含有ITAM的细胞质信号传导结构域，可以彼此直接连接或通过肽接头连接。在一些实施方案中，本文所述的任何嵌合受体包含位于N末端的信号序列。
A.Fc结合物
本文所述的嵌合受体构建物包含作为Fc结合物的胞外结构域，即能够结合于合适哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊或猴)的免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgM或IgE)的Fc部分。合适的Fc结合物可以衍生自天然存在的蛋白质，例如哺乳动物Fc受体或某些细菌蛋白质(例如蛋白质A，蛋白质G)。另外，Fc结合物可以是特定工程化以高亲和力和特异性结合于本文所述的任何Ig分子的Fc部分的合成多肽。例如，这种Fc结合物可以是特异性结合免疫球蛋白的Fc部分的抗体或其抗原结合片段。实例包括但不限于：单链可变片段(scFv)、结构域抗体或纳米抗体。或者，Fc结合物可以是特异性结合于Fc部分的合成肽，例如Kunitz结构域，小模块免疫药物(SMIP)，adnectin，avimer，亲和体，DARPin或anticalin，其可以通过筛选肽组合文库与Fc的结合活性从而鉴定出。
在一些实施方案中，Fc结合物是哺乳动物Fc受体的胞外配体结合结构域。如本文所用，“Fc受体”是在许多免疫细胞(包括B细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞)的表面上表达的细胞表面结合受体，并显示对抗体的Fc结构域的结合特异性。Fc受体通常包含对抗体的Fc(可结晶片段)部分具有结合特异性的至少2个免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些情况下，Fc受体与抗体的Fc部分的结合可触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应。用于构建如本文所述的嵌合受体的Fc受体可以是天然存在的多态性变体(例如，CD16V158变体)，与野生型对应物相比，其可以具有增加的或降低的对Fc的亲和力。或者，Fc受体可以是野生型对应物的功能变体，其携带改变对Ig分子的Fc部分的结合亲和力的一个或多个突变(例如，可高达10个氨基酸残基的取代)。在一些情况下，突变可改变Fc受体的糖基化模式，并因此改变对Fc的结合亲和力。
下表列出了Fc受体胞外结构域中的多个示例性多态性(参见，例如，Kim等人，J.Mol.Evol.53：1-9,2001)：
表1.Fc受体中的示例性多态性
氨基酸编号 19 48 65 89 105 130 134 141 142 158
FCR10 R S D I D G F Y T V
P08637 R S D I D G F Y I F
S76824 R S D I D G F Y I V
J04162 R N D V D D F H I V
M31936 S S N I D D F H I V
M24854 S S N I E D S H I V
X07934 R S N I D D F H I V
X14356(FcγRII) N N N S E S S S I I
M31932(FcγRI) S T N R E A F T I G
X06948(FcαεI) R S E S Q S E S I V
Fc受体基于其能够结合的抗体的同种型分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)通常结合IgG抗体，例如其一个或多个亚型(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)；Fc-α受体(FcαR)通常结合IgA抗体；和Fc-ε受体(FcεR)通常结合IgE抗体。在一些实施方案中，Fc受体是Fc-γ受体、Fc-α受体或Fc-ε受体。Fc-γ受体的实例包括但不限于：CD64A、CD64B、CD64C、CD32A、CD32B、CD16A和CD16B。Fc-α受体的实例是FcαR1/CD89。Fc-ε受体的实例包括但不限于：FcεRI和FcεRII/CD23。下表列出了用于构建本文所述的嵌合受体的示例性Fc受体及其对相应Fc结构域的结合活性：
表2.示例性Fc受体
选择用于本文所述的嵌合受体的Fc受体的配体结合结构域，对本领域技术人员是显而易见的。例如，其可以取决于多个因素，例如期望Fc受体结合的抗体的同种型和结合相互作用的所需亲和力。
在一些实例中，(a)是CD16的胞外配体结合结构域，其可以引入可调节对Fc的亲和力的天然存在的多态性。在一些实例中，(a)是在158位引入多态性(例如缬氨酸或苯丙氨酸)的CD16的胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，(a)是在改变其糖基化状态及其对Fc的亲和力的条件下产生的。
在一些实施方案中，(a)是引入修饰的CD16的胞外配体结合结构域，所述修饰使引入该修饰的嵌合受体对IgG抗体亚型具有特异性。例如，可以引入增加或降低对IgG亚型(例如IgG1)的亲和力的突变。
在一些实例中，(a)是CD32的胞外配体结合结构域，其可以引入可以调节对Fc的亲和力的天然存在的多态性。在一些实施方案中，(a)是在改变其糖基化状态及其对Fc的亲和力的条件下产生的。
在一些实施方案中，(a)是引入修饰的CD32的胞外配体结合结构域，所述修饰使引入该修饰的嵌合受体对IgG抗体亚型具有特异性。例如，可以引入增加或降低对IgG亚型(例如IgG1)的亲和力的突变。
在一些实例中，(a)是CD64的胞外配体结合结构域，其可以引入可以调节对Fc的亲和力的天然存在的多态性。在一些实施方案中，(a)是在改变其糖基化状态及其对Fc的亲和力的条件下产生的。
在一些实施方案中，(a)是引入修饰的CD64的胞外配体结合结构域，所述修饰使引入该修饰的嵌合受体对IgG抗体亚型具有特异性。例如，可以引入增加或降低对IgG亚型(例如IgG1)的亲和力的突变。
在其它实施方案中，Fc结合物衍生自能够结合IgG分子的Fc部分的天然存在的细菌蛋白。用于构建如本文所述的嵌合受体的Fc结合物，可以是全长蛋白或其功能片段。蛋白A最初是在细菌金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的42kDa表面蛋白。其由五个结构域组成，每个结构域折叠成三螺旋束并且能够通过与大多数抗体的Fc区以及人VH3家族抗体的Fab区的相互作用而结合于IgG。蛋白G是在C和G型链球菌中表达的约60kDa蛋白，其结合于哺乳动物IgG的Fab和Fc区。虽然天然蛋白G还结合于白蛋白，但是重组变体已经被工程化从而去除了白蛋白结合能力。
也可以使用组合生物学或定向进化方法，从头产生用于嵌合受体的Fc结合物。从蛋白质支架(例如，源自IgG的scFv、源自Kunitz型蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域、锚蛋白重复序列、来自蛋白质A的Z结构域、脂质运载蛋白、III型纤连蛋白结构域、来自Fyn的SH3结构域、或其它)开始时，表面上一组残基的氨基酸侧链可以被随机取代，以产生变体支架的大文库。从大文库中，可以通过首先选择结合，随后通过噬菌体、核糖体或细胞展示进行扩增，分离对靶标如Fc结构域具有亲和力的稀有变体。重复的多轮选择和扩增可以用于分离对靶标具有最高亲和力的那些蛋白质。Fc结合肽是本领域已知的，例如DeLano等人,Science,287:5456(2000)；Jeong等人,Peptides,31(2):202-206(2009)；和Krook等人,J.Immunological Methods,221(1-2):151-157(1998)。示例性Fc结合肽可以包含氨基酸序列ETQRCTWHMGELVWCEREHN(SEQ ID NO:85)、KEASCSYWLGELVWCVAGVE(SEQ ID NO:86)或DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:87)。
本文所述的任何Fc结合物可以对治疗性抗体的Fc部分具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观结合常数或KA。KA是解离常数KD的倒数。本文所述的嵌合受体的Fc受体结构域的胞外配体结合结构域对于抗体的Fc部分可以具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10或更低的结合亲和力KD。在一些实施方案中，与Fc结合物对另一抗体、同种型抗体或其亚型的结合亲和力相比，Fc结合物对一抗体、抗体同种型或其亚型具有高结合亲和力。在一些实施方案中，与Fc受体的胞外配体结合结构域与另一抗体、同种型抗体或其亚型的结合相比，Fc受体的胞外配体结合结构域对一抗体、抗体同种型或其亚型具有特异性。具有高亲和力结合的Fc-γ受体包括：CD64A、CD64B和CD64C。具有低亲和力结合的Fc-γ受体包括：CD32A、CD32B、CD16A和CD16B。具有高亲和力结合的Fc-ε受体是FcεRI，具有低亲和力结合的Fc-ε受体是FcεRII/CD23。
可以通过多种不同方法测定包含Fc结合物(例如，Fc受体的胞外配体结合结构域)的Fc受体或嵌合受体的结合亲和力或结合特异性，其中包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱。
在一些实施方案中，Fc受体的胞外配体结合结构域包含与天然存在的Fc-γ受体、Fc-α受体或Fc-ε受体的胞外配体结合结构域的氨基酸序列有至少90％(例如，91、92、93、94、95、96、97、98、99％)相同性的氨基酸序列。使用由Karlin和Altschul改进(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990)的算法，检测两个氨基酸序列的“百分比相同性”。该算法被引入Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以采用XBLAST程序开展BLAST蛋白研究，设定分数＝50，字长(wordlength)＝3，从而获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两序列间存在间隙时，可以采用Altschul等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402,1997中描述的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
Fc受体的胞外配体结合结构域的变体，例如本文所述的那些，也在本发明的范围内。在一些实施方案中，变异的胞外配体结合结构域可以包含相对于参考胞外配体结合结构域的氨基酸序列至多10个氨基酸残基变异(例如，1、2、3、4或5)。在一些实施方案中，由于基因多态性，变体可以是天然存在的变体。在其它实施方案中，变体可以是非天然存在的修饰分子。例如，可将突变引入Fc受体的胞外配体结合结构域以改变其糖基化模式，从而改变其对相应Fc结构域的结合亲和力。
在一些实例中，Fc受体可以是本文所述的CD16A、CD16B、CD32A、CD32B、CD32C、CD64A、CD64B、CD64C或其变体。Fc受体的胞外配体结合结构域可以包含相对于本文所述的CD16A、CD16B、CD32A、CD32B、CD32C、CD64A、CD64B、CD64C的胞外配体结合结构域的氨基酸序列有至多10个氨基酸残基变异(例如，1、2、3、4、5或8)。包含一个或多个氨基酸变异的这种Fc结构域可以称为变体。相对于不包含所述突变的Fc受体结构域，Fc受体的胞外配体结合结构域的氨基酸残基的突变，可导致所述Fc受体结构域结合于抗体、同种型抗体或其亚型的结合亲和力增加。例如，Fc-γ受体CD16A的158位残基的突变可以导致所述Fc受体与抗体的Fc部分的结合亲和力的增加。在一些实施方案中，突变是Fc-γ受体CD16A的158位残基由苯丙氨酸替换为缬氨酸，称为CD16A V158变体。下面提供了人CD16A V158变体的氨基酸序列，其中V158残基以粗体/面(信号肽斜体)突出显示：
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(SEQ ID NO:75)
可以在Fc受体的胞外配体结合结构域中产生的可以增强或降低对分子(例如抗体)的Fc部分的结合亲和力的替代性或额外的突变，对于本领域一般技术人员是显而易见的。在一些实施方案中，Fc受体是CD16A、CD16A V158变体、CD16B、CD32A、CD32B、CD32C、CD64A、CD64B或CD64C。在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体构建物的胞外配体结合结构域不是CD16A或CD16A V158变体的胞外配体结合结构域。
B.跨膜结构域
本文所述的嵌合受体的跨膜结构域可以是本领域已知的任何形式。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。与本文所用的嵌合受体的相容的跨膜结构域，可以从天然存在的蛋白质获得。或者，其可以是合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域基于所述跨膜结构域的三维结构进行分类。例如，跨膜结构域可形成α螺旋，多于一个α螺旋的复合物，β桶或任何其它能够跨越细胞的磷脂双层的稳定结构。此外，跨膜结构域还可以或可选地基于跨膜结构域拓扑结构进行分类，包括跨膜结构域穿过膜的通过数目和蛋白质的取向。例如，单通的膜蛋白穿过细胞膜一次，而多通的膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7或更多次)。
膜蛋白可以定义为I型，II型或III型，这取决于它们的末端和膜通过区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且定向为使得蛋白的N末端位于细胞的脂质双层的胞外侧，而蛋白的C末端位于细胞质侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但是其定向使得蛋白的C末端位于细胞的脂质双层的胞外侧，而蛋白的N末端位于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可以基于跨膜区段的数目和N-和C-末端的位置进一步亚分类。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体的跨膜结构域衍生自I型单通膜蛋白。单通膜蛋白包括但不限于：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在一些实施方案中，跨膜结构域来自选自下组的膜蛋白：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在一些实例中，跨膜结构域是CD8α。在一些实例中，跨膜结构域是4-1BB/CD137。在其它实例中，跨膜结构域是CD28或CD34。在其它实例中，跨膜结构域不衍生自人CD8α。在一些实施方案中，嵌合受体的跨膜结构域是单通α螺旋。
来自多通膜蛋白的跨膜结构域也可以相容地用于本文所述的嵌合受体。多通膜蛋白可以包含复合物(至少2、3、4、5、6、7或更多个)α螺旋或β折叠结构。优选地，多通膜蛋白的N末端和C末端位于脂双层的相对侧，例如，蛋白的N末端位于脂双层的胞质侧，蛋白质的C末端位于胞外侧。来自多通膜蛋白的一个或多个螺旋通道可用于构建本文所述的嵌合受体。
用于本文所述的嵌合受体的跨膜结构域还可以包含合成的、非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段是至少约20个氨基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906B1和PCT公开号WO2000/032776A2中，其相关公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列不包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含两个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含多于两个的半胱氨酸残基(例如，3、4、5或更多个)。
跨膜结构域可以包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的胞质区。跨膜结构域的胞质区可以包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，这有助于定向脂质双层中的跨膜结构域。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基位于跨膜结构域的跨膜区。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基位于跨膜结构域的胞质区。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含多聚的亮氨酸-丙氨酸序列。
可以通过本领域已知的任何方法，例如Kyte和Doolittle亲水性分析法，来评估亲水性能(hydropathy)，或蛋白质或蛋白质区段的疏水性或亲水性。
C.共刺激信号结构域
许多免疫细胞除了抗原特异性信号的刺激外，还需要共刺激以促进细胞增殖、分化和存活，以及激活细胞的效应子功能。本文所述的嵌合受体包含至少一个共刺激信号传导结构域。本文所用的术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答(如效应子功能)的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号结构域可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞介导的应答。
宿主细胞(例如免疫细胞)中共刺激信号结构域的活化可以诱导细胞增加或降低细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号结构域可以相容地用于本文所述的嵌合受体。共刺激信号传导结构域的类型，可基于多种因素例如嵌合受体将在其中表达的免疫细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和期望的免疫效应子功能(例如，ADCC效应)来选择。用于嵌合受体的共刺激信号结构域的实例可以是共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，包括但不限于：B7/CD28家族的成员(例如B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6,和SLAM/CD150)；和任何其它共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1(CD11a)或CD2，或其任何变体。在其它实施方案中，共刺激信号传导结构域不是衍生自4-1BB。
在本发明的范围内，还包括本文所述的任何共刺激信号结构域的变体，使得共刺激信号结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，共刺激信号传导结构域包含可高达10个氨基酸残基变异(例如，1、2、3、4、5或8)。包含一个或多个氨基酸变异的这种共刺激信号结构域可以称为变体。
