KR102550613B1 - 입자들의 안정성 및 응집도를 광학적으로 측정하는 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샘플 용기에 위치되는 액체 샘플 중의 입자들의 적어도 안정성 및 응집도를 광학적으로 측정하는 방법에 관한 것이고, 본 방법은 하기의 단계들: 입자들을 형광적으로 여기시키기 위해 적어도 제1 파장의 광을 사용해 샘플을 조사하는 단계; 입자들의 산란도를 검사하기 위해 적어도 제2 파장의 광(20)을 사용해 샘플(10)을 조사하는 단계; 샘플(10)에 의해 방출되는 형광 광을 측정하는 단계; 및 제2 파장의 흡광 광(22)을 측정하는 단계를 포함하고, 조사된 제2 파장의 광(20)은 샘플 용기(30)를 통과하고, 되반사되며, 반대 방향으로 샘플 용기를 또다시 통과하고, 흡광 광으로서 출사하며, 안정성은 측정된 형광 광에 기초하여 결정되고 응집도는 측정된 흡광 광에 기초하여 결정된다. 본 발명은 게다가 대응하는 장치에 관한 것이다.

Description

입자들의 안정성 및 응집도를 광학적으로 측정하는 시스템 및 방법

본 발명은 일반적으로 입자들의 안정성(stability)의 광학적 측정을 위한 장치 또는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 입자들의 안정성뿐만 아니라 입자들의 응집도(aggregation)가 광학적으로 측정될 수 있는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 입자들의 안정성 및 응집도가 하나의 단일 장치로, 바람직하게는 동시에 또는 거의 동시에 측정될 수 있다.

예를 들어, 항체들과 같은 활성 제제들은 그들의 자연 형태(native form)에서만 활성이도록 개발되었기 때문에, 변성된 활성 제제들은 종종 효과가 없어서 회피되어야만 한다. 변성(denaturation)은 생체분자들, 예를 들어, 단백질들의 구조적 변형을 의미하고, 대부분의 경우에, 상기 분자들의 생물학적 기능의 상실과 관련되어 있다. 변성은 물리적 또는 화학적 영향들 중 어느 하나의 결과일 수 있다. 따라서, 약물들의 변성을 방지하는, 즉 약물들을, 예를 들어, 열적으로, 화학적으로 그리고/또는 시간에 따라 안정화(stabilize)시키는 활성 제제 제형(active agent formulation)들이 개발되어야 한다.

활성 제제들을 응집시키는 것은 무효성(ineffectiveness)을 또한 가져올 수 있다. 게다가, 응집된 및/또는 변성된 입자들, 예를 들어, 응집된 항체들은 체내의 면역 체계의 반응을 유발할 수 있으며, 따라서 약물들에서 회피되거나 약물 중의 그들의 퍼센트가 최소화되어야만 한다.

입자들, 예를 들어, 항체들의 변성은, 유효성(effectiveness)을 감소시키기 때문에, 그 자체가 회피되어야만 한다. 입자들, 예를 들어, 항체들의 응집은, 면역 체계의 반응을 유발하고 또한 유효성의 감소를 가져올 수 있기 때문에, 그 자체가 회피되어야만 한다.

입자가 왜 응집 및/또는 변성되는지: 입자가 변성되기 때문에, 즉 그의 자연 형태로 있지 않기 때문에 입자가 응집되는지 또는 입자가 그의 자연 형태에서 응집되고 그 후에 변성되는지?는 종종 불분명하다. 따라서, 입자들을 포괄적으로 특성분석하기 위해, 응집만 또는 변성만을 서로 분리하여 분석하는 것으로는 종종 충분하지 않다.

본 발명의 시스템 및 방법을 사용해, 입자들의 변성은 물론 응집도가 측정될 수 있다. 상세하게는, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용해, 입자들의 변성은 물론 응집도가 사실상 동시에(실질적으로 동시에) 또는 동시에 측정될 수 있다.

입자들의 변성은 "입자내(intra particle)" 과정이며, 본 발명의 방법 및 시스템을 사용해 고유 입자 형광(예를 들어, 트립토판 형광, 티로신 형광)을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다. 동시에, 입자들의 크기를 변화시키는 "입자간(inter particle)" 과정인 입자들의 응집은 흡수되지 않은 광의 산란에 의해 측정될 수 있다.

광의 산란, 예를 들어, 레일리 산란(Rayleigh scattering)의 경우에 광의 정적 산란이 입자의 크기(반경)의 6제곱에 의존하기 때문에, 입자 크기의 변화들 그리고 따라서 입자들의 응집도를 측정하는 것이 매우 적합하다. 상기 광산란법은 공지되어 있고 많은 장치들 및 방법들에 의해 사용된다. 상세하게는, 종래 기술로부터 공지된 디바이스들은 결정된 입체각들에서의 입자들의 산란 광(scattered light), 즉 입사 광에 대해 결정된 입체각으로 입자에 의해 산란되는 광의 비율(share)을 측정한다. 입자들이 클수록 그리고 파장이 작을수록, 고정된, 적당하게 결정된 각도에 대한 산란 광의 강도가 커진다(예를 들어, http://www.lsinstruments.ch/technology/static_light_scattering_sls/를 참조). 이러한 방법은, 예를 들어, 출원 US 2014/0234865 A1에 기술되어 있다.

산란 광의 증가로부터, 예를 들어, 온도의 상승 동안, 이 방법들은 입자들의 크기 변화 그리고 따라서 응집을 결론지을 수 있다. 광 산란 과정들의 분야의 통상의 기술자는 검사될 입자들 상으로 조사되는 여기 광이 검출 광학계 내로 들어가는 것이 회피되어야만 한다는 것을 알고 있다. 통상의 기술자는 대응하는 장치들을 상기 여기 광의 직접 검출이 회피되거나 여기 광이 차단되는 방식으로 항상 구성할 것이고, 이는 상당한 기술적 노력을 요구한다. 산란광 측정들과 관련하여 반사들이 바람직하지 않고 또한 유리 큐벳들에서의 반사들이 문제들을 유발할 수 있다는 것이, 예를 들어, 특허 DE 10 2007 031 244에 기술되어 있다.

따라서, 입자들의 안정성 및 응집도를 측정하기 위한 개선된 또는 대안의 시스템 또는 개선된 또는 대안의 방법이 필요하다.

본 발명의 장치 및 본 발명의 방법은 독립 청구항들의 특징들에 의해 한정된다. 유리한 실시예들이 종속 청구항(subclaim)들에서 얻어질 수 있다.

본 발명은 샘플 용기에 위치되는 액체 샘플 중의 입자들의 안정성 및/또는 응집도를 광학적으로 측정 또는 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 응집도가 안정성과 독립적으로 측정될 수 있지만; 바람직하게는 응집도는 물론 안정성이 결정된다. 본 발명의 방법은 다음과 같은 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:

특히 입자들을 형광 발광하도록 자극하기 위해, 샘플이 제1 파장의 광 또는 광선으로 조사된다. 제1 파장의 광은 따라서 형광 여기 광이다. 샘플의 형광도를 결정하기 위해, 샘플에 의해 방출되는 형광 광이 측정된다. 전형적으로, 형광 광의 파장은 형광 여기 광의 제1 파장과 상이하다. 형광 광의 측정된 밝기 또는 강도에 기초하여, 입자들의 안정성에 대한 정보가 주어질 수 있다. 바람직하게는, 검출기는 형광도를 측정하며, 형광 여기 광은 260 nm 내지 300 nm의 파장 범위에, 더욱 바람직하게는 270 nm 내지 290 nm의 파장 범위에 있고, 형광 방출 광은 320 nm 내지 380 nm의 파장 범위에 있다.

입자들의 응집도는 제2 파장의 광을 사용해, 바람직하게는 제1 강도(I₀)를 사용해 샘플을 조사하는 것에 의해 결정된다. 본 발명에 따르면, 제1 또는 제2 파장은, 예를 들어, 레이저에 의해 제공되는 바와 같이, 정확한 파장에 대응할 수 있다. 본 발명에 따르면, 제1 및 제2 파장이라는 용어는 또한, 즉 파장 범위의 의미에서, "중간" 파장 또는 "중심" 파장일 수 있다. 예를 들어, 광원이 레이저가 아닌 경우 광원에 의해 파장 범위들이 방출된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 작거나 큰 파장 범위에 걸쳐 광을 방출하는 LED들이 사용된다. 파장의 범위를 제한하기 위해, 대역 통과 필터 = "여기 필터"가 바람직하게는 광선들의 경로에 포함된다. 예를 들어, 원하는 여기 파장 범위를 유지하기 위해 대역 통과 필터가 30 nm 내지 1 nm 사이의 대역 통과 폭을 가질 수 있다. 이것은, LED에 의해 방출되는 광이 형광 방출 검출의 파장 범위에 없는 파장 범위로 제한되도록, 형광과 관련하여 특히 바람직하다. 게다가, 소산도(extinction) 측정을 위해 LED를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 또한 이 경우에, 샘플 상으로 방출되는 파장 범위를 "제2 파장"(제2 파장 범위)으로 제한하기 위해 적당한 대역 통과 폭을 갖는 대역 통과 필터가 유사하게 사용될 수 있다.

입자들의 산란도는 바람직하게는 제2 파장을 사용해 결정된다. 본 발명에 따르면, 소산 광이 제2 파장에서 측정되고, 여기서 샘플 용기를 통과하는 제2 파장의 조사 광(I₀)과, 바람직하게는 또한 제2 파장의, 출사 광(emergent light)(I)(강도(I))의 비가 소산도를 나타낸다. 바람직하게는, 입사 방사(I₀)가 샘플 용기를 통과하고, 반사되며, 입사 방향과 실질적으로 반대 방향으로 샘플 용기를 통과하고, 이어서 본 발명의 관점에서 소산 광이라고도 지칭되는 광(I)으로서 출사한다. 특히 조사 광의 강도(I₀)와 관련한, 출사 광(소산 광)의 측정된 밝기 또는 강도(I)에 기초하여, 입자들의 안정성에 대한 정보가 획득될 수 있다. 본 발명에 따르면, 순수 응집도 측정이 또한 앞서 언급된 형광도 측정 없이 수행될 수 있다.

바람직하게는, 검사될 샘플 내의 입자들이 상기 파장에서 흡수되지 않거나 매우 약간만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만 흡수되도록 제2 파장이 선택된다. 더욱 바람직하게는 0.1% 미만이다. 게다가, 파장이 "샘플" 또는 "샘플 액체" 전체와 관련해서가 아니라 입자들의 흡광 거동과 관련하여 선택되는 것이 바람직한데, 그 이유는 선택된 액체와 관련하여 흡수하는 샘플 또는 샘플 액체 내의 첨가제들이 어쩌면 존재하기 때문이다. 그렇지만, 본 발명이 입자들의 안정성 및 응집도를 검사하기 때문에, 나머지 성분들의 흡광 거동은 "일정한" 것으로 가정될 수 있다.

예를 들어, 단백질들은 그들의 펩타이드 결합들(대략 220 nm에서 흡광도 최대) 및 그들의 아미노산들(대략 280 nm에서 흡광도 최대)로 인해 200 nm 내지 300 nm 사이의 범위에 있는 광을 흡수하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직하게는 300 nm보다 큰 파장을 갖는 광이 사용된다(도 16을 참조). 바람직하게는, 제1 파장과 제2 파장이 상이하다. 대안적으로, 제1 파장과 제2 파장이 또한 동일할 수 있다.

형광도를 측정하기 위해, 적어도 하나의 제1 파장이 사용된다. 본 발명에 따르면, 형광도 측정을 위해 제1 파장에 부가하여 추가의 파장이 사용되는 것이 또한 가능하다. 따라서, 예를 들어, 제1 형광은 280 nm의 파장에서 여기될 수 있고, 제2 형광은 632 nm의 제2 형광 채널에서 여기될 수 있다.

그에 대응하여, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 제2 파장이 소산도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 소산도가 2개의 상이한 파장에서: 예를 들어, 385 nm 및 532 nm에서 측정될 수 있다. 여기서, 예를 들어, 미 산란(Mie scattering)을 정량화하기 위해 양쪽 파장들에서의 측정된 값들의 비를 형성하고 평가하는 것이, 예를 들어, 가능하다.

환언하면, 본 발명에 따르면, 결정을 위해 2개 이상의 형광 채널 및/또는 2개 이상의 소산 채널을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예들 또는 본 발명의 바람직한 특징 조합들이 이하의 예시적인 양태들에 기술되어 있다:

1a. 샘플 용기에 위치되는 액체 샘플 중의 입자들, 리간드들 및/또는 입자-리간드 착물들의 특히 안정성 및/또는 응집도의 광학 측정을 위한 방법. 바람직하게는, 샘플 용기가 반사 표면 상에 배치되며, 여기서 샘플 용기는 상기 표면과 적어도 부분적으로 접촉한다.

1b. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 바람직하게는: 입자들을 형광적으로 여기시키기 위해 적어도 하나의 제1 파장 또는 적어도 하나의 제1 파장 범위의 광을 사용해 샘플을 조사하는 단계를 포함하는, 방법.

1c. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 바람직하게는: 입자들 및/또는 리간드 결합의 산란을 검사하기 위해 적어도 하나의 제2 파장 또는 적어도 하나의 제2 파장 범위의 광을 사용해 샘플을 조사하는 단계를 포함하는, 방법.

1d. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 바람직하게는: 샘플에 의해 방출된 형광 광을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.

1e. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 바람직하게는: 적어도 하나의 제2 파장에서의 또는 적어도 하나의 제2 파장 범위에서의 소산 광을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.

1f. 선행하는 양태에 있어서,

적어도 하나의 제2 파장 또는 적어도 하나의 제2 파장 범위의 조사 광은, 샘플 용기를 적어도 부분적으로 통과하고, 상기 표면에 의해 되반사되며, 실질적으로 반대 방향으로 샘플 용기를 적어도 부분적으로 또다시 통과하고 소산 광으로서 출사하도록, 샘플 용기 내로 조사되는, 방법.

1g. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 바람직하게는

측정된 형광 광에 기초하여 안정성을 그리고/또는 측정된 소산 광에 기초하여 응집도 및/또는 리간드 결합을 결정하는 단계를 포함하는 방법.

2. 양태 1에 있어서, 형광 광 및 소산 광이 공통 광학 시스템을 사용해 측정되는, 방법.

3. 양태 1 또는 양태 2 중 어느 한 양태에 있어서, 제1 및 제2 파장을 사용해 샘플을 조사하는 것이 동시에 수행되지 않거나; 제2 파장을 사용해 조사하는 것이 연속적으로 수행되는 반면, 제1 파장을 사용해 조사하는 것이 간헐적으로, 바람직하게는 주기적으로 수행되는, 방법.

4. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 형광 광 및 소산 광이 순차적으로, 거의 동시에 측정 및/또는 방출되는, 방법. 거의 동시에(almost simultaneously)는 바람직하게는 최대 4 ms, 2 ms 또는 1 ms 이내이다. 예를 들어, 단지 제1 파장의 광이 1 ms 동안 스위치 온될 수 있고 이어서 제2 파장의 광이 1 ms 동안 스위치 온될 수 있으며, 따라서 거의 동시에는 2 ms 이내를 의미한다. 본 발명에 따르면, 동시에(simultaneously)가 바람직하다. 동시 측정은, 예를 들어, 도 8의 구성으로 달성될 수 있다. 동시 측정은 보다 높은 효율 또는 성능이라는 특정의 장점을 갖는다. 따라서, 도 8의 구성에 의해, 예를 들어, 응집도를 측정할 때, 도 7에 의한 것보다 5 배 더 높은 성능이 가능하다.

5. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 소산 광 및 형광 광이 공통 검출기에 의해 측정되고(예를 들어, 도 6을 참조); 소산 광은 제1 검출기 및/또는 제2 검출기에 의해 측정되며, 제1 형광 파장의 형광 광은 제1 검출기에 의해 측정되고 제2 형광 파장의 형광 광은 제2 검출기(51)에 의해 측정되며(예를 들어, 도 7을 참조); 또는 소산 광은 제1 검출기에 의해 측정되며, 제1 형광 파장의 형광 광은 제2 검출기에 의해 측정되고 제2 형광 파장의 형광 광은 제3 검출기에 의해 측정되는(예를 들어, 도 8을 참조), 방법.

6. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 샘플 용기는 모세관인, 방법.

7. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 샘플 용기는 템퍼링(가열 또는 냉각)되고, 바람직하게는 템퍼링 요소(가열 또는 냉각 요소) 상에 놓이며, 접촉에 의해 템퍼링되고, 템퍼링 요소는 바람직하게는 반사 표면을 포함하고 바람직하게는 제2 파장의 조사 광을 되반사시켜, 반대 방향으로 샘플 용기(30)를 또다시 통과시키고 소산 광으로서 출사시키는, 방법.

8. 양태 7에 있어서, 템퍼링 요소는 자가형광(autofluorescence)을 거의 갖지 않는 재료로 제조되는, 방법. 바람직하게는, 상기 재료는 최대 형광 신호의 5%, 3% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만, 더욱 바람직하게는 0.5% 미만의 자가형광을 갖는다. 환언하면, 예를 들어, 최대 출력을 갖는 여기 LED가 광을 방출하고 형광 검출기가 (포화되기 전에) 최대 100개의 신호를 측정하는 경우, 1의 신호 강도만이 자가형광 재료를 확인할 수 있고; 이것은 1%일 것이다. 재료가 제2 파장의 파장 범위에서 높은 반사율, 바람직하게는 30% 초과, 바람직하게는 40% 초과, 더욱 바람직하게는 50% 초과를 가질 때가 더욱 유리하다. 바람직하게는, 재료는 실리콘(silicon)을 함유하거나 순수 실리콘으로 이루어져 있다.

추가의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 표면은 적어도 하나의 리세스, 예를 들어, 측정 동안 모세관이 놓이는 템퍼링 요소의 표면의 적어도 한 영역에 걸쳐 연장되는 퍼로우(furrow), 그루브(groove) 또는 마이크로 그루브의 형태를 갖는다. 바람직하게는, 모세관은 측정 동안 템퍼링 요소의 표면과 직접 접촉하는 반면, 모세관은 그루브의 깊이로 인해 그루브 위쪽에 있고 그루브의 바닥과 직접 접촉하지 않는다. 바람직하게는, 그루브는 1 내지 10 ㎜ 사이, 보다 바람직하게는 2 내지 8 ㎜ 사이, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 ㎜ 사이, 더욱 바람직하게는 대략 3 ㎜의 폭이고, 본 발명의 광의 되반사는 바람직하게 그루브 위쪽에 있는 모세관들의 영역에서 생성 또는 측정된다. 바람직하게는, 그루브는 대략 10 내지 30 μm의 깊이를 갖는다. 상세하게는, 그루브는 후방 산란에서의 간섭 효과들을 추가로 억제하기 위해 사용된 광의 코히런스 길이(coherence length)의 절반보다 더 큰 깊이를 갖는다. 따라서, 바람직하게는, 7.5 μm 초과의 그루브의 깊이가 바람직하도록, 사용된 LED 광원들은 대략 15 μm의 범위에 있는 코히런스 파장(coherence wavelength)들을 갖는다.

그루브의 바닥으로부터의 광의 효율적인 되반사를 보장하기 위해, 그루브가 바람직하게는 에칭된다. 바람직하게는, 그루브 또는 그루브의 바닥은 바람직하게는 나노미터 범위에 있는, 예를 들어, ± 5 nm, 바람직하게는 ± 1 nm인 평균 거칠기(average roughness)를 갖는다. 바람직한 실시예에 따르면, 예를 들어, 몇 개의 모세관이 그루브 위쪽에 배치될 수 있도록 그루브가 상기 표면의 상당 부분에 걸쳐 연장될 수 있다. 추가의 바람직한 실시예에 따르면, 그루브는 상기 표면의 에지까지 연장되지 않으며, 따라서 실리콘은 그루브 주위에서 일정한 두께를 갖고 따라서, 예를 들어, 커팅(cutting) 또는 소잉(sawing)에 의해 용이하게 가공될 수 있다.

9. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 샘플 용기는 측정 기간 동안 제1 및/또는 제2 파장의 조사 광에 대해 그리고/또는 검출기에 대해 시프트되고, 바람직하게는 여러 번(연속적으로) 앞뒤로 이동되며, 더욱 바람직하게는 복수의 샘플 용기들 또는 복수의 모세관들이 상기 상대 이동에 의해 스캔되는, 방법.

10. 양태 9에 있어서, 형광도 값은 시프팅을 통해 형광 광의 강도를 적분하는 것에 의해 결정되고 그리고/또는 소산도 값은 시프팅을 통해 소산 광의 강도를 적분하는 것에 의해 결정되는, 방법.

11. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 측정 기간 동안, 열적 안정성을 결정하기 위해, 샘플들의 온도가 변화되고, 바람직하게는 상승되며; 화학적 안정성을 결정하기 위해, 상이한 액체 샘플들 중의 변성제들의 농도가 상이하게 선택되며; 그리고/또는 시간에 따른 안정성을 결정하기 위해, 샘플이 1 시간 초과의 기간 동안 실질적으로 일정한 온도에 유지되는, 방법.

12. 양태 11에 있어서, 측정 기간 동안 복수의 샘플 용기들 및/또는 광학 시스템이 연속적으로 여러 번 앞뒤로 이동되고, 형광 광 및/또는 소산 광의 측정들이 이동 동안 수행되는, 방법.

13. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 소산 광의 측정이 제2 파장의 광의 산란에 대한 직접적인 척도이도록 제2 파장은 1%, 0.1%, 0.05% 미만, 바람직하게는 0.1% 미만이 샘플 또는 샘플 내의 입자들에 의해 흡수되도록 선택되는, 방법.

14. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 제1 파장의 광과 제2 파장의 광은 샘플 용기 내로 조사되는 공선형 광선(collinear ray)으로 결합되는, 방법.

15. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 되반사되어 조사 방향과 반대 방향으로 샘플 용기를 빠져나가는 제2 파장의 소산 광은 조사 방향으로부터 최대 5°, 바람직하게는 2° 미만, 더욱 바람직하게는 1° 미만 벗어나는, 방법.

16.a. 특히 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 따른, 샘플 용기에 위치되는 액체 샘플 중의 입자들 및/또는 리간드들 및/또는 입자-리간드 착물들의 특히 안정성 및/또는 응집도의 광학적 측정을 위한 장치.

16.b. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 장치는, 특히 검사될 입자들을 형광적으로 여기시키기 위해, 적어도 하나의 제1 파장의 광을 샘플 용기 내로 조사하기 위한 적어도 하나의 제1 광원을 포함하는, 장치.

16.c. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 장치는, 입자들 및/또는 리간드 결합의 산란 또는 응집을 측정하기 위해, 적어도 하나의 제2 파장의 광을 샘플 용기 내로 조사하기 위한 적어도 하나의 제2 광원을 포함하는, 장치.

16.d. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 장치는 샘플로부터 방사되는 여기된 형광 광을 측정하기 위한 적어도 하나의 제1 검출기를 포함하는, 장치.

16.e. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 장치는 적어도 하나의 제2 파장의 소산 광을 측정하기 위한 적어도 하나의 제2 검출기를 포함하고, 제2 파장의 조사 광은 샘플 용기를 통과하고, 되반사되며, 반대 방향으로 샘플 용기를 또다시 통과하고, 소산 광으로서 출사하는, 장치.

16.f. 선행하는 양태들 중 어느 한 양태에 있어서, 장치는 측정된 형광 광에 기초하여 입자들의 안정성을 결정하고 측정된 소산 광에 기초하여 입자들 및/또는 리간드 결합의 응집도를 결정하는 평가 수단을 포함하는, 장치. 바람직하게는, 장치는 제1 및 제2 광원들의 방출 광을, 각각, 제1 및 제2 파장들로 한정시키기 위한 제1 및/또는 제2 대역 통과 필터를 포함한다. 바람직하게는, 대역 통과 필터는 10 nm, 20 nm 또는 30 nm의 대역 통과 폭을 갖는다.

바람직하게는, 장치는 제2 파장의 조사 광이 되반사되는 반사 표면을 갖는 템퍼링 요소를 갖는다. 예를 들어, 실리콘이, 바람직한 반사 거동을 갖고 접촉을 통한 템퍼링에 적합하기 때문에, 특히 바람직하다는 것이 밝혀졌다. 게다가, 장치는 측정 목적을 위해 적어도 하나의 샘플 용기를 표면 상에 배치하는 데 적합한 것이 바람직하다. 예를 들어, 개별적으로 배치된 모세관들의 형태의 또는 복수의 모세관들을 포함하는 캐리어에 의한 몇 개의 샘플 용기들이 표면 상에 배치될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 그루브가 템퍼링 요소의 표면에 구성되고, 샘플 용기는 제2 파장의 조사 광이 바람직하게는 적어도 그루브의 바닥으로부터 되반사되는 방식으로 그루브 위쪽에 배치될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 10 mm 사이의 폭 및 제2 파장의 광의 코히런스 길이의 절반보다 더 큰 깊이를 갖는 그루브가 구성될 수 있다.

17. 앙태 1 내지 양태 15 중 어느 한 양태에 따른 방법을 수행하기 위한 양태 16에 따른 장치의 용도.

본 발명의 방법 또는 본 발명의 시스템은 종래의 광 산란 측정들과 비교하여 완전히 상이한 접근법을 갖는다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 산란되지 않은 광이 측정된다. 게다가, 바람직하게는 입자들에 의해 흡수되지 않는 파장을 갖는 광이 사용된다. 이는 입자들의 크기의 증가로 인해 산란이 증가할 때 측정된 신호가 감소한다는 것을 의미한다. 상기 본 발명의 측정 기법이 (소산도에 의한) 응집도의 보다 신속하고, 보다 정확하며, 보다 강건한 동시 검출 및 (형광에 의한) 단백질들의 변성 또는 언폴딩(unfolding)의 검출을 바람직하게는 높은 처리율로 가능하게 하는 특정 형광 광학계와 결합되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 응집도 측정을 위한 여기 광이 샘플 용기를 2회 통과하고 검출기로 되반사되는 방식으로 구성된다(도 1을 참조). 본 발명에 따르면, 응집도 측정을 위한 여기 광이 샘플 용기를 한 번만 통과하고 이어서 단방향 투과가 측정되는 것이 또한 가능하다. 직접 투과는 물론 반사 이후의 투과는, 정확히 말하면 공지된 방법들에서는 회피되었어야만 하는 것인, 여기 광의 "잔류 부분"이 측정된다는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 원칙적으로 소산도가 측정된다(예를 들어, https://de.wikipedia.org/wiki/Extinktion_(Optik)를 참조). 광학에서, 소산도 또는 광학 밀도는 로그 수식으로 된 지각적 불투명도(perceptional logarithmically formulated opacity)(

) 그리고 따라서 매질을 통과한 후의 방사(예를 들어, 광)의 감쇠에 대한 척도이다. I₀이 입사 방사이고 I가 출사 방사인 경우, 소산도(E)는 투과도(τ)를 로그 값으로 나타낸 것이다:

일반적으로, 흡수, 산란, 편향 및 반사의 프로세스들이 감쇠/소산에 수반된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는, 검사될 입자들(예를 들어, 생체분자들)에 의해 흡수되지 않는 파장들이 사용되고, 반사 및 편향과 같은 다른 영향을 미치는 변수들이 바람직하게는 일정하게 유지되기 때문에, 본 발명에 따르면 실질적으로 순수 산란에 기초한 감쇠가 측정된다.

이 접근법은, 상기 "산란도" 측정 원리가 고유 입자 형광을 측정하기 위한 (단일) 광학 시스템에 잘 통합될 수 있기 때문에, 특히 유리하다. 따라서, 하나의 광학 시스템만으로, nm 스케일에서의 입자들의 변성은 물론 nm 내지 μm 스케일에서의 입자들의 응집도가 검출 또는 측정될 수 있다. 구성에 따라, 양쪽 측정들이 순차적으로, 연달아 또는 심지어 동시에 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 검사될 샘플들이 바람직하게는 모세관들에서 검사되고, 이는 모세관들을 원하는 측정 위치로 신속하게 가져갈 수 있다는 바람직한 장점을 추가로 가지며, 이는 복수의 샘플들을 동시에 분석하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 이것은 작은 신호 변화들조차도 정확하게 결정 및 평가하는 것 - 이는 기존의 방법들에 의해 지금까지 보장되지 않음 - 을 가능하게 하는 높은 밀도의 데이터 점들을 보장한다.

본 발명에 따르면, 복수의 모세관들이 측정 디바이스의 어레이 요소 바로 위에 놓일 수 있다. 추가의 실시예에 따르면, 복수의 모세관들이 또한 개별적인 어레이 상에 배치될 수 있으며, 이는 반자동 또는 자동 채움 및/또는 측정을 가능하게 한다.

본 발명의 출원인인 NanoTemper Technologies GmbH는 모세관 내의 액체들이 광학적으로 검사되는 측정 디바이스들을 개발 및 판매한다. 개개의 모세관이 손으로 파지되고 액체에 침지되며 이어서 어레이 상에 개별적으로 위치된 다음에 측정 장치 내로 밀어 넣어지는 것이 추가로 공지되어 있다. 개별적인 모세관들을 채우는 상기 방법은, 예를 들어, http://www.youtube.com/watch?v=rCot5Nfi_Og에 게시되어 있는 NanoTemper Technologies GmbH의 비디오에 나와 있다. 특정한 개개의 샘플들에 대해 개별적으로 채우는 것이 유리하지만, 많은 양의 샘플들에 대해, 상기 방법은 용이하게 자동화될 수 없는 많은 핸들링 단계들을 필요로 한다.

