KR102257477B1 - 연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티-폴루션 효과를 가지는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연잎 분쇄물 중량 대비 10배의 40 ∼ 60% 1,3-부틸렌글리콜 용매에서 초음파 처리한 연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티-폴루션 효과를 가지는 화장료 조성물을 개시한다.

Description

연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티-폴루션 효과를 가지는 화장료 조성물{Cosmetic composition having Anti-pollution effect comprising Lotus leaf extracts as an effective component}

본 발명은 연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 안티폴루션용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

환경 오염과 미세먼지로 인한 피부 노화가 증가함에 따라 2005년 이후 화장품 업계에서 '안티-폴루션(anti-pollution)'기능이 있는 제품개발이 증가하고 있다. 일반적인 안티-폴루션 제품은 세안을 통하여 세포 모공 속에 침투한 중금속 및 미세먼지를 제거하는 것이 제안되고 있으나, 단순한 세안만으로 흡착력이 강한 중금속 및 미세먼지를 효과적으로 제거하기 어렵다. 또한, 세안력이 강한 제품의 경우 피부에 자극이 강한 화학물질을 포함하기 때문에 민감하거나 예민한 피부의 경우 각종 피부질환이 발생하는 문제가 있다.

이에 따라 안티-폴루션 제품의 개발은 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용하고 있다. 천연물에서 얻어진 생리 활성 물질들은 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화 시켜 피부 건강을 유지할 뿐 아니라, 안정성이 높다. 최근에 녹차를 발효한 추출물이 미세먼지에 의한 피부 손상을 완화하는 효능이 확인되면서 천연물을 발효한 화장품의 개발이 증가하고 있다.

따라서 공기 중의 미세먼지와 같은 환경 스트레스에 대한 피부 보호 효과가 우수한 천연물 유래 화장품 제품의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황에서, 본 발명자들은 천연 추출물을 우수한 기능성 화장료 조성물을 개발하고자 착수하였다.

연잎(Nelumbo nucifera)은 수생식물 중 부엽식물에 속하는 쌍떡잎 식물로서 인도와 중국을 중심으로 열대, 온대의 동부아시아를 비롯한 한국, 중국, 일본 등에 널리 분포하고 있다. (Borsch, 1983). 연잎은 맛이 쓰고 성질은 유하며 여름철에 지친 심신을 안정시켜 식욕을 돋게 한다고 알려져 있다. 또한 예로부터 출혈성 위궤양이나 위염, 치질, 지혈, 설사, 두통과 빈혈, 산후 어혈치료, 야뇨증, 해독작용 등에 민간요법으로 사용되어 왔다(Kim, 1981). 연잎의 성분은 진통 작용, 진정 작용이 있는 roemerine, nuciferin, armepavine, n-nornuciferine, pronuciferine, liriodenine, d-n-methylcoclaurine, 주석산, 구연산, 호박산, 탄닌 등이 함유되어 있다(Yuk, 1990). 그 외에 칼슘과 칼륨 함량이 비교적 높고 β-carotene, 비타민 C, E와 같은 항산화 비타민이 free radical을 제거하여, 관상동맥질환, 암, 백내장을 예방하고 노화방지에도 효과적이다. 특히 녹색 잎에 많이 함유된 flavonoids는 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxide, catalase와 peroxyl nitrate의 scavenging, Fe와 Cu의 chelating 뿐만 아니라 항산화 효소의 활성을 증가시켜, 지질 과산화와 low density lipoprotein (LDL)의 산화를 방지한다(이경석 등, 2006; 임진아 등, 2008). 또한 연잎에 함유된 폴리페놀 성분으로 인해 항산화(김금숙 등, 2008; 박찬흠 등, 2007 ; LIN et al., 2009), 항균(김천현 등, 2008 ; 박윤점 등, 2008 ; Mingyu et al., 2008)등의 생리활성 작용을 하며, 부인병에 좋다고 알려져 있다.

상기와 같이 연잎에 대한 연구가 시행되고 있으나, 아직까지 연잎 추출물 및 이를 유효성분을 함유하는 안티폴루션 화장료 조성물에 대한 연구는 시행된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 연잎 추출물을 이용한 연구를 수행하여 본 발명에 이르렀다.

최근 환경오염과 미세먼지로 인한 피부노화방지를 위한 안티폴루션용 화장료가 아레카야자(Chrysalidorcarpus lutescens) 식물의 분쇄물을 에탄올로 추출하여 막필터로 여과한 여과액과 상기 아레카야자 식물의 분쇄물에 꽃송이버섯균사체를 접종하여 배양한 에탄올 추출물을 이용한 항염 피부 보습 및 피부보호용 화장료 조성물이 국내 등록특허 제10-1825713호에 제안된 바 있다.

