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KR102337927B1 - 면역글로불린의 분무 - Google Patents

면역글로불린의 분무 Download PDF

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KR102337927B1
KR102337927B1 KR1020167030898A KR20167030898A KR102337927B1 KR 102337927 B1 KR102337927 B1 KR 102337927B1 KR 1020167030898 A KR1020167030898 A KR 1020167030898A KR 20167030898 A KR20167030898 A KR 20167030898A KR 102337927 B1 KR102337927 B1 KR 102337927B1
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aerosol
nebulizer
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세드릭 피에레 보나르부륵
카린 슈타인퓌러
울리히 바우만
Original Assignee
체에스엘 베링 아게
파리 파마 게엠베하
메디치니쉐 호흐슐레 하노버
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 다클론성 면역글로불린(Ig)을 포함하는 조성물의 분무에 의해 에어로졸을 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다. 효율적인 막 분무기 및 이러한 막 분무기를 사용하여 분무를 위해 최적화된 조성물의 선택은, Ig의 기도로의 투여를 위한 에어로졸을 생성시키는 특히 효율적인 방법을 초래한다.

Description

면역글로불린의 분무{NEBULIZATION OF IMMUNOGLOBULIN}
본 발명은, 치료 목적을 위해 에어로졸을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은, 면역글로불린(Ig), 특히 다클론성 면역글로불린, 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 A(IgA) 또는 면역글로불린 M(IgM) 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물을 분무(nebulizing)하는 방법에 관한 것이다.
면역글로불린(Ig)은 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 인간 혈장의 성분들이다. 이들 특이적 면역 단백질들은 B-림프구에 의해 합성되고 혈장, 림프 및 모든 척추동물의 기타 신체 분비물에서 발견된다. 면역글로불린은 인간에 있어 혈장 단백질의 대략 20%를 구성한다. 세 가지 면역글로불린 부류들, IgG, IgA 및 IgM은 다른 것들보다 더 중요하다. 인간 IgG는 혈장 내에서 가장 풍부한 면역글로불린을 대표하는 반면, IgA는 외분비물, 예를 들면, 타액, 눈물, 및 호흡기 및 장관의 점액에서의 주요 항체 부류를 대표한다. IgA는 세균성 및 바이러스성 병원균에 대한 1차 방어선 중 하나를 형성한다. IgM은 인간 순환계에서 지금까지 신체상으로는 최대 항체이며, 감염 과정에서 초기에 나타나며 통상적으로 추가의 노출 후에 더 적은 정도로 나타난다.
지난 세기에 걸쳐, 면역글로불린 제제는 원발성 면역결핍 장애를 가진 환자들에서 대체 치료요법으로서 감염성 질환의 치료에 그리고 다양한 염증성 및 자가면역 병태 뿐만 아니라 특정 신경학적 장애의 예방과 치료에 성공적으로 사용되었다.
이들 면역글로불린 제제는 전신 투여를 위해 개발되었으며, 대부분 IgG로 구성되었다. 현재, 이들 제제는 수천 명의 건강한 공여자들(1,000 내지 60,000 공여자들)의 풀링된 혈장으로부터 유도되며 특이적 항체와 자연 항체 둘 다를 함유하며, 이는 공여자 집단의 누적 항원 경험을 반영한다. 이러한 넓은 범위의 특이적 항체와 자연 항체는 넓은 범위의 항원(예를 들면, 병원균, 외부 항원 및 자기/자가항원)을 인지할 수 있다.
일반적으로 면역글로불린은 정맥내 또는 피하 투여된다. 여러 시판 제형들은 이들 투여 경로들에 이용할 수 있다. 또한, 면역글로불린의 국소 투여, 더욱 구체적으로 기도로의 투여(상기도: 코와 비도(nasal passage), 부비강, 인후, 구강인두, 인두, 후두(voice box), 후두(larynx) 및 호흡관; 뿐만 아니라 하기도: 기도, 폐, 분기, 기관지 및 세기관지, 호흡 세기관지, 폐포 관, 폐포 낭, 및 폐포 포함)가 제안되었다.
예를 들면, US 4,994,269에는, 피 애루기노사(P.　 aeruginosa)로의 항체의 국소 투여 방법이 기재되어 있다. 상기 항체는, 예를 들면, 코로의 적용을 통해, 폐로의 에어로졸로서 또는 호흡관내 투여를 통해 에어로졸 형태로 투여될 수 있다.
WO 92/01473에는, 주요 보호 바이러스 표면 항원(들) 상에 존재하는 다양한 보호 항원 부위들에 대한 특이적 단클론성 항체들의 혼합물의 작은 입자(< 2 ㎛) 에어로졸을 민감한 공여자의 하기도 내로 투여함을 포함하는 방법이 기재되어 있다.
문헌(참조: Rimensberger and Roth ("Physical Properties of Aerosolized Immunoglobulin for Inhalation Therapy", Journal of Aerosol Medicine, Vol. 8(3), pp 255-262, 1995)에서, 면역글로불린 용액(IVIG)의 분무는 4개의 압축 공기 분무기들을 사용하여 평가하였다.
US 2002/0136695에는, 정량 분무식 흡입기 또는 분무기에 의한, 면역결핍 및 감염을 포함하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 면역글로불린 A의 에어로졸 투여가 기재되어 있다.
WO 03/059424에는, 식별 마커/표지를 갖는 네뷸(nebule)의 내용물의 식별에 근거하여 에어로졸 발생기를 제어할 수 있는 제어기가 기재되어 있다. 상기 시스템은 여러 약물 그룹들의 분무에 사용될 수 있다. 항체는 약물 그룹들 중 하나로서 언급된다.
WO 2004/004798에는, FcRn 결합 파트너를 갖는 치료제의 에어로졸 함유 항체 또는 접합체들을 폐의 중심 기도의 상피에 투여함에 의한 치료제의 전신 전달을 위한 방법들 및 조성물들이 기재되어 있다. 상기 방법들과 제품들은 전신 전달에 영향을 미치기 위해 깊은 폐에 투여할 필요가 없다는 이점을 갖는다. 상이한 작동 원리를 갖는 에어로졸 발생기들의 사용이 제안된다.
WO 2006/122257에는, 보체계의 활성을 억제하고 폐 질환 또는 병태의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 항체를 사용하는 방법들 및 조성물들이 기재되어 있다. 상이한 분무기 유형들이 모로클로날 항체의 투여를 위해 제안된다.
WO 2011/098552에는, 응집물 형성의 양이 상당히 감소되는, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 에어로졸의 제조 방법이 기재되어 있다.
이들 특허문헌들은 상이한 유형의 항체들을 적용하는 몇 가지 방법들을 제안하지만, 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM, 또는 이들의 조합을, 특히 신속하고 효율적인 방식으로 분무하는 방법이 여전히 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 다클론성 Ig를 환자의 기도에 효율적인 방식으로 전달하기 위해, 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물의 에어로졸을 생성시키는 방법을 제공하는 것으로서, 예를 들면, 에어로졸 발생기의 전달된 용량(DD: delivered dose)은 적어도 40%, 또는 바람직하게는 적어도 50%일 수 있으며, 호흡 가능 분율(respirable fraction)(입자 크기 5㎛ 미만 MMD)은 적어도 70% 또는 바람직하게는 적어도 80%여야 하며, 또한 에어로졸 생성 후의 기포 발생 특성들 및 액체 저장소 내의 삽입 유체의 잔류 용적이, 예를 들면, 1.0mL 미만 또는 바람직하게는 0.5mL 미만, 또는 더욱 바람직하게는 0.3mL 미만으로 감소될 수 있다.
본 발명은, (a) 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 포함하는 액체 수성 조성물을 제공하는 단계(여기서, Ig의 농도는 20 내지 200mg/mL의 범위 내이다); (b) 내부에 상기 조성물이 충전되어 있는 저장소를 갖는 막 분무기(membrane nebulizer)를 제공하는 단계; 및 (c) 상기 분무기를 사용하여 상기 조성물을 분무하여 에어로졸을 얻는 단계(에어로졸 생성)를 포함하는, 에어로졸 생성 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 상기 Ig는 다클론성이다. 바람직하게는, 상기 Ig는 다클론성 IgG, 다클론성 단량체성 IgA, 다클론성 이량체성 IgA, 다클론성 IgM, 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 분비 성분, 바람직하게는 재조합하여 생성된 인간 분비 성분을 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 양태에서, 액체 수성 조성물 중의 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 농도는 20 내지 100mg/mL의 범위 내이다. 또한, 상기 조성물은 안정제를 포함할 수 있다. 상기 안정제는 프롤린일 수 있다. 계면활성제와 같은 기타 부형제들이 상기 조성물에 함유될 수도 있다.
특정 양태에서, 저장소 내부 압력이 단계 (c) 전에 또는 단계 (c) 동안에 감소하도록 분무기 저장소를 대기로부터 격리시킨다. 바람직한 양태에서, 상기 분무기는 진동 막 분무기이다. 특정 양태에서, 분무기는 하기도 및/또는 상기도를 표적으로 하는 에어로졸을 생성시키기 위해 구체적으로 구성된다.
하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 저장소 내에 충전된 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 용량의 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%를 함유하는 에어로졸을 생성한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 활성도가 저장소 내에 충전된 조성물 중의 활성도의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 90%인 에어로졸을 생성한다.
본 발명의 추가의 양태들은 하기 상세한 설명, 실시예 및 청구범위에 기초하여 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 사용될 수 있는 공지된 막 분무기의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 사용될 수 있는 공지된 막의 컴퓨터 단층 촬영(CT) 사진을 나타낸다.
도 3은 환원(A) 조건 및 비-환원(B) 조건하에 SDS-PAGE에 의한 비-분무된 및 분무된 IgG 조성물(PrivigenTM)의 구조 분석의 결과를 나타낸다.
도 4는 환원(A) 조건 및 비-환원(B) 조건하에 SDS-PAGE에 의한 비-분무된 및 분무된 IgG(PBS 또는 글리신 중), IgA 및 IgAM 조성물의 구조 분석의 결과를 나타낸다. (C)는 환원(좌측 패널) 조건 및 비-환원(우측 패널) 조건하에 추가의 IgA(p, q), IgAM(r, s), SIgAM(t, u) 및 IgG(v, w, x, y)의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 5는 분무 전(-) 및 후(N)의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)에 대한 상이한 제형들의 결합을 나타낸다.
도 6은 상피 세포 단층의 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 감염의 다양한 측면들에 대한 분무 전과 후의 상이한 제형들의 활성도에 대한 분무 효과를 나타낸다: (A) 시겔라 플렉스네리 단독 (C+)에 반응하는, 또는 다양한 면역글로불린 제형의 비분무된(-) 또는 분무된(N) 제형과의 복합체에 에 반응하는 상피 세포에 의한 염증성 사이토카인 분비에 대한 영향; (B) 시겔라 플렉스네리 단독 (C+)의, 또는 다양한 면역글로불린 제형의 비분무된(-) 또는 분무된(N) 제형과의 복합체의 상기 세포 단층의 경상피(transepithelial) 막 내성에 대한 영향; (C) 시겔라 플렉스네리 단독 (C+)으로, 또는 다양한 면역글로불린 제형의 비분무된(-) 또는 분무된(N) 제형과의 복합체로 감염 후의 감염된 영역(좌측 패널)과 감염 병소의 수(우측 패널).
도 7은 분무된 면역글로불린 제형의 폐 침착, 및 동물 모델에서 BAL시 이들의 존재의 시간 경과를 나타낸다.
도 8은 항-감마 쇄(a), 항-알파 쇄(b), 및 항-뮤 쇄(c)로 프로빙된, 시간 0, 1h, 6h, 12h 및 24h에서 취한 BAL 샘플들의 웨스턴 블롯(Western blot)을 나타낸다.
본 발명의 방법은 액체 수성 조성물을 분무함에 의해 에어로졸을 생성하는 방법이다. 액체 수성 조성물은 액체 시스템이며, 액체 캐리어 또는 용매는 주로 또는 완전히 물로 이루어진다. 특정 경우에서, 상기 액체 캐리어는 적어도 부분적으로 수혼화성인 하나 이상의 액체들의 작은 분획을 함유할 수 있다.
상기 조성물은, 통상적으로 인간 공여자들의 혈장으로부터 얻은 다클론성 면역글로불린을 포함한다. 바람직하게는, 다수의 공여자, 예를 들면, 100명 이상의 공여자, 바람직하게는 500명 이상의 공여자, 심지어 더욱 바람직하게는 1,000명 이상의 공여자로부터의 혈장을 풀링하였다. 전형적으로, 혈장 풀을 에탄올 분별하고, 이어서 수개의 정제 단계들, 예를 들면, 추가의 침전 단계들 및/또는 컬럼 크로마토그래피 단계들 뿐만 아니라, 바이러스 및 다른 병원균의 불활성화 및 제거 단계들, 예를 들면, 나노여과 또는 용매/세제 처리한다.
상기 조성물은 Ig로도 언급되는 다클론성 면역글로불린을 포함한다. 이러한 다클론성 Ig, 예를 들면 IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합은, 인간 혈액 공여자의 혈장으로부터 얻을 수 있다. 정상적인 인간 IgG는 적어도 95% 순도 IgG로 얻을 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 조성물 중에 함유된 IgG는 일반적으로 적어도 95% 순도 IgG, 바람직하게는 적어도 96% 순도 IgG, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 순도 IgG, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순도 IgG를 갖는다. 바람직하게는, 소량의 IgA만을 함유한다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 조성물은 최대로 25㎍의 IgA/mL를 함유한다.