相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和增强的免疫应答刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的减少和减少的免疫应答刺激。例如，天然CD28氨基酸序列的第186和187位残基的突变，可导致增加的共刺激活性和通过嵌合受体的共刺激结构域而诱导的免疫应答。在一些实施方案中，突变是CD28共刺激结构域在在186和187位的每一位置的赖氨酸被甘氨酸残基取代，称为CD28LL→GG变体。可以增强或降低结构域的共刺激活性的、在共刺激信号结构域中进行的其它突变，对于本领域一般技术人员是显而易见的。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是4-1BB、CD28、OX40或CD28LL→GG变体。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域不是4-1BB。
在一些实施方案中，所述嵌合受体可以包含多于一个的共刺激信号传导结构域(例如，2、3或更多个)。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含两个或更多个相同的共刺激信号结构域，例如两个拷贝的CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含来自不同共刺激蛋白的两个或更多个的共刺激信号结构域，例如本文所述的任何两种或更多种共刺激蛋白。共刺激信号传导结构域的类型，基于多种因素例如所述嵌合受体将在其中表达的宿主细胞的类型(例如，免疫细胞例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和期望的免疫效应子功能进行选择。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含两个共刺激信号结构域。在一些实施方案中，所述两个共刺激信号结构域是CD28和4-1BB。在一些实施方案中，所述两个共刺激信号结构域是CD28LL→GG变体和4-1BB。
D.包含基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的细胞质信号传导结构域
包含基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的任何胞质信号传导结构域，可用于构建本文所述的嵌合受体。本文所用的“ITAM”是保守的蛋白质基序，其通常存在于许多免疫细胞中表达的信号分子的尾部。所述基序可以包含由6-8个氨基酸分开的两个重复的氨基酸序列YxxL/I，其中每个x独立地为任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号分子内的ITAM对于细胞内的信号转导是重要的，其介导过程至少部分通过信号分子激活后ITAM中酪氨酸残基磷酸化进行。ITAM还可以用作参与信号传导途径的其它蛋白质的停靠位点。在一些实例中，包含ITAM的胞质信号传导结构域是CD3ζ或FcεR1γ。在其它实施例中，含有ITAM的细胞质信号传导结构域不是衍生自人CD3ζ。在其它实例中，当相同嵌合受体构建物的胞外配体结合结构域来自CD16A时，含ITAM的细胞质信号传导结构域不衍生自Fc受体。
在一个具体实施方案中，几个信号传导结构域可以融合在一起用于产生叠加或协同效应。有用的额外信号传导结构域的非限制性实例包括：TCR Zeta链、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIy、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132和CD40一个或多个的部分或全部。
E.铰链结构域
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体进一步包含位于胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且其可以允许蛋白质有柔性以及允许一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用任何氨基酸序列，只要该氨基酸序列提供Fc受体的胞外配体结合结构域相对于嵌合受体的跨膜结构域的这种柔性和运动性。
铰链结构域可含有约10-100个氨基酸，例如15-75个氨基酸，20-50个氨基酸或30-60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸。
在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域，可适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分，并将柔性赋予所述嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。
抗体的铰链结构域，例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体也适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是抗体的，并且包含所述抗体的铰链结构域和所述抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，所述抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中，Fc受体的胞外配体结合结构域的C末端和跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，例如(GlyxSer)n接头，其中x和n，独立地可以是3至12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：76)，其中n可以是3至60之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：77)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)6(SEQ ID NO：78)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)9(SEQ ID NO：79)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)12(SEQ IDNO：80)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)15(SEQ ID NO：81)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)30(SEQ ID NO：82)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)45(SEQ ID NO：83)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)60(SEQ ID NO：84)。
在其它实施方案中，铰链结构域是延长的重组多肽(XTEN)，其是由不同长度(例如10-80个氨基酸残基)的亲水性残基组成的非结构化多肽。XTEN肽的氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的，并且可以在例如美国专利号8,673,860中找到，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含30个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含45个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含15个氨基酸。
F.信号肽
在一些实施方案中，嵌合受体还包含在多肽的N末端的信号肽(也称为信号序列)。通常，信号序列是将多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施方案中，信号序列将嵌合受体靶向细胞的分泌途径，并且将允许嵌合受体整合并锚定到脂质双层中。信号序列包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列，它们与本文所述的嵌合受体是相容的，这些信号序列对本领域技术人员是显而易见的。在一些实施方案中，所述信号序列来自CD8α。在一些实施方案中，所述信号序列来自CD28。在其它实施方案中，所述信号序列来自鼠κ链。在其它实施方案中，所述信号序列来自CD16。
G.嵌合受体的实例
表3-5提供本文所述的示例性嵌合受体。该示例性构建物从N末端到C末端依次具有信号序列、Fc结合物(例如Fc受体的胞外结构域)、铰链结构域和跨膜结构，而共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的位置可以互换。
表3：示例性嵌合受体
表4：示例性嵌合受体
表5：示例性嵌合受体
下文提供了示例性嵌合受体的氨基酸序列(信号序列用斜体表示)。
SEQ ID NO：2：
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SEQ ID NO：20：
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SEQ ID NO：55：
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO：56：
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体可以包含：一个或多个CD16(CD16F或CD16V，也称为F158 FCGR3A和V158 FCGR3A变体)的胞外配体结合结构域、CD8α的铰链和跨膜结构域、4-1BB的共刺激信号传导结构域和CD3ζ(例如本文公开的CD16F-BB-ζ和CD16V-BB-ζ)的细胞质信号传导结构域。这些组分的氨基酸序列和示例性编码核苷酸序列提供在下表6中。
表6：示例性序列
在一些实例中，本文所述的嵌合受体不包括所有上述列出的组分。例如，本文所述的嵌合受体可以不是下表7中所列的任何嵌合受体，或可以不包含上表6中所列的一个或多个序列。
表7.示例性嵌合受体
与本文公开的其他嵌合受体一样，这些示例性嵌合受体在免疫细胞例如T细胞和NK细胞中的表达，将赋予这些细胞ADCC能力，因此将显著增加单克隆抗体的抗肿瘤潜力(以及包含Fc部分的其它抗肿瘤分子，例如由结合肿瘤表面受体的配体(例如细胞因子，免疫细胞受体)与免疫球蛋白或含Fc的DNA或RNA的Fc部分进行组合所形成的复合分子)，而不管其靶向的肿瘤抗原。
与本文所述的其它嵌合受体一样，这些示例性嵌合受体也是具有显著增强抗多种肿瘤的抗体疗法的功效的潜在的通用嵌合受体。如下文实施例1中所讨论的，当通过逆转录病毒转导在人T细胞中表达时，本发明的V158受体，与包含共同的F158变体(本发明也提供)的相同嵌合受体相比，具有显著更高的、针对人源化抗体(例如抗CD20抗体利妥昔单抗)的亲和力。嵌合受体的结合，引起T细胞活化、溶胞颗粒的胞吐作用和增殖。即使当在骨髓来源的间充质细胞上进行CLL培养时，表达CD16V-BB-ζ的T细胞在利妥昔单抗存在下并在低的效应子：靶比率下，能够特异性杀死淋巴瘤细胞系和原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞。抗HER2抗体曲妥珠单抗引发嵌合受体介导的针对乳腺癌和胃癌细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，而抗GD2抗体hu14.18K322A引发针对神经母细胞瘤和骨肉瘤细胞的ADCC。如实施例部分中进一步公开的，在免疫缺陷小鼠中表达嵌合受体T细胞与利妥昔单抗的组合，可根除了淋巴瘤细胞，而单独的T细胞或抗体则不能根除。为了促进该技术的临床转化，开发了基于嵌合受体mRNA的电穿孔的方法，这导致在不使用病毒载体情况下的有效而瞬时地表达受体。
H.包含嵌合受体的制备和药物组合物
本文所述的任何嵌合受体可以通过常规方法制备，例如重组技术。用于制备嵌合受体的方法涉及：产生编码包含嵌合受体的每个结构域的多肽的核酸，其中包括Fc受体的胞外配体结合结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激信号传导结构域，和包含ITAM的胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，核酸还编码Fc受体的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。编码嵌合受体的核酸还可以编码信号序列。在一些实施方案中，核酸序列编码由SEQ ID NO：2-30和32-56所提供的示例性嵌合受体中的任一个。
嵌合受体的每种组分的序列可以通过常规技术获得，例如基于本领域已知的多种来源中的任一种，进行PCR扩增。在一些实施方案中，嵌合受体的一种或多种组分的序列获自人细胞。或者，可以合成嵌合受体的一种或多种组分的序列。使用诸如PCR扩增或连接的方法，可以直接或间接地(例如使用编码肽接头的核酸序列)连接各组分(例如结构域)的序列，以形成编码嵌合受体的核酸序列。或者，可以合成编码嵌合受体的核酸。在一些实施方案中，核酸是DNA。在其他实施方案中，核酸是RNA。
任何嵌合受体蛋白，编码它们的核酸和携带这种核酸的表达载体可以与药学上可接受的载体混合，以形成药物组合物，其也在本发明的范围内。“可接受的”是指载体与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)是相容的，并且不对施用组合物的受试者产生负面影响。用于本发明方法的任何药物组合物可以包含冻干形式或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
药学上可接受的载体，包括缓冲液，是本领域公知的，并且可以包括：磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水聚合物；单糖；二糖；和其他碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见，例如，Remington：The Science and Practiceof Pharmacy第20版。(2000)Lippincott Williams和Wilkins编辑(K.E.Hoover)。
本发明的药物组合物还可以含有一种或多种对于所治疗的具体适应症所必需的额外的活性化合物，优选那些具有互补活性的且彼此不产生不利影响的活性化合物。可能的额外的活性化合物的非限制性实例包括：例如IL2以及以下在组合治疗的讨论中列出的各种药剂。
II.表达嵌合受体的免疫细胞
表达本文所述嵌合受体的宿主细胞，提供了一类特异性细胞群，其可识别由含Fc的治疗剂(例如抗体(例如治疗性抗体)或Fc融合蛋白)结合的靶细胞。在这样的宿主细胞(例如，免疫细胞)上表达的嵌合受体构建物的细胞外配体结合结构域与抗体的Fc部分或Fc-融合蛋白的结合，将激活信号传递到嵌合受体构建物的共刺激信号传导结构域和含ITAM的细胞质信号传导结构域，从而激活宿主细胞的细胞增殖和/或效应子功能，例如由宿主细胞引发的ADCC效应。共刺激信号结构域和包含ITAM的细胞质信号传导结构域的组合，可以允许细胞内多个信号传导途径的稳定激活。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在其他实施方案中，免疫细胞可以是建立的细胞系，例如NK-92细胞。
免疫细胞群可以从任何来源获得，例如外周血单核细胞(PBMC)，骨髓，组织例如脾、淋巴结、胸腺或肿瘤组织。适合获得所需宿主细胞类型的来源，对本领域技术人员是显而易见的。在一些实施方案中，免疫细胞群体衍生自PBMC。期望的宿主细胞的类型(例如，免疫细胞例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合)，可以在通过将细胞与刺激分子共培养获得的细胞群中进行扩增。例如，抗CD3和抗CD28抗体可用于扩增T细胞。
为了构建表达本文所述的任何嵌合受体构建物的免疫细胞，可以通过本文所述的常规方法，构建用于稳定或瞬时表达嵌合受体构建物的表达载体，并将其引入免疫宿主细胞。例如，编码嵌合受体的核酸可以克隆到合适的表达载体(如病毒载体)中，并与合适的启动子可操作地连接。核酸和载体可以在合适的条件下与限制酶接触，从而在每个分子上产生互补末端，这些末端可以彼此配对并且用连接酶连接。或者，合成的核酸接头可以连接到编码嵌合受体的核酸的末端。合成接头可以含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/质粒/病毒载体的选择，取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型，但应适合在真核细胞中整合和复制。
多种启动子可用于表达本文所述的嵌合受体，包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR例如劳氏肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹病毒启动子。用于表达嵌合受体的另外的启动子包括：免疫细胞中的任何组成型活跃的启动子。或者，可以使用任何可调节的启动子，使得其表达可以在免疫细胞内进行调节。
另外，载体可以含有例如以下的一些或全部：选择性标记基因，例如用于在宿主细胞中选择稳定或瞬时的转染子的新霉素基因；用于高水平的转录的、来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的RNA加工信号和转录终止序列；SV40多瘤病毒复制起点和ColE1，其用于合适的附加体的复制；内部核糖体结合位点(IRESes)，多功能多克隆位点；T7和SP6RNA启动子，其用于有义和反义RNA的体外转录；当被引发时引起携带载体的细胞死亡的“自杀开关”或“自杀基因”(例如HSV胸苷激酶，诱导型胱天蛋白酶如iCasp9)和用于评估嵌合受体表达的报告基因。
在一个具体实施方案中，此类载体还包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予基因表达的细胞对试剂例如药物的敏感性的基因，并且当细胞与试剂接触或暴露于试剂时导致细胞死亡。自杀基因是本领域已知的(参见例如自杀基因疗法：方法和综述(Suicide Gene Therapy：Methodsand Reviews)，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Center for CancerTherapeutics在肿瘤研究所的肿瘤治疗的UK癌症研究中心(Sutton，Surrey，UK)，Humana出版，2004)，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶氨基转移酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶和胱天蛋白酶如半胱天冬酶8。
用于产生含有转基因的载体的合适载体和方法是本领域熟知的。用于表达嵌合受体的载体的制备的实例，可以在例如US2014/0106449中找到，其通过引用整体并入本文。
包含编码本文所述的嵌合受体构建物的核酸序列的任何载体，也在本发明的范围内。这样的载体或编码其中包含的嵌合受体的序列，可以通过合适的方法递送到宿主细胞例如宿主免疫细胞中。将载体递送至免疫细胞的方法是本领域熟知的，并且可包括：DNA电穿孔、RNA电穿孔、转染试剂例如脂质体、或病毒转导。
