KR102512157B1

KR102512157B1 - 폐 고혈압 치료용 조성물 및 치료 방법

Info

Publication number: KR102512157B1
Application number: KR1020197004432A
Authority: KR
Inventors: 라빈드라 쿠마르; 존 크노프
Original assignee: 악셀레론 파마 인코포레이티드
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2023-03-21
Also published as: US11497794B2; HRP20210694T1; JP2024009166A; AU2017296040C1; PL3496739T3; US11622992B2; US10722558B2; LT3496739T; SI3496739T1; EP3496739A1; ES2875905T3; EP3928784A1; US10695405B2; MX2019000618A; MD3496739T2; RU2021114098A; US20200405814A1; US20180221447A1; RS62011B1; RU2019104084A3

Abstract

일부 양상들에서, 본 명세서는 폐 고혈압 (PH)의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소, 특히, 하나 이상의 PH-관련 합병증의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 위한, GDF/BMP 길항제들 및 GDF/BMP 길항제들의 사용 방법에 관한 것이다. 본 명세서는 또한 폐 혈관 재형성, 폐 섬유증, 및 우심실 비대를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 병태들의 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 위해 GDF/BMP 길항제를 사용하는 방법을 제공한다. 본 명세서는 필요로 하는 대상체에서 우심실 수축기압을 감소시키기 위해 GDF/BMP 길항제를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

폐 고혈압 치료용 조성물 및 치료 방법

관련 명세서에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 7월 15일 출원된 미국 가특허출원 제 62/362,955호; 2017년 2월 2일 출원된 제 62/453,888호; 및 2017년 5월 24일 출원된 제 62/510,403호에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 출원들의 내용은 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

발명의 배경

폐 고혈압 (PH)은 폐동맥, 폐정맥, 및 폐 모세혈관을 비롯한 폐 혈관계통에서의 높은 혈압으로 특징되는 질환이다. 일반적으로, PH는 휴지시 ≥25 mm Hg 또는 활동시 ≥30 mm Hg의 평균 폐동맥 (PA) 압력으로 정의된다 [Hill 외, Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. 주요 PH 증상은 호흡의 어려움 또는 호흡 곤란이며, 다른 증상들에는 피로, 어지러움, 기절, 말초 부종 (발, 다리 또는 발목의 부기), 푸르스름한 입술 및 피부, 가슴 통증, 협심증, 운동 중 가벼운 현기증, 비-객담성 기침, 빠른 맥박 및 두근거림이 포함된다. PH는 심부전을 유발하는 중증의 질환일 수 있으며, 심부전은 폐 고혈압을 보유한 사람들의 가장 일반적인 사망 원인들 중 하나이다. 수술 후 폐 고혈압은 많은 유형의 수술 또는 절차들을 복잡하게 만들 수 있으며, 높은 사망율과 관련된 문제점을 나타낼 수 있다.

PH는 병리생리학적 기전, 임상 증상, 및 치료적 접근법에 있어서 유사성을 공유하는 상이한 질환 소견들을 기준으로 하여 그룹화될 수 있다 [Simonneau 외, JACC 54(1):S44-54 (2009)]. PH의 임상 분류는 1973에 최초로 제안되었으며, 최근 최신 임상 분류는 2008년에 세계 보건 기구 (WHO)에 의해 승인되었다. 최신 PH 임상 분류에 따르면, 다음과 같은 5개 주요 PH 그룹이 존재한다: PA 쐐기압 15 mm Hg으로 특징되는 폐동맥 고혈압 (PAH); PA 쐐기압 >15 mm Hg으로 특징되는, 좌측 심장 질환으로 인한 PH (폐 정맥 고혈압 또는 울혈성 심부전으로도 공지됨); 폐 질환 및/또는 저산소증으로 인한 PH; 만성 혈전색전성 PH; 및 불명확하거나 다인성 원인들로 인한 PH [Simonneau 외, JACC 54(1):S44-54 (2009); Hill 외, Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. PAH는 특발성 PAH (IPAH), PAH 가족력이나 확인된 위험 요인이 전혀 없는 산발성 질환; 유전적 PAH; 약물 및 독소에 의해 유발되는 PAH; 결합 조직 질환, HIV 감염, 문맥 고혈압, 선천성 심장 질환, 주혈흡충증, 및 만성 용혈성 빈혈과 연관된 PAH; 및 신생아의 지속성 PH로 더욱 분류된다 [Simonneau 외, JACC 54(1):S44-54 (2009)]. 다양한 PH 유형들에 관한 진단에는 일련의 테스트가 필요하다.

일반적으로, PH 치료는 PH의 원인 또는 분류에 따라 달라진다. PH가 공지의 약제 또는 의학적 병태에 의해 유발되는 경우, 이는 이차적인 PH로 알려져있으며, 이의 치료는 통상적으로 기저 질환을 대상으로 한다. 폐 정맥 고혈압의 치료는 일반적으로 이뇨제, 베타 차단제, 및 ACE 억제제를 투여함으로써, 또는 승모판 또는 대동맥판을 복구 또는 대체함으로써 좌심실 기능을 최적화하는 것과 관련되어 있다. PAH 요법은 폐 혈관확장제, 디곡신, 이뇨제, 항응고제, 및 산소 요법을 포함한다. 폐 혈관확장제는 프로스타사이클린 경로 (예컨대, 정맥내 에포프로스테놀, 피하 또는 정맥내 트레프로스티닐, 및 흡입형 일로프로스트를 비롯한 프로스타사이클린), 산화 질소 경로 (예컨대, 실데나필 및 토달라필을 비롯한 포스포다이에스테라제-5 억제제), 및 엔도텔린-1 경로 (예컨대, 경구 보센탄 및 경구 암브리센탄을 비롯한 엔도텔린 수용체 길항제)를 포함한 상이한 경로들을 표적한다 [Humbert, M. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179:650-6 (2009); Hill 외, Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. 그러나, 현재의 치료법은 PH에 대한 치유를 전혀 제공하지 않으며, 이들은 많은 PH 환자들에서 관찰되는 혈관들의 기본적인 혈관 재형성 및 근육화를 직접 치료하지 않는다.

그러므로, 효과적인 폐 고혈압 치료 요법에 대한 수요는 높으며 충족되지 않고 있다. 따라서, 본 명세서의 목적은 PH의 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소방법, 특히 하나 이상의 PH-관련 합병증들을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

일부에서, 본 명세서에 제시된 데이터는 GDF/BMP 길항제들 (억제제)이 폐 고혈압 치료에 사용될 수 있음을 입증한다. 예를 들면, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형이량체는 각각, 모노크로탈린-유도된 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 혈압, 심장 비대, 및 폐 중량을 감소시키기 위해 사용될 수 있음이 나타났다 Sugen 저산소증 PAH 모델에서 ActRIIA 폴리펩티드에 대하여 유사한 긍정적 효과들이 관찰되었다. 조직학적 분석은 또한 ActRIIA 폴리펩티드가 PAH의 모노크로탈린-유도된 그리고 Sugen 저산소증 모델 모두에서 혈관 재형성 및 혈관들의 근육화 감소에 대해 놀랍고 유의한 효과를 가졌음을 나타내었다. 더욱이, ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형이량체 모두는 놀랍게도 PAH 치료용으로 승인된 약물인 실데나필에 비해, 다양한 PAH 합병증들을 개선함에 있어서 더 큰 효과를 가졌다. 그러므로, 본 출원은 ActRII (ActRIIA 및 ActRIIB) 신호전달 경로들의 길항제들이 폐 고혈압의 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있음을 증명한다. 가용성 ActRIIa 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형다량체는 ActRIIA/B 리간드 길항작용 이외의 기전을 통하여 폐 고혈압에 영향을 줄 수 있으나, 그럼에도 불구하고 본 출원은 ActRII 신호전달 길항제 활성을 기초로 하여 바람직한 치료제들이 선택될 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 출원은, 예를 들어, 하나 이상의 ActRIIA/B 리간드들 [예컨대, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, 및 BMP10]을 억제하는 길항제들; 하나 이상의 I형 및/또는 II형 수용체들 (예컨대, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 ALK5)을 억제하는 길항제들; 및 하나 이상의 하류 신호전달 성분들 (예컨대, Smad 단백질, 가령, Smads 2 및 3)을 억제하는 길항제들을 비롯한 다양한 ActRII 신호전달 길항제들을 사용한, 고혈압, 특히, 폐 고혈압 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 신호전달 길항제들은 총괄하여 “길항제들” 또는 “억제제”로 지칭된다. 따라서, 본 출원은, 부분적으로, 폐 고혈압 (예컨대, PAH) 치료, 특히, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증들 (예컨대, 혈압 상승, 심장 비대, 혈관 재형성, 및 혈관의 근육화) 치료를 위한 GDF/BMP 길항제 조성물 및 치료 방법을 제공한다. 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제들에는, 예를 들어, 리간드 트랩 (예컨대, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, ALK4: ActRIIB이형이량체, 폴리스타틴 폴리펩티드, 및 FLRG 폴리펩티드), 항체 길항제들, 소분자 길항제들, 및 뉴클레오티드 길항제들이 포함된다. 선택적으로, GDF/BMP 길항제들은 폐 고혈압을 치료하기 위한 하나 이상의 지지 요법 및/또는 추가 활성 제제와 병용하여 사용될 수 있다.

특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRIIA 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 폐동맥 고혈압 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여 서열 번호: 9의 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135 중 어느 하나에서 종료하는 아미노산 서열에 최소한 70% (예컨대, 최소한 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 10의 아미노산 서열에 최소한 70% (예컨대, 최소한 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 최소한 70% (예컨대, 최소한 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 도메인 및 ActRIIA에 이종인 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인이다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 융합 단백질은 ActRIIA 폴리펩티드 도메인과 하나 이상의 이종 도메인 (예컨대, Fc 면역글로불린 도메인) 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 링커 도메인은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: TGGG (서열 번호: 23), TGGGG (서열 번호: 21), SGGGG (서열 번호: 22), GGGGS (서열 번호: 25), GGG (서열 번호: 19), GGGG (서열 번호: 20), 및 SGGG (서열 번호: 24). 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 동형이량체 단백질 복합체의 일부이다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 당화된다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 중국 햄스터 난소 세포에서 발현하여 얻을 수 있는 당화 패턴을 가진다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐동맥 압력을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐동맥 압력을 최소한 10% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 최소한 80%) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 심실 비대를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 심실 비대를 최소한 10% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 최소한 80%) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 평활근 비대를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 평활근 비대를 최소한 10% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 최소한 80%) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐 세동맥 근육을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐 세동맥 근육을 최소한 10% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 최소한 80%) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐혈관저항을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐혈관저항을 최소한 10% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 최소한 80%) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드의 투여는 환자의 폐 혈관 저항을 최소한 25-30% 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 폐동맥 고혈압을 가지며 폐 고혈압에 관한 세계 보건 기구의 기능 분류 체계에 따른 기능 분류 II 또는 분류 III 폐 고혈압을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 아형들로 분류되는 폐동맥 고혈압을 가진다: 특발성 또는 유전적 폐동맥 고혈압, 약물- 및/또는 독소-유발된 폐 고혈압, 결합 조직 질환 관련 폐 고혈압, 및 단락 복원술 후 최소한 1년의 선천성 체-폐 단락과 관련된 폐 고혈압. 일부 구체예들에서, 환자는 하나 이상의 혈관확장제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제제들로 치료받은 적이 있다: 포스포다이에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극인자, 프로스타사이클린 수용체 작용제, 및 엔도텔린 수용체 길항제. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 제제들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄, 및 토달라필. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 하나 이상의 혈관확장제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제제들의 투여를 추가로 포함한다: 포스포다이에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극인자, 프로스타사이클린 수용체 작용제, 및 엔도텔린 수용체 길항제. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 제제들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄, 및 토달라필. 일부 구체예들에서, 환자는 150 내지 400 미터의 6분 도보 거리를 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 6분 도보 거리를 최소한 10 미터 (예컨대, 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 400 미터 이상)만큼 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 >8 내지 <15 g/dl의 헤모글로빈 수준을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐동맥 고혈압의 임상 악화를 지연시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압에 관한 세계 보건 기구의 기능 분류 체계에 따른 폐 고혈압의 임상 악화를 지연시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐동맥 고혈압과 관련된 하나 이상의 합병증들로 인한 입원 위험을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 리간드에 결합한다: 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, GDF8, BMP10, 및 BMP6.

일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 폐 고혈압 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 폐 고혈압 예방 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 폐 고혈압의 진행 속도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 간질성 폐 질환 치료 방법을 제공하며, 이 때 GDF/BMP 길항제는 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및 ALK7 중 하나 이상을 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 간질성 폐 질환 치료, 예방 또는 진행 속도 감소 및/또는 이의 하나 이상의 합병증들의 중증도 감소 방법을 제공하며, 이 때 GDF/BMP 길항제는 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및 ALK7 중 하나 이상을 억제한다. 일부 구체예들에서, 간질성 폐 질환은 특발성 폐 섬유증이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 폐 고혈압의 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압의 하나 이상의 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증) 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증) 예방 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증)의 진행 속도 감소 방법에 관한 것이다. 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제, 또는 GDF/BMP 길항제들의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증)의 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 바람직한 특정 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐동맥 고혈압을 가진 환자와 관련된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 최소한 25 mm Hg (예컨대, 최소한 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mm Hg)의 휴지기 폐동맥 압력 (PAP)을 가지는 환자와 관련된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐 고혈압 환자의 PAP를 감소시킨다. 예를 들어, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 PAP를 최소한 3 mmHg (예컨대, 최소한 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 또는 25 mm Hg) 만큼 감소시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐혈관저항을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐 고혈압 환자의 폐 모세혈관 쐐기압을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐 고혈압 환자의 좌심실 확장기말 압력을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐 고혈압 환자의 운동능 (능력, 내성)을 증가 (개선)시킨다. 예를 들어, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6분 도보 거리를 증가시킬 수 있으며, 선택적으로 6분 도보 거리를 최소한 10 미터 (예컨대, 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 미터 또는 그 이상)만큼 증가시킨다. 또한, 상기 방법은 환자의 Borg 호흡곤란 지수 (BDI)를 감소시킬 수 있으며, 선택적으로 6-분 도보 테스트 후 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 Borg 호흡곤란 지수 (BDI)를 최소한 0.5 지수 포인트 (예컨대, 최소한 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 지수 포인트) 만큼 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 세계 보건 기구가 인정한 분류 I, 분류 II, 분류 III, 또는 분류 IV 폐 고혈압 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 폐 고혈압의 임상 진행 (악화) (예컨대, 세계 보건 기구 표준으로 측정된 진행)을 지연시키는 것에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 분류상의 진행을 방지 또는 지연시킨다 (예컨대, 세계 보건 기구가 인정한 분류 I에서 분류 II로, 분류 II에서 분류 III으로, 또는 분류 III에서 분류 IV로의 폐 고혈압 진행을 예방 또는 지연시킨다). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 분류의 회귀를 촉진 또는 증가시킨다 (예컨대, 세계 보건 기구가 인정한 분류 IV에서 분류 III으로, 분류 III에서 분류 II로, 또는 분류 II에서 분류 I로의 폐 고혈압 회귀를 촉진 또는 증가시킨다). 일부 구체예들에서, 환자는 하나 이상의 GDF/BMP 길항제 이외에도 폐 고혈압 치료를 위한 하나 이상의 지지 요법 또는 활성제가 추가로 투여된다. 예를 들어, 환자는 또한 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 지지 요법 또는 활성제가 투여될 수 있다: 프로스타사이클린 및 이의 유도체 (예컨대, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제 (예컨대, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제 (예컨대, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 통로 차단제 (예컨대, 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀; 항응고제 (예컨대, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격절개술; 폐동맥 혈전내막제거술; 포스포다이에스테라제 5형 억제제 (예컨대, 실데나필 및 토달라필); 활성화제 of 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제 (예컨대, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제 (예컨대, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-다이온, NQDI-1; 2-싸이옥소-싸이아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-싸이옥소-싸이아졸리딘-5-일리덴)-1,3-다이하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제들 (예컨대, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-다이플루오로프로피온아마이드; C28 이미다졸 (CDDO-Im); 2-사이아노-3,12-다이옥솔란-1,9-다이엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트라이플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트라이플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS2); 메틸 3,11-다이옥솔란-12-엔-28-올레이트 (DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사다이아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트) 폐 및/또는 심장 이식술. 일부 구체예에서, 환자는 또한 BMP9 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 성숙 BMP9 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 제약학적 제재로 투여되며, 선택적으로 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함하는 BMP9 제약학적 제재들에서, BMP9 폴리펩티드는 BMP9 프로도메인 폴리펩티드와 비공유적으로 결합될 수 있다. 일부 구체예들에서, BMP9 제약학적 제재들은 BMP9 프로도메인 폴리펩티드가 실질적으로 없거나 이를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 환자는 또한 올레아놀릭 애시드 또는 이의 유도체가 투여될 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 GDF11을 억제하는 물질 (가령, GDF11 길항제)이다. GDF11 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법들)을 비롯한 세포-기반 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 GDF11에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 GDF11에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 GDF11을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, GDF11을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3).

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 GDF8을 억제하는 물질 (가령, GDF8 길항제)이다. GDF8 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법들)을 비롯한 세포-기반 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 GDF8에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 GDF8에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 GDF8을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, GDF8을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3).

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 GDF3을 억제하는 물질 (가령, GDF3 길항제)이다. GDF3 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법)을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 GDF3에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 GDF3에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 GDF3을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, GDF3을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3)을 추가로 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 BMP6을 억제하는 물질 (예컨대, BMP6 길항제)이다. BMP6 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법)들을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 BMP6에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 BMP6에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 BMP6를 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, BMP6를 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3)을 추가로 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 BMP15를 억제하는 물질 (예컨대, BMP15 길항제)이다. BMP15 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법)들을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 BMP15에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 BMP15에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 BMP15를 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, BMP15를 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3)을 추가로 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 BMP10을 억제하는 물질 (예컨대, BMP10 길항제)이다. BMP10 억제에 대한 효과는, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (예컨대, Smad 신호전달 리포터 분석)을 포함한 세포-기반 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 BMP10에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 BMP10에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, 및 FLRG 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이종다량체 FLRG 폴리펩티드), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 BMP10을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, BMP10을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3)을 추가로 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE)을 억제하는 물질 (가령, 액티빈 길항제)이다. 액티빈 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법)을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 액티빈에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 액티빈에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 액티빈을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 액티빈을 억제하는 GDF/BMP 길항제 또는 길항제들의 조합은, 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: BMP15 GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3). 특정 바람직한 구체예들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 액티빈 B를 억제하는 물질이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 액티빈 A (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M)에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 액티빈 A 활성을 억제하지 않는다. 특정 바람직한 구체예들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 액티빈 B를 억제하지만, (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 KD 로 액티빈 A에 결합하거나 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M)에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 액티빈 A 활성을 억제하지 않는다.

특정 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 ActRII (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)를 억제하는 물질 (예컨대, ActRII 길항제)이다. ActRII 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석법들)을 비롯한 세포-기반 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 ActRII에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 ActRII에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 ActRII를 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, ActRII를 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3)를 추가로 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 ALK4를 억제하는 물질 (가령, ALK4 길항제)이다. ALK4 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석) 을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 ALK4에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 ALK4에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 ALK4를 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, ALK4를 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3).

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 ALK5를 억제하는 물질 (가령, ALK5 길항제)이다. ALK5 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석)을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 ALK5에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 ALK5에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 ALK5를 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, ALK5를 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK7, ALK4, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3).

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 ALK7을 억제하는 물질 (가령, ALK7 길항제)이다. ALK7 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석)을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 ALK7에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 ALK7에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 ALK7을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, ALK7을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK4, 및 하나 이상의 Smads (예컨대, Smads 2 및 3).

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합은 최소한 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 억제하는 물질이다. Smad 억제에 있어서 효과는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들 (가령, Smad 신호생성 리포터 분석)을 비롯한 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합물은 최소한 1 x 10^-7 M (가령, 최소한 1 x 10^-8 M, 최소한 1 x 10^-9 M, 최소한 1 x 10^-10 M, 최소한 1 x 10^-11 M, 또는 최소한 1 x 10^-12 M)의 K_D로 최소한 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 리간드 트랩 (가령, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체), 항체, 소분자, 뉴클레오티드 서열, 및 이의 조합을 비롯한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 억제하는 다양한 GDF/BMP 길항제들이 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 억제하는 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제들의 조합은 다음 중 하나 이상을 추가로 억제할 수 있다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, 및 ALK4.

특정 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제는 ActRII 폴리펩티드이다. 용어 “폴리펩티드”는 자연 발생 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드 뿐만 아니라, 가령, 본 출원에 기재된 이의 절두부들 및 변이체들 (예컨대, GDF 트랩 폴리펩티드)을 집합적으로 지칭한다. 바람직하게는 ActRII 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변형된 (변이체) 형태의 리간드-결합 도메인을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드의 ActRIIA 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ActRIIA 세포외 도메인의 일부분을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 ActRIIB 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ActRIIB 세포외 도메인의 일부분을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 방법들에 따라 사용되는 ActRII 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서는 ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 21-30 중 임의의 하나에 대응하는 잔기에서 시작하고 (가령, 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30에서 시작하고), 서열 번호: 9의 임의의 하나의 아미노산 110-135에 대응하는 잔기에서 종료하는 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135 중 임의의 하나에서 종료하는) ActRIIB의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 10의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 36의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다.

다른 양상들에서, 본 출원은 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산 [자연 발생적 (E 또는 D) 또는 인공적인 산성 아미노산]을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 출발하고, 서열 번호: 1의 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 종료하는 서열에 대하여 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 출발하고, 서열 번호: 1의 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 종료하는 서열에 대하여 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이 때 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 기타 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 3에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 5에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 6의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 6의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 6에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 40의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 42의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 45의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 46의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 46의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 69의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 74의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 74의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 77의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 77의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 78의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 78의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에 산성 아미노산을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 명세서에서 기재된 방법 및 용도에 따라 이용된 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 L79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산을 포함하지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 및 이의 변이체들 (GDF 트랩)은 동형중합체, 예를 들면, 동형이량체(homodimer), 동형삼량체(homotrimer), 동형사량체(homotetramers), 동형오량체(homopentamers), 및 더 높은 차수의 동형다량체 복합물일 수 있다. 특정 바람직한 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드 및 이의 변이체들은 동형이량체이다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 ActRII 폴리펩티드 이량체들은 제 2 ActRII 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합되는 제 1 ActRII 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 제 1 폴리펩티드는 하나의 ActRII 도메인 및 상호작용 쌍의 제 1 구성원 (또는 제 2 구성원)의 하나의 아미노산 서열 (예컨대, 면역글로불린의 불변 도메인)을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 2 구성원 (또는 제 1 구성원)의 하나의 아미노산 서열 및 하나의 ActRII 폴리펩티드를 포함한다.

특정 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제는 ALK4: ActRIIB이종다량체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, ALK4: ActRIIB이형이량체 단백질 복합체는 상응하는 ActRIIB 및 ALK4 동형이량체와 비교하여 상이한 리간드-결합 프로파일/선택성을 가짐을 발견하였다. 특히, ALK4: ActRIIB이형이량체는 동형이량체와 비교하여 액티빈 B에 대하여 향상된 결합을 보이며, ActRIIB 동형이량체에서 관찰된 바와 같이, 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 대하여 강력한 결합을 유지하고, 그리고 BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 특히, BMP9는 ALK4: ActRIIB이형이량체에 대하여 낮은 친화력 내지 탐지불가능한 친화력을 나타내는 반면, 이 리간드는 ActRIIB 동형이량체에 강력하게 결합한다. ActRIIB 동형이량체와 유사하게, ALK4: ActRIIB이형이량체는 BMP6에 대한 중간-수준의 결합을 유지한다. 도 19를 참고하라. 이들 데이터는 ALK4: ActRIIB이형이량체가 ActRIIB 동형이량체와 비교하였을 때, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 더 큰 선택적 길항제 (억제제)임을 입증한다. 따라서, ALK4: ActRIIB이형이량체는 특정 용도에서 ActRIIB 동형이량체보다 더 유용할 것이며, 이때 이러한 선택적 길항작용이 유익하다. 실시예는 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF8, 및 GDF11의 길항작용을 유지하지만, 하나 또는 그 이상의 BMP9, BMP10, 및 GDF3의 길항작용은 최소화시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다. 더욱이, ALK4: ActRIIB이형이량체는 환자의 PAH를 치료하는 것으로 나타났다. 특정 작용 기전에 제한하고자 하는 것은 아니지만, 최소한 하나 또는 그 이상의 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 및 액티빈 AC), GDF8, 및/또는 GDF11에 결합하는 ALK4: ActRIIB이형다량체, 뿐만 아니라 이의 변이체들은 PAH 환자들에서 유익한 효과를 촉진시키기 위한 유용한 제제가 될 것이다.

따라서, 본 명세서는 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드 및 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드 (ALK4: ActRIIB이형다량체)를 포함하는 이형다량체 복합체 (ALK4: ActRIIB이형다량체) 뿐만 아니라 이의 용도를 제공한다. 바람직하게는, ALK4 폴리펩티드는 ALK4 수용체의 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ALK4 세포외 도메인의 일부분을 포함한다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드는 일반적으로 ActRIIB 수용체의 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ActRIIB 세포외 도메인의 일부분을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 ALK4 및 ActRIIB 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 이형다량체는 가용성이다.

특정 양상들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 100의 아미노산 34-101에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 101에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 105에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 122에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 124에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 116에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 117에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 111에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 113에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ALK4 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양상들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 2에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 3에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 5에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 6에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 118에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 120에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 114에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 115에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 108에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 110에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 ActRIIB 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 특정 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 1의 L79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산 (예컨대, E 또는 D)을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하지 않는다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, ALK4: ActRIIB이형다량체 구조는 예를 들면, 이형이량체, 이형삼량체, 이형사량체, 이형오량체, 및 더 높은 차수의 복합체들을 포함한다. 예컨대, 도 21-23을 참고하라. 바람직한 특정 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 이형이량체이다. 특정 양상들에서, ALK4 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있다.

특정 양상들에 있어서, ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 이의 변이체들 (가령, GDF 트랩)은 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에 있어서, ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 (또는 ALK4) 도메인과 하나 또는 그 이상의 이종 (비-ActRII) 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드는 하나의 도메인으로써, ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드 (가령, ActRII (또는 ALK4) 수용체의 리간드-결합 도메인 또는 이의 변이체)로부터 유도된 아미노산 서열과, 가령, 개선된 약물동력학, 더 용이한 정제, 특정 조직으로의 표적화, 등을 제공하는 하나 또는 그 이상의 이종 도메인을 보유하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 도메인은 하나 또는 그 이상의 생체내 안정성, 생체내 반감기, 취입/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다량체화(multimerization), 및/또는 정제를 향상시킬 수 있다. 선택적으로, 융합 단백질의 ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드 도메인은 하나 이상의 이종 폴리펩티드 도메인에 직접 연결(융합)되거나, 또는 ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 하나 이상의 이종 도메인의 아미노산 서열 사이에 링커와 같은 개입 서열이 위치할 수 있다. 특정 구체예에서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 이종 도메인과 ActRII (또는 ALK4) 도메인 사이에 위치한 비교적 구조화되지 않은 링커를 포함한다. 이와 같은 비구조적 링커는 ActRII (또는 ALK4)의 세포외 도메인의 C-말단 단부에 대략 15개의 아미노산으로 된 비구조 영역에 상응할 수 있으며, 또는 링커는 상대적으로 2차 구조가 없는 3 내지 15, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 인공 서열일 수 있다. 링커는 글리신 및/또는 프롤린 잔기가 많고, 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 반복 서열을 함유할 수 있다. 링커의 예는 서열 TGGG (서열 번호: 23), SGGG (서열 번호: 24), TGGGG (서열 번호: 21), SGGGG (서열 번호: 22), GGGGS (서열 번호: 25), GGGG (서열 번호: 20), 및 GGG (서열 번호: 19)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 면역글로불린의 불변 도메인, 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA (IgA1 또는 IgA2), IgE, 또는 IgM 면역글로불린의 Fc 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열. 예를 들면, 면역글로불린 도메인의 Fc 부분은 서열 번호: 14-18 중 임의의 하나에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성될 수 있다. 이러한 면역글로불린 도메인은 변경된 Fc 활성, 가령, 하나 또는 그 이상의 Fc 효과기 기능의 감소를 부여하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형 (가령, 결손, 추가, 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 구성 A-B-C로 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, B 부분은 예컨대, 본 명세서에 기재된 N- 및 C-말단 절두된 ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드이다. 상기 A와 C 부분은 독립적으로 0, 1, 또는 하나 이상의 아미노산일 수 있고, A와 C 부분 모두 B에 대하여 이종이다. 상기 A 및/또는 C 부분은 B 부분에 링커 서열을 통해 부착될 수 있다. 특정 구체예에서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 리더 서열을 포함한다. 상기 리더 서열은 고유의 ActRII (또는 ALK4) 리더 서열 또는 이종 리더 서열일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 리더 서열은 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA) 리더 서열 (예컨대, 서열 번호: 34)이다.

변이체를 비롯한 ActRII 폴리펩티드 또는 ALK4 폴리펩티드는 정제 하위서열, 가령, 에피토프 테그, FLAG 테그, 폴리히스티딘 서열, 및 GST 융합을 포함할 수 있다. 선택적으로, ActRII 폴리펩티드 또는 ALK4 폴리펩티드는 당화된 아미노산, 페길화된(PEGylated) 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 및/또는 지질 모이어티에 접합된 아미노산에서 선택된 하나 또는 그 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다. ActRII 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드는 최소한 하나의 N-연계된 당을 포함할 수 있고, 그리고 2, 3개 또는 그 이상의 N-연계된 당을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 O-연계된 당을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 환자에게서 바람직하지 못한 면역 반응을 감소시키기 위하여, 상기 폴리펩티드의 자연 당화를 적절하게 매개하는 포유류 세포 계통에서 발현되는 ActRII 및 ALK4 폴리펩티드가 바람직하다. ActRII 및 ALK4 폴리펩티드는 유전자조작된 곤충 또는 효모 세포, 그리고 포유류 세포, 가령, COS 세포, CHO 세포, HEK 세포 및 NSO 세포가 포함된 환자에게 사용하는데 적합한 방식으로 단백질을 당화시키는 다양한 세포계통에서 생산될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드는 당화된 것이며, 중국 햄스터 난소 세포주로부터 수득가능한 당화 패턴을 갖는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드는 포유동물 (예컨대, 생쥐 또는 인간)에서 최소한 4, 6, 12, 24, 36, 48, 또는 72 시간의 혈청 반감기를 나타낸다. 선택적으로, ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드는 포유동물 (예컨대, 생쥐 또는 인간)에서 최소한 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, 또는 30 일의 혈청 반감기를 나타낼 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서는 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 길항제와 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 제재들을 제공한다. 제약학적 제재는 또한 하나 이상의 폐 고혈압 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서의 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증)의 치료 또는 예방에 사용되는 화합물을 포함할 수도 있으며, 이러한 화합물에는 하나 이상의 추가 활성제, 가령, 예를 들어, 혈관확장제, 가령, 프로스타사이클린, 에포프로스테놀, 및 실데나필; 엔도텔린 수용체 길항제, 가령, 보센탄; 칼슘 통로 차단제, 가령, 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀; 항응고제, 가령, 와파린; 이뇨제; BMP9 폴리펩티드; BMP10 폴리펩티드; 바르독솔론 메틸; 및 올레아놀릭 애시드가 포함된다. 일반적으로 제재는 바람직하게는 발열원이 없을 것이다 (치료용도로 제품의 질을 관리하는 규정에서 요구하는 수준으로 발열원이 없다는 것을 의미한다).

특정 경우들에서, 본 명세서의 GDF/BMP 길항제, 또는 길항제의 조합을 본 명세서에서 기재된 장애 또는 상태에 투여할 때, 상기 GDF/BMP 길항제를 투여하는 동안 적혈구에서의 효과를 모니터하고, 또는 적혈구 상에서 원하지 않는 효과를 감소시키기 위하여 상기 GDF/BMP 길항제의 투여량을 결정 또는 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 또는 적혈구용적률 수준의 증가는 바람직하지 못한 혈압 증가를 야기할 수 있다.

특정 양상들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제는 항체, 또는 항체들의 조합물이다. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 ActRII (ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 결합한다. 특정 구체예들에서 ActRII에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, ActRII에 결합하는 항체는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드, I형 수용체들, 또는 공동-수용체들이 ActRII에 결합하는 것을 억제한다. 특정 구체예들에서, ActRII에 결합하는 항체는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드들이 ActRII에 결합하는 것을 억제하며, 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, 및 GDF3. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 ALK4에 결합한다. 특정 구체예들에서, ALK4에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ALK4 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, ALK4에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드, II형 수용체, 또는 공동-수용체가 ALK4에 결합하는 것을 억제한다. 특정 구체예들에서 ALK4에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드가 ALK4에 결합하는 것을 억제하며, 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, 및 GDF3. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 ALK5에 결합한다. 특정 구체예들에서, ALK5에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ALK5 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, ALK5에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드, II형 수용체, 또는 공동-수용체가 ALK5에 결합하는 것을 억제한다. 특정 구체예들에서 ALK5에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드가 ALK5에 결합하는 것을 억제하며, 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다:액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, 및 GDF3. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 최소한 ALK7에 결합한다. 특정 구체예들에서, ALK7에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ALK7 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, ALK7에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드, II형 수용체, 또는 공동-수용체가 ALK7에 결합하는 것을 억제한다. 특정 구체예들에서 ALK7에 결합하는 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드가 ALK7에 결합하는 것을 억제하며, 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, 및 GDF3. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 GDF11에 결합한다. 특정 구체예들에서, GDF11에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, GDF11에 결합하는 항체는 GDF11-ActRII 결합 및/또는 GDF11-ALK 결합 (예컨대, GDF11-ALK4, GDF11-ALK5, 및/또는 GDF11-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 GDF8에 결합한다. 특정 구체예들에서, GDF8에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, GDF8에 결합하는 항체는 GDF8-ActRII 결합 및/또는 GDF8-ALK 결합 (예컨대, GDF8-ALK4, GDF8-ALK5, 및/또는 GDF8-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 BMP6에 결합한다. 특정 구체예들에서, BMP6에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, BMP6에 결합하는 항체는 BMP6-ActRII 결합 및/또는 BMP6-ALK 결합 (예컨대, BMP6-ALK4, BMP6-ALK5, 및/또는 BMP6-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 항체는 최소한 BMP15에 결합한다. 특정 구체예들에서, BMP15에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, BMP15에 결합하는 항체는 BMP15-ActRII 결합 및/또는 BMP15-ALK 결합 (예컨대, BMP15-ALK4, BMP15-ALK5, 및/또는 BMP15-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 최소한 GDF3에 결합한다. 특정 구체예들에서, GDF3에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, GDF3에 결합하는 항체는 GDF3-ActRII 결합 및/또는 GDF3-ALK 결합 (예컨대, GDF3-ALK4, GDF3-ALK5, 및/또는 GDF3-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 최소한 BMP10에 결합한다. 특정 구체예들에서, GDF3에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, BMP10에 결합하는 항체는 BMP10-ActRII 결합 및/또는 BMP10-ALK 결합 (예컨대, BMP10-ALK4, BMP10-ALK5, 및/또는 BMP10-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 항체는 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, and 액티빈 BE)에 결합한다. 특정 구체예들에서, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE)에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, and 액티빈 BE)에 결합하는 항체는 액티빈-ActRII 결합 및/또는 액티빈-ALK 결합 (예컨대, 액티빈-ALK4, 액티빈-ALK5, 및/또는 액티빈-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 액티빈 B에 결합한다. 특정 구체예들에서, 액티빈 B에 결합하는 항체는 선택적으로 세포-기반 분석, 가령, 본 명세서에서 기재된 것들에서 측정되었을 때, ActRII 신호생성을 억제한다. 특정 구체예들에서, 액티빈 B에 결합하는 항체는 액티빈 B-ActRII 결합 및/또는 액티빈 B-ALK 결합 (예컨대, 액티빈 B-ALK4, 액티빈 B-ALK5, 및/또는 액티빈 B-ALK7 결합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, 항체는 ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15 중 하나 이상에 결합하는 다중특이적 항체 또는 다중특이적 항체들의 조합이다. 특정 양상들에서 다중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체들의 조합은, 세포-기반 분석에서 다음 중 하나 이상의 신호생성을 억제한다: ActRIIB, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10 및 BMP15. 일부 구체예들에서, 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 단쇄 항체, F(ab')₂ 단편, 단쇄 디아바디, 탠덤 단쇄 Fv 단편, 탠덤 단쇄 디아바디(diabody), 또는 단쇄 디아바디와 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 최소 일부분을 포함하는 융합 단백질이다.

특정 양상들에 있어서, 상기 GDF/BMP 길항제는 소분자(small molecule) 억제제 또는 소분자 억제제의 조합이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 ActRII (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 ALK4의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 ALK5의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 ALK7의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 GDF11의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 GDF8의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 BMP6의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 BMP15의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 BMP10의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 GDF3의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE)의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 액티빈 B의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자 억제제는 최소한 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)의 억제제이다.

특정 양상들에 있어서, 상기 GDF/BMP 길항제는 핵산 억제제 또는 핵산 억제제의 조합이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 ActRII (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 ALK4의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 ALK5의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 ALK7의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 GDF11의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 GDF8의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 BMP6의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 BMP15의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 BMP10의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 GDF3의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE)의 억제제이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 액티빈 B의 억제제다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 억제제는 최소한 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)의 억제제이다.

