KR102119700B1

KR102119700B1 - 바이러스 감염 및 기타 질환 치료용 퀴나졸린 유도체

Info

Publication number: KR102119700B1
Application number: KR1020197031596A
Authority: KR
Inventors: 고완 데이비드 맥; 피에르 쟝-마리 베르나르 라브와송; 팀 휴고 마리아 욘커스; 스테판 율리엔 라스트; 베르너 엠브레히츠; 세르게 마리아 알로이시우스 피터스
Original assignee: 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2020-06-08
Also published as: HRP20180447T1; US20140073642A1; US8916575B2; SI2709989T1; EA201391719A1; BR112013029537A2; BR112013029537B1; KR102038895B1; KR20190124337A; IL228906A0; CA2835229C; CN103748081A; UA114476C2; PH12019502269A1; EP2709989B8; HUE036220T2; AU2012258220B2; ES2663601T3; SG194852A1; PT2709989T

Abstract

본 발명은 퀴나졸린 유도체, 그 제조 방법, 약제학적 조성물 및 치료에 있어서의 사용에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염 및 기타 질환 치료용 퀴나졸린 유도체{QUINAZOLINE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS AND FURTHER DISEASES}

본 발명은 바이러스 감염, 면역 또는 염증 질환의 치료에서의 퀴나졸린 유도체의 사용에 관한 것으로, 톨-유사 수용체(toll-like-receptor; TLR)의 조절 또는 작용을 수반한다.

톨-유사 수용체는 세포외 루이신 풍부 도메인 및 보존 영역을 포함하는 세포질 확장을 특징으로 하는 1차 경막 단백질이다. 선천성 면역시스템은 특정 타입의 면역 세포의 세포 표면상에 발현된 이들 톨-유사 수용체들을 통해 병원체-관련 분자 패턴을 인식할 수 있다. 외래 병원체의 인식은 사이토킨의 생성 및 식세포상의 공-자극 분자의 상향 조절을 활성화한다. 이는 T 세포 행동의 조절을 이끈다.

대부분의 포유류 종은 10 내지 15개 타입의 톨-유사 수용체를 가진 것으로 추산된다. 13개의 TLR들(TLR1 내지 TLR13로 명명)이 인간 및 마우스에서 확인되었으며, 이들 다수의 등가 형태가 다른 포유류 종에서 발견되었다. 그러나 인간에서 발견된 특정 TLR의 등가물들이 모든 포유류에 존재하는 것은 아니다. 예를 들면, 인간에서 TLR10에 유사한 단백질을 코딩 하는 유전자는 마우스에 존재하지만, 레트로바이러스에 의해 과거 어떤 시점에서 손상된 것으로 보인다. 한편, 마우스는 TLR 11, 12, 및 13을 발현하나, 이들 중 어떤 것도 인간에서는 나타나지 않는다. 다른 포유류는 인간에서 발견되지 않는 TLR들을 발현할 수 있다. 다른 비-포유류 종은, 예컨대 타키푸구 복어에서 발견되는 TLR14에 의해 입증되는 바와 같이, 포유류와 다른 TLR들을 가질 수 있다. 이는 인간의 선천성 면역의 모델로서 실험 동물을 사용하는 과정을 복잡하게 할 수 있다.

톨-유사 수용체에 관한 자세한 리뷰는 하기 학술지 논문을 참조. Hoffmann, J.A., Nature, 426, p33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., and Kaisho, T., Annual Rev. Immunology, 21, p335-376, 2003; Ulevitch, R. J., Nature Reviews: Immunology, 4, p512-520, 2004.

WO 2006/117670에서의 퓨린 유도체, WO 98/01448 및 WO 99/28321에서의 아데닌 유도체 및 WO 2009/067081에서 피리미딘들과 같은 톨-유사 수용체에 활성을 나타내는 화합물이 이전에 기술된 바 있다.

그러나 선행 기술의 화합물에 비교하여 더 바람직한 선택성, 더 높은 역가, 더 높은 대사 안정성 및 개선된 안정성 프로파일을 갖는 신규한 톨-유사 수용체 조절제가 매우 필요하다.