또, 엘라스타제 억제(Elastase inhibition)효과와 콜라겐 합성(Collagen synthesis) 효과에 따른 항주름의 우수한 연꽃, 연잎, 연줄기, 연근, 연자육의 100~120℃에서의 열수추출물이 국내 공개특허 제10-2011-0115047호에 개시된 바 있다.

한편, 연잎의 에탄올 추출물의 피부상재균 3종에 대한 항균 활성 효과와 항산화 효과 및 항염증 효과가 개시되었다(Reserch Article, kor. J. Aesthet. cosmetol., vol. 10 No.2, 405-413, 2012.5).

그러나, 지금까지 유기용매 특히 1,3부틸렌글리콜과 함께 초음파 처리한 연잎추출물을 이용한 항산화, 미백활성 및 특히 미세먼지(Particulate Matter, PM)에 의한 피부세포 생존과 관련한 효과에 의한 피부 보호 효과에 대하여는 연구된 바 없었다. 본 발명자들은 특히, 본 발명 제조방법에 따라 제조된 연잎추출물이 미세먼지(PM) 피부세포 보호용 화장료 조성물로서의 새로운 용도 발명에 대하여 본 발명을 완성하고 본 특허출원을 수행하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 연잎 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 연잎 추출물의 제조방법과 상기 방법으로 제조된 연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 연잎을 수세 건조하는 단계와;

상기 단계에서 얻은 수세 건조된 연잎을 분쇄하는 단계와;

상기 단계에서 얻은 분쇄된 연잎을 40~60% 부틸렌글리콜(Butylene Glycol)에 첨가한 후 sonicator(JAC. 4020, Jinwoo, Korea)를 이용하여 온도 40~50℃로 고정하고 추출하는 단계와; 상기 단계에서 추출된 시료를 0.45 ㎛ 멤브레인필터로 여과하여 얻은 여액을 환경 스트레스와 관련된 항산화 활성 효과, 미백 활성 효과 및 특히 미세먼지에 의한 피부세포 보호 활성 효과를 평가함으로써 달성하였다.

본 발명에 따르면 연잎의 40~60% 부틸렌글리콜의 초음파 추출물은 항산화 활성, 미백 활성 효과뿐만 아니라 특히 미세먼지에 의한 피부세포 보호 활성 효과가 뛰어나 지금까지 존재하지 않았던 신규한 화장료 조성물과 그에 따른 다양한 제형의 화장품을 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 연잎 분해물에 대하여 50% 1,3-부틸렌글리콜의 초음파 추출물의 SOD 유사 활성 효과를 검증한 그래프,
도 2는 DPPH 라디칼 소거능을 검증한 그래프,
도 3은 ROS 생성 억제 활성을 검증한 그래프
도 4는 피부 미백 활성 효과 실험결과를 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명에 따른 50% 1,3-부틸렌글리콜의 초음파 추출물의 미세먼지에 대한 피부세포 생존율 실험 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 세포사멸(아폽토시스)의 저해능을 검증한 그래프이다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 하나의 실시예에 불구한다. 따라서 이 실시예 등은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것에 불과하고 첨부된 청구항에 기재한 본 발명의 권리범위는 이를 실시예에 의한 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 실시예에 따르면 본 발명 신규한 1,3-부틸렌글리콜의 초음파 연잎 추출물은 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 미백 활성 효과 및 피부 보호 효과가 우수한 기능성 조성물을 의미한다.

피부 보호 효과라 하면 미세먼지, 황사, 담배연기, 매연 등 피부 손상을 유래하는 환경 스트레스로부터 인체 피부를 보호하는 것을 포함한다.

여기서 유효성분이라함은 상기 언급한 효과를 발현할 수 있을 정도의 최소범위 수치 이상의 함량을 포함하는 것을 뜻한다.

본 발명의 "연잎 추출물"은 초음파 추출물을 의미하며 물(H₂O) 또는 탄소수 1~4개의 저급 알콜 특히 에탄올을 포함하는 유기용매 추출물을 포함하지만 가장 바람직하기로는 1,3-부틸렌글리콜(Butylene Glycol) 용매에 원료가 되는 건조 후 분쇄된 연잎 분말을 접촉시켜 초음파 추출한 것을 의미한다.