특정 양상들에서, GDF/BMP 길항제는 폴리스타틴 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열 번호: 26의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열 번호: 27의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열 번호: 28의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열 번호: 29의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열 번호: 30의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

특정 양상들에서, GDF/BMP 길항제는 FLRG 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 FLRG 폴리펩티드는 서열 번호: 31의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 다중 ActRIIB 및 ActRIIA 결정 구조의 복합 분석에 근거하여, 상자로 표시된 리간드와 직접 접촉하기 위하여, 본 명세서에서 추측된 잔기를 갖는 인간 ActRIIB의 세포외 도메인(서열 번호: 2)과 인간 ActRIIA의 세포외 도메인 (서열 번호: 10)의 정렬을 나타낸다.
도 2는 다양한 척추동물 ActRIIB 단백질 (서열 번호: 53-58) 및 인간 ActRIIA (서열 번호: 59)의 다수의 서열 정렬, 뿐만 아니라 이러한 정렬로부터 유래한 공통 ActRII 서열 (서열 번호: 60)을 보여준다.
도 3는 다양한 척추동물 ActRIIA 단백질들 및 인간 ActRIIA의 다수의 서열 정렬을 보여준다 (서열 번호: 61-68).
도 4는 Clustal 2.1을 이용하여 인간 IgG 아이소형으로부터 Fc 도메인의 복수 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄에 의해 표시된다. 두줄 밑줄은 비대칭 사슬 페어링을 증진하기 위해 IgG1 Fc (서열 번호: 34)에서 조작될 수 있는 위치 및 다른 아이소형 IgG2, IgG3 및 IgG4에 대한 상응하는 위치의 실례를 나타낸다.
도 5는 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 단백질은 크기 컬럼 (상부 패널) 및 쿠마씨(Coomassie) 염색 SDS-PAGE (하부 패널) (왼쪽 레인: 분자량 표준; 오른쪽 레인: ActRIIA-hFc)에서 보는 바와 같이 하나의, 잘-정의된 피크로 정제된다.
도 6은 Biacore^TM 분석법으로 측정한, 액티빈 (상부 패널) 및 GDF-11 (하부 패널)에 대한 ActRIIA-hFc의 결합을 보여준다.
도 7은 ActRIIB(25-131)-hFc (서열 번호: 69)에 대한 가공되지 않은 전체 아미노산 서열을 보여준다. TPA 리더 (잔기들 1-22) 및 이중-절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (잔기들 24-131, 서열 번호: 1의 고유 서열에 기초한 넘버링을 사용)들에 각각 밑줄 표시한다. 서열 번호: 1과 관련하여 위치 25에 있는, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질의 N-말단 아미노산인 것으로 나타난 글루타메이트를 강조표시하였다.
도 8A 및 8B는 ActRIIB(25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (코딩 가닥은 상부에 나타내고, 서열 번호: 70, 상보적인 가닥은 하부에 3'-5'로 나타낸다, 서열 번호: 71). TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66) 및 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 73-396)을 인코딩하는 서열들에 밑줄 표시한다. ActRIIB(25-131)에 대한 대응하는 아미노산 서열을 또한 나타낸다.
도 9A 및 9B는 ActRIIB(25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드서열을 나타낸다 (코딩 가닥은 상단, 서열 번호: 72 에 나타내고, 보체는 바닥 3'-5'에, 서열 번호: 73 으로 나타낸다). 이러한 서열은 초기 형질전환에서 보다 큰 단백질 발현 수준을 제공하여, 더 신속한 과정으로 세포주를 발달시킨다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66) 및 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 73-396)을 인코딩하는 서열들에 밑줄 표시하였으며, ECD의 야생형 뉴클레오티드 서열에서의 치환 (도 8 참고)을 강조하였다. ActRIIB(25-131)에 대한 대응하는 아미노산 서열을 또한 나타낸다.
도 10은 TPA 리더 서열 (두줄 밑줄), ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 20-134; 한줄 밑줄), 및 hFc 도메인을 포함하는 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (서열 번호: 128)에 대한 전체 아미노산 서열을 보여준다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트를 두줄 밑줄로 표시하여 강조하고, 서열분석에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 나타난 글리신에 대하여도 같다.
도 11A 및 11B는 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 75는 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 76은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에 두줄 밑줄 표시하고, ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-420)에 한줄 밑줄 표시한다.
도 12 는 TPA 리더 (두줄 밑줄), 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 25-131; 한줄 밑줄), 및 hFc 도메인을 포함한, 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 의 전장 아미노산 서열 (서열 번호: 77)을 보여준다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 두줄 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 나타난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 13은 리더가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 대한 아미노산 서열을 보여준다 (서열 번호: 78). 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131)에 밑줄 표시한다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 두줄 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 나타난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 14는 리더, hFc 도메인, 및 링커가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)에 대한 아미노산 서열을 보여준다 (서열 번호: 79). 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 나타난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 15A 및 15B는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 80은 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 81은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에 두줄 밑줄 표시하고, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)에 한줄 밑줄 표시한다. 상기 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131)의 아미노산 서열을 또한 보여준다.
도 16A 및 16B는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 대안적 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 82는 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 83은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에는 두줄 밑줄 표시하고, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)에는 밑줄 표시하고, 세포외 도메인의 야생형 뉴클레오티드 서열에서의 치환에 두줄 밑줄 표시하여 강조한다 (서열 번호: 81과 비교, 도 15). 상기 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131)의 아미노산 서열을 또한 보여준다.
도 17는 도 16에 도시된 대안적 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 82)의 뉴클레오티드 76-396 (서열 번호: 84)을 보여준다. 이 도면에서 도 16에 표시된 것과 동일한 뉴클레오티드 치환들에도 밑줄 표시하고 이 부분을 강조하였다. 서열 번호: 84는 L79D 치환을 갖는, 오직 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131에 상응), 가령, ActRIIB(L79D 25-131)을 인코드한다.
도 18은 다양한 척추동물 ALK4 단백질들 및 인간 ALK4의 다수의 서열 정렬을 보여준다 (서열 번호: 126-132).
도 19는 ActRIIB-Fc 동형이량체와 ALK4-Fc 동형이량체와 비교하여 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체 단백질 복합체에 대한 비교 리간드 결합 데이타를 나타낸다. 각 단백질 복합체의 경우, 리간드는 리간드 신호전달 억제와 관련된 동역학 상수인 k_off에 의해 등급결정되며, 결합 친화력 (가장 단단하게 결합된 리간드가 상위에 열거됨)의 내림 순서로 열거된다. 왼쪽에서 노란색, 빨간색, 녹색 및 파란색 선은 해리 속도 상수의 크기를 나타낸다. 검정색 선은 동형이량체와 비교하여 이형이량체에 대한 결합이 강화되거나 변하지 않은 리간드를 나타내지만, 빨간색 점선은 동형이량체에 비해 결합이 실질적으로 감소한 것을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 이들 동형이량체와 비교하여 액티빈 B에 강화된 결합을 보이고, ActRIIB-Fc 동형이량체에서 관찰된 바와 같이, 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 강력한 결합을 유지하지만, BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대해서 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. ActRIIB-Fc 동형이량체와 유사하게, 상기 이형이량체는 BMP6에 중간-수준 결합을 유지한다.
도 20 은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 A-204 Reporter 유전자분석에 의해 측정된 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체 비교 IC₅₀ 데이터를 나타낸다. ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체와 유사하게 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 신호전달 경로를 억제한다. 그러나, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 BMP9 및 BMP10 신호전달 경로 억제는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체와 비교하여 상당히 감소된 것이다. 이들 데이터는 ALK4: ActRIIB이형이량체가 상응하는 ActRIIB:ActRIIB 동형이량체와 비교하였을 때, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 더 큰 선택적 길항제임을 설명한다.
도 21A 및 21B 는 I형 수용체와 II형 수용체 폴리펩티드를 포함하는 이형화학 단백질 복합체의 2가지 도식적 예를 보여준다. 도 21A는 한 가지 I형 수용체 융합 폴리펩티드와 한 가지 II형 수용체 융합 폴리펩티드를 포함하는 이형이량체 단백질 복합체를 나타내는데, 이때 이들 두 폴리펩티드는 각 폴리펩티드 쇄 안에 함유된 다량체화 도메인을 통하여 공유적으로 또는 비공유적으로 어셈블리될 수 있다. 어셈블리된 두 다량체화 도메인은 유도된 또는 비-유도될 수 있는 상호작용 쌍을 구성한다. 도 21B는 도 21A에서 도시된 바와 같이, 2개의 이형이량체 복합체를 포함하는 이형사량체(heterotetrameric) 단백질 복합체를 나타낸다. 더 높은 차수의 복합체도 생각해볼 수 있다.
도 22 는 I형 수용체 폴리펩티드 (“I”로 나타냄) (가령, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인간 또는 다른 종의 ALK4 단백질의 세포외 도메인에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)와 II형 수용체 폴리펩티드 (“II”로 나타냄) (가령, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인간 또는 다른 종의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형화학성(heteromeric) 단백질 복합체의 도식적 예를 나타낸다. 도시된 구체예들에 있어서, I형 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 1 구성원 (“C₁”)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이며, 그리고 II형 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 2 구성원 (“C₂”)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 각 융합 폴리펩티드에서, 링커는 I형 또는 II형 수용체 폴리펩티드와 상호작용 쌍의 상응하는 구성요소 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제 1 및 제 2 구성원은 유도된 (비대칭) 쌍일 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 자가 결합보다는 서로에 선호적으로 결합된다는 것을 의미하고, 또는 상호작용 쌍은 비유도될 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 실제적으로 선호 없이 서로 결합되거나 또는 자가-결합될 수 있고 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 비유도된 상호작용 쌍의 실례이고, 반면 다양한 가공된 Fc 도메인은 유도된(비대칭) 상호작용 쌍으로서 설계되었다.[Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].
도 23A-23D는 ALK4 폴리펩티드 (가령, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인간 또는 다른 종의 ALK4 단백질의 세포외 도메인에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)와 ActRIIB 폴리펩티드(가령, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인간 또는 다른 종의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형화학성 단백질 복합체의 도식적 예를 나타낸다. 도시된 구체예들에 있어서, ALK4 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 1 구성원 (“C₁”)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이며, 그리고 ActRIIB 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 2 구성원 (“C₂”)을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 적합한 상호작용 쌍은 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 상호작용 쌍, 절두(truncations), 및 본 명세서에서 설명된 바와 같은 이의 변이체들 [가령, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]을 포함한다. 각 융합 폴리펩티드에서, 링커는 ALK4 또는 ActRIIB 폴리펩티드와 상호작용 쌍의 상응하는 구성요소 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제 1 및 제2 구성원들은 비유도될 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 실제적인 선호 없이 서로 결합되거나 또는 자가-결합될 수 있고, 그리고 따라서, 이들은 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 도 23A를 참고하라. 대안으로, 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 유도된(비대칭) 쌍일 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 자가 결합보다는 서로에 선호적으로 결합된다는 것을 의미한다. 도 23B를 참고하라. 더 높은 차수의 복합체도 생각해볼 수 있다. 도 23C 및 23D를 참고하라.

발명의 상세한 설명

1. 개요

TGF-β슈퍼패밀리는 TGF-베타, 액티빈, nodals, 뼈 형태발생 단백질 (BMPs), 성장 및 분화 인자 (GDFs), 그리고 항-Mullerian 호르몬 (AMH)을 포함하는 30가지 이상의 분비된 인자로 구성된다[Weiss 등 (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. 척추동물과 무척추동물 모두에서 발현되는 상기 슈퍼패밀리의 구성요소들은 동물의 평생 동안 발달의 가장 초기 단계에서 다양한 조직과 기능에 편재되어 발현된다. 게다가, TGF-β슈퍼패밀리 단백질은 줄기 세포의 자가 재생, 생식기, 분화, 기관 형태 형성 및 성인 조직 항상성의 핵심 매개체이다. 이러한 편재된 활성과 일관되게, TGF-베타 슈퍼패밀리의 비정상 신호전달은 예를 들면, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 섬유증 질환, 및 암이 포함된 다양한 인간 병리에 관련된다.

TGF-베타 슈퍼패밀리의 리간드들은 하나의 단량체의 중심 3-1/2 회전 나선이 다른 단량체의 베타-가닥에 의해 형성된 오목한 표면을 채우는 동일한 이량체 구조를 공유한다. 대다수의 TGF-베타 패밀리 구성요소들은 분자 내 이황화 결합으로 더욱 안정화된다. 이 디설파이드 결합은 다른 2 개의 디설파이드 결합에 의해 형성된 고리를 통과하는데, 이로써 '시스테인 매듭 (cysteine knot)'모티프로 불리는 것이 생성된다[Lin 등 (2006) Reproduction 132: 179-190; 그리고 Hinck 등 (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].

TGF-베타 슈퍼패밀리 신호전달은 리간드 자극 시 하류 SMAD 단백질 (가령, SMAD 단백질 1, 2, 3, 5, 및 8) 을 인산화시키고, 활성화시키는, I형 및 II형 세린/트레오닌 키나제 수용체의 이형화학성 복합체에 의해 매개된다[Massagu

e (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]. 이들 I형 및 II형 수용체는 시스테인-풍부한 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다. 일반적으로, I형 수용체는 세포내 신호전달을 매개하고, II형 수용체는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 결합에 필요하다. I형 및 II 수용체는 리간드 결합 후 안정적 복합체를 형성하여, II형 수용체에 의해 I형 수용체가 인산화된다.

TGF-베타 패밀리는 그들이 결합하는 I 형 수용체와 그들이 활성화시키는 Smad 단백질을 기준으로 두 가지 계통 발생적 분류로 나눌 수 있다. 하나는 더 최근에 생긴 분류로서, 가령, TGFβ액티빈, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 및 nodal을 포함하며, 이는 Smads 2 및 3을 활성화시키는 I형 수용체를 통하여 신호전달한다 [Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870]. 다른 분류는 좀더 거리가 먼 슈퍼패밀리 관련 단백질을 포함하는데, 가령, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6, 및 GDF7을 포함하며, 이들은 Smads 1, 5, 및 8을 통하여 신호전달한다.

액티빈은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성요소이며, 구성원이며 처음에는 난포-자극 호르몬의 분비 조절제로 밝혀졌지만, 이후 다양한 생식 및 비 생식-기능이 규명되었다. 2개의 밀접하게 관련된 β소단위 (β_Aβ_A, β_Bβ_B, 및 β_Aβ_B, 차례로)의 동형/이형이량체인 3가지 주요 액티변 형태(A, B, 및 AB)가 있다. 인간 게놈은 또한 주로 간에서 발현되는 액티빈 C 및 액티빈 E 를 인코드하고, 그리고 β_C 또는 β_E를 함유하는 이형이량체 형태 또한 공지되어 있다. TGF-베타 슈퍼패밀리에서, 액티빈은 난소 및 태반 세포에서 호르몬 생성을 자극하고, 신경 세포 생존을 지원하고, 세포 유형에 따라 세포주기 진행에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있고, 그리고 최소한 양서류 태아에서 중배엽 분화를 유도할 수 있는 독특하고 다기능적 요소다[DePaolo 등 (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson 등 (1997) Curr Biol. 7:81-84; 그리고 Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. 몇몇 조직에서, 액티빈 신호전달은 이것의 관련된 이형이량체, 인히빈에 의해 길항된다. 예를 들면, 뇌하수체로부터 난포-자극 호르몬 (FSH) 분비 조절에 있어서, 액티빈은 FSH 합성 및 분비를 촉진시키지만, 한편 인히빈은 FSH 합성 및 분비를 감소시킨다. 액티빈 생활성을 조절하고 및/또는 액티빈에 결합하는 다른 단백질은 폴리스타틴 (FS), 폴리스타틴-관련된 단백질 (FSRP, 또한 FLRG 또는 FSTL3으로도 알려짐), 및 α₂-마크로글로블린을 포함한다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이, 단리된 β소단위 또는 이량체 복합체 (가령, β_Aβ_A 동형이량체 또는 β_Aβ_B 이형이량체)에서 “액티빈 A”에 결합하는 물질은 β_A 소단위에 특이적으로 결합하는 물질이다. 이형이량체 복합체 (가령, β_Aβ_B이형이량체)의 경우, “액티빈 A”에 결합하는 물질은 β_A 소단위 안에 존재하는 에피토프(epitopes)에 특이적이지만, 이 복합체의 비-β_A 소단위 (가령, 복합체의 β_B 소단위 ) 안에 존재하는 에피토프에는 결합하지 않는다. 유사하게, “액티빈 A”를 길항(억제)하는 것으로 본 명세서에서 공개된 물질은 단리된 β_A 소단위 또는 이량체 복합체 (가령, β_Aβ_A 동형이량체 또는 β_Aβ_B 이형이량체)에서 β_A 소단위에 의해 중개되는 하나 또는 그 이상의 활성을 억제하는 물질이다. β_Aβ_B 이형이량체의 경우에, “액티빈 A”를 억제하는 물질은 β_A 아단위의 하나 또는 그 이상의 활성을 특이적으로 억제하지만, 복합체의 비-β_A 아단위 (가령, 복합체의 β_B아단위)의 활성을 억제하지 않는 물질이다. 이러한 원리는 “액티빈 B”“액티빈 C”및 “액티빈 E”에 결합하고 및/또는 이를 억제하는 물질에도 적용된다. “액티빈 AB”에 길항작용하는 본 명세서에 개시된 물질은 β_A 소단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성 및 β_B 소단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성을 억제하는 물질이다.

BMPs 및 GDFs는 함께, TGF-베타 슈퍼패밀리의 특징적인 폴드(characteristic fold)를 공유하는 시스테인-매듭 사이토카인의 패밀리를 형성한다. [Rider 등 (2010) Biochem J., 429(1):1-12]. 이 패밀리는 예를 들면, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (GDF10로도 알려짐), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (GDF2로도 알려짐), BMP10, BMP11 (GDF11로도 알려짐), BMP12 (GDF7로도 알려짐), BMP13 (GDF6로도 알려짐), BMP14 (GDF5로도 알려짐), BMP15, GDF1, GDF3 (VGR2로도 알려짐), GDF8 (미오스타틴로도 알려짐), GDF9, GDF15, 및 데카펜타플레직 (decapentaplegic)을 포함한다. 뼈 형성을 유도 할 수 있는 능력(이로 인하여 BMP로 불림)외에도, BMP/GDF는 광범위한 조직의 발생에 형태형성적 활성을 보여준다. BMP/GDF 동형-이량체 및 이형-이량체는 I 형과 II 형의 수용체 이량체의 조합과 상호작용하여, 여러 가지 가능한 신호 생성 복합체를 생성하고, SMAD 전사 인자의 두 경쟁 세트 중 하나의 활성화를 유도한다. BMP/GDFs는 매우 특이적이며, 국소화된 기능을 갖는다. 이들은 다양한 방식으로 조절되는데, BMP/GDF 발현의 발생 제한, 그리고 사이토카인에 고친화력으로 결합하는 몇 가지 특이적인 BMP 길항 단백질의 분비를 통하여 조절된다. 신기하게도, 다수의 이들 길항제들은 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드들과 유사하다.

성장 및 분화 인자-8 (GDF8)은 또한 미오스타틴으로 알려져 있다. GDF8은 골격근량의 음성 조절인자로써, 발생중인 그리고 성인 골격근에서 상당히 발현된다. 유전자삽입 생쥐에서 GDF8 null 돌연변이는 눈에 띄는 골격근의 비대 및 다형성을 특징으로 한다 [McPherron 등 Nature (1997) 387:83-90]. 소에서 자연 발생 GDF8 돌연변이에서 유사한 골격근량 증가가 명백하며, 그리고 인간에서 현저하게 나타난다 [Ashmore 등 (1974) Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur 등 Genome Res. (1997) 7:910-915; 그리고 Schuelke 등 (2004) N Engl J Med, 350:2682-8]. 연구에 따르면, 사람의 HIV 감염과 관련된 근육 소모는 GDF8 단백질 발현 증가를 수반한다[Gonzalez-Cadavid 등, PNAS (1998) 95:14938-43]. 또한, GDF8은 근육 특이적 효소 (예: 크레아틴 키나제)의 생산을 조절하고, 근섬유 세포 증식을 조절할 수 있다.[International Patent Application Publication No. WO 00/43781]. GDF8 프로펩티드(propeptide)는 성숙한 GDF8 도메인 이량체에 비공유 결합하여, 그 생물학적 활성을 불활성화시킬 수 있다 [Miyazono 등 (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield 등 (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; 그리고 Brown 등 (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. GDF8 또는 구조적으로 관련된 단백질에 결합하고, 이들의 생물학적 활성을 억제시키는 다른 단백질은 폴리스타틴, 그리고 잠재적으로, 폴리스타틴-관련된 단백질을 포함한다.[Gamer 등 (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].

BMP11로도 알려진, GDF11은 ,생쥐 발생 동안 꼬리싹(tail bud), 팔다리싹(limb bud), 상악 및 하악 아치, 그리고 후근 신경절에서 발현되는 분비 단백질이다. [McPherron 등 (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; 그리고 Nakashima 등 (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. GDF11은 중배엽 및 신경 조직 모두에서 패턴화에 독특한 역할을 한다. [Gamer 등 (1999) Dev Biol., 208:222-32]. GDF11은 병아리 날개 발달에있어서 연골 형성 및 근형성의 음성 조절자인 것으로 나타났다. [Gamer 등 (2001) Dev Biol., 229:407-20]. 근육에서 GDF11의 발현은 GDF8과 유사한 방식으로 근육 성장을 조절하는 역할을 암시한다. 또한, 뇌에서 GDF11의 발현은 GDF11이 또한 신경계의 기능과 관련된 활성을 가질 수 있음을 시사한다. 흥미로운 것은, GDF11은 후각 상피의 신경 발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다 [Wu 등 (2003) Neuron., 37:197-207]. 따라서, GDF11은 근육 질환 및 신경 퇴행성 질환(가령, 근위축성 측색 경화증)과 같은 질병의 치료에서 시험관내 및 생체내 적용될 수 있다.

본 명세서에서 입증된 바와 같이, 다양한 ActRIIA 및 ActRIIB-상호작용 리간드들에 결합하는 가용성 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형이량체는, PAH 모델에서 혈압 및 심장 비대 감소에 효과적이다. 임의의 특정 기전으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 물질들의 효과는 ActRIIA/B 신호전달 길항 효과에 의해 주로 유발되는 것으로 예상된다. 기전에 관계없이, 본 명세서에 제시된 데이터로부터 ActRIIA/B 신호전달 길항제들 (GDF/BMP 길항제들)은 혈압을 감소시키고, 심장 비대를 감소시키며, 폐 고혈압 치료에 있어서 다른 긍정적 효과들을 가짐이 명백하다. 혈압 및 비대는 동적이며, 변화는 혈압과 비대를 증가시키는 인자들 및 혈압과 비대를 감소시키는 인자들의 균형에 따라 달라짐을 유의하여야 한다. 혈압 및 심장 비대는 혈압과 심장 비대를 감소시키는 인자들을 증가시키거나, 혈압과 심장 비대 상승을 촉진시키는 인자들을 감소시키거나 또는 둘 모두에 의해 감소될 수 있다. 용어 혈압 감소 또는 심장 비대 감소는 혈압과 심장 조직에서 관찰가능한 신체적 변화를 지칭하며 변화를 일으키는 기전에 대해 중립적인 경향이 있다.

본 명세서에 기재된 연구에서 사용되었던 PAH에 관한 쥐 모델은 인간에서의 효능을 예측할 수 있는 것으로 간주되므로, 본 명세서는 ActRIIA 폴리펩티드, ALK4: ActRIIB이종다량체, 및 폐 고혈압 (예컨대, PAH)를 치료하기 위한 다른 GDF/BMP 길항제들을 사용하여, 특히, 인간에서 하나 이상의 폐 고혈압 합병증을 치료, 예방 또는 이의 중증도 또는 기간을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 용어 GDF/BMP 길항제들은, 예를 들어, 하나 이상의 ActRIIA/B 리간드 [예컨대, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 E, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10]를 억제하는 길항제들; 하나 이상의 I형 및/또는 II형 수용체들 (예컨대, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 ALK5)을 억제하는 길항제들; 및 하나 이상의 하류 신호전달 성분들 (예컨대, Smad 단백질, 가령, Smads 2 및 3)을 억제하는 길항제들을 비롯한, ActRIIA/B 신호전달을 길항하기 위해 사용될 수 있는 다양한 물질들을 지칭한다. 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용되는 GDF/BMP 길항제들은, 예를 들어, 리간드 트랩 (예컨대, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, ALK4: ActRIIB이형이량체, 폴리스타틴 폴리펩티드, 및 FLRG 폴리펩티드), 항체 길항제들 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 ALK5 중 하나 이상을 억제하는 항체들), 소분자 길항제들 [예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3) 중 하나 이상을 억제하는 소분자들], 및 뉴클레오티드 길항제들 [예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3) 중 하나 이상을 억제하는 뉴클레오티드 서열들]과 같은 다양한 형태들을 포함한다.

이 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 개시 내용 및 각 용어가 사용되는 특정 상황에서 당해 분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 명세서의 구성 및 방법을 설명하고, 이를 작성하고 사용하는 방법에 대해 숙련된 기술자에게 추가 지침을 제공하기 위해 아래 또는 다른 곳에서 논의된다. 어떤 용어의 사용의 범위나 의미는 그것이 사용되는 특정 상황에서 명백해질 것이다.

모든 문법적 형태 및 단어 변이에서 “상동성(homologous)”이란 동일한 유기체 종에서 슈퍼패밀리의 단백질을 포함하는 "공통적인 진화 기원"을 포함하는 두개 단백질간의 상관관계를 지칭하거나, 뿐만 아니라 상이한 유기체 종의 상동성 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질 (및 이의 인코딩 핵산)은 서열 상동성을 갖고, 동일성 (%) 또는 특정 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치의 존재 여부와 관계없이, 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적인 용도 및 본 출원에서, "상동성"이라는 용어는 "매우"와 같은 부사로 수식될 때 서열 유사성을 지칭할 수 있고, 일반적인 진화적 기원과 관련 될 수도 있고 또는 그렇지 않을 수도 있다.

용어 "서열 유사성 (sequence similarity)"은 모든 문법적 형태에서 일반적인 진화론적 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치 정도를 의미한다.

기준 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티이드) 서열에 대한 "서열 동일성 백분율(%)"은 후보 서열의 아미노산 잔기(또는 핵산)이 기준 폴리펩티드(뉴클레오티드) 서열에의 아미노산 잔기(또는 핵산)과 동일한 아미노산 잔기 (또는 핵산)의 백분율로 정의되는데, 이때 서열을 정렬시킨 후 최대 서열 동일성 백분율을 얻기 위하여 필요하다면 갭을 도입하고, 보존적 치환은 상기 서열의 동일성의 일부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 구현될 수 있다. 숙련된 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 (핵산) 서열 동일성 %값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 작성되었으며, 소스 코드(source code)는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 Genentech, Inc.에서 공개적으로 입수할 수 있으며, 소스 코드에서 컴파일 할 수도 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체제에서 사용을 위해 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 가변적이지 않다.

"항진하다(agonize)"는 모든 문법적 형태로 단백질 및/또는 유전자를 활성화 (예컨대, 단백질의 유전자 발현을 활성화 또는 증폭하거나 비활성 단백질을 활성화상태로 유도함으로써)하거나 단백질 및 단백질을 증가시키는 과정을 의미한다.

"길항하다(antagonize)"는 모든 문법적 형태로 단백질 및/또는 유전자를 억제(예컨대, 단백질의 유전자 발현을 억제 또는 감소시키거나 활성 단백질을 비활성화상태로 유도함으로써)하거나 단백질 및 단백질을 감소시키는 과정을 의미한다.

명세서 및 청구 범위에 걸쳐 수치와 관련하여 사용되는 용어 "약" 및 "대략"이란 숙련된 기술자에게 친숙하고 허용가능한 정확도의 구간을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 구간은 ± 10%이다. 대안으로, 그리고 특히 생물학적 계통에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 크기의 차수, 바람직하게는 ≤5 배, 보다 바람직하게는 ≤2 배 이내의 값을 의미 할 수 있다.

여기에 개시된 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.

용어 "하나" 는 사용되는 내용에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 용어 "하나 이상" 및 "최소한 하나"는 본 출원에서 호환적으로 사용된다. 또한, 본 출원에서 사용되는 "및/또는"은 둘 이상의 구체적인 특징들 또는 구성요소들 각각에 다른 특징이나 구성요소가 있거나 없는 것을 구체적으로 개시하기위해 사용되는 것이다. 그러므로, 가령, 본 출원에서 "A 및/또는 B"의 어구에서 사용시 용어 “및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 가령, "A, B, 및 / 또는 C"의 어구에서 사용시 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 양상들을 포함하는 것으로 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본 명세서 전반에 걸쳐, "포함한다(comprise)"라는 단어 또는 "포함하는(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수 그룹을 포함하지만, 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

2. ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, ALK4: ActRIIB 이형다량체, 및 이의 변이체

특정 양상들에서, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드 및 이의 용도 (예컨대, 폐 고혈압 또는 하나 이상의 폐 고혈압 합병증을 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소) 및/또는 간질성 폐 질환 (예컨대, 특발성 폐 섬유증)에 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “ActRII”는 II형 액티빈 수용체들의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리는 IIA형 액티빈 수용체 (ActRIIA) 및 IIB형 액티빈 수용체 (ActRIIB)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “ActRIIB”는 임의의 종으로부터 그리고 이 유발 또는 다른 변형에 의해 그러한 ActRIIB 단백질로부터 유래된 변이체로부터 액티빈 수용체 II형B (ActRIIB) 단백질의 패밀리를 나타낸다. ActRIIB의 지칭은 현재 확인된 형태중 하나를 지칭하는 것으로 이해된다. ActRIIB 패밀리의 구성요소는 시스테인-풍부 영역을 포함하는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 예상 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 이루어진 막경유 단백질이다.

용어 “폴리펩티드”는 또한 ActRIIB 패밀리 구성원의 자연 발생적 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 유용한 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드 유사체를 포함)를 포함한다. 이러한 변이체 ActRIIB 폴리펩티드들의 예는 본 명세서 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호. WO 2006/012627, WO 2008/097541, WO 2010/151426, 및 WO 2011/020045에서 제공되며, 이들은 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 ActRIIB 관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한, 하기에 제공된 인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (서열 번호: 1)의 넘버링에 기초한다.

인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:

신호 펩티드는 한줄 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시되며; 잠재적인 내인성 N-연결된 당화 부위는 두줄 밑줄로 표시된다.

가공된 (성숙) 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 2).

일부 구체예들에 있어서, N-말단에 “SGR…”서열을 갖는 상기 단백질이 만들어질 수 있다. 세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 한줄 밑줄로 나타낸다. “꼬리”가 결실된 서열(Δ서열)은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호: 3).

서열 번호: 1의 위치 64에 알라닌 (A64)을 갖는 ActRIIB 형태 또한 문헌에 보고되었다. 가령, Hilden 등 (1994) Blood, 83(8): 2163-2170 참고. A64 치환을 갖는 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 액티빈과 GDF11에 대하여 상대적으로 낮은 친화력을 가짐을 출원인이 확인하였다. 대조적으로, 위치 64에 아르기닌 (R64)을 갖는 동일한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 액티빈과 GDF11에 대하여 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위의 친화력을 가진다. 따라서, R64를 갖는 서열은 본 명세서에서 인간 ActRIIB의 "야생형(wild-type)”기준 서열로 이용된다.

위치 64에 알라닌을 갖는 ActRIIB 형태는 다음과 같다:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGS G RGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE

51 GEQDKRLHCY ASWANSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV VVHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (서열 번호: 4)

신호 펩티드는 한줄 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시된다.

대체 A64 형태의 가공된 (성숙) 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 5)

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호: 6)

인간 ActRIIB 전구체 단백질를 인코드하는 핵산 서열은 하기에 나타내며(서열 번호: 7), 이는 Genbank 기준 서열 NM_001106.3의 뉴클레오티드 25-1560을 나타내며, 이것은 ActRIIB 전구체의 아미노산 1-513를 인코드한다. 나타낸 바와 같이, 서열은 위치 64에 아르기닌을 제공하며, 대신 알라닌을 제공하기 위하여 변형될 수 있다. 신호 서열은 밑줄로 표시된다.

1 ATGACGGCGC CCTGGGTGGC CCTCGCCCTC CTCTGGGGAT CGCTGTGCGC

51 CGGCTCTGGG CGTGGGGAGG CTGAGACACG GGAGTGCATC TACTACAACG

101 CCAACTGGGA GCTGGAGCGC ACCAACCAGA GCGGCCTGGA GCGCTGCGAA

151 GGCGAGCAGG ACAAGCGGCT GCACTGCTAC GCCTCCTGGC GCAACAGCTC

201 TGGCACCATC GAGCTCGTGA AGAAGGGCTG CTGGCTAGAT GACTTCAACT

251 GCTACGATAG GCAGGAGTGT GTGGCCACTG AGGAGAACCC CCAGGTGTAC

301 TTCTGCTGCT GTGAAGGCAA CTTCTGCAAC GAACGCTTCA CTCATTTGCC

351 AGAGGCTGGG GGCCCGGAAG TCACGTACGA GCCACCCCCG ACAGCCCCCA

401 CCCTGCTCAC GGTGCTGGCC TACTCACTGC TGCCCATCGG GGGCCTTTCC

451 CTCATCGTCC TGCTGGCCTT TTGGATGTAC CGGCATCGCA AGCCCCCCTA

501 CGGTCATGTG GACATCCATG AGGACCCTGG GCCTCCACCA CCATCCCCTC

551 TGGTGGGCCT GAAGCCACTG CAGCTGCTGG AGATCAAGGC TCGGGGGCGC

601 TTTGGCTGTG TCTGGAAGGC CCAGCTCATG AATGACTTTG TAGCTGTCAA

651 GATCTTCCCA CTCCAGGACA AGCAGTCGTG GCAGAGTGAA CGGGAGATCT

701 TCAGCACACC TGGCATGAAG CACGAGAACC TGCTACAGTT CATTGCTGCC

751 GAGAAGCGAG GCTCCAACCT CGAAGTAGAG CTGTGGCTCA TCACGGCCTT

801 CCATGACAAG GGCTCCCTCA CGGATTACCT CAAGGGGAAC ATCATCACAT

851 GGAACGAACT GTGTCATGTA GCAGAGACGA TGTCACGAGG CCTCTCATAC

901 CTGCATGAGG ATGTGCCCTG GTGCCGTGGC GAGGGCCACA AGCCGTCTAT

951 TGCCCACAGG GACTTTAAAA GTAAGAATGT ATTGCTGAAG AGCGACCTCA

1001 CAGCCGTGCT GGCTGACTTT GGCTTGGCTG TTCGATTTGA GCCAGGGAAA

1051 CCTCCAGGGG ACACCCACGG ACAGGTAGGC ACGAGACGGT ACATGGCTCC

1101 TGAGGTGCTC GAGGGAGCCA TCAACTTCCA GAGAGATGCC TTCCTGCGCA

1151 TTGACATGTA TGCCATGGGG TTGGTGCTGT GGGAGCTTGT GTCTCGCTGC

1201 AAGGCTGCAG ACGGACCCGT GGATGAGTAC ATGCTGCCCT TTGAGGAAGA

1251 GATTGGCCAG CACCCTTCGT TGGAGGAGCT GCAGGAGGTG GTGGTGCACA

1301 AGAAGATGAG GCCCACCATT AAAGATCACT GGTTGAAACA CCCGGGCCTG

1351 GCCCAGCTTT GTGTGACCAT CGAGGAGTGC TGGGACCATG ATGCAGAGGC

1401 TCGCTTGTCC GCGGGCTGTG TGGAGGAGCG GGTGTCCCTG ATTCGGAGGT

1451 CGGTCAACGG CACTACCTCG GACTGTCTCG TTTCCCTGGT GACCTCTGTC

1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC (서열 번호: 7)

가공된 세포외 인간 ActRIIB 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 다음과 같다 (서열 번호: 8). 나타낸 바와 같이, 서열은 위치 64에 아르기닌을 제공하며, 대신 알라닌을 제공하기 위하여 변형될 수 있다.

1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG

51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC

101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC

151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA

201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT

251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAACGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT

301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACC

(서열 번호: 8)

인간 ActRIIB 세포외 도메인과 인간 ActRIIA 세포외 도메인의 아미노산 서열 정렬은 도 1에 도시된다. 이 정렬은 ActRII 리간드에 직접 접촉하는 것으로 보이는 두 수용체 내의 아미노산 잔기들을 나타낸다. 예를 들면, 상기 복합체 ActRII 구조에서 ActRIIB-리간드 결합 포켓은, 부분적으로, 잔기 Y31, N33, N35, L38 내지 T41, E47, E50, Q53 내지 K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, A92, 및 E94 내지 F101로 정의됨을 나타낸다. 이들 위치에서, 보존 돌연변이가 용인될 것으로 예상된다.

또한, ActRIIB는 척추동물간에 잘-보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레취(stretches)는 완벽하게 보존된다. 예를 들면, 도 2는 인간 ActRIIB 세포외 도메인의 다수-서열 정렬을 다양한 ActRIIB 이종상동성 유전자(orthologs)와 비교하여 도시한다. ActRIIB에 결합하는 많은 리간드들이 잘 보존되어 있다. 따라서, 이들 정렬로부터, ActRIIB- 리간드 결합의 정상적 활성에 중요한 리간드 결합 도메인 내에서의 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 ActRIIB- 리간드 결합 활성을 크게 변화시키지 않으면서 치환을 용인할 수 있는 아미노산 위치를 예측할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성을 가진 인간 ActRIIB 변이체 폴리펩티드는 다른 척추 동물 ActRIIB의 서열의 상응하는 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추 동물 서열에서와 유사한 잔기를 포함 할 수 있다. 다음 실시예들은 활성 ActRIIB 변이체를 정의하는 접근법을 설명하지만, 이에 제한하고자 함은 아니다. 인간 세포외 도메인 (서열 번호: 2)의 L46은 제노푸스(xenopus) ActRIIB (서열 번호: 58)에서 발린이며, 따라서 이 위치는 변경될 수 있고, 선택적으로 또다른 소수성 잔기, 가령, V, I 또는 F로 변경될 수 있거나, 또는 비-극성 잔기 가령, A로 변경될 수 있다. 인간 세포외 도메인에서 E52는 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 부위가 다양한 광범위한 변화, 가령, 극성 잔기, 가령, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y 그리고 아마도 A를 포함하는 변화를 용인할 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 T93은 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 다양한 구조적 변이를 용인하는데, 극성 잔기, 가령, S, K, R, E, D, H, G, P, G 및 Y를 선호함을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 F108은 제노푸스에서 Y이며, 따라서 Y 또는 다른 소수성 기, 가령, I, V 또는 L이 용인되어야 함을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 E111은 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 D, R, K 및 H, 뿐만 아니라 Q와 N을 포함하는 하전된 잔기가 용인될 수 있음을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 R112는 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 R 및 H를 포함하는 염기성 잔기가 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 위치 119의 A는 상대적으로 덜 보존되며, 설치류에서는 P이고, 제노푸스에서는 V이며, 따라서 이 위치는 기본적으로 임의의 아미노산이 용인되어야 함을 나타낸다.

더욱이, ActRII 단백질은 해당 분야에서 구조적 및 기능적 특징, 특히 리간드 결합에 관해 특성화되었던 바 있다[Attisano 등 (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 등 (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph 등 (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson 등 (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 제: 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 본 출원의 개시내용 외에도, 이들 참고 문헌은 하나 또는 그 이상의 정상 활성 (예: 리간드 결합 활성)을 보유하는 ActRIIB 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.