또 다른 구체적인 양태에서, 상기 조성물은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 94%, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 가장 바람직하게는 적어도 98%의 순도를 갖는 IgA를 포함한다. 바람직하게는, IgA는 인간 혈장으로부터 정제되지만, 우유, 타액 또는 기타 IgA-함유 체액과 같은 IgA의 다른 공급원이 사용될 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, IgA는 단량체성 IgA이다. 추가의 또 다른 구체적인 양태에서, IgA에는 이량체성 IgA가 풍부하며; 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50%의 IgA가 이량체성 형태이다. 임의로, IgA 조성물은 분비 성분, 바람직하게는 재조합하여 생성된 분비 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이의 전문이 인용에 의해 포함되는 WO2013/132052에 개시된 조성물이 사용될 수 있다.
추가의 또 다른 특정 양태에서, 상기 조성물은 IgM을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 조성물은 IgM 및 IgA를 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 IgM 및 이량체성 IgA를 포함하고, 이는 J-쇄를 또한 포함한다. 임의로, 상기 조성물은 또한 분비 성분, 바람직하게는 재조합하여 생성된 분비 성분을 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 IgM, IgA 및 IgG를 포함한다. 구체적인 양태에서, 이러한 조성물은 76% IgG, 12% IgA 및 12% IgM을 함유할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 비교적 고농도의 Ig, 예를 들면 IgG, IgA, IgM, 또는 이들의 조합이 사용된다. 더욱 특히, Ig, 특히 IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 농도는 20 내지 200mg/mL의 범위이다. 바람직하게는, 상기 농도는 20 내지 190mg/mL, 20 내지 180mg/mL, 20 내지 170mg/mL, 20 내지 160mg/mL, 20 내지 150mg/mL, 30 내지 200mg/mL, 30 내지 190mg/mL, 30 내지 180mg/mL, 30 내지 170mg/mL, 30 내지 160mg/mL, 30 내지 150mg/mL, 40 내지 200mg/mL, 40 내지 190mg/mL, 40 내지 180mg/mL, 40 내지 170mg/mL, 40 내지 160mg/mL, 40 내지 150mg/mL의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 상기 농도는 20 내지 140mg/mL, 20 내지 130mg/mL, 20 내지 120mg/mL, 30 내지 140mg/mL, 30 내지 130mg/mL, 30 내지 120mg/mL, 40 내지 140mg/mL, 40 내지 130mg/mL, 40 내지 120mg/mL, 50 내지 140mg/mL, 50 내지 130mg/mL 또는 50 내지 120mg/mL의 범위이고, 심지어 더욱 바람직하게는, 상기 농도는 약 50mg/mL, 60mg/mL, 70mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 110mg/mL, 또는 120mg/mL이다. 비교적 고농도는 낮은 충전 용적 및 짧은 분무 시간을 가능하게 하며, 따라서, 상기 방법의 치료 효율을 보장하는데 중요하다.
막 분무기를 사용하여 본 발명의 방법에 따른 에어로졸을 생성시킨다. 본원에서 분무기는 액체 물질을 분산된 액체 상(dispersed liquid phase)으로 에어로졸화시킬 수 있는 장치로서 정의된다. 본원에서 에어로졸은 연속 가스 상, 및 이에 분산되어 있는 액체 입자들의 불연속 또는 분산된 상을 포함하는 시스템으로서 정의된다.
에어로졸 발생기는, 예를 들면, Ig, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 함유하는 유체의 초기 용적을 보유하도록 구성된 액체 저장소, 개구부들을 갖는 막을 가질 수 있으며, 상기 액체 저장소는, 예를 들면, 중력에 의해 액체를 상기 막의 한 측면에 공급하기 위해 막과 소통하며, 상기 막은 상기 개구부들을 통해 액체를 수송하도록 오실레이션할 수 있어서(oscillatable), 액체가 막의 다른 측면 상에서 에어로졸의 형태로 방출된다.
에어로졸 발생기는 한 측면 상에 존재하는 액체로부터 액적을 생성시키고 유체 저장소의 벽의 일부가 진동하는 때에 상기 액적을 다른 측면 상에서 에어로졸로서 방출시키는 막, 및 유체 저장소의 벽의 일부가 진동되도록 유체 저장소의 벽의 일부에 연결되어 있는 진동-발생 장치, 예를 들면, 압전 소자를 가질 수 있다(수동 막 분무기, 유형 I).
에어로졸 발생기는 한 측면 상에 존재하는 액체로부터 액적을 생성시키고 유체 공급기(예를 들면, 튜브)의 벽의 일부가 진동하는 때에 상기 액적을 다른 측면 상에서 에어로졸로서 방출시키는 막, 및 유체 공급기가 진동되도록 유체 공급기에 연결되어 있는 진동-발생 장치, 예를 들면, 압전 소자를 가질 수 있다(수동 막 분무기, 유형 II).
에어로졸 발생기는 한 측면 상에 존재하는 액체로부터 액적을 생성시키고 막이 진동하는 때에 상기 액적을 다른 측면 상에서 에어로졸로서 방출시키는 막, 및 상기 막이 진동되도록 막에 연결되어 있는 진동-발생 장치, 예를 들면, 압전 소자를 가질 수 있다(활성 막 분무기).
분산된 상은 본질적으로 액적으로 이루어진다. 분산된 상의 액적은 액체 환경에서 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 포함한다. 액체 환경은 주로, 아래에 추가로 기재된 바와 같은 추가의 부형제를 갖거나 갖지 않는 수성 상이다. 본원에 개시된 바와 같이, 상기 액체 조성물에 관한 특성들 및 선호사항들이 또한 상기 조성물로부터 생성되는 에어로졸의 분산된 상에 적용될 수 있고 그 반대일 수도 있음을 당업자에 의해 이해될 것이다.
에어로졸의 연속 가스 상은 약제학적으로 허용되는 임의의 가스 또는 가스들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 가스는 단순히 공기 또는 압축 공기일 수 있으며, 에어로졸 발생기들로서 분무기를 사용하는 흡입 치료요법에서 가장 통상적이다. 또는, 다른 가스들 및 가스 혼합물, 예를 들면, 산소로, 이산화탄소로 또는 질소와 산소의 혼합물로 풍부화된 공기가 사용될 수 있다.
두 가지 값들이 실험적으로 측정될 수 있으며, 생성된 에어로졸의 입자 크기 또는 액적 크기를 기술하는데 유용할 수 있다: 질량 중간 직경(MMD) 및 질량 중간 에어로다이나믹 직경(MMAD). 두 값들 간의 차이는 MMAD는 물의 밀도로 정규화(등가 공기역학적)된다는 것이다.
MMAD는 임팩터(impactor), 예를 들면, ACI(Anderson Cascade Impactor) 또는 NGI(Next Generation Impactor)에 의해 측정될 수 있다. 또는, 레이저 회절 방법들이 사용될 수 있으며, 예를 들면, Malvern MasterSizer XTM로 MMD를 측정한다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 에어로졸의 분산된 상은 바람직하게는 10㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 내지 약 6㎛, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 5㎛ 및 심지어 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 4.5㎛의 입자 크기, 예를 들면, MMD를 나타낸다. 또는, 입자 크기는 바람직하게는 10㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 내지 약 6㎛, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 5㎛ 및 심지어 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 4.5㎛의 MMAD를 가질 수 있다. 에어로졸의 분산된 상을 기술하는 또 다른 파라미터는 에어로졸화된 액체 입자들 또는 액적들의 입자 크기 분포이다. 기하학적 표준 편차(GSD)는 생성된 에어로졸 입자들 또는 액적들의 입자 또는 액적 크기 분포의 넓음에 대해 종종 사용되는 척도이다.
상기 기재된 범위 내의 정확한 MMD의 선택은 에어로졸의 침착을 위한 표적 영역 또는 조직을 고려해야 한다. 예를 들면, 최적의 액적 직경은 경구, 비강 또는 호흡관 흡입이 의도되는 지에 따라 상이할 것이며, 상기도 및/또는 하기도 전달(예를 들면, 구강인두, 인후, 호흡관, 기관지, 폐포, 폐, 코, 및/또는 부비강으로)에 초점을 맞추고 있다. 추가로, 연령 의존적 해부학적 기하학적 형태(예를 들면, 코, 입 또는 기도 기하형태) 뿐만 아니라 환자의 호흡기 질환 및 병태, 및 이들의 호흡 패턴은 하기도 또는 상기도로의 약물 전달을 위한 최적의 입자 크기(예를 들면, MMD 및 GSD)를 결정하는 중요한 인자들에 속한다.
일반적으로, 2mm 미만의 내경으로 정의되는 작은 기도는 폐 용적의 약 99%를 나타내고, 따라서 폐 기능에 중요한 역할을 한다. 폐포는 산소와 이산화탄소를 혈액과 교환하는 깊은 폐 내의 부위이다. 일부 바이러스 또는 세균에 의해 유도된 폐포 내 염증은 부위 상에 유체를 분비하도록 하고 폐에 의한 산소 섭취량에 직접적인 영향을 미친다. 에어로졸을 사용한 깊은 폐의 기도의 치료학적 표적화는 5.0㎛ 미만, 바람직하게는 4.0㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 3.5㎛ 미만 및 심지어 더욱 바람직하게는 3.0㎛ 미만의 MMD를 갖는 에어로졸을 필요로 한다.
기도로의 에어로졸 전달을 위해, 에어로졸은 10.0㎛ 미만, 바람직하게는 5.0㎛, 더욱 바람직하게는 3.3㎛ 미만, 및 심지어 더욱 바람직하게는 2.0㎛ 미만의 MMD를 갖는다. 바람직하게는, MMD는(액적 크기는) 약 1.0 내지 약 5.0㎛의 범위 내이며, 크기 분포는 2.2 미만, 바람직하게는 2.0 미만, 더욱 바람직하게는 1.8 미만 또는 심지어 더욱 바람직하게는 1.6 미만의 GSD를 갖는다. 이러한 입자 크기 및 입자 크기 분포 파라미터들은, 에어로졸화되는 약물의 양에 비해 기관지 및 세기관지를 포함하는 인간의 기도(예를 들면, 폐)에서 높은 국소 약물 농도를 달성하는데 특히 유용하다. 이러한 맥락에서, 깊은 폐 침착은 성인과 어린이의 중심 기도에서의 침착보다 더 작은 MMD를 필요로 하며, 유아와 아기의 경우 약 1.0 내지 약 3.3㎛의 범위의 심지어 더 작은 액적 크기(MMD)가 더 바람직하고 2.0㎛ 미만의 범위가 심지어 더 바람직한 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 에어로졸 치료요법에서, 5㎛ 미만(성인에 의해 호흡 가능 분율을 나타냄) 및 3.3㎛ 미만(어린이에 의해 호흡 가능하거나 성인의 깊은 폐에 침착되는 분율을 나타냄)의 액적의 분율을 평가하는 것이 통상적이다. 또한, 2㎛ 미만의 액적의 분율은 종종, 성인과 어린이의 말단 세기관지 및 폐포에 최적으로 도달할 수 있으며 유아와 아기의 폐에 침투할 수 있는 에어로졸의 분율을 나타내는 것으로서 평가된다.
본 발명의 방법에서, 5㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 액적들의 분율은 바람직하게는 65% 초과, 더욱 바람직하게는 70% 초과 및 심지어 더욱 바람직하게는 80% 초과이다. 3.3㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 액적들의 분율은 바람직하게는 25% 초과, 더욱 바람직하게는 30% 초과, 심지어 더욱 바람직하게는 35% 초과 및 더욱 더 바람직하게는 40% 초과이다. 2㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 액적들의 분율은 바람직하게는 4% 초과, 더욱 바람직하게는 6% 초과 및 심지어 더욱 바람직하게는 8% 초과이다.
에어로졸은 또한 호흡 모의 실험에서 측정된 바와 같이 이의 전달된 용량(DD)으로 특징지울 수 있다. 전달된 용량을 사용하여, 예를 들면, 레이저 회절(예를 들면, Malvern MasterSizer XTM)에 의해 또는 임팩터(예를 들면, Anderson Cascade Impactor - ACI, 또는 Next Generation Impactor - NGI)를 사용하여 측정되는 호흡 가능 분율(RF)에 근거한 호흡 가능 용량(RD: respirable dose)을 계산할 수 있다. 성인 호흡 패턴(사인곡선 유동, 500mL 호흡량(tidal volume), 15회 호흡/min)을 갖는 호흡 모의 실험(예를 들면, BRS3000(제조사: Copley) 또는 Compass IITM(제조사: PARI)과 같은 호흡 시뮬레이터를 사용함)에서 본 발명의 방법을 적용하고 2mL의 조성물(예를 들면, 200mg Ig, 200mg IgG, 200mg　IgA, 200mg　IgM 또는 이들의 조합)을 막 분무기 내로 충전시키는 경우, 전달된 용량(DD)은 바람직하게는 40% 초과(80mg Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합), 더욱 바람직하게는 45% 초과(90mg Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합) 및 심지어 더욱 바람직하게는 50% 초과(100mg Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합)이다.
상기도, 특히 코, 비강 및/또는 비부비동 점막, 골협구 복합체, 및 부비동의 치료를 위해, 약 5.0㎛ 미만, 또는 약 4.5㎛ 미만, 또는 약 4.0㎛ 미만, 또는 약 3.3 미만 또는 약 3.0㎛ 미만의 MMD가 특히 적합하다.
상기도에 적용하기 위한 생성된 에어로졸의 적합성은 WO 2009/027095에 기재된 인간 비강 캐스트 모델과 같은 비강 흡입 모델에서 평가될 수 있다. 코로 에어로졸을 전달하기 위해, 예를 들면, SinusTM 장치(제트 분무기)(제조사: PARI) 및 또한 막 분무기(Vibrent™ 기술의 프로타입)가 존재한다.