C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 경우(Fried et. al. Peginterferon-alfa plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection, N Engl J Med 2002; 347: 975-82)와 같이, 특정 바이러스 감염의 치료에 있어서, 인터페론(IFNα) 주사를 정기적으로 투여할 수 있다. 경구 투여 가능한 소분자 IFN 유도제는 감소된 면역원성 및 투여 편리성의 잠재적 이점을 제공한다. 따라서, 신규한 IFN 유도제는 바이러스 감염 치료를 위한 잠재적으로 효과적인 새로운 클래스의 약물이다. 항바이러스 효과를 갖는 소분자 IFN 유도제의 문헌상 예는 De Clercq, E.; Descamps, J.; De Somer, P. Science 1978, 200, 563-565 참조.

IFNα는 또한 특정 타입의 암 치료에서 다른 약물과 조합하여 투여된다(예를 들어, Eur. J. Cancer 46, 2849-7, 및 Cancer Res. 1992, 52, 1056 참조). TLR 7/8 작용제는 또한 현저한 Th1 반응을 유도하는 능력 때문에 백신 애쥬번트로서 관심의 대상이다.

본 발명에 따라, 화학식 (I)의 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형이 제공된다:

식에서,

R₁은 C_3- ₈알킬, C_3- ₈알콕시, C_2- ₆알케닐 또는 C_2- ₆알키닐이며, 이들 각각은 임의로 할로겐, 하이드록실, 아미노, 니트릴, 에스테르, 아미드, C_1- ₃알킬, C_1- ₃알콕시 또는 C_3-6사이클로알킬에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되고,

R₂는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1- ₇알킬, C_1- ₇알킬아미노, C_1- ₆알콕시, (C_1-4)알콕시-(C_1-4)알킬, C_3- ₆사이클로알킬, C_4- ₇헤테로사이클, 방향족, 바이사이클릭 헤테로사이클, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 카복실 아미드 또는 카복실 에스테르이고, 이들 각각은 임의로 할로겐, 하이드록실, 아미노, C_1- ₆알킬, 디-(C_1-6)알킬-아미노, C_1- ₆알킬아미노, C_1- ₆알킬, C_1- ₆알콕시, C_3- ₆사이클로알킬, 카복실산, 카복실 에스테르, 카복실 아미드, 헤테로사이클, 아릴, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 니트릴에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되고,

R₃는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1- ₇알킬, C_1- ₇알케닐, C_1- ₇알키닐, C_1- ₇알킬아미노, C_1- ₆알콕시, (C_1- ₄)알콕시-(C_1- ₄)알킬, C_3- ₆사이클로알킬, C_4- ₇헤테로사이클, 방향족, 바이사이클릭 헤테로사이클, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 케톤 또는 니트릴이고, 이들 각각은 임의로 할로겐, 하이드록실, 아미노, C_1- ₆알킬, 디-(C_1-6)알킬아미노, C_1-6알킬아미노, C_1-6알킬, C_1-6알콕시, C_3- ₆사이클로알킬, 카복실산, 카복실 에스테르, 카복실 아미드, 헤테로사이클, 아릴, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 또는 니트릴에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되고,

R₄는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1- ₇알킬, C_1- ₇알킬아미노, C_1- ₆알콕시, (C_1-4)알콕시-(C_1-4)알킬, C_3- ₆사이클로알킬, C_4- ₇헤테로사이클, 바이사이클릭 헤테로사이클, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시이고, 이들 각각은 임의로 할로겐, 하이드록실, 아미노, C_1- ₆알킬, 디-(C_1-6)알킬아미노, C_1-6알킬아미노, C_1-6알킬, C_1- ₆알콕시, C_3- ₆사이클로알킬, 카복실산, 카복실 에스테르, 카복실 아미드, 헤테로사이클, 아릴, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 니트릴에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되고,

R₅는 수소, 불소, 염소 또는 메틸이며,

단, R₂, R₃, R₄ 및 R₅ 는 모두 H일 수는 없다.

첫째 실시형태에서, 본 발명은 R₁이 부틸, 펜틸 또는 2-펜틸이고, R₂, R₃, R₄ 및 R₅가 위와 같이 특정된화학식 (I)의 화합물을 제공한다.

추가적 실시형태에서, 본 발명은 R₁이 하이드록실로 치환된 C_4- ₈알킬이며, R₂, R₃, R₄ 및 R₅가 위와 같이 특정된화학식 (I)의 화합물을 제공한다.

다른 실시형태는 R₁이 하이드록실로 치환된 C_4- ₈알킬일 때, 하기 중 하나인 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.

나아가 본 발명은 R₅가 바람직하게 수소 또는 불소이고, R₁, R₂, R₃, 및 R₄ 가 위와 기술된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.