본 발명과 동일한 출원인에 의해 출원된, 출원 EP 2 572 787에서, 자기력들에 의해 어레이에 유지되는 모세관들이 기술되어 있다. 이것은, 그 중에서도 특히, 개개의 모세관들을 어레이 상에 보다 쉽고 그리고/또는 보다 정확하게 위치시키는 것을 가능하게 한다. 환언하면, 개개의 모세관들을 개별적으로 채우는 것이 더욱 바람직하지만, 후속 단계는 자기력들에 의해 지지된다.

마지막으로, 출원 EP 2 848 310에서, 반자동 또는 자동 채우기 및/또는 측정도 가능하게 하는, 모세관들에 대한 개별적인 어레이가 기술된다. 상세하게는, 상기 어레이들은 또한, 복수의 모세관들이 효율적으로 채워질 수 있을 뿐만 아니라 매우 빠르게 스캔될 수 있다는 부가의 장점을 갖는, 본 발명의 방법에 대해 사용될 수 있다.

이하에서, 일부 용어들이 본 출원과 관련하여 어떻게 이해되어야 하는지에 관해 정의된다.

입자들

입자들은 본 출원과 관련하여 바람직하게는 활성 제제들, 일반적인 생체분자들, 예를 들어, 단백질들, 항체들, 막 단백질들, 막 수용체들, 펩타이드들, 뉴클레오티드들, DNA, RNA, 효소들; 분자 단편들, "저분자들", 당류, 유기 결합들, 무기 결합들; 소포(vesicle)들, 바이러스들, 박테리아들, 세포들, 미셀들, 리포솜들, 조직 샘플들, 조직 절편들, 막 표본들, 마이크로비드들 및/또는 나노입자들이지만, 이들로 제한되지 않는다.

형광도 측정

입자, 바람직하게는 단백질은 화학적으로 또는 열적으로 변성될 수 있고 내부 구조 변화들이 고유 형광, 예를 들어, 트립토판 형광, 티로신 형광, 페닐알라닌 형광, 바람직하게는 단백질들의 경우에 트립토판 형광에 의해 측정될 수 있다. 여기서, 입자의 구조/내부 변화들은 형광 강도의 변화들 또는 최대 형광의 시프팅 또는 형광 수명의 변화들 등에 의해 검출될 수 있다. 검사될 입자, 예를 들어, 단백질의 소위 융점(melting point)이 또한 이러한 방식으로 결정될 수 있다. 융점은 검사될 입자, 예를 들어, 단백질이 하프 폴딩되고(half-folded)(예를 들어, 단백질: 자연 형태로 있음) 하프 언폴딩된(half-unfolded)(예를 들어, 단백질: 구조화되지 않은, 변성된 형상) 상태로서 정의된다. 이와 관련하여, 형광 강도의 변화는, 예를 들어, 온도 또는 변성제 또는 보조 인자(co-factor)/리간드의 첨가에 따라 결정될 수 있고 그리고/또는 시간적 경과가 기록될 수 있다.

단백질들이 검사되는 경우, 예를 들어, 330 nm +/- 10 nm 및 350 nm +/- 10 nm의 파장의 트립토판 형광이 동시에 측정될 수 있지만 스펙트럼적으로 분리될 수 있다. 350 nm에서의 형광 강도와 330 nm에서의 형광 강도의 비(F350/F330)는, 입자의 내부 구조 또는 형태 변화들에 의존하기 때문에, 바람직한 측정 값이다. 트립토판이, 예를 들어, 단백질 내부에서, 단백질의 언폴딩으로 인해, 그의 소수성 환경에서 벗어나 친수성 환경, 예를 들어, 물에 들어갈 때, 트립토판의 형광 방출 최대치는, 예를 들어, 짧은 파장들(예를 들어, 330 nm +/- 10 nm)로부터 긴 파장들(예를 들어, 350 nm +/- 10 nm)로 시프트한다. 예를 들어, 융점이 F350/F330 곡선의 1차 도함수의 최대치로부터 결정될 수 있다.

소산도/산란도 측정

용액들 중의 입자들은 조사 광을 산란시킬 수 있다. 물리학에서의 산란은 일반적으로 국소적으로 상이한 객체(산란 중심)와의 상호작용에 의한 객체의 편향을 의미한다. 입자들에서의 광의 산란은 따라서 검사될 입자와의 상호작용에 의한 조사 (여기) 광의 편향이다. 산란각(θ)는 산란 광이 편향되는 각도로서 정의된다. 본 발명에 따르면, 광이, 조사 (여기) 광의 광선들의 경로로부터 측정되는, 바람직하게는 약 1° 초과, 바람직하게는 2°, 3°, 4° 초과 그리고 바람직하게는 179°, 178°, 177°, 176°미만 만큼 실제로 편향될 때, 이를 산란이라고 한다.

예를 들어, 레일리 산란(입자 치수가 광 파장의 약 1/10, 즉 입자 치수가 광 파장에 비해 작음) 및 미 산란(입자 치수들이 광 파장 이상의 범위에 있음)과 같은, 상이한 종류들의 산란이 구별된다. 용액 중에서의 산란의 정도는 입자들의 치수 및 개수에 의존한다. 역네제곱(inverse 4^th power)을 따르는 레일리 산란의 산란 강도가 파장에 의존하기 때문에, 산란 강도가 긴 파장 범위들에서보다, 짧은 파장 범위들, 예를 들어, 300 내지 400 nm에서 더 두드러진다. 산란의 정도는 조사 광의 강도를 투과 광의 강도와 비교하는 것에 의한 소산도 측정에 의해 정량화될 수 있다. 차이는 산란 광의 양에 대응하고, 따라서 입자들의 형성 또는 입자들의 응집에 대한 척도로서 역할한다.

생체분자들, 예를 들어, 단백질들의 경우에, 300 nm보다 더 높은 파장에서의 소산도의 검출이 유리하다. 상세하게는, 300 내지 400 nm 사이에서의 소산도의 검출이 유리하고 대략 385 nm에서 특히 유리한데, 그 이유는 여기서 실질적으로 광이 흡수되지 않지만(단백질들의 흡광도 최대가 대략 280 nm에서 있지만), 레일리 산란의 파장 의존성으로 인한 산란이 매우 높기 때문이다. 예를 들어, 385 nm의 광의 사용이 유리한데, 그 이유는 시장에 있는 적절한 LED들이 상당히 더 짧은 파장을 갖는 LED들보다 상기 파장에서 더 효율적이기 때문이다. 상세하게는, 강한 광 출력이 많은 광자들을 검출하는 데 유리하다. 따라서, 소산도 측정이 광자 잡음에 의해 종종 제한된다. 광자 잡음의 신호대 잡음비는 푸아송 분포를 따르고, 즉 이는 제곱근(광자들의 개수)에 따라 향상된다.

그에 부가하여, 소산도를 위한 파장의 앞서 언급된 선택은 추가의 장점들을 갖는다. 광이 입자들에 의해 흡수되지 않기 때문에, 입자들이 파괴되지 않으며, 따라서 이 파장 범위에 있는 "강한" 광 출력이 사용될 수 있다. 소산도 측정을 위한 LED의 광 출력은 바람직하게는 100 μW보다 더 높은 범위에 있고, 바람직하게는 1 mW보다 더 높은 범위에 있다. 바람직하게는, 소산도 측정을 위한 LED의 광 출력은 0.1 μW 내지 5 mW의 범위에 있다.

소산도를 측정하기 위해, 신호의 잡음이 적은 것 및 여기 광원의 드리프트가 적은 것이 유리하다. LED들은 적당한 LED 제어기들에 의해 매우 안정적으로 작동되고 잡음 감소될 수 있으며 따라서 소산도 측정들에 유리하다.

생체분자들, 예를 들어, 단백질들이 유리한 파장 범위들보다 상당히 더 작기 때문에, 레일리 산란이 가정될 수 있다. 레일리 산란이 입자 직경의 6제곱에 의존하기 때문에, 예를 들어, 입자들의 응집으로 인한, 입자의 크기의 변화들이 산란도의 큰 변화를 가져온다. 입자들에서의 산란이 모든 공간 방향들로 발생하기 때문에, 본 발명에 따르면, 소산도를 통해 산란도 또는 산란의 정도를 정량화하는 것이 제안되는데, 그 이유는, 산란 광이 작은 각도 범위에서만 검출되는 종래의 광 산란 측정들과는 달리, 총 산란도의 정량화가 산란각에 의존하지 않고 가능하기 때문이다. 게다가, 소산도 측정들이, 예를 들어, 경계 표면들 및, 예를 들어, 먼지 입자들과 같은 오염물들에서의 반사들과 같은, 측정 아티팩트들에 덜 민감하다.

소산도 측정들을 위한 바람직한 파장들 또는 파장 범위들은, 단백질들에 대한 흡광 스펙트럼이 도시되어 있는, 예를 들어, 도 16으로부터 도출될 수 있다. 예를 들어, 280 nm보다 더 큰, 바람직하게는 300 nm보다 더 큰 파장들이 특히 바람직하다는 것이 상기 스펙트럼으로부터 도출될 수 있다.

샘플 용기들

본 발명에 따르면, 액체들 또는 유체들의 형태로 용기들 또는 샘플 용기들에 있는 샘플들이 검사된다. 원칙적으로, 본 발명의 방법은 특정 종류 및 형상의 샘플 용기들로 제한되지 않는다. 그렇지만, 바람직하게는 모세관들이 샘플 용기들로서 사용되고, 이는 몇 가지 장점들을 갖는다. 예를 들어, 가는 모세관들의 사용은 작은 체적으로 인해 재료의 낭비의 감소를 가져온다. 게다가, 가는 모세관들은, 그들의 모세관력(capillary force)들에 의해서만, 수동적으로 액체를 흡입하기 위해 높은 모세관력들을 갖는다. 고점도 액체들조차도 모세관력들에 의해 모세관 내로 흡입될 수 있다. 예를 들어, 중력들도 모세관력들의 방향으로 작용하고 따라서 채우는 것을 지원하도록, 흡입될 샘플을 거꾸로 뒤집는 것이 또한 가능할 수 있다. 일회용 모세관들의 사용은 개개의 샘플들 간의 교차 오염을 회피할 수 있다. 가는 모세관이란 모세관을 통과하는 광 경로 길이가 작다는 것을 의미한다. 이것은 초고농축 용액들(고농도의 입자들)도 측정하는 데 유리하다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 개개의 모세관들이 사용될 수 있거나 어레이들 내의 모세관들이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 몇 개의 모세관을 갖는 어레이를 반사 표면 상에 위치시키는 것이 가능하고, 여기서 몇 개의 모세관이 바람직하게는 모세관들을 어레이로부터 제거할 필요 없이 표면과 접촉한다. 환언하면, 모세관들이 어레이에 남아 있으면서, 모세관들이 접촉 템퍼링을 통해 표면과의 접촉에 의해 템퍼링될 수 있다.

모세관들을 갖는 바람직한 어레이들은, 참조에 의해 본원에 원용되는, 예를 들어, EP 2 848 310에 기술되어 있다. 상세하게는, EP 2 848 310은 마이크로웰 플레이트의 몇 개의 모세관을 동시에 채우는 것을 가능하게 하는 몇 개의 모세관을 위한 어레이에 관한 것이다. 게다가, EP 2 848 310은 또한 마이크로리터 범위의 체적들을 갖는 액체들을 채우고, 이송하며 측정하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에 따르면, 24개의 모세관이 하나의 어레이에 배치될 수 있다.

액체 샘플은 바람직하게는 측정 동안 모세관들 내에서 정적, 즉 비유동 상태에 있다. 바람직하게는, 측정 동안 자연스러운 온도 이동 및/또는 액체에서의 증발로 인한 가능한 이동들을 초과하는 모세관 내에서의 어떤 유동들도 없다.

모세관들은 유리 및/또는 폴리머 및/또는 보로실리케이트 유리, 보로실리케이트 3.3 유리(예를 들어, DURAN 유리), 수프라실(suprasil)과 같은 석영 유리, 인프라실(infrasil), 합성 용융 실리카, 소다 석회 유리, Bk-7, ASTM Type 1 Class A 유리, ASTM Type 1 Class B 유리의 원소들 중 적어도 하나로 이루어져 있을 수 있다. 폴리머들은: PTFE, PMMA, Zeonor™, Zeonex™, Teflon AF, PC, PE, PET, PPS, PVDF, PFA, FEP, 및/또는 아크릴 유리를 포함할 수 있다.

특히, 모세관들의 적어도 하나의 범위가 200 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 250 nm 내지 900 nm의 파장을 갖는 광에 대해 투명한 것이 바람직하다. 모세관의 상기 범위가 또한 다음과 같은 파장 범위들: 940 nm 내지 1040 nm (바람직하게는 980 nm +/- 10 nm), 1150 nm 내지 1210 nm, 1280 nm 내지 1600 nm(바람직하게는 1450 nm +/- 20 nm 및/또는 1480 nm +/- 20 nm 및/또는 1550 nm +/- 20 nm), 1900 nm 내지 2000 nm(바람직하게는 1930 nm +/- 20 nm)를 갖는 광에 대해 투명한 것이 특히 바람직하지만, 이들로 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 투명한 범위(들)가 또한 모세관 전체에 걸쳐 연장될 수 있다는 것을 이해한다. 환언하면, 모세관들이 투명할 수 있고 바람직하게는 앞서 언급된 재료들 중 하나로 일체로 제조된다.

바람직하게는, 사용된 모세관들은 0.1 mm 내지 0.8 mm, 바람직하게는 0.2 mm 내지 0.6 mm, 더욱 바람직하게는 0.5mm의 내경을 갖는다. 바람직한 모세관들의 외경은 바람직하게는 0.2 mm 내지 1.0 mm 사이, 바람직하게는 0.3 mm 내지 0.65 mm이다.

모세관들의 기하학적 형태가 특정 형상으로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 원형 단면 또는 타원형 단면을 갖는 튜브형 모세관들이 사용된다. 그렇지만, 예를 들어, 삼각형, 사각형, 오각형 또는 다각형과 같은 상이한 단면을 갖는 모세관들을 사용하는 것이 또한 가능하다. 게다가, 모세관들의 길이에 걸쳐 일정하지 않거나 일정한 직경 및/또는 단면을 갖는 모세관들이 사용될 수 있다.

실리콘 표면

본 발명에 따르면, 샘플 용기들은 실리콘 표면 상에 있다. 바람직하게는, 실리콘 표면 위쪽에 배치되는 모세관들이 샘플 용기들로서 사용된다. 실리콘 표면은 바람직하게는 여기 광의 반사 표면 또는 반사를 위한 표면으로서 역할한다. 게다가, 본 발명에 따르면, 샘플 용기/모세관과 실리콘 사이의 직접 접촉 열 교환이 달성되도록, 샘플 용기들 또는 모세관들이 실리콘 표면과 직접 접촉되게 할 수 있다. 실리콘은 본 발명에 특히 유리한 몇몇 특성들을 갖는다.