본 발명의 방법에 사용된 분무기는 막 분무기이다. 바람직하게는, 막 분무기는 진동 막 분무기이다. 후자 유형의 분무기는 분무용 액체가 충전되어 있는 저장소를 포함한다. 분무기가 작동하는 경우, 오실레이션, 즉, 진동(예를 들면, 압전 소자에 의해)되는 제조된 막으로 액체를 공급한다. 진동 막의 한 측면에 존재하는 액체는 이에 의해 진동 막("기공들" 또는 "홀들"로도 언급됨)에서 개구부들을 통해 전달되며, 진동 막의 다른 측면 상에 에어로졸의 형태를 취한다. (예를 들면, eFlow rapid 및 eRapid(제조사: PARI), HL100(제조사: Health and Life) 및 AeronebGo 및 AeronebSolo(제조사: Aerogen)). 이러한 분무기들은 "활성 막 분무기들"로 언급될 수 있다.
다른 유용한 막 분무기들에서, 조성물을 막보다는 오히려 액체를 진동시킴으로써 분무시킬 수 있다. 이러한 오실레이션하는 유체 막 분무기는, 분무될 액체가 충전되어 있는 저장소를 포함한다. 분무기가 작동하는 경우, 액체는 오실레이션되는(즉, 예를 들면, 압전 소자에 의해 진동되는) 액체 공급 시스템을 통한 막으로 공급된다. 이러한 액체 공급 시스템은 저장소(예를 들면, AerovectRxTM 기술, Pfeifer Technology) 또는 진동 액체 수송 슬라이더(예를 들면, I-NebTM 장치(제조사: Respironics), 또는 U22TM 장치(제조사: Omron))의 진동 후방벽(back wall)일 수 있다. 이들 분무기들은 "수동 막 분무기들"로 언급될 수 있다.
상이한 막 유형들은 막 분무기를 사용하여 액체를 분무하는데 사용 가능하다. 이들 막은 상이한 액적 크기(MMD 및 GSD)를 갖는 에어로졸을 생성시키는 상이한 기공 크기를 특징으로 한다. 조성물의 특징들 및 원하는 에어로졸 특징들에 따라, 상이한 막 유형들(즉, 상이한 개질된 막 분무기 또는 에어로졸 발생기들)이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서, MMD가 2.0㎛ 내지 5.0㎛의 범위, 바람직하게는 3.0㎛ 내지 4.9㎛의 범위 및 더욱 바람직하게는 3.4㎛ 내지 4.5㎛의 범위인 에어로졸을 생성시키는 막 유형들을 사용하는 것이 바람직하다. 발명의 또 다른 양태에서, MMD가 2.8㎛ 내지 5.5㎛의 범위, 바람직하게는 3.3㎛ 내지 5.0㎛의 범위, 및 더욱 바람직하게는 3.3㎛ 내지 4.4㎛의 범위인 에어로졸, 예를 들면, 등장성 염수(NaCl 0.9%)를 생성시키는 에어로졸 발생기 장치에 설치된 막 유형들을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 양태에서, MMD가 2.8㎛ 내지 5.5㎛의 범위, 바람직하게는 2.9㎛ 내지 5.0㎛의 범위 및 더욱 바람직하게는 3.8㎛ 내지 5.0㎛의 범위인 에어로졸, 예를 들면, 등장성 염수를 생성시키는 에어로졸 발생기 장치에 설치된 막 유형들을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 발명자들은, 저장소 내의 압력이 다클론성 Ig, 예를 들면 IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 포함하는 액체 수성 조성물을 분무시키는 단계(즉, 단계 (c)) 전에 또는 이 동안에 감소하도록 저장소를 대기로부터 격리시키는 경우, 본 발명의 방법이 특히 잘 기능하는 것을 발견하였다. 즉, 상기 방법은, 액체 수성 조성물이, 에어로졸 액적이 방출되는 영역의 주변 압력보다 약간 낮은 압력하에 막에 공급되는 경우 특히 효율적이다. 액체 분무 단계 전에 저장소 내의 개시 압력은 바람직하게는 적어도 50mbar, 더욱 바람직하게는 적어도 75mbar, 및 가장 바람직하게는 적어도 100mbar이다.
또한, 에어로졸 발생기는, 밀봉된 상태의 액체 저장소의 용적(V1)이 막이 오실레이션되기 전(즉, 투여 개시 또는 사용 전) 용적(V2)으로 증가되도록 액체 저장소와 협력하는 부압 발생 장치를 갖는다. 이러한 부압 발생 장치는 US　6,983,747　B2에 개시된 바와 같이 형성될 수 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다. 또는, 상기 부압 발생 장치는 또한 WO　2007/020073　A1에 개시된 바와 같이 구성될 수 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다.
저장소 내의 압력 감소를 실현하기 위해, 도 1에 나타낸 바와 같이, 저장소(10) 내의 개구부용 기밀 실(gas-tight seal)을 제공하도록 상기 개구부 상에 배열된 밀봉 소자(sealing element)(16)에 의해 그리고, 슬라이딩 가능한 소자(21)의 이동이 밀봉 소자(16)의 적어도 하나의 섹션(18)의 이동에 영향을 미쳐 부압이 저장소(10)에서 생성되도록 하는 방식으로 밀봉 소자(16)에 연결된 상기 슬라이딩 가능한 소자(21)에 의해, 상기 저장소를 대기로부터 격리시키는 것이 특히 바람직하다. 저장소 내부의 압력을 감소시키는 이러한 방법은 WO 02/064265에 기재되어 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다. 또는, 부압 발생 장치는 또한 EP　1353759　B1에 개시된 바와 같이 구성될 수 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다. 다른 유용한 막 분무기에서, 부압은 폐쇄 소자 또는 기계적 시스템에 의해, 예를 들면, 용적 팽창 벨로스(bellows), 이동, 흡인, 펌핑 등을 사용하여 밀봉된 액체 저장소에서 발생된다.
또는, 저장소 내의 부압 발생 장치는 유체 또는 액체로부터의 완전한 에어로졸 생성 공정 동안 저장소에서 거의 일정한 부압 범위를 생성하도록 구성될 수도 있다. 저장소 내의 부압 범위는, 액체 분무 단계 동안, 바람직하게는 50 내지 400mbar의 범위, 가장 바람직하게는 100 내지 400mbar의 범위, 심지어 보다 바람직하게는 100 내지 350mbar의 범위, 및 가장 바람직하게는 100 내지 200mbar의 범위이다. 이러한 부압 범위 장치는 WO　2012/069531　A2에 개시된 바와 같이 형성될 수 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다.
그러나, 부압은 또한 분무 단독 동안 생성될 수 있거나, 상기 기재된 바와 같은 폐쇄 소자에 의해 생성된 부압은 분무를 수행하면서(즉, 단계 (c)) 적절하게 일정한 수준으로 유지될 수 있다.
상기 방법으로 하기도, 예를 들면, 기관지 또는 깊은 폐를 표적화하려는 경우, 압전 천공된 막-유형 분무기가 에어로졸을 생성시키기 위해 선택되는 것이 특히 바람직하다. 적합한 분무기의 예는 수동 막 분무기, 예를 들면, I-Neb™, U22™, U1™, Micro Air™, 초음파 분무기, 예를 들면, Multisonic™, 및/또는 활성 막 분무기, 예를 들면, HL100™, Respimate™, eFlow™ 기술 분무기, AeroNeb™, AeroNeb Pro™, AeronebGo™, 및 AeroDose™ 장치 패밀리 뿐만 아니라 프로토타입 Pfeifer, Chrysalis(Philip Morris) 또는 AerovectRxTM 장치를 포함한다. 하기도로 약물을 표적화하기 위한 특히 바람직한 분무기는 진동 천공된 막 분무기이거나 또는 소위 활성 막 분무기, 예를 들면, eFlow™ 분무기(독일 PARI로부터 구입 가능한 전자 진동 막 분무기)이다. 또는, 수동 막 분무기, 예를 들면, U22™ 또는 U1™(제조사: Omron) 또는 Telemaq.fr 기술 또는 Ing. Erich Pfeiffer GmbH 기술에 근거한 분무기가 사용될 수 있다.
상기도를 표적화하기 위한 바람직한 막 분무기는, eFlow™ 기술을 사용하여 개질된 임상용 막 분무기와 같은 천공된 진동 막 원리를 통해 에어로졸을 생성시키지만, 원하는 위치에서 또는 원하는 위치(예를 들면, 비부비동 또는 부비강)로 에어로졸 구름(cloud)을 수송하는 동안 생성된 에어로졸 구름이 맥동(즉, 압력 변동을 겪음)할 수 있도록 맥동 기류(pulsating air flow)를 방출시킬 수도 있는 분무기이다. 이러한 유형의 분무기는 코 내로 에어로졸 구름을 수송하는 유동에 대한 노즈 피스(nose piece)를 갖는다. 이러한 개질된 전기 분무기에 의해 전달된 에어로졸은 에어로졸이 연속(비-맥동) 모드로 전달되는 경우보다 훨씬 더 잘 비부비동 또는 부비동에 도달할 수 있다. 부수적으로 적용된 에어로졸이 이들 공동 내에 더 잘 분포되고 침착되도록, 맥동 압력파는 부비동의 보다 강력한 통풍을 달성한다.
더욱 특히, 환자의 상기도를 표적화하기 위해 바람직한 분무기는 약 5　ℓ/분 미만의 효과적인 유속으로 에어로졸을 생성시키고 약 10 내지 약 90Hz 범위의 주파수에서 에어로졸의 압력 맥동을 행하는 수단을 동시에 작동하기 위해 구성된 분무기이며, 여기서, 에어로졸이 환자의 기도로 도입되기 때문에 효과적인 유속은 에어로졸의 유속이다. 이러한 전기 분무 장치의 예는 WO 2009/027095에 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기도를 표적화하는 분무기는 에어로졸 구름이 원하는 위치에 도달한 다음, 예를 들면, 대안적인 모드로 에어로졸 구름의 맥동을 시작하는 경우 중단될 수 있는 수송 유동을 사용하는 분무기이다. 상세 사항은 WO　2010/097119　A1 및 WO　2011/134940　A1에 기재되어 있다.
폐 또는 비부비동 전달을 위해 구성될지라도, 분무기는 바람직한 분사율(output rate)로 단위 용량을 에어로졸화할 수 있도록 선택되거나 구성되어야 하는 것이 바람직하다. 본원에서 단위 용량은 유효량의 활성 화합물, 즉, Ig, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 포함하는 액체 수성 조성물의 용적으로서 정의되며, 단일 투여 동안 투여되도록 지정된다. 바람직하게는, 분무기는 적어도 0.1mL/min의 속도로 또는 조성물의 상대 밀도가 통상적으로 약 1일 것이라는 가정하에 적어도 100mg/min의 속도로 이러한 단위 용량을 전달할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 분무기는 각각 적어도 0.4mL/min 또는 400mg/min의 분사율을 발생시킬 수 있다. 추가의 양태에서, 분무기 또는 에어로졸 발생기의 액체 분사율은 적어도 0.50mL/min, 바람직하게는 적어도 0.55mL/min, 더욱 바람직하게는 적어도 0.60mL/min, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 0.65mL/min, 및 가장 바람직하게는 적어도 0.7mL/min이며, 이러한 장치들은 높은 분사량 또는 높은 분사율을 갖는 에어로졸 발생기로 불린다. 바람직하게는, 액체 분사율은 약 0.35 내지 약 1.0mL/min 또는 약 350 내지 약 1000mg/min의 범위이고; 바람직하게는, 액체 분사율은 약 0.5 내지 약 0.90mL/min 또는 약 500 내지 약 800mg/min의 범위이다. 액체 분사율은 시간 단위당 분무된 액체 조성물의 양을 의미한다. 액체는 활성 화합물, 약물, Ig, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합 및/또는 대용물, 예를 들면, 염화나트륨 0.9%를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 위해, 즉, 20 내지 200mg/mL 농도로 조성물 중에 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합으로부터 에어로졸의 생성을 위해, 분사율을 증가시키기 위해 분무기 내에 특정 막 유형들이 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들면, 분사율과 관련하여 유체와 접촉하기 위한 제1 측면(124) 및 대향하는 제2 측면(125)을 갖는 막(122)을 사용하는 것이 특히 유리한 것으로 밝혀졌으며, 상기 막은 제1 측면으로부터 제2 측면으로 연장(extension) 방향(E)으로 막을 관통하는 복수의 쓰루 홀(through hole)(126)들을 가져서, 상기 막이 제2 측면에서 에어로졸을 생성시키기 위해 진동하는 때에 상기 유체가 제1 측면으로부터 제2 측면으로의 쓰루 홀들을 통과하며, 각각의 쓰루 홀(126)은 이의 연장 방향(E)을 따라 최소 직경(DS), 최소 직경보다 더 크고 상기 최소 직경의 3배, 바람직하게는 2배에 가까운 직경으로 한정되는 더 큰 직경(DL)을 가지며, 각각의 쓰루 홀은 상기 쓰루 홀의 최소 직경을 포함하는 상기 연장 방향의 쓰루 홀의 연속 부분에 의해 한정되고 상기 쓰루 홀의 더 큰 직경에 의해 경계 지워지는 노즐 부분(132)을 가지며, 여기서, 상기 연장 방향의 상기 노즐 부분(132)들의 각각의 하나의 길이에 대한 상기 연장 방향의 각각의 쓰루 홀(126)의 총 길이의 비가 적어도 4임을 특징으로 한다. 이러한 막은 WO 2012/168181　A1에 기재되어 있으며 명세서에 포함된 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 나타내는 도 2에 나타낸다.
