JPH0792076A - 粒子解析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被検粒子の自家蛍光を測定し、精度の良い詳
細な解析を行う。 【構成】 フローセル１の中心にはフロー部２が形成さ
れ、被検粒子Ｓは上から下に流れる。フローセル１の側
方には、第１の光ビームB1を発生する第１の光ビーム発
生光源３が配置され、フローセル１の出射方向には第１
の光検出器８が配置されている。この下方には、第１の
検出器８で得られた被検粒子の検出後に所定の遅延時間
を経て光ビームB2を発生する第２の光ビーム発生光源９
が配置され、フローセルの出射方向には第２の光検出器
１３が配置されている。第２の光ビームB2はパルス状と
し、第２の光検出器１３は被検粒子から発生する散乱
光、自家蛍光のうち、自家蛍光のみを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えばフローサイトメ
ータのように、サンプル中の個々の被検粒子に光ビーム
を照射し、光学的測定によって被検粒子の解析を行う粒
子解析装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フローサイトメータとは、高速で流れる
細胞浮遊液、即ちサンプル液に例えばレーザー光を照射
し、その散乱光・蛍光による光電信号を検出し、細胞の
性質・構造を解明する装置であり、細胞化学、免疫学、
血液学、腫瘍学、遺伝学等の分野で使用されている。

【０００３】このフローサイトメータ等に用いられる従
来の粒子解析装置では、フローセルの中央部の例えば２
００μｍ×２００μｍの微小な四角形断面を有する流通
部内を、シース液に包まれて通過する血球細胞等の被検
粒子にレーザー光などの照射光を照射し、その結果とし
て生ずる前方及び側方散乱光により、被検粒子の形状・
大きさ・屈折率などの粒子的性質を得ることが可能であ
る。また、蛍光剤により染色され得る被検粒子に対して
は、照射光とほぼ直角方向の側方散乱光から被検粒子の
蛍光を検出することにより、被検粒子を解析するための
重要な情報を集めることができる。

【０００４】そして、光源としては一般的に光量及び波
長の安定性の高いアルゴンレーザー等のガスレーザー光
源が使用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような粒子解析装
置では、被検粒子から発生する自家蛍光をノイズとして
捨てるか、又は解析に使用するとしても自家蛍光を発生
するかしないかを検出するに留まっていた。後者の場合
に、蛍光剤を用いて解析する場合と比較して、染色等の
前処理が不要という利点があるものの、被検粒子の体
積、形状などによって自家蛍光量が異なり、精度の良い
解析ができない。

【０００６】また、連続照射光源の代りにパルス光を周
期的に連続照射して、蛍光剤からの蛍光の時間変化を測
定する方法も考えられているが、自家蛍光は塵埃などか
らも発生するため、この方法では精度の良い解析を行う
ことが困難である。

【０００７】本発明の目的は、上述の問題を解消し、被
検粒子から発生する自家蛍光の時間変化を検出すること
によって、従来よりも詳細で高精度の自家蛍光解析がで
きる粒子解析装置を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めの本発明に係る粒子解析装置は、分離されて１個ずつ
順次に流れる被検粒子の通過を検出する第１の検出手段
と、該第１の検出手段の位置よりも下流位置で前記第１
の検出手段からの出力を基に被検粒子の通過に合わせて
被検粒子を照射するためのパルス状の光ビームを発生す
る光ビーム発生手段と、前記パルス状の光ビームの照射
により被検粒子から発生する蛍光光量を検出する第２の
検出手段と、前記蛍光光量を時間の関数として記録する
記録手段とを有することを特徴とする。

【０００９】

【作用】上述の構成を有する粒子解析装置は、複雑な前
処理を必要とせず、被検粒子から発生する自家蛍光の時
間変化を検出でき、被検粒子のより詳細で精度の良い解
析が可能となる。更には、自家蛍光に限らず、通常の蛍
光の測定についても蛍光量の時間変化を精度良く検出で
き、従来よりも詳細な解析が可能となる。

【００１０】

【実施例】以下に、本発明を図示の実施例を基に詳細に
説明する。図１は実施例の構成図であり、１はフローセ
ルであって、その中心にはフロー部２が形成され、被検
粒子Ｓは上から下にシースフロー方式によってシース流
で包まれて流れている。フローセル１の側方には、実質
的に連続光である第１の光ビームB1を発生する第１の光
ビーム発生光源３が配置され、この第１の光ビーム発生
光源３とフローセル１を結ぶ光路01には結像レンズ４が
設けられ、光路01の延長線のフローセル１の反対側には
ストッパ５、集光レンズ６、バンドパスフィルタ７、散
乱光を検出する第１の光検出器８が順次に配置されてい
る。これらの光ビーム発生光源３〜第１の光検出器８は
被検粒子の通過を検出する第１の検出手段を構成してい
る。