화학식 (I) 화합물 및 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형은 약제로서 특히 톨-유사 수용체(특히 TLR7 및/또는 TLR8) 활성 조절제로서의 활성을 갖는다.

따라서, 추가적 양태에서 본 발명은 화학식 (I) 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형과 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명에 따른 화학식 (I) 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형, 또는 상기 화학식 (I) 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형을 포함하는 약제학적 조성물은 의약품으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 화학식 (I) 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형, 또는 상기 화학식 (I) 화합물 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 다형을 포함하는 약제학적 조성물이 따라서 TLR7 및/또는 TLR8의 조절이 관련되는 질병의 치료에 사용될 수 있다는 것이다.

용어 "알킬"은 특정 수의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 지방족 탄화수소를 지칭한다.

용어 "할로겐" 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 지칭한다.

용어 "알케닐"은 적어도 두 개의 탄소원자와 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합으로 이루어진 상기 정의된 알킬을 지칭한다.

용어 " 알키닐"은 적어도 두 개의 탄소원자와 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합으로 이루어진 상기 정의된 알킬을 지칭한다.

용어 "사이클로알킬"은 특정 수의 탄소원자를 함유하는 카보사이클릭 고리를 지칭한다.

용어 "알콕시"는 메톡시 또는 에톡시기와 같은 산소에 단독으로 결합된 알킬기 (탄소 및 수소쇄)를 지칭한다.

용어 "아릴"은 임의로 N, O 및 S, 특히 N 및 O에서 선택되는 하나 또는 두개의 헤테로원자를 포함하는 방향족 고리 구조를 의미한다. 상기 방향족 고리 구조는 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있다. 특히, 상기 방향족 고리 구조는 5 또는 6개의 고리 원자를 가질 수 있다.

용어 "아릴옥시"는 방향족 고리 구조를 지칭한다. 상기 방향족기는 예컨대 페놀과 같이, 산소에 단독으로 결합된다.

용어 "헤테로아릴옥시"는 N, O 및 S에서 선택되는 하나 또는 두 개의 헤테로원자를 임의로 포함하는 방향족 고리 구조를 지칭한다. 상기 방향족기는 예컨대 하이드록시피리딘과 같이, 5 내지 7개의 고리 원자를 함유하며, 이들 중 하나는 산소에 단독으로 결합된다.

용어 "바이사이클릭 헤테로사이클"은 두개의 융합된 방향족 고리로 구성된 용어 "아릴"에 정의된 바와 같은 방향족 고리 구조를 의미한다. 각 고리는 임의로 N, O 및 S, 특히 N 및 O에서 선택되는 헤테로원자를 포함한다.

용어 "아릴알킬"은 임의로 알킬기로 치환된 용어 "아릴"에 정의된 바와 같은 방향족 고리 구조를 의미한다.

용어 "헤테로아릴알킬"은 임의로 알킬기로 치환된 용어 "헤테로아릴"에 정의된 바와 같은 방향족 고리 구조를 의미한다.

헤테로사이클은 포화 또는 부분 포화된 분자를 지칭하며, 에틸옥사이드, 테트라하이드로푸란, 디옥산 또는 다른 사이클릭 에테르를 포함한다. 질소를 함유하는 헤테로사이클은 예를 들면 아제티딘, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘 등을 포함한다. 다른 헤테로사이클은 예를 들면, 티오모르폴린, 디옥소리닐 및 사이클릭 설폰을 포함한다.

헤테로아릴기는 성질상 방향족인 헤테로사이클릭기이다. 이들은 N, O 또는 S에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 폴리사이클릭이다. 헤테로아릴기는 예를 들면, 이미다졸릴, 이속사졸릴, 푸릴, 옥사졸릴, 피롤릴, 피리도닐, 피리딜, 피리다지닐 또는 피라지닐일 수 있다.

화학식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 이들의 산부가염 및 염기염을 포함한다. 적당한 산부가염은 비-독성염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 적당한 염기염은 비-독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다.

본 발명의 화합물은 또한 비용매화 및 용매화 형태로 존재할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본 발명에서 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 용매 분자, 예를 들면, 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다.

용어 "다형"은 둘 이상의 형태 또는 결정 구조로 존재하는 본 발명의 화합물의 능력을 지칭한다.