액체 조성물의 짧은 분무 시간을 달성하도록 분무기의 분사율이 선택되어야 한다. 명백하게는, 분무 시간은 에어로졸화될 조성물의 용적과 분사율에 좌우될 것이다. 바람직하게는, 분무기는, 20분 미만 내에, 유효 용량의 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 포함하는 액체 조성물의 용적을 에어로졸화할 수 있도록 선택되거나 구성되어야 한다. 더욱 바람직하게는, 단위 용량에 대한 분무 시간은 15분 미만이다. 추가의 양태에서, 분무기는 10분 미만, 및 더욱 바람직하게는 6분 미만 및 심지어 더욱 바람직하게는 3분 미만의 단위 용량당 분무 시간을 선택하거나 구성할 수 있다. 0.5 내지 5분 범위의 분무 시간이 현재 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (c)에서 분무되는 조성물의 용적은 짧은 분무 시간이 가능하도록 낮은 것이 바람직하다. 용량의 용적으로도 언급되는 용적, 또는 용량 단위 용적(dose unit volume), 또는 단위 용량 용적은, 단일 투여 또는 분무기 치료요법 세션을 위해 사용되는 것으로 의도되는 용적으로서 이해되어야 한다. 구체적으로, 용적은 0.3mL 내지 6.0mL, 바람직하게는 0.5mL 내지 4.0mL, 또는 더욱 바람직하게는 1.0mL 내지 약 3.0mL, 또는 심지어 더욱 바람직하게는 약 2mL의 범위일 수 있다. 잔류 용적이 바람직하거나 도움이되는 경우, 이러한 잔류 용적은 1.0mL 미만, 더욱 바람직하게는 0.5mL 미만, 및 가장 바람직하게는 0.3mL 미만이어야 한다. 따라서, 효율적으로 분무된 용적은 바람직하게는 0.2 내지 3.0mL 또는 0.5 내지 2.5mL의 범위, 또는 더욱 바람직하게는 0.75 내지 2.5mL 또는 1.0 내지 2.5mL의 범위이다.
바람직하게는, 분무기는 액체 조성물의 부하된 용량의 대부분의 분획이 에어로졸로서 전달되는 에어로졸을 생성하도록, 즉 높은 분사량을 갖도록 구성된다. 더욱 구체적으로, 분무기는 조성물 중의 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 용량을 적어도 50%로 함유하거나, 또는 다시 말해, 저장소 내에 충전된 액체 조성물의 적어도 50%를 방출시키는 에어로졸을 생성시키도록 구성한다. 특히 이들의 특이성으로 인해 용량이 높을 필요가 없는 모로클로날 항체와의 비교에 있어서, 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 이러한 높은 분사량으로 생성시킬 수 있는 분무기를 선택하는 것이 중요하다. 본 발명의 방법에 사용된 막 분무기가 특히 높은 분사량으로 조성물 중의 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 에어로졸을 생성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
또한, 분무기는 에어로졸 챔버 또는 혼합 챔버로도 언급될 수 있는 흡입 밸브 및 호기 밸브(exhalation valve)를 갖는 챔버를 포함할 수 있다. 막 분무기 저장소는 액체로 충전되어 있으며 막은 혼합 챔버 내로 에어로졸을 생성시킨다. 바람직하게는, 호기 밸브는 마우스 피스 가까이에 위치하며 흡입 밸브는 유입 대기 개구부들 가까이에 위치한다. 이것은, 이러한 단계 동안 생성되는 에어로졸이 환자가 흡입할 때까지 혼합 챔버 내에서 대부분 유지되기 때문에, 환자의 호기 단계 동안 에어로졸의 손실을 감소시킨다. 이러한 혼합 챔버를 갖는 막 분무기가 WO　2001/34232 및 WO　2010/066714에 기재되어 있다. 상이한 크기의 혼합 챔버들이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 적어도 45mL, 더욱 바람직하게는 적어도 50mL, 및 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 60mL의 용적을 갖는 대형 혼합 챔버를 사용하는 것이 바람직하다. 또는, 60 내지 150mL 범위의 용적을 갖는 대형 혼합 챔버가 사용될 수 있다. 이러한 대형 혼합 챔버를 갖는 막 분무기가 EP　1 927 373에 기재되어 있으며, 상기 특허문헌은 이의 전문이 인용에 의해 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 액체 수성 조성물은 하나 이상의 안정제를 함유한다. 액체 면역글로불린 제형을 제형화하는 경우 통상적으로 직면하는 이슈는, 적절한 첨가제로 충분히 안정화되지 않는 경우 면역글로불린이 응집되고 침전물을 형성하는 경향이 있다는 점이다. 몇가지 아미노산, 예를 들면, 프롤린, 글리신 및 히스티딘, 또는 사카라이드, 또는 당 알콜, 또는 단백질, 예를 들면, 알부민, 또는 이들의 조합이, 면역글로불린을 액체 제형으로 안정화시키고 액체 수성 조성물에서 사용될 수 있는 것으로 공지되어 있다.
Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 분무에 의한 폐 투여를 위해, 분무에 의해 고농도의 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 높은 용량의 다클론성 Ig을 필요로 하지만, 가능한 짧은 분무 시간을 유지하기 위해 분무될 용적을 가능한 훨씬 많이 최소로 하는 것이 중요하다. 후자는 환자의 수용상태와 관련하여 관계가 있다. 따라서, 높은 Ig 농도를 갖는 Ig 조성물이 본 발명의 방법에 바람직하다. 그러나, Ig 농도의 증가가 점도의 비-선형 증가를 초래하는 것으로 밝혀졌다.
액체 조성물의 역학 점도(dynamic viscosity)가 이러한 조성물의 분무에 의해 형성된 에어로졸의 액적 크기 분포 및 분무 효율에 영향을 미친다고 일반적으로 공지되어 있다. 막 분무를 사용하여 액체 조성물을 분무하기 위해, 본 발명의 방법에 사용된 액체 조성물이 20℃ +/- 0.1℃의 온도에서 약 0.8 내지 약 4.0mPaㆍs 범위의 역학 점도를 나타내는 것이 일반적으로 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 2.2.49에서 유럽 약전 버전(European Pharmacopoeia Version) 6.0에 따른 회플러(Hoppler)에 따른 낙하 볼 점도계(falling ball viscosimeter)("Kugelfallviskosimeter") 및 DIN 53015의 요구조건에 따라 측정하는 경우, 역학 점도는 20℃ +/- 0.1℃의 온도에서 약 1.0 내지 약 3.5mPaㆍs의 범위 내이다. 이로서, 한정된 치수 및 한정된 경사를 갖는 튜브 또는 모세관 내의 볼 또는 구의 롤링 시간(rolling time)을 측정한다. 롤링 시간을 근거로 하여, 튜브 또는 모세관 내의 액체의 점도를 측정할 수 있다. 측정은 전형적으로 20.0℃ +/- 0.1℃의 온도에서 이루어진다.
본 발명의 하나의 양태는 면역글로불린 용액의 에어로졸을 생성시키기 위한 방법으로, 여기서, 상기 면역글로불린 용액은 1 내지 17mPaㆍs, 1 내지 16mPaㆍs, 1 내지 15mPaㆍs, 1 내지 14mPaㆍs, 1 내지 13mPaㆍs, 1 내지 12mPaㆍs, 1 내지 11mPaㆍs, 1 내지 10mPaㆍs, 2 내지 17mPaㆍs, 2 내지 16mPaㆍs, 2 내지 15mPaㆍs, 2 내지 14mPaㆍs, 2 내지 13mPaㆍs, 2 내지 12mPaㆍs, 2 내지 11mPaㆍs, 2 내지 10mPaㆍs, 3 내지 17mPaㆍs, 3 내지 16mPaㆍs, 3 내지 15mPaㆍs, 3 내지 14mPaㆍs, 3 내지 13mPaㆍs, 3 내지 12mPaㆍs, 3 내지 11mPaㆍs, 3 내지 10mPaㆍs의 점도를 가지며; 바람직하게는, 면역글로불린 용액은 1 내지 9mPaㆍs, 1 내지 8mPaㆍs, 1 내지 7mPaㆍs, 1 내지 6mPaㆍs, 2 내지 9mPaㆍs, 2 내지 8mPaㆍs, 2 내지 7mPaㆍs, 2 내지 6mPaㆍs, 3 내지 9mPaㆍs, 3 내지 8mPaㆍs, 3 내지 7mPaㆍs, 또는 3 내지 6mPaㆍs의 점도를 가지며; 더욱 바람직하게는, 면역글로불린 용액은 1 내지 5mPaㆍs, 1 내지 4mPaㆍs, 2 내지 5mPaㆍs, 2 내지 4mPaㆍs, 3 내지 5mPaㆍs, 또는 3 내지 4mPaㆍs의 점도를 갖는다.
고점도에 의해 야기되는 분무 이슈를 피하기 위해, WO2011/095543에 개시된 바와 같이, Ig의 농도가 높은 경우일지라도 비교적 저점도의 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 제제가 달성될 수 있기 때문에, 프롤린이 바람직하게는 안정제로서 사용된다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 이들 조성물이 분무기를 사용하여 에어로졸을 생성시키는 방법에 사용하기 위해 의도되는 경우, 프롤린을 다클론성 Ig 조성물에 첨가하는 것이 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 한편으로, 프롤린은 액체 조성물 중의 Ig의 원하는 안정성을 제공하고, 다른 한편으로, 조성물의 점도를 감소시키며, 따라서 높은 Ig 농도를 갖는 작은 액체 용적을 분무 가능하도록 하고, 이는 분무에 의한 신속하고 효율적인 치료를 초래한다.
안정제로서 프롤린을 사용하는 경우, L-프롤린을 사용하는 것이 특히 바람직하다. L-프롤린은 통상적으로 인간 신체에 존재하고, 매우 유리한 독성 프로파일을 갖는다. L-프롤린의 안정성은 반복-투여 독성 연구, 생식 독성 연구, 돌연변이 연구 및 안전성 약리학 연구에서 조사되었으며, 부작용을 나타나지 않았다.
일반적으로, 조성물에 첨가되는 프롤린, 더욱 바람직하게는 L-프롤린의 양은 면역글로불린 조성물 중에 프롤린의 농도가 약 10 내지 약 1000mmol/L, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 약 500mmol/L의 범위인 양이고 가장 바람직하게는 약 250mmol/L이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 다클론성 IgG 및 안정화 양의 프롤린을 포함하는 액체 수성 조성물의 점도는 1mPaㆍs 내지 17mPaㆍs(20.0℃ +/- 0.1℃의 온도에서)의 범위이다. 100mg/mL 다클론성 IgG 및 250mM 프롤린을 포함하는 조성물의 점도는 20.0℃ +/- 0.1℃의 온도에서 약 3mPaㆍs이다.
프롤린을 함유하는 본 발명에 따라 사용되는 IgG 조성물은 4.2 내지 5.4, 바람직하게는 4.6 내지 5.0, 가장 바람직하게는 약 4.8의 pH를 가지며, 이는 제제의 높은 안정성에 추가로 기여한다.
프롤린의 사용은, 단일 제제의 사용에 의해 제형의 안정성이 증가하고 조성물의 점도가 감소하는 조성물의 제조를 가능케 한다. 이것은 막 분무기를 사용하여 에어로졸을 생성시키는 방법들에서 특히 유용한 조성물을 초래한다.
본 발명의 방법에 사용되는 액체 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며 상기 약제학적으로 허용되는 부형제는 조성물의 특성들 및/또는 에어로졸의 특성들을 최적화시킨다. 이러한 부형제의 예는 pH 조정용 또는 완충용 부형제, 삼투압 조정용 부형제, 산화방지제, 계면활성제, 서방출 또는 연장된 국소 체류용 부형제, 맛-차단제, 감미제, 및 풍미제이다. 이들 부형제는 최적의 pH, 삼투압, 점도, 표면 장력 및 맛을 얻기 위해 사용되고, 제형 안정성, 에어로졸화, 내약성 및/또는 흡입시 제형의 효능을 지속시킨다.
본 발명에 사용되는 면역글로불린 용액은 약 60 내지 75mN/m, 바람직하게는 약 64 내지 71mN/m의 표면 장력을 갖는다.
예를 들면, 계면활성제를 조성물에 첨가할 수 있다. 이러한 첨가는 조성물 내에서(즉, 저장 동안 그리고 저장소 내에서)의 그리고 분무 동안(즉, 분무기의 막을 통과하는 동안 그리고 그 후) 면역글로불린의 응집율을 제어하는 것을 도울 수 있어서, 에어로졸 중의 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 활성도에 영향을 미친다. 유용한 계면활성제의 예는 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 80이다.