본 발명에 따르면 원료가 되는 연잎에 함유된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출물이 달라지며 상기 1,3-부틸렌글리콜이 물이나 에탄올 또는 메탄올에 비하여 생리 활성 물질의 추출에 있어서 선택성이 뛰어나고 특히, 상기 용매 1,3-부틸렌글리콜에서의 초음파 추출물이 피부 항산화, 미백 및 특히 피부세포 보호효과 구현에 가장 효과적인 사실을 발견하였다.

물과 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜은 극성이 각각 상이하고 각 극성에 따라 추출되는 유효성분도 차이가 있으며 따라서, 1,3-부틸렌글리콜의 농도는 최적의 피부미백 활성 및 피부세포 보호 활성이 극대화될 수 있도록 최적 농도를 제어해줄 필요가 있다. 본 발명에 따르면, 1,3-부틸렌글리콜의 농도가 40%이하이면 피부개선효과를 나타내는 활성성분이 충분히 추출되지 않고 60%이상이면 추출수율이 급격히 악화되었다.

본 발명에 따르면 1,3-부틸렌글리콜의 초음파 처리한 연잎 추출물은 상기 물 또는 유기용매와 함께 당단백질 열응고점 이하의 온도 40 ∼ 50℃에서 12 ∼ 15시간동안 추출하는 것이 수율상 가장 바람직하였다.

본 발명에 따르면 본 발명 연잎 초음파 추출물은 1,3-부틸렌글리콜을 사용하여 추출할 경우 40℃미만이면 추출 효율이 저하되고 유효성분 함량이 감소하며 50℃이상에서 추출할 경우 천연물에 함유된 유효활성 성분인 당단백질이 고온에서 변성되어 피부 개선효과가 저하되어 바람직하지 않았다. 또한 상기 추출시간이 12시간 이하에서는 천연 물질에 함유된 유효성분의 추출이 불완전하고 15시간이 초과되는 경우에는 연잎에 함유된 잔여 활성성분의 함량이 과소하여 시간과 비용상 효율성이 떨어진다.

본 발명에 따르면 연잎의 초음파 추출물의 사용 함량은 화장료 조성물의 전체 총 중량 대비 0.005중량% 내지 20중량%까지 바람직하다. 상기 연잎 추출물의 함량이 0.005중량% 미만이면 유효성분의 충분한 활성이 구현되기 어렵고 20중량%가 초과되면 제품 비용의 효율화에 지장이 될 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 미세먼지 및 중금속 등을 제거하여 환경 스트레스에 대한 피부 보호 및 미백 효과를 증진시킬 수 있었다.

상기 환경 스트레스 저감은 미세먼지 또는 중금속 제거 외에도 황사, 매연 담배연기 등 피부에 손상을 줄 수 있는 어떠한 물질이라도 그 축적이 고무되는 것이면 이를 방지하기 위한 것이 모두 해당된다. 특히 인체 피부 보호는 피부의 각질을 개선하고 피부 활성을 증진하는 것을 의미한다.

상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 영양로션, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 오일, 파운데이션, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 샴푸, 린스, 팩 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜-로션, 바디로션 등의 유액; 영양-크림, 수분-크림, 아이-크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징-크림, 클렌징-로션, 클렌징-오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징-폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

본 발명 연잎 초음파 추출물의 제조

연잎을 수세하고 상온에서 완전히 건조시키고 분쇄기로 분쇄하여 연잎 분말 100 g을 수득하였다.

본 발명자들은 상기 연잎 분말 100 g에 대하여 가장 바람직하게는 50% 1,3-부틸렌글리콜을 용매로 하고 1:10(w/w)으로 혼합한 다음 추출 수율을 극대화 하기 위해 초음파 처리기(sonicator, JAC. 4020, Jinwoo, Korea)를 사용하여 온도를 45℃에 고정하고 13시간동안 추출하였다. 추출된 시료는 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 여과하고 여액 약 950 mL를 수득하였다.

[비교예 1~3]

상기 실시예 1과 달리 통상적으로 수행되는 공지된 물 또는 에탄올 추출 방법을 적용하되 비교예 1은 정제수 10배를 넣어 100℃에서 2시간 열수추출하고,

비교예 2에서는 50% 에탄올을 10배의 용매로 가하여 25℃의 진탕배양기에서 13시간 추출하고,

끝으로, 비교예 3에서는 30% 에탄올을 용매를 10배 가하여 25℃의 진탕배양기에서 역시 13시간 추출하였다.