본 발명의 화합물은 결정형 또는 무정형 산물로 투여될 수 있다. 이들은 예를 들면 침전, 결정화, 동결 건조, 분무 건조 또는 증발 건조와 같은 방법에 의해 예컨대 고체 플러그, 분말 또는 필름으로서 수득될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 화합물과 조합하여 또는 하나 이상의 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 일반적으로 이들은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제제로서 투여될 것이다. 용어 "부형제"는 본 발명에서 본 발명의 화합물 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 사용된다. 부형제의 선택은 주로 특정 투여 모드, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과 및 제형의 성질과 같은 인자에 따라 달라진다.

본 발명의 화합물 또는 이들의 임의의 하위그룹은 투여 목적에 대한 다양한 약제학적 형태로 제제화될 수 있다. 적합한 조성물로서 전신 투여 약물에 통상적으로 채용되는 모든 조성물이 인용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 유효량의 특정 화합물, 임의로 부가염 형태를 활성성분으로서 약제학적으로 허용가능한 담체와 친밀한 혼합물로 합하고, 이때 담체는 투여에 바람직한 제제 형태에 따라 다양한 형태를 가질 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 바람직하게 예를 들면, 경구, 직장 또는 경피 투여에 적합한 단일 제형으로 존재한다. 예를 들면, 경구 제형의 조성물을 제조하는데 임의의 통상적인 약제학적 매질이 채용될 수 있으며, 현탁액, 시럽, 엘릭실, 에멀젼 및 용액과 같은 경구 액체 제제의 경우에는 예를 들면, 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 분말, 필, 캡슐 및 정제의 경우에는 전분, 슈가, 카올린, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제 등과 같은 고체 담체를 채용할 수 있다. 투여의 편의성 때문에, 정제 및 캡슐제는 가장 유용한 경구 복용 단위 형태를 대표하며, 이 경우 고체 약제학적 담체가 자명하게 채용된다. 또한 사용 직전 액체 형태로 전환될 수 있는 고체 형태 제제도 포함된다. 경피 투여에 적합한 조성물에서 담체는 임의로 투과 증강제 및/또는 적당한 습윤제를 포함하며, 임의로 피부에 유의한 유해효과를 일으키지 않는 적합한 임의의 성질의 첨가제를 부차적 비율로 조합할 수 있다. 상기 첨가제는 피부 투여를 촉진하며/하거나 원하는 조성물을 제조하는데 도움이 될 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방식, 예컨대 경피 패치, 스폿-온, 연고로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 흡입 또는 통기를 통해 이러한 방식으로 투여하기 위해 당업계에 사용되는 방법 및 제형으로 투여될 수 있다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 화합물은 용액, 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 폐에 투여될 수 있다.

투여 편의성 및 용량 균일성을 위해 전술한 약제학적 조성물을 단위 제형으로 제형화 하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에서 단위 제형은 요구되는 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 산출하도록 계산된 예정된 양의 활성 성분을 포함하는 단위를 포함하는, 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구별되는 단위들을 지칭한다. 이러한 단위 제형의 예는 정제(분할선이 있는 정제 또는 코팅된 정제를 포함), 캡슐, 필, 분말 패킷, 웨이퍼, 좌제, 주사 가능한 용액 또는 현탁액 등 및 이들의 분리된 배수들이다.

감염 질환의 치료분야의 당업자는 후술하는 검사 결과로부터 유효량을 결정할 수 있다. 일반적으로 유효 일일량은 0.01 mg/체중 kg 내지 50　mg/체중 kg, 더 바람직하게 0.1 mg/체중 kg 내지 10 mg/체중 kg으로 사료된다. 요구되는 용량을 하루에 걸쳐 적합한 간격으로 둘, 셋, 넷 이상의 하위-용량으로 투여하는 것이 적합할 수 있다. 상기 하위-용량은 예컨대 단위 제형당 1 내지 1000 mg, 및 특히 5 내지 200　mg의 활성성분을 포함하는 단위 제형으로서 제형화될 수 있다.

정확한 용량과 투여빈도는 당업자에 알려져 있는 바와 같이, 사용되는 특정 화학식 (I)의 화합물, 치료될 특정 병태, 치료될 병태의 심각도, 특정 환자의 나이, 체중 및 일반적인 신체적 상태 및 각자가 복용하고 있는 다른 약물에 좌우된다. 나아가, 치료되는 대상의 반응 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 의존하여 유효량이 감소되거나 증가될 수 있음은 명백하다. 전술한 유효량 범위는 단지 가이드라인이며 본 발명의 범위나 사용을 임의의 범위로 제한하지 않는다.