일반적으로, Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합의 활성도가, 분무기 저장소 내에 충전된 조성물 중의 Ig의 활성도의 적어도 80%인 에어로졸을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 방법은 Ig의 상당한 응집을 초래하지도 않고, Ig의 상당한 변성을 초래하지도 않는다. Ig의 활성도는 표준 면역학적 방법들(예를 들면, ELISA, 유동 세포측정법 및 세포 기반 검정)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 에어로졸은, 다클론성 Ig, 예를 들면, IgG, IgA, IgM 또는 이들의 조합이 나타내는 몇몇 병태들의 치료요법 및 예방에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법에 의해 생성된 에어로졸은 대체 치료요법이 필요한 환자들에서, 즉, 폐 질환, 부비동염을 갖는 환자들, 이들이 충분한 항체를 갖지 않는, 또는 다시 말해, 면역결핍 증후군을 갖기 때문에 재발성 감염 위험이 있는 환자들에서 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 에어로졸은 원발성 면역결핍증(PID), 속발성 면역결핍증(SID), 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병 또는 다발성 골수종으로 인한 저감마글로불린혈증 및 재발성 세균 감염, 동종이형 혈액 줄기세포 이식 후 저감마글로불린혈증(HSCT), 악성종양 치료를 위한 화학치료요법으로 인한 저감마글로불린혈증, 악성종양 또는 자가면역 질환 치료를 위한 생물학적 제제, 예를 들면, 리툭시맵을 사용한 치료로 인한 저감마글로불린혈증, 자가면역 질환 또는 고형 장기 이식 치료를 위한 면역억제제에 의한 기도 감염에 대한 민감성을 갖는 환자들, 및 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS, HIV)을 갖는 환자들의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 에어로졸은 만성 기도 감염을 갖는 병태들, 예를 들면, 낭포성 섬유증 및 원발성 섬모 운동이상증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 만성 세균성 부비동염, 기도의 만성 염증을 갖는 병태들, 예를 들면, 폐쇄성 세기관지염, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴, 비-낭포성 섬유증 기관지확장증, 만성 세균성 기관지염, 간질성 폐 질환, 기관지 천식, 또는 통상성 간질성 폐렴에서, 또는 알레르기성 병태, 예를 들면, 외인성 알레르기성 폐포염, 알레르기성 천식, 또는 만성 부비동염에서 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 생성된 에어로졸은 조정이 필요한 비정상적인 면역계를 갖는 환자들의 면역조정을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 에어로졸은 출혈 위험이 높거나 수술 전에 혈소판 수의 보정이 필요한 특발성 (또는 원발성) 혈소판감소성 자반병(ITP)을 갖는 환자들, 길랑-바레 증후군, 가와사키병 또는 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병(CIDP)을 가진 환자들에 사용될 수 있다.
하기 표에 기재된 시판중인 면역글로불린 제형은 다클론성 면역글로불린 G를 포함하는 액체 수성 조성물로서 본 발명의 방법에 사용될 수 있다:
Figure 112016107747298-pct00001
실시예
하기 비제한적인 실시예들은 본 발명을 예시한다.
실시예 1: IgG 의 분무
주사용수 내에 100mg/mL 정상적인 인간 면역글로불린 및 0.25mol/L 프롤린을 함유하는 조성물의 분무를 평가하였다. 상기 면역글로불린 분획은 적어도 98%의 IgG를 함유했고 상기 조성물은 IgA를 최대 25㎍/mL 함유했고; 인간 혈액 공여자들의 혈액으로부터 제조하였다. 상기 조성물은 pH가 4.82이고, 밀도가 1.0336g/mL이고, 20℃에서의 점도가 3.33mPaㆍs이고, 20℃에서의 표면 장력이 71.1mN/m이고, 삼투압이 312mOsm/kg였다.
대형 혼합 챔버(약 90mL 용적), 100 내지 400mbar 범위의 액체 저장소에서의 초기 부압, 및 상이한 홀 크기 및 홀 기하학적 형태를 갖는 다양한 막 유형들을 갖는 전자 진동 막 분무기(eFlow™ 기술(제조사: 독일의 PARI Pharma GmbH)을 사용한 개질된 막 분무기)를 사용하여 분무를 수행하였다. 상이한 막 유형들은 상이한 액적 또는 입자 크기(질량 중간 직경(MMD) 및 기하학적 표준 편차(GSD)를 특징으로 함) 및/또는 상이한 분사율(예를 들면, 약물 전달율(DDR) 또는 총 분사율(TOR 또는 소위 분사량))을 생성하도록 설계된다. 에어로졸 발생기 장치에 위치하는 막의 정상적인 분사율은 0.55mL/min 미만으로 정의되고 높은 분사율은 적어도 0.55mL/min의 값으로 정의된다. 또는, 분사율은 mg/min으로 특징(또는 정의)될 수 있으며; 정상적인 분사율은, 예를 들면, 550mg/min 미만이고 높은 분사율은, 예를 들면, 적어도 550mg/min이다. (또는 높은 분사율에 대한 제한은 적어도 0.50mL/min, 바람직하게는 적어도 0.55mL/min, 더욱 바람직하게는 적어도 0.60mL/min 또는 가장 바람직하게는 적어도 0.65mL/min으로 정의될 수 있으며, 따라서 분사율은 mg/min 이다). 상기 한정은, 액체 특성들, 예를 들면, 밀도, 점도, 표면 장력 등에 따라 좌우되며 상기 한정은 에어로졸 발생기 장치의 품질 보증 목적을 위해 규정될 수 있으며, 예를 들면, Ig, 예를 들면, IgG, IgA 및/또는 IgM 용액 대신에 염화나트륨 0.9%와 같은 대용물 용액으로 규정될 수 있다. 이후에, 에어로졸 발생기 장치에 설치된 막으로부터 생성된 대용물 용액(예를 들면, 염화나트륨 0.9%)의 정상적인 분사율은 적어도 0.55mL/min, 더욱 바람직하게는 적어도 0.60mL/min 및 더욱 바람직하게는 적어도 0.65mL/min으로 규정된다. 또는, 높은 분사율은 적어도 550mg/min, 바람직하게는 적어도 600mg/min 및 더욱 바람직하게는 적어도 650mg/min이다. IgG 조성물을 분무하기 위해 사용되었던 막 유형들은 표 1에서 분별되고 특성확인된다.
[표 1] IgG 조성물을 분무하는데 사용되는 막 유형들(eFlow™ 기술을 사용)
Figure 112016107747298-pct00002
레이저 회절 장치(Malvern MasterSizer X™)는 생성된 에어로졸의 액적 크기(질량 중간 직경(MMD) 측면에서 표현됨) 및 액적 크기 분포(기하학적 표준 편차(GSD) 측면에서 표현됨)를 측정하기 위해 사용되었다. 2mL 용적의 IgG 조성물을 분무기 저장소에 충전시키고 분무기가 작동할 때 생성되는 에어로졸은 에어로졸 구름을 20L/min의 흡입 유동을 사용하는 MasterSizer XTM 장치의 레이저 빔 속으로 향하게 함으로써 분석되었다. 측정 동안의 온도와 상대 습도는 각각 23℃(± 2℃) 및 50%(± 5%)였다. 동일한 실험에서, 총 분사율(TOR)을 평가하였다. 측정은 각각의 막 유형에 대해 2회(n = 2) 수행하였다. 결과(평균값과 표준 편차(SD))를 표 2에 나타낸다.
[표 2] 레이저 회절 실험 및 총 분사율의 결과
Figure 112016107747298-pct00003
실시예 2: IgG 의 분무의 재현성
실시예 1에 기재된 레이저 회절 실험을 eFlow™ 기술을 사용하고 대형 혼합 챔버(약 90mL), 100 내지 400mbar 범위의 액체 저장소에서 초기 부압을 가지며 유형 2 및 유형 4의 막들(상기 구체화된 바와 같음)을 사용하는 세가지 개질된 막 분무기를 사용하여 반복하였다. MMD, GSD 및 TOR을 측정하는 것에 추가하여, 5㎛ 미만, 3.3㎛ 미만 및 2㎛ 미만의 액적의 백분율(즉, 상이한 호흡 가능 분율(RF)의 백분율)을 측정하였다. 5㎛ 미만의 액적의 백분율은 성인의 하기도 내로 흡입 가능한 액적의 백분율의 우수한 표시를 제공하는 반면, 3.3㎛ 미만의 액적의 분율은 어린이의 하기도 내로 흡입 가능한 액적의 백분율의 추정치를 제공한다. 2㎛ 미만의 액적의 분율은 말단 세기관지 및 폐포에 도달할 수 있는 액적의 백분율을 나타낸다. 상이한 입자 크기를 갖는 에어로졸의 폐 침착은 성인, 어린이, 유아 또는 아기와 같은 상이한 연령 그룹에 대해 ICRP 모델(참조: The Respiratory Deposition model Proposed by the ICRP Task Group Radiat Prot Dosimetry (1991) 38 (1-3): 159-165, A.C. James et al.)과 같은 수학적 모델에 의해 계산될 수 있다.
실험은 시험된 각각의 분무기에 대해 2회(n = 2) 수행하였다. 측정 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3] 상이한 분무기를 사용한 레이저 회절 실험 및 총 분사율의 결과
Figure 112016107747298-pct00004
실시예 3: 다양한 면역글로불린 제형의 분무
다양한 혈장-유래 면역글로불린 이소형 및 중합체(IgA 및 IgM) 뿐만 아니라 IgG 제형을 분무하고, 수득한 에어로졸은 동일한 분무기와 막을 사용하여 실시예1에 기재된 것과 유사한 방식으로 특성확인하였다.
더욱 구체적으로, 하기 제형의 분무에 의해 수득한 에어로졸의 특성확인은 레이저 회절에 의해 비교하였다.
Figure 112020034564930-pct00028
입자 크기 분포는, 2개의 상이한 막 유형들(실시예 1에 구체화된 바와 같음)을 사용하여 각각을 폐쇄하면서 대형 혼합 챔버 및 부압을 유도하는 저장소를 갖춘 임상용 eFlowTM 분무기 시스템을 사용하여 분무시 제형들 각각을 레이저 회절 측정(Malvern MasterSizer X™)함에 의해 측정하였다. 충전 용적은 각각의 경우 2mL였다. 측정된 파라미터들은 MMD, GSD, 총 분사율(TOR) 및 호흡 가능 분율이었다. TOR은 분무 전 및 완전한 분무 후 충전된 분무기를 칭량함에 의해 측정되었고 중량 차를 분무 시간으로 나눔으로써 계산하였다.
모든 측정은 3회 수행하였다. 결과(3회 측정의 평균값과 표준 편차(SD))를 표 4에 나타낸다.
[표 4] 다양한 면역글로불린 제형에 대한 레이저 회절 실험 및 총 분사율의 결과
Figure 112016107747298-pct00006
이들 결과는 모든 시험된 제형이 우수한 성능으로 분무될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 호흡 모의 실험
실시예 1 및 실시예 3에 기재된 조성물의 분무는 또한 eFlow™ 기술을 사용하고 유형 2 및 유형 4의 막들(상기 구체화된 바와 같음)을 사용하는 대형 혼합 챔버를 갖는 세가지 개질된 막 분무기를 사용한 호흡 모의 실험에서 평가하였다. 분무기 각각은 2회(n = 2) 시험하였다.
호흡 모의 실험은 유럽 약전 2.9.44(즉, 500mL의 호흡량을 갖는 사인곡선 유동, 15회 호흡/분 및 흡입:호기(I:E) 비 50:50)에 따른 성인 호흡 패턴을 사용하여 수행하였다. 각각의 시험에서, 분무기를 부비동 펌프(PARI Compass IITM 호흡 시뮬레이터)에 연결시켰다. 흡기 필터(폴리프로필렌; 3M)를 마우스 피스를 포함하는 분무기와 펌프 사이에 설치하고 고무 커넥터들로 고정시켰다. 분무기에 실시예 1에 기재된 2mL의 조성물을 충전시키고 분무를 개시하고 에어로졸 생성을 더 이상 볼 수 없을 때까지 계속하였다. 약물 함유 에어로졸 액적을 흡입 필터 상에 수집하였다.
전달된 용량, 즉, 분무 동안 필터 상에 수집된 면역글로불린의 양을 측정하기 위해, 흡입 필터를 핀셋으로 필터 케이싱으로부터 제거하여 스크류 캡을 갖는 50mL 플라스틱 튜브 내에 넣었다. 이후에, 상기 필터 케이싱을 정제수 중에 0.9% 식염수 및 0.5% SDS(나트륨 도데실 설페이트, 98.5%)를 함유하는 40mL 완충액으로 세정하고 이어서 세정 유체를 필터를 사용하여 튜브에 첨가하였다. 상기 필터를 회전기 상에서 진탕하면서 1시간 동안 추출하였다.
추가로, 분무기를 40mL의 상기 기재된 완충액으로 수회 세정하고 상기 세정액을 저장소에 잔류하는 약물(잔류물)의 양을 측정하기 위해 비이커에서 수집하였다.
필터 추출과 분무기의 세정으로부터 생성된 용액을 UV 분광광도법을 사용하여 분석하였다. 상기 용액 각각의 샘플을 완충액으로 희석시켜 대략 0.5mg/mL 면역글로불린의 농도를 달성하였다. 대략 0.8mL의 희석된 샘플 용액을 일회용 마이크로 큐벳에 충전시키고 280nm에서 완충액에 대해 측정하였다. 용액 중의 Ig 함량은 ε(0.1%) = 1.38mL/(mgㆍcm)의 질량 흡수 계수를 사용하는 비어-램버트 법칙(Beer-Lambert law)(A　=　εㆍcㆍL)에 따라 계산하였다. 더욱 구체적으로, Ig 함량을 계산하기 위한 식은 다음과 같다:
c (mg/mL) = 희석 배율(dilution factor) * A280 / ε * l
호흡 가능 용량은 실시예 2에서 레이저 회절에 의해 측정된 평균 호흡 가능 분율 및 전달된 용량을 근거로 하여 계산하였다.
호흡 모의 실험 동안, 분무 시간을 또한 기록하였다. 호흡 모의 실험의 결과는 표 5a 및 5b에 요약되어 있다. 시험된 각각의 파라미터에 대해, 막 유형에 따른 6가지 실험들(즉, 3개의 상이한 분무기로 2회 시험들)의 결과의 평균을 표준 편차(SD)와 함께 나타낸다.