본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 ∼ 3에 따른 용매 추출 결과 얻은 수득량(g)은 사용한 용매의 종류와 처리 조건에 따라 하기 [표 1]과 같이 보관 조건의 차이 외에 항산화, 미백효과(도표생략)에서도 차이가 있었다.

구분	용매	수득량	처리조건	보관조건
실시예 1	50% 1,3-부틸렌글리콜	135.2	초음파기(sonicator) 추출후 40.5kHz/0.45㎛필터여과	-4℃
비교예 1	열수추출 100℃/2시간	72.5	추출후 열수추출기/ 0.45㎛필터여과 후 냉각	-4℃
비교예 2	50% 에탄올	82.2	진탕배양기/ 원심분리 후 감압회전 증발 농축	-20℃
비교예 3	30% 에탄올	89.5	진탕배양기/ 원심분리 후 감압회전 증발 농축	-20℃

이하에서는 본 발명 상기 실시예 1에 따라 제조된 수득량 및 항산화, 미백효능이 가장 우수한 연잎추출물을 -4℃의 냉장고에 보관하고 공시 재료로 사용하되, 농도별로 실험을 수행하였다.

[실험예 1]

SOD 유사활성 성분

Superoxide dismutase(SOD)는 항산화계 효소로 세포 내 활성산소 종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 H₂O₂로 전환시키며 생성된 H₂O₂는 퍼옥시다아제(peroxidase)나 카탈라아제(catalase)에 의해 물과 산소로 분해된다.

즉, 수퍼옥사이드(superoxide)의 산화반응을 억제하여 생체를 보호하는 역할을 한다.

본 발명에 따라 제조된 연잎추출물의 SOD 유사활성 측정은 Nishikimi의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료에 pH 7.4로 보정한 phosphate buffer에 3 mM Xanthine, 3 mM EDTA, BSA, PPE (0.25-5.0 mg), PMS (30 mM), NADH (338 mM) and NBT (0.75 mM))을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1 N HCl를 가하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물 첨가구와 대조군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

완충액(50 mM KH₂PO₄/KOH (pH 7.4) buffer, 15 mM Na₂EDTA in buffer, 3 mM Hypoxanthine in 50mM KOH, 0.6 mM NBT in buffer)을 제조하였고, 혼합액(mixture solution)은 1개의 well당 15 mM Na₂EDTA 20 μL, 0.6 mM NBT 50 μL, 3 mM Hypoxanthine 30 μL, 50 mM KH₂PO₄/KOH 145 μL, 마 추출물, 화살나무 추출물, 화살나무 추출물과 마 추출물을 섞은 시료를 각각 5 μL (첫 번째 줄에 넣는다.), Xanthine oxidase 50 μL (0.1 units/mL in 50 mM KH₂PO₄/KOH)를 포함하도록 하였다.

첫 번째 줄에 혼합액 245 μL와 각각의 추출물 5 μL를 넣고 나머지는 125 μL의 혼합액을 넣은 후 첫 번째 줄에서 밑으로 희석시켜 농도를 맞춘 후 모든 well에 125 μL의 혼합액을 넣어 Xanthine oxidase 50 μL까지 총 300 μL의 최종 부피에서 Fluorescence Multi-Detection Reader(Bio-Tek, U.S.A)사용하여 반응속도 값을 설정 후 20초 단위로 5분 동안 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과는, 도 1과 같이 농도의존적으로 증가하였다.

[실험예 2]

DPPH 라디칼 소거능 실험

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA) 라디칼 소거능은 Blois(Blois, M.S. “Antioxidant determination by the use of a stable free radical”, Nature 181:1199-1200, 1958)의 방법으로 측정하였다. 시료를 MeOH로 녹여 500 μL를 1.5 mL tube에 넣고 0.3 mM DPPH 500 μL를 넣어 총 양이 1 mL가 되도록 하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Bio-Tek, USA)로 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능 = 100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도)×100}.

실험결과는 도 2와 같다.

[실험예 3]

ROS 생성 억제 효능

본 발명에 따라 제조된 연잎추출물의 항산화 활성을 검정하기 위해 DCFH-DA(2'7'-dichloro flurescin diacetate)를 이용하여 검정하였다. 이를 위해 피부 섬유아세포(HDFn)를 DMEM(10% 혈청 및 1% 항생제 첨가) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 well당 1x10⁵ 세포수가 되도록 24시간 배양하였다. 상기 단계에서 수득한 피부 섬유아세포에 추출물 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 배양한 후 산화스트레스 유발 물질인 H₂O₂ 1 mM 및 DCFH-DA 20 M을 첨가한 후 excitation 485 nm, emission 535 nm 조건으로 spectrofluorophotometer로 측정하였다. 시료를 넣지 않고 항산화 활성을 측정한 처리군을 대조군으로 이용하였고 항산화 활성은 하기 수학식1의 방법으로 계산하였다. 모든 실험은 3번 반복하여 실험하였다.