실리콘은 바람직한 파장 범위에서 자가형광을 갖지 않는다. 실리콘은 본 발명에 따라 바람직한 파장 범위에서 높은 반사율을 갖는다(예를 들어, 도 9를 참조). 또한, 실리콘은 복수의 모세관들의 신속하고 균질한 템퍼링에 특히 유리한 높은 열 전도율을 갖는다. 상기 3개의 특성은 본 발명의 장치 및 본 발명의 방법에 특히 유리하다.

실리콘의 추가의 장점들은, 예를 들어, 그의 내화학성, 및 용이하게 입수가능하고 생산하기 용이하다는 것 - 이는 게다가 매우 매끄럽거나 매우 정확한 형상들/표면들을 형성하는 것을 가능하게 함 - 이다.

그렇지만, 본 발명이 실리콘의 사용으로 제한되지 않는다. 따라서, 반사 표면 및/또는 템퍼링을 위해 실리콘 대신에 다른 재료들이 사용될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 파장 측정 범위에서 낮은 자가형광을 갖거나 자가형광을 갖지 않고 바람직하게는 동시에 조사 광의 반사, 예를 들어, 10% 초과 반사를 나타내는 재료들이 적당하다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 바람직하게는 반사 코팅, 예를 들어, 간섭계 코팅(interferometric coating)을 구비하는 석영 층 또는 석영 플레이트가 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 복수의 측정들을 수행하기 위한 효율, 속도 및 비용과 관련하여 몇 가지 장점을 제공한다. 바람직하게는 실리콘 상에 놓이고 단일 광학 시스템에 대해 바람직하게 연속적으로 시프트되는 가는 모세관들의 조합이, 고유 형광(형광, 인광, 발광)의 측정 및 산란도(소산도)의 측정과 함께, 바람직하고 특히 유리하다. 상세하게는, 실리콘은 매우 양호한 열 전도 특성들과 사용된 파장의 광을 반사시키는 특성의 조합으로 인해 바람직한 재료이다. 개개의 모세관들 상에서 체류하지 않고 복수의 샘플들을 지나가는 것에 의한 소산도의 빠르고 정확한 검출은 또한 종래의 방법들에 비해 측정 속도와 데이터 점 밀도를 크게 증가시킨다.

본 발명의 방법 및 본 발명의 장치는 종래 기술과 본질적으로 상이하다. 상세하게는, 본 발명에 따르면, 광 산란 기술분야의 통상의 기술자가 종래 기술의 교시에 기초하여 사용하지 않을 방식으로 컴포넌트들이 조합된다. 게다가, 본 발명의 측정이 또한 흡광도 측정 기술분야의 통상의 기술자가 수행할 공지된 방법들과 상이하다. 원칙적으로, 흡광도 측정을 위한 광학 시스템과 본 발명의 장치 사이에 공통점들이 있다. 그렇지만, 본 발명에 따르면, 소산도 측정을 위한 파장은, 샘플에 의해 흡수되지 않도록, 특별히 선택된다. 따라서, 본 발명에 따르면, 치수에 의존하는 광의 산란도의 측정이 달성될 수 있다.

예를 들어, 종래 기술로부터, unCHAINED LABS에 의해 UNit^TM라는 이름으로 판매되는 장치가 공지되어 있다. 상기 장치에서, 마이크로큐벳들이 개별적으로 제어되어야만 하고, 측정을 위해 마이크로큐벳들이 측정 광학계에 대해 정확히 배치되어야만 한다. 본 발명에 따르면, 모세관들은 측정을 위해 멈추지 않고 상시/연속적으로 움직이고; 모세관들이 "전체적으로 스캔"된다. 따라서, 본 발명에 따르면, 보다 강건하고 보다 효율적인 구성 및 특히 훨씬 더 높은 데이터 밀도가 달성된다.

종래 기술에 따른 전체 스펙트럼의 기록으로 인해, 제어된 마이크로큐벳당 측정 시간은 몇 초 걸린다. 따라서, 하나의 온도에서의, 예를 들어, 48개의 샘플의 측정은 이미 몇 분 걸린다. 통상의 1℃/min의 가열 속도는 따라서 작은 데이터 점 밀도를 가져온다. 본 발명에 따르면, 단지 2개의 개별 파장(소산 및 형광)이 검출되는 것으로 이미 충분하며, 여기서 모세관들은 지나가는 동안 각각이 50 ms 미만 동안 광에 노출될 수 있으며, 따라서, 본 발명에 따르면, 몇 자릿수 더 높은 데이터 점 밀도가 달성된다.

종래 기술에서는 평소와 같이 정적 광 산란이 측정되며, 즉 실제로는 산란되는 광의 일부만이 측정되도록 여기 광은 차단된다. 그렇지만, 본 발명에 따르면, 투과된 부분 또는 반사된 부분, 즉 산란되지 않는 광 또는 조사 광의 일부가 측정된다.

게다가, 종래 기술로부터의 광 산란의 측정은 샘플들을 정확히 조준하는 것을 필요로 하며, 이는 광범위한 조절 및 정기적인 유지보수를 요구한다. 게다가, 이것은 좋지 않은 반복성을 가져오는데, 그 이유는 개별적인 샘플들을 조준함에 있어서의 작은 에러들조차도 광 산란 신호의 변동들을 초래할 수 있기 때문이다.

본 발명에 따르면, 광이 반사로 인해 모세관을 두 번 통과한 후에 소산 광이 측정된다. 고농도의 입자들 및 긴 경로 길이(예를 들어, 1cm)의 경우에, 어떠한 광도 모세관을 통해 복귀하지 않을 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 예를 들어, 0.5 mm의 내경을 갖는 가는 모세관들이 바람직하다. 현재 이용가능한 해결책들/방법들/장치들은 고농축 용액들, 예를 들어, 고농축 항체들(예를 들어, 수용액 중에 150mg/ml 항체들을 가짐)을 핸들링 및 측정하는 데 문제점들을 갖는다. 한편으로는 그들이 사용된 샘플 챔버들 내에 고점도 액체들을 채울 수 없기 때문이고, 다른 한편으로는 그들의 광학 경로 길이들이 너무 길기 때문이다. 그렇지만, 상기 고농축 용액들은 제약 산업, 특히 제제 측정(formulation measurement)에서 매우 관심을 끈다.

가는 모세관들의 사용은, 측정들이 고도로 민감하기 때문에, 큰 측정 다이내믹 레인지를 가능하게 하고(형광도 검출의 경우에 모세관 재료 및 실리콘의 자가형광이 거의/전혀 없음, 소산도 검출의 경우에 얇은 벽 모세관들의 높은 투과율 및 우수한 반사 특성들/균질성) 이와 동시에 고농축 용액들의 측정을 가능하게 한다(고농축 용액들의 소산도 측정들과 관련하여 유리한 얇은 광학 층 두께). 본 발명의 방법은 개개의 샘플 각각이 그 자체만으로 참조되기 때문에 내부 필터 효과들에 대해 강건하다. 따라서, 큰 재료 농도 범위들, 예를 들어, 50 mg/ml 단백질 내지 5 μg/ml 단백질이 하나의 단일 측정으로 분석될 수 있다.

특성: 모세관들을 광학계 아래에서 연속적으로 앞뒤로 이동시키는 것:

측정 동안 광학계에 대한 모세관들의 바람직한 연속적인 상대 시프팅(도 3 및 도 4를 참조)은 측정의 효율 및 정밀도와 관련하여 추가의 장점들을 갖는다. 본 발명에 따르면, 복수의 샘플들이, 예를 들어, 모든 샘플들을 동시에 동일한 온도로 템퍼링하는 것에 의해, 병렬로 측정될 수 있다. 본 발명의 방법은 개개의 모세관들 상에서의 긴 체류 시간을 요구하지 않으며; 모세관 상의 특정 측정 지점 쪽으로 지향된 구동이 필요하지 않으며, 그로 인해 본 방법이 매우 강건하고 매우 빠르다.

본 발명에 따르면, 게다가, 측정이 바람직하게는 모세관의 길이방향 축에 수직으로 수행되기 때문에 모세관의 대칭성이 이용될 수 있다. 게다가, 원형 또는 원통형 모세관들(원형 단면)이 유리한데, 그 이유는 이러한 모세관들이 저렴하게 제조될 수 있을 뿐만 아니라 양호한 품질을 갖고 높은 정밀도를 갖기 때문이다.

본 발명의 고속 스캔 절차로 인해, 매우 높은 데이터 점 밀도들이 달성될 수 있으며, 이는 데이터 평가에 유리한 효과들을 갖는다. 이하에서는, 상기 장점들 중 일부는 일 예에 의해 계산된다.

예를 들어, 0.5 mm의 내경 및 0.65 mm의 외경을 갖는 48개의 개별 모세관이 템퍼링된 실리콘 상에 2.25 mm의 거리(모세관의 중심으로부터 모세관의 중심까지)를 두고 수평으로 배치된다. 모세관들을 갖는 상기 템퍼링 보디 전체가, 예를 들어, 스텝 모터에 의해 작동되는, 예를 들어, 선형 축에 의해 고정 장착된 광학 시스템 하에서 연속적으로 앞뒤로 이동된다.

예를 들어, 템퍼링 보디 그리고 따라서 모세관들은 광학계 아래에서, 예를 들어, 45 mm/s의 속도로 스캔된다. 이 속도에서, 2.25 mm의 거리를 갖는 48개의 모세관 전부가 대략 3초 이내에 이동된다. 상세하게는, 앞뒤로 이동시키는 것에 의해, 각각의 모세관이 평균적으로 3초마다 측정된다("평균적으로"라고 한 이유는, 예를 들어, 가장 바깥쪽 모세관들이 구동 방향을 반대로 하는 것에 의해 사실상 순간적으로 두 번 측정되고 따라서 모세관이 또다시 광학계 바로 아래에 있을 때까지 3초(뒤로 구동) + 3초(복귀) = 6초 걸리기 때문임).

예시적인 구성에서, 템퍼링 보디의 온도가 측정되고 따라서 모세관들의 온도는 연속적으로 앞뒤로 이동시키는 동안 분당 1℃의 속도로 연속적으로 상승된다. 따라서, 분당 1℃의 온도 램프(temperature ramp)에 따라, 평균 0.05℃의 온도 분해능에 대응하는, 모세관별 분당 20개의 측정 점들의 데이터 밀도가 달성된다. 분당 1℃의 온도 상승 속도가 일정한 모세관 개수 및 일정한 이동 속도에서 분당 0.5℃로 절반으로 되는 경우, 온도 분해능은 0.05℃(분당 1℃의 경우)로부터 0.025℃(분당 0.5℃의 경우)로 2배로 된다.

모세관들의 직경 전체에 걸쳐 스캔되며, 즉 연속적으로 측정되기 때문에, 본 발명의 방법은 종래 기술로부터의 종래의 방법들 - 이에 따르면, 모세관의 하나의 단일 지점에서만 측정됨(예를 들어, unCHAINED LABS에 의한 UNit^TM을 참조) - 보다 국소적인 오염물들(예를 들어, 먼지 입자들, 기포들, 상세하게는 모세관의 직경보다 더 작은 오염물들)에 대해 더 강건하다. 상세하게는, 종래 기술에서는, 작은 국소적인 오염물들조차도 측정 아티팩트 및 측정의 거부를 가져올 수 있다.

본 발명의 모세관 스캐닝의 추가의 유리한 양태는 원형 모세관들을 "측정 빔"을 사용해 스캔하는 것으로 인해 상이한 층 두께들이 사실상 자동으로 측정된다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 도 3은 최대 샘플 두께/층 두께가 모세관의 중심에 있다는 것을 도시하고 있다. 샘플 액체의 보다 작은 층 두께는 대칭적으로 에지들에 있다. 예를 들어, 이것은, 예를 들어, 초고농축 용액들 - 이 경우에, 산란이 너무 많아서 모세관의 중심(가장 큰 층 두께)에서 어떠한 신호도 통과하지 못함(광 전체가 산란됨) - 에 유리하다. 그렇지만, 어떠한 신호도 통과하지 않는 경우, 신호의 변화들이 측정될 수 없다. 본 발명에 따르면, 모세관들의 직경 전체에 걸쳐 스캔되기 때문에, 반사 광선이 모세관을 통해 보다 짧은 거리를 커버해야 하는 에지 영역에서 0 초과의 측정된 값들이 달성된다. 이것은 실제적인 장점인데, 그 이유는 이에 따라 용액에서 보다 높은 농도 범위의 샘플들이 측정될 수 있기 때문이다.

형광도 및 소산도/산란도를 측정하기 위한 광학계

본 발명의 추가의 장점은, 보다 간단한 방식으로 구성되는, 형광도 및 소산도를 측정하기 위한 광학계에서 볼 수 있다. 유리하게도, 양쪽 측정들을 위해 공통 광학 시스템이 사용될 수 있다. 종래 기술로부터의 개별적인 광학계와 비교하여, 예를 들어, 조절, 위치결정, 재료 소비의 영역들에서 본 발명의 (공통) 광학계의 장점들이 있다. 그에 부가하여, 본 발명의 공통 광학 시스템은 또한 공간을 절감한다.

본 발명에 따르면, 형광도 측정과 소산도 측정은 순차적으로, 거의 동시에 또는 동시에 수행될 수 있다. 동시 측정이란: 형광에 의한 입자내(= 분자내) 프로세스들이 "산란도"/소산도에 의한 입자들의 크기 변화(= 분자간)의 측정과 동시에 수행될 수 있다는 것을 의미한다. 이것은 양쪽 프로세스들의 직접적인 상관관계를 가져온다. 이러한 방식으로, 변성(형광)과 응집(소산)이 동시에 또는 동일한 온도에서 시작되는지 여부 또는 하나의 프로세스가 다른 프로세스보다 먼저 시작되는지 여부가 인식될 수 있다. 이것은 또한 보다 강건한 측정을 가져온다.

측정들이 동시에 수행된다는 사실은 또한 보다 높거나 높은 데이터 밀도를 가져오고; 소산도와 형광도가 서로 개별적으로 측정되는 것처럼 시간 단위당 2배의 데이터가 측정될 수 있다. 따라서, 측정이 보다 정밀하고 단백질의 융점 및 단백질의 응집이 시작되는 온도가 보다 쉽게 결정될 수 있다.

소산도 측정("산란도" 측정)의 본 발명의 구성은 정적 산란 광 측정들보다 모세관 상의 및 모세관 내의 오염물들, 불순물들, 기포들에 대해 보다 강건하다.

입자들, 예를 들어, 항체들, 효소들, 펩타이드들과 같은 단백질들의 바람직한 재료 농도는 0.001 내지 500 mg/ml 사이이다. 유리한 농도들은 0.1 내지 100 mg/ml 사이이다.