在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体，通过病毒转导递送至宿主细胞。用于递送的示例性病毒方法包括但不限于：重组逆转录病毒(参见例如PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利5,219,740和4,777,127；英国专利2,200,651；和欧洲专利0 345 242)，基于甲病毒的载体和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公开号WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体是逆转录病毒。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体是慢病毒。
描述逆转录病毒转导的参考文献的实例包括：Anderson等，US5,399,346；Mann等人，Cell 33：153(1983)；Temin等人，美国专利号4,650,764；Temin等人，美国专利4,980,289；Markowitz等人，J.Virol。62：1120(1988)；Temin等人，美国专利号5,124,263；由Dougherty等人的1995年3月16日公开的国际专利公开号WO 95/07358；和Kuo等人，Blood82：845(1993)。国际专利公开号WO 95/07358描述了原代B淋巴细胞的高效转导。关于可以使用的逆转录病毒转导和mRNA电穿孔的具体技术的实例，还参见下文的实施例部分。
在使用病毒载体将编码嵌合受体的载体导入宿主细胞的实施例中，能够感染免疫细胞并携带载体的病毒颗粒可以通过本领域已知的任何方法产生，并且可以在以下文献中找到，例如在PCT申请WO 1991/002805A2，WO 1998/009271 A1和美国专利6,194,191中。从细胞培养物上清液收获病毒颗粒，并且可以在使病毒颗粒与免疫细胞接触之前，分离和/或纯化病毒颗粒。
在一些实施方案中，编码本文所述的任何嵌合受体的RNA分子，可以通过常规方法(例如体外转录)制备，然后通过已知方法引入合适的宿主细胞，例如本文所述的那些，例如Rabinovich等人，Human Gene Therapy 17：1027-1035。如下文实施例中所示，mRNA电穿孔导致本发明的嵌合受体在T淋巴细胞中的有效表达。
在将编码本文提供的任何嵌合受体的载体或编码嵌合载体的核酸(例如RNA分子)导入宿主细胞后，在允许嵌合受体表达的条件下，培养细胞。在其中编码嵌合受体的核酸由可调节启动子调节的实例中，宿主细胞在其中可调节启动子被激活的条件下进行培养。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，并且在诱导分子存在下或在产生诱导分子的条件下培养免疫细胞。确定嵌合受体是否表达，对于本领域技术人员是明显的，并且可以通过任何已知的方法进行评估，例如通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)检测嵌合受体编码mRNA或检测嵌合受体蛋白，包括Western印迹、荧光显微镜和流式细胞术。或者，嵌合受体的表达可以在将免疫细胞施用于受试者后在体内发生。
或者，在本文公开的任何免疫细胞中嵌合受体构建物的表达，可以通过引入编码嵌合受体构建物的RNA分子来实现。这样的RNA分子可以通过体外转录或通过化学合成制备。然后通过例如电穿孔，将RNA分子引入合适的宿主细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合)。例如，可以按照Rabinovich等，Human Gene Therapy，17：1027-1035和WO WO2013/040557中描述的方法，合成RNA分子并将其引入宿主免疫细胞。
用于制备表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞的方法，还可以包括离体活化宿主细胞。激活宿主细胞指刺激宿主细胞进入激活状态，在所述状态下所述细胞能够执行效应子功能(例如ADCC)。激活宿主细胞的方法将取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型。例如，T细胞可以在一种或多种分子例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2或植物凝集素的存在下，进行离体活化。在其他实施例中，NK细胞可以在一种或多种分子存在下进行活化，例如4-1BB配体、抗4-1BB抗体、IL-15、抗IL-15受体抗体、IL-2、IL12、IL-21和K562细胞。在一些实施方案中，表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞，在施用于受试者之前在体外被活化。确定宿主细胞是否被激活，对于本领域技术人员是明显的，并且可以包括评估与细胞活化、细胞因子的表达或分泌和细胞形态相关的一种或多种细胞表面标志物的表达。
制备表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞的方法，可以包括离体扩增宿主细胞。扩增宿主细胞可以涉及导致表达嵌合受体的细胞数目增加的任何方法，例如允许宿主细胞增殖或刺激宿主细胞进行增殖。刺激宿主细胞扩增的方法取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型，并且对于本领域技术人员是明显的。在一些实施方案中，表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞，在给予受试者之前进行离体扩增。
在一些实施方案中，表达嵌合受体的宿主细胞，在向受试者施用细胞之前在体外进行扩增和活化。宿主细胞激活和扩增可用于使得病毒载体整合到基因组中并表达编码如本文所述的嵌合受体的基因。如果使用mRNA电穿孔，则可能不需要活化和/或扩增，尽管在活化细胞上进行时电穿孔可能更有效。在一些情况下，嵌合受体在合适的宿主细胞中瞬时表达(例如，3-5天)。如果存在潜在的毒性，瞬时表达可能是有利的，并且应当临床测试的初始阶段中对于测定可能的副作用是有帮助的。
IV.表达嵌合受体的免疫细胞在免疫治疗中的应用
本发明的示例性嵌合受体，赋予T淋巴细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)能力并增强NK细胞中的ADCC。当受体与结合肿瘤细胞的抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)结合时，其引发针对抗体(或包含Fc部分的其它抗肿瘤分子)靶向的癌细胞的T细胞活化、持续增殖和特异性的细胞毒性)。如下文实施例部分所公开的，包含本发明的嵌合受体的T淋巴细胞，对广泛的肿瘤细胞类型(包括B细胞淋巴瘤、乳腺癌和胃癌、神经母细胞瘤和骨肉瘤)以及原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)具有高度的细胞毒性。细胞毒性完全依赖于与靶细胞结合的特异性抗体的存在：可溶性抗体不诱导溶细胞颗粒的胞吐并且不引起非特异性细胞毒性。
CD16对Ig的Fc部分的亲和力程度是ADCC，并因此是抗体免疫治疗的临床反应的关键决定因素。选择对Ig具有高结合亲和力并介导优异ADCC的具有V158多态性的CD16，作为一个实例。虽然F158受体在诱导T细胞增殖和ADCC中具有比V158受体更低的效力，但是F158受体可能具有比V158受体更低的体内毒性，这使其在一些临床情况中是有用的。
本发明的嵌合受体，通过允许一种单一受体用于多种癌细胞类型来促进T细胞治疗。它还允许同时靶向多种抗原，基于肿瘤利用的免疫逃逸机制(Grupp等人，N Engl JMed)，该可能最终是有利的策略。。当需要时，通过抗体给药的简单撤回就可以停止抗体介导的细胞毒性。因为表达本发明的嵌合受体的T细胞仅由与靶细胞结合的抗体激活，所以未结合的免疫球蛋白不对输注的T细胞产生任何刺激。通过使用mRNA电穿孔瞬时表达嵌合受体，可限制任何潜在的自身免疫反应性，从而进一步增强临床安全性。
下文实施例部分公开的结果表明，在用本发明的嵌合受体进行遗传修饰后，离体活化和扩增并再输注的自体T细胞的输注，可显著提高ADCC。因为组合的CD3ζ/4-1BB信号还引起T细胞增殖，所以应当在肿瘤部位积聚活化的T细胞，这可以进一步增强它们的活性。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者(对象)中增强基于抗体的免疫治疗的功效的方法，所述受试者正在用能够结合癌细胞并具有人源化Fc部分的抗体，其可以结合人CD16，所述方法包括：向受试者中引入治疗有效量的T淋巴细胞或NK细胞，所述T淋巴细胞或NK细胞含有本发明的嵌合受体。
A.增强免疫治疗功效
本发明所述的表达嵌合受体(编码核酸或包含所述核酸的载体)的宿主细胞(例如免疫细胞)，可用于增强受试者中的ADCC和/或用于增强基于抗体的免疫治疗的功效。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或家养哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是人类癌症患者。在一些实施方案中，受试者已经用本文所述的任何治疗性抗体治疗或正在治疗。
免疫细胞可以与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，这也在本发明的范围内。
为了进行本文所述的方法，可将有效量的表达本文所述的任何嵌合受体构建物的免疫细胞，施用于需要治疗的受试者。免疫细胞可以是受试者自体的，即免疫细胞获自需要治疗的受试者，可以遗传工程化以用于表达嵌合受体构建物，然后施用于同一受试者。与施用非自体细胞相比，向受试者施用自体细胞可导致宿主细胞的排斥减少。或者，宿主细胞是同种异体细胞，即，细胞从第一受试者获得，经基因工程改造用于表达嵌合受体构建物，并施用于不同于第一受试者但是相同物种的第二受试者。例如，同种异体免疫细胞可以源自人供体，并施用于不同于所述供体的人受体。
在一些实施方案中，将免疫细胞施用于受试者，以有效增加ADCC活性至少20％，例如50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
在一些实施方案中，免疫细胞与治疗性含Fc的治疗剂(例如抗体或Fc融合分子如Fc融合蛋白)共同使用，以便增强基于抗体的免疫治疗的功效。基于抗体的免疫治疗用于治疗、减轻或减轻任何疾病或病症的症状，其中对于所述疾病或病症而言，免疫治疗被认为在受试者中是有用的。在这种治疗中，治疗性抗体可以结合在癌细胞上差异表达的细胞表面抗原(即，不在非癌细胞上表达或在非癌细胞上以较低水平表达)。被治疗性抗体结合并且表明表达所述抗原或靶分子的细胞应当遭受ADCC的抗原或靶分子的实例，包括但不限于：CD17/L1-CAM、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD52、CD56、CD70、CD79b、CD138、CEA、DS6、EGFR、EGFRvIII、ENPP3、FR、GD2、GPNMB、HER2、IL-13Rα2、间皮素、MUC1、MUC16、结合素4(Nectin-4)、PSMA和SCL44A4。
基于抗体的免疫治疗的功效，可以通过本领域已知的任何方法评估，并且对于熟练的医疗专业人员是显而易见的。例如，基于抗体的免疫治疗的功效，可以通过受试者或者肿瘤的存活或者受试者或者其组织或者其样品中的癌症负荷来评估。在一些实施方案中，将免疫细胞以有效增强基于抗体的免疫治疗的功效的量，施用于需要治疗的受试者，从而与不存在免疫细胞的情况下的效力相比，显示出更高至少20％的效率，例如50％、80％、100％、更优选至少5倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
在本文所述的任何方法中，免疫细胞例如T淋巴细胞或NK细胞，可以是从经受治疗的受试者分离的自体细胞。在一个具体实施方案中，在重新引入受试者之前，自体免疫细胞(例如T淋巴细胞或NK细胞)在活体外被活化和/或扩增。在另一个实施方案中，免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK细胞)是同种异体细胞。
在一个具体实施方案中，T淋巴细胞是同种异体T淋巴细胞，其中内源性T细胞受体的表达已被抑制或消除。在一个具体实施方案中，在引入受试者之前，同种异体T淋巴细胞在活体外被活化和/或扩增。T淋巴细胞可以通过本领域已知的任何方法，例如在抗CD3/CD28抗体、IL-2和/或植物血细胞凝集素的存在下进行活化。
NK细胞可以通过本领域已知的任何方法活化，例如，在一种或多种选自下组的物质下进行活化：CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。参见例如美国专利号7,435,596和8,026,097，它们描述用于扩增NK细胞的有用方法。例如，本发明的方法中使用的NK细胞，可以通过暴露于缺乏或表达主要组织相容性复合物I和/或II分子并且已经被遗传修饰以表达膜结合的IL-15和4-1BB配体(CDI37L)的细胞，优选地进行扩增。这样的细胞系包括但不必限于：K562[ATCC，CCL243；Lozzio等人，Blood 45(3)：321-334(1975)；Klein等人，J.Cancer 18：421-431(1976)]和Wilms肿瘤细胞系HFWT(Fehniger等人，Int Rev Immunol 20(3-4)：503-534(2001)；Harada H，等人Exp Hematol 32(7)：614-621(2004))，子宫内膜瘤肿瘤细胞系HHUA，黑素瘤细胞系HMV-II，肝母细胞瘤细胞系HuH-6，肺小细胞癌细胞系Lu-130和Lu-134-A，成神经细胞瘤细胞系NB19和N1369，来自睾丸NEC14的胚胎癌细胞系，宫颈癌细胞系TCO-2和骨髓转移的神经母细胞瘤细胞系TNB1[Harada等人，Jpn.J.Cancer Res 93：313-319(2002)]。优选地，所使用的细胞系缺乏或不足地表达MHC I和II分子，例如K562和HFWT细胞系。可以使用固体载体代替细胞系。这种固相载体应优选在其表面上附着至少一种的分子，所述分子能够结合NK细胞并诱导初级活化事件和/或增殖反应，或作为骨架能够结合具有这种效应的分子。载体可以在其表面的附着有：CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白或IL-15受体抗体。优选地，固相载体在其表面上结合有IL-15受体抗体和CD137抗体。
在上述方法的一个实施方案中，将T淋巴细胞或NK细胞引入(或再次引入)受试者，随后给予受试者治疗有效量的IL-2。
本发明的嵌合受体可用于治疗任何癌症，包括但不限于癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病，其中存在或能够产生具有Fc部分的特异性抗体与嵌合受体中的Fc结合物之间的结合。可以通过本发明的嵌合受体治疗的癌症的具体非限制性实例，包括例如B细胞来源的癌症(例如，B系急性淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非-霍奇金淋巴瘤)，乳腺癌，胃癌，成神经细胞瘤和骨肉瘤。
为了实施本文公开的方法，可以将有效量的表达嵌合受体的免疫细胞、含Fc的治疗剂(例如，含Fc的治疗性蛋白，例如Fc融合蛋白和治疗性抗体)或其组合(物)施用于需要治疗的受试者(例如，人类癌症患者)，这可通过合适的途径例如静脉内施用。任何表达嵌合受体的免疫细胞、含Fc的治疗剂或其组合(物)，可以以有效量施用于受试者。如本文所用，有效量是指在施用后赋予受试者治疗效果的相应药剂(例如，表达嵌合受体的宿主细胞、含Fc的治疗剂或其组合物)的量。确定本文所述的细胞或组合物的量是否达到治疗效果，对于本领域技术人员是明显的。有效量取决于所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数包括年龄、身体状况、大小、性别和体重、治疗持续时间、并发治疗的性质(如果有的话)、具体的给药途径以及的类似因素，这是本领域技术人员知晓的并且是健康从业者的知识和专长范围内的。在一些实施方案中，有效量减轻、缓解、改善、改善、减少症状或延迟受试者中任何疾病或病症的进展。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者是人类癌症患者。例如，受试者可以是患有癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤或白血病的人类患者。施用本文公开的细胞和组合物的合适的癌症的实例包括：例如淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌癌症、横纹肌肉瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌、头颈癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和甲状腺癌。
根据本发明，可以通过输注治疗有效剂量的免疫细胞(例如包含本发明的嵌合受体的T淋巴细胞或NK细胞，其治疗有效剂量在约105至1010或更多细胞每千克体重(细胞/Kg)的范围内)来治疗患者。输注可以经常重复和重复多次，直到达到所需的反应。合适的输注剂量和方案将随患者而变化，但可由治疗医师为特定患者确定。通常，输注约106细胞/Kg的初始剂量，升至108或更多细胞/Kg。可以共同施用IL-2以在输注后扩增所输注的细胞。IL-2的量可以是每平方米身体表面积约1-5×106国际单位。
在一些实施方案中，将表达本文公开的任何嵌合受体的免疫细胞施用于已经用含Fc的治疗剂(例如Fc融合蛋白或治疗性抗体)治疗或正在治疗的受试者。表达本文公开的任何一种嵌合受体的免疫细胞，可以与含Fc的治疗剂共同施用。例如，免疫细胞可以与治疗性抗体同时施用于人类受试者。或者，免疫细胞可在基于抗体的免疫治疗过程中施用于人类受试者。在一些实例中，免疫细胞和治疗性抗体可以相隔至少4小时，例如间隔至少12小时、间隔至少1天、间隔至少3天、间隔至少1周、至少相隔两个星期、或至少相隔一个月。
治疗性含Fc的治疗性蛋白的实例包括但不限于：阿达木单抗、曲妥珠单抗－美金刚偶联物(Ado-trastuzumab emtansine)、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、地诺单抗、地努单抗(Dinutuximab),依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥株单抗、戈利木单抗、英利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、那他珠单抗、阿托株单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托西珠单抗、曲妥珠单抗(tratuzumab)、伏特克单抗、和维多珠单抗。
使用的含Fc的治疗剂的合适剂量，将取决于要治疗的癌症的类型、疾病的严重性和病程、先前的治疗、患者的临床历史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。抗体可以在一次或一系列治疗中施用于患者。本发明的治疗的进展，可以通过常规技术和测定法容易地进行监测。
含Fc的治疗剂的施用可以通过任何合适的途径进行，包括全身施用以及直接施用于疾病部位(例如原发性肿瘤)。
B.组合治疗
本发明中描述的组合物和方法可以与用于癌症的其他类型的治疗(例如化疗、手术、放射、基因治疗等)联合使用。这些治疗可以与根据本发明的免疫治疗同时或依次(以任何顺序)进行。
当与另外的治疗剂共同施用时，由于叠加作用或协同作用，每种试剂的合适的治疗有效剂量可以降低。