실험결과는 도 3과 같이 25% 광노화 억제 효능을 보였다.

[실험예 4]

미백활성 실험

멜라닌 형성 억제 실험

Murine melanoma(B16 F1) 세포를 적량의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 24-well plate에 well당 2×0⁴개로 접종한 후 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 Alpha-Melanovyte-stimulating hormone이 포함된 배지에샘플을 적당 농도로 희석하여처리한 후 5% CO₂, 37℃에서 일정시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 120 μL의 cell lysis buffer를 넣어 60℃ 오븐에서 세포 내 멜라닌을 얻었다. 상기 액을 이용하여 마이크로플레이트 측정기로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 일정 단백질 당 멜라닌양을 구하였다.

실험결과, 본 발명에 따라 제조된 연잎 추출물을 처리하였을 때 39%의 멜라닌 생성이 억제되는 효능을 보였다(도 4).

[실험예 5]

본 발명 연잎 추출물의 PM2.5에 대한 세포 생존률 실험

본 발명에 따른 실험예들을 기초로 하여 특히 본 발명이 착안하고 있는 본 발명 제조방법에 따라 제조된 연잎 추출물의 PM(Particulate Matter, 미세먼지)에 대한 세포 생존률 실험은 인간각질세포인 HaCaT 세포를 활용한 MTT 시약 반응법을 바탕으로 실시되었다. HaCaT 세포를 4 X 10⁴ cell/well로 96-well plate에 접종하였다. 24시간 이후 100 μg/mL의 PM2.5를 포함한 배지에 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였으며, 이후, 5 mg/mL (PBS)의 MTT 시약을 100 μL 처리하여 4시간을 더 배양하였다. 배지를 제거하고 남은 침전물을 DMSO 150 μL로 용해하여 각각의 샘플을 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3번 반복하였으며, 유의성 검정은 SPSS19.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. P<0.05 또는 P<0.01 일 경우 유의성이 있다고 판단하였다.

PM2.5에 노출한 결과, HaCaT 세포의 생존률이 대조군과 비교해 53.93%로 유의하게 감소하였다. 반면, 연잎 추출물을 2, 4, 8 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 각각 세포 생존률이 60.02% (P<0.05), 63.05% (P<0.01), 70.25% (P<0.001)로 유의하게 증가하였다.

실험결과는 도 5와 같다.

[실험예 6]

본 발명 연잎 추출물의 PM2.5에 대한 세포 사멸(아폽토시스) 저해능 실험

본 발명이 특히 착안하고 있는 본 발명 제조방법에 따라 지조된 연잎 추출물의 PM(Particulate Matter, 미세먼지)에 대한 세포 사멸 저해능 실험은 인간각질세포인 HaCaT 세포로 확인하였다. HaCaT 세포에 각각 blank control, PM2.5 100 ug/mL, 연잎추출물 2, 4, 8 μ의 농도로 처리하였다. 이 후 유세포분석기를 이용하여 세포 사멸(아폽토시스)의 발생 저해율을 확인하였다.

PM2.5에 의하여 세포 사멸을 유도한 후 농도별로 본 발명 제조방법에 따라 제조된 연잎 추출물을 처리하였을 때, 13.9%±0.7% (P<0.05), 11.7%±1.3% (P<0.05) 그리고 8.3%±1.4% (P<0.01)으로 세포 사멸을 저해하는 것을 확인하였다(도 6).

본 발명은 건조 분말화한 연잎 분말을 1,3-부틸렌글리콜 용매에서 초음파처리하여 얻은 신규한 연잎 추출물을 제공하고, 상기 연잎 추출물을 이용한 항산화 및 미백, 특히 미세먼지에 의한 피부세포 보호용 안티폴루션 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

1. 연잎 분말 총중량에 대하여 10배의 40 ∼ 60% 1,3-부틸렌글리콜 용매를 넣어 40 ∼ 50℃에서 12 ∼ 15시간 초음파 처리한 것이 특징인 연잎 추출물.
2. 삭제
3. 제1항의 연잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티폴루션 효능을 갖는 피부 보호용 화장료 조성물.
4. 제3항의 화장료 조성물이 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 샴푸, 린스 중에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 화장료 조성물.

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