[표 5a] 호흡 모의 실험에서 IgG(10%)에 대해 얻은 결과
Figure 112020034564930-pct00029
[표 5b] 호흡 모의 실험에서 상이한 제형들에 대해 얻은 결과
Figure 112016107747298-pct00008
실시예 5: 분무 후 면역글로불린의 생화학적 성질들(분자 크기 특성확인)
실시예 1 및 실시예 3에서 수득한 분무된 조성물은 면역글로불린의 구조적 무결성 및 다량체화(multimerization)에 대해 특성확인하였다. 이러한 목적을 위해, (i) SDS-PAGE, (ii) 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 (iii) 동적 광산란(DLS) 분석을 분무된 조성물의 샘플들에 대해 수행하였다.
분무된 샘플들은 다음과 같은 분무 공정 후에 직접 수집하였다: 탄성중합체성 커넥터들을 갖는 분무기 혼합 챔버의 배출구에 팔콘 튜브를 직접 연결하였다. 분무기, 커넥터 및 팔콘 튜브를 실험 전에 오토클레이빙하고 층류 기류 조건하에 분무를 수행하였다. 분무기의 저장소를 4mL의 샘플 제형으로 충전시켰다. 샘플링 튜브를 스크류 캡으로 닫고 무결성 시험 전에 -18℃에서 동결시켰다.
전체적으로, 36개의 샘플들을 SDS-PAGE 및 SEC 분석에 도입하였다:
ㆍ 프롤린으로 제형화된 IgG에 대해 8개(도 3): 2개의 비-분무된 대조군 샘플들(a), 막 유형 2로부터 얻은 3개의 분무된 샘플들(b) 및 막 유형 4로부터 얻은 3개의 분무된 샘플들(c). 샘플들을 각각 이중으로(비-분무된 샘플들) 그리고 삼중으로(분무된 샘플들) 분석하였다.
ㆍ PBS(d, f, g) 및 글리신(e, h, i)에서 IgG에 대해 14개(도 4): 2개의 비-분무된 대조군(d, e), 막 유형 2로 얻은 6개의 분무된 샘플들(f, h) 및 막 유형 4로 얻은 6개의 분무된 샘플들(g, i). 샘플들을 삼중으로(분무된 샘플들) 분석하였다.
ㆍ IgA(j, l, m) 및 IgAM(k, n, o)에 대해 14개(도 4): 2개의 비-분무된 대조군(j, k), 막 유형 2로 얻은 6개의 분무된 샘플들(l, n) 및 막 유형 4로 얻은 6개의 분무된 샘플들(m, o). 샘플들을 삼중으로(분무된 샘플들) 분석하였다.
ㆍ IgA(p,q), IgAM(r, s), SIgAM(t, u) 및 IgG(v, w, x, y)에 대해 10개(도 4): 막 유형 4로 얻은 5개의 비-분무된 대조군(p, r, t, v, x) 및 5개의 분무된 샘플들(q, s, u, w, y).
모든 면역글로불린 용액은 인간 혈액 공여자들의 혈장으로부터 제조하였다. IgG 용액은 단백질 농도가 100mg/mL이며 적어도 98%의 IgG를 함유하였다. 모든 세가지 IgG 제형(250mM 프롤린; 250mM 글리신; PBS)은 pH가 4.8이었다. IgA 용액 및 IgAM(중합체성 IgA + IgM) 용액은 단백질 농도가 50mg/mL이었고 PBS 중에서 pH 7.4로 제형화되었다. IgA 용액의 상대적인 IgM 함량은 2%이며, IgAM 용액의 상대적인 IgM 함량은 35%였다. IgA 및 IgAM 용액은 또한 프롤린(125mM) 중에서 제형화되었다. 인간 재조합 분비 성분은 PBS 중에서 IgA 및 IgM에 회합된 다음, 프롤린(125mM) 중에서 제형화되었다. 프롤린 제형화된 IgA 용액 중의 IgM 함량은 다음과 같았다: IgA(<2%), IgAM(33%), SIgAM(32%).
SDS-PAGE는 제조업체의 프로토콜에 따라 Mini-Cell 시스템(Life Technologies)을 사용하여 수행하였다. 간단히, 샘플들을 각각 환원 또는 비-환원 조건하에 샘플 완충액 중에서 변성시켰고, NuPAGETM MES 전기영동 완충액(Life Technologies)을 사용하여 사전-캐스트 구배 겔, NuPAGE NovexTM Bis-Tris 4 내지 12% 1.0mM 15 웰 상에서 전기영동 분리시켰다. 전기영동 후에, 겔 내의 단백질을 고정시키고 제조업체의 프로토콜에 따라 Coomassie G-250(SimplyBlue SafestainTM; Life Technologies)으로 염색시켰다. 단백질 염색 패턴은 ImageQuantTM LAS 4000 시스템(GE Healthcare Lifesciences)을 사용하여 디지털로 기록하였다.
SDS-PAGE 분석으로 얻은 단백질 밴딩 패턴을 도 3(여기서, 표지들 a, b 및 c는 상기 언급된 샘플들의 그룹들을 언급한다)과 도 4(여기서, 표지들 d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, x 및 y는 상기 언급된 샘플들의 그룹들을 언급한다)에 나타낸다. 도 3A, 4A, 4C(좌측 패널)는 환원 조건들하에 얻은 결과를 나타내고, 도 3B, 4B, 4C(우측 패널)는 비-환원 조건들하에 얻은 결과를 나타낸다.
SEC 분석을 위해, 샘플들을 TSK 겔 G3000SWxl 7.8mM ID × 30cm 컬럼(Tosoh Bioscience) 상에 0.7mL/min의 유속으로 크기 배제 크로마토그래피를 위해 Agilent Technologies 1260 InfinityTM HPLC 시스템 내에 200㎍/2㎕(IgG) 또는 100㎍/2 ㎕(IgA, IgAM)로 주입하였다. 생성된 크로마토그램으로부터, (i) 면역글로불린 중합체 및 응집물, (ii) 단량체 및 이량체, 및 (iii) 단편 각각의 상대적 함량을 평가하였다. 결과를 표 6 및 7에 나타낸다.
DLS 분석을 위해, 샘플들을 후방산란 모드로 측정 위치, 검출기 감쇠, 실행 기간, 실행 횟수 및 측정 횟수에 대한 동일한 고정 장치 설정을 가지고 Malvern Zetasizer NanoTM을 사용하여 측정하였고 측정 결과는 독점 Zetasizer 소프트웨어를 사용하여 샘플당 평균이었다. 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 6] 분무된 IgG의 SEC 분석
Figure 112020034564930-pct00030
[표 7] 분무된 IgA 및 IgAM의 SEC 분석
Figure 112016107747298-pct00010
[표 8] 분무된 IgA/M의 DLS 분석
Figure 112016107747298-pct00011
비-분무된 면역글로불린 샘플과 각각의 분무된 면역글로불린 샘플을 비교하여, SDS-PAGE 분석에 의해 얻은 단백질 밴딩 패턴은 환원 조건과 비-환원 조건 둘 다에서 동일한 면역글로불린 제형의 모든 분석된 샘플에 대해 동일하였으며(도 3 및 도 4), 이는 분무된 샘플들 중의 면역글로불린의 구조적 무결성이 보존되었음을 시사한다.
이러한 발견은 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하는 분자 크기 분석에 의해 강력하게 지지된다. 단백질 크기 카테고리(중합체 & 응집물, 단량체 & 이량체, 및 단편)의 상대적인 함량을 모든 분석된 샘플들에 대해 비교하였다(표 6, 표 7). 특히, IgG의 프롤린 또는 글리신 제형으로 관찰된 ≤1%의 응집물 함량은 에어로졸화된 고도로 농축된 IgG에 대해 매우 낮으며 심지어 정맥내 투여된 IgG에 대한 요구조건을 충족시킨다. 또한, 산성화된 PBS 중에서 제형화된 10%(w/w) IgG(~3%의 응집물 함량), PBS 중의 5%(w/w) IgA(~17% Ig 중합체 & 응집물), 프롤린 중의 5%(w/w) IgA(~21% Ig 중합체 & 응집물), PBS 중의 5%(w/w) IgAM(~55% Ig 중합체 & 응집물), 프롤린 중의 5%(w/w) IgAM(~54% Ig 중합체 & 응집물) 및 프롤린 중의 5%(w/w) SIgAM(~56% Ig 중합체 & 응집물)으로서 증가된 함량의 고분자량 단백질 종들을 갖는 면역글로불린 제제도 분무 공정에 의해 현저하게 변경되지 않았다.
SEC 분석이 Ig 중합체와 응집물 사이에서 구별되지 않았기 때문에, 분무 전과 후에 중합체-풍부 IgAM 샘플들을 큰 입자들에 대해 증가된 감도를 갖는 방법인 동적 광산란(DLS)으로 추가로 분석하였다. 단백질 응집물의 형성으로 인한 Ig 단백질 입자 크기 분포의 변경은 DLS 분석에 의해 밝혀질 것이다. 그러나, Z-평균, 다분산도 및 입자 계수율에 대한 DLS 결과는 분무가 입자 크기 분포에 변화를 야기하지 않음을 나타낸다(표 8).
요약하면, 상기 생화학적 분석은 비-분무된 샘플과 분무된 샘플 간에 거의 차이를 나타내지 않는다.
실시예 6: 분무 후 면역글로불린의 활성도
면역글로불린은 이들의 Fab 단편(항원 결합 단편) 및 Fc 단편(결정화 가능 단편)에 직접 의존하는 고유 기능을 나타낸다. Fab 부분이 항원 인식에 관련되지만, Fc 부분은 특정화된 수용체에 결합될 수 있고 하류 분자 경로를 활성화시킬 수 있다. 중요하게는, 보체를 활성화시킬 수도 있다.
6a. 분무 후 면역글로불린의 Fc 활성도
실시예 1 및 실시예 3에 기재된 조성물은, eFlow™ 기술을 사용하고 유형 2 및 유형 4의 막들(상기 특정된 바와 같음)을 사용하는 대형 혼합 챔버를 갖는 개질된 막 분무기로 분무시켰고, 생성된 에어로졸을 수집하였다. 수집된 용액을 사용하여 분무 후 면역글로불린의 활성도를 측정하였고, 분무 공정이 면역글로불린의 활성도에 미치는 영향을 평가하기 위해 분무 전의 조성물 중의 면역글로불린의 활성도와 비교하였다.
활성도는 항원 인식 능력 및 분무된 면역글로불린의 Fc 기능을 시험함에 의해 먼저 측정하였다. 모든 인간 Ig 제제에서, 이종간반응성 항체가 존재한다. 이종항원(래빗 적혈구)을 이러한 조성물에 첨가하여 면역 복합체 형성을 초래하였다. 생성된 면역 복합체를 인간 다형핵 호중구(PMN)에 첨가한 다음, 이들의 FcγRII 및 FcγRIIIγ 수용체 상에 IgG의 Fc 단편, 또는 CD89(IgA 수용체) 상에 IgA의 Fc 단편의 결합 및 인식에 의해 활성화시킨다. 이후에, 유리 산소 라디칼이 생성되고(호흡 폭발(burst)), 이는 화학발광에 의해 검출된다. 세포 활성도는 면역글로불린의 Fc 부분의 무결성 및 적혈구에 결합하는 양에 좌우된다. 면역글로불린의 Fc 부분의 성질에만 의존하는 데이터를 얻기 위해, 래빗 적혈구에 결합하는 항체의 양을 FACS에 의해 측정하고 화학발광 및 결합 데이터를 계산한다. Fc 활성도 ≥50%를 갖는 면역글로불린은 정상적인 Fc 기능을 나타낸다. 결과를 표 9a 및 9b에 나타낸다. 표 9b에서, Fc 활성도는 분무전 활성에 대한 백분율로서 나타내고, 다음과 같이 계산한다:
Fc 활성도(샘플) = 분무전 반 최대(half maximum) 화학발광에서 결합된 Ig / 분무후 반 최대 화학발광에서 결합된 Ig * 100%
모든 분무전 면역글로불린은 Fc 활성도 ≥50%를 갖는다.
[표 9a] 호흡 폭발 실험에서 얻은 평균 데이터(제형 6)
Figure 112016107747298-pct00012
[표 9b] 호흡 폭발 실험에서 상이한 제형들에 대해 얻은 평균 데이터
Figure 112020034564930-pct00031
정상적인 IgG는 호중구 상에서 97%의 Fc 활성도를 나타낸다. 어느 분무 막 유형이 사용되든, 분무된 IgG는 IgG 대조군(Fc 활성도 > 90%)에 매우 가까운 Fc 활성도를 나타냈다. 따라서, 분무된 IgG는 이종항원을 인식하고 PMN 및 비-분무되는 IgG에 결합하여 활성화시킬 수 있었다.
분무 전과 후의 상이한 프롤린 제형(IgG, IgA, IgAM 및 SIgAM)의 Fc 활성도 비교는 분무 공정 동안 기능의 손실을 나타내지 않는다(표 9a 및 9b).
제2 검정에서, Fc 기능은 보체 활성화를 측정함에 의해 평가한다. 분무되는 IgG 및 대조군 IgG는 폴리스티렌 미소구체에 흡착되어, 면역 복합체의 모델을 형성한다. 이후에, 이들 코팅된 미소구체를 보체 공급원으로서의 인간 혈청과 항온처리하였다. 생성된 보체 활성화는 FACS에 의해 미소구체로 활성화된 C3 단편의 침착을 측정함에 의해 정량화한다. 이들 데이터를 미소구체에 결합된 실제량의 IgG에 대한 데이터와 비교함에 의해, IgG의 Fc-부분의 무결성을 평가한다.
따라서, IgG의 분무가 보체를 활성화시키는 IgG 능력에 영향을 미치지 않음이 밝혀졌다.