本发明的治疗可以与其他免疫调节治疗进行组合，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX，基于DC的疫苗等)，检查点抑制剂(包括但不限于：阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等)或活化剂(包括但不限于增强41BB，OX40等的试剂)。
可用于与本发明的免疫治疗组合的其它治疗剂的非限制性实例包括：(i)抗血管生成剂(例如TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑素(纤溶酶原的38-Kd片段)、内皮抑制素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增殖素相关蛋白，以及在Carmeliet和Jain(2000)中所列出的那些)；(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，例如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体(aptamer)、中和性的抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及其任何组合；和(iii)化学治疗化合物，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)，嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括天然产物如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨(vinorelbine))，微管干扰剂如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)，长春新碱，长春花碱，诺考达唑，埃坡霉素和诺维本(navelbine)，表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)，DNA破坏剂(放线菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲胺奥沙利铂(hexamethyhnelamineoxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊甙、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素、米托蒽醌、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其在全身代谢L-天冬酰胺并去除不具有合成自身天冬酰胺的能力的细胞)；抗血小板药；抗增殖和抗有丝分裂的烷化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺及其类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲蜜胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)及其类似物，链脲霉素)，曲安-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)，丙卡巴肼，羟基脲，米托坦，氨鲁米特；激素，激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成的肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)，阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷菲德菌素(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸吗乙酯)；抗血管生成化合物(例如TNP-470、染料木黄酮(genistein)、贝伐单抗)和生长因子抑制剂(例如成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、依诺霉素、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康、伊立替康)，皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)。生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶激活剂；和染色质破坏剂。
另外有用的试剂的实例，还参见Physician's Desk Reference，第59版，(2005)，Thomson P D R出版(Montvale N.J)；Gennaro等人编辑的Remington's The Science andPractice of Pharmacy，20版，(2000)，Lippincott Williams和Wilkins出版社(BaltimoreMD)；Braunwald等人编辑，Harrison's Principles of Internal Medicine，15版，(2001)，McGraw Hill,NY；Berkow等人编辑，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，(1992)，Merck Research Laboratories出版(Rahway N.J.)。
V.用于治疗用途的试剂盒
本发明还提供了用于使用嵌合受体的试剂盒,从而增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和增强基于抗体的免疫治疗。这样的试剂盒可包括一个或多个容器，所述容器包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含任何核酸或宿主细胞(例如，免疫细胞，例如本文所述的那些)和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包含治疗性抗体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于本文所述的任何方法的说明书。所包括的说明书可以包括：对受试者施用第一和第二药物组合物以实现受试者的预期活性(例如增强ADCC活性和/或增强基于抗体的免疫治疗的功效)的描述。试剂盒可以进一步包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适于治疗的受试者的描述。在一些实施方案中，说明书包括将第一和第二药物组合物给予需要治疗的受试者的描述。
与本文所述的嵌合受体和第一和第二药物组合物的使用有关的说明，通常包括关于用于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单元剂量、大包装(例如多剂量包装)或亚单元剂量。在本发明的试剂盒中提供的说明书，通常是在标签或包装说明书上的书面说明。所述标签或包装说明书表明，所述药物组合物被用于治疗、延迟和/或缓解受试者的疾病或病症的发作。
本文提供的试剂盒位于合适的包装中。合适的包装包括但不限于：小瓶，瓶、罐、柔性包装等。还考虑了与特定装置(例如吸入器、鼻腔给药装置或输注装置)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，它们具有可被皮下注射针头刺穿的塞子)。容器还可以具有无菌入口。药物组合物中的至少一种活性剂是本文所述的嵌合受体。
试剂盒可任选地提供额外的组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供一制品，该制品包含上述试剂盒内含物。
通用技术
除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的阐述，例如“分子克隆：实验手册”(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，第二版(Sambrook，等人，1989)Cold Spring Harbor出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait，编，1984)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社；“细胞生物学：实验手册”(Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1989)学术出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑.1987)；细胞和组织培养的介绍(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；“细胞和组织培养：实验室程序”(Celland Tissue Culture：Laboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley and Sons出版；酶学方法(Methods in Enzymology)(学术出版社公司)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)：用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；分子生物学的当前方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel，等人编辑，1987)；PCR：聚合酶链反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis，等人编辑1994)；免疫学的当前方案(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等人编，1991)；分子生物学的短小方案(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物学(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(P.Fanch，1997)；抗体：实践方法(D.Catty编辑，IRL出版社，1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1999)；抗体(The Antibodies)(M.Zanetti和JDCapra编辑，Harwood AcademicPublishers，1995)；DNA克隆：实践方法，卷I和II(D.N.Glover编辑.1985)；核酸杂交(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)；转录和翻译(B.D.Hames&S.J.Higgins，编(1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney，(1986)；固定化的细胞和酶(1RL出版社，(1986)；和B.Perbal，分子克隆的实践指导(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等人(编))。
无需进一步详细描述，相信本领域技术人员可以基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本发明的其余部分。本文引用的所有出版物，通过引用并入本文用于参考的目的或主题。
实施例1
实施例1.表达CD16信号传导受体的T淋巴细胞发挥抗体依赖性癌细胞杀伤效力
材料和方法
细胞
人类B谱系淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos、T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat和神经母细胞瘤细胞系CHLA-255、NB1691和SK-N-SH，可在圣犹达儿童研究医院(St.JudeChildren's Research Hospital)获得。乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC HTB-22)和SK-BR-3(ATCC HTB-30)和骨肉瘤细胞系U-2OS(ATCC HTB-96)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；罗克维尔(Rockville)，马里兰州(MD))；胃癌细胞系MKN7来自国家生物医学创新研究所(National Institute of Biomedical Innovation)(大阪，日本)。还用鼠干细胞病毒(MSCV)-内核糖体进入位点(IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)逆转录病毒载体(含有包含萤火虫荧光素酶基因)转导Daudi、CHLA-255、NB1691、SK-N-SH、SK-BR-3、MCF-7、U-2OS和MKN7 34。用FACSAria细胞分选仪(BD Biosciences，San Jose，CA)筛选表达GFP的转导的细胞。来自新诊断和未治疗的B-慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的外周血或骨髓样品，在管辖新加坡国立大学医院的地区特定伦理委员会的知情同意和批准后获得。
外周血样品获自来自健康成人供体的血小板捐献的未鉴定的副产物。通过在Accu-Prep人类淋巴细胞细胞分离培养基(Accurate Chemical&Scientific Corp.，Westbury，NY)上离心富集单核细胞，并与抗CD3/CD28珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)在含有％10胎牛血清(FBS)、抗生素、100IU白细胞介素(IL)-2(Roche，Mannheim，德国)的RPMI-1640中一起培养3天。在第4天，通过用CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123和CD235a抗体和磁珠(Pan T Cell Isolation Kit II；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的混合物，进行阴性选择纯化T细胞(纯度，>98％)。将纯化的T细胞维持在上述培养基中，每隔一天加入100IU IL-2。
质粒，病毒生产和基因转导
pMSCV-IRES-GFP、pEQ-PAM3(-E)和pRDF获自圣犹达儿童研究医院载体开发和生产共享资源(St.Jude Children's Research Hospital Vector Development andProduction Shared Resource(Memphis，TN))10。FCRG3A cDNA获自Origene(Rockville,MD)，使用引物“F”CTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTC(SEQ ID NO：73)和“R”GACACATTTTTACTCCCAACAAGCCCCCTGCAGAAG(SEQ ID NO：74)，通过PCR进行定点诱变产生其V158F变体。将编码CD8α铰链和跨膜结构域的多核苷酸(SEQ ID NO：66)和4-1BB的细胞内结构域(SEQ ID NO：67)和CD3ζ(SEQ ID NO：68)从之前制备的抗CD19-41BB-CD3ζ cDNA(Imai等人,2004)中亚克隆。这些分子使用通过PCR的重叠延伸并进行剪接而组装。将构建物(“CD16F-BB-ζ”和“CD16V-BB-ζ”)和所述表达盒亚克隆到MSCV-IRES-GFP载体的EcoRI和MLu1位点。
为了产生RD114假型逆转录病毒，使用fuGENE 6或X-tremeGENE 9(Roche，Indianapolis，IN)，用3.5μg编码CD16V-BB-ζ的cDNA、3.5μg pEQ-PAM3(-E)和3μg的pRDF转染3x 106 293T细胞(Imai等人,2004)。用含10％FBS的RPMI-1640替换所述培养基24小时后，在48-96小时后收获含有逆转录病毒的培养基，并加入到RetroNectin(TakaRa，Otsu，Japan)包被的聚丙烯管中，将其在1400g离心10分钟并在37℃温育6小时。在进一步离心并除去上清液后，将T细胞(1×105)加入管中并在37℃下放置24小时。然后将细胞维持在含有FBS、抗生素和100IU/mL IL-2的RPMI-1640中，直到实验时间，在转导后7-21天。
通过使用R-Phycoerythrin结合的抗人CD16(克隆B73.1，BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)的流式细胞仪，分析CD16的表面表达。对于蛋白(western)印迹，将2×107个T细胞在含有1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和1％磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma)的Cellytic M裂解缓冲液(Sigma，St Louis，MO)中裂解，离心后，将裂解物上清液与等体积的具有或不具有还原缓冲液(Invitrogen)的LDS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)一起煮沸，然后通过NuPAGE Novex 12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)分离。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，其与小鼠抗人CD3ζ(克隆8D3；BD eBioscience Pharmingen)，然后与山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶偶联的的二抗(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)进行孵育。通过使用Amersham ECL Prime检测试剂(GE Healthcare)显示抗体结合。
mRNA电穿孔
pVAX1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)用作体外mRNA转录的模板。将CD16V-BB-ζcDNA亚克隆到pVAX1的EcoRI和XbaI位点。相应的mRNA在体外用T7 mScript mRNA生产系统(CellScript，Madison，WI)转录。Shimasaki等人，Cytotherapy。2012；14(7)：830-40。
对于电穿孔，使用Amaxa Nucleofector(Lonza，Walkersville，MD)；将1×107个用200IU/mL IL-2过夜活化的纯化T细胞，与200μg/mL mRNA在Cell Line Nucleofector KitV(Lonza)中混合，转移到处理室中，并使用程序X-001转染。电穿孔后立即将细胞从处理室转移到24孔板中，然后在含有FBS、抗生素和100IU/mL IL-2(Roche，Mannheim，Germany)的RPMI-1640中培养。还参见Shimasaki等人，Cytotherapy，2012,1-11。
抗体结合，细胞偶联和细胞增殖测定