본 발명의 구성 및 본 발명의 방법은 많은 상이한 농도들을 하나의 단일 실험에서 동시에 측정하는 것을 가능하게 한다. 이는, 예를 들어, 1000배만큼 상이한 농도들이 동일한 측정 설정으로 서로 동시에 측정될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 시스템 및 방법에 의해, 입자들의 열적 안정성, 입자들의 화학적 안정성은 물론 시간에 따른 입자들의 안정성의 측정들이 가능하다. 이하에서는, 안정성을 측정하기 위한 예들이 보다 상세히 기술된다.

열적 안정성

열적 안정성이 측정될 때, 수용액 중의 또는 액상의 입자들을 갖는 모세관들이 실리콘을 포함하는 템퍼링 보디 상에 위치되며, 모세관들의 온도가 낮은 값, 예를 들어, 15℃로부터 높은 값, 예를 들어, 95℃까지 상승되면서(도 13을 참조) 고유 형광 및 산란도/소산도가 바람직하게는 연속적으로(바람직하게는 동시에) 측정된다. 예를 들어, -20℃ 내지 +130℃ 및/또는 그의 일부분들의 온도들이 또한 사용될 수 있다.

먼저, 실리콘 표면이 천과 무수 에탄올로 여러 번 닦는 것에 의해 세정된다. 이어서, 적어도 10 μl의 분석될 샘플들, 예를 들어, 5 mg/ml 내지 0.3 mg/ml 사이의 상이한 재료 농도들의 항체 용액들 또는 상이한 생체분자들 또는 상이한 완충액들 중의 동일한 생체분자들이 준비된다. 10 μl의 각각의 용액이 이어서 모세관들을 용액들에 침지시키는 것에 의해 모세관력들에 의해 모세관들 내에 채워진다. 채워진 모세관들은 이어서 모세관 어레이로 이송되고 이어서 뚜껑에 의해 실리콘 표면 상에 압착된다. 20℃의 온도에서 3 내지 5초 내에 모든 모세관들의 330 및 350 nm 방출 파장에서의 소산도는 물론 형광도를 결정하는 "발견 스캔(discovery scan)"에 의해, 광 강도들이 조절되며, 이는 검출기들의 과다노출을 회피하기 위해 수동으로 또는 자동으로 수행될 수 있다. 이어서, 측정될 온도 범위, 예를 들어, 20℃ 내지 95℃ 그리고 온도 램프, 예를 들어, 1℃/min이 결정된다. 후자는, 예를 들어, 0.1℃/min과 100℃/min 사이에서 변화될 수 있다. 상기 파라미터들이 결정된 후에, 측정이 시작되고 샘플 소산도 및 샘플 형광도의 온도 의존성이 동시에 측정되고 디스플레이된다. 측정이 완료된 후에, 온도가 자동으로 시작 값으로 다시 설정된다.

열적 언폴딩 곡선들의 분석은, 예를 들어, 특정 언폴딩 온도(입자들의 50%가 언폴딩되는 온도)의 결정 - 이는, 예를 들어, 원시 데이터의 1차 또는 2차 도함수의 분석에 의한 변곡점들의 식별에 의해 또는 다른 수학적 프로세스들에 의해 수행될 수 있음 - 을 통해 수행된다. 소산도 측정에 의한 입자 형성의 분석은 바람직하게는 응집이 시작되는 온도를 검출하는 것에 의해 그리고 최대 소산도를 결정하는 것에 의해 수행된다.

예를 들어, 입자의 언폴딩의 가역성 또는 비가역성이 또한 열적 안정성 측정에 의해 결정될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 먼저 온도를 분당 1℃의 온도 램프로 20℃로부터 95℃까지 상승시키고 이어서 95℃의 온도를 동일한 또는 상이한 온도 램프로 20℃까지 하강시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 언폴딩이 가역적인 경우, 예를 들어, 가열 및 냉각의 프로세스 이후에, 330 nm에 대한 350 nm의 형광도 비가 또다시 시작 레벨/상기 프로세스에 대해 가졌던 값과 동일한 값에 도달한다. 본 발명에 따른 응집의 동시 측정에 의해, 응집이 언폴딩의 비가역성을 가져오는지 여부가 발견될 수 있다. 예를 들어, 항체가 형광 신호 중에서 상이한 열적 언폴딩 프로세스들을 갖는, 예를 들어, 60℃ 및 72℃의 용융 온도들을 갖는 경우에 그리고 항체가 이와 동시에 소산 동안 75℃에서 응집을 갖는 경우에, 예를 들어, 제1 실험에서 60℃까지 가열하고 이어서 또다시 냉각하며 제2 실험에서 75℃ 초과까지, 즉 응집 온도를 초과하여 가열하고 이어서 또다시 냉각하는 것이 가능하다. 제1 실험이 가역적 언폴딩을 보여주고 제2 실험이 비가역적 언폴딩을 보여주는 경우, 응집이 비가역적 언폴딩을 가져오거나 자연 상태로의 리폴딩(refolding)을 방해한다고 결론지을 수 있다.

화학적 안정성:

화학적 안정성을 측정할 때, 입자들이 변성제들, 예를 들어, 구아니디늄 하이드로클로라이드 또는 요소와 같은 카오트로픽염(chaotropic salt)들의 농도들을 증가시키면서 수용액들 중에서 혼합되고 모세관들에 채워지며 템퍼링 보디 상에 위치된다. 정의된 온도에서 모세관들을 1회 이동시키고 형광을 검출하는 것에 의해 입자들의 언폴딩의 정도가 검출된다(도 12를 참조).

화학적 언폴딩의 사용 분야들은, 예를 들어, 항체들 및 효소들과 같은, 단백질들의 제제들의 최적화, 입자들의 열역학적 특성분석은 물론 활성 제제 연구이다.

시간에 따른 안정성

시간에 따른 안정성을 측정할 때, 수용액 중의 입자들이 모세관들 내에 채워지고, 일정한 온도에서 정의된 기간에 걸쳐 소산도 및 형광도가 측정된다. 3시간 초과의 측정들과 관련하여, 증발에 의한 샘플 재료의 손실을 회피하기 위해 적당한 물질들, 예를 들어, 액상 플라스틱, 접착제, 왁스, 퍼티를 사용해 또는, 적당한 재료들, 예를 들어, 실리콘, 고무, 플라스틱을 압착하는 것에 의해 기계적으로 모세관 단부들을 실링하는 것이 유리하다. 시간에 따른 안정성을 측정하는 것은, 예를 들어, 입자들, 상세하게는 단백질들 및 활성 제제들의 특성분석을 위해 그리고 상기 입자들의 제제의 최적화를 위해 사용된다.

품질 관리

품질 관리를 위해 측정들이 수행될 때, 입자 용액들이 그들의 재현성 또는 보관성과 관련하여 테스트되고 스트레스 테스트들이 수행된다. 후자와 관련하여, 예를 들어, 단백질들이 어쩌면 그들의 폴딩에 부정적인 영향을 미치는 조건들, 예를 들어, 상승된 온도, 강도높은 진탕(shaking)/교반(stirring), 냉동 및 해동의 사이클들에 노출된다. 상이한 절차들을 수행한 후에, 용액들이 모세관들 내에 채워지고 샘플들의 형광도는 물론 소산도가 단일 모세관 스캔으로 또는 온도 램프에 따라, 예를 들어, 20℃로부터 95℃까지 1℃/min로 검출된다. 처리되지 않은 기준 샘플과 비교하는 것에 의해, 언폴딩되고 응집된 단백질의 비율이 검출될 수 있다.

리간드 결합

상기 측정들은 "열 이동 분석법(thermal shift assay)들"이라고도 지칭된다. 리간드 결합을 측정할 때, 입자들, 예를 들어, 효소들, 예를 들어, 키나아제들이, 리간드들, 예를 들어, 분자들의 단편들과 함께, 수용액 중에서 배양된다. 리간드가 입자에 결합하는 경우, 상기 리간드 결합은 입자의 안정성, 예를 들어, 열적 안정성 및/또는 그의 응집 거동에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 리간드가 입자에 결합하는 것은, 입자의 50%가 자연 형태로 있고 50%가 변성된 형태로 있는 온도인, 입자의 용융 온도를 상승 또는 하강시키며, 즉 입자를 안정화 또는 불안정화(destabilize)시킨다. 리간드를 갖지 않는 입자에 대한 입자-리간드 착물의 용융 온도의 상기 시프팅은 "ΔT"로서 측정될 수 있고, 따라서 리간드와 입자 간의 결합이 검출될 수 있다. 본 발명의 방법 및 장치는 ΔT>= 0.2°C의 용융 온도의 가장 작은 시프팅조차도 확실히 그리고 재현가능하게 검출 및 정량화하는 것을 가능하게 한다. 상이한 리간드들이 이어서, 예를 들어, 그들의 용융 온도의 시프팅(ΔT)에 의해 분류 및 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질들의 결정구조분석(crystallography)과 같은 응용분야들과 관련하여, 결합될 때 입자의 용융 온도를 특히 높은 용융 온도들로 시프트시키고 따라서 입자를 안정화시키는 리간드들이 탐색된다.

여기서, 형광 신호에 의해 열적 안정화를 측정할 뿐만 아니라, 본 발명의 소산도 측정에 의해 입자들, 리간드들 및/또는 입자-리간드 착물들의 가능한 응집을 측정하는 것이 유리하다. 이것은, 예를 들어, 열적 안정화는 물론 응집을 가져오는 리간드들을 선별하는 것을 가능하게 한다.

이하에서, 본 발명의 바람직한 실시예들이 도면들을 참조하여 상세히 기술된다.
도 1은 광 투과의 감쇠를 측정하는 것에 의한 본 발명의 광 산란의 측정의 동작 모드를 도시한 도면;
도 2는 종래 기술에 따른 고정된 산란 광 검출각을 사용한 산란 광의 직접 측정을 도시한 도면;
도 3은 샘플들을 광학 시스템에 대해 이동시키는 것에 의한 형광도 신호들 및 소산도 신호들의 발생을 도시한 도면;
도 4는 소산도 측정을 평가하기 위한 일 실시예를 도시한 도면;
도 5는 형광도 측정을 평가하기 위한 일 실시예를 도시한 도면;
도 6은 형광도와 소산도를 동시에 측정하기 위한 일 실시예를 도시한 도면;
도 7a는 형광 광선들의 경로가 그려져 있는, 형광도 비와 소산도의 거의 동시 측정을 위한 일 실시예를 도시한 도면;
도 7b는 도 7a의 실시예를 도시하지만, 소산 광선들의 경로가 그려진 도면;
도 8a는 형광 광선들의 경로가 그려져 있는, 형광도 비와 소산도의 동시 측정을 위한 추가의 실시예를 도시한 도면;
도 8b는 도 8a의 실시예를 도시하지만, 소산 광선들의 경로가 그려진 도면;
도 9는 실리콘의 반사율을 도시한 도면;
도 10은 항체의 형광도에 의해 분자내 언폴딩을 그리고 소산도에 의해 분자간 응집도를 동시에 검출하기 위한 측정 예를 도시한 도면;
도 11은 상이한 완충액들 중에서의 온도에 의존하는 항체의 응집도의 증가의 측정 예를 도시한 도면;
도 12는 화학적 언폴딩에 의한 상이한 온도들에서의 단백질 안정성을 검출하기 위한 측정 예를 도시한 도면;
도 13은 50 mg/ml 내지 2 μg/ml 사이의 상이한 단백질 농도들이 사용될 때 형광 광학계의 다이내믹 레인지를 설명하기 위한 예시적인 측정을 도시한 도면;
도 14는 강제 분해 시험(forced degradation test)들에 의한 단백질들의 품질 관리를 위한 예시적인 측정을 도시한 도면;
도 15는 항체의 최적 보관 조건들에 대한 완충액 스크리닝(buffer screening)을 위한 예시적인 측정 데이터를 도시한 도면;
도 16은 단백질의 예시적인 흡광 스펙트럼을 도시한 도면;
도 17a 및 도 17b는 본 발명의 템퍼링 보디의 평면도 및 단면도.

도 2는 고정된 각도에서의 정적 산란 광 측정에 의해 입자들을 측정하는 통상의 방법을 도시하고 있다. 검사될 샘플(13)은 강하게 산란하거나 강하게 응집하는 입자들을 갖는 액체이다. 샘플 액체는 표면(77) 상에 배치된 모세관(30) 내에 있다. 소산도 측정을 위해, 광(20)이 상부로부터 아래쪽으로 모세관(30)을 통해 샘플 액체 내로 조사된다. 조사 광(20)의 일부분이 반사 광(22)으로서 똑바로, 즉 조사 방향과 실질적으로 반대로 되반사된다. 산란 광(24)의 측정을 위해, 산란 광 검출기(200)는 조사 광선(20)과 샘플 사이에 각도 Φ로 있으며 따라서 강하게 산란하는 입자들(13)을 갖는 샘플 내에서 산란되는 광(24)을 직접 결정한다.

이 시스템의 단점들은 다음과 같이 요약될 수 있다. 검출기(200)에서의 신호에 대한 기여는 작은 각도 범위/각도 Φ를 중심으로 한 범위 내로의 산란에 의해서만 생성된다. 작은 각도 범위에서의 측정으로 인해, 이 시스템은 원하지 않는 기계적 움직임들, 예를 들어, 수직 방향으로의 움직임들에 취약하다. 모세관(30)의 특정 위치들에서, 검출기(200)의 방향으로의 모세관 벽들에서의 반사(예를 들어, 광선(25))가 검사될 입자들에서의 광 산란보다 더 강하다. 산란 광 측정의 기술분야의 통상의 기술자는 반사들 또는 반사 표면들(77)(예를 들어, 실리콘)을 회피하는 것이 중요하다는 것을 알고 있는데, 그 이유는, 예를 들어, 원하지 않는 반사 광선(26)이 또한 거기로부터 검출기(200)에 들어갈 수 있기 때문이다. 산란 광 측정들의 경우, 종래의 교시에 따르면 각도 Φ를 중심으로 한 매우 작은 각도 범위만이 측정될 수 있기 때문에, 산란 광 검출기(200)에 들어가는 상기 반사 광선(26)은 측정 신호의 변조(falsification)를 가져온다. 따라서, 통상의 기술자는 모든 원하지 않는 산란 광을 차단하기 위해 매우 복잡한 광학 시스템을 구성할 것이지만, 이는 광학 시스템을 취약하고 고가로 만든다. 상세하게는, 통상의 기술자는 반사 표면들을 회피할 것이다. 게다가, 검출기(200)의 경사진 배치는 수직 광선 경로를 갖는 기존의 광학계 내의 통합을 방해한다.

도 1은 본 발명의 측정의 동작 모드를 개략적으로 도시하고 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 광의 산란된 부분이 도 2에서와 같이 직접적으로 측정되는 것이 아니라 광 투과의 감쇠, 소위 소산도의 측정에 의해 측정된다. 환언하면, 소산 광은 산란되지 않는 광이다. 광학계의 구성에 따라, 조사 광(20)의 광선 축(A)으로부터 ± 10° 미만, 바람직하게는 ± 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2°, 1° 미만으로 산란되는 광이 바람직하게는 산란되지 않는 광으로서 해석된다. 큰 수광각 범위(acceptance angle range)를 가질 때는, 높은 신호대 잡음비가 달성될 수 있고, 작은 범위를 가질 때는, 높은 농도들에서 선형성이 보다 양호하다.