6b. 분무 후 면역글로불린에 의한 항원 인식
분무 후 면역글로불린의 생물학적 성질들에 대한 추가의 특성확인은 EBV, CMV, FSME, HB, HAV, HSV, VZV, 볼거리, 풍진 및 홍역과 같은 항원 인식에 대한 ELISA, 및 보체 결합 반응 및 수용체 결합 시험들에 의한 분석을 포함한다. 특히, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 폐렴구균 폴리사카라이드(PCP) 항원 인식을 모든 제형(5 내지 9)에 대해 평가한다. ELISA는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 결과는 표 10a 및 10b에 나타낸다. 항-RSV 및 항-PCP 항원 항체들은 다클론성 면역글로불린의 각각의 제형에서 검출된다. 중요하게는, 상이한 제형들에 의한 RSV 및 PCP 항원 인식은 분무에 의해 영향을 받지 않는다.
[표 10a] 분무 전 및 후의 면역글로불에 의한 RSV 항원 인식
Figure 112016107747298-pct00014
[표 10b] 분무 전 및 후의 면역글로불에 의한 PCP 항원 인식
Figure 112016107747298-pct00015
항원 인식은 세균에 대해 직접 시험하였다. 5×107 CFU/mL의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae ) A66.1 균주를 4℃에서 밤새 카보네이트 완충액 중에서 폴리소르브 플레이트들(NUNC) 상에 코팅하였다. PBS-트윈(0.05%)을 사용하여 세척한 후에, 플레이트들을 실온에서 1.5시간 동안 2.5% FCS(PBS 중에서)로 차단하였다. PBS-트윈(0.05%)을 사용하여 세척한 후에, 제형을 333㎍/mL(차단 완충액 중에서 희석시킴)에서 첨가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈(0.05%)을 사용하여 세척한 후에, 이차 항체(염소 항 인간 IgG/A/M-HRP (Novex); 1mg/mL, 차단 완충액 중에서 1:2,000)를 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈(0.05%)을 사용하여 세척한 후에, TMB 기질을 웰에 첨가하고 촉매작용은 HCL을 첨가하여 중지시켰다. 이후에, 플레이트들을 플레이트 판독기에서 판독하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
항-에스. 뉴모니애 항체를 모든 제형(5 내지 9)에서 검출하였다. IgAM 및 SIgAM은 더 높은 O.D.에 의해 도시된 바와 같이, 항-에스. 뉴모니애 항체의 더 우수한 역가를 나타낸다. 중요하게는, 분무되는 제형과 비-분무되는 대조군과의 비교는 분무된 제형에 의한 세균의 인식에서의 차이를 나타내지 않는다. 따라서, 분무는 다클론성 면역글로불린에 의한 세균성 항원 인식에 영향을 미치지 않았다.
6c. 시험관내 감염 모델에서 분무된 면역글로불린의 활성도
중합체성 면역글로불린은 점막 표면에서 중요한 역할을 한다. 면역글로불린은 신체로 세균이 침입하는 것을 방지하는데 참여하며, 이는 면역 배제(immune exclusion)로서 공지된 과정이다. 이것은 세균을 더 잘 응집시키기 위한 중합체성 면역글로불린의 능력 뿐만 아니라 면역글로불린에 의한 세균 표면 상의 항원의 인식을 을 포함한다.
분무가 중합체성 면역글로불린의 기능을 손상시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 제형들(5 내지 9)은 양극화된 점막 상피 세포의 감염의 시험관내 모델에서 시험하였다. 상기 점막 상피 세포를 감염시키는 것으로 공지된 바와 같이 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)는 감염원으로서 사용되어 인간에서 설사를 초래하였다. 장의 세포 단층은 이러한 목적을 위해 사용되었다. 세포 단층은 미처리(C-)로 남겨두거나, 14시간 동안 시겔라 플렉스네리 단독(C+)으로 또는 대조군 제형(-) 또는 분무된 제형(N)과의 복합체에 노출시킨다(도 6). 시겔라 플렉스네리에 의한 감염은 TNF-알파, CXCL8 및 CCL3과 같은 상피 세포에 의한 염증성 사이토카인의 분비를 유도하였다(도 6A). 또한, 감염은 막 무결성 및 밀착 연접(tight junction)의 손실을 초래하여 경상피 전기 저항의 관련 손실을 측정함에 의해 평가할 수 있다(도 6B). 마지막으로, 감염된 병소의 수를 계산하고 감염된 영역을 측정함에 의해 감염을 모니터링하였다(도 6C). 이들 종말점을 측정하기 위한 상세한 프로토콜은 문헌(참조: 특허 출원 WO2013132052, 및 Longet S. et al, J Biol Chem. 2014 Aug 1;289(31):21617-26)에 공개되어 있다.
감염의 이러한 시험관내 모델에서, 단량체성 면역글로불린은 보호되지 않는다(참조: Longet S. et al, J Biol Chem. 2014 Aug 1;289(31):21617-26). 프롤린 중의 단지 IgAM 및 SIgAM만이 감염, 염증성 사이토카인 분비 및 보호된 막 무결성을 감소시켰다(도 6A, B, C; 제형 8 및 9). 중요하게는, 시겔라 플렉스네리와 분무되는 IgAM 및 SIgAM의 면역 복합체는 시겔라 플렉스네리아와 비-분무되는 IgAM 및 SIgAM에 의해 형성된 면역 복합체만큼 시겔라 플렉스네리의 감염력과 사이토카인 분비를 감소시킬 수 있다. 단량체성 면역글로불린들의 분무(도 6, 제형 5 내지 7)는 이들의 시험관내 활성도에 영향을 미치지 않았다. 진정으로, 이러한 감염 모델에서 기능의 획득 또는 손실이 관찰되지 않았다.
따라서, 총괄적으로, 다클론성 면역글로불린의 분무는 면역글로불린 항원 인식 및 Fc 기능을 변경시키지 않음이 밝혀졌다.
실시예 7: 동물 모델에서 분무된 면역글로불린의 폐 침착
실시예 1과 실시예 3에 기재된 조성물들을, 에어로졸이 동물에게 분배되는 유동 통과 챔버(flow pass chamber)에 연결된 막 분무기를 사용하여 래트에게 분무하여 투여하였다.
에어로졸 투여 후 상이한 시간(0, 1h, 6h, 12h 및 24h)에서, 래트를 희생시켰다. 폐의 좌측 엽을 기관지폐포 세척술(BAL)에 사용하였다. 이러한 목적을 위해, 기관지 삽관하였으며 폐를 멸균 PBS로 2회 세척하였다(2×5mL). 각각의 개별적인 BAL로부터의 수율을 풀링하고 멸균 플라스틱 튜브 내에서 수집하였다. BAL 샘플들을 원심분리(대략 4℃에서 10분 동안 1500×g에서)하고, BAL 상청액을 2개의 멸균 튜브(각각 약 5mL)로 분취하였다. 우측 엽을 분리시키고, 고정시키고, 표준 기술을 사용하여 조직검사를 위해 준비하였다. 이후에, 폐 내의 Ig 분포는 파라핀 섹션에서 특이적 이차 항체를 사용하여 면역조직화학 방법들을 사용하여 평가하였다. 폐의 특정 부분을 연구하였다(예를 들면, 호흡 세기관지,　폐포 관,　폐포 낭, 및　폐포).
BAL에서의 면역글로불린의 존재는 ELISA에 의해 측정하였다. IgA 검출을 위해, 플레이트들(NUNC)을 실온에서 1시간 동안 염소 항-인간 IgA(Bethyl Laboratories; 코팅 완충액(1.59g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 1ml H2O, pH 9.6) 중의 1/500)로 코팅하였다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, 차단 용액(PBS, 1% BSA)을 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 완충액을 PBS-트윈을 사용하여 세척하고, 샘플들을 플레이트에 분배시키고 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, 염소 항-인간 IgA-HRP(Bethyl Laboratories; 희석 완충액(낮은 교차(cross) 완충액(Candor), 1% 카세인) 중의 1/8000)를 실온에서 1시간 동안 웰에 첨가하였다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, TMB 기질을 실온에서 15분 동안 웰에 첨가하였고, 정지 용액을 첨가함에 의해 촉매작용을 정지시켰다.
IgG 검출을 위해, 플레이트들(NUNC)을 실온에서 2시간 동안 염소 항-인간 IgG(Acris; 코팅 완충액(1.59g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 1ml H2O, pH 9.6) 중의 1.5㎍/mL의 최종 농도)로 코팅하였다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, 차단 용액(PBS, 1.6% BSA)를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 완충액을 PBS-트윈을 사용하여 세척하고, 샘플들을 플레이트들에 분배시키고 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, 염소 항-인간 IgA-HRP(Acris; 희석 완충액(낮은 교차 완충액(Candor), 1% 카세인) 중의 0.3㎍/mL의 최종 농도)를 실온에서 1시간 동안 웰에 첨가하였다. PBS-트윈을 사용하여 세척한 후에, TMB 기질을 실온에서 15분 동안 웰에 첨가하였고, 정지 용액을 첨가함에 의해 촉매작용을 정지시켰다. 결과를 도 7에 나타낸다.
에어로졸(시간 0h)에 의해 제형 5, 7 및 8의 적용 시점에서 BAL에서 최고량의 면역글로불린들이 검출되었다. 시간이 경과함에 따라, 분무된 면역글로불린의 양이 감소하였고, 키네틱(kinetic)의 말미(24h)에 더 적은 양이 검출되었다. 중요하게는, 분무된 면역글로불린은 분무 후 24h 째에 BAL에서 여전히 검출 가능하였다.
래트로부터의 혈장 내의 분무된 면역글로불린의 존재를 또한 분석하였다. IgA 제형(IgA 및 IgAM) 중 어느 것도 분무 후 24h 째에 검출되지 않았다. 그러나, 분무되는 IgG는 3마리 래트가 에어로졸을 투여받은지 24h 후에 이들의 혈장에서 검출될 수 있었다(참조 표 11).
[표 11] 분무된 IgG가 면역글로불린 전달 24시간 후에 혈장에서 검출되었다
Figure 112016107747298-pct00016
본 발명자들은 분무가 면역 글로불린의 구조에 영향을 미치지 않음을 상기에 나타냈다. 그러나, 폐 내의 점액 층들은 적용된 면역글로불린의 무결성에 영향을 미칠수 있는 프로테아제를 함유하는 것으로 공지되어 있다. BAL로부터의 ELISA 결과를 보완하기 위해, 본 발명자들은 분무된 면역글로불린의 무결성을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. SDS PAGE는 표준 프로토콜에 따라 수행되었거나 특허 출원 WO2013132052에 기재된 바와 같이 수행되었다. 면역블로팅(immunoblotting)을 위해, 다클론성 래빗 항체들이 사용되었다: a) 래빗 항-인간 감마 쇄(Dako, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)-접합됨; 1/10,000 희석), b) 래빗 항-인간 알파 쇄(Dako, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)-접합됨: 1/5,000 희석); c) 래빗 항-인간 뮤 쇄(Dako, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-접합됨; 1/3,000 희석). 모든 항온처리는 주위 온도에서 3시간 동안 5% 분유 및 0.5% 트윈을 함유하는 PBS 중에서 수행하였다. PBS-트윈으로 최종 세척 후에, 막 상의 면역검출은 화학발광에 의해 드러났으며 ImageQuant LAS 4000 시스템(GE Healthcare Lifesciences)에서 디지털로 기록되었다. 환원된 겔로부터의 웨스턴 블롯을 도 8에 나타낸다.
ELISA 데이터를 확인한 바, IgG의 감마 쇄는, 분무되는 IgG를 투여받은 래트의 각각의 BAL 샘플에서 검출되었다(도 8; 5, a). 분무 후 24h까지 밴드가 검출 가능하였다. 분무되는 IgA를 투여받은 래트의 BAL 샘플들에서, 알파 쇄는 전달 후 초기 시점에서 검출되었지만(7, b), 6h 후 희미해졌다. 알파 쇄는 진정으로 분무 후 24h째에 검출하기가 매우 어려웠다(도 8; 7, b). 분무되는 IgAM을 투여받은 래트에서, 각각의 BAL 샘플에서 알파 쇄의 검출은 명확하지만 24h에서 신호가 더 낮았다. 동일한 BAL 샘플들에서, 뮤 쇄(c)는 24h까지 각각의 샘플에서 검출되었으며, 이 마지막 시점에서 희미했다.
BAL 샘플들은 또한 비-환원된 겔에서 실행하였다. 감마, 알파 및 뮤 쇄의 단편들이 검출되지 않았다. 검출되었던 면역글로불린은 온전하였다.
총체적으로, 본 발명의 발명자들은 분무된 면역글로불린이 동물의 폐에 충분히 도달할 수 있고, 이들의 양이 시간 경과에 따라 감소하는 경향이 있더라도, 이들 면역글로불린이 이 환경에서 24시간 동안 온전하게 머물러 있었음을 보여주었다.
실시예 8: 만성 부비동염의 치료 및 예방을 위한 분무된 면역글로불린
만성 부비동염(CS)은 상당히 손상된 삶의 질(참조: Khalid AN, Quraishi SA, Kennedy DW. Long-term quality of life measures after functional endoscopic sinus surgery. Am J Rhinol 2004 May;18(3):131-6)과 실질적인 의료 소비(참조: Anand VK. Epidemiology and economic impact of rinosinusitis. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 2004 May;193:3-5.)를 초래하는 가장 흔한 만성 감염성 병태들(면역결핍 환자와 정규 모집단에서 13%의 유병) 중 하나이다.