【００１１】第１の光検出手段の下方には、パルス状の
第２の光ビームB2を発生する第２の光ビーム発生光源９
が配置され、この光ビーム発生光源９とフローセル１を
結ぶ光路02には結像レンズ１０が設けられ、光路02の延
長線のフローセル１の反対側には集光レンズ１１、バン
ドパスフィルタ１２、被検粒子から発生する自家蛍光の
光量を検出する第２の光検出器１３が順次に配置され、
第２の検出手段が構成されている。

【００１２】また、第１の光検出器８の出力は信号処理
部１４に接続され、この信号処理部１４の出力は光ビー
ム発生光源９、第２の光検出器１３に接続されている。
更に、第２の光検出器１３の出力は記録部１５を経て解
析部１６に接続されている。

【００１３】被検粒子Ｓとして、実施例ではヒトの肺組
織の単離浮遊細胞が用いられている。第１の光ビーム発
生光源３としては波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー
光源を用い、この第１の光ビーム発生光源３から発生す
る第１の光ビームB1は結像レンズ４でフローセル１の中
心に集光される。このフローセル１のフロー部２を流れ
る被検粒子Ｓによる前方散乱光は、集光レンズ６、バン
ドパスフィルタ７を経て第１の光検出器８に入射して電
気信号に変換され、信号処理部１４に送られる。ストッ
パ５は直進する第１の光ビームB1を遮断するものであ
り、バンドパスフィルタ７は６３３ｎｍ以外の波長の外
光を第１の光検出器８に入射させないためのものであ
る。

【００１４】信号処理部１４では、被検粒子Ｓからの散
乱光か或いは塵埃などからの散乱光かであるかを、送ら
れてきた電気信号のレベルに応じて判断し、被検粒子Ｓ
からの散乱光が或る大きさのレベルの電気信号の場合に
は、被検粒子Ｓが光ビームB2が照射される位置に到達す
る所定の遅延時間後に光ビーム発生光源９をオンにし、
１パルスの光ビームB2を発生させる。

【００１５】この遅延時間は第１の光ビームB1の照射位
置と下流にあるパルス状の光ビームB2の照射位置との距
離と、フロー部２を流れる被検粒子Ｓの速度が分かれば
容易に求められる。更に、信号処理部１４は１パルスの
光ビームB2の照射後に第２の光検出器１３をオンにす
る。

【００１６】実施例では光ビーム発生光源９として、波
長５３０ｎｍ、パルス時間１００ｐＳに調整したダイレ
ーザーを用いている。光ビーム発生光源９から発生する
光ビームB2は結像レンズ１０でフローセル１の中心に集
光され、被検粒子Ｓは励起されて自家蛍光が発生する。
この自家蛍光は集光レンズ１１、バンドパスフィルタ１
２を経て、自家蛍光の光量を検出する第２の光検出器１
３へ入射し電気信号に変換され、その電気信号つまり自
家蛍光の光量は記録部１５で時間の関数として記録さ
れ、解析部１６に送られる。

【００１７】第２の光検出器１３として、実施例ではス
トリークカメラと一次元ＣＣＤの組み合わせが用いられ
ている。ストリークカメラは入射光により発生する電子
を電気的に高速で曲げることにより、入射光量の高速な
時間変化を空間的に記録することを可能にするものであ
る。このストリークカメラは二次元検出器と共に用いる
ことが多いが、この実施例では一次元のＣＣＤで十分で
あり、例えば５１２×５１２ピクセルの二次元ＣＣＤを
用いる場合と比較して、５１２ピクセルの一次元ＣＣＤ
を用いるとメモリー容量が５１２分の１で済み、そのた
め高速で解析ができるので粒子解析には好都合である。

【００１８】また、第２の光ビームB2をパルス状にする
理由は、被検粒子Ｓからの自家蛍光が発生するまでの極
く短い時間だけ光ビームB2を照射し、第２の光検出器１
３への光ビームB2からの散乱光などの混入を防ぎ、自家
蛍光のみを検出することができるようにするためであ
る。ここでは１００ｐＳのパルス時間としたが、通常で
は５００ｐＳでも十分である。

【００１９】図２、図３は第２の光検出器１３から記録
部１５に送られる電気信号の例を示し、それぞれ正常肺
組織細胞、腫瘍肺組織細胞からのものであり、横軸は時
間、縦軸は電圧に比例する自家蛍光量を任意単位で表し
たものである。図中に矢印で示した自家蛍光量の立ち下
がり部の時間が、図２の正常細胞では長く、図３の腫瘍
細胞では短く現われる。