다시 말하지만, 이 예에서, 검사될 샘플이 표면(77) 상에 놓인 모세관(30) 내에 있다. 도착하는 광선(20)의 광은 샘플 용액 중의 입자들(13)에 의해 상이한 각도들로 부분적으로 산란된다(산란 광(24)을 참조). 조사 광의 광선은 표면(77)에서 반사되고 조사 광선(20)과 반대 방향으로 광선(22)으로서 되돌아간다. 표면(77)에서 반사되고 따라서 샘플 체적(13)을 두 번 통과한 광선(20, 22)의 강도는 샘플에서의 광 산란의 강도에 의존한다. 반사 광선(22)의 강도는 검출기(100)에 의해 측정되며, 검출기(100)의 수광 범위는 광선(20) 또는 광선들(20, 22)과 공선형이다. 도착하는/조사 광선들(20) 및 반사 광선들(22)의 파장은 측정될 샘플이 상기 범위에서 가능한 한 적은 광을 흡수하도록 선택되는 것이 바람직하다. 따라서, 광의 감쇠가 흡광에 의해서가 아니라 산란(소산)에 의해 주로 초래된다는 것이 달성될 수 있다. 상기 본 발명의 방법의 추가의 장점은 표면(77)에서 반사되는 광선들(26)이 측정을 방해하지 않는다는 것이다.

도 17a는 본 발명의 템퍼링 보디의 표면(77) - 몇 개의 모세관(30)이 그 위에 배치됨 - 을 평면도로 도시하고 있다. 도 17a 및 도 17b로부터 알 수 있는 바와 같이, 표면(77)은 길이(L) 및 폭(B)을 가지며, 여기서 표면 층은 게다가 깊이(T)를 갖는다. 바람직하게는, 길이(L)는 폭(B)보다 더 길다. 게다가, 측정을 위해 모세관들(30)이 표면(77)의 폭(B)을 따라 연장되고 모세관들이 바람직하게는, 모세관들의 양쪽 단부들이 표면(77)을 넘어 돌출하도록, 폭(B)보다 더 긴 것이 바람직하다. 접촉을 통해 모세관들(30)을 템퍼링하기 위해, 모세관들이 템퍼링 요소의 표면(77) 바로 위에 놓이며, 즉 표면(77)과 직접 접촉하는 것이 바람직하다. 추가의 바람직한 실시예에 따르면, 모세관의 일부분이 표면과 직접 접촉하지 않는 반면 모세관의 다른 영역이 표면과 접촉하도록 적어도 하나의 영역을 구성하는 것이 추가로 유리할 수 있다. 상세하게는, 이하에서 논의될 것인 바와 같이, 직접 접촉을 갖지 않는 영역이 광학 측정들에 유리하다.

바람직한 실시예에 따르면, 그루브(90)의 영역에서 모세관과 표면(77) 간의 직접 접촉이 없도록, 예를 들어, 퍼로우, 그루브, 마이크로 그루브 또는 "디치(ditch)"(90)의 형태로 리세스(90)가 표면(77)에 제공될 수 있다. 그루브(90)는 바람직하게는 측정 동안 모세관들이 놓이는 템퍼링 요소의 적어도 한 영역에 걸쳐 연장된다. 그루브(90)는 바람직하게는 각각의 모세관이 중앙 측정 영역(90)에서 표면(77)과의 직접 접촉을 갖지 않도록 템퍼링 요소의 폭에 대해 중앙 영역에 구성된다. 그렇지만, (템퍼링 요소의 폭에 대해) 상기 영역(90)의 좌우에서, 모세관(30)은 접촉 템퍼링을 확보하기 위해 표면과 직접 접촉한다.

그루브는 바람직하게는 1 내지 10 mm 사이, 보다 바람직하게는 2 내지 8 mm 사이, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 mm 사이, 예를 들어, 5 mm, 더욱 바람직하게는 (폭(B)을 따라) 대략 3 mm의 폭을 갖는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 광 반사는 바람직하게는 모세관들의 상기 그루브 부분에서 생성되거나 측정된다.

바람직하게, 그루브는 대략 10 내지 30 ㎛ 깊이이다. 후방산란에서의 간섭 효과들을 추가로 억제하기 위해, 그루브(90)가 사용된 광의 코히런스 길이의 절반보다 더 큰 깊이(도 17b에서 깊이(T)의 방향을 참조)를 갖는 것이 특히 바람직하다. 교란 간섭 효과들은, 예를 들어, 본 발명의 그루브를 사용해 억제되거나 심지어 회피될 수 있는, 뉴턴 링(Newton's ring)들로 인해 발생한다. 본 발명에 따르면, 레이저 광원 또는 LED가 광원으로서 사용될 수 있다. LED 광원들은, 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 7.5 μm 초과의 그루브의 깊이가 바람직하도록, 전형적으로 대략 15 μm의 범위에 있는 코히런스 파장들을 갖는다. 깊이가 코히런스 파장의 절반의 1.5 배 내지 코히런스 파장의 절반의 10 배 사이인 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 깊이의 상한은 코히런스 파장의 절반의 5 배이다. 상세하게는, 본 발명에 따르면, 그루브는 간섭들을 억제하기에 충분한 깊이이기만 하면 되고 그로 인해 모세관 아래에 너무 큰 에어 쿠션이 있어서는 안되는데, 그 이유는 이 경우에 모세관들에서의 원하는 온도가 에어 쿠션에 의해 방해될 수 있기 때문이다. 게다가, 그루브는, 측정 영역(그루브)에서 모세관(30)의 표면의 스크래치 및 모세관에 의한 템퍼링 보디의 표면의 스크래치가 억제 또는 회피될 수 있도록, 모세관(30)의 표면이 표면(77)과 직접 접촉하지 않는다는 추가의 바람직한 장점을 갖는다. 상세하게는, 본 발명에 따르면, 템퍼링 보디의 표면이 스크래치되는 것은 회피될 수 있는 반면, 모세관들의 가능한 스크래치는 허용가능할 수 있는데, 그 이유는 모세관들이 바람직하게는 일회용 물품으로서 사용되기 때문이다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 실리콘보다 더 낮은 경도를 갖는 재료로 된 모세관들이 사용될 수 있다.

그루브(90)의 바닥으로부터의 광의 보다 효율적인 반사를 보장하기 위해, 그루브가 바람직하게는 템퍼링 요소의 표면 내로 에칭된다. 바람직하게는, 그루브(90)가 실리콘 층에 직접 형성되도록 템퍼링 요소가 실리콘으로 이루어진 표면 층을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 그루브가 실리콘 내로 에칭된다. 게다가, 바람직한 에칭 방법은 그루브의 바닥의 표면이 상기 표면의 반사 거동이 여전히 우수하도록 매우 매끄러운 방식으로 구성된다는 장점을 갖는다. 바람직하게는, 바닥의 표면은 바람직하게는 나노미터 범위에 있는, 바람직하게 ± 10 nm 미만, 바람직하게는 ± 5 nm 미만, 예를 들어 ± 1 내지 2 nm인 평균 거칠기를 갖는다.

바람직한 실시예에 따르면, 예를 들어, 측정되어야만 하는, 표면(77) 위에 놓인 모든 모세관들(30)이 그루브 위쪽에 배치될 수 있도록 그루브(90)가 표면의 상당 부분에 걸쳐 연장될 수 있다. 도 17a에 예시된 바와 같이, 그루브(90)는, 모세관들(30)이 그루브(90) 위쪽에 횡방향으로 배치될 수 있도록, 길이(L)를 따라 연장된다(도 17b를 참조). 추가의 바람직한 실시예에 따르면, 바람직하게는 에지 영역(91)에 어떠한 그루브도 구성되지 않도록, 그루브(90)가 길이(L) 전체에 걸쳐 연장되지 않는다. 이것은, 예를 들어, 실리콘이 그루브(90) 주위에서 일정한 두께를 갖고, 따라서 보다 용이하게 가공(예를 들어, 커팅 또는 소잉)될 수 있다는 장점을 갖는다.

바람직하게는, 실리콘이 템퍼링 요소의 표면으로서 사용된다. 바람직하게는, 이하에서 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 순수 (결정질) 실리콘이 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 그루브(90)는 결정질 실리콘의 바람직한 결정학적 방향을 따라, 바람직하게는 [111] 방향(밀러(Miller)의 방향 인덱스들)을 따라 구성된다.

예를 들어, 그루브는 또한 모세관의 외부에 있는 액체가, 바람직하게는 그루브의 영역에 있는, 측정 영역에 도달하지 않는다는 장점을 갖는다. 모세관과 템퍼링 보디 사이의 거리가 그루브의 영역의 외부에서보다 그루브의 영역에서 더 크기 때문에, 모세관의 외부에 있는 액체가 모세관력들로 인해 그루브의 외부에 여전히 있는 것이 바람직하다.

따라서, 예를 들어, 모세관들이 채워질 때 때때로 액적들이 모세관의 외부에 달라붙는 일이 있을 수 있다. 상기 액적들은, 그들이 측정 영역에 도달할 때, 방해가 될 수 있다. 그렇지만, 모세관과 템퍼링 보디 사이의 거리가 짧을수록 커지는 모세관력들이 상기 액체를 그루브의 외부에 유지시킨다. 따라서, 예를 들어, 액적들의 액체가 그루브 내의 측정 영역에 도달하는 것이 회피될 수 있다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 형광도 측정 및 소산도 측정을 위한 신호들의 생성을 도시하고 있다. 도 1과 유사하게, 검사될 샘플은 모세관 내에 있다. 검사될 샘플은 산란하는/응집하는 입자들(이하에서, 샘플(12)이라고 지칭됨)은 물론 형광 입자들(이하에서, 샘플(15)이라고 지칭됨)을 함유한다. 샘플을 측정하기 위해, 바람직하게는 검출기가 모세관 위쪽에서 시프트되거나 모세관이 검출기 아래에서 시프트된다. 상기 시프팅은 바람직하게는 모세관의 길이방향 축에 대해 횡방향으로 수행된다. 대안적으로, 모세관은 물론 검출기도 시프트될 수 있다. 그렇지만, 바람직하게는 측정 동안 모세관(30)과 검출기(100) 사이의 상대 이동(80)이 일어나게 되어 있다.

형광도 측정 및 소산도 측정을 위한 조사 광선들(20, 21)이 모세관(30)에 도달하기 전에, 검출기는 형광 광(23)을 측정하지 않고(상부 행; 신호(형광도)), 소산도 측정(22)을 위한 반사 광(22)의 감쇠를 측정하지 않는다(하부 행; 신호(소산도)). 따라서, 도 3a에서의 다이어그램들에 수평 라인이 도시되어 있다.

광학 시스템의 검출 영역 아래에서의 모세관(30)의 (상대) 이동(80) 동안, 측정된 형광 강도(23)는 증가하고 모세관에서의 굴절에 의해 그리고 샘플(12)에서의 산란에 의해 반사 광선(22)의 강도는 감소한다(도 3b를 참조).

샘플을 갖는 모세관이 광학계의 검출 범위를 벗어날 때, 바람직하게는 검출 범위 내에 들어갈 때 생성되는 신호들에 대응하는 신호들이 생성된다. 이것은 광학 시스템의 대칭적 배치 또는 모세관 위쪽에서의 대칭적 이동으로 인한 것이다. 따라서, 샘플들과 광학 시스템 사이의 이동의 방향(80)은 중요하지 않다.

본 발명에 따르면, 복수의 모세관들에 있는 복수의 샘플들이 연달아 연속적으로 측정될 수 있다. 복수의 모세관들이 바람직하게는 샘플 어레이 상에 배치될 수 있다. 이는, 샘플 어레이의 바람직하게는 연속적인 이동에 의해, 높은 데이터 밀도(시간 단위당 샘플당 데이터 점들)를 갖는 복수의 샘플들이 기록될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 최대 100 kHz 초과의 측정 주파수들을 달성하는 것이 가능하다. 상기 본 발명의 방법의 추가의 장점은 시스템의 낮은 조절 노력이다. 게다가, 샘플 챔버에 대한 포맷인 모세관들(30)은 모세관력들에 의해 샘플을 모세관 내에 자동으로 채우는 것에 의해 간단한 채움을 가능하게 하며, 이는, 예를 들어, 또한 고점도 용액들을 채우는 것을 가능하게 한다. 모세관들은 바람직하게는 표면(77) 바로 위에 놓이고 양호한 열 접촉을 갖는다.

도 4a는 모세관들(30) 내의 3개의 상이한 샘플(11, 12, 13)의 단면을 도시하고 있다. 제1 샘플(11)은, 조사 광선들(20)의 대부분(22)이 대물 렌즈 및 검출기(100)의 방향으로 되반사되도록, 광원에 의해 생성 및 방출된 광(20)을 산란시키지 않는다. 다른 2개의 샘플(12, 13)은 검출기(100)의 수광각을 벗어난 상이한 방향들로 조사 광(20)의 일부분을 산란시킨다. 샘플(12)을 통하는 것보다 샘플(13)를 통해 조사 광의 더 많은 부분이 산란되고, 이는 복수의 산란 화살표들(24)로 도시되어 있다.

도 3과 관련하여 이미 기술된 바와 같이, 측정 동안 샘플들이 광학 시스템에 대해 이동되는 것이 바람직하다. 도 4b는 샘플들의 수평 위치에 따라 검출기(100)에 의해 측정된 광 강도의 전형적인 경과를 도시하고 있다(소산도 측정). 측정된 강도(밝기 [I])는 한편으로는 모세관 벽들(30)에서의 광 회절에 그리고 다른 한편으로는 샘플에서의 소산에 의존한다. 양호한 근사화에서 상이한 샘플들에 대해 모세관 벽들에서의 광 회절이 동일한 것으로 가정될 수 있다. 그렇지만, 샘플들(12 및 13)이 샘플(11)보다 조사 광(20)의 더 많은 부분을 산란시키기 때문에, 보다 적은 광(22)이 되반사된다. 따라서, 샘플들(12 및 13)에서의 밝기(강도)가 보다 많이 감소한다.

도 4c는 샘플들의 위치에 따른 소산도의 가능한 경과를 도시하고 있다. 소산도를 계산하는 수식은 일반적으로

이다.

I0(x)는 가장 간단한 경우에 상수이거나 물로 채워진 모세관에서의 강도의 경과이거나 온도 유도 응집 형성(temperature-induced formation of aggregation)으로 인해 소산이 시작되기 전에 측정이 시작될 때의 강도의 경과일 수 있다.