화합물의 제조

화학식 (I)의 화합물이 반응식 1에 따라 제조된다. 2,4-디클로로 퀴나졸린은 별도 단계에서 반응되어 2,4-디아미노퀴나졸린을 허용 가능한 수율로 수득할 수 있다. 제1 단계에서, 2,4-디클로로-퀴나졸린은 전이 금속 촉매와 함께 또는 없이 아민과 함께 혼합되거나 가열되어 2-클로로-4-아미노퀴나졸린을 생성한다. 조 2-클로로-4-아미노퀴나졸린의 워크업 후, 중간체는 암모니아 공급원(예컨대, 메탄올내 암모니아) 및 임의로 CuO와 함께 압력 용기내에서 가열된다.

반응식 1

화학식 (I)의 화합물은 반응식 2에 따라 제조될 수도 있다. 치환된 안트라닐 에스테르(IV)를 문헌(O'Hara et. al. JOC (1991) 56, p776)에 기술된 방법에 따라, 과량의 시아나미드의 존재 하에 알콜성 용매(예, 에탄올) 또는 디그림(diglyme)을 사용하여 산 조건하에서 가열하였다. 2-아미노-4-하이드록시퀴나졸린(V)의 후속 아민 치환은 수개의 상이한 경로에 의해 진행될 수 있다. 한 예로서, 중간체 V는 용매와 함께 또는 용매 없이 인 옥시클로라이드 (POCl₃)의 존재하에 가열될 수 있다. 용매를 제거한 후, 아민을 그대로 또는 극성 용매(예, 아세토니트릴)의 존재 하에 가하고 실온 또는 가열하여 VI를 수득할 수 있다. 제2 방법은 중간체 V를 DBU 및 아민 존재 하에 BOP 또는 PyBOP와 같은 커플링제와 반응시키는 것이다. 반응은 극성 용매 (예, DMF) 내에서 일어난다. 제3 방법은 중간체 V 내 2-아미노기를 아실기로 보호하는 것이다. 중간체 V는 무수물(예, 아세트산 무수물)과 통상 수시간 동안 환류 하에서 반응시킨다. 용매는 감압 하에 제거될 수 있으며, 조산물은 전술한 바와 같이 POCl₃과의 후속반응을 진행할 수 있다. 염기성 용매(예, 메탄올내 소듐 메톡사이드) 내에서 반응시킴으로써 보호 아실기를 손쉽게 제거할 수 있다.

반응식 2

실험 섹션

중간체 A의 제조.

2,4-디클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린(500 mg, 1.9 mmol) 및 디이소프로필에틸 아민(0.73 mL, 4.2 mmol) 및 아세토니트릴(0.1 mL) 혼합물에 아세토니트릴(5 mL) 내 n-부틸아민(0.19 mL, 1.9 mmol) 용매를 교반하면서 적가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 하루 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 가하고, 유기층을 포화 암모늄 클로라이드 수용액으로 세척하였다. 유기층을 수거하여 마그네슘 설페이트상에서 건조하였다. 고체를 여과로 수거하여 조산물 A를 수득하고, 그대로 다음 단계에서 사용하였다.

1 화합물의 제조

중간체 A(0.5 g, 1.7 mmol)를 메탄올(15 mL) 내 7N 암모니아와 함께 20 mL 압력 용기 내에 넣고, 여기에 CuO(242 mg, 1.7　mmol)를 가하였다. 용기를 밀봉하고 혼합물을 130℃로 가열하고 18 시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각하였다. 고체를 여과로 제거하고 여액의 용액을 감압 하에 제거하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그라피(Vydac Denali C18 column 10㎛, 250g, 5cm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)로 정제하였다.

9의 제조

단계 1. 마그네틱 교반 막대를 구비한 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 메틸 2-아미노-6-메톡시벤조에이트(25 g, 149.6 mmol), 에탄올(200 mL), 시아나미드(9.43 g, 224 mmol) 및 진한 HCl(6 mL)을 넣었다. 혼합물을 환류하에 6 시간 동안 교반하였다. 1시간 간격으로, 진한 HCl(0.5 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 고체 V-1을 여과로 분리하고 에탄올로 세척하였다.

LC-MS m/z = 192(M+H).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 3.88 (s, 3 H), 6.96 (dd, J=8.2, 3.1 Hz, 2 H), 7.69 (t, J=8.3 Hz, 1 H), 8.28 (br. s., 2 H), 12.67 (br. s., 1 H)

단계 2.