【００２０】このような自家蛍光量が時間の関数である
性質を利用し、解析部１６では個々の被検粒子が正常細
胞か腫瘍細胞かを判別することができる。それは、例え
ば自家蛍光量のピーク値が２分の１になる時間を求め、
その時間が設定値よりも長ければ正常細胞、短ければ腫
瘍細胞であると判断する方法でもよい。このような時間
で判定することにより、自家蛍光量の違いで判定しよう
とする際に問題となる個々の細胞の体積や形状の違いに
よる大きな誤差を除くことができる。

【００２１】また、実施例では第１の光ビーム発生光源
３、第１の光検出器８などで被検粒子Ｓの通過を検出す
る第１の光検出手段を構成しているが、この検出は一般
に良く知られている被検粒子が細孔を通過する時の電気
抵抗変化を検出する方法でもよい。

【００２２】更に、実施例では第１の光検出手段で被検
粒子Ｓから発生する前方散乱光を用いて被検粒子Ｓの検
出を行っているが、この前方散乱光或いは側方散乱光又
は被検粒子と結合した蛍光剤からの蛍光をも被検粒子Ｓ
の解析に用いれば、解析のパラメータが増加し更に詳細
な被検粒子Ｓに対する解析を行うことができる。

【００２３】また、被検粒子Ｓから発生する自家蛍光の
光量を検出する第２の光検出器１３で、自家蛍光の代り
に蛍光剤からの蛍光の光量を検出して、その時間の関数
を被検粒子Ｓの解析に用いることもできる。この場合に
は、被検粒子Ｓの通過を検知して測定を行うので、被検
粒子Ｓのみからの蛍光を精度良く測定できる。

【００２４】

【発明の効果】以上説明したように本発明に係る粒子解
析装置は、個々の被検粒子の通過を検出する第１の検出
手段、自家蛍光励起用のパルス状の光ビームを発生する
光ビーム発生手段、自家蛍光量を検出する第２の検出手
段、そして自家蛍光量を時間の関数として記録する記録
手段を備え、個々の被検粒子から発生する自家蛍光量の
時間変化を精度良く検出することができ、複雑な前処理
を必要とせず短時間のうちに大量の細胞などの被検粒子
の自家蛍光に基づく詳細な解析を行うことができる。更
には、自家蛍光に限らず、通常の蛍光の測定についても
蛍光量の時間変化を精度良く検出でき、従来よりも詳細
な解析が可能となる効果もある。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例の構成図である。

【図２】正常細胞からの信号例のグラフ図である。

【図３】腫瘍細胞からの信号例のグラフ図である。

【符号の説明】

１ フローセル ２ フロー部 ３ 第１の光ビーム発生光源 ８ 第１の光検出器 ９ 第２の光ビーム発生光源 １３ 第２の光検出器 １４ 信号処理部 １５ 記録部 １６ 解析部

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分離されて１個ずつ順次に流れる被検粒
   子の通過を検出する第１の検出手段と、該第１の検出手
   段の位置よりも下流位置で前記第１の検出手段からの出
   力を基に被検粒子の通過に合わせて被検粒子を照射する
   ためのパルス状の光ビームを発生する光ビーム発生手段
   と、前記パルス状の光ビームの照射により被検粒子から
   発生する蛍光光量を検出する第２の検出手段と、前記蛍
   光光量を時間の関数として記録する記録手段とを有する
   ことを特徴とする粒子解析装置。
2. 【請求項２】 前記蛍光は自家蛍光である特許請求の範
   囲第１項に記載の粒子解析装置。
3. 【請求項３】 前記第１の検出手段は、被検粒子に実質
   的に連続光である連続光ビームを照射し、被検粒子から
   発生する散乱光を検出することにより被検粒子の通過を
   検出する請求項１に記載の粒子解析装置。
4. 【請求項４】 被検粒子はシースフロー方式により流す
   ようにした請求項１に記載の粒子解析装置。
5. 【請求項５】 前記パルス状の光ビームはレーザー光と
   した請求項１に記載の粒子解析装置。
6. 【請求項６】 前記パルス状の光ビームのパルス照射時
   間は５００ｐＳ以下とした請求項１に記載の粒子解析装
   置。
7. 【請求項７】 前記連続光ビームはレーザー光とした請
   求項３に記載の粒子解析装置。
8. 【請求項８】 前記連続光ビームにより被検粒子から発
   生する散乱光を、更に被検粒子の解析に用いるようにし
   た請求項３に記載の粒子解析装置。
9. 【請求項９】 前記連続光ビームにより被検粒子から発
   生する蛍光を、更に被検粒子の解析に用いるようにした
   請求項３に記載の粒子解析装置。
10. 【請求項１０】 前記記録手段に記載された蛍光光量の
    時間変化が、設定された値よりも大きい場合に、被検粒
    子が腫瘍細胞であると判断する解析部を更に有する請求
    項１に記載の粒子解析装置。