원하는 측정 값인 "소산도"(도 4d)는 소산 경과 E(x)의 적분으로부터 얻어진다. 적분 한계들은 각각의 모세관을 중심으로 대칭인 것이 바람직하다. 광원의 밝기 또는 검출기의 감도의 변동들의 평준화(balance)하기 위해, 검출된 소산도가 모세관이 없는 범위에서의 곡선 E(x)의 적분에 의해 계산된 기준 값(도 4c: "기준 표면"을 참조)에 의해 보정될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 모세관에 대해 개별적으로, 상기 개별적인 모세관 바로 옆에 있는 모세관이 없는 영역을 사용해 상기 보정이 수행된다. 본 발명에 따르면, 이것은, 예를 들어, 종래 기술로부터의 측정 방법들과는 달리, 샘플이 바람직하게는 측정 시스템에 대해 이동되기 때문에 가능하다.

도 5는 도 3으로부터의 측정 데이터의 가능한 처리를 높은 형광도(14), 평균 형광도(15) 및 낮은 형광도(16)를 갖는 3개의 샘플의 예를 사용하여 예시적으로 설명한다.

샘플들에 의해 방출되는 형광 광의 강도가 도 5b에서 모세관에 대한 검출기(100)의 이동 또는 위치에 따라 도시되어 있다. "형광도 값"을 결정하기 위해, 광학 시스템에 대한 샘플들의 시프팅(80)의 값에 걸쳐 형광도 값이 적분된다(도 5c를 참조). 적분 한계들은 바람직하게는 대칭적으로 하나의 개별적인 모세관을 포함한다. 적분된 형광 강도는 바람직하게는 결정될 샘플의 형광도의 측정 값에 대응한다. 2개 이상의 상이한 파장에서 형광 강도들을 측정하는 것이 또한 가능하다. 이 경우에, 적분된 형광 강도들의 비는 결정되어야 하는 측정 값인 "형광도 비"이다.

도 6은 형광도 및 소산도를 측정하기 위한 본 발명의 시스템의 예시적인 구성을 도시하고 있다. 바람직하게는, 형광도 및 소산도의 상기 측정은 연달아, 거의 동시에 또는 동시에 수행될 수 있다. (제1) 광원(40), 예를 들어, LED는 (제1) 파장(21)을 갖는 광 방사(21)를 생성하고, 광 방사(21)는 샘플 체적(10)에서의 형광 방사의 방출을 자극한다. 자극 필터(70)는 원하지 않는 파장 범위들에서의 광원(40)의 가능한 방사를 억제한다. (제2) 광원(41)은 샘플 체적(10)이 단지 조금밖에 흡수하지 않는 (제2) 파장 범위에서의 광 방사(20)를 생성한다. 양쪽 광원들(40, 41)의 광은 바람직하게는 광학 렌즈들(60, 61)에 의해 콜리메이트(collimate)되고 다이크로익 빔 스플리터(71)에 의해 공선형 광선으로 결합된다.

빔 스플리터(72)는 바람직하게는 (제1) 파장 범위(40)에서 높은 반사율을 갖는다. 게다가, 빔 스플리터(72)가 샘플의 형광 방출의 파장 범위에서 높은 투과율을 포함하는 것이 유리하다. 또한, 빔 스플리터(72)가 (제2) 광원(41)의 파장 범위에서 부분 투과율 및 부분 반사율을 포함하는 것이 추가로 바람직하다. 광원(41)의 파장이 샘플(10)의 형광 방출과 매칭할 때는 상기 요구사항들이, 예를 들어, 다이크로익 빔 스플리터(dichroic beam splitter)에 의해 충족된다. 보다 일반적인 경우에, 빔 스플리터(72)는 트리크로익 빔 스플리터(trichroic beam splitter)이다.

빔 스플리터(72)는 제1 및 제2 파장들(20, 21)의 광을 모세관(30) 내의 샘플(10) 쪽으로 반사시킨다. 대물 렌즈(62)는 조사 광을 샘플(10)에 집속시킨다. 제1 광원(40)의 광은 샘플(10)에서 형광 방사를 생성하고 이 형광 방사는 렌즈(62)에 의해 콜리메이트된다. 제2 광원(41)에 의해 생성되는 조사 빔에서의 광은 샘플(10) 및 모세관(30)을 통해 표면(77)에 도착하고, 반사 또는 되반사되며 샘플(10) 및 모세관(30)을 재차 통과한다.

표면(77)은 바람직하게는 소산도를 측정하기 위해 제2 광원(41)의 파장 범위에서 그 자체적으로 형광을 거의 갖지 않고 높은 반사율을 갖는 재료로 이루어진다. 반사 방사는 렌즈(62)에 의해 또다시 콜리메이트된다. 샘플 체적 내에 어쩌면 존재하는 입자들이 조사 광을 산란시키고, 따라서 원래 조사된 광의 보다 작은 부분만이 대물 렌즈(62)에 의해 흡수된다. 따라서, 렌즈(62) 쪽으로 되반사되는 광의 강도는 입자들의 농도 및 치수 그리고 따라서 샘플의 소산도에 실질적으로 의존한다.

필터(73)는 바람직하게는 (제1) 광원(40)의 형광 여기 광을 억제한다. 검출기(53)는, 바람직하게는 파장 선택적 방식으로, 샘플로부터 나오는 광선의 강도를 측정한다. 바람직하게는, 제2 파장의 광, 즉 샘플을 통과하여 되반사되는 광은 물론, 형광 광, 즉 샘플의 형광 방출의 광이 검출기(53)에 의해 측정된다. 게다가, 파장 선택적이란 상이한 파장들에서의 강도들이 바람직하게는 서로 개별적으로 결정될 수 있다는 것을 의미한다.

도 7a는 형광 측정 동안의 광선들의 경로가 그려져 있는 본 발명의 시스템의 추가의 실시예를 도시하고 있다. 그렇지만, 도 6과는 달리, 이 시스템은 (적어도) 2개의 검출기를 갖는다. 양쪽 검출기들(50, 51)은 2개의 상이한 파장에서 형광 강도를 측정하는 역할을 한다. 예를 들어, 330 nm 및 350 nm가 검출된 파장들로서 선택되는 경우, 양쪽 신호들의 비는 샘플 체적(10)에 존재하는 거대분자들의 구조에 관한 정보를 제공한다.

상기 실시예에서, 소산도 측정을 위한 (제2) 광원(41)의 파장은 샘플(10)의 형광 방출의 범위 내에 있다. 따라서, 형광도의 측정 동안, 광원(41)은 스위치 오프되어야만 한다. 소산도와 형광도를 빠르게 교대로 측정하는 것으로 인해 순차적 또는 거의 동시 측정이 이루어진다. 측정 유형의 2개의 데이터 점 사이에서 경과하는 시간은, 2개의 측정된 값 사이의 차이가 측정된 값의 측정 불확도(measurement uncertainty)보다 낮도록, 짧아야만 한다. 예: 고농축 샘플의 소산도가 80℃ 초과의 온도들에서 대략 0.2mAU/s(밀리 흡광도 단위/초)로 변한다. 소산도에 대한 측정 불확도는, 예를 들어, 약 0.2mAU이다. 그에 대응하여, 소산도가 바람직하게는 초당 한 번 이상 측정되고, 형광도가 또한 초당 한 번 이상 측정된다. 상기 실시예에서, 대역 통과(73)는, 예를 들어, 320 nm 내지 360 nm의 범위에 있는 형광 방사(23)의 일부를 투과시킨다. 빔 스플리터(74)는 형광 방사를, 예를 들어, 320 nm 내지 340 nm 및 340 nm 내지 360 nm의 파장 범위들을 갖는 2개의 광선으로 분리시킨다. 광선들은 집광기 렌즈들(63, 64)에 의해 양쪽 검출기들(50, 51) 상에 번들링된다. 양쪽 측정 신호들의 비가 결정될 측정 값이다.

도 7b는 도 7a의 시스템의 예시적인 실시예를 도시하지만, 소산도 측정 동안의 광선들의 경로가 그려져 있다. 제2 광원(41)은 광 방사(20)를 방출하고, 이 광 방사(20)는 베이스 플레이트(77)에서의 반사 이후에 샘플(10)을 두 번 통과하고 광선(22)으로서 위쪽으로 이어진다. 샘플(10)에서, 광선의 강도는 검출 범위 밖으로의 산란에 의해 감쇠된다. (제2) 광원(41)의 파장은 바람직하게는 필터(73)의 투과 범위 내에 있다. 광원(41)의 파장에 따라, 광이 이어서 양쪽 검출기들(50, 51)에 분배된다. 바람직하게는, 파장이 대략 350 nm이고, 따라서 광의 대부분이 하나의 단일 검출기에 의해 측정된다.

도 8a는, 도 7에서의 실시예와 비교하여, 부가의 검출 브랜치에 의해 확장된 도 6의 시스템의 예시적인 실시예를 도시하고 있다. 도 7a에서의 광선들의 경로에 대응하는, 형광에 대한 광선들의 경로가 그려져 있다. 부가의 다이크로익 빔 스플리터(75)는 검출기들(50, 51)에 의해 측정되는 파장 범위에서 투명하다.

도 8b는 도 8a의 시스템을 도시하지만, 소산도 측정을 위한 광선들의 경로가 그려져 있다. 도 7의 시스템과 비교하여, 광원(41)의 파장 범위는 검출기들(50, 51)에 의해 측정되는 파장 범위 밖에 있으며, 예를 들어, 380nm이다. 따라서, 광원(41)은 측정 동안 스위치 온될 수 있고, 측정 유형들인 형광도와 소산도 사이에서 스위칭될 필요가 없다. 빔 스플리터(72)는 광원(41)의 파장 범위에서 부분적으로 투명하다. 이상적으로는, 투과/반사 비가 1:1이다.

빔 스플리터(75)는 (제2) 광원(41)으로부터의 광을, 샘플(10)에서의 소산에 의해 감쇠된 후에, 검출기(52)로 지향시킨다. 대역 통과(76)는 바람직하게는 검출기(52) 쪽으로의 형광 광의 비율을 감소시킨다.

3개의 검출기(51, 52, 53)를 갖는 상기 실시예로 인해, 소산도 및 형광도 비가 연속적으로 그리고 동시에 측정될 수 있다. 게다가, 검출기(52)의 감도가 광원(41)으로부터의 방사의 강도에 맞춰 개별적으로 적합화될 수 있다. 검출기의 감도가, 예를 들어, 소산도의 잡음 감소된 측정을 위해 상당히 더 높게 조절될 수 있다. 유리한 실시예에서, 검출기들의 신호들은, 예를 들어, 4kHz의 속도로 3개의 검출기 채널 전부를 동시에 판독할 수 있는 24 비트 아날로그 디지털 변환기(ADC)에 의해 디지털화된다.

도 9는 실리콘에 대한 파장에 따른 반사율이 도시되어 있는 다이어그램이다. 상세하게는, 도 9는 UV 범위에서의 실리콘의 양호한 반사율 - 이는, 소산도 측정 동안 검출기 쪽으로 반사되는 광 강도가 가능한 한 높도록, 특히 바람직함 - 을 도시하고 있다. 상세하게는, 높은 광 강도는 적은 잡음을 갖는 측정을 가능하게 한다. 실리콘의 추가의 유리한 특성들은 사용된 파장들에서 그 자체로 거의 형광을 갖지 않는다는 것, 기계로 용이하게 제조될 수 있다는 것 및 높은 내화학성을 갖는다는 것이다.

도 10은 도 6에 기술된 본 발명의 시스템을 사용한 측정을 예시적으로 도시하고 있다. 단백질들의 온도 의존적 언폴딩은 물론 항체의 온도 의존적 응집도가 도시되어 있다. 도시된 예에서, 항체의 서브단위(sub-unit)들 중 하나의 서브단위의 언폴딩은 60℃에서 이미 시작되며, 이는 350 nm에서의 방출과 330 nm에서의 방출 사이의 형광도 비의 특성 변화에 의해 특징지워진다. 응집도 그리고 따라서 소산도의 증가는 73℃ 이후로부터만 계속 관찰되며, 이는 열적으로 보다 불안정한 단백질 도메인의 언폴딩이 항체의 응집도에 기여하지 않는다는 것을 암시한다.

도 11은 pH4 내지 pH6 사이의 상이한 pH 값들에서 25 mM 아세테이트 완충액 중의 1 mg/ml의 물질 농도를 갖는 항체(리툭시맵)의 소산도의 측정을 예시적으로 도시하고 있다. 각각의 모세관 내의 10 μl의 용액이 1℃/min의 가열 속도로 50℃로부터 95℃까지 가열되었다. 72℃ 초과의 상승된 온도들에서 소산도의 증가가 관찰될 수 있는데, 이는 응집에 의해 설명될 수 있다. 소산도 증가의 정도는 용액의 pH 값에 의존하며, 여기서 보다 낮은 pH 값들은 온도 유도 응집을 저지시킨다. 이것은 한편으로는 소산도 증가의 늦은 시작("응집-개시 온도")에 의해 그리고 다른 한편으로는 보다 낮은 총 최대 소산도에 의해 특징지워진다.

도 12는 상이한 구아니딘-하이드로클로라이드 농도들에서 10 mM 시트르산염 완충액 pH4에서의 단백질 리소자임의 화학적 안정성의 분석을 예시적으로 도시하고 있다. 구아니딘-클로라이드 농도를 증가시키면서 48개의 용액에 1mg/ml의 리소자임이 제조되었고 10 μl의 각각의 용액이 모세관들에 채워졌으며, 상기 모세관들은 모세관 어레이 상에 배치되어 고정되었고 이어서 각각의 모세관이 20℃, 30℃ 및 40℃에서 스캔되었다. 이어서, 획득된 형광도 비들이 증가하는 구아니딘 농도들과 관련하여 설정된다. 상세하게는, 형광도 비는 모든 샘플들에서 구아니딘 농도가 증가할 때 시그모이달 증가(sigmoidal increase)를 보여주며, 이는 언폴딩된 단백질의 비율에 정비례한다. 온도가 상승할 때, 단백질은 점점 더 불안정화되고, 이는 데이터 점들이 보다 낮은 구아니딘 농도들로 시프팅하는 것에 의해 특징지워진다.

도 13은 50 mg/ml 내지 7 μg/ml의 상이한 물질 농도들에서 PBS, pH 7.3에서의 단백질 스트렙타비딘의 예시적인 측정을 도시하고 있다. 모세관 스캔은 모세관들에서의 상이한 형광 강도들을 예시하고 있다. 상부 다이어그램은 열적 언폴딩의 측정의 시작에서의 모세관 스캔을 도시하고 있다. 모든 농도들이 이중으로(as duplicates) 측정된다. 피크들의 높이는 350 nm의 방출 파장에서 모세관들 내에서의 형광 강도에 대응한다. 높은 스트렙타비딘 농도에서의 형광도의 감소는, 여기 광의 강한 흡수 및 그로 인한 감소된 침투 깊이(따라서 보다 낮은 형광도)에 의해 야기되는, 내부 필터 효과에 의해 설명될 수 있다. 하부 다이어그램은 350nm와 330nm에서의 온도에 따른 형광도 비의 경과를 도시하고 있다. 상기 언폴딩 곡선들은 모든 농도들에 대한 언폴딩 프로파일들이 기록되었다는 것을 보여준다. 모든 농도들에서 명확한 언폴딩 프로세스가 인식될 수 있다. 용융 전이(melting transition)는 높은 스트렙타비딘 농도들에서 보다 높은 온도들로 시프트되며, 이는 단백질의 분자내 안정화에 기인한다.