예를 들면, 3 개-핑거 톡신 폴드(three-finger toxin fold)로 알려진 구조적 모티프는 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며, 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 안에 다양한 위치에 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다. [Greenwald 등 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이러한 보존된 시스테인의 가장 바깥쪽에 의해 경계가 표시되는 인간 ActRIIB의 코어 리간드-결합 도메인은 서열 번호:1 1(ActRIIB 전구체)의 29-109 위치에 상응한다. 이러한 시스테인으로 경계가 표시되는 코어 서열에 인접한 구조적으로 덜 규칙적인 아미노산은 반드시 리간드 결합을 바꾸지 않고도 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 잔기 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개 잔기가 절두될 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 절두에 대한 예시적인 ActRIIB 세포외 도메인은 서열 번호: 2, 3, 5, 및 6을 포함한다.

Attisano 외.는 ActRIIB의 세포외 도메인의 C- 말단에서 프롤린 결절의 결손은 액티빈에 대한 수용체의 친화력을 감소시킴을 보여 주었다. 본 서열 번호: 1의 아미노산 20-119을 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, “”는 ActRIIB(20-134)-Fc와 비교하여 GDF11 및 액티빈에 감소된 결합을 가지며, 이는 프롤린 매듭 영역 및 완벽한 막근접 (juxtamembrane) 도메인을 포함한다 (가령, 미국 특허 제 7,842,663호 참고). 그러나, ActRIIB(20-129)-Fc 단백질은 프롤린 매듭 영역이 파괴되었다 하더라도, 야생형에 비해 유사하지만 다소 감소된 활성을 유지한다.

따라서, (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129에서 종료되는 ActRIIB 세포외 도메인은 모두 활성인 것으로 예상되지만, 134 또는 133에서 종료되는 구조체는 대부분이 활성일 수 있을 것이다. 유사하게, (서열 번호: 1에 대하여) 잔기 129-134 중 임의의 위치에서의 돌연변이는 리간드-결합 친화력을 큰 폭으로 변경시키지 않을 것으로 예상된다. 이를 뒷받침하는 것으로, (서열 번호: 1에 대하여) P129 및 P130의 돌연변이는 실질적으로 리간드 결합을 감소시키지 않는 것으로 알려져있다. 따라서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 아미노산 109 (최종 시스테인)와 같이 조기에 종료될 수 있지만, 그러나, 109와 119에서 또는 그 사이 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119)에서 종료되는 형태들은 감소된 리간드 결합을 가질 것으로 예상된다. (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 119는 잘 보존되지 않고, 따라서 용이하게 변경 또는 절두된다. (서열 번호: 1에 대하여) 128에서 또는 그 이후에 종료되는 ActRIIB 폴리펩티드들은 리간드-결합 활성을 유지해야만 한다. 서열 번호: 1에 대하여 119와 127에서, 또는 그 사이 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127)에서 종료되는 ActRIIB 폴리펩티드들은 중간 결합 능력을 가질 것이다. 임의의 이들 형태들은 임상 또는 실험 환경에 따라 사용되는 것이 바람직할 수 있다.

ActRIIB의 N-말단에서, (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 29 또는 그 전에 시작하는 단백질은 리간드-결합 활성을 보유할 것으로 예상된다. 아미노산 29는 초기 시스테인을 나타낸다. (서열 번호: 1에 대하여) 위치 24에서 알라닌-에서-아스파라긴으로의 돌연변이는 리간드 결합에 실질적으로 영향을 주지 않고 N-연계된 당화 서열을 도입시킨다 [미국 특허 제 7,842,663]. 이로써 신호 절단(cleavage) 펩티드와 아미노산 20-29에 상응하는 시스테인 교차(cross)-연계된 영역에서의 돌연변이는 잘 용인된다는 것이 확인된다. 구체적으로, (서열 번호: 1에 대하여) 위치 20, 21, 22, 23, 및 24에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드들은 전반적으로 리간드-결합 활성을 유지하여야 하고, (서열 번호: 1에 대하여) 위치 25, 26, 27, 28, 및 29에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드들 또한 리간드-결합 활성을 유지할 것으로 예상된다. 예컨대, 미국 특허 제 7,842,663은, 놀랍게도, 22, 23, 24, 또는 25에서 시작되는 ActRIIB 구조체가 최고 활성을 가지게 될 것임을 입증하였다.

종합하면, ActRIIB의 활성 부분 (예컨대, 리간드-결합 부분)에 관한 일반식은 서열 번호: 1의 아미노산 29-109를 포함한다. 따라서 ActRIIB 폴리펩티드들은 예를 들면, 서열 번호: 1의 아미노산 20-29 중 임의의 하나에 대응하는 잔기 (가령, 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 임의의 하나의 아미노산 109-134에 대응하는 잔기에서 종료되는 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIB의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 예로는 서열 번호: 1의 위치 20-29 (가령, 위치 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나) 또는 21-29 (가령, 위치 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 위치 119-134 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나), 119-133 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133중 임의의 하나), 129-134 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134), 또는 129-133 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 또는 133중 임의의 하나)에서 끝나는 폴리펩티드들을 포함한다. 다른 예로는 서열 번호: 1의 위치 20-24 (가령, 위치 20, 21, 22, 23, 또는 24중 임의의 하나), 21-24 (가령, 위치 21, 22, 23, 또는 24중 임의의 하나), 또는 22-25 (가령, 위치 22, 22, 23, 또는 25중 임의의 하나)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 위치 109-134 (가령, 위치 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나), 119-134 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나) 또는 129-134 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나)에서 종료되는 구조체들을 포함한다. 이 범위 내의 변이체들, 특히, 서열 번호: 1의 해당부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 변이체들이 또한 고려된다.

본 명세서에 설명된 변형은 다양한 방식으로 조합 될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, ActRIIB 변이체는 리간드-결합 포켓내에 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 보존 아미노산을 포함하고, 선택적으로 리간드-결합 포켓내에 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에 0, 1, 또는 그 이상의 비-보존 변경을 포함한다. 변이성이 특히 잘 용인될 수 있는 결합 포켓 외부의 부위들은 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 (상기 언급한 바와 같음) 및 (서열 번호: 1에 대하여) 위치 42-46 및 65-73 을 포함한다. 위치 65에서 아스파라긴에서-알라닌으로의 변경(N65A)은 R64 배경에서 리간드 결합을 감소시키는 것으로 보이지 않는다 [미국 특허 제 7,842,663]. 이 변화는 아마도 A64 배경에서 N65의 당화를 제거하므로, 이 영역에서의 유의한 변화가 용인될 수 있음을 입증한다. R64A 변화가 잘 용인되지는 않지만, R64K는 잘 용인되고, 따라서 H와 같은 또 다른 염기성 잔기는 64 번 위치에서 용인될 수 있다[미국 특허 제 7,842,663]. 추가적으로, 해당 분야에 기재된 돌연변이 유발 프로그램의 결과는 ActRIIB에서 종종 보존에 유익한 아미노산 위치들이 있음을 나타낸다. 서열 번호: 1에 있어서, 이들은 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성, 특히 트립토판), 위치 37 (산성, 특히 아스파르트산 또는 글루탐산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)을 포함한다. 따라서, 본 명세서는 ActRIIB 폴리펩티드들에서 보존될 수 있는 아미노산의 틀을 제공한다. 보존되는 것이 바람직할 수 있는 기타 위치는 다음과 같다: 모두 서열 번호:1에 대하여 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된, 특히 E, D, R 또는 K).

ActRIIB 세포외 도메인에 N-연계된 당화 부위 (N-X-S/T)를 추가 첨가하는 것이 잘 용인된다는 것은 이미 입증되었다(가령, 미국 특허 제 7,842,663 참고). 따라서, N-X-S/T 서열은 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드에서 도 1에 정의된 리간드 결합 포켓 외부의 위치로 일반적으로 도입될 수 있다. 비-내인성 N-X-S/T 서열의 도입에 특히 적합한 부위에는 (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134가 포함된다. N-X-S/T 서열들은 ActRIIB 서열과 Fc 도메인 또는 그 외 융합 구성성분 간의 링커기에, 뿐만 아니라 선택적으로 융합 구성성분 자체에 도입될 수 있다. 이러한 부위는 기존 S 또는 T에 대하여 정확한 위치에 N을 도입함으로써, 또는 기존 N에 대하여 정확한 위치에 S 또는 T를 도입함으로써 최소한의 노력으로 도입될 수 있다. 따라서, N-연계된 당화 부위를 만들어낼 수 있는 바람직한 변경은 다음과 같다: A24N, R64N, S67N (N65A 변경과 조합 가능), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T (서열 번호: 1에 대하여). 당화될 것으로 예측되는 임의의 S는 당화에 의해 제공되는 보호 때문에 면역원성 부위를 생성하지 않고, T로 변형될 수 있다. 유사하게, 당화될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서, 변경 S67T 및 S44T (서열 번호: 1에 대하여)가 고려된다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변경이 이용될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 상기에 기재된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 추가, 비-내인성 N-연계된 당화 공통 서열을 보유한 변이체일 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 명세서는 하나의 ActRIIB 폴리펩티드 (이의 단편, 기능적 변이체, 및 변형된 형태들을 포함)를 포함하는 GDF/BMP 길항제들 (억제제) 및 이의 용도 (예컨대, PH 또는 하나 이상의 PH-관련 합병증 치료 또는 예방)에 관한 것이다. 바람직하게는, ActRIIB 폴리펩티드들은 가용성이다 (가령, ActRIIB의 세포외 도메인 포함). 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP15, 및 BMP10]의 활성 (예컨대, Smad 신호전달)을 길항한다. 그러므로, 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP15, 및 BMP10]에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의의 아미노산 20-29에 대응하는 잔기 (가령, 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나에서 시작)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 아미노산 109-134에 대응하는 위치 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나에서 종료되는)에서 종료되는 ActRIIB의 부분에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 해당하는 위치는 산성 아미노산 (자연 발생 산성 아미노산 D 및 E 또는 인공 산성 아미노산)이다. 특정 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 특정 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118, 및 120 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118, 및 120 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하거나 이러한 폴리펩티드로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이 아니다 (즉, 자연 발생 산성 아미노산 D 또는 E 또는 인공 산성 아미노산 잔기가 아님).

특정 구체예에서, 본 출원은 ActRIIA 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “”는 임의의 종으로부터 얻은 액티빈 수용체 IIA형 (ActRIIA) 단백질 그리고 이러한 ActRIIA 단백질로부터 돌연변이 유발 또는 다른 변형에 의해 유도된 변이체의 패밀리를 나타낸다. ActRIIA의 지칭은 현재 나타낸 형태들 중 하나에 대한 지칭으로 이해하면 된다. ActRIIA 패밀리의 구성원들은 시스테인-풍부 영역을 가지는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 예상 세린/트레오닌 키나아제 활성을 가지는 세포질 도메인으로 이루어진 막경유 단백질이다.

용어 “폴리펩티드”는 ActRIIA 패밀리 구성원의 자연 발생적 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 유용한 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드 모방체 형태들을 포함함)를 포함한다. 이러한 변이체 ActRIIA 폴리펩티드들의 예는 본 명세서 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호. WO 2006/012627 및 WO 2007/062188에서 제공되며, 이의 전문은 본 명세서에 참고자료로 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 ActRIIA 관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한, 하기에 제공된 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열 (서열 번호: 9)의 넘버링에 기초한다.

표준 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:

가공된(성숙) 세포외 인간 ActRIIA 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (서열 번호: 10)

세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 한줄 밑줄로 나타낸다. “꼬리”가 결실된 서열(Δ서열)은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (서열 번호: 11)

인간 ActRIIA 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 하기에 나타내며 (서열 번호: 12), 이는Genbank 기준 서열 NM_001616.4의 뉴클레오티드 159-1700에 따른다. 신호 서열은 밑줄로 표시된다.

1 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc

51 ttcaggtgct atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta

101 atgctaattg ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt

151 tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat

201 ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca

251 actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta

301 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt

351 tccggagatg gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc

401 caccctatta caacatcctg ctctattcct tggtgccact tatgttaatt

451 gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg tacaggcatc acaagatggc

501 ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca cccccacctt

551 ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg

601 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc

651 tgtcaaaata tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg

701 aagtctacag tttgcctgga atgaagcatg agaacatatt acagttcatt

751 ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat gtggatcttt ggctgatcac

801 agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag gctaatgtgg

851 tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg

901 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc

951 catatctcac agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc

1001 tgacagcttg cattgctgac tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc

1051 aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt ggtacccgga ggtacatggc

1101 tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat gcatttttga

1151 ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc

1201 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga

1251 ggaaattggc cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc

1301 ataaaaaaaa gaggcctgtt ttaagagatt attggcagaa acatgctgga

1351 atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa tgttgggatc acgacgcaga

1401 agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc cagatgcaga

1451 gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg

1501 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta (서열 번호: 12)

가공된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIA 폴리펩티드의 핵산 서열은 다음과 같다:

1 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg

51 ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca

101 aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc

151 attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca actgctatga

201 caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta tatttttgtt

251 gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg

301 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc(서열 번호:13)

ActRIIA는 척추동물간에 잘-보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레취(stretches)는 완벽하게 보존된다. 예를 들면, 도 3은 다양한 ActRIIA 이종상동성 유전자(orthologs)와 비교하여 인간 ActRIIA 세포외 도메인의 다수의-서열 정렬을 도시한다. ActRIIA에 결합하는 많은 리간드들이 상당히 보존되어 있다. 따라서, 이들 정렬로부터, ActRIIA- 리간드 결합의 정상적 활성에 중요한 리간드 결합 도메인 내에서의 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 ActRIIA- 리간드 결합 활성을 크게 변화시키지 않으면서 치환을 용인할 수 있는 아미노산 위치를 예측할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성을 가진 인간 ActRIIA 변이체 폴리펩티드는 다른 척추 동물 ActRIIA의 서열의 상응하는 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추 동물 서열에서와 유사한 잔기를 포함 할 수 있다.

다음 예들은 활성 ActRIIA 변이체를 정의하는 방법을 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 도 3에 도시된 바와 같이, 인간 세포외 도메인에서의 F13은 오비스 아리에스 (서열 번호: 62), 갈루스 갈루스 (서열 번호: 65), 보스 타우루스 (서열 번호: 66), 타이토 알바 (서열 번호: 67), 및 마이오티스 다비디 (서열 번호: 68) ActRIIA에서 Y이며, 이것은 F, W, 및 Y를 비롯한 방향족 잔기들이 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 Q24는 보스 타우루스 ActRIIA에서 R이며, 이는 D, R, K, H, 및 E를 비롯한 하전된 잔기들이 이 위치에서 용인될 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 S95는 갈루스 갈루스 및 타이토 알바 ActRIIA에서 F이며, 이는 극성 잔기들, 가령, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 및 아마도 소수성 잔기, 가령, L, I, 또는 F를 비롯한 널리 다양한 변화가 이 부위에서 용인될 수 있음을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 E52는 오비스 아리에스 ActRIIA에서 D이며, 이는 D 및 E를 비롯한 산성 잔기들이 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 P29는 상대적으로 잘 보존되지 않아, 오비스 아리에스 ActRIIA에서 S 그리고 마이오티스 다비디 ActRIIA에서 L로 나타나는 것이므로, 본질적으로 임의의 아미노산은 이 위치에서 용인되어야 한다.

더욱이, 상기 논의한 바와 같이, ActRII 단백질은 당해 분야에서 구조적/기능적 특징, 특히, 리간드 결합에 관해 특성화되었다 [Attisano 외. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 외. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph 외. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson 외. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 제 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 본 출원에 개시된 내용 이외에도, 이들 참고 문헌은 하나 또는 그 이상의 원하는 활성 (예컨대, 리간드-결합 활성)을 보유하는 ActRII 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.

예를 들면, 3 개-핑거 톡신 폴드(three-finger toxin fold)로 알려진 구조적 모티프는 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며, 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 안에 다양한 위치에 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다. [Greenwald 등 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이렇게 보존된 시스테인들의 가장 바깥쪽에 의해 경계가 표시되는 인간 ActRIIA의 핵심 리간드-결합 도메인은 서열 번호 9 (ActRIIA 전구체)의 30-110 위치에 해당한다. 따라서, 이러한 시스테인으로 경계가 표시되는 코어 서열에 인접한 구조적으로 덜 규칙적인 아미노산은 반드시 리간드 결합을 바꾸지 않고도 N-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 잔기 그리고 C-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 잔기가 절두될 수 있다. 예시적인 ActRIIA 세포외 도메인들의 절두부들은 서열 번호: 10 및 11을 포함한다.

따라서, ActRIIA의 활성 부분 (예컨대, 리간드 결합)에 대한 일반적인 형식은 서열 번호: 9의 아미노산 30-110을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 구성되는 폴리펩티드이다. 따라서 ActRIIA 폴리펩티드들은 예를 들면, 서열 번호: 9의 아미노산 21-30 중 임의의 하나에 대응하는 잔기 (가령, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30)에서 시작하고, 서열 번호: 9의 임의의 하나의 아미노산 110-135에 대응하는 잔기에서 종료되는 (가령, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIA의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 예들은 서열 번호: 9의 21-30 (예컨대, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 22-30 (예컨대, 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 23-30 (예컨대, 아미노산 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 24-30 (예컨대, 아미노산 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작)에서 선택된 위치에서 시작하여, 서열 번호: 9의 111-135 (예컨대, 아미노산 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 임의의 하나에서 종료), 112-135 (예컨대, 아미노산 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 113-135 (예컨대, 아미노산 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 120-135 (예컨대, 아미노산 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 130-135 (예컨대, 아미노산 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 111-134 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 어느 하나에서 종료), 111-133 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133 중 어느 하나에서 종료), 111-132 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132 중 어느 하나에서 종료), 또는 111-131 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 중 어느 하나에서 종료)에서 선택된 위치에서 종료하는 구조체를 포함한다. 이 범위 내의 변이체들, 특히, 서열 번호: 9의 해당부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되는 변이체들이 또한 고려된다. 그러므로, 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이러한 폴리펩티드로 본질적으로 구성되거나 또는 구성될 수 있다. 선택적으로, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 리간드 결합 포켓에서 1, 2, 5, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예들에서, 본 출원은 ActRIIA 폴리펩티드 (이의 단편, 기능적 변이체, 및 변형된 형태들을 포함)를 포함하는 GDF/BMP 길항제들 (억제제) 및 이의 용도 (예컨대, 필요로 하는 환자의 면역 반응 증가 및 암 치료)에 관한 것이다. 바람직하게는, ActRIIA 폴리펩티드들은 가용성이다 (가령, ActRIIA의 세포외 도메인). 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP15, 및/또는 BMP10]의 활성 (예컨대, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP15, 및/또는 BMP10]에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 21-30에 대응하는 잔기에서 시작하고 (가령, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 서열 번호: 9의 아미노산 110-135에 대응하는 위치에서 종료되는 (가령, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIA의 부분에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 특정 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 32, 36, 및 39 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성된다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서는 GDF 트랩 폴리펩티드 ( “트랩”으로도 또한 지칭됨)에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF 트랩은 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, “야생형” 또는 비변형된 ActRII 폴리펩티드)의 세포외 도메인 (또한 리간드-결합 도메인으로도 지칭됨)에서 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 아미노산 부가, 결실, 치환, 및 이의 조합)를 포함하는 변이체 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)이며, 이러한 변이체 ActRII 폴리펩티드는 대응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 변형된 리간드-결합 활성을 가진다. 바람직한 구체예들에서, 본 명세서의 GDF 트랩 폴리펩티드는 대응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드와 최소한 하나의 유사한 활성을 유지한다. 예를 들면, 바람직한 GDF 트랩은 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하여, 이의 기능을 억제(가령, 길항)한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 GDF 트랩은 GDF/BMP의 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합하여, 이를 억제한다. 따라서, 본 명세서는 하나 이상의 ActRII 리간드들에 대한 변형된 결합 특이성을 가지는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.

이를 설명하기 위해, 하나 이상의 ActRII-결합 리간드들, 가령, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E), 특히 액티빈 A에 대하여보다 GDF11 및/또는 GDF8에 대해, 변형된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이가 선택될 수 있다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은, 야생형 리간드-결합 도메인의 비율과 비교하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 결합에 대한 K_d 대 GDF11 및/또는 GDF8 결합에 대한 K_d의 비율을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 야생형 리간드-결합 도메인에 비해, 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 A의 억제에 관한 IC₅₀ 대 GDF11 및/또는 GDF8의 억제에 관한 IC₅₀ 의 비율을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 액티빈의 억제에 관한 IC₅₀ 보다 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 작은 IC₅₀으로 GDF11 및/또는 GDF8을 억제한다.

ActRIIB 단백질들의 아미노산 잔기들 (예컨대, 서열 번호: 1에 대해 E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80, 및 F101)은 ActRIIB 리간드-결합 포켓에 존재하며, 예를 들면, 액티빈 A, GDF11, 및 GDF8을 비롯한 그 리간드들에 대한 매개 결합을 돕는다. 그러므로 본 명세서는 이들 아미노산 잔기들에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, ActRIIB 수용체의 변형된-리간드 결합 도메인 (예컨대¸ GDF8/GDF11-결합 도메인)을 포함하는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.

구체적인 예로서, ActRIIB의 리간드-결합 도메인의 양으로 하전된 아미노산 잔기 Asp (D80)를 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 GDF8에 선호적으로 결합하나, 액티빈에는 결합하지 않는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호: 1에 대해 D80 잔기는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 잔기로 변화된다: 하전되지 않은 아미노산 잔기, 음의 아미노산 잔기, 및 소수성 아미노산 잔기. 추가 특정 예로써, 서열 번호: 1의 소수성 잔기 L79는 변경된 액티빈-GDF11/GDF8 결합 성질을 부여하기 위하여, 변경될 수 있다. 예를 들면, L79P 치환은 액티빈 결합보다 더 큰 정도로 GDF11 결합을 감소시킨다. 대조적으로, L79의 산성 아미노산으로의 치환 [아스파르트산 또는 글루탐산; L79D 또는 L79E 치환]은 액티빈 A 결합 친화성을 상당히 감소시키는 반면 GDF11 결합 친화력을 유지시킨다. 예시적인 구체예들에서, 본 명세서에서 기재된 방법은 GDF 트랩 폴리펩티드를 이용하는데, 이는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 치환, 추가, 또는 결손과 복합되어, 서열 번호: 1의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산 (가령, D 또는 E) 을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드다.

특정 양상들에서, 본 명세서는 ALK4 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “”는 임의의 종으로부터 그리고 이 유발 또는 다른 변형에 의해 그러한 ALK4 단백질로부터 유래된 변이체로부터 액티빈 수용체-유사 키나제-4 단백질의 패밀리를 나타낸다. ALK4의 지칭은 현재 나타낸 형태들 중 하나에 대한 지칭으로 이해하면 된다. ALK4 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 예상 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 이루어진 막경유 단백질이다.

용어 “폴리펩티드”는 뿐만 아니라 ALK4 패밀리 구성원의 자연 발생적 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 유용한 활성을 보유하는 그의 임의의 변이체 (돌연변이 체, 단편, 융합체 및 펩티드 유사체를 포함함)를 포함한다. 본원에 기재된 모든 ALK4-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한, 하기에 제공된 인간 ALK4 전구체 단백질 서열 (서열 번호: 100)의 넘버링에 기초한다.

인간 ALK4 전구체 단백질 서열 (NCBI 참고 서열 NP_004293)은 다음과 같다:

1 maesagassf fplvvlllag sgg sgprgvq allcactscl qanytcetdg acmvsifnld

61 gmehhvrtci pkvelvpagk pfyclssedl rnthccytdy cnridlrvps ghlkepehps

121 mwgpvelvgi iagpvfllfl iiiivflvin yhqrvyhnrq rldmedpsce mclskdktlq

181 dlvydlstsg sgsglplfvq rtvartivlq eiigkgrfge vwrgrwrggd vavkifssre

241 erswfreaei yqtvmlrhen ilgfiaadnk dngtwtqlwl vsdyhehgsl fdylnrytvt

301 iegmiklals aasglahlhm eivgtqgkpg iahrdlkskn ilvkkngmca iadlglavrh

361 davtdtidia pnqrvgtkry mapevldeti nmkhfdsfkc adiyalglvy weiarrcnsg

421 gvheeyqlpy ydlvpsdpsi eemrkvvcdq klrpnipnww qsyealrvmg kmmrecwyan

481 gaarltalri kktlsqlsvq edvki (서열 번호: 100)

가공된 세포외 인간 ALK4 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

SGPRGVQALLCACTSCLQANYTCETDGACMVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCLSSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLKEPEHPSMWGPVE (서열 번호: 101)

인간 ALK4 전구체 단백질을 인코드하는 핵산 서열은 하기에 나타내며(서열 번호: 102), 이는 Genbank 기준 서열 NM_004302.4의 뉴클레오티드 78-1592에 상응한다. 신호 서열은 한줄 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시된다.

ATGGCGGAGTCGGCCGGAGCCTCCTCCTTCTTCCCCCTTGTTGTCCTCCTGCTCGCCGGCAGCGGCGGG TCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGGCCAACTACACGTGTGAGACAGATGGGGCCTGCATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAGCTGGTAGGCATCATCGCCGGCCCGGTGTTCCTCCTGTTCCTCATCATCATCATTGTTTTCCTTGTCATTAACTATCATCAGCGTGTCTATCACAACCGCCAGAGACTGGACATGGAAGATCCCTCATGTGAGATGTGTCTCTCCAAAGACAAGACGCTCCAGGATCTTGTCTACGATCTCTCCACCTCAGGGTCTGGCTCAGGGTTACCCCTCTTTGTCCAGCGCACAGTGGCCCGAACCATCGTTTTACAAGAGATTATTGGCAAGGGTCGGTTTGGGGAAGTATGGCGGGGCCGCTGGAGGGGTGGTGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCTTCTCGTGAAGAACGGTCTTGGTTCAGGGAAGCAGAGATATACCAGACGGTCATGCTGCGCCATGAAAACATCCTTGGATTTATTGCTGCTGACAATAAAGATAATGGCACCTGGACACAGCTGTGGCTTGTTTCTGACTATCATGAGCACGGGTCCCTGTTTGATTATCTGAACCGGTACACAGTGACAATTGAGGGGATGATTAAGCTGGCCTTGTCTGCTGCTAGTGGGCTGGCACACCTGCACATGGAGATCGTGGGCACCCAAGGGAAGCCTGGAATTGCTCATCGAGACTTAAAGTCAAAGAACATTCTGGTGAAGAAAAATGGCATGTGTGCCATAGCAGACCTGGGCCTGGCTGTCCGTCATGATGCAGTCACTGACACCATTGACATTGCCCCGAATCAGAGGGTGGGGACCAAACGATACATGGCCCCTGAAGTACTTGATGAAACCATTAATATGAAACACTTTGACTCCTTTAAATGTGCTGATATTTATGCCCTCGGGCTTGTATATTGGGAGATTGCTCGAAGATGCAATTCTGGAGGAGTCCATGAAGAATATCAGCTGCCATATTACGACTTAGTGCCCTCTGACCCTTCCATTGAGGAAATGCGAAAGGTTGTATGTGATCAGAAGCTGCGTCCCAACATCCCCAACTGGTGGCAGAGTTATGAGGCACTGCGGGTGATGGGGAAGATGATGCGAGAGTGTTGGTATGCCAACGGCGCAGCCCGCCTGACGGCCCTGCGCATCAAGAAGACCCTCTCCCAGCTCAGCGTGCAGGAAGACGTGAAGATC (서열 번호: 102)

세포외 ALK4 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 다음과 같다:

TCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGGCCAACTACACGTGTGAGACAGATGGGGCCTGCATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAG (서열 번호: 103)

인간 ALK4 전구체 단백질 서열의 대안적 아이소형인, 아이소형 B (NCBI 참고 서열 NP_064732.3)은 다음과 같다:

1 mvsifnldgm ehhvrtcipk velvpagkpf yclssedlrn thccytdycn ridlrvpsgh

61 lkepehpsmw gpvelvgiia gpvfllflii iivflvinyh qrvyhnrqrl dmedpscemc

121 lskdktlqdl vydlstsgsg sglplfvqrt vartivlqei igkgrfgevw rgrwrggdva

181 vkifssreer swfreaeiyq tvmlrhenil gfiaadnkdn gtwtqlwlvs dyhehgslfd

241 ylnrytvtie gmiklalsaa sglahlhmei vgtqgkpgia hrdlksknil vkkngmcaia

301 dlglavrhda vtdtidiapn qrvgtkryma pevldetinm khfdsfkcad iyalglvywe

361 iarrcnsggv heeyqlpyyd lvpsdpsiee mrkvvcdqkl rpnipnwwqs yealrvmgkm

421 mrecwyanga arltalrikk tlsqlsvqed vki (서열 번호: 104)

세포외 도메인은 굵게 표시된다.

가공된 세포외 ALK4 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

1 mvsifnldgm ehhvrtcipk velvpagkpf yclssedlrn thccytdycn ridlrvpsgh

61 lkepehpsmw GPVE(서열 번호: 105)

인간 ALK4 전구체 단백질 (아이소형 B)을 인코드하는 핵산 서열은 하기에 나타내며(서열 번호: 106), 이는 Genbank 기준 서열 NM_020327.3의 뉴클레오티드 186-1547에 상응한다. 세포외 도메인을 인코드하는 뉴클레오티드는 굵게 표시된다.

1 atggtttcca ttttcaatct ggatgggatg gagcaccatg tgcgcacctg

51 catccccaaa gtggagctgg tccctgccgg gaagcccttc tactgcctga

101 gctcggagga cctgcgcaac acccactgct gctacactga ctactgcaac

151 aggatcgact tgagggtgcc cagtggtcac ctcaaggagc ctgagcaccc

201 gtccatgtgg ggcccggtgg agctggtagg catcatcgcc ggcccggtgt

251 tcctcctgtt cctcatcatc atcattgttt tccttgtcat taactatcat

301 cagcgtgtct atcacaaccg ccagagactg gacatggaag atccctcatg

351 tgagatgtgt ctctccaaag acaagacgct ccaggatctt gtctacgatc

401 tctccacctc agggtctggc tcagggttac ccctctttgt ccagcgcaca

451 gtggcccgaa ccatcgtttt acaagagatt attggcaagg gtcggtttgg

501 ggaagtatgg cggggccgct ggaggggtgg tgatgtggct gtgaaaatat

551 tctcttctcg tgaagaacgg tcttggttca gggaagcaga gatataccag

601 acggtcatgc tgcgccatga aaacatcctt ggatttattg ctgctgacaa

651 taaagataat ggcacctgga cacagctgtg gcttgtttct gactatcatg

701 agcacgggtc cctgtttgat tatctgaacc ggtacacagt gacaattgag

751 gggatgatta agctggcctt gtctgctgct agtgggctgg cacacctgca

801 catggagatc gtgggcaccc aagggaagcc tggaattgct catcgagact

851 taaagtcaaa gaacattctg gtgaagaaaa atggcatgtg tgccatagca

901 gacctgggcc tggctgtccg tcatgatgca gtcactgaca ccattgacat

951 tgccccgaat cagagggtgg ggaccaaacg atacatggcc cctgaagtac

1001 ttgatgaaac cattaatatg aaacactttg actcctttaa atgtgctgat

1051 atttatgccc tcgggcttgt atattgggag attgctcgaa gatgcaattc

1101 tggaggagtc catgaagaat atcagctgcc atattacgac ttagtgccct

1151 ctgacccttc cattgaggaa atgcgaaagg ttgtatgtga tcagaagctg

1201 cgtcccaaca tccccaactg gtggcagagt tatgaggcac tgcgggtgat

1251 ggggaagatg atgcgagagt gttggtatgc caacggcgca gcccgcctga

1301 cggccctgcg catcaagaag accctctccc agctcagcgt gcaggaagac

1351 gtgaagatCT AA (서열 번호: 106)

세포외 ALK4 폴리펩티드(아이소형 B)를 인코드하는 핵산 서열은 다음과 같다:

1 atggtttcca ttttcaatct ggatgggatg gagcaccatg tgcgcacctg

51 catccccaaa gtggagctgg tccctgccgg gaagcccttc tactgcctga

101 gctcggagga cctgcgcaac acccactgct gctacactga ctactgcaac

151 aggatcgact tgagggtgcc cagtggtcac ctcaaggagc ctgagcaccc

201 gtccatgtgg ggcccggtgg agctggtagg (서열 번호: 107)

ALK4는 척추동물간에 잘-보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레취(stretches)는 완벽하게 보존된다. 예를 들면, 도 18은 인간 ALK4 세포외 도메인의 다수의-서열 정렬을 다양한 ALK4 이종상동성 유전자(orthologs)와 비교하여 도시한다. ALK4에 결합하는 많은 리간드들이 매우 잘 보존되어 있다. 따라서, 이들 정렬로부터, ALK4- 리간드 결합의 정상적 활성에 중요한 리간드 결합 도메인 안에 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 ALK4- 리간드 결합 활성을 크게 변화시키지 않으면서 치환을 용인할 수 있는 아미노산 위치를 예측할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성을 가진 인간 ALK4 변이체 폴리펩티드는 다른 척추 동물 ALK4의 서열의 상응하는 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추 동물 서열에서와 유사한 잔기를 포함 할 수 있다.

다음 실시예들은 활성 ALK4 변이체를 정의하는 접근법을 설명하지만, 이에 제한하고자 함은 아니다. 도 18에 도시된 바와 같이, humALK4 세포외 도메인 (서열 번호: 126)에서 V6은 무스 무쿨루스(mus muculus) ALK4 (서열 번호: 130)에서 이소류신이며, 따라서 이 위치는 변경될 수 있고, 선택적으로 또다른 소수성 잔기 가령, L, I, 또는 F, 또는 갈루스 갈루스(gallus gallus) ALK4 (서열 번호: 129)에서 관찰된 바와 같이, 비-극성 잔기 가령, A로 변경될 수 있다. 인간 세포외 도메인의 E40은 갈루스 갈루스(gallus gallus) ALK4에서 K이며, 이것은 이 부위가 극성 잔기, 가령, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 그리고 아마도 비-극성 잔기 가령, A가 포함된 다양한 변화에 내성이 있음을 나타낸다. S15 in the 인간 세포외 도메인의 S15는 갈루스 갈루스(gallus gallus) ALK4에서 D이고, 이는 이 위치가 선호되는 극성 잔기, 가령, S, T, R, E, K, H, G, P, G 및 Y로 광범위한 구조적 변이를 용인한다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 E40은 갈루스 갈루스(gallus gallus) ALK4에서 K이며, 이는 D, R, K, H, 뿐만 아니라 Q 및 N를 포함하는 하전된 잔기가 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 R80은 콘딜루라 크리스타타(condylura cristata) ALK4 (서열 번호: 127)에서 K이며, 이것은 이 위치에서 R, K, 및 H을 포함하는 염기성 잔기가 용인된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인의 Y77은 수스 스크로파(sus scrofa) ALK4 (서열 번호: 131)에서 F이며, F, W, 및 Y를 포함하는 방향족 잔기가 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 P93은 상대적으로 잘 보존되지 않은 것으로써, 에리나세우스 유로파에우스(erinaceus europaeus) ALK4 (서열 번호: 128)에서 S, 그리고 갈루스 갈루스(gallus gallus) ALK4에서 N이고, 따라서 기본적으로 임의의 아미노산이 이 위치에서 용인되어야 한다.

더욱이, ALK4 단백질은 당해 분야에서 구조적 및 기능적 특징, 특히 리간드 결합에 관해 특성화되었던 바 있다[가령, Harrison 등 (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano 등 (2012) J Mol Model 18(8):3617-3625; 그리고 Calvanese 등 (2009) 15(3):175-183]. 본 출원의 개시내용 외에도, 이들 참고 문헌은 하나 또는 그 이상의 정상 활성 (예: 리간드 결합 활성)을 보유하는 ALK4 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.

예를 들면, 3 개-핑거 톡신 폴드(three-finger toxin fold)로 알려진 구조적 모티프는 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며, 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 내부의 다양한 위치에 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다. [Greenwald 등 (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이러한 보존된 시스테인의 가장 바깥쪽에 의해 경계가 표시되는 인간 ALK4의 핵심 리간드-결합 도메인은 서열 번호 100 (ALK4 전구체)의 34-101 위치에 상응한다. 이러한 시스테인으로 경계가 표시되는 코어 서열에 인접한 구조적으로 덜 규칙적인 아미노산은 반드시 리간드 결합을 바꾸지 않고도 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33개 잔기 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 잔기가 절두될 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 절두에 대한 예시적인 ALK4 세포외 도메인은 서열 번호: 101 및 105를 포함한다.

이와 함께, ALK4의 일반적인 활성 부분(가령, 리간드-결합 부분)은 서열 번호: 100의 아미노산 34-101을 포함한다. 따라서 ALK4 폴리펩티드는 예를 들면, 서열 번호: 100의 아미노산 24-34중 임의의 하나 (가령, 아미노산 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34중 임의의 하나에서 시작하고) 그리고 서열 번호: 100의 아미노산 101-126중 임의의 하나에 상응하는 위치에서 끝나는 (가령, 아미노산 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126중 임의의 하나에서 끝나는) ALK4의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 다른 예들은 서열 번호: 100의 24-34 (가령, 위치 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34중 임의의 하나), 25-34 (가령, 위치 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34중 임의의 하나), 또는 26-34 (가령, 위치 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34중 임의의 하나)에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 100의 위치 101-126 (가령, 위치 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126중 임의의 하나), 102-126 (가령, 위치 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126중 임의의 하나), 101-125 (가령, 위치 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125중 임의의 하나), 101-124 (가령, 위치 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124중 임의의 하나), 101-121 (가령, 위치 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 또는 121중 임의의 하나), 111-126 (가령, 위치 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126중 임의의 하나), 111-125 (가령, 위치 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125중 임의의 하나), 111-124 (가령, 위치 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124중 임의의 하나), 121-126 (가령, 위치 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126중 임의의 하나), 121-125 (가령, 위치 121, 122, 123, 124, 또는 125중 임의의 하나), 121-124 (가령, 위치 121, 122, 123, 또는 124중 임의의 하나), 또는 124-126 (가령, 위치 124, 125, 또는 126중 임의의 하나)에서 끝나는 구조체를 포함한다. 이 범위 안에 변이체들, 특히, 서열 번호: 100의 대응하는 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 변이체들이 특히 고려된다.

본 명세서에 설명된 변형은 다양한 방식으로 조합 될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, ALK4 변이체는 리간드-결합 포켓 안에 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 보존 아미노산을 포함한다. 가변성이 특히 잘 용인될 수 있는 결합 포켓 외부의 위치는 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 (상기 언급 한 바와 같음)을 포함한다.