50 mL 바이알에 V-1(250 mg, 1.24 mmol), 무수 DMF(5 mL), DBU(0.6 g, 3.73 mmol) 및 BOP(659 mg, 1.49 mmol)을 넣었다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, n-부틸아민(287 mg, 3.73 mmol)을 가하고, 반응액을 실온에서 15 시간 동안 교반하였다. 용매의 부피를 줄이고 잔류물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 10% 메탄올 구배를 사용한 실리카 칼럼 크로마토그라피로 정제하였다. 최상 분획들을 모아 용매를 감압하 제거하여 9를 수득하였다.

하기 중간체를 V-1 제조 방법에 따라 제조하였다.

LC-MS m/z = 240/242

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 3.09 - 3.55 (m, 2 H), 7.09 (br. s., 1 H), 7.26 (dd, J=7.9, 1.3 Hz, 1 H), 7.37 - 7.48 (m, 2H)

LC-MS m/z = 196(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 7.00 (br. s., 2 H) 7.13 (d, J=7.78 Hz, 1 H) 7.18 (d, J=8.28 Hz, 1 H) 7.50 (t, J=8.03 Hz, 1 H), 페놀 프로톤은 관찰되지 않았다.

LC-MS m/z = 176(M+H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 6.98 (dd, J=11.0, 8.3 Hz, 1 H), 7.13 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.51 (br. s., 2 H), 7.64 (td, J=8.3, 5.8 Hz, 1 H), 12.30 (br. s, 1　H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

LC-MS m/z = 239/241(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 7.32 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.49 (s, 2 H), 7.71 (br. s., 1 H), 7.81 (dd, J=8.6, 2.4 Hz, 1 H), 8.00 (d, J=2.4 Hz, 1 H)

LC-MS m/z = 192(M+H)

LC-MS m/z = 176(M+H)

V-22

LC-MS m/z = 180(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 7.01 - 7.16 (m, 2 H), 7.56 (br. s., 2 H), 7.99 (t, J=7.7 Hz, 1 H), 10.38 - 13.48 (m, 1 H)

LC-MS m/z = 196(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 7.41 (dd, J=8.5, 2.0 Hz, 1 H), 7.55 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 7.98 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 8.49 (br. s., 2 H), 10.79 - 13.69 (m, 1　H)

LC-MS m/z = 176(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 2.43 (s, 3 H), 7.22 (d, J=1.0 Hz, 1 H), 7.24 (s, 1 H), 7.89 (d, J=8.0 Hz, 1 H), 8.29 (br. s., 2 H), 12.65 (br. s, 1 H)

LC-MS m/z = 192(M+H)

LC-MS m/z = 220(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 3.87 - 3.95 (m, 3 H), 7.12 - 7.47 (m, 1 H), 7.83 (dd, J=8.3, 1.4 Hz, 1 H), 7.99 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 8.07 - 8.13 (m, 1 H), 8.43 (br. s., 2 H)

LC-MS m/z = 198(M+H)

LC-MS m/z = 298(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 3.85 (s, 3 H), 5.10 (s, 2 H), 6.17 (br. s., 2 H), 6.70 (s, 1 H), 7.30 - 7.36 (m, 2 H), 7.40 (t, J=7.4 Hz, 2 H), 7.44 - 7.48 (m, 2 H), 10.82 (br. s., 1 H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 6.51-6.67 (m, 2H), 7.00-7.08(m, 1H), 7.42(ddd, J =11.2, 7.9 1.3Hz, 1H), 7.69 (dd, J=7.9, 0.6Hz, 1H), 11.08 (br. s., 1H)

LC-MS m/z = 196 (M+H)

LC-MS m/z = 176 (M+H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 2.41 (s, 3 H), 7.15 (t, J=7.5 Hz, 1 H), 7.43 (br. s., 2 H), 7.55 (d, J=7.0 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=7.8 Hz, 1 H), 11.17 - 12.49 (m, 1 H)

10의 제조

단계 1. V-6의 제조. 마그네틱 교반 막대를 구비한 50 mL 바이알에 V-3(500 mg, 2.16 mmol), 페닐 보론산(342 mg, 2.8 mmol), 포타슘 카보네이트(1.19 g, 8.62 mmol), 디옥산(5.5 mL), 물(1.8 mL) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(249 mg, 0.215 mmol)을 넣었다. 질소 가스를 10분 동안 반응 혼합물에 넣었다. 바이알을 밀봉하고 130℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고 용매를 감압하에 제거하였다. 조산물을 역상 칼럼 크로마토그라피 (RP Vydac Denali C18 - 10 ㎛, 200 g, 5 cm. 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)로 정제하여 V- 6를 수득하였다.