도 14는 단백질 MEK1-키나아제에 대한 강제 분해 시험의 예시적인 데이터를 도시하고 있다. 50 mM 헤페스 pH 7.4, 150 mM NaCl 및 2 mM DTT 중에서 1 mg/ml의 농도를 갖는 용액이 제조되고 50 μl씩 5개의 분액(aliquot)으로 나누었다. 하나의 분액은 4℃에서 보관되고 기준으로서 역할한 반면, 나머지 분액들은 상이한 조건들 - 상승된 온도에서의 배양, 냉동-해동 사이클들, 강한 교반 - 에 노출되었다. 이어서, 모든 샘플들이 모세관 내에 채워지고 모세관 어레이 상에 위치되어 압착되며, 25℃로부터 90℃까지 1℃/min의 가열 속도로 열적 언폴딩이 형광도를 통해 검출되었다. 상부 다이어그램은 샘플들의 언폴딩 곡선들을 도시하고 있다. 이전의 처리(treatment)에 따라, 언폴딩 곡선들의 시작 레벨들이 상이하며, 이는 이미 언폴딩된 단백질의 상이한 비율들을 암시한다. 하부 다이어그램은 언폴딩된 단백질의 비율을 % 단위로 정량화한 것을 도시하고 있으며, 여기서 4℃ 배양의 샘플은 0%로서 언폴딩되고 60℃에서 15분 배양 이후의 샘플은 기준으로서 사용되었다.

도 15는 항체들의 보관을 위한 최적의 조건들을 식별하기 위한 완충액 스크리닝의 예시적인 데이터를 도시하고 있다. 모노클로날 항체(monoclonal antibody)가 상이한 pH 값들을 갖는 그리고 130 mM NaCl의 부존재 및 존재 시의 아세테이트 완충액 중에서 5 mg/ml의 농도로 보관되었다. 10 μl의 각각의 항체 용액이 이어서 유리 모세관들 내에 채워졌고 단백질들의 온도 의존적 언폴딩이 형광도의 변화를 통해 측정되었으며 온도 의존적 응집도가 1℃/min의 가열 속도로 소산도의 증가를 통해 측정되었다. 도 15a 및 도 15b는 응집도의 온도 의존적 증가를 도시하고 있다. 도시된 경우에서, 총 응집도는 pH 값이 증가함에 따라 증가하며, 이는 응집도 신호에서의 보다 큰 진폭들에 의해 특징지워진다. 생리식염 농도들의 첨가는 모든 pH 값들에서 응집도의 추가의 증가를 가져온다(도 15b). 도 15c 및 도 15d는, 베이스 라인(base line)과 관련하여 소산도의 상당한 증가가 관찰되는 가장 낮은 온도에 대응하는, 응집-개시 온도의 결정을 예시적으로 도시하고 있다. 도 15d는 pH 값 및 염 농도에 대한 응집 온도의 상이한 의존성을 예시적으로 도시하고 있다. 도 15e 및 도 15f는, 본 발명에 따라, 도 15a 및 도 15b에 도시된 응집도 데이터와 동시에 기록되는 형광도 데이터를 도시하고 있다. 용액의 pH 값이 증가함에 따라, 항체는 보다 높은 열적 안정성을 나타낸다. 게다가, NaCl은 열적 안정성에 부정적인 영향들을 미치며, 이는 보다 낮은 온도들에서의 단백질의 언폴딩에 의해 인식될 수 있다. 비슷한 실험들에 의해, 단백질, 예를 들어, 항체의 열적 안정성이 최대이고 응집도가 최소인 조건들이 검출될 수 있다.

도 16은 단백질의 예시적인 흡광 스펙트럼을 도시하고 있다.

본 발명은 또한 표현들, 특징들, 수치 값들 또는 범위들이 이상에서 또는 이하에서 "대략, 약, 실질적으로, 개괄적으로, 적어도" 등과 같은 용어들과 함께 언급될 때 정확한(accurate) 또는 정확한(exact) 표현들, 특징들, 수치 값들 또는 범위들 등을 포함한다(즉, "대략 3은 "3"을 또한 포함해야 하거나 "실질적으로 방사상"은 "방사상"을 또한 포함해야 한다).

10: 샘플
11: 산란하는/응집하는 입자를 갖지 않는 샘플
12: 얼마간의 산란하는/응집하는 입자들을 갖는 샘플
13: 강하게 산란하는/응집하는 입자들을 갖는 샘플
14: 많은 형광 입자들을 갖는 샘플
15: 얼마간의 형광 입자들을 갖는 샘플
16: 적은 형광 입자들을 갖는 샘플
20: 소산도 측정을 위한 조사 광
21: 형광도를 위한 여기 광
22: 반사 광
23: 방출 광 형광
24: 특정 산란각 Q에서의 산란 광
25: "원하지 않는" 산란 광
26: "원하지 않는" 반사 산란 광
30: 모세관
40: 형광 여기를 위한 광원
41: 소산을 위한 광원
50: 검출기 1(형광도 및 소산도)
51: 검출기 2(형광도 및 소산도)
52: 검출기 3(소산도)
53: 검출 시스템
60: 40에 대한 콜리메이터 렌즈
61: 41에 대한 콜리메이터 렌즈
62: 대물 렌즈
63: 50에 대한 집광기 렌즈
64: 51에 대한 집광기 렌즈
65: 52에 대한 집광기 렌즈
70: 40에 대한 여기 필터
71: 40+41의 조합에 대한 빔 스플리터
72: 여기와 형광을 분리시키기 위한 빔 스플리터
73: 형광 방출 필터
74: 형광을 분리시키기 위한 빔 스플리터
75: 형광과 소산을 분리시키기 위한 빔 스플리터
76: 소산 필터
77: 반사하는 비-형광 표면, 예를 들어, 실리콘 표면
80: 모세관 어레이의 이동 방향들
90: 그루브, 퍼로우, 디치, 리세스
91: 에지 영역
100: 검출을 위한 본 발명의 대안
200: 종래 기술에 따른 산란 광에 대한 검출 광학계

Claims (32)

1. 샘플 용기(30)에 있는 액체 샘플(10) 내의 입자들의 적어도 안정성 및 응집도를 광학적으로 측정하는 방법으로서,
   템퍼링 요소(77)와의 접촉에 의해 템퍼링되는 샘플 용기(30)를 상기 템퍼링 요소(77) 상에 놓는 단계;
   상기 입자들을 형광적으로 여기시키기 위해 적어도 하나의 제1 파장의 광(21)을 사용해 상기 샘플(10)을 조사하는 단계;
   상기 입자들의 산란도(scattering)를 검사하기 위해 적어도 하나의 제2 파장의 광(20)을 사용해 상기 샘플(10)을 조사하는 단계;
   상기 샘플(10)에 의해 방출된 형광 광을 측정하는 단계; 및
   상기 제2 파장의 소산 광(22)을 측정하는 단계 - 상기 제2 파장의 조사된 상기 광(20)은 상기 샘플 용기(30)를 통과하고, 상기 템퍼링 요소에 의해 되반사되며, 반대 방향으로 상기 샘플 용기를 또다시 통과하고, 소산 광으로서 출사함 -
   를 포함하고,
   상기 안정성은 상기 측정된 형광 광에 기초하여 측정되고 상기 응집도는 상기 측정된 소산 광에 기초하여 측정되는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 형광 광 및 상기 소산 광이 공통 광학 시스템을 사용해 측정되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 상기 조사는
   i) 상기 제1 및 제2 파장들을 사용해 동시에 수행되지 않거나; 또는
   ii) 상기 제2 파장을 사용한 상기 조사는 연속적으로 수행되는 반면, 상기 제1 파장을 사용한 상기 조사는 간헐적으로 수행되는, 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광 광 및 상기 소산 광이 동시에 측정되는, 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   i) 상기 소산 광 및 상기 형광 광이 공통 검출기(53)에 의해 측정되거나;
   ii) 상기 소산 광은 제1 검출기(50) 및/또는 제2 검출기(51)에 의해 측정되며, 제1 형광 파장의 형광 광은 상기 제1 검출기(50)에 의해 측정되고 제2 형광 파장의 형광 광은 상기 제2 검출기(51)에 의해 측정되거나; 또는
   iii) 상기 소산 광은 제1 검출기(52)에 의해 측정되며, 제1 형광 파장의 형광 광은 제2 검출기(51)에 의해 측정되고 제2 형광 파장의 형광 광은 제3 검출기(50)에 의해 측정되는, 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플 용기(30)는 모세관(30)인, 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 제1 파장을 사용한 상기 조사는 주기적으로 수행되는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 템퍼링 요소(77)는
   i) 1% 미만의 적은 자가형광을 갖고/갖거나,
   ii) 상기 제2 파장의 파장 범위에서 30% 초과의 반사율을 가지는
   재료로 이루어져 있는, 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 템퍼링 요소의 표면에 적어도 하나의 그루브(90)가 구성되고, 상기 샘플 용기는 상기 그루브 위쪽에 배치되며, 상기 제2 파장의 상기 조사된 광(20)은 상기 그루브(90)의 바닥으로부터 되반사되는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 그루브(90)는 1 내지 10 mm 사이의 폭 및 상기 제2 파장의 상기 광의 코히런스 길이(coherence length)의 절반보다 더 큰 깊이를 갖는, 방법.
11. 제5항에 있어서, 상기 샘플 용기(30)는 측정 기간 동안 상기 제1 및/또는 제2 파장의 상기 조사된 광에 대해 그리고/또는 상기 검출기에 대해 시프트되는, 방법.
12. 제11항에 있어서,
    i) 형광도 값은 상기 시프트를 통해 상기 형광 광의 강도를 적분하는 것에 의해 결정되고/되거나
    ii) 소산도 값은 상기 시프트를 통해 상기 소산 광의 강도를 적분하는 것에 의해 결정되는, 방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 측정 기간 동안
    i) 열적 안정성을 결정하기 위해, 상기 샘플들의 온도가 변화되고;
    ii) 화학적 안정성을 결정하기 위해, 상이한 액체 샘플들 중의 변성제들의 농도가 상이하게 선택되고/되거나;
    iii) 시간에 따른 안정성을 결정하기 위해, 상기 샘플이 1 시간 초과의 기간을 거쳐 실질적으로 일정한 온도에 유지되는, 방법.
14. 제11항에 있어서, 측정 기간 동안 복수의 샘플 용기들 및/또는 상기 광학 시스템이 연속적으로 여러 번 앞뒤로 구동되고, 상기 형광 광 및/또는 상기 소산 광의 상기 측정들이 상기 이동 동안 수행되는, 방법.
15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 파장의 상기 광(20)은 1%, 0.1%, 0.05% 미만이 상기 샘플 또는 상기 샘플 내의 상기 입자들에 의해 흡수되도록 선택되는, 방법.
16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 파장의 상기 광과 상기 제2 파장의 상기 광은 상기 샘플 용기 내로 조사되는 공선형 광선(collinear ray)으로 결합되는, 방법.
17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 되반사되어 상기 조사 방향과 반대 방향으로 상기 샘플 용기를 빠져나가는 상기 제2 파장의 상기 소산 광은 상기 조사 방향으로부터 최대 5°벗어나는, 방법.
18. 제1항의 방법에 따라, 샘플 용기(30)에 위치되는 액체 샘플(10) 내의 입자들의 안정성 및 응집도의 광학 측정을 위한 장치로서,
    검사될 상기 입자들을 형광적으로 여기시키기 위해 제1 파장의 광을 상기 샘플 용기 내로 조사하기 위한 제1 광원(40),
    상기 입자들의 산란도를 측정하기 위해 제2 파장의 광을 상기 샘플 용기 내로 조사하기 위한 제2 광원(41),
    상기 샘플로부터 방사되는 여기된 형광 광을 측정하기 위한 제1 검출기,
    상기 제2 파장의 소산 광(22)을 측정하기 위한 제2 검출기 - 상기 제2 파장의 조사된 상기 광(20)은 상기 샘플 용기(30)를 통과하고, 되반사되며, 반대 방향으로 상기 샘플 용기를 또다시 통과하고, 소산 광으로서 출사함 -, 및
    상기 측정된 형광 광에 기초하여 상기 입자들의 상기 안정성을 결정하고 상기 측정된 소산 광에 기초하여 상기 입자들의 상기 응집도를 결정하는 평가 수단
    을 포함하는, 장치.
19. 제18항에 있어서, 상기 제2 파장의 상기 조사된 광이 되반사되는 반사 표면을 갖는 템퍼링 요소를 포함하는, 장치.
20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 샘플 용기(30)는 모세관(30)인, 장치.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 반사 표면은 실리콘으로 이루어져 있는, 장치.
22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 적어도 하나의 그루브(90)가 상기 템퍼링 요소의 상기 표면에 구성되고, 상기 샘플 용기는 상기 그루브 위쪽에 배치되며, 상기 제2 파장의 상기 조사된 광(20)은 상기 그루브(90)의 바닥으로부터 되반사되는, 장치.
23. 제22항에 있어서, 상기 그루브(90)는 1 내지 10 mm 사이의 폭 및 상기 제2 파장의 상기 광의 코히런스 길이의 절반보다 더 큰 깊이를 갖는, 장치.
24. 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 수행하기 위해 사용되는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 장치.
25. 제8항에 있어서, 상기 템퍼링 요소는 실리콘을 포함하거나 순수 실리콘으로 이루어지는, 방법.
26. 제11항에 있어서, 상기 샘플 용기는 여러 번 앞뒤로 구동되는, 방법.
27. 제11항에 있어서, 복수의 샘플 용기들 또는 복수의 모세관들(30)은 상기 제1 및/또는 제2 파장의 상기 조사된 광에 대해 그리고/또는 상기 검출기에 대해 시프트함으로써 스캔되는, 방법.
28. 제13항에 있어서, 상기 샘플의 온도는 상승되는, 방법.
29. 제17항에 있어서, 상기 되반사되는 광은 상기 조사 방향으로부터 2°미만 벗어나는, 방법.
30. 제17항에 있어서, 상기 되반사되는 광은 상기 조사 방향으로부터 1°미만 벗어나는, 방법.
31. 제19항에 있어서, 상기 장치는 측정 목적을 위해 적어도 하나의 샘플 용기(30)를 상기 표면 상에 배치하도록 구성된, 장치.
32. 제21항에 있어서, 상기 반사 표면은 결정질 실리콘으로 이루어져 있는, 장치.

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