특정 구체예들에서, 본 출원은 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드 (이의 단편, 기능적 변이체, 및 변형된 형태들을 포함)를 포함하는 이형다량체인 BMP/GDF 길항제들 및 이의 용도 (예컨대, PAH 또는 하나 이상의 PAH 합병증 치료, 예방 또는 이의 중증도 감소)에 관한 것이다. 바람직하게는, ALK4 폴리펩티드들은 가용성이다 (가령, ALK4의 세포외 도메인). 일부 구체예들에서, ALK4 폴리펩티드를 포함하는 이형체는 하나 이상의 TGFβ수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]의 활성 (예컨대, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예들에서, ALK4 폴리펩티드를 포함하는 이형체는 하나 이상의 TGFβ수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이형다량체는 서열 번호: 100의 아미노산 34-101에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이형다량체는 서열 번호: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122, 및 124 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이형다량체는 서열 번호: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122, 및 124 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 동일한 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드로 구성되거나 본질적으로 구성된 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다.

특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ALK4 수용체 폴리펩티드 (예컨대, 서열 번호: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122, 및 124 그리고 이의 변이체) 및 하나 이상의 ActRIIB 수용체 폴리펩티드 (예컨대, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 및 120 그리고 이의 변이체)를 포함하는 이형다량체 복합체 (이의 용도 (예컨대, 필요로 하는 환자의 면역 반응 증가 및 암 치료) 포함)에 관한 것이며, 본 출원에서 이 복합체들은 일반적으로 “ALK4: ActRIIB이형다량체 복합체” 또는 “ALK4: ActRIIB이형다량체”로 지칭된다. 바람직하게는, ALK4: ActRIIB이형다량체는 가용성이다 [예컨대, 이형다량체 복합체는 ALK4 수용체의 가용성 부분(도메인)과 ActRIIB 수용체의 가용성 부분(도메인)을 포함할 수 있음]. 일반적으로, ALK4와 ActRIIB의 세포외 도메인은 이들 수용체의 가용성 부분에 상응한다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 ALK4 수용체의 세포외 도메인과 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 하나 이상의 TGFβ수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]의 활성 (예컨대, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 하나 이상의 TGFβ수퍼패밀리 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122, 및 124 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이로 기본적으로 구성된, 또는 구성된 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ALK4: ActRIIB이형다량체 복합체는 서열 번호: 100의 아미노산 24-34, 25-34, 또는 26-34중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 시작하고, 서열 번호: 100의 위치 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101-121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124, 또는 124-126의 위치에서 끝나는 ALK4 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이로 기본적으로 구성된, 또는 구성된 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 100의 아미노산 34-101에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, ALK4-ActRIIB 이형다량체는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118, 및 120 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ALK4: ActRIIB이형다량체 복합체는 서열 번호: 1의 아미노산 20-29, 20-24, 21-24, 22-25, 또는 21-29중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 시작하고, 서열 번호: 1의 위치 109-134, 119-134, 119-133, 129-134, 또는 129-133 of 서열 번호: 1에서 끝나는 ActRIIB 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, ALK4: ActRIIB이형다량체는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ALK4: ActRIIB이형다량체 복합체는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하며, 이때 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치의 아미노산은 산성 아미노산이 아니다 (즉, 자연 발생적 D 또는 E 아미노산 잔기가 아니거나, 또는 인공적인 산성 아미노산 잔기가 아님). 본 명세서의 ALK4: ActRIIB이형다량체는 가령, 이형이량체, 이형삼량체, 이형사량체, 및 고차 올리고머 구조를 포함한다. 예컨대, 도 21-23을 참고하라. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 본 발명의 이형다량체 복합체는 ALK4: ActRIIB이형이량체이다.

일부 구체예들에 있어서, 본 명세서는 치료 효과 또는 안정성 (예컨대, 생체내 반감기 및 단백질분해에 대한 저항성)을 강화시킬 목적으로, ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 구조를 변경시킴에 의한 기능적 변이체의 제조를 고려한다. 아미노산 치환, 결손, 추가, 또는 이의 조합들에 의해 변이체들이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 류신을 이소류신 또는 발린으로 치환, 아스파르테이트를 글루타메이트로 치환, 트레오닌을 세린으로 치환, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산 (가령, 보존 돌연변이)으로 단리된 치환은 생성 분자의 생물학적 활성에 주요한 영향을 주지 않을 것으로 합리적으로 예측할 수 있다. 보존 치환은 아미노산 측쇄에 관련된 아미노산 패밀리 안에서 일어나는 것이다. 본 명세서의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화로 기능적 동소체가 생성되는 지의 여부는 생성된 변이체 폴리펩티드가 이의 야생형 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포 안에서 반응을 만드는 능력, 또는 예를 들면, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-βTGF-ββ액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty을 포함하는 하나 또는 그 이상의 TGF-베타 리간드들에 결합하는 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 당화를 변경하기 위해 상기 폴리펩티드의 특정한 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 당화 부위, 가령, O-연계된 또는 N-연계된 당화 부위를 도입 또는 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연계된 당화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포의 당화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 삼펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린 (여기에서 “”는 임의의 아미노산임)이다. 이러한 변경은 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 상기 폴리펩티드(O-연계된 당화 부위의 경우)에 추가 또는 치환시켜 만들 수도 있다. 당화 인식 부위 중 제 1 또는 제 3 아미노산 위치의 하나 또는 둘 모두에서의 다양한 아미노산 치환들 또는 결실들 (및/또는 제 2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트라이펩티드 서열에서의 비-당화를 가져온다. 폴리펩티드의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또다른 수단은 상기 단백질에 화학 또는 효소적으로 글리코시드를 결합시키는 것이다. 사용되는 결합 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복시기; (c) 유리 술프하이드릴기, 가령, 시스테인 그룹들; (d) 유리 히드록실기, 가령, 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린 그룹들; (e) 방향족 잔기들, 가령, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판 그룹들; 또는 (f) 글루타민의 아마이드 그룹에 부착될 수 있다. 폴리펩티드 상에 있는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티는 화학적 및/또는 효소적으로 제거될 수 있다. 화학적 탈당화는 예를 들면, 트리플루오로메탄설폰산 또는 이에 등가의 화합물에 대한 폴리펩티드의 노출을 필요로 할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열을 손상시키지 않으면서, 연결당 (N-아세틸 글루코사민 또는 N-아세틸 갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당을 절단하게 된다. 폴리펩티드상의 탄수화물 모이어티의 효소 절단은 Thotakura 등, [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]에서 설명된 바와 같이, 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입시킬 수 있기 때문에 폴리펩티드의 서열은 이용되는 발현계 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 일반적으로, 인간에 사용하기 위한 본 명세서의 폴리펩티드는 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포계통, 가령, HEK293 또는 CHO 세포계통에서 발현될 수 있지만, 다른 포유류 발현 세포계통 또한 마찬가지로 유용할 것으로 예상된다.

본 명세서는 돌연변이체, 특히 본 명세서의 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드 복합 돌연변이체, 뿐만 아니라 절두 돌연변이체를 만드는 방법을 추가로 고려한다. 복합 돌연변이체의 풀(pool)은 기능적으로 활성인 (가령, GDF/BMP 리간드 결합) ActRII 서열을 동정하는데 특히 유용하다. 이러한 복합 라이브러리들을 스크리닝하는 목적은 변경된 성질, 가령, 변경된 약동학적 또는 변경된 리간드 결합을 가지는 폴리펩티드들의 변이체를 만들기 위한 것일 수도 있다. 다양한 스크리닝 분석이 하기에 제공되며, 이러한 분석을 이용하여 변이체들을 평가할 수 있다. 예를 들면, ActRII 및/또는 ALK4 변이체, 및 이를 포함하는 이종다량체는, ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 이종다량체에 대한 GDF/BMP 리간드의 결합을 억제하기 위하여, 및/또는 GDF/BMP 리간드에 의하여 유발되는 신호전달을 간섭하기 위하여 하나 이상의 GDF/BMP 리간드들 (예컨대, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-βTGF-βGF-β액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)에 결합하는 능력에 관해 스크리닝 될 수 있다.

ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이형이량체의 활성은 세포-기반 또는 생체내 분석에서 또한 테스트될 수도 있다. 예를 들어, PH 발병기전에 관여하는 유전자들의 발현에 대한 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체의 효과를 평가하였다. 이는 필요에 따라 하나 이상의 재조합 리간드 단백질들 (예컨대, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-βTGF-β2, TGF-β액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)의 존재하에 실시될 수 있으며, 세포들은 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체, 및 선택적으로, GDF/BMP 리간드를 제조하기 위하여 형질감염될 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체는 생쥐 또는 다른 동물에게 투여될 수 있으며, 해당분야에 알려진 방법들을 이용하여 PH 발병기전에 대한 효과가 평가될 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체, 또는 이의 변이체의 활성은 혈액 세포 전구체 세포들의 성장에 대한 임의의 효과에 관하여 이러한 세포들에서, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법 및 해당 기술 분야에 통상적으로 공지된 분석법으로 테스트할 수 있다. 반응성 리포터 유전자는 하류(downstream) 신호전달에 대한 효과들을 모니터하기 위하여 이러한 세포주들에서 사용될 수 있다.

기준 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체와 비교하여 선택성이 증가된 또는 전반적으로 효능이 증가된 복합-유도된 변이체가 만들어질 수 있다. 재조합 DNA 구조체들로부터 발현된 이러한 변이체 단백질들은 유전자 치료 프로토콜에서 사용될 수 있다. 돌연변이유발은 대응하는 비변형된 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체와 상당히 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 만들 수 있다. 예를 들면, 변형된 단백질은 비변형된 폴리펩티드의 파괴 또는 그렇지 않으면 불활성화를 초래하는 단백질분해 또는 다른 세포 과정에 더 안정적이거나 덜 안정적이 될 수 있다. 이러한 변이체 및 이들을 코딩하는 유전자는 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 폴리펩티드 복합체 수준을 변경 시키는데 이용 될 수 있다. 예를 들면, 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있고, 유도성 발현 시스템의 일부는 세포 안에 재조합 폴리펩티드 복합체 수준을 더 엄밀하게 조절할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체의 반감기를 변형시키기 위하여 링커 (존재하는 경우) 및/또는 Fc 부위에서 이루어질 수 있다.

잠재적 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체 서열의 최소한 일부분을 포함하는 각 폴리펩티드의 라이브러리를 인코드하는 유전자의 축중성(degenerate) 라이브러리에 의해 복합 라이브러리가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열에 효소적으로 결찰되어, 잠재적 ActRII 및/또는 ALK4를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 축중 세트는 개별 폴리펩티드로 발현되거나, 또는 대안으로, 더 큰 융합 단백질 (가령, 파지 디스플레이의 경우)로 발현가능하다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열에 효소적으로 결찰되어, 잠재적 ActRII를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 축중 세트는 개별 폴리펩티드로 발현되거나, 또는 대안으로, 더 큰 융합 단백질 (가령, 파지 디스플레이의 경우)로 발현가능하다.

축중성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 상동체(homologs)의 라이브러리를 만들 수 있는 많은 방법들이 있다. 자동 DNA 합성기에서 축중성 유전자 서열의 화학적 합성을 실행할 수 있고, 그 다음 합성 유전자를 적절한 발현 벡터 안에 결찰시킬 수 있다. 축중 올리고뉴클레오티드 합성은 해당 분야에 공지되어 있다 [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura 등 (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura 등 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura 등 (1984) Science 198:1056; 그리고 Ike 등 (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. 이러한 기술은 다른 단백질의 유도된 진화에 이용되어 왔다 [Scott 등, (1990) Science 249:386-390; Roberts 등, (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin 등, (1990) Science 249: 404-406; Cwirla 등, (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 미국 특허 제: 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815].

대안으로, 다른 형태의 돌연변이유발을 이용하여 조합 라이브러리를 만들 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이형이량체가 만들어지고, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발를 이용한 스크리닝[가령, Ruf 등, (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 등, (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint 등, (1993) Gene 137:109-118; Grodberg 등, (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima 등, (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowam 등, (1989) Science 244:1081-1085], 링커 스캐닝 돌연변이유발 [가령, Gustin 등, (1993) Virology 193:653-660; 그리고 Brown 등, (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight 등, (1982) Science 232:316], 포화 돌연변이유발 [가령, Meyers 등,, (1986) Science 232:613]; PCR 돌연변이유발 [가령, Leung 등, (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; 또는 화학적 돌연변이유발을 포함하는 무작위 돌연변이유발[가령, Miller 등, (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 그리고 Greener 등, (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]에 의해 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은 특히 복합적 환경에서 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체의 절두된 (생물 활성) 형태를 동정하기에 좋은 방법이다.

점 돌연변이 및 절두에 의해 만들어진 복합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한, 그리고 이와 같은 경우, 특정 성질을 갖는 유전자 산물의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 ActRII 폴리펩티드의 복합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 일반적으로 적합할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 가장 광범위하게 이용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고, 적절한 세포를 벡터의 생성 라이브러리로 형질전환시키고, 원하는 활성의 탐지는 해당 유전자의 산물이 탐지되는 해당 유전자를 인코드하는 벡터를 상대적으로 용이하게 단리할 수 있는 조건하에 복합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 분석에는 리간드 (가령, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-ββ1, TGF-βTGF-β액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, nodal, 신경아교세포-유도된 신경영샹성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty) 결합 분석 및/또는 리간드-매개된 세포 신호생성 분석이 포함된다.

숙련된 기술자가 알고 있는 바와 같이, 본원에 기재된 돌연변이, 변이체 또는 변형의 대부분은 핵산 수준에서, 또는 경우에 따라, 번역후(post-translational) 변형 또는 화학 합성에 의해 만들어 질 수 있다. 이러한 기법들은 해당 분야에 널리 공지이며 그 중 일부는 본 명세서에 기재되어 있다. 일부에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 발명의 범위에 속하는 다른 변이체 ActRII 폴리펩티드의 생성 및 사용을 위한 지침으로서 사용될 수 있는 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체의 기능적 활성 부위들 (단편들) 및 변이체들을 동정한다.

특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이형이량체의 기능적 활성 단편들은 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 제조된 폴리펩티드를 선별함으로써 얻을 수 있다. 또한, 단편들은 해당 기술 분야에 공지된 기법들, 가령, 종래의 메리필드 고상 (Merrifield solid phase) f-Moc 또는 t-Boc 화학을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 단편들은 (재조합으로 또는 화학적 합성으로) 제조되고 테스트되어, ActRII 및/또는 ALK4 수용체들 및/또는 하나 이상의 리간드들 (예컨대¸ BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-ββ1, TGF-βTGF-β액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)의 길항제 (억제제)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편들을 동정할 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 명세서의 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및/또는 ALK4: ActRIIB이형이량체는 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체 내에 자연적으로 존재하는 것에 더하여 번역후- 변형을 더욱 포함할 수 있다. 이러한 변형들에는, 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화, 및 아실화가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 그 결과, ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 또는 ALK4: ActRIIB이형이량체는 비-아미노산 원소, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류 및 인산염을 포함한다. 리간드 트랩 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비-아미노산 성분들의 효과는 다른 ActRII, AKL4, 및 ALK4: ActRIIB변이체들에 관하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 테스트될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 초기 형태의 폴리펩티드를 절단함으로써 세포에서 생산되는 경우, 번역 후 가공은 또한 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포들 (예컨대, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)이, 이러한 번역후 활성들에 대한 특이적인 세포 조직 (cellular machinery) 및 특징적 기전을 가지며 ActRII 폴리펩티드의 올바른 변형 및 가공을 확보하기 위해 선택될 수 있다.

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 ActRII 및 ALK4 폴리펩티드는 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드의 부분 (도메인) 및 하나 또는 그 이상의 이종 부위 (도메인)을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예로는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S-전달효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토즈 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 융합 도메인은 친화력 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화력 정제를 목적으로, 친화력 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스, 가령, 글루타티온-, 아밀라제-, 및 니켈- 또는 코발트- 접합된 수지가 이용된다. 이러한 매트릭스중 많은 것들이 "키트" 형태로 이용가능한데, 가령, Pharmacia GST 정제 시스템 및 (HIS₆) 융합 쌍과 함께 유용한 QIAexpress^TM 시스템(Qiagen)이 있다. 또 다른 예로써, 상기 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드의 탐지를 용이하게 하기 위하여 융합 도메인이 선택될 수 있다. 이러한 탐지 도메인의 예로는 다양한 형광 단백질 (가령, GFP) 뿐만 아니라 “에피토프 태그”를 포함하는데, 이는 특이적 항체가 이용가능한 짧은 펩티드 서열이 일반적이다. 특이적 모노클로날 항체들이 용이하게 유용한 널리 공지된 에피토프 태그에는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 c-myc 태그들이 포함된다. 일부 경우들에서, 융합 도메인들은 가령, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 가지는데, 이러한 부위는 관련 프로테아제로 하여금 융합 단백질을 부분적으로 소화할 수 있게 함으로써 그로부터 얻은 재조합 단백질을 유리시킨다. 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 단백질로부터 단리될 수 있다. 선택될 수 있는 그 외 융합 도메인들의 유형들에는 다량체화 (예컨대, 이량체화, 사량체화) 도메인들 및 예를 들면, 면역글로불린들의 불변 도메인들 (예컨대, Fc 도메인들)을 비롯한 (추가 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인들이 포함된다.

특정 양상들에서, 본 출원의 ActRII 및 ALK4 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드들을 "안정화"시킬 수 있는 하나 이상의 변형들을 내포한다. "안정화"는 파괴 감소, 신장에 의한 제거 감소, 또는 일정 물질의 약동학적 효과로 인한 것인지 여부에 관계없이 시험관내 반감기, 혈청 반감기를 증가시키는 어떤 것이든 의미한다. 예를 들면, 이러한 변형은 폴리펩티드의 보관 수명을 강화시키고, 폴리펩티드의 순환 반감기를 강화시키고 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형에는 융합 단백질 (예를 들면, ActRII 폴리펩티드 또는 (ALK4 폴리펩티드) 도메인 및 안정화제 도메인을 포함하는 융합 단백질), 당화 부위의 변형 (예를 들면, 본 명세서의 폴리펩티드에 당화 부위 추가 포함), 및 탄수화물 모이어티의 변형 (예를 들면, 본 명세서의 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티 제거 포함)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “안정화제 도메인”은 융합 단백질인 경우 융합 도메인 (가령, 면역글로불린 Fc 도메인)을 지칭하고, 뿐만 아니라 비단백질성 변형, 가령, 탄수화물 모이어티, 또는 비단백질성 모이어티, 가령, 폴리에틸렌 글리콜을 또한 포함한다. 바람직한 특정 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드 (또는 ALK4 폴리펩티드)는 이를 안정화시키는 이종 도메인 (“안정화제” 도메인), 바람직하게는 폴리펩티드의 생체내 안정성을 증가시키는 이종 도메인과 융합된다. 면역글로불린의 불변 도메인 (예컨대, Fc 도메인)과의 융합이 광범위한 단백질들에 바람직한 약동학적 성질들을 부여함은 공지이다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 원하는 성질들을 부여할 수 있다.

인간 IgG1 (G1Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열을 하기에 예시한다 (서열 번호: 14). 점선은 힌지 영역을 나타내며, 직선은 자연 발생적 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 14에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. G1Fc에서 자연 발생적 변이체는 서열 번호: 14에서 이용된 넘버링 체계에 따라 E134D 및 M136L을 포함할 수 있다(Uniprot P01857 참고).

선택적으로, IgG1 Fc 도메인은 잔기들, 가령, Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434에서 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 특정 경우들에서, 하나 또는 그 이상의 이들 돌연변이 (가령, Asp-265 돌연변이)를 갖는 돌연변이체 IgG1 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인와 비교하여 Fcγ수용체에 대한 결합 능력이 감소된다. 다른 경우들에서, 하나 또는 그 이상의 이들 돌연변이 (가령, Asn-434 돌연변이)를 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인와 비교하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 결합하는 능력이 증가된다.

인간 IgG2 (G2Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열은 하기에 예시된다 (서열 번호: 15). 점선은 힌지 영역을 나타내며, 두줄 밑줄은 이 서열에서 데이터 베이스가 충돌하는 위치를 나타낸다 (UniProt P01859). 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 15에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.

인간 IgG3 (G3Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 2가지 예시 아미노산 서열을 하기에 나타낸다. G3Fc의 힌지 영역은 다른 Fc 쇄의 길이의 최대 4배가 될 수 있고, 유사한 17개-잔기 분절을 선행시키는, 3개의 동일한 15개-잔기 분절들을 포함한다. 하기에 나타낸 제 1 G3Fc 서열(서열 번호: 16)은 단일 15개-잔기 분절로 구성된 짧은 힌지 영역을 포함하며, 반면 제 2 G3Fc 서열 (서열 번호: 17)은 전장 힌지 영역을 포함한다. 각 경우에서, 점선은 힌지 영역을 나타내며, 직선은 UniProt P01859에 따른 자연 발생적 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 16 및 17에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.

G3Fc (예를 들면, Uniprot P01860)에서 자연 발생적 변이체들은 서열 번호: 16에 이용된 넘버링 체계로 전환될 때 E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y를 포함하며, 본 명세서는 이들 변이중 하나 또는 그 이상을 함유하는 G3Fc 도메인이 포함된 융합 단백질을 제공한다. 또한, 인간 면역글로불린 IgG3 유전자 (IGHG3)는 상이한 힌지 길이에 의해 특징화되는 구조적 다형태를 나타낸다[Uniprot P01859]. 특히, 변이체 WIS는 대부분의 V 영역과 모든 CH1 영역이 결여되어 있다. 변이체 WIS는 힌지 영역에 정상적으로 존재하는 위치 11 이외에도 위치 7에 여분의 쇄간 이황화결합이 있다. 변이체 ZUC는 대부분의 V 영역, 모든 CH1 영역, 그리고 일부 힌지가 결여되어 있다. 변이체 OMM은 대립형질 형태 또는 또다른 감마 쇄 하위분류를 나타낼 수 있다. 본 명세서는 하나 또는 그 이상의 이들 변이체를 함유하는 G3Fc 도메인이 포함된 추가적인 융합 단백질을 제공한다.

인간 IgG4 (G4Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열은 하기에 예시된다 (서열 번호: 18). 점선은 힌지 영역을 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 18에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.

Fc 도메인 안에서 다양하게 조작된 돌연변이는 G1Fc 서열 (서열 번호: 14)에 대하여 나타내며, G2Fc, G3Fc, 및 G4Fc에서 유사 돌연변이는 도 4의 G1Fc와 정렬함으로부터 유도될 수 있다. 같지 않은 힌지 길이로 인해, 아이소형 정렬 (도 4)을 기준으로 유사한 Fc 위치들은 서열 번호: 14, 15, 16, 17, 및 18에서 상이한 아미노산 번호를 소유한다. 힌지, C_H2, 및 C_H3 영역 (예컨대, 서열 번호: 14, 15, 16, 17, 및 18)으로 구성된 면역글로불린 서열에서 주어진 아미노산 위치는 Uniprot 데이타베이스에서와 같이, 넘버링이 IgG1 중쇄 불변 도메인 (C_H1, 힌지, C_H2, 및 C_H3 영역으로 구성됨) 전체를 포괄하는 경우, 동일한 위치가 아닌 상이한 번호로 확인될 것이라는 것을 또한 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 인간 G1Fc 서열 (서열 번호: 14), 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (Uniprot P01857), 및 인간 IgG1 중쇄에서 선택된 C_H3 위치 간의 대응성은 다음과 같다.

특정 양상들에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비-공유적으로 연관된 최소한 하나의 ALK4 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 본 명세서의 폴리펩티드들은 이형이량체성 복합체를 형성하지만, 더욱 고차의 이형이량체 복합체들 (이형다량체), 가령, 이형삼량체, 이형사량체, 및 추가 올리고머 구조를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다 (예컨대, 도 21 -23 참고). 일부 구체예들에 있어서, ALK4 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드는 최소한 하나의 다량체화 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 용어 “다량체화 도메인(multimerization domain)”은 최소한 제 1 폴리펩티드와 최소한 제 2 폴리펩티드 사이에 공유 또는 비-공유 상호작용을 촉진시키는 아미노산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 명세서의 폴리펩티드들은 다량체화 도메인에 공유적 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 바람직하게는 다량체화 도메인은 이형다량체 형성 (가령, 이형이량체 형성)을 촉진시키고, 선택적으로 동형다량체 형성 (가령, 동형이량체 형성)을 방해 또는 그렇지 않으면 이의 형성을 선호하지 않고, 이로 인하여 원하는 이형다량체가 증가되도록 하기 위하여, 제 1 폴리펩티드 (가령, ALK4 폴리펩티드)와 제 2 폴리펩티드 (가령, ActRIIB 폴리펩티드) 간의 상호작용을 촉진시킨다(가령, 도 22 참고).

해당 분야에 공지된 많은 방법을 사용하여 본 발명의ALK4: ActRIIB이형다량체를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 제 1 폴리펩티드 (가령, ALK4 폴리펩티드)에 있는 자연 발생적 아미노산을 자유 티올-함유하는 잔기, 가령, 시스테인으로 대체하여, 이러한 자유 티올이 제 2 폴리펩티드 (가령, ActRIIB 폴리펩티드)에 있는 또다른 자유 티올-함유하는 잔기과 반응하고, 이황화결합이 제 1 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드들 사이에 형성되도록 함으로써, 비-자연 발생적 이황화결합이 구축될 수 있다. 이형다량체 형성을 촉진시키는 상호작용의 추가 예로는 Kjaergaard 등, WO2007147901에서 설명된 이온 상호작용; Kannan 등, 미국 특허 8,592,562에서 설명된 정전기적 스티어링; Christensen 등, 미국 출원 20120302737에서 설명된 코일드-코일 상호작용; Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584에서 설명된 류진 지퍼; Pack 등, (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277에서 설명된 나선-턴-나선 모티프를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 분절들의 연결은 가령, 공유 결합 가령, 화학적 교차-연결, 펩티드 링커, 이황화물 다리 등을 통하여 얻어지거나, 또는 친화력 상호작용, 가령, 아비딘-비오틴 또는 류신 지퍼 기술에 의해 획득될 수 있다.

특정 측면들에 있어서, 다량체화 도메인은 상호작용 쌍의 하나의 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리펩티드들은 단백질 복합체들은 제 2 폴리펩티드와 공유 또는 비-공유적으로 결합된 제 1 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 형성할 수 있으며, 이때 제 1 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드와 상기 상호작용 쌍(pair)의 제 1 구성원의 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 제 2 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상기 상호작용 쌍의 제 2 구성원의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 상호작용 쌍은 복합체, 구체적으로, 이형이량체 복합체를 형성하기 위하여 상호작용하는 임의의 2개 폴리펩티드 서열일 수 있지만, 실제 구체예에서는 또한 동형이량체 복합체를 형성하는 상호작용 쌍이 이용될 수도 있다. 상기 상호작용 쌍의 하나의 구성원은 예를 들면, 서열 번호: 2, 3, 5, 6, 101, 및 103중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 기본적으로 이로 구성된 또는 구성된 폴리펩티드 서열이 포함된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ALK4 또는 ActRIIB 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 개선된 성질/활성, 가령, 증가된 혈청 반감기를 부여하거나, 또는 개선된 성질/활성을 제공하기 위하여 또다른 모이어티가 부착된 어뎁터로 작용하는 상호작용 쌍이 선택될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 개선된 성질/활성, 가령, 개선된 혈청 반감기를 제공하기 위하여 상호작용 쌍의 성분중 뷴 러머 또는 모두에 부착될 수 있다.

상호작용 쌍의 제 1 및 제 2 구성원은 비대칭 쌍일 수도 있는데, 이것은 구성원들이 자가-결합되기 보다는 서로 선호적으로 결합된다는 것을 의미한다. 따라서, 비대칭 상호작용 쌍의 제 1 및 제2 구성원들은 이형이량체 복합체를 만들 수 있다. (가령, 도 22 참고). 대안으로, 상호작용 쌍은 비유도될 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 실제적인 선호 없이 서로 결합되거나 또는 자가-결합될 수 있으므로, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 비유도된 상호작용 쌍의 제 1 및 제 2 구성원은 연관하여 동형이량체성 복합체 또는 이형이량체성 복합체를 형성할 수 있다. 선택적으로, 상호작용 쌍 (가령, 비대칭 쌍 또는 비유도 상호작용 쌍)의 제 1 구성 요소는 상호작용 쌍의 제 2 구성원과 공유적으로 결합한다. 선택적으로, 상호작용 쌍(가령, 비대칭 쌍 또는 비유도 상호작용 쌍)의 제 1 구성원은 상호작용 쌍의 제 2 구성원과 비-공유적으로 결합한다.

특정 예로서, 본 발명은 이형다량체 형성을 촉진하도록 변형되어 있는 면역글로불린의 불변 도메인, 가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4로부터 유도된 면역글로불린의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합된 ALK4 또는 ActRIIB를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단일 세포계통으로부터 비대칭 면역글로불린-기반의 단백질의 대량 생산에서 발생되는 문제는 “쇄 결합 문제”로 알려져 있다. 이중특이적 항체의 생산에서 주로 직면하게 되는, 쇄 결합 문제는 상이한 중쇄 및/또는 경쇄가 단일 세포주에서 생성될 때 본질적으로 얻어지는 다수의 조합 중에서 원하는 다중 결합 단백질을 효율적으로 생산하려는 문제에 관한 것이다 [Klein et al (2012) mAbs 4:653-663 참고]. 이 문제는 두 개의 다른 중쇄와 두 개의 다른 경쇄가 동일한 세포에서 생산될 때 가장 심각한데, 이 경우에서 전형적으로 하나만이 필요할 때, 총 16 개의 가능한 쇄 조합이 있다 (그러나 이들 중 일부는 동일하다). 그럼에도 불구하고, 동일한 원리는 오직 2 개의 상이한 (비대칭) 중쇄를 혼입시키는 원하는 다중쇄 융합 단백질의 수율 감소를 설명한다.

허용가능한 수율로 바람직한 비대칭 융합 단백질을 생산하기 위해 단일 세포주에서 Fc-함유 융합 폴리펩티드 쇄의 바람직한 페어링을 증가시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어있다[Klein et al (2012) mAbs 4:653-663; 및 Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106 참고]. Fc-함유 쇄들의 바람직한 페어링을 얻는 방법은 하전-기반의 페어링 (정전기적 스티어링), “매듭-인투-홀(knobs-into-holes)”입체적 페어링, SEEDbody 페어링, 및 류신 지퍼-기반의 페어링을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.[[Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et al (2010); 285:19637-19646; Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, 및 WO 2011/034605]. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이들 방법을 이용하여 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형다량체 복합체를 만들 수 있다. 예컨대, 도 23 참고.

ALK4: ActRIIB이형다량체 및 이러한 이형다량체의 제조 방법은 이미 공지된 바 있다. 예를 들면, WO 2016/164497에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전문은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.

융합 단백질의 상이한 요소들(예컨대, 면역글로불린 Fc 융합 단백질)은 원하는 기능성과 일관된 방식으로 정렬될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, ActRII 폴리펩티드 (또는 ALK4 폴리펩티드) 도메인은 이종 도메인의 C 말단에 배치될 수 있거나, 또는 대안으로, 이종 도메인은 ActRII 폴리펩티드 (또는 ALK4 폴리펩티드) 도메인의 C 말단에 배치될 수 있다. ActRII 폴리펩티드 (또는 ALK4 폴리펩티드) 도메인과 이종 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 그리고 추가 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 한쪽 도메인의 C- 또는 N 말단에 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.

예를 들면, ActRII (또는 ALK4) 수용체 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있다. B 부분은 ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드 도메인에 상응한다. A와 C 부분은 독립적으로 0, 1, 또는 하나 이상의 아미노산일 수 있고, A와 C 부분 모두 존재하는 경우 B에 대하여 이종이다. A 및/또는 C 부분은 B 부분에 링커 서열을 통해 부착될 수 있다. 링커는 글리신 (가령, 2-10개, 2-5개, 2-4개, 2-3개 글리신 잔기)이 많거나, 또는 글리신과 프롤린 잔기가 많을 수 있고, 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있고, 가령, GGG (서열 번호: 19), GGGG (서열 번호: 20), TGGGG(서열 번호: 21), SGGGG(서열 번호: 22), TGGG(서열 번호: 23), SGGG(서열 번호: 24), 또는 GGGGS (서열 번호: 25) 단일항, 또는 반복부를 포함할 수 있다. 링커는 글리신 (가령, 2-10개, 2-5개, 2-4개, 2-3개 글리신 잔기)이 많거나, 또는 글리신과 프롤린 잔기가 많을 수 있고, 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있고, 가령, GGG (서열 번호: 19), GGGG (서열 번호: 20), TGGGG(서열 번호: 21), SGGGG(서열 번호: 22), TGGG(서열 번호: 23), SGGG(서열 번호: 24), 또는 GGGGS (서열 번호: 25) 단일항, 또는 반복부를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이때 A는 리더(신호) 서열이며, B는 ActRII (또는 ALK4) 폴리펩티드 도메인으로 구성되며, 그리고 C는 생체내 안정성, 생체내 반감기, 취입/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체 형성, 및/또는 정제중 하나 또는 그 이상을 개선하는 폴리펩티드 부분이다.. 특정 구체예들에 있어서, ActRII (또는 ALK4) 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이때 A는 TPA 리더 서열이며, B는 ActRII (또는 ALK4) 수용체 폴리펩티드 도메인으로 구성되며, 그리고 C는 면역글로불린 Fc 도메인이다. 바람직한 융합 단백질은 다음의 서열 번호중 임의의 하나에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다: 32, 36, 39, 40, 42, 45, 46, 48, 69, 74, 77, 78, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 122, 및 124.

바람직한 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법에 따라 이용되는 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이형다량체는 단리된 복합체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 성분으로부터 단리된 것이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 폴리펩티드는 예를 들면, 전기영동 (가령, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 폴리펩티드는 예를 들면, 전기영동 (가령, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 순도의 측정 방법은 당분야에 공지되어 있다[Flatman 등, (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 방법에 따라 이용되는 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체는 재조합 폴리펩티드이다.

본 명세서의 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, 및 ALK4: ActRIIB이종다량체는 해당 기술 분야에 공지된 다양한 기술들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 폴리펩티드는 표준 단백질 화학 기술, 예를 들면, Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명된 것들을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 자동화된 펩티드 합성장치들을 상업적으로 구매가능하다 (예컨대, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안으로, 본 명세서의 폴리펩티드들과 이의 변이체들은 당분야에 공지된 다양한 발현 시스템 [예컨대, 대장균(E. coli)), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS 세포, 베큘로바이러스]을 이용하여 재조합적으로 만들어질 수 있다. 추가 구체예에서, 본 명세서의 변형된 또는 변형되지 않은 폴리펩티드는 예로서, 프로테아제, 예를 들면, 트립신, 서몰리신, 키모트립신, 펩신, 또는 대합된 염기성 아미노산 전환 효소 (PACE)를 이용함으로써 재조합적으로 생산된 전장 ActRII 폴리펩티드의 소화에 의해 생산될 수 있다. 단백질분해가능한 절단 부위는 컴퓨터 분석(시판되는 소프트웨어, 가령, MacVect또는, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.)을 이용하여 동정해낼 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 화학적 절단 (예컨대, 사이아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 등)을 사용하여 재조합적으로 생성된 전장 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드로부터 제조될 수 있다.

3. ActRII 및 ALK4 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 및 이의 변이체

특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드 (이의 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질 포함)를 인코드하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열 번호: 7은 자연 발생 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (상기 기재된 R64 변이체)를 인코드하며, 서열 번호: 8은 ActRIIB (상기 기재된 R64 변이체)의 가공된 세포외 도메인을 인코드한다. 대상 핵산은 단일-가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ActRIIB-기반의 리간드 트랩 폴리펩티드를 만드는 방법에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 단리된 핵산(들)은 자연 환경의 성분으로부터 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.

특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들은 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135 중 임의의 하나의 변이체들인 핵산들을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 다른 서열, 예를 들면, 대립형질 변이체를 포함하고; 그리고, 이런 이유로, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135 중 하나에서 지정된 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.

특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 또는 ALK4 폴리펩티드는 서열 번호: 77, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135 중 하나에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열들에 의해 인코딩된다. 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135에 상보적인 서열들에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열들, 및 이의 변이체들 또한 본 출원의 범위에 속함을 이해할 것이다. 추가 구체예들에서, 본 명세서의 핵산 서열은 단리되거나, 재조합되거나, 및/또는 이종 뉴클레오티드 서열과 융합되거나 또는 DNA 라이브러리 안에 있을 수 있다.

다른 구체예들에서, 본 명세서의 핵산들은 또한 매우 엄격한 조건들하에서 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135에서 지정된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135의 상보적 서열들인 뉴클레오티드 서열들, 또는 이의 단편들을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건들이 변화할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 숙련된 기술자는 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격 조건은 가변적일 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 약 45 °C에서 혼성화, 이어서 50 °C에서 2.0 x SSC의 세척으로 실행할 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 50 °C에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성으로부터 50 °C에서 0.2 x SSC의 높은 엄격성에서 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 22 °C의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65 °C의 높은 엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염이 변화될 수 있거나, 또는 다른 변수가 변화되는 동안 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서는 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격성 조건하에 혼성화되고, 이어서 실온에서 2 x SSC에서 세척된 핵산을 제공한다

유전자 코드에서 축중성으로 인해 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123, 및 135에서 제시된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산들 역시 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, 다수의 아미노산이 하나 이상의 삼중항으로 지정된다. 동일한 아미노산을 명시하는 코돈들, 또는 동의어들 (예를 들면, CAU 및 CAC는 히스티딘에 관한 동의어들이다)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 “침묵” 돌연변이들을 생성할 수 있다. 그러나, 포유류 세포 중에 본 단백질의 아미노산 서열의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 존재할 것으로 예상된다. 숙련된 기술자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 최대 약 3 내지 5 %)에서의 이러한 변이가 자연 대립 유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체들 사이에 존재할 수 있음을 알 것이다. 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오티드 변형들 및 생성된 아미노산 다형태들은 본 출원의 범위에 속한다.

일정한 구체예에서, 본 명세서의 재조합 핵산은 발현 구조체 내에서 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 있어서 다수 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 당분야에 공지되어 있고, 다양한 숙주 세포에서 이용될 수 있다. 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종료 서열, 번역 개시 및 종료 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당분야에 공지된 구성 또는 유도성 프로모터는 본 명세서에서 고려된다. 상기 프로모터는 자연 발생적 프로모터이거나, 또는 하나 이상의 프로모터 요소들이 복합된 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포 안 에피좀 상에, 가령, 플라스미드로 존재하거나, 또는 발현 구조체는 염색체 안에 삽입될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별이 가능하도록 선택가능한 표지 유전자를 함유한다. 선택가능한 표지 유전자는 당분야에 공지되어 있으며, 이용되는 숙주 세포에 따라 가변적일 수 있다.