为了测量嵌合受体的抗体结合能力，将用嵌合受体或仅含有GFP的载体转导的T淋巴细胞(5×105)与利妥昔单抗(Rituxan，Roche；0.1-1μg/mL)，曲妥珠单抗(赫赛汀，Roche；0.1-1μg/mL)和/或纯化的人IgG(R&D Systems，Minneapolis，MN；0.1-1μg/mL)，在4℃温育30分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，将细胞与山羊抗人IgG-PE(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)在室温下温育10分钟，并使用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)测量细胞染色。
为了确定抗体与受体结合是否促进细胞聚集，用CellTrace钙黄绿素红橙色AM(Invitrogen)标记CD20阳性Daudi细胞，然后在4℃与利妥昔单抗(0.1μg/mL)温育30分钟。在PBS中洗涤两次后，转导嵌合受体或模拟转导的Jurkat细胞在96孔圆底板(Costar，Corning，NY)中在1:1的E:T比例下，在37℃下温育60分钟。通过流式细胞术测定形成异源细胞聚集体(钙黄绿素AM-GFP双阳性)的细胞的比例。
为了测量细胞增殖，将用嵌合受体转导或模拟转导的1×106个T细胞置于含有FBS、抗生素和50IU/ml IL-2的RPMI-1640的24孔板的孔中(Costar，Corning，NY)。用Streck细胞防腐剂(Streck Laboratories，Omaha，NE)处理Daudi细胞以终止增殖，并在4℃用利妥昔单抗(0.1μg/mL)标记30分钟。在第0、7、14和21天，将它们与T细胞以1:1的比例加入到孔中。通过流式细胞术测量培养后的存活的T细胞的数量n。
CD107脱颗粒和细胞毒性测定
为了确定CD16交联是否引起裂解颗粒的胞吐作用，将嵌合受体和模拟转导的T细胞(1×105)置于利妥昔单抗包被的96孔平底板的每个孔中，并在37℃下培养4小时。在其他实验中，将T细胞与用利妥昔单抗预温育过的Daudi细胞共培养。在培养开始时加入偶联有藻红蛋白(BD Biosciences)的抗人CD107a抗体，1小时后加入GolgiStop(0.15微升；BDBiosciences)。通过流式细胞术分析CD107a阳性T细胞。
为了测试细胞毒性，将靶细胞悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640中，用钙黄绿素AM(Invitrogen)标记，并接种在96孔圆底板(Costar)中。以结果中所示的各种E：T比例加入T细胞，并与靶细胞共培养4小时，有或没有抗体利妥昔单抗(Rituxan，Roche)、曲妥株单抗(Herceptin，Roche)或hu14.18K322A(获自Dr.James Allay，St Jude Children's GMP，Memphis，TN；以1μg/mL)。在培养结束时，收集细胞，重悬于相同体积的PBS中，加入碘化丙啶。使用Accuri C6流式细胞仪对活的靶细胞(钙黄绿素阳性，碘化丙啶阴性)的数量进行计数34。对于贴壁细胞系，使用荧光素酶标记的靶细胞测试细胞毒性。为了测量对贴壁细胞系NB1691、CHLA-255、SK-BR-3、MCF-7、U-2OS和MKN7的细胞毒性，使用它们的经荧光素酶标记的衍生物。在铺板至少4小时后，如上所述加入T细胞。共培养4小时后，将Promega Bright-Glo荧光素酶试剂(Promega，Madison，WI)加入每个孔中。5分钟后，使用酶标仪BiotekFLx800(BioTek，Tucson，AZ)测量发光，并用Gen5 2.0数据分析软件分析。
异种移植实验
将表达荧光素酶的Daudi细胞腹膜内(i.p.；0.3×106个细胞/小鼠)注射进NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wj1/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor)中。一些小鼠在Daudi接种后4天，接受利妥昔单抗(100μg)腹膜内注射。有或没有在第5天和第6天，腹膜内注射人原代T细胞。用抗CD3/CD28珠激活T细胞3天，用CD16V-BB-ζ受体转导，重悬于含有10％FBS的RPMI-1640中，然后每只小鼠注射1×107个细胞。每周重复利妥昔单抗注射4周，无进一步的T淋巴细胞注射。所有小鼠接受腹腔注射1000-2000IU的IL-2，每周两次，持续4周。一组小鼠接受组织培养基，以代替利妥昔单抗或T细胞。
使用Xenogen IVIS-200系统(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)测量肿瘤的植入和生长。成像在腹腔注射D-荧光素钾盐的水溶液(3mg/小鼠)后5分钟开始，使用Living Image 3.0软件对从荧光素酶表达细胞发射的光子进行定量。
结果
CD16V-BB-ζ受体的表达
在约四分之一的个体中表达FCGR3A(CD16)的V158多态性，该多态性编码高亲和力免疫球蛋白Fc受体，并且与抗体治疗的有利反应相关。将FCGR3A基因的V158变体与CD8α的铰链和跨膜结构域、T细胞刺激分子CD3ζ和共刺激分子4-1BB(图1A)组合。使用含有CD16V-BB-ζ构建物和GFP的MCSV逆转录病毒载体，转导来自12个供体的外周血T淋巴细胞：CD3+细胞中的中值GFP表达为89.9％(范围，75.3％-97.1％)；在相同的细胞中，通过抗CD16染色评估的嵌合受体表面表达中值为83.0％(67.5％-91.8％)(图1B)。用仅含GFP的载体转导的来自相同供体的T淋巴细胞具有90.3％(67.8％-98.7％)的GFP表达中值，但仅有1.0％(0.1％-2.7％)的CD16表达(图1B)。CD4+和CD8+T细胞之间的受体表达无显著差异：与77.6％±9.2％的CD8+细胞相比，用CD16V-BB-ζ转导后，69.8％±10.8％的CD4+细胞是CD16+(图2)。
为了确保嵌合受体的其他组分被表达，通过流式细胞术测量CD3ζ的表达水平。如图1B所示。CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞表达CD3ζ的水平比模拟转导细胞表达的水平高得多：前者的平均荧光强度的平均值(±SD)为45,985±16,365，而后者为12,547±4,296(通过t检验，P＝0.027；n＝3；图1B)。还通过用抗CD3ζ抗体探测的蛋白印迹来测定嵌合蛋白的存在。如图1C所示，除了16kDa的内源性CD3ζ外，CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞在还原条件下表达约25kDa的嵌合蛋白。在非还原条件下，CD16V-BB-ζ蛋白显示表达为单体或50kDa的二聚体。
V158与F158CD16受体的抗体结合能力
为了测试CD16V-BB-ζ嵌合受体结合免疫球蛋白(Ig)的能力，转导来自3个供体的外周血T淋巴细胞。如图3A所示，在与利妥昔单抗孵育后，用抗体包被表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞。使用曲妥珠单抗和人IgG获得相似的结果。
然后，将含有FCGR3A(CD16)的高亲和力V158多态性的CD16V-BB-ζ受体的Ig结合能力，与含有F158变体替代的相同受体(“CD16F-BB-ζ”)的Ig结合能力进行比较。用任一受体转导Jurkat细胞后，将其与利妥昔单抗和抗人Ig PE抗体(结合利妥昔单抗)一起温育，PE荧光强度与GFP的荧光强度相关。如图3B所示，在任何给定水平的GFP，用CD16V-BB-ζ受体转导的细胞具有比用CD16F-BB-ζ受体转导的细胞更高的PE荧光强度，这表明前者具有显著更高的抗体-结合亲和力。曲妥珠单抗和人IgG也通过CD16V-BB-ζ受体以更高亲和力结合(图4)。
为了确定与CD16V-BB-ζ受体结合的抗体是否能够促进效应细胞和靶细胞的聚集，将表达CD16V-BB-ζ(和GFP)的Jurkat细胞与CD20+Daudi细胞系(用钙黄绿素AM红橙进行标记)以1:1的比例混合60分钟，并且在加入或不加入利妥昔单抗的情况下，测量GFP-钙黄绿素双联体(doublets)的形成。在3个实验中，如果表达CD16V-BB-ζ受体的Jurkat细胞并在利妥昔单抗存在时，则共培养物中39.0％±1.9％的结果是双联体(图3C和D)。相比之下，用人IgG代替利妥昔单抗，或用模拟转导的Jurkat细胞时，则不管是否存在利妥昔单抗，双联体小于5％。
Ig与CD16V-BB-ζ的结合诱导T细胞活化、脱颗粒和细胞增殖
评估了通过固定化抗体的CD16V-BB-ζ受体交联是否可以诱导T淋巴细胞中的激活信号。事实上，当在包被有利妥昔单抗的平板上培养时，用CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞显著增加了IL-2受体表达(CD25)，而在无抗体的情况下或在模拟转导的细胞中，而不管是否存在抗体，没有检测到变化(图5A和B)。
除了IL-2受体的表达，CD16V-BB-ζ受体交联引发了T淋巴细胞中裂解颗粒的胞吐作用，这通过CD107a染色被检测到。因此，在来自4个供体的T淋巴细胞接种在利妥昔单抗(n＝3)包被的微量滴定板上或在利妥昔单抗(n＝3)存在下与Daudi细胞共培养的6个实验中，表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞变为CD107a阳性(图5C)。
最后，确定受体交联是否可以诱导细胞增殖。如图5D所示，在利妥昔单抗和Daudi细胞(与T淋巴细胞以1:1的比例)存在下，对表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞进行扩增：在3个实验中，培养7天后的平均T细胞回收率为输入细胞的632％(±97％)；培养4周后，为6877％(±1399％)。值得注意的是，未结合的利妥昔单抗，即使在非常高的浓度下(1-10μg/mL)，在不存在靶细胞的情况下对细胞增殖没有显著的影响，并且在没有利妥昔单抗或在模拟转导的T细胞中，则不论是否存在抗体和/或靶细胞，都没有细胞生长(图5D)。因此，CD16V-BB-ζ受体的交联作用会诱导导致持续增殖的信号。
表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞在体外和体内介导ADCC
观察到CD16V-BB-ζ交联引起裂解颗粒的胞吐作用，这意味着CD16V-BB-ζ T淋巴细胞应当能够在特异性抗体存在下杀死靶细胞。实际上，在4小时体外细胞毒性测定中，在利妥昔单抗存在下，CD16V-BB-ζ T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos具有高度细胞毒性：超过50％的靶细胞，通常在以2:1的E:T比率共培养的4小时后裂解(图6和图7)。相比之下，在不存在抗体或模拟对照转导的T细胞的情况下，靶细胞的杀伤是低的(图6和图7)。值得注意的是，在这些实验中使用的效应细胞是CD3+T淋巴细胞高度富集的(>98％)，并且不含可检测的CD3-CD56+NK细胞。利妥昔单抗介导的CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的细胞毒性用，对于CD20+的原代CLL细胞也是明显的(n＝5)。如图6B所示，在2:1的E:T比例下共培养4小时后，细胞毒性通常超过70％。骨髓间充质基质细胞已显示出可发挥免疫抑制作用。为了测试这是否会影响CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的细胞毒性能力，将它们在骨髓来源的间充质基质细胞存在下，在1:2的E:T比下，与CLL细胞共培养24小时。如图6C所示，间充质细胞不减少介导ADCC的淋巴细胞的杀伤能力。
接下来，研究不同的免疫治疗抗体是否可以引发针对表达相应抗原的肿瘤细胞的相似的细胞毒性。因此，针对表达HER2(乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3，以及胃癌细胞系MKN7)或GD2(神经母细胞瘤细胞系CHLA-255、NB1691和SK-N-SH，以及骨肉瘤细胞系U2-OS)的实体肿瘤细胞，测试CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的细胞毒性。)。抗体曲妥珠单抗用于靶向HER2，而hu14.18K322A用于靶向GD2。CD16V-BB-ζ T淋巴细胞，在相应抗体存在下，对这些细胞具有高度细胞毒性(图6和图7)。在使用NB1691的实验中，还通过将培养物延长至24小时，测试是否可以在甚至更低的E：T比下实现细胞毒性。如图8所示，在hu14.18K322A存在下，在1:8比率下细胞毒性超过50％。为了进一步测试CD16V-BB-ζ介导的细胞杀伤的特异性，将CD20+Daudi细胞与CD16V-BB-ζ T淋巴细胞和不同特异性的抗体一起培养：仅利妥昔单抗介导细胞毒性，而在曲妥珠单抗或hu14.18K322A存在下，细胞毒性没有增加(图8)。最后，确定在免疫治疗抗体存在下，CD16V-BB-ζ介导的细胞杀伤是否可被未结合的单体型IgG所抑制。如图8所示，即使IgG以高于细胞结合的免疫治疗抗体的高1000倍的浓度存在，也不会影响T细胞的细胞毒性。
为了测量体内CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的抗肿瘤能力，用植入荧光素酶标记的Daudi细胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠进行实验。通过在接受CD16V-BB-ζ T淋巴细胞+利妥昔单抗的小鼠中的活体成像，来测量肿瘤生长，并且将它们的结果与仅接受利妥昔单抗或T淋巴细胞或未接受治疗的小鼠进行比较。如图9所示，肿瘤细胞在所有小鼠中增殖，除了先接受利妥昔单抗然后CD16V-BB-ζ T淋巴细胞的小鼠。与未处理的或接受抗体或单独的细胞处理的12只小鼠中留下0只相比，用这种组合治疗的所有5只小鼠在肿瘤注射的120多天后仍然缓解。在植入成神经细胞瘤细胞系NB1691并用hu14.18K322A和CD16V-BB-ζ T淋巴细胞处理的小鼠中，也观察到强的抗肿瘤活性(图10)。
CD16V-BB-ζ与其他受体的比较
首先比较了携带CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ受体的T细胞的功能。CD16F-BB-ζ受体诱导的T细胞增殖和ADCC，均高于在模拟对照转导的T细胞中的测量值。然而，与其对Ig的更高亲和力一致，CD16V-BB-ζ受体诱导的T细胞增殖和ADCC，显著高于由较低亲和力CD16F-BB-ζ受体所引发的T细胞增殖和ADCC(图11)。
接下来，将携带CD16V-BB-ζ的T细胞的功能与表达具有不同信号传导性质的其它受体的T细胞的功能进行比较。这些受体包括：没有信号能力的受体(“CD16V截短型”)，具有CD3ζ但没有4-1BB的受体(“CD16V-ζ”)，以及先前描述的将CD16V与Fcγ的跨膜和胞质结构域进行组合所形成的受体(图12)。在活化的T细胞中用逆转录病毒转导后，所有受体都高表达(图13)。如图14所示，CD16V-BB-ζ比所有其他构建物诱导显著更高的激活、增殖和特异性细胞毒性。
通过mRNA电穿孔表达CD16V-BB-ζ受体
在所有上述实验中，CD16V-BB-ζ表达是通过逆转录病毒转导实施的。测试另一种方法，即mRNA的电穿孔，是否也能赋予T淋巴细胞ADCC能力。对来自2个供体的活化T淋巴细胞进行电穿孔，并获得了高表达效率：在电穿孔后24小时，55％和82％的T淋巴细胞变为CD16+(图15A)。在第二供体中，还在第3天测试受体表达，当时为43％，这结果类似于使用另一受体的先前实验的结果，其表达持续了72至96小时。在用CD16V-BB-ζ mRNA电穿孔的T淋巴细胞中激活了ADCC：在利妥昔单抗存在下，在2:1的E:T比例下，在2小时后杀死80％Ramos细胞，而未用mRNA电穿孔的细胞无效。(图15B)。
还参见Kudo等人，Cancer Res.2014年1月1日；74(1)：93-103，其全部内容通过引用并入本文。
讨论
本文描述的是嵌合受体的开发，它将发挥ADCC的能力赋予T淋巴细胞。当CD16V-BB-ζ受体与结合于肿瘤细胞的抗体结合时，其引发T细胞活化、持续的增殖和针对抗体靶向的癌细胞的特异性细胞毒性。CD16V-BB-ζ T淋巴细胞对广泛的肿瘤细胞类型(包括B细胞淋巴瘤、乳腺癌和胃癌、神经母细胞瘤和骨肉瘤)以及原发性CLL细胞具有高度细胞毒性。细胞毒性完全依赖于与靶细胞结合的特异性抗体的存在；未结合的抗体不引起非特异性细胞毒性，也不影响细胞结合抗体的细胞毒性。当它们在间充质细胞层上培养时，无论该微环境的已知免疫抑制作用如何，CD16V-BB-ζ T细胞也杀死CLL细胞。此外，在利妥昔单抗后输注的CD16V-BB-ζT淋巴细胞，根除植入免疫缺陷小鼠的B细胞淋巴瘤细胞，并且在抗GD2抗体存在下，在植入神经母细胞瘤细胞的小鼠中具有相当大的抗肿瘤活性。总之，表达CD16V-BB-ζ的T细胞在体外和体内发挥强ADCC。
CD16对Ig的Fc部分的亲和力是ADCC的关键决定因素，并因此影响对抗体免疫治疗的临床反应。因此，正在进行相当大的努力以进一步增强Fc片段对FcγR的亲和力，例如通过糖基工程化。为了构建本发明的嵌合受体，选择具有V158多态性的FCGR3A(CD16)基因(SEQ ID NO：65)作为实例。该变体编码对Ig具有更高结合亲和力的受体，并且已经显示出介导优异的ADCC。实际上，在与包含更常见的F158变体的相同的嵌合受体的一对一的比较中，CD16V-BB-ζ具有显著更高的结合于人Ig Fc的能力，并且诱导更强烈的增殖和细胞毒性，这引起了最近针对亲和力在嵌合抗原受体功能中的作用的研究。当前的“第二代”嵌合受体，将刺激分子与共刺激分子组合，以增强信号传导并防止活化诱导的细胞凋亡。因此，将CD16V158，与CD3ζ和4-1BB(CD137)构成的刺激分子串联物(tandem)进行组合。事实上，与通过单独的CD3ζ或FcεRIγ作用的受体相比，CD16V-BB-ζ受体诱导显著更优的T细胞活化、增殖和细胞毒性。
通过临床试验的结果，越来越多地证明了遗传修饰的且表达受体的T细胞的临床潜力，其中所述受体识别肿瘤细胞表面抗原并可转导刺激信号。最值得注意的是，在接受通过病毒转导的、表达针对CD19或CD20的嵌合抗原受体的自体T淋巴细胞的B细胞恶性肿瘤患者中，已经报道了显著的肿瘤减少和/或完全缓解。将该策略扩展到其他肿瘤涉及相当大的努力，包括开发另一种嵌合抗原受体构建物，以及根据调节要求优化大规模转导条件。在这方面，本文所述的CD16V-BB-ζ受体，可通过允许一种单一受体用于多种癌细胞类型，来协助T细胞治疗的实施。它还应该允许同时靶向多种抗原，这种策略最终可能是有利的，考虑到肿瘤所采用的免疫逃逸机制，这种机制以由最近报道所阐述，其中缺乏由具有单特异性的嵌合受体靶向的标志物的亚克隆，会驱动白血病复发。当需要时，通过简单地撤回抗体施用，可以停止抗体指导的细胞毒性。因为表达CD16V-BB-ζ的T细胞仅被结合于靶细胞的抗体所激活，所以可溶性免疫球蛋白不会对输注的T细胞产生任何刺激。如本文所证明的，mRNA电穿孔可以非常有效地表达受体。
抗体治疗已成为许多癌症亚型的标准治疗；其临床效力主要由其通过Fc受体的结合所引发ADCC的能力决定。ADCC的主要效应子是NK细胞，但它们的功能在癌症患者中可能受损。例如，据报道，与用来自患有早期疾病或健康供体的患者的样品相比，来自胃癌患者和晚期疾病的外周血单核细胞的曲妥珠单抗介导的针对过表达HER2的胃癌细胞的ADCC显著降低。此外，反应可能受其他因素影响，包括NK细胞抑制性受体及其配体的基因型。本文提供的结果表明，用CD16V-BB-ζ受体遗传工程改造的自体T细胞的输注，可显著提高ADCC。因为组合的CD3ζ/4-1BB信号还引起T细胞增殖，所以在肿瘤部位会积聚活化的T细胞，这可以进一步增强它们的活性。CD16V-BB-ζ受体可以通过mRNA电穿孔，不仅在活化的T淋巴细胞中表达，而且在静息的外周血单核细胞中表达，该程序从血液收集到输注表达CD16V-BB-ζ的细胞仅需要几个小时，因此非常适合临床应用。