현재 치료는 항생제, 장기간의 스테로이드 및 (반복) 수술을 포함한다. 그러나, 이들 중재적 치료는 고위험 그룹(예를 들면, 1차 항체 결핍증, 낭포성 섬유증)에서 높은 실패율과 함께 제한된 효능을 가지며 항생제 내성은 반복적 사용으로부터 잠재적으로 나타날 수 있다.
CS를 예방하거나 치료하기 위해, 실시예 1에 기재된 조성물, 바람직하게는 IgA 또는 재조합 분비 성분이 임의로 보충된 중합체성 IgA와 IgM의 혼합물을 분무시키고 비부비동 또는 부비동을 표적으로 하는 맥동 기류를 방출시킬 수 있는 대형 혼합 챔버를 갖는 막 분무기를 사용하여 표적 환자들에게 투여된다. 표적 환자들은 고위험 그룹(예를 들면, 원발성 항체 결핍증, 낭포성 섬유증)에 속하거나 또는 CS의 재발 에피소드를 갖는 것으로 알려진 환자들이다.
CS를 겪고 있는 환자들에서, 적용은 비용종(nasal polyp) 제거 수술 및/또는 항생제 또는 스테로이드 치료 후 개시한다. 환자들에게 IgG(10%) 또는 IgA(50mg/mL) 또는 중합체성 IgA와 IgM(50mg/mL), 바람직하게는 재조합 분비 성분과 회합된 중합체성 IgA 및 IgM(50mg/mL)의 혼합물을 포함하는 2mL의 액체 조성물을 8주 기간 동안 적어도 1일 1회 분무한다. 이것은 1회 처리 주기에 상응한다.
예방 치료요법에서, 환자들에게 IgG(10%) 또는 IgA(50mg/mL) 또는 중합체성 IgA와 IgM(50mg/mL), 바람직하게는 재조합 분비 성분과 회합된 중합체성 IgA 및 IgM(50mg/mL)의 혼합물을 포함하는 2mL의 액체 조성물을 매년 2회-처리 주기로 분무한다.
분무된 면역글로불린은 예방적 치료의 경우 만성 부비동염 에피소드를 감소시킨다.
CS를 갖는 환자들에 적용하는 경우, 분무된 면역글로불린은 비울혈 및 분비물, 얼굴 압박 또는 통증, 눈, 뺨 및 코 주위 부종과 같은 증상을 감소시킨다.
실시예 9: 원발성 면역결핍증( PID )에서 만성 하기도 감염의 치료시에 있어서 분무된 면역글로불린
PID 환자들에서 IgG 대체 치료요법은 폐렴 및 중증 감염율을 효율적으로 감소시킨다. 그러나, 이들 환자들은 여전히 매년 환자당 3 내지 4회 감염을 경험한다. 염증과 조합되는 이러한 높은 감염율은 IgG 치료요법이 기관지확장증, 만성 설사, 자가면역, 및 림프세포증식성 장애와 같은 만성 감염 부작용에 적게 영향을 미침을 나타낸다.
장기간 IgG 대체 치료요법하에 폐렴, 기관지확장증 및 패혈증은 낮은 IgM과 관련이 있는 한편, 낮은 IgA에 의해서는 위장 감염율이 상당히 증가하였으며(참조: Oksenhendler E, Gerard L, Fieschi C, et al. Infections in 252 patients with common variable immunodeficiency. Clin Infect Dis 2008 May 15;46(10):1547-54; Gregersen S, Aalokken TM, Mynarek G, et al. Development of pulmonary abnormalities in patients with common variable immunodeficiency: associations with clinical and immunologic factors. Ann Allergy Asthma Immunol 2010 Jun;104(6):503-10; Quinti I, Soresina A, Guerra A, et al. Effectiveness of immunoglobulin replacement therapy on clinical outcome in patients with primary antibody deficiencies: Results from a multicenter prospective cohort study. J Clin Immunol 2011 Mar 2.), 이것은 IgA 및/또는 IgM이 중요한 누락된 인자일 수 있음을 다시 한번 나타낸다.
기관지확장증 환자는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염에 취약하다. X-연결된 무감마글로불린혈증(XLA)은 PID 환자들의 하부-집단에 영향을 미치는 질환이다. 이는 성숙 B 림프구 뿐만 아니라 특이 항체의 생성시 결함과 혈청 중의 면역글로불린의 낮은 농도를 특징으로 한다. 이들 환자들은 기관지확장증 발현을 초래할 수 있는 만성 감염을 나타낸다.
만성 하기도 감염된 특정 연구 집단은 피. 애루기노사(P. aeruginosa)로 폐 감염의 첫 번째 에피소드를 경험한 XLA 환자들이다. 따라서, 치료의 목적은 감염 재발 방지와 기관지확장증의 장기간 방지일 것이다. 이러한 특정 표시에 대해 IgA 또는 혼합된 IgM/IgA 생성물 중 하나가 고려된다. 환자들에게 IgG(10%) 또는 IgA(50mg/mL) 또는 중합체성 IgA과 IgM(50mg/mL), 바람직하게는 재조합 분비 성분과 회합된 중합체성 IgA 및 IgM(50mg/mL)의 혼합물을 포함하는 2mL의 액체 조성물을 적어도 1일 1회로 8주 기간(= 1회 처리 사이클) 동안 분무시킨다. 환자들은 매년 2회-처리 주기로 투여받아야 한다.
감염 재발률, 기관지확장증 발생율, 유도 객담 내의 미생물 부하량/염증 파라미터들을 포함하는 효능 파라미터들이 잘 정의되어 있다.
실시예 10: 점성 면역글로불린 제형의 분무
이전 실시예들에 나타낸 바와 같이, 임상시험용 개질된 eFlow 기술을 사용하는 면역글로불린의 분무는 면역글로불린 구조나 이들의 기능도 손상시키지 않는다. 기도(상기도 및/또는 하기도)로 전달될 특정량의 면역글로불린을 표적화하는 경우 분무 시간을 단축시키기 위해, 더 높은 농도의 면역글로불린이 바람직하다. 면역글로불린의 높은 분자량(150kD 내지 1040kD) 뿐만 아니라 분자의 높은 농도는, 두 가지 형태로, 즉 개별적으로 또는 연합하여, 제형의 점도에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 점도는 분무 성능에 직접적으로 영향을 미친다.
점도가 분무 성능에 어떻게 영향을 미치는지를 더 잘 이해하기 위해, 몇몇 제형들을 세가지 개별 장치들에서 시험하였다. 임상시험용 eFlow 분무기(개질된 막 유형 4), Omron Micro Air U22 및 Aerogen Aeroneb®Go가 사용되었다.
제형이 표 12에 도시되어 있다.
[표 12] 시험된 제형의 특성
Figure 112016107747298-pct00017
레이저 회절 실험은 실시예 1, 2 및 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 3개의 임상시험용 개질된 eFlow 분무기들(활성 진동 막 및 부압), 3개의 Omron Micro Air U22(수동 진동 막), 및 1개의 Aerogen Aeroneb®Go(활성 진동 막)가 이 연구에 사용되었다. 샘플들이 이중으로(Aeroneb®Go) 또는 삼중으로(임상시험용 개질된 eFlow, Micro Air U22) 시험되었다. Omron 분무기 및 Aerogen 분무기는 각 제조업체의 취급 설명서에 따라 사용되었다. 모든 제형은 무작위 순서로 시험하였다. 결과를 표 13 및 표 14에 나타낸다.
[표 13] IgG 제형을 사용한 분무 결과
Figure 112016107747298-pct00018
[표 14] IgAM 제형을 사용한 분무 결과
Figure 112016107747298-pct00019
표 13 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 동일한 단백질(예를 들면, 단량체성 다클론성 면역글로불린)의 농도 증가는 점도 증가(각각 5% 내지 20% 범위의 IgG에 대해 1.75 내지 14.52mPa*s)와 관련되었다. 중합체성 면역글로불린(IgA 및 IgM)과 같은 더 크고 더 복잡한 단백질의 경우, 단량체성 면역글로불린보다 점도가 더 빨리 증가하였다. 5% 및 9% IgG는 1.75mPa*s 및 2.65mPa*s의 점도를 각각 나타냈지만, 농도 5% 및 9%의 중합체성 IgA 및 IgM의 제형은 3.88mPa*s 및 15.87mPa*s의 점도를 나타냈다. 증가된 점도는 총 분사율(TOR)의 감소와 관련되었다. 액적 크기는 최소한으로 감소하지만 점도는 증가했다.
증가하는 농도의 다클론성 IgG의 분무는 농도가 13%일 때까지 임상시험용 개질된 eFlow 분무기(IM-eFlow)를 사용하여 가능했다. 15% IgG를 위해, 3개 중 1개의 분무기는 IgG를 분무시킬 수 있었다. 20% IgG는 또한 3개 중 1개의 분무기에 의해 분무될 수 있지만, 매우 낮은 TOR(6mg/min)일 것이다. Omron Micro Air U22는 7% 초과의 IgG 농도, 및 매우 낮은 TOR(160mg/min) 및 더 큰 액적 크기(> 6㎛; IM-eFlow < 4㎛)를 갖는 제형을 분무시킬 수 없었다. Aerogen Aeroneb®Go는 7% 및 9% 제형을 매우 낮은 TOR(각각 117mg/min 및 20mg/min)로 분무시킬 수 있었다. 7% 및 9%의 IgG의 경우, eFlow 분무기는 고성능(예를 들면, TOR > 550mg/min)을 나타냈다.
IgA 및 IgM 제형(예를 들면, IgAM 5% 및 8%)의 분무는 eFlow 분무기를 사용하여 우수한 성능이 가능하다. 9%의 IgAM은 정상적인 성능으로 1회만 분무시킬 수 있었다. Omron Micro Air U22는 중합체성 다클론성 면역글로불린을 함유하는 이들 제형을 분무시킬 수 없었다. Omron 장치 및 Aerogen 장치는 면역글로불린 제형으로부터의 에어로졸을 3mPa*s 초과의 점도로 생성시킬 수 없었다.
종합적으로, 다클론성 면역글로불린의 조성물을 분무함에 의해 에어로졸을 생성시키는 본 발명의 방법은, 고도로 농축된 단량체성 및 중합체성 면역글로불린 분무시에 현재의 방법에 비해 탁월한 성능을 나타낸다.

Claims (15)

  1. (a) 다클론성 면역글로불린(Ig)을 포함하는 액체 수성 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 Ig의 농도가 40 내지 200mg/mL의 범위 내인, 단계;
    (b) 내부에 상기 조성물이 충전되어 있는 저장소를 갖는 막 분무기(membrane nebulizer)를 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 분무기를 사용하여 상기 조성물을 분무(nebulizing)하여 에어로졸을 얻는 단계
    를 포함하고,
    상기 면역글로불린 조성물의 점도는 1 내지 17mPa·s인, 에어로졸을 생성시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물 중의 Ig의 농도가 50 내지 100mg/mL의 범위 내인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 안정제를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 안정제가 프롤린인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 계면활성제를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저장소 내부의 압력이 단계 (c) 전에 또는 단계 (c) 동안에 감소하도록 상기 저장소를 대기로부터 격리시키는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 저장소(10) 내의 개구부용 기밀 실(gas-tight seal)을 제공하도록 상기 개구부 상에 배열된 밀봉 소자(sealing element)(16)에 의해 그리고, 슬라이딩 가능한 소자(21)의 이동이 상기 밀봉 소자(16)의 적어도 하나의 섹션(18)의 이동에 영향을 미쳐 부압이 상기 저장소(10)에서 생성되도록 하는 방식으로 상기 밀봉 소자(16)에 연결된 상기 슬라이딩 가능한 소자(21)에 의해, 상기 저장소를 대기로부터 격리시키는, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 분무기가 진동 막 분무기인, 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 분무기는 유체와 접촉하기 위한 제1 측면(124) 및 대향하는 제2 측면(125)을 갖는 진동 가능한 막(122)을 포함하고, 상기 막은 상기 제1 측면으로부터 상기 제2 측면으로의 연장(extension) 방향(E)으로 상기 막을 관통하는 복수의 쓰루 홀(through hole)(126)들을 가지며, 상기 막이 상기 제2 측면에서 에어로졸을 생성시키기 위해 진동하는 때에 상기 유체가 상기 제1 측면으로부터 상기 제2 측면으로의 상기 쓰루 홀들을 통과하며, 각각의 쓰루 홀(126)은 이의 연장 방향(E)을 따라 최소 직경(DS), 상기 최소 직경보다 최대 3배 더 큰 직경(DL)을 가지며, 각각의 쓰루 홀은 상기 쓰루 홀의 최소 직경을 포함하는 상기 연장 방향의 쓰루 홀의 연속 부분에 의해 한정되고 상기 쓰루 홀의 더 큰 직경에 의해 경계 지워지는 노즐 부분(132)을 가지며, 여기서, 상기 연장 방향의 상기 노즐 부분(132)들의 각각의 하나의 길이에 대한 상기 연장 방향의 각각의 쓰루 홀(126)의 총 길이의 비가 적어도 4임을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분무기가 환자의 하기도를 표적으로 하는 에어로졸을 생성시키기 위해 구성되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분무기가 환자의 상기도를 표적으로 하는 에어로졸을 생성시키기 위해 구성되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분무기가 활성 막 분무기인, 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린(Ig)이 다클론성 면역글로불린 G(IgG), 다클론성 면역글로불린 A(IgA), 및/또는 다클론성 면역글로불린 M(IgM)인, 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달된 에어로졸이, 상기 분무기 저장소 내에 충전된 상기 조성물 중에 상기 Ig 용량의 적어도 50용적%를 함유하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에어로졸 중의 상기 Ig의 활성도가 상기 분무기 저장소 내에 충전된 상기 조성물 중의 상기 Ig의 적어도 80%인, 방법.
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