일정한 양상에서, 본 출원에 개시된 주제 핵산은 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 인코딩하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에서 제공된다. 조절 서열들은 기술분야에 공지이며 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 직접 발현을 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적인 조절 서열들은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기재되어 있다. 가령, 자신에게 작동가능하게 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 임의의 매우 다양한 발현 제어 서열이 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 이용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들면, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 중합효소에 의해 발현이 지시되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 피복 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 가령, Pho5, 효모 α-메이팅 인자들의 프로모터, 베큘로바이러스 시스템의 폴리헤드곤 프로모터, 또는 진핵 세포 또는 이의 바이러스의 발현을 제어하는 것으로 알려진 기타 서열, 및 다양한 이의 조합들을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 변형될 숙주 세포 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 유형의 선택과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 더욱이, 해당 벡터의 복제수, 항생제 표지자와 같은 해당 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 그 외 단백질의 복제수 및 발현을 제어하는 능력 또한 고려되어야 한다.

본 명세서의 재조합 핵산은 원핵 또는 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 이둘 모두에서 발현하는데 적합한 벡터에 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 결찰시킴으로써 만들어질 수 있다. 재조합 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 운반체는 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터들에는 다음과 같은 유형들의 플라스미드들이 포함된다: 원핵 세포들, 가령, 대장균(대장균)에서의 발현을 위한 pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 pUC-유래 플라스미드.

일부 포유류 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 실행하는 원핵(prokaryotic) 서열과 진핵 세포에서 발현된 진핵(eukaryotic) 전사 단위를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예들이다. 이들 벡터중 일부는 박테리아 플라스미드, 가령, pBR322의 서열로 변형되어, 진핵 세포와 원핵 세포 모두에서 복제 및 약물 저항성 선별이 가능하다. 대안으로, 바이러스, 가령, 소의 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유래 그리고 p205)의 유도체들이 진핵 세포에서 단백질의 일시적 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 하기 유전자 요법 운반 시스템의 설명에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체들의 변형에 사용되는 다양한 방법들은 해당 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 원핵 세포와 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템, 뿐만 아니라 전반적인 재조합 과정은, 예컨대, Molecular Cloning　A Laboratory　Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)을 참고한다. 일부 예들에서, 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 배큘로바이러스 발현 시스템들의 예들에는 pVL-유래 벡터들 (가령, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래 벡터들 (가령, pAcUW1), 및 pBlueBac-유래 벡터들 (가령, ß을 함유하는 pBlueBac III)이 포함된다.

바람직한 구체예에서, 벡터, 예를 들면, Pcmv-스크립트 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wisc.)는 CHO 세포에서 대상 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 생산하도록 설계될 것이다. 대상 유전자 구조체들을 이용하여 배양물에서 증식된 세포들에서 대상 ActRII 폴리펩티드를 발현시켜, 예컨대, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 정제용 단백질을 제조할 수 있음은 자명해질 것이다.

본 명세서는 하나 또는 그 이상의 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열이 포함된 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 또한 관계한다. 숙주 세포는 임의의 원핵세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드는 박테리아 세포, 가령, 대장균, 곤충 세포 (가령, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용), 효모, 또는 포유류 세포 [가령, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포계통]에서 발현될 수 있다. 숙련된 기술자들에게는 다른 적합한 숙주 세포들이 또한 알려져 있다.

따라서, 본 명세서는 추가로 대상 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관련된다. 가령, ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분비되고, 이 폴리펩티드를 함유하는 세포와 배지 혼합물로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획물 및 수집되어 용해된 세포들, 및 분리된 단백질에 함유되어 있을 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 해당 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 해당 폴리펩티드들은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRII 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화력 정제, 그리고 ActRII 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 물질을 이용한 친화력 정제 (가령, 단백질 A 컬럼을 이용하여 ActRII-Fc 융합 단백질을 정제할 수 있다)를 포함하는 단백질을 정제하는데 공지된 기술을 이용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 이 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.

일부 구체예들에 있어서, 예를 들면, 다음중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드는 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정하였을 때, >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도이고, SDS PAGE에 의해 측정하였을 때 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도를 가질 수 있다. 목표 수준의 순도는 포유류 시스템, 특히 비-인간 영장류, 설치류(생쥐), 및 인간에 바람직한 결과를 얻는데 충분한 정도이어야 한다.

다른 구체예에서, 재조합 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드의 원하는 부분의 N 말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제 개열 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni²⁺ 금속 수지를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이후, 정제 리더 서열은 정제된 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드 및 이의 이종다량체를 제공하기 위해, 엔테로키나아제로 처리에 의해 차후 제거될 수 있다. 예컨대, Hochuli 외., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht 외. (1991) PNAS USA 88:8972 참조.

융합 유전자를 만드는 기술은 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열들을 코딩하는 다양한 DNA 절편의 결합은 결찰용 블런트-단부 또는 스태거-단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 적절한 점성 단부의 충진, 원치않는 결합을 피하기 위한 알칼리 포스파타아제 처리, 및 효소적 결찰을 이용하는 종래의 기술들에 따라 수행된다. 또다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성장치를 비롯한 종래의 기술들에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 간에 상보적 오버행(overhangs)을 만드는 엥커 프라이머를 이용하여 실행되고, 후속적으로 어닐링시켜 키메라 유전자 서열을 만들 수 있다. 예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 외., John Wiley & Sons: 2009를 참조하라.

4. 항체 길항제들

특정 양상들에 있어서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제는 항체 (GDF/BMP 길항제 항체), 또는 항체의 조합이다. GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체들의 조합은, 예를 들어, 하나 이상의 ActRII 리간드들 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, 및/또는 GDF3), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), I형 수용체 (ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7) 및/또는 공동-수용체에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, GDF/BMP 길항제 항체는 폐 고혈압 (PH)을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 특히, 하나 또는 그 이상의 PH-관련 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 지지 요법 또는 활성물질과 병용하여 이용될 수 있다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE)을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 액티빈에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 액티빈 항체 (항-액티빈 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 액티빈에 결합하는 항체로, 이 항체는 액티빈을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-액티빈 단백질에 액티빈항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, 액티빈에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 액티빈 항체는 상이한 종의 액티빈중에서 보존되는 액티빈의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에서, 항-액티빈 항체는 인간 액티빈에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 항체는 액티빈이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 액티빈-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 항체는 액티빈이 ActRII 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 액티빈-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 액티빈 A는 액티빈 B에 일부 서열 상동성을 공유하고, 따라서 일부 경우에 액티빈 A에 결합하는 항체는 또다른 액티빈 B에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있고, 이는 또한 항-액티빈 B 항체에 적용된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 액티빈에 결합하고, 그리고 추가로 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관계한다. 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에 있어서, 액티빈에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에 있어서, 액티빈에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 상기 항체의 조합은 액티빈 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 슈퍼패밀리 리간드 [가령, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 BMP10 항체 그리고 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 액티빈 B를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 액티빈 B에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 액티빈 B 항체 (또는 항-액티빈 B 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 액티빈 B에 결합할 수 있고, 따라서 이 항체는 액티빈 B를 표적으로 하는 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-액티빈 B 단백질에 액티빈 B 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, 액티빈 B에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 액티빈 B 항체는 상이한 종의 액티빈 B 중에서 보존되는 액티빈 B의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-액티빈 B 항체는 인간 액티빈 B에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B 항체는 액티빈 B가 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 액티빈 B-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B 항체는 액티빈 B가 공동-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈 B-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 액티빈 B는 액티빈 A와 유사한 서열 상동성을 가지며, 따라서 일부 경우에 액티빈 B에 결합하는 항체는 또한 액티빈 A에 결합 및/또는 이를 억제 할 수 있음을 유의해야 한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 액티빈 B에 결합하고, 그리고 추가로 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관계한다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 상기 항체의 조합은 액티빈 B 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 액티빈 B 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF8을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF8에 결합한다. 본 명세서에서 사용되는, GDF8 항체 (또는 항-GDF8 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF8에 결합하는 항체로, 이 항체는 GDF8을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF8 단백질에 GDF8 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, GDF8에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, GDF8 항체는 상이한 종의 GDF8에서 보존되는 GDF8의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-GDF8 항체는 인간 GDF8에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF8 항체는 GDF8이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF8-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, GDF8 항체는 GDF8이 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF8-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. GDF8은 GDF11과 높은 서열 상동성을 가지므로, 일부 경우에 GDF8에 결합하는 항체는 GDF11에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있음을 유의하여야 한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 GDF8에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF11, GDF3, BMP15, BMP10, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, GDF8에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에 있어서, GDF8에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 GDF8 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF8 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, GDF8 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF811을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF11에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, GDF11 항체 (또는 항-GDF11 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF11에 결합하는 항체로, 이 항체는 GDF11을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF11 단백질에 GDF11 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, GDF11에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, GDF11 항체는 상이한 종의 GDF11에서 보존된 GDF11의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-GDF11 항체는 인간 GDF11에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF11 항체는 GDF11이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF11-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, GDF11 항체는 GDF11이 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF11-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. GDF11은 GDF8과 높은 서열 상동성을 가지고, 따라서 일부 경우에 GDF11에 결합하는 항체는 GDF8에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 GDF11에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, GDF11에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, GDF11에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 GDF11 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF11 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, GDF11 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP6을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP6에 결합한다. 본 명세서에서 사용되는 BMP6 항체 (또는 항-BMP6 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP6에 결합하는 항체로, 이 항체는 BMP6을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP6 단백질에 BMP6 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, BMP6에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, BMP6 항체는 상이한 종의 BMP6에서 보존된 BMP6의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-BMP6 항체는 인간 BMP6에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP6 항체는 BMP6이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP6-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, BMP6 항체는 BMP6이 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP6-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 BMP6에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10, 및 GDF11], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, BMP6에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, BMP6에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10^-7 M 보다 큰 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 BMP6 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP10, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP6 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, BMP6 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF3을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 GDF3에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, GDF3 항체 (또는 항-GDF3 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF3에 결합하는 항체로, 이 항체는 GDF3을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF3 단백질에 GDF3 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, GDF3에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, GDF3 항체는 상이한 종의 GDF3에서 보존된 GDF3의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-GDF3 항체는 인간 GDF3에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF3 항체는 GDF3이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF3-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, GDF3 항체는 GDF3이 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 GDF3-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 GDF3에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, BMP6, BMP15, BMP10, 및 GDF11], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, GDF3에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, GDF3에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 또는 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나 또는 상대적으로 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 GDF3 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 액티빈 BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, 및 BMP15], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF3 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, GDF3 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP15를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP15에 결합한다. 본 명세서에서 사용되는 BMP15 항체 (또는 항-BMP15 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP15에 결합하는 항체로, 이 항체는 BMP15를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP15 단백질에 BMP15 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, BMP15에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, BMP15 항체는 상이한 종의 BMP15에서 보존되는 BMP15의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-BMP15 항체는 인간 BMP15에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP15 항체는 BMP15가 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP15-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, BMP15 항체는 BMP15가 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP15-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 BMP15에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP10, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, BMP15에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, BMP15에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 BMP15 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, 및 GDF11], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP9 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, BMP15 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP10을 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 BMP10에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, BMP10 항체 (또는 항-BMP10 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP10에 결합하는 항체로, 이 항체는 BMP10을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP10 단백질에 BMP10 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, BMP10에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, BMP10 항체는 상이한 종의 BMP10에서 보존된 BMP10의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-BMP10 항체는 인간 BMP10에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP10 항체는 BMP10이 I형 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7)에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP10-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, BMP10 항체는 BMP10이 공동-수용체에 결합하는 것을 억제시킬 수 있고, 따라서 BMP10-매개된 신호전달 (가령, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 BMP10에 결합하고, 그리고 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF11, GDF3, 및 BMP6], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체), 및 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에 있어서, BMP10에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는다 (가령, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 BMP9에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, BMP10에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 액티빈 A에 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 가령, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는다). 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 BMP10 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 추가 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및 액티빈 BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, 및 GDF11], 하나 또는 그 이상의 I형 수용체 및/또는 II형 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 하나 또는 그 이상의 공동-수용체에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, BMP10 항체를 포함하는 항체의 조합은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, BMP10 항체를 포함하는 항체의 조합은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ActRIIB를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ActRIIB에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ActRIIB 항체 (항-ActRIIB 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 ActRIIB에 결합하는 항체를 말하며, 이 항체는 ActRIIB를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ActRIIB 단백질에 ActRIIB 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, ActRIIB에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, ActRIIB 항체는 상이한 종의 ActRIIB에서 보존된 ActRIIB의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-ActRIIB 항체는 인간 ActRIIB에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-ActRIIB 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15]가 ActRIIB에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항-ActRIIB 항체는 ActRIIB에 결합하고, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF3, BMP6, 및 BMP10], I형 수용체 (가령, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 공동-수용체, 및/또는 추가 II형 수용체 (가령, ActRIIA)수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 항-ActRIIB 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) BMP6, GDF3, 및 BMP10], 공동-수용체, I형 수용체 (가령, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 추가 II형 수용체 (가령, ActRIIA)에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. ActRIIB는 ActRIIA와 서열 유사성을 가지고, 따라서 일부 경우에 ActRIIB에 결합하는 항체는 ActRIIA에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ActRIIA를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ActRIIA에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ActRIIA 항체 (항-ActRIIA 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 ActRIIA에 결합하는 항체를 말하며, 이 항체는 ActRIIB를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ActRIIA 단백질에 ActRIIA 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, ActRIIA에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-ActRIIA 항체는 상이한 종의 ActRIIA에서 보존된 ActRIIA의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-ActRIIA 항체는 인간 ActRIIA에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-ActRIIA 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15]가 ActRIIA에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항-ActRIIA 항체는 ActRIIA에 결합하고, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF3, BMP6, 및 BMP10], I형 수용체 (가령, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 공동-수용체, 및/또는 추가 II형 수용체 (가령, ActRIIB)수용체에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 항-ActRIIA 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) BMP6, GDF3, 및 BMP10], 공동-수용체, I형 수용체 (가령, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), 및/또는 추가 II형 수용체 (가령, ActRIIB)에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다. ActRIIA는 ActRIIB와 서열 유사성을 가지고, 따라서 일부 경우에 ActRIIA에 결합하는 항체는 ActRIIB에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK4를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK4에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ALK4 항체 (또는 항-ALK4 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 ALK4에 결합하는 항체로, 이 항체는 ALK4를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ALK4 단백질에 ALK4 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, ALK4에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-ALK4항체는 상이한 종의 ALK4에서 보존된 ALK4의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-ALK4 항체는 인간 ALK4에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-ALK4 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15]가 ALK4에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항-ALK4 항체는 ALK4에 결합하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF3, BMP6, 및 BMP10], II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK5 및/또는 ALK7)에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 항-ALK4 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) BMP6, 및 BMP10], 공동-수용체, II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK5 및/또는 ALK7)에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK5를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK5에 결합한다. 본 명세서에서 사용되는 ALK5 항체 (또는 항-ALK5 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 ALK5에 결합하는 항체로, 이 항체는 ALK5를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ALK5 단백질에 ALK5 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, ALK5에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-ALK5항체는 상이한 종의 ALK5에서 보존된 ALK5의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-ALK5 항체는 인간 ALK4에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-ALK5 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15]가 ALK5에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항-ALK5 항체는 ALK5에 결합하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF3, BMP6, 및 BMP10], II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK4 및/또는 ALK7)에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 항-ALK5 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) BMP6, 및 BMP10], 공동-수용체, II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK4 및/또는 ALK7)에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다.

특정 양상들에 있어서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK7를 억제하는 항체다. 따라서, 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 항체, 또는 항체의 조합은 최소한 ALK7에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ALK7 항체 (또는 항-ALK7 항체)는 일반적으로 충분한 친화력으로 ALK7에 결합하는 항체로, 이 항체는 ALK7을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ALK7 단백질에 ALK7 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA), Biacore, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화력 분석에 의해 측정하였을 때, ALK7에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-ALK7 항체는 상이한 종의 ALK7에서 보존된 ALK7의 에피토프에 결합한다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 항-ALK7 항체는 인간 ALK7에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-ALK7 항체는 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP15]가 ALK7에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항-ALK7 항체는 ALK7에 결합하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC) GDF3, BMP6, 및 BMP10], II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK4 및/또는 ALK5)에 결합하는 다중특이적 항체 (가령, 이중-특이적 항체)이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 항체의 조합, 및 이의 용도에 관계하는데, 이때 항체의 조합은 항-ALK7 항체 및 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, GDF11, GDF8, 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및 액티빈 BE) BMP6, 및 BMP10], 공동-수용체, II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 추가 I형 수용체 (가령, ALK4 및/또는 ALK5)에 결합하는 하나 또는 그 이상의 추가 항체를 포함한다.

용어 항체는 본 명세서에서 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않은 다양한 항체 구조를 포괄하는 광범위한 의미로 이용된다. 항체 단편은 손상되지 않은(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예: scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다[가령, Hudson 등, (2003) Nat. Med. 9:129-134; Pl

uckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제 5,571,894; 5,587,458; 및 5,869,046]. 디아바디는 2가 또는 이중-특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다 [see, 가령, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies) 또한 Hudson 등, (2003) Nat. Med. 9:129-134에서 설명된다. 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예들에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체다 [가령, 미국 특허 제 6,248,516]. 본 명세서에서 공개된 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 거기에 부착되어, 탐지가능하게 만드는 라벨을 포함할 수 있다 (예를 들어, 라벨은 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자 일 수 있다). 바람직한 특정 구체예들에서, 본 발명의 항체는 단리된 항체다. 바람직한 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 항체는 재조합 항체다.

본 발명의 항체는 임의의 분류일 수 있다. 항체의 분류는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5 가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 추가 세분될 수 있다. 상이한 면역 글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤(mu)라고 불린다.

일반적으로, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 항체는 바람직하게는 높은 결합 친화력으로 그 표적 항원에 결합한다. 친화력은 K_D 값으로 표현될 수 있으며, 고유 결합 친화력을 반영한다 (가령, 최소화된 항체결합력(항체결합력) 효과). 전형적으로, 결합 친화력은 시험 관내에서 무(free)-세포 또는 세포와 관련된 환경에서 측정된다. 예를 들면, Biacore, 방사능라벨된 항원-결합 분석 (RIA), 및 ELISA가 포함된 본원에 개시된 것들을 포함하여, 당해 분야에 공지된 다수의 임의의 분석을 사용하여 결합 친화력 측정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체는 최소한 K_D 값이 1x 10^-7 또는 더 강하게, 1x10^-8 또는 더 강하게, 1x10^-9 또는 더 강하게, 1x10^-10 또는 더 강하게, 1x10^-11 또는 더 강하게, 1x10^-12 또는 더 강하게, 1x10^-13 또는 더 강하게, 또는 1x10^-14 또는 더 강하게 이들의 표적 항원(가령, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, 액티빈, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10, 및/또는 BMP6)에 결합한다.

특정 구체예들에 있어서, K_D는 하기 분석에 기재된 바와 같이, 관심있는 항체의 Fab 버전 및 그의 표적 항원으로 수행된 RIA에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화력은 라벨되지 않은 항원의 일련의 역가 존재하에 최소 농도의 방사능라벨된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 그 다음 항-Fab 항체-피복된 플레이트로 결합된 항원(예컨대, ¹²⁵I-라벨된)을 포집시킴으로써 측정된다 [예로써, Chen 등, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881 참고]. 상기 분석의 조건을 확립하기 위하여, 다중-웰 플레이트 (가령, MICROTITER^®, Thermo Scientific)는 포획용 항-Fab 항체 (가령, Cappel Labs)로 피복하고(가령, 하룻밤동안), 후속적으로 바람직하게는 실온 (대략 23°C)에서 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트에서 방사능라벨된 항원은 일련의 관심 대상 Fab 희석물과 혼합된다 [가령, 항-VEGF 항체, Fab-12의 측정과 일관되게, Presta 등, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. 관심대상의 Fab는 그 다음 바람직하게는 하룻밤 동안 항온처리되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 약 65 시간) 동안 항온처리가 지속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 바람직하게는 실온에서 약 1 시간 동안 배양을 위해 포획 플레이트로 이동시킨다. 상기 용액은 제거되고, 플레이트는 바람직하게는 폴리소르베이트 20 및 PBS 혼합물로 수차례 세척된다. 상기 플레이트가 건조되면, 섬광제(scintillant) (가령, MICROSCINT^®, Packard)가 추가되고, 이 플레이트는 감마 카운터 (가령, TOPCOUNT^® _,Packard)상에서 카운트된다.

또 다른 구체예에 따르면, K_D는 예를 들면, BIACORE^®2000 또는 BIACORE^®3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용하여, 고정된 항원 CM5 칩, 약 10 반응 단위 (RU)와 함께 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된다. 간략하게 설명하자면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업자에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙시니미드 (NHS)로 활성화시킨다. 예를 들면, 항원은 결합된 단백질의 대략 10 반응 단위(RU)를 얻기 위하여 분당 5 μl의 유속으로 주사하기 전, 10 mM 아세테이트 나트륨, pH 4.8으로 5 ㎍/ml (약 0.2 μM)로 희석시킬 수 있다. 항원 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비-반응 그룹을 차단한다. 역동학 측정을 위하여, 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^®) 계면활성제 (PBST)와 함께 Fab의 2-배 일련의 희석물 (0.78 nM 에서 500 nM)은 PBS에서 분당 대략 25 μl의 유속으로 주사된다. 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)는 결합 및 해리 센소그램의 동시 피틸에 의해, 예를 들면, 단순한 일대일(one-to-one) Langmuir 결합 모델 (Biacore^® Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 산출된다. 평형 해리 상수 (K_D)는 k_오프/k_온 비율로 계산된다[가령, Chen 등, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결합 속도가, 예를 들면, 10⁶ M^-1 s^-1 를 초과하는 경우, 분광계, 가령, 스탑-플로우(stop-flow)가 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 구비한 8000-시리즈 SLM-AMINCO^® 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정시, 항원의 농도를 증가시키면서 PBS 안에 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도(가령, 여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 ??칭 기술에 의해 결합 속도(on-rate)를 측정할 수 있다.

항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 손상되지 않은 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 재조합 숙주 세포(가령, 대장균(E. coli) 또는 파지)에 의해 생산된 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 ActRIIA, ActRIIB, ALK7, ActRIIB, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 및 액티빈 E), GDF11, GDF8, BMP15, GDF3, BMP10, 및 BMP6의 핵산 및 아미노산 서열은 당분야에 공지되어 있다. 또한, 항체를 생성하기 위한 수많은 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 그 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본 명세서의 내용에 따라 사용하기 위한 항체 길항제는 본원에 제공된 기술 및 개시에 기초하여, 숙련된 기술자에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 키메라 항체다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 특정 키메라 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567; 그리고 Morrison 등, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855에서 설명된다. 일부 구체예들에 있어서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (가령, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 가령, 원숭이로부터 유도된 가변 영역)과 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 키메라 항체는 부류 또는 하위분류가 모 항체의 부류 또는 하위분류에서 변경된 "부류 전환(class switched)"항체다. 일반적으로, 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 구체예들에 있어서, 키메라 본 발명의 항체는 인간화된 항체다. 인간화된 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVRs)의 아미노산 잔기와 인간 틀-구조 영역 (FRs)의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVRs (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 말한다. 인간화된 항체 및 이를 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633에서 검토되며, 그리고 예를 들면 Riechmann 등, (1988) Nature 332:323-329; Queen 등,. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; 미국 특허 제 5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; 그리고 7,087,409; Kashmiri 등, (2005) Methods 36:25-34 [SDR (a-CDR) 그래프팅을 설명]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 ("재표면화"를 설명); Dall'Acqua 등,. (2005) Methods 36:43-60 ("FR 셔플링"을 설명); Osbourn 등,. (2005) Methods 36:61-68; 그리고 Klimka 등,. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (FR 셔플링에 대한 "유도된 선별" 방식을 설명)에서 설명되고 있다. 인간화에 이용되는 인간 틀-구조 영역은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: "best-fit" 방법을 이용하여 선택된 틀-구조 영역 [가령, Sims 등,. (1993) J. Immunol. 151:2296 ]; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위집단의 인간 항체의 콘센수스 서열로부터 유도된 틀-구조 영역 [가령, Carter 등,. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; 그리고 Presta 등,. (1993) J. Immunol., 151:2623]; 인간 성숙 (체세포적으로 성숙된) 틀-구조 영역 또는 인간 생식계 틀-구조 영역 [가령, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 틀-구조 영역 [가령, Baca 등,., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 그리고 Rosok 등,., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618].

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 인간 항체다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459에서 기재된다. 예를 들면, 인간 항체는 항원 공격에 대하여 손상되지 않은 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 손상되지 않은 항체를 만들도록 변형된 이식유전자를 가진 동물에게 면역원 (가령, GDF11 폴리펩티드, 액티빈 B 폴리펩티드, ActRIIA폴리펩티드, 또는 ActRIIB 폴리펩티드)을 투여하여 만들 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 내인성 면역 글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 무작위로 동물의 염색체에 통합된 인간 면역 글로불린 좌위 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 이식유전자를 가진 동물에서 내인성 면역 글로불린 유전자 좌위는 일반적으로 불활성화되었다. 이식유전자를 가진 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법은 예를 들면, Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125; 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSE™기술 설명); 미국 특허 제 5,770,429 (HuMab^® 기술 설명); 미국 특허 제 7,041,870 (K-MMOUSE^® 기술 설명); 그리고 미국 공개특허 출원 제 2007/0061900 (VelociMouse^® 기술 설명)을 참고한다. 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 얻은 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형 될 수 있다.

인간 본 발명의 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단클론 항체 생산용 인간 골수종 및 생쥐-인간 이형골수종 세포계통이 기재된 바 있다 [가령, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur 등 (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; 그리고 Boerner 등 (1991) J. Immunol., 147: 86 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 만들어진 인간 항체는 Li 등, (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562에서 기재되어 있다. 추가 방법은 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 (하이브리도마 세포 계통에서 단클론 인간 IgM 항체를 생산하는 것을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma technology)은 또한 Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91에 기재된다. 본 발명의 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변-도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인에 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하는 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 기술하고 있다.

예를 들면, 본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 작용을 가진 항체에 대하여 복합 라이브러리 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 원하는 결합 특성을 가진 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, Hoogenboom 등 (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J. and further described, for example, in the McCafferty 등 (1991) Nature 348:552-554; Clackson 등, (1991) Nature 352: 624-628; Marks 등 (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu 등 (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee 등 (2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; 그리고 Lee 등 (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132에서 검토된다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 그 다음 파지 라이브러리에 무작위로 재조합된 다음, Winter 등 (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455에서 설명된 바와 같이, 항원-결합 파지에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편의 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 출처로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 고-친화력 항체 (예컨대, ActRIIA, ActRIIB, 액티빈, GDF11, GDF8, BMP15, GDF3, 또는 BMP6)를 제공한다. 대안으로, Griffiths 등 (1993) EMBO J, 12: 725-734에서 설명된 바와 같이 전혀 면역화되지 않은 광범위한 비-자가 및 자가 항원에 대한 항체의 단일 출처를 제공하기 위해 (가령, 인간으로부터) 나이브(naive) 레퍼토리가 클론될 수 있다. 끝으로, Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388에 기재된 바와 같이, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험 관내에서 재배열을 수행하기 위하여, 재배치되지 않은 V- 유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 나이브 라이브러리를 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 간행물은 예를 들면: 미국 특허 제 5,750,373, 및 미국 공개특허 출원 제 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360를 포함한다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체다. 다중특이적 항체 (전형적으로 단클론 항체)는 하나 또는 그 이상의 (가령, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의) 항원에서 최소한 2개의 (가령, 2, 3, 4, 5, 또는 6 또는 그 이상의) 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다.

다중특이적 항체를 만드는 기술은 상이한 특이성을 가진 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄의 재조합 공동-발현을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 [가령, Milstein and Cuello (1983) Nature 305: 537; 국제특허공개. WO 93/08829; 그리고 Traunecker 등 (1991) EMBO J. 10: 3655, 및 미국 특허 제 5,731,168 ("놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작기술)]. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이형이량체 분자를 만드는 정전기적 스티어링 효과 (가령, WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편의 가교 [가령, 미국 특허 제 4,676,980; 그리고 Brennan 등 (1985) Science, 229: 81]; 이중특이적 항체를 만들기 위하여 류신 지퍼 이용 [가령, Kostelny 등 (1992) J. Immunol., 148(5):1547-1553]; 이중특이적 항체 단편을 만들기 위하여 "디아바디" 기술 이용 [가령, Hollinger 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]; 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체 이용 [가령, Gruber 등 (1994) J. Immunol., 152:5368]; 그리고 삼중특이적 항체 준비 (가령, Tutt 등 (1991) J. Immunol. 147: 60)에 의해 또한 만들어질 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 준비될 수 있다. "옥토푸스(Octopus) 항체"를 포함하는 3개 또는 그 이상의 기능성 항원-결합 부위를 가진 조작된 항체 또한 본 명세서에 포함된다 [가령, US 2006/0025576A1].

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 단클론 항체다. 단클론 항체는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 에피토프에 대해 지시되는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단일 클론 항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 방법에 따라 사용될 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조 될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.

예를 들면, 액티빈 유래 면역원을 이용하여, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단클론 항체를 표준 프로토콜에 의해 만들 수 있다 [가령, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988 참고]. 포유류, 가령, 생쥐, 햄스터, 또는 토끼는 액티빈 폴리펩티드의 면역원 형태, 항체 반응을 유도할 수 있는 항원 단편, 또는 융합 단백질로 면역화될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 운반체에 대한 접합, 또는 당업계에 널리 공지된 다른 기술을 포함한다. 액티빈 폴리펩티드의 면역원 부분은 보강제 존재하에 투여될 수 있다. 면역화 과정은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가 탐지에 의해 모니터될 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역분석은 항체 생산 수준 및/또는 결합 친화력 수준을 평가하기 위하여 항원으로 면역원을 이용한다.

액티빈 항원 제재로 동물을 면역화시킨 후, 항혈청이 수득되며, 원하는 경우, 혈청으로부터 다클론 항체가 단리될 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체 생성 세포 (림프구)를 면역화 동물로부터 수확하고, 표준 체세포 융합 과정에 의해 골수종 세포와 같은 불멸화 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 수득 할 수 있다. 이러한 기술은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 하이브리도마 기술 [가령, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], 인간 B 세포 하이브리도마 기술 [가령, Kozbar 등 (1983) Immunology Today, 4:72], 및 EBV-하이브리도마 기술[Cole 등 (1985) 단클론 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]을 포함한다. 하이브리도마 세포는 액티빈 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 및 그러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양 물로부터 단리된 항체의 생산을 위해 면역화학적으로 스크리닝 될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항체의 Fc 영역 안으로 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이체가 만들어질 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환, 결손, 및/또는 추가)이 포함된 인간 Fc 영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

예를 들면, 본원의 개시 내용은 전체 효과기 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 효과기 기능 [가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)]은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 Fcγ만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγFcγ및 Fcγ를 발현시킨다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 예를 들면, Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적인 예는 미국 특허 제 5,500,362; Hellstrom, I. 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; 미국 특허 제 5,821,337; Bruggemann, M. 등 (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361에 기재되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법이 이용될 수 있다(가령, ACTI™유동 세포측정용 비-방사능활성 세포독성 분석; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 그리고 CytoTox 96^®비-방사능활성 세포독성 분석, Promega, Madison, Wis.). 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, 동물 모델에서 생체에서 평가될 수 있는데, 가령, Clynes 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656에 기재되어 있다. 이 항체는 C1q에 결합 할 수 없으므로, CDC 활성이 결핍된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 시행될 수 있다 [가령, C1q 및 C3c 결합 ELISA, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402]. 보체 활성화 평가를 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다[가령, Gazzano-Santoro 등 (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. 등 (2003) Blood 101:1045-1052; 그리고 Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743 참고]. FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정은 당분야에 공지된 방법에 의해 또한 실행될 수 있다 [가령, Petkova, S. B. 등 (2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769]. 감소된 효과기 기능을 가진 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329에 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 또는 그 이상이 치환된 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 제 7,332,581).

특정 구체예들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기으로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 가령, "thioMAbs"를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로 구체예에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이 상체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 가령, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 임의의 하나 또는 그 이상의 다음 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541에서 설명된 바와 같이 만들어질 수 있다.

또한, 원하는 항체를 동정하기 위하여 항체를 스크리닝하는데 이용되는 기술은 수득되는 항체의 성질에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 항체가 용액 내 항원을 결합시키는데 사용되는 경우, 용액 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 동정하기 위해, 항체와 항원 사이의 상호 작용을 시험하기 위한 다양한 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술에는 ELISAs, 표면 플라스몬 공명 결합 분석 (가령, Biacore 결합 분석, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 분석 (가령, 반자성 비드 시스템, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), 웨스턴 블랏, 면역침전 분석, 및 면역조직 화학이 포함된다.

특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들도 고려된다. 예를 들면, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들은 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 이 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 안에 잔기의 결손 및/또는 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 원하는 성질, 가령, 표적-결합 (가령, 및 액티빈 가령, 액티빈 E 및/또는 액티빈 C 결합)을 보유한다면, 최종 구조체에 결손, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.

예를 들면, 항체 친화력을 개선시키기 위하여 변경 (가령, 치환)은 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR에서 "hotspots", 가령, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코드되는 잔기에서 만들어질 수 있고[가령, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)], 및/또는 SDRs (a-CDRs), 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화력에 대하여 테스트된다. 2 차 라이브러리로부터의 재구성 및 재선택에 의한 친화성 성숙은 당업계에 기술되어 있다[가령, Hoogenboom 외, in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). 친화력 성숙의 일부 구체예들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(가령, 오류-발생(error-prone) PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이생성). 제 2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화력을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지시된 방법을 포함하는데, 이때 몇 개의 HVR 잔기 (가령, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위 배정된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 가령, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 대개 표적이 된다.

특정 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVRs에 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (가령, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 HVRs에 만들어 질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDRs 밖에 있을 수 있다. 상기에서 제시된 변이체 VH 및 VL의 특정 구체예들에 있어서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기 집단 (가령, 하전된 잔기, 가령, Asp, Arg, His, Lys, 및 Glu)는 동정되고, 그리고 항체-항원의 상호작용이 영향을 받는지를 판단하기 위하여 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 추가 치환이 상기 아미노산 위치에 도입되어, 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정(crystal) 구조를 결정하여 항체와 항원 간의 접촉 점들을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로 표적화되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 이 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 (가령, ADEPT를 위한) 효소 또는 이 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 이 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.

특정 구체예들에 있어서, 본원에서 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 예로는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소레인, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동형중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동형중합체, 프로일프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 상태하에 치료에 사용될 것인지 여부에 관계없이, 개선되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정 특성 또는 기능을 포함하는, 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.

5. 소분자 길항제들

다른 양상들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제는 소분자 (GDF/BMP 소분자 길항제), 또는 소분자 길항제의 조합이다. GDF/BMP 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은, 예를 들어, 하나 이상의 GDF/BMP 리간드 (예컨대, 액티빈, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, 및/또는 BMP15), I형 수용체 (예컨대, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), II형 수용체 (예컨대, ActRIIB 및/또는 ActRIIA), 공동-수용체, 및/또는 하나 이상의 신호전달 인자들 (예컨대, Smad 단백질, 가령, Smads 2 및 3)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제의 조합은 예를 들면, 세포-기반 분석, 가령, 본원에서 설명된 것들에서 측정되었을 때, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP-결합 리간드에 의해 매개된 신호전달을 억제한다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, GDF/BMP 소분자 길항제는 폐 고혈압 (PH)을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 특히, 하나 또는 그 이상의 PH-관련 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 지지 요법 또는 활성물질과 병용하여 이용될 수 있다.

일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 GDF11, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 GDF8을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF11, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE)을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 액티빈 B를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 BMP6을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 BMP15를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 GDF3을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 BMP10을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 ActRIIA를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 ActRIIB를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 ALK4를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 ALK5를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 길항제 소분자, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 ALK7을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제의 조합은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 BMP9를 억제하지 않거나, 또는 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제의 조합은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 액티빈 A를 억제하지 않거나, 또는 실질적으로 억제하지 않는다.

GDF/BMP 소분자 길항제는 직접 또는 간접 억제제일 수 있다. 예를 들면, 간접적 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제의 조합은 최소한 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 B, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 또는 액티빈 BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 GDF8], I형 수용체 (예컨대, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), II형 수용체들 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 하나 이상의 하류 신호전달 성분들 (예컨대, Smads)의 발현 (가령, 전사, 번역, 세포성 분비, 또는 이의 조합)을 억제할 수 있다. 대안으로, 직접적 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제의 조합은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 [가령, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 B, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 또는 액티빈 BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 GDF8], I형 수용체 (예컨대, ALK4, ALK5 및/또는 ALK7), II형 수용체들 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 하나 이상의 하류 신호전달 성분들 (예컨대, Smads)에 직접적으로 결합하여, 이를 억제할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 간접적 그리고 하나 또는 그 이상의 직접적 GDF/BMP 소분자 길항제의 조합은 본 명세서에 따라 이용될 수 있다.

본 명세서의 소-분자 길항제의 결합은 공지의 방법을 이용하여 동정 및 화학적으로 합성될 수 있다 (가령, PCT 공개번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585). 일반적으로, 본 명세서의 소분자 길항제는 보통 약 2000 달톤 크기, 대안으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만의 크기이며, 이때 이러한 유기 소분자는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 바람직하게 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 소분자 길항제는 잘 알려진 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인 될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다(가령, 국제 공개특허 제. WO00/00823 및 WO00/39585).

본 명세서의 결합 유기 소분자는 예를 들면, 알데히드, 케톤, 옥심, 하이드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1 차 아민, 2 차 아민, 3 차 아민, N-치환된 하이드라진, 하이드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 디설파이드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할로겐화물, 아릴 술포네이트, 알킬 할로겐화물, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물 및 산 클로라이드를 포함한다.

6. 폴리뉴클레오티드 길항제들

다른 양상들에서, 본 명세서의 방법 및 용도에 따라 사용된 GDF/BMP 길항제는 폴리뉴클레오티드(GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제), 또는 폴리뉴클레오티드의 조합이다. GDF/BMP 길항제 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드의 조합은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 리간드 (가령, 액티빈, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10,및/또는 BMP15), I형 수용체 (가령, ALK4, ALK5, 및/또는 ALK7), II형 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 공동-수용체, 및/또는 하류 신호생성 성분 (가령, Smads)을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 예를 들면, 세포-기반 분석, 가령, 본원에서 설명된 것들에서 측정되었을 때, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP-결합 리간드에 의해 매개된 신호전달을 억제한다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제는 폐 고혈압 (PH)을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 특히, 하나 또는 그 이상의 PH-관련 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 지지 요법 또는 활성물질과 병용하여 이용될 수 있다.