实施例2.各种不同嵌合受体的构建
编码以下嵌合受体的核酸序列，被克隆到载体pVAX1的HindIII和XbaI位点：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14。通过用限制性内切核酸酶XbaI消化，使DNA载体线性化，并用T7RNA聚合酶转录成RNA。随后使用来自Cellscript的ScriptCap Capping Enzyme和ScriptCap 2'-O-甲基转移酶，在其5'端对RNA进行酶促加帽，以得到Cap 1结构，然后在其3'末端用poly-A聚合酶进行多腺苷酸化。使用Invitrogen Neon电穿孔系统，将得到的mRNA电穿孔入Jurkat细胞，并在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃下，生长6小时。
然后将培养基中的电穿孔细胞与CD20特异性抗体－利妥昔单抗(Rituxan)(10μg/mL)在37℃下温育30分钟。收获细胞，用流式细胞术缓冲液(FC缓冲液；不含Ca2+和Mg2+的DPBS，0.2％牛血清白蛋白，0.2％NaN3)洗涤两次，并用PE-标记的抗CD16抗体或抗CD32抗体(用于SEQ ID NO：6)以检测嵌合受体表达，或用PE标记的山羊抗人抗体以检测结合的利妥昔单抗。通过流式细胞术分析被染色的细胞。用PE标记的抗CD16或抗CD32抗体，检测来自所有构建物的嵌合受体蛋白，其中平均荧光值范围为36,000至537,000。U构建物1(Ucontruct1)(SEQ ID NO：1)显示最高的表达水平。
图16(图A至C)显示了利妥昔单抗与用SEQ ID NO：1mRNA电穿孔的细胞和模拟对照电穿孔细胞的结合情况的流式细胞检测数据。与少于2％的模拟电穿孔细胞相比，大于95％的用编码SEQ ID NO：1的mRNA电穿孔的细胞被山羊抗人抗体所染色，这表明在Jurkat细胞表面上表达的嵌合受体能够结合于利妥昔单抗(图16A和16B)。当用PE-标记的山羊抗人抗体染色时，用SEQ ID NO：1mRNA电穿孔细胞的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高大约700倍(图16C和表8)。对SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：14，进行了类似的分析。使用这些构建物的嵌合受体mRNA进行电穿孔的细胞的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高约14至680倍，当用PE-标记的山羊抗人抗体染色时(表8)，这表明在Jurkat细胞表面上表达的所有这些嵌合受体蛋白能够结合利妥昔单抗。
这些实验表明，嵌合受体SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11和SEQ ID NO：14都在Jurkat细胞中表达，并且都结合于CD20特异性抗体利妥昔单抗。
表8：在嵌合受体构建物的活性实验中，嵌合受体结合于利妥昔单抗，以及CD25和CD69表达的相对中值荧光。
实施例3.表达嵌合受体的细胞显示出T细胞活化标记物
通过监测细胞表面活性标记CD25和CD69的存在，来评价上述实施例2中公开的表达嵌合受体的Jurkat细胞的活性。对于这些实验，使用Invitrogen Neon电穿孔系统，在没有mRNA(模拟对照)或存在编码上述实施例2中所述的嵌合受体构建物的mRNA下，电穿孔Jurkat细胞，并在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，在37℃生长8-9小时。收获细胞，用含有10％胎牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基洗涤。将这些细胞与Daudi靶细胞按1:1比例混合并与CD20特异性抗体利妥昔单抗(10μg/mL)混合，其中所述Daudi靶细胞(已用Streck细胞防腐剂将其固定)的细胞表面表达CD20。将该混合物在含有10％胎牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃下孵育18-20小时。收获细胞并用PE-标记的抗CD7抗体染色，以检测Jurkat细胞；并用APC-标记的抗CD25抗体或APC-标记的抗CD69抗体，以分别检测Jurkat细胞上的CD25和CD69表达。通过流式细胞术评价染色的细胞。
评价CD7阳性细胞的CD25和CD69的表达情况。在采用编码SEQ ID NO：1的mRNA的条件下，大于45％的CD7阳性细胞被APC标记的抗CD25抗体染色，相比之下，在模拟电穿孔条件下仅有小于3％的CD7阳性细胞。这表明，在这些实验的条件下，与不表达受体的细胞相比，表达嵌合受体的Jurkat细胞上的CD25活性标记物的表达增加(图17A和17B)。当CD7阳性细胞用APC-标记的抗CD25抗体染色进行评估时，在SEQ ID NO：1的mRNA条件下的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高大约6.7倍(图17C，表8)。与模拟电穿孔条件中约46％的CD7阳性细胞相比，在编码SEQ ID NO：1的mRNA条件下，大于98％的CD7阳性细胞被APC标记的抗CD69抗体染色，这表明，在这些实验的条件下，与不表达受体的细胞相比，表达嵌合受体的Jurkat细胞上的CD69活性标记物的表达增加(图18A和18B)。当CD7阳性细胞用APC-标记的抗-CD69抗体染色进行评估时，在SEQ ID NO：1的mRNA条件下的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高大约69倍(图18C，表8)。
对SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14进行了类似的分析。当对CD7阳性细胞用APC-标记的抗CD25抗体染色进行评估时，在细胞表达这些构建物的嵌合受体的条件下的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高大约2.3-7.6倍(表8)。这表明，在这些实验的条件下，与不表达受体的细胞相比，在表达这每一种嵌合受体的Jurkat细胞上的CD25活性标记物的表达是增加的(表8)。当CD7阳性细胞用APC-标记的抗-CD69抗体染色进行评估时，在细胞表达这些构建物的嵌合受体的条件下的中值荧光值，比模拟电穿孔细胞的中值荧光值高约10至64倍(表8)。这表明，在这些实验的条件下，与不表达受体的细胞相比，在表达这些嵌合受体的Jurkat细胞上的CD69活性标记物的表达是增加的(表8)。
这些实验表明，在这些受体与CD20特异性抗体－利妥昔单抗和表达CD20的Daudi靶细胞发生相互作用的条件下，与不表达嵌合受体的Jurkat细胞相比，表达这些嵌合受体的Jurkat细胞显示出活性标志物CD25和CD69的增加。
实施例4.嵌合受体在Jurkat细胞上表达
用编码嵌合受体的mRNA电穿孔的Jurkat细胞，通过用抗CDζ抗体的Western印迹分析，来分析嵌合受体表达。对于这些实验，使用Invitrogen Neon电穿孔系统，在无mRNA(mock)或在编码上述实施例2中所公开的构建物的mRNA存在下，电穿孔Jurkat细胞，并在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，在37℃生长8-9小时。收集细胞，并在磷酸酶和蛋白酶抑制剂存在下用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠，pH 7.4)裂解。对于每种裂解物，将25μg总蛋白上样于4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶的一个泳道上。将蛋白转移到PVDF膜上，并且在室温下，在TBST缓冲液(500mM Tris-HCl，1.5M NaCl，1％Tween-20，pH 7.4)中用5％牛奶封闭膜1小时。在4℃下用抗CDζ抗体与膜杂交检测过夜，用TBST缓冲液洗涤3次，并用辣根过氧化物酶连接的山羊抗人二抗进行检测。使用辣根过氧化物酶化学发光底物显现蛋白条带。
Western印迹实验的结果示于图19中。抗-CDζ抗体检测到含有CDζ胞内蛋白质序列的嵌合受体蛋白质的C-末端区域。对于所有嵌合受体构建物，检测到对应于全长受体蛋白的条带(泳道2-13)。嵌合受体蛋白的移动性以与蛋白质的不同分子量一致的方式进行变化。
这些结果表明，在用相应的mRNA电穿孔后，这些嵌合受体都在Jurkat细胞中表达。
其他实施例
在本说明书中公开的所有特征，可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由出于相同、等同或类似目的的替代特征所替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅仅是通用的一系列等同或类似特征的一个示例。
基于上面的描述中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改，以便适合各种不同的用途和条件。因此，其他实施例也在本权利要求的范围内。
序列表
<110> 优努姆治疗公司
<120> 嵌合受体及其在免疫治疗中的应用
<130> U1199.70000WO00
<140> 未给出
<141> 同时提供
<150> US 62/047,916
<151> 2014-09-09
<160> 87
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val
20 25 30
Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln
50 55 60
Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr
85 90 95
Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly
100 105 110
Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro
115 120 125
Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val
130 135 140
Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser
145 150 155 160
Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn
180 185 190
Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe
195 200 205
Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
210 215 220
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
225 230 235 240
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
275 280 285
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
290 295 300
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
<210> 2
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val
35 40 45
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Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
225 230 235 240
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu
260 265 270
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly
275 280 285
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
290 295 300
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
340 345 350
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355 360 365
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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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435 440
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<400> 11
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275 280 285
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
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Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
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Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
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Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
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355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Leu Pro Pro Arg
435
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
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Leu Pro Pro Arg
435
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<211> 436
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
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<223> 合成多肽
<400> 22
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<211> 436
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<211> 436
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<220>
<223> 合成多肽
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195 200 205
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340 345 350
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355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
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405 410 415
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435
<210> 28
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
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1 5 10 15
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala
65 70 75 80
Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser
85 90 95
Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu
100 105 110
Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu
115 120 125
Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu
130 135 140
Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr
145 150 155 160
Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly
165 170 175
Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile
180 185 190
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210 215 220
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
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Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
245 250 255
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
275 280 285
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290 295 300
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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
325 330 335
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
340 345 350
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
355 360 365
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370 375 380
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
405 410 415
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420 425 430
Arg
<210> 46
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
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65 70 75 80
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130 135 140
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370 375 380
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Leu Pro Pro Arg
435
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<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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305 310 315 320
Gly Asp Pro Gly Cys Leu Lys Pro Leu His Glu Lys Asp Ser Glu Ser
325 330 335
Gly Gly Gly Lys Asp Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
340 345 350
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
355 360 365
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
370 375 380
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
405 410 415
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
420 425 430
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
435 440 445
Ala Leu Pro Pro Arg
450
<210> 54
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val
20 25 30
Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln
50 55 60
Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr
85 90 95
Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly
100 105 110
Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro
115 120 125
Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val
130 135 140
Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser
145 150 155 160
Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn
180 185 190
Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe
195 200 205
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210 215 220
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
225 230 235 240
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Lys Lys Gln Arg
275 280 285
Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala
290 295 300
Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro
305 310 315 320
Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg
325 330 335
Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln
340 345 350
His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His
355 360 365
Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro
370 375 380
Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val
20 25 30
Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln
50 55 60
Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr
85 90 95
Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly
100 105 110
Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro
115 120 125
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130 135 140
Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser
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165 170 175
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210 215 220
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Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Cys Asp Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr
260 265 270
Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg
275 280 285
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305 310 315 320
Pro Pro Gln Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
325 330 335
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340 345 350
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360 365
<210> 56
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val
20 25 30
Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln
50 55 60
Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr
85 90 95
Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly
100 105 110
Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro
115 120 125
Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val
130 135 140
Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe
195 200 205
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Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
225 230 235 240
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
275 280 285
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
290 295 300
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr
325 330 335
Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn
340 345 350
Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
355 360 365
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
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115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
<210> 58
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 59
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 62
cttctgcagg gggcttgttg ggagtaaaaa tgtgtc 36
<210> 63
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 63
gacacatttt tactcccaac aagccccctg cagaag 36
<210> 64
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 64
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggcatgc ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac 120
agggtgctcg agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg gagcctactc ccctgaggac 180
aattccacac agtggtttca caatgagagc ctcatctcaa gccaggcctc gagctacttc 240
attgacgctg ccacagtcga cgacagtgga gagtacaggt gccagacaaa cctctccacc 300
ctcagtgacc cggtgcagct agaagtccat atcggctggc tgttgctcca ggcccctcgg 360
tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc acagctggaa gaacactgct 420
ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga agtattttca tcataattct 480
gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct cctacttctg cagggggctt 540
gttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca ccatcactca aggtttggca 600
gtgtcaacca tctcatcatt ctttccacct gggtaccaaa ccacgacgcc agcgccgcga 660
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 720
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 780
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 840
tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 900
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 960
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1020
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1080
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1140
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1200
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1260
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1311
<210> 65
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 65
ggcatgcgga ctgaagatct cccaaaggct gtggtgttcc tggagcctca atggtacagg 60
gtgctcgaga aggacagtgt gactctgaag tgccagggag cctactcccc tgaggacaat 120
tccacacagt ggtttcacaa tgagagcctc atctcaagcc aggcctcgag ctacttcatt 180
gacgctgcca cagtcgacga cagtggagag tacaggtgcc agacaaacct ctccaccctc 240
agtgacccgg tgcagctaga agtccatatc ggctggctgt tgctccaggc ccctcggtgg 300
gtgttcaagg aggaagaccc tattcacctg aggtgtcaca gctggaagaa cactgctctg 360
cataaggtca catatttaca gaatggcaaa ggcaggaagt attttcatca taattctgac 420
ttctacattc caaaagccac actcaaagac agcggctcct acttctgcag ggggcttgtt 480
gggagtaaaa atgtgtcttc agagactgtg aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg 540
tcaaccatct catcattctt tccacctggg taccaa 576
<210> 66
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 66
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
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<210> 67
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 67
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 68
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 68
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
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gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
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<210> 69
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 69
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 70
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
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Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
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Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
<210> 71
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 71
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggcatgc ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac 120
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tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 900