일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 GDF11을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 GDF8을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF11, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE)을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 액티빈 B를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 BMP6을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 BMP15을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 GDF3을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 BMP10을 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ActRIIA를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ActRIIB를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ALK4를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ALK5를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ALK7를 억제하며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 GDF8, 액티빈(예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10, 및 하나 이상의 Smad 단백질 (예컨대, Smads 2 및 3)을 더 억제한다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 BMP9를 억제하지 않거나, 또는 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, GDF/BMP 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 액티빈 A를 억제하지 않거나, 또는 실질적으로 억제하지 않는다.

일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 길항제는 안티센스 핵산, RNAi 분자 [가령, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 작은-헤어핀 RNA (shRNA), microRNA (miRNA)], 압타머 및/또는 리보자임일 수 있다. 인간 GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 및 액티빈 E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15, 및 Smad 단백질의 핵산 및 아미노산 서열은 해당 분야에 공지되어 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 길항제를 만드는 상이한 많은 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 명세서에 따라 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 길항제는 본 명세서에 제공된 기술 및 개시 내용에 기초하여, 숙련된 기술자에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.

안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 삼중 나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들면, Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense 억제제s of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)에서 논의된다. 삼중-나선 형성은 예를 들면, Cooney 외. (1988) Science 241:456; 그리고 Dervan 외, (1991) Science 251:1300에서 논의된다. 상기 방법은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한다. 일부 구체예들에 있어서, 안티센스 핵산은 본원에 개시된 유전자의 RNA 전사체의 최소한 일부에 상보적인 단일 가닥 RNA 또는 DNA 서열을 포함한다. 그러나, 절대적인 상보성이 바람직하지만, 반드시 필요한 것은 아니다.

본원에서 언급된 "RNA의 최소한 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화되어 안정한 이중을 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 본원에 개시된 유전자의 이중 가닥 센스 핵산의 경우, 상기 이중 가닥 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나, 삼중체 형성을 검정할 수 있다. 혼성화하는 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이 모두에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화되는 핵산이 많을수록 RNA와의 염기 미스 매치가 더 많이 포함될 수 있으며, 여전히 안정한 이중 (또는 경우에 따라 삼중나선)을 형성할 수 있다. 숙련된 기술자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위하여 표준 절차에 따라 허용가능한 정도의 불일치를 확인할 수 있다.

메시지의 5 '말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지의 5'-비-번역되는 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작용해야 한다. 그러나, mRNA의 3'-비-번역 서열에 상보적인 서열은 mRNA의 번역 억제에도 효과적임이 밝혀졌다 [가령, Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. 따라서, 본 발명의 유전자의 5'- 또는 3'- 비-번역된 비-코딩 영역 중 어느 하나에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내인성 mRNA의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근법에서 사용될 수 있다. mRNA의 5'-비-번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역에 다소 효과가 적은 억제제이지만, 본 명세서의 방법에 이용될 수 있다. 본 명세서의 mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩 영역에 혼성화되도록 설계된다면, 안티센스 핵산은 길이가 최소한 6개 뉴클레오티드이어야 하고, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 약 50개 뉴클레오티드가 된다. 특정 양상에서 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개 뉴클레오티드, 최소한 17개 뉴클레오티드, 최소한 25 개 뉴클레오티드 또는 최소한 50개 뉴클레오티드이다.

한 구체예에서, 본 명세서의 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터 전사에 의해 세포 안에서 생성된다. 예를 들면, 벡터 또는 이의 부분이 전사되어, 본 명세서의 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)이 만들어진다. 이러한 벡터는 원하는 안티센스 핵산을 인코드하는 서열을 함유할 것이다. 이러한 벡터 는 목적하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있는 한, 에피솜 (episomal)으로 남아있거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당 업계의 표준 재조합 DNA 기술 방법에 의해 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 또는 척추동물 세포에서 복제 및 발현에 이용되는 당분야에 공지된 다른 것들이 될 수 있다. 본 명세서의 바람직한 유전자를 인코딩하는 서열 또는 이의 단편은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 것으로 당분야에 알려진 임의의 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 항시성 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 [가령, Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310], Rous 육종 바이러스의 3' 긴-말단 반복부에 포함된 프로모터 [가령, Yamamoto 등 (1980) Cell 22:787-797], 허피스 티미딘 프로모터 [가령, Wagner 등 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1441-1445], 그리고 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열[가령, Brinster, 등 (1982) Nature 296:39-42]을 포함한다.

일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 길항제는 다음 중 하나 이상의 발현을 표적하는 간섭 RNA (RNAi) 분자들이다: GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 및 액티빈 E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15, 및 Smad 단백질. RNAi는 표적화된 mRNA의 발현을 방해하는 RNA의 발현을 의미한다. 구체적으로, RNAi는 siRNA(짧은 간섭 RNA)를 통해 특정 mRNA와 상호작용하여 표적 유전자를 침묵시킨다. 그런 다음 ds RNA 복합체는 이 세포에 의한 분해의 표적이 된다. siRNA 분자는 길이가 10 내지 50개 뉴클레오티드의 이중-가닥으로 된 RNA 이중나선으로, 충분히 상보적인(가령, 이 유전자에 최소 80% 동일성) 표적 유전자의 발현을 간섭한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 siRNA 분자는 이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

추가 RNAi 분자는 짧은-헤어핀 RNA (shRNA)을 포함하며; 또한 짧은-간섭 헤어핀 및 microRNA (miRNA)을 포함한다. 상기 shRNA 분자는 루프에 의해 연결된 표적 유전자의 센스 및 안티센스 서열을 함유한다. 상기 shRNA는 핵으로부터 세포질로 운반되며, mRNA를 따라 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터는 RNAi를 위한 RNAs 발현에 이용될 수 있다. Paddison 등 [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002]는 RNAi에 영향을 주는 수단으로 헤어핀으로 접힌 작은 RNA 분자를 사용했다. 따라서, 이러한 짧은-헤어핀 RNA (shRNA) 분자는 본 명세서에서 기재된 방법에 또한 유익하게 이용된다. 기능적 shRNA의 줄기와 루프의 길이는 다양하며; 줄기 길이는 약 25 내지 약 30nt 범위일 수 있고, 루프 크기는 침묵 활성에 영향을 미치지 않고, 4 내지 약 25nt 범위일 수 있다. 특정 이론에 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 shRNA는 DICER RNase의 이중 가닥으로 된 RNA (dsRNA)와 유사하며, 특정 유전자 발현 억제에 동일한 능력을 갖는다. 상기 shRNA는 렌티바이러스성 벡터로부터 발현될 수 있다. miRNA는 길이가 약 10 ~ 70개 뉴클레오티드의 단일 가닥으로된 RNA이며, "스템 루프 (stem-loop)" 구조를 특징으로 하는 pre-miRNA로 먼저 전사되고, 후속적으로 RISC를 통해 추가 처리후 성숙 miRNA로 처리된다.

siRNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 RNAi를 매개하는 분자는 화학적 합성 (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), dsRNA의 가수분해 (Yang 등, Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), T7 RNA 중합효소와 시험관내 전사 (Donzeet 등, Nucleic Acid Res 30:e46, 2002; Yu 등, Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), 그리고 뉴클레아제, 가령, 대장균(e. coli) RNase III를 이용하여 이중-가닥으로 된 RNA의 가수분해 (Yang 등, Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 시험관 내에서 만들어질 수 있다.

또다른 측면에 따르면, 본 명세서는 decoy DNA, 이중-가닥으로 된 DNA, 단일-가닥으로 된 DNA, 복합체화된 DNA, 포집화된(encapsulated) DNA, 바이러스성 DNA, 플라스미드 DNA, 네이키드(naked) RNA, 포집화된 RNA, 바이러스성 RNA, 이중-가닥으로 된 RNA, RNA 간섭을 만들 수 있는 분자, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 폴리뉴클레오티드 길항제를 제공한다.

일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 길항제는 압타머(aptamers)이다. 압타머는 이중-가닥으로 된 DNA와 단일-가닥으로 된 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자로써, 표적 분자에 특이적으로 결합하여, 4차 구조를 형성한다. 압타머의 일반적 그리고 치료 용도는 당분야에 잘 확립되어 있다 (가령, 미국 특허 제 5,475,096). 압타머에 대한 추가 정보는 미국 공개특허 출원 제 20060148748에서 찾아볼 수 있다. 핵산 압타머는 당업계에 공지 된 방법, 예를 들어, 지수적 농축 (SELEX) 프로세스에 의한 리간드의 체계적 진화 (Systemigen Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 통해 선택된다. SELEX는 가령, 미국 특허 제 5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177; 6,011,577; 그리고 6,699,843에 기재된 바와 같이, 표적 분자에 매우 특이적 결합을 하는 핵산 분자의 시험관내 개발 방법이다. 압타머를 동정하기 위한 또다른 스크리닝 방법은 미국 특허 제 5,270,163에 설명되어 있다. SELEX 과정은 다양한 2-차원 및 3-차원 구조를 형성하기 위한 핵산의 능력 뿐만 아니라, 실제 모든 화합물과 함께 리간드 (특정 결합 쌍을 형성)로 작용하는 뉴클레오티드 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다양성을 기반으로 하는데, 이들 단량체 또는 중합체는 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로 작용할 수 있다. SELEX 방법은 후보 올리고 뉴클레오티드의 혼합물로부터의 선택 및 원하는 결합 친화력 및 선택성을 달성하기 위해, 동일한 일반 선택 방안을 사용하여 결합, 분할 및 증폭의 단계적 반복을 포함한다. 무작위화된 서열의 분절을 포함할 수 있는 핵산 혼합물로부터 시작하여, 상기 SELEX 방법은 결합에 우호적인 조건하에 표적에 상기 혼합물을 접촉시키는 단계; 표적 분자에 특이적으로 결합된 핵산으로부터 결합안된 핵산을 분할시키는 단계; 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜, 핵산의 리간드 농축된 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 상기 결합, 분할, 해리 및 증폭 단계들은 표적 분자에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 핵산 리간드를 만들기 위하여 필요한 수의 주기로 반복된다.

전형적으로, 이러한 결합 분자는 동물에 별도 투여되지만 [가령, O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], 그러나 이러한 결합 분자는 숙주 세포가 취한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있고, 생체내에서 발현될 수 있다 [가령, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].

7. 폴리스타틴 및 FLRG 길항제들

다른 양상들에서, GDF/BMP 길항제는 폴리스타틴 또는 FLRG 폴리펩티드이다. 본 명세서에 기재된 폴리스타틴 및/또는 FLRG 폴리펩티드는 폐 고혈압 (PH)을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여, 특히, 하나 또는 그 이상의 PH-관련 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위하여 이용될 수 있다.

용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 임의의 자연 발생적 폴리스타틴 폴리펩티드, 뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 임의의 이의 변이체들 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드이며, 임의의 기능성 폴리스타틴 단량체 또는 다량체를 더 포함한다. 특정 바람직한 구체예들에서, 본 명세서의 폴리스타틴 폴리펩티드는 액티빈, 구체적으로 액티빈 A에 결합하고 및/또는 이의 활성을 억제한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 폴리스타틴 폴리펩티드 변이체들은 폴리스타틴 및 액티빈 상호작용과 관련된 기존 연구에 근거하여 동정될 수 있다. 예를 들면, WO2008/030367은 액티빈 결합에 중요한 것으로 보이는 특이적 폴리스타틴 도메인 ("FSDs")을 개시한다. 하기 서열 번호: 28-30에 나타낸 바와 같이, 폴리스타틴 N-말단 도메인 ("FSND" 서열 번호:28), FSD2 (서열 번호: 30), 그리고 다소 약한 FSD1 (서열 번호: 29)은 액티빈 결합에 중요한 폴리스타틴 안에 있는 예시적인 도메인을 나타낸다. 또한, 폴리펩티드 라이브러리를 만들고 테스트하는 방법은 ActRII 폴리펩티드 관련 내용에서 설명되며, 이러한 방법들 또한 폴리스타틴의 변이체를 만들고, 테스트하는 방법에 속한다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 선택적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의 공지의 폴리스타틴 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 예로는 예를 들면, WO2005/025601에서 설명된 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 (서열 번호: 90)의 성숙 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 더 짧은 아이소형 또는 다른 변이체들을 포함한다.

인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 아이소형 FST344는 다음과 같다:

1 mvrarhqpgg lcllllllcq fmedrsaqag ncwlrqakng rcqvlyktel

51 skeeccstgr lstswteedv ndntlfkwmi fnggapncip cketcenvdc

101 gpgkkcrmnk knkprcvcap dcsnitwkgp vcgldgktyr necallkarc

151 keqpelevqy qgrckktcrd vfcpgsstcv vdqtnnaycv tcnricpepa

201 sseqylcgnd gvtyssachl rkatcllgrs iglayegkci kakscediqc

251 tggkkclwdf kvgrgrcslc delcpdsksd epvcasdnat yasecamkea

301 acssgvllev khsgscnsis edteeeeede dqdysfpiss ilew

(서열 번호: 26; NCBI 참조 번호 NP_037541.1)

상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시되며; 또한 상기 밑줄은 하기에 나타낸 더 짧은 폴리스타틴 아이소형과 이 폴리스타틴 아이소형을 구별시키는 C-말단 연장을 나타내는 마지막 27개 잔기다.

인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 아이소형 FST317은 다음과 같다:

1 MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL

51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC

101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLKARC

151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA

201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC

251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA

301 ACSSGVLLEV KHSGSCN (서열 번호: 27; NCBI 참조 번호 NP_006341.1)

상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.

폴리스타틴 N-말단 도메인 (FSND) 서열은 다음과 같다:

gncwlrqakngrcqvlyktelskeeccstgrlstswteedvndntlfkwmifnggapncipck (서열 번호: 28; FSND)

FSD1 및 FSD2 서열은 다음과 같다:

etcenvdcgpgkkcrmnkknkprcv (서열 번호: 29; FSD1)

ktcrdvfcpgsstcvvdqtnnaycvt (서열 번호: 30; FSD2)

다른 양상들에서, 본 명세서에 따라 사용되는 물질은 폴리스타틴-유사 관련된 유전자(FLRG)이며, 이는 또한 폴리스타틴-관련된 단백질 3 (FSTL3)로도 알려져 있다. 용어 "FLRG 폴리펩티드"는 임의의 자연 발생적 FLRG 폴리펩티드, 뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 임의의 이의 변이체들 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 본 명세서의 FLRG 폴리펩티드는 액티빈, 특히 액티빈 A에 결합하고 및/또는 이의 활성을 억제한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 FLRG 폴리펩티드 변이체들은 FLRG 및 액티빈 상호작용을 분석하는데 이용되는 통상적인 방법(가령, US 6,537,966)을 이용하여 동정될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 라이브러리를 만들고 테스트하는 방법은 ActRII 폴리펩티드 관련 내용에서 설명되며, 이러한 방법들 또한 FLRG의 변이체를 만들고, 테스트하는 방법에 속한다. FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 선택적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의 공지의 FLRG 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다.

인간 FLRG 전구체 (폴리스타틴-관련된 단백질 3 전구체) 폴리펩티드는 다음과 같다:

1 mrpgapgplw plpwgalawa vgfvssmgsg npapggvcwl qqgqeatcsl

51 vlqtdvtrae ccasgnidta wsnlthpgnk inllgflglv hclpckdscd

101 gvecgpgkac rmlggrprce capdcsglpa rlqvcgsdga tyrdecelra

151 arcrghpdls vmyrgrcrks cehvvcprpq scvvdqtgsa hcvvcraapc

201 pvpsspgqel cgnnnvtyis schmrqatcf lgrsigvrha gscagtpeep

251 pggesaeeee nfv (서열 번호: 31; NCBI 참조 번호 NP_005851.1)

상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.

특정 구체예들에 있어서, 폴리스타틴 폴리펩티드와 FLRG 폴리펩티드의 기능성 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴 폴리펩티드의 최소한 일부분 또는 FLRG 폴리펩티드와 하나 또는 그 이상의 융합 도메인, 가령, 예를 들면, 폴리펩티드의 단리, 탐지, 안정화 또는 다량체화를 용이하게 하는 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 적합한 융합 도메인은 ActRII 폴리펩티드와 관련하여 상기에서 상세하게 논의된다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 길항제 물질은 Fc 도메인에 융합된 폴리스타틴 폴리펩티드의 액티빈-결합 부분이 포함된 융합 단백질이다. 또다른 구체예에서, 본 명세서의 길항제 물질은 Fc 도메인에 융합된 FLRG 폴리펩티드의 액티빈-결합 부분이 포함된 융합 단백질이다.

8. 스크리닝 검사

특정 양상들에서, 본 발명은 폐 고혈압 (PH)을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소, 특히, 하나 이상의 PH-관련 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시킬 수 있는 화합물 (제제들)을 동정하기 위한, 대상 GDF/BMP 길항제들 (예컨대, ActRII 폴리펩티드 및 이의 변이체)의 용도에 관한 것이다.

하나 이상의 GDF/BMP 리간드들의 신호전달 (예컨대,, Smad 신호전달)을 표적함으로써 PH를 치료하는 치료제를 스크리닝하는 다수의 방법들이 존재한다. 특정 구체예들에 있어서, 선택된 세포 계통에서 GDF/BMP 리간드-매개된 효과를 교란시키는 물질을 동정하기 위해 화합물의 고효율 스크리닝이 수행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 분석은 GDF/BMP 리간드 (예컨대,.액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, GDF3, BMP6, GDF8, GDF15, GDF11 또는 BMP10)의 그 결합 쌍, 가령, II형 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 대한 결합을 특이적으로 억제 또는 감소시키는 화합물을 스크리닝 및 동정하기 위하여 실행된다. 대안으로, 상기 분석은 GDF/BMP 리간드가 이의 결합 쌍, 가령, II형 수용체에 대한 결합을 향상시키는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, II형 수용체와 상호 작용하는 능력에 의해 이 화합물이 동정될 수 있다.

다양한 분석 포맷이 본 명세서에 비추어 충분할 것이나, 본 명세서에 명백하게 기술되지 않은 것들도 해당 분야의 숙련된 기술자들은 알고 있을 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 테스트 화합물 (물질)은 임의로 조합한 화학 방법에 의해 생성 될 수 있다. 대안으로, 본 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 합성된 자연 발생 생체 분자일 수 있다. 조직 성장의 조절자로서 작용하는 능력에 대하여 테스트되는 화합물 (물질)은 예를 들어, 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체 (예 : 천연 생성물)에 의해 생성될 수 있고, 화학적으로 만들어질 수 있거나 (예: 펩티도모방체를 포함하는 소분자), 또는 재조합 적으로 생산 될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 테스트 화합물은 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 테스트 물질은 분자량이 약 2,000 달톤 미만인 작은 유기 분자이다.

본 명세서의 테스트 화합물은 단일의 별개 엔터티로 제공되거나, 또는 조합 화학에 의해 만들어진, 더 큰 복합체 라이브러리로 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예를 들어, 알코올, 알킬 할로겐화물, 아민, 아미드, 에스터, 알데히드, 에터 및 다른 분류의 유기 화합물을 포함 할 수 있다. 테스트 화합물을 테스트 시스템에 제시하는 것은 분리된 형태 또는 화합물의 혼합물로서, 특히 초기 스크리닝 단계에서 제시할 수 있다. 선택적으로, 상기 화합물은 임의로 다른 화합물로 유도체화 될 수 있고, 이 화합물의 단리를 용이하게 하는 유도체화 기를 가질 수 있다. 유도체화기의 비-제한적인 예는 바이오틴, 플루오레세인, 디옥시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위 원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타티온 S-전이효소(GST), 광활성 가교제 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다.

화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 테스트하는 많은 약물-스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간 동안 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 고-처리량 분석이 바람직하다. 정제되거나 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 것과 같이, 세포가 없는 시스템에서 수행되는 분석은 테스트 화합물에 의해 중재되는 분자 표적의 신속한 개발 및 변경의 상대적으로 용이한 탐지를 가능하게 하기 위해 생성 될 수 있다는 점에서 종종 "1 차" 스크린으로 선호된다. 더욱이, 테스트 화합물의 세포 독성 또는 생물이용성의 효과는 시험관 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있지만, 대신 이 분석은 GDF/BMP 리간드 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, GDF8, GDF15, GDF11, GDF3, BMP6, 또는 BMP10)와 이의 결합 쌍, 가령, II형 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)간의 결합 친화력의 변경으로 현시될 수 있는, 분자 표적 상에 약물의 효과에 주로 집중한다.

단지 설명하기 위해, 본 발명의 예시적인 스크리닝 분석에서, 목적 화합물은 분석 의도에 적합하다면, ActRIIB 리간드에 통상적으로 결합 할 수 있는, 분리 및 정제된 ActRIIB 폴리펩티드에 접촉시킨다. 상기 화합물 및 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIB 리간드 (가령, GDF11)가 함유된 조성물이 추가된다. ActRIIB/ActRIIB-리간드 복합체의 탐지 및 정량화는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성을 억제(또는 강화)하는데 있어서 이 화합물의 효과를 측정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 테스트 화합물을 사용하여 얻은 데이터로부터 용량-반응 곡선을 생성함으로써 평가할 수 있다. 더욱이, 대조 분석을 수행하여 비교를 위한 기준을 제공할 수도 있다. 예를 들면, 대조군 분석에서, 단리 및 정제된 ActRIIB 리간드가 ActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가되고, ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체의 형성은 테스트 화합물의 부재하에 정량화된다. 일반적으로, 반응물이 혼합되는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 정제된 단백질 대신, 세포성 추출물과 용해물을 이용하여 적합한 무-세포 분석 시스템을 제공한다.

GDF/BMP 리간드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들면, 복합체 형성의 조절은 예를 들면, 탐지가능하도록 라벨된 단백질 가령, 방사능라벨된 (가령, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광으로 라벨된 (가령, FITC), 또는 효소적으로 라벨된 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 단백질을 이용하거나, 면역분석에 의해, 또는 크로마토그래피 탐지에 의해 정량화될 수 있다.

GDF/BMP 리간드와 이의 결합 단백질 간에 상호작용을 직접적으로, 또는 간접적으로 측정함에 있어서, 형광 편광 분석 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석의 이용을 고려한다. 더욱이, 다른 방식의 탐지, 가령, 광학 도파관(waveguides) (가령, PCT 공개 WO 96/26432 및 미국 특허 제 5,677,196 참고), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 표면 전하 센서, 및 표면력 센서등은 본 명세서의 많은 구체예에 적합하다.

더욱이, 본 명세서는 GDF/BMP 리간드와 이의 결합 쌍 사이의 상호작용을 파괴 또는 강화시키는 물질들을 동정하기 위한 "2-하이브리드 분석"으로 알려진 상호작용 트랩 분석의 사용을 고려한다. 가령, 미국 특허 제 5,283,317; Zervos 등, (1993) Cell 72:223-232; Madura 등, (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel 등, (1993) Biotechniques 14:920-924; 그리고 Iwabuchi 등, (1993) Oncogene 8:1693-1696). 특정 구체예에서, 본 명세서는 GDF/BMP 리간드와 이의 결합 단백질 간의 상호작용을 해리시키는 화합물 (가령, 소분자 또는 펩티드)를 동정하기 위한 역 2-하이브리드 시스템의 사용을 고려한다 [Vidal 및 Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal 및 Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 및 미국 특허 5,525,490; 5,955,280; 그리고 5,965,368 참고].

특정 구체예들에 있어서, 상기 대상 화합물은 본 명세서의 GDF/BMP 리간드와 상호작용하는 능력에 의해 동정된다. 상기 화합물과 GDF/BMP 리간드 간의 상호작용은 공유 또는 비-공유적일 수 있다. 예를 들면, 광-가교, 방사능라벨된 리간드 결합, 및 친화력 크로마토그래피가 포함된 시험관내 생화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 이러한 상호작용이 동정될 수 있다. [Jakoby WB 등 (1974) Methods in Enzymology 46:1]. 특정 경우에서, 상기 화합물은 기전-기반의 분석, 가령, GDF/BMP 리간드에 결합하는 화합물을 탐지하는 분석에서 스크리닝될 수 있다. 이 분석은 고형-상 또는 유체-상 결합의 경우를 포함할 수 있다. 대안으로, GDF/BMP 리간드를 인코드하는 유전자는 리포터 시스템 (가령, β갈락토시다제, 루시퍼라제, 또는 녹색 형광 단백질)과 함께 세포 안으로 형질감염되고, 라이브러리, 바람직하게는 고처리량 스크리닝 또는 이 라이브러리의 개별 구성요소들에 대하여 스크리닝될 수 있다. 다른 기전-기반의 결합 분석이 이용될 수 있는데, 예를 들면, 자유 에너지의 변화를 탐지하는 결합 분석이 이용될 수 있다. 결합 분석은 웰, 비드 또는 칩에 고정된 표적을 이용하여 또는 고정된 항체에 의해 포집된 표적 또는 모세관 전기영동에 의해 해리되는 표적을 이용하여 실행될 수 있다. 상기 결합된 화합물은 발색 종점 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 탐지될 수 있다.

9. 치료 용도

일부에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압 (예컨대, 폐동맥 고혈압)의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증 (예컨대, 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피 세포 증식, 폐 동맥에서 혈관신생, 호흡곤란, 가슴 통증, 폐 혈관 재형성, 우심실 비대, 및 폐 섬유증) 치료 방법을 고려한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 하나 또는 그 이상의 폐 고혈압 합병증의 예방법을 고려하며, 이 방법은 이를 요하는 환자에게 효과량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 폐 고혈압의 진행 속도 감소 방법을 고려하며, 이 방법은 필요로 하는 환자에게 효과량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 하나 이상의 폐 고혈압 합병증의 진행 속도 감소 방법을 고려하며, 이 방법은 필요로 하는 환자에게 효과량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 하나 또는 그 이상의 폐 고혈압 중증도 감소 방법을 고려하며, 이 방법은 필요로 하는 환자에게 효과량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 하나 또는 그 이상의 폐동맥 고혈압 합병증의 중증도 감소 방법을 고려하며, 이 방법은 필요로 하는 환자에게 효과량의 GDF/BMP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 선택적으로, 본 명세서에 개시된, 폐 고혈압을 치료, 예방, 또는 진행 속도 및/도는 중증도를 감소, 특히, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증을 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위한 방법들은, 폐 고혈압을 치료하기 위한 하나 이상의 지지 요법 또는 추가 활성제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자는 또한 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 지지 요법 또는 활성제가 투여될 수 있다: 프로스타사이클린 및 이의 유도체 (예컨대, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제 (예컨대, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제 (예컨대, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 통로 차단제 (예컨대, 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀; 항응고제 (예컨대, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격절개술; 폐동맥 혈전내막제거술; 포스포다이에스테라제 5형 억제제 (예컨대, 실데나필 및 토달라필); 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제 (예컨대, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제 (예컨대, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-다이온, NQDI-1; 2-싸이옥소-싸이아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-싸이옥소-싸이아졸리딘-5-일리덴)-1,3-다이하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제들 (예컨대, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-다이플루오로프로피온아마이드; C28 이미다졸 (CDDO-Im); 2-사이아노-3,12-다이옥솔란-1,9-다이엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트라이플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트라이플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS2); 메틸 3,11-다이옥솔란-12-엔-28-올레이트 (DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사다이아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트) 폐 및/또는 심장 이식술. 일부 구체예에서, 환자는 또한 BMP9 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 성숙 BMP9 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, BMP9 폴리펩티드는 제약학적 제재로 투여되며, 선택적으로 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 BMP9 프로도메인 폴리펩티드를 포함하는 BMP9 제약학적 제재들에서, BMP9 폴리펩티드는 BMP9 프로도메인 폴리펩티드와 비공유적으로 결합될 수 있다. 일부 구체예들에서, BMP9 제약학적 제재들은 BMP9 프로도메인 폴리펩티드가 실질적으로 없거나 이를 포함하지 않는다. BMP9 폴리펩티드 (성숙 및 프로-폴리펩티드), BMP9 프로도메인 폴리펩티드, 이를 포함하는 제약학적 조성물, 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드 및 제약학적 조성물의 제조 방법은, 예를 들어, WO 2013/152213에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 본 명세서에서 사용되는, 장애 또는 병태를 "예방하는" 치료는, 통계적 시료에서, 비처리안된 대조 시료와 비교하여 처리된 시료에서 장애 또는 병태의 발생이 감소되거나, 또는 비처리된 대조 시료와 비교하여 장애 또는 병태의 하나 또는 그 이상의 증상의 개시를 지연시키거나 또는 그 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 본 명세서에 개시된 유효량의 임의의 GDF/BMP 길항제들 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)을 투여하는 것을 포함하는 간질성 폐 질환 (예컨대, 특발성 폐 섬유증) 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 간질성 폐 질환은 폐 섬유증이다. 일부 구체예들에서, 간질성 폐 질환은 다음 중 어느 하나에 의해 유발된다: 규폐증, 석면폐증, 베릴륨증, 과민성 폐렴, 약물 사용 (예컨대, 항생제, 화학치료 약물, 항부정맥제, 스타틴), 전신 경화증, 다발근육염, 피부근육염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 감염 (예컨대, 비정형 폐렴, 주폐포자충 폐렴, 결핵, 클라미디아 트라코마티스, 및/또는 호흡기 세포융합 바이러스), 림프관성 암종증, 담배 흡연, 또는 발달 장애. 일부 구체예들에서, 간질성 폐 질환은 특발성 (예컨대, 사르코이드증, 특발성 폐 섬유증, 하만-리치 증후군 (Hamman-Rich syndrome), 및/또는 항합성효소 증후군)이다. 특정 구체예들에서, 간질성 폐 질환은 특발성 폐 섬유증이다. 일부 구체예들에서, 특발성 폐 섬유증의 치료는 추가 치료제와 조합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 추가 치료제는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 피르페니돈, N-아세틸시스테인, 프레드니손, 아자티오프린, 닌테다닙, 이의 유도체 및 이의 조합.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 특정 병태가 일단 확립되었을 때 그 병태의 개선 또는 제거를 포함한다. 어느 경우에나, 예방 또는 치료는 의사 또는 다른 건강 관리 제공자에 의해 제공된 진단 및 의도한 치료제 투여 결과로 동정 될 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에서 설명된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방은 GDF/BMP 길항제의 "유효량"을 투여하여 이루어진다. 물질의 유효량이란 필요한 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 본 명세서의 물질의 "치료학적 유효량"은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 물질의 능력에 따라 달라질 수 있다. 물질의 예방차원의 유효량이란 원하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "대상체", "개체", 또는 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 호환가능하며, 일반적으로 포유류를 지칭한다. 포유류는 길들여진 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

폐 고혈압 (PH)은 기존에 원발성 (특발성) 또는 속발성으로 분류되어 왔다. 최근, 세계 보건 기구 (WHO)는 폐 고혈압을 다음 5개 그룹으로 분류하였다: 그룹 1: 폐동맥 고혈압 (PAH); 그룹 2: 좌측 심장 질환이 있는 폐 고혈압; 그룹 3: 폐 질환 및/또는 저산소혈증이 있는 폐 고혈압; 그룹 4: 만성 혈전증 및/또는 색전증 질환으로 인한 폐 고혈압; 및 그룹 5: 기타 병태 (예컨대, 사르코이드증, 조직구증 X, 림프관종 및 폐 혈관의 압박). 예를 들어, Rubin (2004) Chest 126:7-10을 참고하라.

특정 양상들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 (예컨대, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증의 치료, 예방, 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소) 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐동맥 고혈압을 가진 폐 고혈압 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 좌측 심장 질환이 있는 폐 고혈압을 가진 폐 고혈압 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 질환 및/또는 저산소혈증을 가진 폐 고혈압 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 만성 혈전증 및/또는 색전증 질환을 가진 폐 고혈압 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 사르코이드증, 조직구증 X, 또는 림프관종 및 폐 혈관의 압력을 가진 폐 고혈압 환자에 관련된다.

폐동맥 고혈압은 폐 혈관구조의 심각하고 진행성이며 삶을 위협하는 질환으로, 극심한 혈관수축 및 폐동맥 벽에 있는 평활근 세포들의 이상 증식으로 특징된다. 폐의 혈관들의 중증도의 수축은 매우 높은 폐동맥 압력을 초래한다. 이러한 높은 압력은 심장이 혈액을 폐를 통해 펌프시켜 산소화되기 어렵게 한다. PAH 환자는 심장이 이러한 높은 압력에 대항하여 펌프하고자 애쓰기 때문에 극심한 호흡 곤란을 경험한다. PAH 환자는 전형적으로 폐 혈관 저항 (PVR)의 유의한 증가 및 폐 동맥 압력 (PAP)의 지속적 상승을 발달시키며, 이는 궁극적으로 우심실부전 및 사망을 초래한다. PAH를 진단받은 환자는 예후가 좋지 않고 삶의 질도 이와 동일하게 손상되며, 치료하지 않을 경우 진단시부터 평균 기대 수명이 2 내지 5년이다.

혈관 재형성 (즉, 과다형성)의 원인이 될 수 있는 폐 세포들의 증식을 비롯한 다양한 요인들이 폐 고혈압의 발병에 원인이 된다. 예를 들어, 폐 혈관 재형성은 폐 고혈압 환자의 평활근 세포 및 동맥 내피 세포들의 증식에 의해 주로 발생한다. 다양한 사이토카인의 과발현은 폐 고혈압을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 또한, 폐 고혈압은 폐동맥 평활근 세포 및 폐 내피 세포의 과다증식으로부터 생길 수 있음이 발견되었다. 또한, 진행성 PAH는 원위 폐 세동맥의 근육화, 동심성 내막 비후, 및 내피 세포들을 증식시킴에 의한 혈관 내강의 폐쇄로 특징될 수 있다. Pietra 외, J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004).

특정 양상들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 (예컨대, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증의 치료, 예방, 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소) 방법에 관한 것이며, 이 때 환자는 최소한 25 mm Hg (예컨대, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mm Hg)의 휴지기 폐동맥 압력 (PAP)을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 25 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 30 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 35 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 40 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 45 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 50 mm Hg의 휴지기 PAP을 가지는 환자에 관련된다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, PH 환자들의 하나 이상의 혈류역학 매개변수를 보다 정상 (예컨대, 유사 연령 및 성별의 건강한 사람들과 비교시 정상) 수준으로 조절하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 PAP를 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 3 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 5 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 7 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 10 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 12 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 15 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 20 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 PAP를 최소한 25 mmHg 만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 혈관 저항 (PVR)을 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 모세혈관 쐐기압 (PCWP)을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 좌심실 확장기말 압력 (LVEDP)을 증가시키는 것에 관한 것이다.

특정 양상들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는 하나 이상의 폐 고혈압 합병증의 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐 동맥에서 세포 증식의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐 동맥에서 평활근 및/또는 내피세포 증식의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐 동맥에서 혈관신생의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 신체 활동을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 호흡곤란 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 가슴 통증 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 피로 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐 섬유증 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 섬유증 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 폐 혈관 재형성 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 우심실 비대 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소에 관한 것이다.

특정 양상들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압 환자의 운동능 증가 방법에 관한 것이다. 임의의 적합한 운동능 측정법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체가 6분 이내에 얼마나 멀리 걸을 수 있는지, 즉, 6분 도보 거리 (6MWD)를 측정하는 6-분 도보 테스트 (6MWT)에서 운동능은, 폐 고혈압 중증도 및 질환 진행을 평가하기 위하여 빈번하게 사용된다. Borg 호흡곤란 지수 (BDI)는 인지된 호흡곤란 (호흡 불편)을 평가하기 위한 수치 척도이다. 이것은, 예를 들어, 6MWT 완료 후, 숨 참 (breathlessness)의 정도를 측정하며, 이 때 BDI 0은 숨 참이 없음을 나타내고 10은 최대 숨 참을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 10 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 20 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 30 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 40 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 50 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 60 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 70 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 80 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 90 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 6MWD를 최소한 100 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 0.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 1 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 1.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 2 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 2.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 3 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 3.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 4 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 4.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 5.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 6 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 6.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 7 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 7.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 8 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 8.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 9 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 9.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 최소한 3 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 폐 고혈압 환자의 BDI를 10 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다.

기준선에서의 폐 고혈압은 예를 들어, 세계 보건 기구 (WHO) 기능 분류로 측정시 경증, 중등증 또는 중증일 수 있으며, 이는 폐 고혈압 환자에서 질환 중증도의 측정치이다. WHO 기능 분류는 뉴욕 심장 학회 (NYHA) 체계를 개조한 것이며, 예를 들어, 질환 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터링함에 있어서 활동 내성을 정량적으로 평가하기 위해 통상적으로 사용된다 (Rubin (2004) Chest 126:7-10). WHO 체계에서 다음과 같은 4가지 기능 분류들이 인정된다: 분류 I: 신체 활동을 제한하지 않는 폐 고혈압; 일상의 신체 활동은 과도한 호흡곤란 또는 피로, 가슴 통증 또는 실신을 유발하지 않음; 분류 II: 신체 활동을 약간 제한하는 폐 고혈압; 환자는 휴식시 편안함; 일상의 신체 활동이 과도한 호흡곤란 또는 피로, 가슴 통증 또는 실신을 유발함; 분류 III: 신체 활동을 두드러지게 제한하는 폐 고혈압; 환자는 휴식시 편안함; 일상적인 것보다 덜한 활동이 호흡곤란 또는 피로, 가슴 통증 또는 실신을 유발함; 분류 IV: 증상없이 임의의 신체 활동을 수행하는 무능력을 가져오는 폐 고혈압; 환자는 우-심부전의 징후를 나타냄; 호흡곤란 및/또는 피로는 휴식시에도 존재할 수 있음; 어떠한 신체 활동에 의해서도 불편함이 증가됨.

특정 양상들에서, 본 명세서는 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압의 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 (예컨대, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증의 치료, 예방, 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소) 방법에 관한 것이며, 이 때 환자는 WHO가 인정하는 분류 I, 분류 II, 분류 III, 또는 분류 IV 폐 고혈압을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 WHO가 인정하는 분류 I 폐 고혈압을 가지는 환자에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 WHO가 인정하는 분류 II 폐 고혈압을 가지는 환자에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 WHO가 인정하는 분류 I 폐 고혈압으로부터 분류 II 폐 고혈압으로 진행하는 것을 예방 또는 지연시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 II 폐 고혈압으로부터 분류 I 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 WHO가 인정하는 분류 III 폐 고혈압을 가지는 환자에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 WHO가 인정하는 분류 II 폐 고혈압으로부터 분류 III 폐 고혈압으로 진행하는 것을 예방 또는 지연시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 III 폐 고혈압으로부터 분류 II 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 III 폐 고혈압으로부터 분류 I 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 WHO가 인정하는 분류 IV 폐 고혈압을 가지는 환자에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 WHO가 인정하는 분류 III 폐 고혈압으로부터 분류 IV 폐 고혈압으로 진행하는 것을 예방 또는 지연시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 IV 폐 고혈압으로부터 분류 III 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 IV 폐 고혈압으로부터 분류 II 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자가 분류 IV 폐 고혈압으로부터 분류 I 폐 고혈압으로 회귀하는 것을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다.