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<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 72
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cataaggtca catatttaca gaatggcaaa ggcaggaagt attttcatca taattctgac 420
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gggagtaaaa atgtgtcttc agagactgtg aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg 540
tcaaccatct catcattctt tccacctggg taccaa 576
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 73
cttctgcagg gggcttgttg ggagtaaaaa tgtgtc 36
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 74
gacacatttt tactcccaac aagccccctg cagaag 36
<210> 75
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 79
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 80
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
<210> 81
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75
<210> 82
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150
<210> 83
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser
225
<210> 84
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
<210> 85
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Glu Thr Gln Arg Cys Thr Trp His Met Gly Glu Leu Val Trp Cys Glu
1 5 10 15
Arg Glu His Asn
20
<210> 86
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Lys Glu Ala Ser Cys Ser Tyr Trp Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Val
1 5 10 15
Ala Gly Val Glu
20
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10

Claims (72)

1.一种嵌合受体，其包含：
(a)Fc结合结构域；
(b)跨膜结构域；
(c)至少一个共刺激信号结构域；和
(d)包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质信号传导结构域；其中(c)或(d)位于所述嵌合受体的C末端；和其中
(i)如果(a)是CD16A的胞外配体结合结构域，则(d)不包含Fc受体的ITAM结构域，和
(ii)所述嵌合受体不是从N末端到C末端包含F158CD16A或V158CD16A的胞外配体结合结构域、CD8α的铰链和跨膜结构域、4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的细胞质信号传导结构域的受体。
2.如权利要求1所述的嵌合受体，其中(d)位于所述嵌合受体的C末端。
3.如权利要求1或权利要求1所述的嵌合受体，其还包含(e)铰链结构域，所述铰链结构域位于(a)的C末端和(b)的N末端。
4.如权利要求1-3中任一所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体在其N-末端还包含信号肽。
5.如权利要求1-4中任一所述的嵌合受体，其中(a)的Fc结合结构域选自下组：
(i)Fc受体的胞外配体结合结构域，所述受体任选地为Fc-γ受体、Fc-α受体或Fc-ε受体；
(ii)结合免疫球蛋白的Fc部分的抗体片段；
(iii)结合免疫球蛋白的Fc部分的天然存在的蛋白质，或其Fc结合片段，和
(iv)结合免疫球蛋白的Fc部分的合成多肽。
6.如权利要求5所述的嵌合受体，其中所述Fc结合结构域是(i)，其是CD16A，CD32A或CD64A的胞外配体结合结构域。
7.如权利要求6所述的嵌合受体，其中所述Fc结合结构域是CD32A或CD64A的胞外配体结合结构域。
8.如权利要求5所述的嵌合受体，其中所述Fc结合结构域是(ii)，其是单链可变片段(ScFv)、结构域抗体或纳米抗体。
9.如权利要求5所述的嵌合受体，其中所述Fc结合结构域是(iii)，其是蛋白A或蛋白G。
10.如权利要求5所述的嵌合受体，其中所述Fc结合结构域是(iv)，其是Kunitz肽、SMIP、avimer、亲和体、DARPin或anticalin。
11.如权利要求1-10中任一所述的嵌合受体，其中(b)的跨膜结构域是单通膜蛋白。
12.如权利要求11所述的嵌合受体，其中所述跨膜结构域是选自下组的膜蛋白的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16A、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。
13.如权利要求11所述的嵌合受体，其中所述跨膜结构域是选自下组的膜蛋白的跨膜结构域：CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16A、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。
14.如权利要求1-10中任一所述的嵌合受体，其中(b)的跨膜结构域是非天然存在的疏水蛋白片段。
15.如权利要求1-14中任一所述的嵌合受体，其中(c)的至少一个共刺激信号传导结构域是来自选自下组的共刺激分子：4-1BB、CD28、CD28LL→GG变体、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1和CD2。
16.如权利要求1-14中任一所述的嵌合受体、其中(c)的至少一个共刺激信号传导结构域是来自选自下组的共刺激分子：CD28、CD28LL→GG变体、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1和CD2。
17.如权利要求1-16中任一所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含两个共刺激信号结构域。
18.如权利要求17所述的嵌合受体，其中所述两个共刺激结构域是：
(i)CD28和4-1BB；或
(ii)CD28LL→GG变体和4-1BB。
19.如权利要求1-18中任一所述的嵌合受体，其中(d)的细胞质信号传导结构域是CD3ζ或FcεR1γ的细胞质结构域。
20.如权利要求3-19中任一所述的嵌合受体，其中(e)的铰链结构域是CD8α或IgG的铰链结构域。
21.如权利要求3-19中任一所述的嵌合受体，其中所述铰链结构域是非天然存在的肽。
22.如权利要求21所述的嵌合受体，其中所述铰链结构域是延伸的重组多肽(XTEN)或(Gly4Ser)n多肽，其中n是3-12且包含端点的整数。
23.如权利要求3所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含如表3所示的组分(a)-(e)。
24.如权利要求23所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含选自SEQ ID NO：2-11所示的氨基酸序列。
25.如权利要求3所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含如表4所示的组分(a)-(e)。
26.如权利要求25所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含选自SEQ ID NO：12-17所示的氨基酸序列。
27.如权利要求3所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含如表5所示的组分(a)-(e)。
28.如权利要求27所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体包含选自SEQ ID NO：18-30和32-56所示的氨基酸序列。
29.一种核酸，其包含编码权利要求1-28中任一所述的嵌合受体的核苷酸序列。
30.如权利要求29所述的核酸，其中所述核酸是RNA分子。
31.一种载体，所述载体包含权利要求29的核酸。
32.如权利要求31所述的载体，其中所述载体是表达载体。
33.如权利要求32所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
34.如权利要求33的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求29或权利要求30所述的核酸，或权利要求31-34中任一所述的载体。
36.如权利要求35所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
37.如权利要求36所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或T细胞。
38.如权利要求35-37中任一所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是其中内源性T细胞受体的表达已被抑制或消除的T细胞。
39.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含(a)权利要求20或权利要求30所述的核酸、权利要求31-34中任一所述的载体或权利要求35-38中任一所述的宿主细胞，和(b)药学上可接受的载体。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述组合物还包含含Fc的治疗剂。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其中所述含Fc的治疗剂是Fc融合蛋白。
42.如权利要求40所述的药物组合物，其中所述含Fc的治疗剂是治疗性抗体或Fc融合蛋白。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述含Fc的治疗剂是选自下组的治疗性抗体：阿达木单抗、曲妥珠单抗－美金刚偶联物(Ado-trastuzumab emtansine)、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、地诺单抗、地努单抗(Dinutuximab),依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥株单抗、戈利木单抗、英利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、那他珠单抗、阿托株单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托西珠单抗、曲妥珠单抗(tratuzumab)、伏特克单抗、和维多珠单抗。
44.一种试剂盒，其包括：
第一药物组合物，其包含(i)权利要求29或权利要求30所述的核酸、权利要求31-34中任一所述的载体或权利要求35-38中任一所述的宿主细胞，和(ii)药学上可接受的载体；和
第二药物组合物，其包含含Fc的治疗剂和药学上可接受的载体。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述含Fc的治疗剂是Fc融合蛋白。
46.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述含Fc的治疗剂是治疗性抗体。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中所述治疗性抗体选自下组：阿达木单抗、、曲妥珠单抗－美金刚偶联物、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、地诺单抗、地努单抗(Dinutuximab)、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥株单抗、戈利木单抗、英利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、那他珠单抗、阿托株单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托西珠单抗、曲妥珠单抗、伏特克单抗、和维多珠单抗。
48.一种用于增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或用于增强受试者中基于抗体的免疫治疗的功效的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的表达权利要求1-28中任一所述嵌合受体的宿主免疫细胞，和药学上可接受的载体。
49.如权利要求48所述的用于使用的药物组合物，其中所述宿主免疫细胞是天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或其组合。
50.如权利要求48或权利要求49所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述宿主免疫细胞是自体的。
51.如权利要求48或权利要求49所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述宿主免疫细胞是同种异体的。
52.如权利要求48-51中任一所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述宿主免疫细胞是体外活化的，扩增的或兼而有之。
53.如权利要求48-52中任一所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述受试者已经或正在用含Fc的治疗剂治疗。
54.如权利要求53所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述含Fc的治疗剂是治疗性抗体或Fc融合蛋白。
55.如权利要求54所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述含Fc的治疗剂是选自下组的治疗性抗体：阿达木单抗、曲妥珠单抗－美金刚偶联物、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那单抗、西妥昔单抗、赛妥株单抗，达利珠单抗、地诺单抗、地努单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥株单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、莫罗单抗、那他珠单抗、阿托株单抗、奥法木单抗、阿托株单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、雷株单抗、利妥昔单抗、托西珠单抗(TRocilizumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、伏特克单抗、和维多珠单抗。
56.如权利要求53-55中任一所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述受试者是患有癌症的人类患者，并且所述含Fc的治疗剂用于治疗所述癌症。
57.如权利要求56所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症选自下组：癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。
58.如权利要求57所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症选自下组：B细胞来源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌、头颈癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和甲状腺癌。
59.如权利要求58所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述B细胞来源的癌症选自下组：B系急性淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
60.一种用于制备表达嵌合受体的免疫细胞的方法，包括：
(i)提供免疫细胞群；
(ii)将权利要求1-28中任一所述的编码嵌合受体的核酸导入所述免疫细胞；和
(iii)在允许嵌合受体表达的条件下，培养所述免疫细胞。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)。
62.如权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述免疫细胞是天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或其组合。
63.如权利要求60-62中任一所述的方法，其中所述免疫细胞衍生自人类患者。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述人类患者是癌症患者。
65.如权利要求60-64中任一所述的方法，其中所述核酸是病毒载体。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
67.如权利要求60-64中任一所述的方法，其中所述核酸是RNA分子。
68.如权利要求60-67中任一所述的方法，其中所述载体通过慢病毒转导、逆转录病毒转导、DNA电穿孔或RNA电穿孔，被导入免疫细胞。
69.如权利要求60-68中任一所述的方法，其还包括(iv)活化所述表达嵌合受体的免疫细胞。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞，所述T细胞在抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和植物凝集素中的一种或多种的存在下进行活化。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述免疫细胞是其中内源性T细胞受体被抑制或消除的T细胞。
72.如权利要求69的方法，其中所述免疫细胞包含天然杀伤细胞、其在一种或多种以下物质的存在下被活化：4-1BB配体、抗4-1BB抗体、IL-15、抗IL-15受体的抗体、IL-2、IL-12、IL-21和K562细胞。
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