폐 고혈압에 관한 공지된 치료제는 존재하지 않으며; 현재의 치료 방법들은 환자의 수명을 연장시키고 환자 삶의 질을 개선하는 것에 초점을 두고 있다. 현재의 폐 고혈압 치료 방법들은 다음의 투여를 포함한다: 혈관확장제, 가령, 프로스타사이클린, 에포프로스테놀, 및 실데나필; 엔도텔린 수용체 길항제, 가령, 보센탄; 칼슘 통로 차단제, 가령, 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀; 항응고제, 가령, 와파린; 및 이뇨제. 폐 고혈압의 치료는 또한 산소 요법, 심방 중격절개술, 폐 혈전내막제거술, 및 폐 및/또는 심장 이식술을 사용하여 실시되어 왔다. 그러나 이들 방법들 각각은 하나 또는 여러 문제점들을 가지는데, 이러한 문제점에는 효율성 없음, 심각한 부작용, 낮은 환자 순응도, 및 고 비용이 포함될 수 있다. 특정 양상들에서, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF/BMP 길항제 (예컨대, 액티빈, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, 및 하나 이상의 Smad 단백질 중 하나 이상의 길항제)를, 폐 고혈압을 치료하기 위한 하나 이상의 추가 활성제 및/또는 지지 요법 (예컨대, 혈관확장제, 가령, 프로스타사이클린, 에포프로스테놀, 및 실데나필; 엔도텔린 수용체 길항제, 가령, 보센탄; 칼슘 통로 차단제, 가령, 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀; 항응고제, 가령, 와파린; 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격절개술; 폐 혈전내막제거술: 및 폐 및/또는 심장 이식술); BMP9 폴리펩티드; BMP10 폴리펩티드; 바르독솔론 메틸 또는 이의 유도체; 올레아놀릭 애시드 또는 이의 유도체와 병용하여 투여(예컨대,, 동시에 또는 상이한 시간에, 그러나 일반적으로 중첩되는 약리학적/생리학적 효과를 구현하는 방식으로 투여)하는 것을 포함하는, 폐 고혈압 치료, 예방, 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소 (예컨대, 하나 이상의 폐 고혈압 합병증을 치료, 예방 또는 이의 진행 속도 및/또는 중증도 감소)에 관한 것이다.

특정 구체예들에서, 본 명세서는, 본 명세서의 하나 이상의 GDF/BMP 길항제들 (예컨대, 리간드 트랩, 가령, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 및 GDF 트랩 폴리펩티드)로 치료받았던 또는 치료될 후보군인 환자를, 환자의 하나 이상의 혈액학적 매개변수를 측정함으로써, 관리하는 방법을 제공한다. 혈액학적 매개변수는 본 명세서의 길항제로 치료될 후보군인 환자에 대한 적절한 투약을 평가하고, 치료 동안 혈액학적 매개변수를 모니터링하고, 하나 또는 이상의 길항제로 투약하는 동안 투약량을 조절할지 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있거나,및/또는 본 명세서의 하나 이상의 길항제의 적절한 유지 투여 량을 평가할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수가 정상 수준을 벗어나면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 길항제의 투여는 감소, 지연 또는 종료 될 수 있다.

본원에서 제공된 방법에 따라 측정될 수 있는 혈액학적 매개변수는 예를 들어 적혈구 수준, 혈압, 철 저장 및 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 증가된 적혈구 수준과 상호 관련이 있는 체액에서 발견되는 다른 물질들을 포함한다. 이러한 매개변수는 환자의 혈액 시료를 사용하여 결정될 수 있다. 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 및/또는 적혈구용적률 수준의 증가는 혈압의 증가를 유발할 수 있다.

한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 길항제로 치료될 후보인 환자에서 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수가 정상 범위를 벗어나거나 정상의 상측에 있는 경우, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여 개시는 혈액 매개변수가 자연적으로 또는 치료적 중재를 통해 정상 또는 허용 수준으로 되돌아 올 때까지 지연 될 수 있다. 예를 들면, 후보 환자가 고혈압 또는 전-고혈압 환자인 경우, 환자의 혈압을 낮추기 위해 혈압 강하제로 치료할 수 있다. 개별 환자의 상태에 적합한 임의의 혈압 강하제,예를 들면, 이뇨제, 아드레날린 억제제 (알파 차단제 및 베타 차단제), 혈관확장제, 칼슘 채널 차단제, 앙지오텐신-전환 효소(ACE) 억제제, 또는 앙지오텐신 II 수용체 차단제가 이용될 수 있다. 혈압은 대안으로 식이 요법과 운동 요법으로 치료될 수 있다. 유사하게, 후보군 환자가 정상보다 낮은 철 저장 또는 정상보다 낮은 철 저장을 보유한다면, 환자의 철 저장이 정상 수준 또는 수용 가능한 수준으로 회복 될 때까지 환자는 적절한 식이 요법 및/또는 철 보충제를 사용하여 치료할 수 있다. 적혈구 수치가 정상보다 높거나 헤모글로빈 수치가 높은 환자의 경우, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여는 또는 허용가능한 수준으로 회복될 때까지 지연될 수 있다.

특정 구체예들에서, 하나 이상의 GDF/BMP 길항제들로 치료될 후보군인 환자에서 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수가 정상 범위를 벗어나거나 정상의 상한에 있는 경우, 상기 투여 개시는 지연되지 않을 수 있다. 그러나, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제를 투여하는 투약량 또는 투여 빈도는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여시 발생하는 혈액학적 매개변수의 허용할 수 없는 증가의 위험을 감소시키는 양으로 설정할 수 있다. 대안으로, 상기 환자를 위하여 바람직하지 않은 수준의 혈액학적 매개변수를 다루는 치료제와 하나 이상의 GDF/BMP 길항제들을 조합시킨 치료 요법이 개발될 수 있다. 예를 들면, 환자가 상승된 혈압을 가지는 경우, 하나 이상의 GDF/BMP 길항제와 혈압 저하제의 투여를 포함하는 치료 요법을 설계할 수 있다. 바람직한 철 저장보다 낮은 수준의 환자의 경우, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 길항제 및 철 보충제가 관련된 치료요법이 개발될 수 있다.

한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수에 대한 기저 수준 매개변수(들)은 본 명세서의 하나 이상의 GDF/BMP 길항제로 치료를 받게 될 후보 환자에 대해 확립될 수 있으며, 상기 기준선 값(들)에 근거하여 환자에 대한 적절한 투약 요법이 확립될 수 있다. 대안으로, 환자의 병력에 근거하여 확립된 기준선 매개 변수를 사용하여 환자에 대한 적절한 길항제 투약 요법을 고지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 건강한 환자가 정의된 정상 범위 이상인 확립된 기준선 혈압을 보유한 다면, 상기 환자의 혈압을 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제로 치료하기에 앞서, 일반 모집단에 대해 정상으로 간주되는 범위가 되게 할 필요는 없다. 본 명세서의 하나 이상의 GDF/BMP 길항제들로 치료하기 앞서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수에 대한 환자의 기저 수준 값은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제로 치료하는 동안 혈액학적 매개변수로의 임의의 변화를 모니터하기 위한 관련 비교 값으로도 또한 이용될 수 있다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수는 하나 이상의 GDF/BMP 길항제로 치료될 환자에서 측정된다. 상기 혈액학적 매개변수는 치료하는 동안 상기 환자를 모니터하는데 이용할 수 있고, 그리고 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약 조정 또는 종료, 또는 다른 치료제의 추가 투여의 조정 또는 종료하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 GDF/BMP 길항제들 의 투여로 혈압, 적혈구 수준, 또는 헤모글로빈 수준의 증가, 또는 철 저장의 감소가 초래된다면, 본 명세서의 상기 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약은 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수에 대한 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 효과를 감소시키기 위하여 그 양 또는 빈도를 줄일 수 있다. 하나 이상의 GDF/BMP 길항제의 투여로 인하여 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수가 상기 환자에게 불리하게 변화된다면, 본 명세서의 하나 이상의 길항제의 투약은 상기 혈액학적 매개변수(들)이 허용가능한 수준으로 회복될 때까지 일시적으로 종료될 수 있거나, 또는 영구적으로 종료될 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 매개변수가 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여량 또는 빈도의 감소후 허용가능한 범위내에 있지 않는 경우, 상기 투약은 종료될 수 있다. 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약 감소 또는 종료에 대한 대안으로서 또는 추가로서, 상기 환자에게, 혈액학적 매개변수(들)의 바람직하지 않은 수준을 해결하는 추가의 치료제, 예를 들어, 혈압 강하제 또는 철 보충제를 투여할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 GDF/BMP 길항제로 치료될 환자가 상승된 혈압을 가지는 경우, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약은 동일한 수준으로 지속될 수 있고, 혈압-강하제가 치료 섭생에 추가되며, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약 (가령, 양 및/또는 빈도)이 감소되고 그리고 혈압-강하제가 상기 치료 섭생에 추가되거나, 또는 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약은 종료될 수 있고 상기 환자는 혈압-강하제로 치료될 수 있다.

10. 제약학적 조성물

본 명세서에 기재된 치료제 (예를 들어, GDF/BMP 길항제)는 제약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 제약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 이러한 제제들은 일반적으로 대부분의 규제 요구 사항에 따라 실질적으로 발열원이 없을 것이다.

특정 구체예들에서, 본 명세서의 치료 방법은 상기 조성물을 전신 투여하거나, 또는 임플란트 또는 장치로부터 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여 될 때, 본원에서 사용하기 위한 치료용 조성물은 실질적으로 발열원이 없고 생리학적으로 허용가능한 형태이다. 전술한 바와 같이 조성물에 임의로 포함될 수 있는 GDF/BMP 길항제들 이외의 치료학적으로 유용한 제제는 본 명세서에 개시된 방법에서 대상 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

전형적으로, 본 명세서에 개시된 단백질 치료제는 비경구적으로, 특히 정맥내 또는 피하로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물들은 본 명세서의 하나 이상의 GDF/BMP 길항제와 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성 될 수 있는 멸균 분말을 포함할 수 있고, 여기에는 항산화제, 완충제, 정균제, 그리고 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제제를 제공하는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제가 포함될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 가령, 올리브 오일, 그리고 주사가능한 유기 에스터, 가령, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 가령, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 그리고 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

조성물 및 제제는, 원한다면, 활성 성분을 함유하는 하나 또는 그 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 관리 지침이 수반될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 표적 조직 부위에 운반하기 위한 형태에 포집되거나 또는 주입될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 조성물은 표적 조직 부위에 하나 또는 그 이상의 치료 화합물 (예를 들어, GDF/BMP 길항제들)을 전달할 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있고, 발달중인 조직을 위한 구조를 제공하고, 신체 내로 최적으로 재흡수될 수 있다. 예를 들면, 상기 매트릭스는 상기 GDF/BMP 길항제의 지연 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 다른 이식된 의학 분야에서 현재 사용중인 재료들로 형성될 수 있다.

매트릭스 재료는 생체적합성, 생분해성, 기계적 성질, 미용적 외관 및 경계면 성질을 기준으로 선택된다. 해당 조성물의 특정 용도가 적절한 제형을 규정할 것이다. 상기 조성물에 가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 황산칼슘, 인산삼 칼슘, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드리드로 규정될 수 있다. 다른 가능한 재료는 생분해성의 생물학적으로 잘 규정된 물질, 가령, 뼈 또는 피부 콜라겐이다. 또한 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분들로 구성된다. 다른 가능한 매트릭스는 비-생분해성이며 화학적으로 규정된 것, 가령, 소결(sintered) 하이드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹이다. 매트릭스는 전술한 유형의 물질, 가령, 폴리락트산 및 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 인산삼 칼슘의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오 세라믹은 공극 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시키기 위하여 조성, 가령, 칼슘-알루미네이트-포스페이트 및 공정이 변경될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 방법은, 예를 들면, 캡슐, 카시에(cachets), 알약, 정제, 로젠지(풍미제 베이스, 보통, 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가탄 이용), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체에 용액 또는 현탁액, 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 에멀젼, 또는 엘릭시르(elixir) 또는 시럽, 또는 당의정 (pastilles) (비활성 베이스, 가령, 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아 이용), 및/또는 구강 세척제 등의 형태로 경구 투여될 수 있는데, 이들 각각은 활성 성분으로써, 예정된 양의 화합물을 함유한다. 물질은 볼루스(bolus), 연질약(electuary), 또는 페이스트로 또한 투여될 수 있다.

경구 투여용 고체 투여 제형 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립제 및 이와 유사한 것들)에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 치료 화합물은 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체, 가령, 구연산 나트륨 또는 인산 이칼슘, 및/또는 다음 중 어느 하나와 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 연장제, 가령, 전분, 락토즈, 슈크로즈, 포도당, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 가령, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로즈, 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 가령, 글리세롤; (4) 분해제, 가령, 한천-한천, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 탄산 나트륨; (5) 용액 지체제, 가령, 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 가령, 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 가령, 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 가령, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 가령, 활석, 스테아레이트 칼슘, 스테아레이트 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 술페이트 나트륨, 및 이의 혼합물; 그리고 (10) 발색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 상기 제약학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 형태의 고체 조성물은, 가령, 락토스 또는 유당과 같은 부형제, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용하여 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐 안에 충전물로 이용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투약형은 제약학적으로 허용가능한 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 활성 성분에 추가하여, 액체 투약형태는 해당 분야에서 통상적으로 이용하는 비활성 희석액, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 용해화제 및/또는 유화제, 가령, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (가령, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 검, 올리브, 피마자, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 외에도, 경구 조성물은 가령, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향료, 착색제, 향료 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물 이외에, 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 그리고 트라가탄 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유 할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균제를 포함시킴으로써 확보될 수 있다. 조성물에 설탕, 염화나트륨 등의 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 추가적으로, 예를 들어, 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질을 포함시킴으로써 주사가능한 제약학적 형태의 연장된 흡수가 이루어질 수 있다.

투여 섭생은 본 명세서의 대상 화합물(예컨대, GDF/BMP 길항제들)의 작용을 변형시키는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 다양한 요인에는 환자의 연령, 성별, 식이, 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 요인이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로, 투여량은 재구성에 사용된 매트릭스의 유형 및 조성물 중의 화합물의 유형에 따라 다를 수 있다. 최종 조성물에 대한 기타 공지의 성장 인자들의 추가 또한 투약에 영향을 줄 수 있다. 진행은 골 성장 및/또는 회복 (예: X- 선 (DEXA 포함)), 조직 형태 측정 및 테트라사이클린 라벨링을 주기적으로 평가하여 모니터링 할 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명은 GDF/BMP 길항제들의 생체내 생산을 위한 유전자 치료요법을 또한 제공한다. 그러한 치료요법은 상기 열거된 하나 이상의 장애를 갖는 세포 또는 조직 내로 GDF/BMP 길항제 폴리뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 그의 치료 효과를 얻을 수 있다. GDF/BMP 길항제 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 예를 들어, 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템과 같은 재조합 발현 벡터를 사용하여 달성 될 수 있다. GDF/BMP 길항제 폴리뉴클레오티드서열의 바람직한 치료 전달은 표적화된 리포좀을 사용하는 것이다.

본 명세서에서 제시된 바와 같이, 유전자 요법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 유두종, 또는 RNA 바이러스, 가령, 레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 쥐과 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외부 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예로는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하베이 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 및 라우스 육종 바이러스 (RSV). 다수의 추가 레트로바이러스 벡터는 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 이들 모든 벡터는 선택가능한 표지의 유전자를 전달 또는 혼입하여, 형질전환된 세포를 동정 및 생성할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들면, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착시킴으로써, 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용하여 이루어진다. 숙련된 기술자는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 레트로바이러스 게놈 안에 삽입시키거나 또는 바이러스 외피에 부착시켜, 상기 GDF/BMP 길항제를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 운반이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 실시 양상에서, 벡터는 뼈 또는 연골을 표적으로 한다.

대안으로, 조직 배양 세포는 통상적인 인산칼슘 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol, 및 env를 인코드하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 관심 대상의 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 생성된 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지로 방출한다.

GDF/BMP 길항제 폴리뉴클레오티드에 대한 또다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 본 명세서의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관내 및 생체내에서 전달 운반체들로서 유용한 인공 막 소포이다. RNA, DNA, 및 고유 비리온은 수성 내부에 포집되고, 생물학적 활성 형태로 세포로 운반된다 (예컨대, Fraley, 외. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77 참고). 리포좀 비히클을 이용한 효과적인 유전자 전달 방법은 당분야에 공지되어 있다, 가령, Mannino, 외. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988 참고. 리포좀의 조성물은 통상 인지질의 조합물이며, 스테로이드, 구체적으로, 콜레스테롤과 통상적으로 복합된다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 성질은 pH, 이온 강도 그리고 이가양이온 존재에 따라 달라진다.

리포좀 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올 아민, 스핑고리피드, 세레브로시드 및 강글리오사이드와 같은 포스파티딜 화합물을 포함한다. 예시적인 인지질은 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포좀의 표적화는 또한 예를 들면, 장기(organ)-특이성, 세포-특이성, 및 소기관-특이성에 기초할 수 있으며, 해당 분야에 공지되어 있다.

본 명세서는 pH를 조정하기 위해 산 및 염기를; 그리고 pH를 좁은 범위로 유지시키기 위해 완충제를 포함하도록, 변화될 수 있는 제제를 제공한다.

실시예

지금부터 본 발명을 일반적으로 설명하며, 본 발명은 하기 실시예를 참고하면 보다 용이하게 이해될 것이며, 본 발명의 특정 구체예 및 실시 양상는 예시를 위한 목적으로만 포함되는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: ActRIIa-Fc 융합 단백질

인간 또는 생쥐 Fc 도메인에, 이들 사이에 최소 링커로 융합된 인간 ActRIIa의 세포외 도메인을 가지는 가용성 ActRIIA 융합 단백질을 작제하였다. 이 구조체들은 각각 ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc로서 지칭된다.

ActRIIA-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 것으로 하기와 같이 나타낸다 (서열 번호: 32):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질들은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 33)

(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호: 34)

(iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호: 35).

선택된 형태는 TPA 리더를 사용하며 다음과 같은 가공되지 않은 아미노산 서열을 가진다:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 36)

이 폴리펩티드는 다음 핵산 서열에 의해 인코딩된다:

ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (서열 번호: 37)

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 모두는 확실히 재조합 발현이 가능했다. 도 5에 도시된 바와 같이, 단백질은 하나의 잘 정의된 단백질 피크로 정제되었다. N-말단 시퀀싱은 -ILGRSETQE (서열 번호: 22)의 하나의 서열을 나타내었다. 정제는 다음 중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. ActRIIA-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 측정시 >98%, 그리고 SDS PAGE로 측정시 >95% 순도로 정제되었다.

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc는 리간드들에 대한 높은 친화력을 보였다. GDF11 또는 액티빈 A를 표준 아민-커플링 절차를 사용하는 Biacore™CM5 칩 상에 고정시켰다. ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질들을 시스템에 적재하고 결합을 측정하였다. ActRIIA-hFc는 액티빈에 5 x 10^-12의 해리 상수 (K_D)로 결합되었으며, GDF11에 9.96 x 10^-9의 K_D로 결합되었다. 도 6 참고. Using a 유사한 결합 분석법을 사용하여, ActRIIA-hFc는, 예를 들어, 액티빈 B, GDF8, BMP6, 및 BMP10을 비롯한 다른 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드에 대해 고 내지 중등도의 친화력을 가지는 것으로 결정되었다. ActRIIA-mFc는 유사하게 거동하였다.

ActRIIA-hFc는 약동학 연구에서 매우 안정하였다. 쥐들에게 1 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 ActRIIA-hFc 단백질을 투여하고, 단백질의 혈장 수준을 24, 48, 72, 144 및 168 시간에 측정하였다. 별도의 연구에서, 쥐들에게 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg를 투여하였다. 쥐에서, ActRIIA-hFc는 11-14일의 혈청 반감기를 가졌으며, 약물의 순환 수준은 2주 후 상당히 높았다 (1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 관하여 각각 11 ㎍/ml, 110 (㎍/ml), 또는 304 (㎍/ml)). 시노몰구스 원숭이들에서, 혈장 반감기는 실질적으로 14 일 보다 컸으며, 약물의 순환 수준은 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 관하여 각각 25 ㎍/ml, 304 (㎍/ml), 또는 1440 (㎍/ml)였다.

실시예 2: ActRIIA-hFc 단백질의 특성화

ActRIIA-hFc 융합 단백질은 서열 번호: 34의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용하여 pAID4 벡터 (SV40 원점/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정하게 형질감염된 CHO-DUKX B11 세포들에서 발현되었다. 상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이 정제된 단백질은 서열 번호: 32의 서열을 가졌다. Fc 부위는 서열 번호: 32에 나타낸 인간 IgG1 Fc 서열이다. 단백질 분석은 ActRIIA-hFc 융합 단백질이 이황화 결합을 보유한 동형이량체로 형성됨을 나타낸다.

CHO-세포-발현된 물질은 인간 293 세포들에서 발현된 ActRIIa-hFc 융합 단백질에 대해 보고되었던 친화력보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화력을 가진다 [del Re 외. (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135 참조]. 또한, TPA 리더 서열을 사용하여 다른 리더 서열들 보다 더 많이 제조하였으며 고유 리더를 사용하여 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 매우 순도 높은 N-말단 서열을 제공하였다. 고유 리더 서열을 사용하여 각각 상이한 N-말단 서열을 가지는 ActRIIA-Fc의 2가지 주요 종들을 생성하였다.

실시예 3: 대체 ActRIIA-Fc 단백질

본 명세서에 기재된 방법들에 따라 사용될 수 있는 다양한 ActRIIA 변이체들은 WO2006/012627로 공개된 국제 특허 출원에 기재되어 있으며 (예컨대, pp. 55-58 참조), 이 문헌의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다 대안적 구조체는 C-말단 꼬리 (ActRIIA의 세포외 도메인의 마지막 15개 아미노산)의 결실을 가질 수 있다. 이러한 구조체에 관한 서열을 하기에 나타낸다 (Fc 부위 밑줄) (서열 번호: 39):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

실시예 4: ActRIIB-Fc 융합 단백질의 생성

출원인은 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에, 이들 사이에 최소 링커로 융합된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 가지는 가용성 ActRIIB 융합 단백질을 작제하였다. 이 구조체들은 각각 ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc로서 지칭된다.

ActRIIB-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 것으로 하기와 같이 나타낸다 (서열 번호: 40):

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc 단백질들은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다: (i) 꿀벌 멜리틴 (HBML), ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 및 (iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호: 41).

선택된 형태는 TPA 리더를 이용하고, 다음의 가공되지 않은 아미노산 서열을 갖는다 (서열 번호: 42):

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

이 폴리펩티드는 다음의 핵산 서열 (서열 번호: 43)에 의해 인코드된다:

A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GCTAGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA

CHO-세포-생산된 물질의 N-말단 서열화에서 -GRGEAE (서열 번호: 44)의 주요 서열이 드러났다. 특히, 문헌에 보고된 다른 구조물은 -SGR ... 서열로 시작한다.

정제는 다음 중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.

ActRIIB-Fc 융합 단백질은 또한 HEK293 세포 및 COS 세포에서 발현되었다. 모든 세포주의 물질 및 적당한 배양 조건이 생체 내에서 근육 형성 활성을 갖는 단백질을 제공하였지만, 아마도 세포주 선별 및 /또는 배양 조건과 관련하여 역가의 가변성이 관찰되었다.

출원인들은 ActRIIB의 세포외 도메인에서 일련의 돌연변이를 제조하였으며 세포외 ActRIIB와 Fc 도메인 사이에 가용성 융합 단백질로서 이들 돌연변이 단백질들을 제조하였다. 기준 ActRIIB-Fc 융합은 서열 번호: 40의 서열을 가진다.

N- 및 C-말단 절두들을 비롯한 다양한 돌연변이가 기준 ActRIIB-Fc 단백질에 도입되었다. 본 명세서에 제시된 데이터에 기초하여, TPA 리더를 사용하여 발현되는 경우 이들 구조체들은, N-말단 세린이 없을 것으로 예상된다. PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에 돌연변이들을 생성하였다. PCR 후, 단편을 Qiagen 컬럼으로 정제하고, SfoI 및 AgeI로 분해하고 겔 정제 하였다. 이러한 단편은 발현 벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조)에 결찰시켜, 결찰될 때, 인간 IgG1과 융합 키메라가 생성되었다. E. coli DH5 알파로의 형질 전환시, 콜로니를 채취하고 DNA를 단리하였다. 쥐과 구조체 (mFc)의 경우, 쥐과 IgG2a가 인간 IgG1로 치환되었다. 모든 돌연변이체의 서열이 확인되었다.

모든 돌연변이체는 일시적인 형질 감염에 의해 HEK293T 세포에서 생산되었다. 요약하면, 500ml 스피너에서 HEK293T 세포는 250ml 부피의 Freestyle (Invitrogen사) 배지에서 6x10⁵ 세포/ml로 셋업하고, 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 이들 세포를 0.5ug/ml의 최종 DNA 농도의 DNA:PEI (1:1) 복합체로 처리하였다. 4 시간 후, 250 ml 배지를 첨가하고, 세포를 7 일 동안 성장시켰다. 세포를 회전시켜 가라앉힘으로써, 농축된 배지를 수확하고 농축시켰다.

돌연변이체는 예를 들어, 단백질 A 컬럼을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 정제되었고, 낮은 pH (3.0) 글리신 완충액으로 용리되었다. 중화시킨 후, PBS로 이들을 투석하였다.

돌연변이체도 유사한 방법으로 CHO 세포에서 생산되었다. 돌연변이체는 본원에 참고로 인용된 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627호에 기재된 결합 분석법 및/또는 생물 검정법으로 시험하였다. 일부의 경우, 정제된 단백질보다는 조건화된 배지를 사용하여 분석을 수행하였다. ActRIIB의 추가적인 변형은 미국 특허 제 7,842,663 호에 기재되어있다.

출원인은 ActRIIB(25-131)-hFc 융합 단백질을 만들었고, 이 단백질은 N-말단 및 C-말단 절두된 인간 ActRIIB 세포외 도메인을 포함하고(고유의 단백질 서열 번호: 1의 잔기 25-131), 이 단백질은 고유의 ActRIIB 리더를 대체하는 TPA 리더 서열을 갖는 N-말단에 융합되고, 최소 링커 (3개의 글리신 잔기)를 통하여 인간 Fc 도메인에 융합된다(도 7). 이 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도 8에 나타낸다. 출원인은 코돈을 변형시키고, 초기 형질전환체의 발현 수준을 실질적으로 개선시켰던 ActRIIB (25-131)-hFc 단백질을 코딩하는 변이체 핵산을 발견 하였다(도 9).

성숙 단백질은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다 (N 말단은 N- 말단 서열 분석에 의해 확인됨)(서열 번호: 45):

ETRECIYYNA NWELERTNQS GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK

KGCWLDDFNC YDRQECVATE ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV

TYEPPPTGGG THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV

VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD

WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ

VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV

DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK

발현된 분자는 예를 들어, 다음 중 3 개 이상을 임의의 순서로 포함하는, 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제되었다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.

ActRIIB (25-131) -hFc 및 그의 전장-대응물인 ActRIIB (20-134) -hFc에 대한 몇몇 리간드의 친화성을 Biacore ™장치로 시험관내에서 평가하였고, 그 결과를 하기 표에 요약하였다. 복합체의 매우 빠른 결합과 해리는 k_온과 k_오프의 정확한 결정을 방해하는데, 이로 인해 정상-상태 친화성 적용에 의해 Kd 값을 얻었다. ActRIIB(25-131)-hFc는 높은 친화력으로, 예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 및 GDF11에 결합하였다.

ActRIIB-hFc 형태의 리간드 친화력:

실시예 5: GDF 트랩 생성

GDF 트랩은 다음과 같이 작제되었다. ActRIIB (L79D 치환을 갖는 서열 번호: 1의 아미노산 20-134)의 변형된 세포외 도메인을 보유하는 폴리펩티드는 GDF11 및/또는 미오스타틴 (서열 번호:의 위치 79에서 류신이 아스파르테이트 치환된 공통 서열로써)과 비교하여 액티빈 A 결합이 상당히 감소되었으며, 이 폴리펩티드는 그 사이에 최소 링커로 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 융합되었다. 이 구조체들은 각각 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 및 ActRIIB(L79D 20-134)-mFc로 지칭된다. 위치 79에 아스파르테이트가 아닌 글루타메이트를 이용한 대안적 형태들을 유사하게 실시하였다 (L79E). 하기 서열 번호: 64에 대하여 226 번 위치의 발린이 아닌 알라닌을 갖는 다른 형태도 생성되어, 시험된 모든 측면에서 동등하게 수행되었다. 위치 79에서의 아스파르테이트 (서열 번호: 1에 대해)는 아래에 두줄 밑줄로 표시되어있다. 서열 번호: 29에 대하여 위치 226의 발린 또한 하기에서 두줄 밑줄로 또한 표시된다.

GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc는 하기에 나타낸 바와 같이, CHO 세포주로부터 정제된다(서열 번호: 46).

GDF 트랩의 ActRIIB 유도 부분은 아래에 기재된 아미노산 서열 (서열 번호 47)을 가지며,이 부분은 단량체, 또는 단량체, 이량체, 또는 그 이상 차수의 형태로써 비 Fc 융합 단백질로 이용될 수 있다.

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 47)

상기 GDF 트랩 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML), (ii) 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA), 및 (iii) 고유.

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 48)

이 폴리펩티드는 다음의 핵산 서열 (서열 번호: 49)에 의해 인코드된다:

A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GGACGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA

정제는 다음 중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. 정제 방법의 예에서, 세포 배양 배지를 단백질 A 칼럼을 통과시키고, 그 다음 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0)에서 세척한 다음 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0)에서 세척하고, 0.1 M 글리신, pH 3.0로 용리시켰다. 낮은 pH 용출물은 바이러스 제거 단계로써, 실온에서 30 분간 유지한다. 상기 용출물을 중성화시키고, Q-세파로스 이온-교환 컬럼으로 옮기고, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl로 세척하고, 150 mM과 300 mM 사이의 NaCl 농도를 갖는 50 mM Tris pH 8.0에서 용리시켰다. 그 다음 용출물을 50 mM Tris pH 8.0, 1.1 M 황산 암모늄으로 교환하고, 페닐 세파로스 컬럼을 통과시켜 세척하고, 그리고 150 mM과 300 mM 사이의 황산 암모늄으로 50 mM Tris pH 8.0에서 용리시켰다. 용출물은 투석되고, 여과되어 사용된다.

또 다른 GDF 트랩 (미오스타틴 또는 GDF11 결합에 비해 액티빈 A 결합의 비율을 감소시키기 위해 변형된 ActRIIB-Fc 융합 단백질)은 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627에 기재되어 있으며, 이 문헌들은 본 명세서에 참고로 포함된다.

실시예 6: GDF11- 및 액티빈-중재된 신호생성에 대한 생물학적 검정

GDF-11 및 액티빈 A에 의한 신호 생성에 대한 ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 효과를 평가하기 위해, A-204 리포터 유전자 분석을 사용하였다. 세포주: 인간 횡문근육종 (근육으로부터 유도됨). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100에서 설명됨). CAGA12 모티프는 TGFβ반응성 유전자 (예를 들면, PAI-1 유전자)에 존재하며, 이 벡터는 SMAD2 및 SMAD3을 통한 신호생성 인자에 일반적으로 사용된다.

1일차: 48-웰 플레이트에 A-204 세포를 분열시킨다.

2일차: A-204 세포는 10 ug pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 ug)+pRLCMV (1 ug) 및 Fugene로 형질감염시킨다.

3일차: 인자들을 추가한다 (배지+0.1% BSA로 희석됨). 억제제는 세포에 추가하기 전, 약 1 시간 동안 인자들로 사전 배양될 필요가 있다. 6시간 후, 세포는 PBS로 헹구고, 그리고 용해된다.

그 후 루시퍼라제 분석한다. 임의의 억제제 없이, 액티빈 A는 리포터 유전자 발현의 10-배 자극 및 ED50 ~ 2 ng/ml을 나타낸다. GDF-11: 16 배 자극, ED50: ~ 1.5 ng/ml.

ActRIIB(20-134)는 이 분석에서, 예를 들어, 액티빈 A, GDF-8, 및 GDF-11 활성의 강력한 억제제다. 하기 기재된 바와 같이, ActRIIB 변이체 또한 이 분석에서 시험하였다.

실시예 7: ActRIIB-Fc 변이체들, 세포-기반 활성

ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 활성을 전술한 바와 같은 세포-기반 검정법으로 시험하였다. 결과는 아래 표에 요약되어 있다. 일부 변이체는 다른 C-말단 절두 구조체로 시험하였다. 전술한 바와 같이, 5 개 또는 15 개의 아미노산이 절두되면 활성이 감소되었다. GDF 트랩 (L79D 및 L79E 변이체)은 액티빈 A 억제의 실질적인 손실을 나타내지만, GDF11의 야생형 억제는 거의 유지한다.

GDF11 및 액티빈 A에 가용성 ActRIIB-Fc 결합:

+ 빈약한 활성 (대략 1x10^-6 K_I)

++ 중등도 활성 (대략 1x10^-7 K_I)

+++ 우수한 (야생형) 활성 (대략 1x10^-8 K_I)

++++ 야생형 활성보다 큼

A24N 변이체는 세포-기반 분석법에서 활성을 가지며 (상부) 이는 야생형 분자와 동일한 것이다. A24N 변이체, 그리고 상기 테스트한 임의의 다른 변이체들은, GDF 트랩 분자들, 가령, L79D 또는 L79E 변이체들과 조합될 수 있다.

실시예 8: GDF11 및 액티빈 A 결합.

리간드에 대한 특정 ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 결합을 Biacore^TM 분석에서 시험하였다.

ActRIIB-Fc 변이체 또는 야생형 단백질을 항-hFc 항체를 사용하여 시스템 상에 포획하였다. 리간드들을 주입하였고, 포집된 수용체 단백질 위로 흐르도록 하였다. 결과는 아래 표에 요약되어 있다.

리간드-결합 특이성 IIB 변이체.

세포-유리 분석법에서 얻은 이러한 데이터들은, A24N 변이체가 ActRIIB(20-134)-hFc 분자와 유사한 리간드-결합 활성을 유지하며 L79D 또는 L79E 분자는 미오스타틴 및 GDF11 결합을 유지하지만 액티빈 A에 대하여 현저히 감소된 (정량불가) 결합을 보여줌을 입증하는 세포-기반 분석법 데이터를 확인시켜준다.

WO2006/012627에 기재된 바와 같이, 다른 변이체들을 생성하고 테스트하였다 (이 문헌의 전문은 본 명세서에 참고로 포함됨). 장치에 커플링된 리간드 및 커플링된 리간드 위에 유동(flowing) 수용체를 사용, 예컨대 59-60 페이지를 참조. 특히, K74Y, K74F, K74I (및 K74에서 다른 소수성 치환, 가령, K74L), 및 D80I는 야생형 K74 분자와 비교하였을 때, GDF11 결합에 대한 액티빈 A (ActA) 결합 비율 감소를 야기한다. 이러한 변이체들과 관련한 데이터 표는 다음과 같다:

GDF11 및 액티빈 A에 가용성 ActRIIB-Fc 변이체 결합 (Biacore™분석)

* 관찰된 결합 없음

-- < 1/5 WT 결합

- ~ 1/2 WT 결합

+ WT

++ < 2x 증가된 결합

+++ ~5x 증가된 결합

++++ ~10x 증가된 결합

+++++ ~ 40x 증가된 결합

실시예 9: 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩 생성

ActRIIB(L79D 20-134)-hFc로 지칭되는 GDF 트랩은 류신-아스파르테이트 치환 (서열 번호:1의 잔기 79에서)을 갖는 ActRIIB 세포외 도메인(서열 번호:1에서 잔기 20-134)에 TPA 리더를 N-말단 융합시키고, 최소 링커 (3개의 글리신 잔기)와 함께 C-말단에 인간 Fc 도메인을 융합하여 만들어진다 (도 10; 서열 번호: 74). 이 융합 단백질에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 도 11에 나타낸다 (서열 번호: 75, 센스 가닥; 및 서열 번호: 76, 안티센스 가닥).

ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 지칭되는, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩은 류신-아스파르테이트 치환 (서열 번호:1의 잔기 79에서)을 갖는 절두된 세포외 도메인(서열 번호:1에서 잔기 25-131)에 TPA 리더를 N-말단 융합시키고, 최소 링커 (3개의 글리신 잔기)와 함께 C-말단에 인간 Fc 도메인을 융합하여 만들어진다 (도 12, 서열번호: 77). ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 세포 정제된 형태의 서열은 도 13 (서열 번호: 78)에 제시된다. 이 융합 단백질을 인코드하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 도 15 (서열 번호: 80)에 그 상보적 서열 (서열 번호: 81)과 함께 나타내고, 정확히 동일한 융합 단백질을 인코드하는 대체 뉴클레오티드 서열을 도 16 (서열 번호: 82)에 그 상보적 서열 (서열 번호: 83)과 함께 나타낸다.

실시예 10: 이중-절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 보유하는 GDF 트랩에 의한 선택적 리간드 결합

몇 가지 리간드들에 대한 GDF 트랩 및 다른 ActRIIB-hFc 단백질들의 친화력을 Biacore™장치로 시험관내에서 평가하였다. 결과는 아래 표에 요약되어 있다. 복합체의 매우 빠른 결합과 해리는 k_온과 k_오프의 정확한 결정을 방해하는데, 이로 인해 정상-상태 친화성 적용에 의해 Kd 값을 얻었다.

ActRIIB-hFc 변이체의 리간드 선택성:

절두된 세포외 도메인, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 GDF 트랩은 더 긴 변이체, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc에 의해 나타나는 리간드 선택성과 동일하거나 또는 능가하며, L79D 치환이 없는 ActRIIB-hFc 대응부와 비교하였을 때, 액티빈 A 결합은 확연하게 상실되고, 액티빈 B 결합은 부분적으로 상실되며, 그리고 거의 완전하게 GDF11 결합을 유지한다. 절두만의 경우 (L79D 치환 없이) 여기에서 나타나는 리단드간의 선택성을 변경시키지 않았다 [ActRIIB(L79 25-131)-hFc 와 ActRIIB(L79 20-134)-hFc의 비교]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 또한 Smad 2/3 신호전달 리간드 GDF8 및 Smad 1/5/8 리간드들 BMP6 및 BMP10에 대하여 강한 내지 중간의 결합을 유지시킨다.

실시예 11: ActRIIB5로부터 유도된 GDF 트랩

다른 연구자들은 ActRIIB (ActRIIB5로 명명)의 대체 가용성 형태를 보고했는데, 이때, 상기 ActRIIB 막경유 도메인을 포함하는 엑손 4는 상이한 C-말단 서열로 대체된다 (가령, WO 2007/053775 참고).

리더가 없는 고유의 인간 ActRIIB5의 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK

KGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST

TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호: 50)

류신에서-아스파르테이트 치환, 또는 기타 산성 치환은 변이체 ActRIIB5(L79D)를 작제하는 것에서 설명된 바와 같이, 고유의 위치 79(밑줄)에서 실행되었으며, 다음 서열을 갖는다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK

KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST

TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호: 51)

이 변이체는 다음 서열을 갖는 인간 ActRIIB5(L79D)-hFc 융합 단백질을 만들기 위하여, TGGG 링커 (한줄 밑줄)로 인간 Fc (두줄 밑줄)에 연결될 수 있다:

이 구조체는 CHO 세포에서 발현될 수 있다.

실시예 12: ALK4: ActRIIB이형이량체의 생성

인간 ActRIIB 및 인간 ALK4의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형화학성 복합체를 작제하였으며, 상기 세포외 도메인 각각은 별도로 이 세포외 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한 링커로 Fc 도메인에 융합되어 있다. 개별 구조체는 차례로 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드로 지칭되며, 이들 각 서열은 하기에서 제시된다.

ActRIIB-Fc 또는 ALK4-Fc 동형이량체 복합체와 반대로, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형화학성 복합체의 형성을 촉진하는 방법은 비대칭 이형화학성 복합체 형성을 유도하기 위하여 Fc 도메인의 아미노산 서열에 변경을 도입시키는 것이다. Fc 도메인을 이용하여 비대칭 상호작용 쌍을 만드는 많은 상이한 방법들이 본 명세서에서 설명된다.

한 가지 방법에서, 각각 서열 번호: 108과 110 및 서열 번호: 111과 113의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에서 설명된 바와 같이, 하나의 Fc 도메인이 상호작용 면에 있는 양이온 아미노산을 도입시키도록 변경되고, 한편 또다른 Fc 도메인은 이 상호작용 면에 음이온 아미노산을 도입시키도록 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 리더를 이용한다.

ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열 번호: 108)은 하기에 나타낸다:

리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동형이량체 복합체보다는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 형성을 촉진시키기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 2개의 아미노산 치환 (산성 아미노산이 리신으로 대체됨)이 ActRIIB 융합 단백질의 Fc 도메인에 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된, 서열 번호: 108의 아미노산 서열이 제공된다.

이 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 다음의 핵산 서열 (서열 번호: 109)에 의해 인코드된다:

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCTGGGCG TGGGGAGGCT GAGACACGGG

101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC

151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC

201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT

251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG

301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA

351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC

401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC

451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA

501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG

551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG

601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA

651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT

701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA

751 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC

801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGAA GGAGATGACC AAGAACCAGG

851 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG

901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC

951 CGTGCTGAAG TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG

1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT

1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG

1101 TAAA (서열 번호: 109)

성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 (서열 번호: 110)는 다음과 같고, 선택적으로 C-말단으로부터 리신(K)이 제거된다.

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS

251 RKEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLKSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(서열 번호: 110)

상보적 형태의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 (서열 번호: 111)은 다음과 같다:

리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열 번호: 108 및 110의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와 함께 이형이량체 형성을 유도하기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 2개의 아미노산 치환 (리신이 아스파르트산으로 대체됨)이 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인으로 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단에 리신(K)이 추가된, 서열 번호: 111의 아미노산 서열이 제공될 수 있다.

ALK4-Fc 융합 단백질은 다음 핵산 (서열 번호: 112)에 의해 인코드된다:

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCCGGGCC CCGGGGGGTC CAGGCTCTGC

101 TGTGTGCGTG CACCAGCTGC CTCCAGGCCA ACTACACGTG TGAGACAGAT

151 GGGGCCTGCA TGGTTTCCAT TTTCAATCTG GATGGGATGG AGCACCATGT

201 GCGCACCTGC ATCCCCAAAG TGGAGCTGGT CCCTGCCGGG AAGCCCTTCT

251 ACTGCCTGAG CTCGGAGGAC CTGCGCAACA CCCACTGCTG CTACACTGAC

301 TACTGCAACA GGATCGACTT GAGGGTGCCC AGTGGTCACC TCAAGGAGCC

351 TGAGCACCCG TCCATGTGGG GCCCGGTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA

401 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC

451 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA

501 GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT

551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG

601 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT

651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA

701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG

751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT

801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA

851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC

901 GACACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG

951 CGACCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT

1001 GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC

1051 TCCCTGTCTC CGGGT (서열 번호: 112)

성숙 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 (서열 번호: 113)는 다음과 같고, 선택적으로 C-말단에 리신(K)이 추가된다.

1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV

51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG

101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

251 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS\

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (서열 번호: 113)

차례로 서열 번호: 110 및 서열 번호: 113의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포계통에서 공동-발현되고, 정제되어, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc을 포함하는 이형화학성 복합체가 생성될 수 있다.

비대칭 Fc 융합 단백질을 이용한 이형다량체 복합체들의 형성을 촉진시키는 또다른 방법에서, 차례로 서열 번호: 114와 115 및 서열 번호: 116과 117의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에서 설명된 바와 같이, 상보적 소수성 상호작용과 추가적인 분자간 이황화결합을 도입하도록 Fc 도메인이 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 리더를 이용한다.

ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열 번호: 114)은 하기에 나타낸다:

리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동형이량체 복합체보다는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 형성을 촉진시키기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 2개의 아미노산 치환 (세린이 시스테인으로 그리고 트레오닌이 트립토판으로 대체됨)이 상기 융합 단백질의 Fc 도메인에 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된, 서열 번호: 114의 아미노산 서열이 제공된다.

성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 다음과 같다:

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC

251 REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(서열 번호: 115)

상보적 형태의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 (서열 번호: 116) 다음과 같고, 선택적으로 C-말단으로부터 리신(K)이 제거될 수 있다.

리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열 번호: 114 및 115의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와 함께 이형이량체 형성을 유도하기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 4개의 아미노산 치환이 ALK4 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인으로 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된, 서열 번호: 116의 아미노산 서열이 제공된다.

성숙 ALK4-Fc 융합 단백질 서열은 다음과 같고, 선택적으로 C-말단으로부터 리신(K)이 제거될 수 있다.

1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV

51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG

101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL

251 SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LVSKLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (서열 번호: 117)

차례로 서열 번호: 115 및 서열 번호: 117의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포계통에서 공동-발현되고, 정제되어, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc을 포함하는 이형화학성 복합체가 생성될 수 있다.

다양한 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 복합체들의 정제는 다음 중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.

비대칭 Fc 융합 단백질을 이용한 이형다량체 복합체들의 형성을 촉진시키는 또다른 방법에서, 차례로 서열 번호: 118-121 및 122-125의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에서 설명된 바와 같이, 상보적 소수성 상호작용, 추가적인 분자간 이황화결합 및 알짜 분자 전하에 기반한 정제를 용이하게 하는, 2개 Fc 도메인들 사이의 정전기 차이를 도입하도록 Fc 도메인이 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 리더를 이용한다.

ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열 번호: 118)은 하기에 나타낸다:

리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동형이량체 복합체보다는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 형성을 촉진시키기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 2개의 아미노산 치환 (세린이 시스테인으로 그리고 트레오닌이 트립토판으로 대체됨)이 상기 융합 단백질의 Fc 도메인에 도입될 수 있다. 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 정제를 촉진시키기 위하여, 2개의 아미노산 치환 (리신이 산성 아미노산으로 대체됨)이 상기 융합 단백질의 Fc 도메인에 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단에 리신이 추가된, 서열 번호: 111의 아미노산 서열이 제공될 수 있다.

ActRIIB-Fc 융합 단백질은 다음 핵산 (서열 번호: 119)에 의해 인코드된다:

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCTGGGCG TGGGGAGGCT GAGACACGGG

101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC

151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC

201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT

251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG

301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA

351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC

401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC

451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA

501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG

551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG

601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA

651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT

701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA

751 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC

801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATGCCGGGA GGAGATGACC GAGAACCAGG

851 TCAGCCTGTG GTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG

901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC

951 CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG

1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT

1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGGAC AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG

1101 T (서열 번호: 119)

성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 다음과 같고 (서열 번호: 120), 그리고 선택적으로 C-말단에 리신이 추가되어 제공될 수 있다.

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC

251 REEMTENQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQDSLSLS PG

(서열 번호: 120)

ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 다음 핵산 (서열 번호: 121)에 의해 인코드된다:

1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG

51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC

101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC

151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA

201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT

251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAGCGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT

301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACCGGTGG

351 TGGAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC

401 CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC

451 CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC

501 TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA

551 AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC

601 GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG

651 CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA

701 AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATGC

751 CGGGAGGAGA TGACCGAGAA CCAGGTCAGC CTGTGGTGCC TGGTCAAAGG

801 CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG

851 AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC

901 TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA

951 CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC

1001 AGGACAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGT (서열 번호: 121)

상보적 형태의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 (서열 번호: 122) 다음과 같고, 선택적으로 C-말단으로부터 리신이 제거될 수 있다.

리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열 번호: 118 및 120의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와 함께 이형이량체 형성을 유도하기 위하여, 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, 4개의 아미노산 치환 (티로신을 시스테인으로, 트레오닌을 세린으로, 류신을 알라닌으로, 그리고 티로신을 발린으로 대체)이 ALK4 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인으로 도입될 수 있다. 상기 두줄 밑줄로 표시된 바와 같이, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 정제를 촉진시키기 위하여, 2개의 아미노산 치환 (아스파라긴이 아르기닌으로 그리고 아스파르테이트가 아르기닌으로 대체됨)이 상기 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인에 도입될 수 있다. 선택적으로 C-말단으로부터 리신이 제거된, 서열 번호: 122의 아미노산 서열이 제공된다.

ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 다음 핵산 (서열 번호: 123)에 의해 인코드된다:

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCCGGGCC CCGGGGGGTC CAGGCTCTGC

101 TGTGTGCGTG CACCAGCTGC CTCCAGGCCA ACTACACGTG TGAGACAGAT

151 GGGGCCTGCA TGGTTTCCAT TTTCAATCTG GATGGGATGG AGCACCATGT

201 GCGCACCTGC ATCCCCAAAG TGGAGCTGGT CCCTGCCGGG AAGCCCTTCT

251 ACTGCCTGAG CTCGGAGGAC CTGCGCAACA CCCACTGCTG CTACACTGAC

301 TACTGCAACA GGATCGACTT GAGGGTGCCC AGTGGTCACC TCAAGGAGCC

351 TGAGCACCCG TCCATGTGGG GCCCGGTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA

401 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC

451 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA

501 GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT

551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG

601 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT

651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA

701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG

751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTGCACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT

801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGTCCTGCGC CGTCAAAGGC TTCTATCCCA

851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCCGCG GGCAGCCGGA GAACAACTAC

901 AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCCGC GGCTCCTTCT TCCTCGTGAG

951 CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT

1001 GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC

1051 TCCCTGTCTC CGGGTAAA (서열 번호: 123)

성숙 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 서열은 다음과 같고 (서열 번호: 124), 선택적으로 C-말단으로부터 리신이 제거될 수 있다.

1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV

51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG

101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL

251 SCAVKGFYPS DIAVEWESRG QPENNYKTTP PVLDSRGSFF LVSKLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (서열 번호: 124)

ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 다음 핵산 (서열 번호: 125)에 의해 인코드된다:

1 TCCGGGCCCC GGGGGGTCCA GGCTCTGCTG TGTGCGTGCA CCAGCTGCCT

51 CCAGGCCAAC TACACGTGTG AGACAGATGG GGCCTGCATG GTTTCCATTT

101 TCAATCTGGA TGGGATGGAG CACCATGTGC GCACCTGCAT CCCCAAAGTG

151 GAGCTGGTCC CTGCCGGGAA GCCCTTCTAC TGCCTGAGCT CGGAGGACCT

201 GCGCAACACC CACTGCTGCT ACACTGACTA CTGCAACAGG ATCGACTTGA

251 GGGTGCCCAG TGGTCACCTC AAGGAGCCTG AGCACCCGTC CATGTGGGGC

301 CCGGTGGAGA CCGGTGGTGG AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC

351 TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG

401 ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC

451 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT

501 GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA

551 CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT

601 GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT

651 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT

701 GCACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG

751 TCCTGCGCCG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA

801 GAGCCGCGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG

851 ACTCCCGCGG CTCCTTCTTC CTCGTGAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC

901 AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT

951 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAA

(서열 번호: 125)

차례로 서열 번호: 120 및 서열 번호: 124의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포계통에서 공동-발현되고, 정제되어, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc을 포함하는 이형화학성 복합체가 생성될 수 있다.

다양한 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 복합체들의 정제는 다음 중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피, 에피토프-기반 친화력 크로마토그래피 (예컨대, ALK4 또는 ActRIIB 상의 에피토프에 대하여 지시되는 항체 또는 기능적으로 균등한 리간드를 이용), 및 다중모드 크로마토그래피 (예컨대, 정전기 및 소수성 리간드 모두를 함유하는 수지를 이용). 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.

실시예 13. ActRIIB-Fc 동형이량체 및 ALK4-Fc 동형이량체와 비교하여 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 리간드 결합 프로파일

상기에서 설명된 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체성 복합체의 리간드 결합 선택성을 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 동형이량체 복합체의 것과 비교하기 위하여 Biacore^TM-기반의 결합 분석이 이용되었다. ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체, ActRIIB-Fc 동형이량체, 및 ALK4-Fc 동형이량체는 항-Fc 항체를 이용하여 상기 시스템에 독립적으로 포집되어 있다. 리간드들을 주입하고, 포집된 수용체 단백질 위로 흐르도록 하였다. 결과를 아래 표에 요약하고, 효과적인 리간드 트랩의 리간드 해리속도(k_d)는 회색 음영으로 나타낸다.

이들 비교 결합 데이터는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 ActRIIB-Fc 또는 ALK4-Fc 동형이량체에 대하여 변경된 결합 프로파일/선택성을 가짐을 입증한다. ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 동형이량체와 비교하여 액티빈 B에 대하여 강화된 결합을 보이며, ActRIIB-Fc 동형이량체에서 관찰된 바와 같이, 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 대하여 강력한 결합을 유지하고, 그리고 BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 구체적으로, BMP9는 ActRIIB-Fc 동형이량체에 대하여 낮은 친화력 또는 탐지불가능한 친화력을 나타내고, 한편 이 리간드는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체에 강력하게 결합한다. ActRIIB-Fc 동형이량체와 마찬가지로, 상기 이형이량체는 BMP6에 대하여 중간-수준의 결합을 유지한다. 도 19를 참고하라.

또한, A-204 리포터(Reporter) 유전자분석을 이용하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, GDF8, BMP10, 및 BMP9에 의한 신호전달에 있어서 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체와 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체의 효과를 평가하였다. 세포 계통: 인간 횡문근육종 (근육에서 유도). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100에서 설명됨). CAGA12 모티프는 TGFβ반응성 유전자 (예를 들면, PAI-1 유전자)에 존재하며, 이 벡터는 SMAD2 및 SMAD3을 통한 신호생성 인자에 일반적으로 사용된다. 예시적인 A-204 리포터 유전자분석을 하기에 개략적으로 설명한다.

1일차: 48-웰 플레이트에 A-204 세포를 분열시킨다.

3일차: 인자들을 추가한다 (배지+0.1% BSA로 희석됨). 억제제는 세포에 추가하기 전, 약 한 시간 동안 인자들로 사전 배양될 필요가 있다. 약 6시간 후, 세포를 PBS로 헹군 다음, 용해시킨다.

상기 단계 후, 루시페라제 분석을 시행하였다.

ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체와 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체는 모두 이 분석에서 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, 및 GDF8의 강력한 억제제인 것으로 결정되었다. 구체적으로, 도 19에 도시된 비교 동형이량체/이형이량체 IC₅₀ 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체와 유사하게 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 신호전달 경로를 억제한다. 그러나, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체의 BMP9 및 BMP10 신호전달 경로 억제는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체와 비교하여 상당히 감소된 것이다. 이 데이터는 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체와 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체 모두가 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11에 강력한 결합을 나타내지만, BMP10 및 BMP9는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동형이량체와 비교하여, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체에 대하여 상당히 감소된 친화력을 갖는 것으로 관찰된 상기-논의된 결합 데이터와 일치한다.

이와 함께, 이들 데이터에서 따라서 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 ActRIIB-Fc 동형이량체와 비교하였을 때, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 더 강한 선택적 길항제임을 입증한다. 따라서, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체는 특정 용도에서 ActRIIB-Fc 동형이량체보다 더 유용할 것이며, 이때 이러한 선택적 길항작용이 유익하다. 실시예는 하나 또는 그 이상의 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AC, GDF8, 및 GDF11의 길항작용을 유지하지만, 하나 또는 그 이상의 BMP9, BMP10, GDF3, 및 BMP6의 길항작용은 최소화시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다.

실시예 14: 모노크로탈린 쥐 모델의 폐 고혈압에 대한 ActRII 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형이량체의 효과

ActRIIA-mFc 융합 단백질 (실시예 1에 기재된 ActRIIA-mFc 동형이량체), ALK4-Fc-ActRIIB-Fc 이형이량체 (실시예 12 및 13에 기재), 및 실데나필 (PAH 치료에 대해 승인된 포스포다이에스테라제-5 억제제)의 효과를 폐동맥 고혈압 (PAH) 쥐 모델에서 조사하였다. 이 모델에서, 스프라그 돌리 쥐에게 치료 시작 24시간 전에 PAH를 유도하기 위해 모노크로탈린 (MCT) 피하 주사하였다.

쥐들을 다음과 같은 상이한 치료 그룹들 (그룹 당 10 마리 생쥐)로 분리하였다: 1) MCT (연구 1일차에 단회 용량으로 60 mg/kg i.p. 투여) 및 Tris 완충 식염수 (매 3일 마다 1 ml/kg으로 i.p.) (비히클 치료 그룹)로 치료, 2) ActRIIA-mFc 폴리펩티드 (매 3일 마다 10 mg/kg i.p. 투여) 및 MCT (연구 1일차에 단회 용량으로 60 mg/kg i.p. 투여)로 치료, 3) ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이형이량체 (매 3일 마다 10 mg/kg i.p. 투여) 및 MCT (연구 1일차에 단회 용량으로 60 mg/kg i.p. 투여)로 치료, 4) 실데나필 (매일 2회 30 mg/kg 경구 투여) 및 MCT (연구 1일차에 단회 용량으로 60 mg/kg i.p. 투여)로 치료, 및 5) 대조 쥐 (매 3일 마다 1 ml/kg의 Tris 완충 식염수 i.p. 투여). 쥐들을 29일 동안 치료하였다. 1일차 첫 투약 전 그 후 연구 전체에 걸쳐 매주 체중을 기록하였다.

28일차에, 케타민/자일라진 (80/10 mg/kg)을 복강내 주사하여 쥐들을 안락사시켰다. 목을 절개하여 경정맥을 분리하고 전방을 결찰시켰다. 폐 동맥 압력 (PAP)을 측정하기 위해 유체가 충전된 압력 카테터를 우측 경정맥에 삽입하였다. 서혜부를 또 절개하여 대퇴 동맥을 분리하고 전방을 결찰시켰다. 수축기 동맥압, 확장기압, 및 심박수를 측정하기 위해 밀라 (Millar) 압력 카테터를 대퇴 동맥에 삽입하였다. 안정한 측정치가 수득될 때까지 평균 동맥압 및 우측 PAP를 Notocord HEM (Croissy sur Seine, 프랑스) v3.5 데이터 캡쳐 시스템을 사용하여 대략 5-10 분 동안 모니터하였다. 측정하는 동안, 쥐들을 가열 패드 상에서 대략 37℃에서 유지시켰으며 직장 온도 탐색자를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 체온을 모니터하였다. 절차 종료시, 쥐들을 안락사시키고, 심장과 폐를 제거하였다. 전체 심장을 계량하였다. 다음으로, 심방들을 제거하고 중격과 함께 좌심실 (LV + S)을 우심실 (RV)로부터 분리하였다. 심실들을 별도로 계량하였다. 일부에서, RV/LV + S를 계산하여 비대를 평가하였다. 또한 폐를 계량하였다.

대조 동물과 비교하여, 모노크로탈린 치료된 쥐 (비히클 치료 그룹)는 감소된 체중, 상승된 PAP, 좌심실 비대, 및 증가된 폐 중량을 가짐이 관찰되었으며, 이는 PAH가 생겼음을 나타낸다. 실데나필 치료된 쥐들은 모노크로탈린 치료된 쥐들에 비해 체중이 전혀 개선되지 않았다. 그러나 실데나필 치료는 모노크로탈린 치료된 쥐들에 비해 상승된 PAP를 30% 만큼 감소시키고, 좌심실 비대를 18.5% 만큼 감소시키고, 그리고 폐 중량을 10% 만큼 감소시켰다. 놀랍게도, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 및 ActRIIA-mFc 모두는 실데나필에 비해 이러한 모델에서 PAH 치료에 상당히 더 큰 효과를 가지는 것으로 나타났다. 예를 들어, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 치료는 체중을 개선시켰고 (+5.1%), 상승된 PAP를 44.6% 만큼 감소시켰고, 좌심실 비대를 39.6% 만큼 감소시켰고, 폐 중량을 19.0% 만큼 감소시켰다. ActRIIA-mFc 치료는 체중의 개선을 보여주지는 않았으나, 이는 PAH의 다른 합병증 치료에 상당한 효과를 보였다. 예를 들어, ActRIIA-Fc 치료는 상승된 PAP를 68% 만큼 감소시켰으며, 좌심실 비대를 47.1% 만큼 감소시켰고, 폐 중량을 18.4% 만큼 감소시켰다.

조직학적 점수를 기준으로 유사한 경향이 혈관 근육에서 관찰되었다. αSMA/엘라스틴을 탐지하기 위해 조직 시료들을 염색한 후, 동물 당 10 μm 내지 50 μm 크기의 100개의 폐 세동맥들을 비-근육화, 부분적 근육화, 또는 완전히 근육화로 분류하였다. 비히클 치료 쥐들의 폐 세동맥들은 62.3% 완전히 근육화, 36.4% 부분적 근육화, 그리고 1.4% 비-근육화인 것으로 결정되었다. 실데나필 치료는 혈관 근육 감소에 단지 보통의 효과를 나타냈다 (예컨대, 폐 세동맥은 57.9% 완전히 근육화, 41.6% 부분적 근육화, 그리고 0.9% 비-근육화임). 대조적으로, ActRIIA-mFc 치료는 실데나필 치료 동물과 비교하여 혈관 근육을 상당히 감소시켰다 (예컨대, 폐 세동맥은 비히클 치료 동물과 비교하여 25.8% 완전히 근육화, 66.9% 부분적 근육화, 그리고 7.3% 비-근육화임). 폐 세동맥들의 평활근 비대에 관한 조직학적 점수 또한 다음과 같이 기록하였다: 0 (정상), 1 (최소), 2 (경도), 3 (중등도), 또는 4 (두드러짐). 비히클 처리된 쥐들은 중등도 내지 두드러짐의 평균 평활근 비대 (3.8 점)를 가졌다. 또산, 실데나필 치료는 평균 점수 3 (중등증)으로 비대에 대해 중등도 효과를 가지는 것으로 관찰되었다. 반면 ActRIIA-mFc 치료된 동물들은 비히클 및 실데나필 치료된 동물들 모두에 비해 평활근 비대가 상당히 감소되었음 (평균 점수 1.6)이 관찰되었다. 종합하면, ActRIIA-mFc 치료는 PAH 모델에서 혈관 근육 및 비대를 상당히 감소시켰다.

이와 함께, 이들 데이터는 ActRIIA-mFc 및 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 모두가 이러한 모노크로탈린-유도된 모델에서 다양한 PAH 합병증을 개선함에 효과적임을 입증한다. 특히, ActRIIA-mFc 및 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 모두는 PAH 치료에 승인된 약물인 실데나필에 대해 관찰되었던 것 보다 동맥압, 좌심실 비대, 및 혈관 근육화 감소에 더 큰 효과를 보였다. 더욱이, 이들 데이터는 다른 GDF/BMP 길항제들, 특히, ActRIIA-mFc 및 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc와 유사한 활성을 가지는 길항제들이 PAH 치료에, 특히, PAH의 다양한 중증도 합병증을 예방 또는 감소시킴에 유용할 수 있음을 나타낸다.

실시예 15: Sugen 저산소증 쥐 모델에서 폐 고혈압에 대한 ActRII 폴리펩티드 및 ALK4: ActRIIB이형이량체의 효과

PAH의 Sugen 저산소증 모델에서 ActRIIA-mFc 융합 단백질 (실시예 1에 기재된 ActRIIA-mFc 동형이량체) 및 실데나필 (PAH 치료에 승인된 포스포다이에스테라제-5 억제제)의 효과를 추가로 조사하였다. 이 모델에서, 치료 시작 24시간 전에 PAH를 유도하기 위해 쥐들에게 일일 용량의 세막사닙을 제공하고 저 산소 환경 (대략 13% 산소)에 둔다.

쥐들을 다음과 같은 상이한 치료 그룹들 (그룹 당 10 마리)로 분리하였다: 1) 세막사닙 (일일 단회 용량으로 200 mg/kg s.c. 투여)/저산소증 및 Tris 완충 식염수 (매 3일 마다 1 ml/kg로 i.p. 투여) (비히클 치료 그룹)로 치료, 2) ActRIIA-mFc 폴리펩티드 (매 3일 마다 10 mg/kg i.p. 투여) 및 세막사닙 (매일 단회 용량으로 200 mg/kg s.c. 투여)/저산소증으로 치료, 3) 실데나필 (일일 2회 30 mg/kg 경구 투여) 및 세막사닙 (일일 단회 용량으로 200 mg/kg s.c. 투여)/저산소증으로 치료, 및 4) 대조 쥐들 (매 3일 마다 1 ml/kg으로 Tris 완충 식염수 i.p. 투여). 쥐들을 29일 동안 치료하였다. 1일차 첫 투약 전 그 후 연구 전체에 걸쳐 매주 체중을 기록하였다.

대조 동물과 비교하여, 세막사닙/저산소증 치료된 쥐 (비히클 치료 그룹)는 감소된 체중, 상승된 PAP, 좌심실 비대, 및 증가된 폐 중량을 가짐이 관찰되었으며, 이는 PAH가 생겼음을 나타낸다. 실데나필 치료는 비히클 치료 동물에 비해 평균 폐동맥 압력을 22.4% 만큼 감소시키고 좌심실 비대를 10% 만큼 감소시켰다. 또한, ActRIIA-mFc 치료는 실데나필에 비해 이러한 모델에서 PAH 치료에 상당히 더 큰 효과를 가지는 것으로 나타났다. 예를 들어, ActRIIA-mFc 치료는 비히클 치료 동물에 비해 평균 폐동맥 압력을 51.3% 만큼 감소시키고 좌심실 비대를 53.5% 만큼 감소시켰다.

조직학적 점수를 기준으로 유사한 경향이 혈관 근육에서 관찰되었다. αSMA/엘라스틴을 탐지하기 위해 조직 시료들을 염색한 후, 동물 당 10 μm 내지 50 μm 크기의 100개의 폐 세동맥들을 비-근육화, 부분적 근육화, 또는 완전히 근육화로 분류하였다. 비히클 치료 쥐들의 폐 세동맥들은 72.5% 완전히 근육화, 27.4% 부분적 근육화, 그리고 0.1% 비-근육화인 것으로 결정되었다. 실데나필 치료는 혈관 근육 감소에 있어서 비히클 치료된 동물에 비해 단지 보통의 효과를 나타냈다 (예컨대, 폐 세동맥은 67.4% 완전히 근육화, 31.6% 부분적 근육화, 그리고 1.0% 비-근육화임). 대조적으로, ActRIIA-mFc 치료는 실데나필 치료 동물과 비교하여 혈관 근육을 상당히 감소시켰다 (예컨대, 폐 세동맥은 비히클 치료 동물과 비교하여 29.3% 완전히 근육화, 69.3% 부분적 근육화, 그리고 1.4% 비-근육화임). 폐 세동맥들의 평활근 비대에 관한 조직학적 점수 또한 다음과 같이 기록하였다: 0 (정상), 1 (최소), 2 (경도), 3 (중등도), 또는 4 (두드러짐). 비히클 처리된 쥐들은 중등도 내지 두드러짐의 평균 평활근 비대 (3.6 점)를 가졌다. 또산, 실데나필 치료는 평균 점수 3 (중등증)으로 비대에 대해 중등도 효과를 가지는 것으로 관찰되었다. 반면 ActRIIA-mFc 치료된 동물들은 실데나필 치료된 동물들에 비해 평활근 비대가 상당히 감소되었음 (평균 점수 1.4)이 관찰되었다. 종합하면, ActRIIA-mFc 치료는 PAH 모델에서 혈관 근육 및 비대를 상당히 감소시켰다.

이와 함께, 이들 데이터는 ActRIIA-mFc가 Sugen 저산소증 모델에서 다양한 PAH 합병증을 개선시킴에 효과적임을 입증한다. 특히, ActRIIA-mFc는 PAH 치료에 승인된 약물인 실데나필에 대해 관찰되었던 것 보다 동맥압, 좌심실 비대, 및 혈관 근육화 감소에 더 큰 효과를 보였다. 더욱이, 이들 데이터는 다른 GDF/BMP 길항제들, 특히, ActRIIA-mFc와 유사한 활성을 가지는 길항제들이 PAH 치료에, 특히, PAH의 다양한 중증도 합병증을 예방 또는 감소시킴에 유용할 수 있음을 나타낸다.

참고문헌으로 포함

여기에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 것과 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.

상기 주제에 관한 특정 실시예들을 논의하였지만, 상기 설명들은 예시적인 것이며 이에 한정되는 것이 아니다. 본 명세서 및 청구 범위를 검토하면 많은 변형이 숙련된 기술자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 이러한 변형들, 그 균등물의 전체 범위 및 명세서와 함께 청구항을 참조하여 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PULMONARY HYPERTENSION <130> 1848179-0002-114-WO1 <140> PCT/US2017/042157 <141> 2017-07-14 <150> 62/510,403 <151> 2017-05-24 <150> 62/453,888 <151> 2017-02-02 <150> 62/362,955 <151> 2016-07-15 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 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Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln 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ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420 tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480 cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540 ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600 tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660 ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720 cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780 ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840 atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900 ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc 1536 <210> 8 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60 cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120 tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180 gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240 tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300 gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc 345 <210> 9 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu 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Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp 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Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met 100 <210> 12 <211> 1539 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 360 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420 ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480 tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380 tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440 cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta 1539 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 300 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345 <210> 14 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile 100 105 110 Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser 115 120 125 Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu Thr Gly Gly 130 135 140 Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 165 170 175 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 180 185 190 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 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600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720 gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780 atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840 gtccagccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900 atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960 ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 74 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr 20 25 30 Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn 35 40 45 Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His 50 55 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Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 275 280 285 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 290 295 300 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 305 310 315 320 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 325 330 335 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 340 345 350 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365 <210> 75 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120 aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180 aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240 aagggctgct gggatgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300 gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360 catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420 ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080 agcctctccc tgtccccggg taaatga 1107 <210> 76 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggggctgtc gggggtggct cgtacgtgac 720 ttccgggccc ccagcctctg gcaaatgagt gaagcgctcg ttgcagaagt tgccttcaca 780 gcagcagaag tacacctggg ggttctcctc agtggccaca cactcctgcc tatcgtagca 840 gttgaagtca tcatcccagc agcccttctt cacgagctcg atggtgccag agctgttgcg 900 ccaggaggcg tagcagtgca gccgcttgtc ctgctcgcct tcgcagcgct ccaggccgct 960 ctggttggtg cgctccagct cccagttggc gttgtagtag atgcactccc gtgtctcagc 1020 ctccccacgc ccagaggcgc cgggcgaaac gaagactgct ccacacagca gcagcacaca 1080 gcagagccct ctcttcattg catccat 1107 <210> 77 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp 65 70 75 80 Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu 85 90 95 Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu 100 105 110 Arg Phe Thr His 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 <210> 80 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (76)..(396) <400> 80 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg ccgct gag aca cgg gag tgc atc tac tac aac gcc aac tgg 111 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp 1 5 10 gag ctg gag cgc acc aac cag agc ggc ctg gag cgc tgc gaa ggc gag 159 Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser 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ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720 cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780 gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840 atcgtcccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900 gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960 gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 82 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (76)..(396) <400> 82 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg ccgcc gaa acc cgc gaa tgt att tat tac aat gct aat tgg 111 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp 1 5 10 gaa ctc gaa cgg acg aac caa tcc ggg ctc gaa cgg tgt gag ggg gaa 159 Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu 15 20 25 cag gat aaa cgc ctc cat tgc tat gcg tcg tgg agg aac tcc tcc ggg 207 Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly 30 35 40 acg att gaa ctg gtc aag aaa ggg tgc tgg gac gac gat ttc aat tgt 255 Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys 45 50 55 60 tat gac cgc cag gaa tgt gtc gcg acc gaa gag aat ccg cag gtc tat 303 Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr 65 70 75 ttc tgt tgt tgc gag ggg aat ttc tgt aat gaa cgg ttt acc cac ctc 351 Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn 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1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720 gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780 atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840 gtcgtcccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900 atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960 ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 84 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 gaaacccgcg aatgtattta ttacaatgct aattgggaac tcgaacggac gaaccaatcc 60 gggctcgaac ggtgtgaggg ggaacaggat aaacgcctcc attgctatgc gtcgtggagg 120 aactcctccg ggacgattga actggtcaag aaagggtgct gggacgacga tttcaattgt 180 tatgaccgcc aggaatgtgt cgcgaccgaa gagaatccgc aggtctattt ctgttgttgc 240 gaggggaatt tctgtaatga acggtttacc cacctccccg aagccggcgg gcccgaggtg 300 acctatgaac ccccgcccac c 321 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 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atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 780 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 840 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 900 gacaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag cgacctcacc 960 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1020 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggt 1065 <210> 113 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser 20 25 30 Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro 35 40 45 Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg 65 70 75 80 Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro 85 90 95 Ser Met Trp Gly 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sapiens <400> 126 Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser 20 25 30 Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro 35 40 45 Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg 65 70 75 80 Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro 85 90 95 Ser Met Trp Gly Pro Val Glu 100 <210> 127 <211> 103 <212> PRT <213> Condylura cristata <400> 127 Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Leu Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser 20 25 30 Ile Phe Asn Leu Asp Gly Leu Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro 35 40 45 Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Phe Cys Asn Lys 65 70 75 80 Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Val Lys Glu Pro Glu Arg Pro 85 90 95 Ser Val Trp Gly Pro Val Glu 100 <210> 128 <211> 103 <212> PRT <213> Erinaceus europaeus <400> 128 Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Gln Thr Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser 20 25 30 Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro 35 40 45 Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Phe Cys Asn Arg 65 70 75 80 Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Pro Lys Glu Ser Glu Gln Ala 85 90 95 Ser Met Trp Gly Pro Val Glu 100 <210> 129 <211> 102 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 129 Ala Pro Gly Gly Ala Arg Ala Leu Thr Cys Leu Cys Ser Asp Cys Lys 1 5 10 15 Gln Ala Asn Ser Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser Val 20 25 30 Phe Asn Leu Asp Gly Val Lys His His Val Arg Thr Cys Ile Pro Glu 35 40 45 Ala Lys Leu Ile Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser Glu 50 55 60 Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Ser Asp Phe Cys Asn Lys Ile 65 70 75 80 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Pro Pro Thr 100 105

Claims

ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 융합단백질을 포함하는, 환자의 폐동맥 고혈압 치료용 조성물로서, 상기 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 최소한 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 ActRIIA 폴리펩티드는 액티빈 및 GDF11 중 하나 이상에 결합하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 환자는 최소한 25 mm Hg의 휴지기 폐동맥 압력 (PAP)을 가지는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 환자의 PAP를 감소시키는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 환자는 세계 보건 기구가 인정한 기능 분류 II 또는 분류 III 폐 고혈압을 가지는, 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 폐 고혈압 기능적 분류 진행을 예방 또는 지연시키는, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는, 조성물:
a. 서열 번호: 9의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
b. 서열 번호: 10의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
c. 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 6에 있어서, 상기 융합단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
청구항 7에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 동형이량체 단백질 복합체의 일부인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 당화된, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 액티빈 A, 액티빈 B, 및 GDF11로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 리간드들에 결합하는, 조성물.
청구항 12에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 BMP10, GDF8, 및 BMP6로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 리간드에 추가로 결합하는, 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 Fc 융합 단백질은 ActRIIA 폴리펩티드와 면역글로불린의 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 포함하는, 조성물.
청구항 14에 있어서, 링커 도메인은 TGGG (서열 번호: 23)를 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 폐 고혈압 치료를 위한 추가 활성 제제 및 지지 요법 중 하나 이상과 병용하여 투여되는, 조성물.
청구항 17에 있어서, 폐 고혈압 치료를 위한 추가 활성 제제 및 지지 요법 중 하나 이상은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는, 조성물:
프로스타사이클린, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 셀렉시팍, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 보센탄, 암로디핀, 딜티아젬, 니페디핀, 와파린, 실데나필 및 토달라필, 시나시구아트, 리오시구아트, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-다이온; NQDI-1; 2-싸이옥소-싸이아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-싸이옥소-싸이아졸리딘-5-일리덴)-1,3-다이하이드로-인돌-2-온; dh404; CDDO-에폭사이드; 2.2-다이플루오로프로피온아마이드; C28 이미다졸 (CDDO-Im); 2-사이아노-3,12-다이옥솔란-1,9-다이엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트라이플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트라이플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1-->2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1-->3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스터; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실(1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시듀로닉 애시드 (CS2); 메틸 3,11-다이옥솔란-12-엔-28-올레이트 (DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사다이아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트; 산소요법; 심방 중격절개술; 폐동맥 혈전내막제거술; 폐, 심장 또는 폐와 심장의 이식.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 액티빈 및 GDF11 중 하나 이상에 결합하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 액티빈 및 GDF11 중 하나 이상에 결합하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
청구항 21에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 환자는 하나 이상의 혈관확장제로 치료받은 적이 있는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 환자는 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄, 시나시구아트, 리오시구아트, 텔린 및 토달라필으로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 제제로 치료되는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 조성물은 하나 이상의 혈관확장제와 병용하여 투여되는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄, 시나시구아트, 리오시구아트, 텔린 및 토달라필으로 구성된 그룹에서 선택되는, 조성물
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
청구항 27 또는 청구항 28에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
청구항 29에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 10의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
청구항 31 또는 청구항 32에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
청구항 33에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
청구항 1에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
청구항 35 또는 청구항 36에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
청구항 37에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 최소한 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
폴리펩티드를 포함하는, 환자의 폐동맥 고혈압 치료용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 32를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
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