LC-MS m/z = 238 (M+H)

단계 2. 마그네틱 교반 막대를 구비한 50 mL 바이알에 V-6(148 mg, 0.624 mmol), 무수 DMF(3.5 mL), DBU(0.373 mL, 2.5 mmol), BOP(345 mg, 0.78 mmol), 이후 (S)-2-아미노펜탄올(322 mg, 3.12 mmol)을 넣었다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 휘발물질들을 감압하 제거하고 조산물을 물 및 에틸 아세테이트에 분배시켰다. 유기층들을 합하여 건조(마그네슘 설페이트)하고, 고체를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 감압 하에 제거하였다. 조산물을 역상 칼럼 크로마토그라피(RP SunFire Prep C18 OBD-10㎛, 30 x150 mm. 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)로 정제하여 10을 수득하였다.

11의 제조

단계 1. 마그네틱 교반 막대를 구비한 1L 둥근 바닥 플라스크 내에 V-1 (8.8 g, 46.03 mmol) 및 아세트산 무수물(150 mL)을 넣었다. 플라스크는 환류 콘덴서를 구비하였으며 혼합물은 15 시간 동안 교반하면서 가열 환류하였다. 침전물을 여과로 분리하고 디이소프로필에테르로 세척한 후 진공 건조하여, 백색 고체 V-9를 수득하였다.

LC-MS m/z = 234 (M+H)

단계 2. 마그네틱 교반 막대를 구비한 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내에 V-9(4.5g, 19.3 mmol) 및 아세토니트릴(100 mL)을 넣었다. POCl₃(5.56 mL, 59.8 mmol)를 30분에 걸쳐 적가한 후, DIPEA(10.3 mL, 59.8 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물은 갈색 용액이 되었으며 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1M NaOH(100 mL)에 붓고 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO₄상에서 건조하고, 고체를 여과로 제거하고 여액을 그대로 다음 단계에서 사용하였다.

단계 3. 에틸 아세테이트 내 단계 2에서 얻은 여액을 DIPEA(9.2 mL, 53.6 mmol) 및 n-부틸아민(3.5 mL, 35.8 mmol)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 주변 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 조산물을 디클로로메탄 내에 재구성하고 물로 세척하였다. 유기층을 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 증발 건조하여 오렌지색 고체 V-11을 수득하였다.

LC-MS m/z = 289 (M+H)

단계 4. 30 mL 압력 튜브내에 V-11(2.8 g, 9.71 mmol), 피리딘 하이드로클로라이드(6.73 g, 58.26 mmol) 및 피리딘 (50 mL)을 넣고, 혼합물을 16 시간 동안 120℃로 가열하였다. 피리딘을 감압하에 제거하였다. 조산물을 디클로로메탄/메탄올: 95/5 혼합물에 녹이고, 1N HCl 용액 및 물로 세척하였다. 유기층을 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 감압 하에 제거하여 VI- 1를 수득하였다.

LC-MS m/z = 231 (M-H)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 0.92 (t, J=7.37 Hz, 3 H) 1.33 - 1.43 (m, 2　H) 1.50 - 1.59 (m, 2 H) 3.41 - 3.49 (m, 2 H) 5.79 - 5.88 (m, 1 H) 6.02 (d, J=8.14 Hz, 1 H) 6.91 (br. s., 2 H) 6.99 - 7.04 (m, 1 H) 10.78 (br. s., 1 H) 13.35 (br. s., 1 H)

단계 5. 100mL 플라스크에 VI-1(175 mg, 0.753 mmol), 세슘 카보네이트(0.74 g, 2.26 mmol) 및 DMF(15 mL)를 넣었다. 혼합물을 주변 온도에서 30분 동안 교반하였다. 2-브로모에틸 메틸 에테르(0.089 mL, 0.94 mmol)를 가하고, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 HPLC(RP Vydac Denali C18 - 10 ㎛, 250 g, 5 cm. 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, 메탄올)로 정제하고, 최상 분획들을 모아 용매를 감압 하에 제거하여 11을 고체로 수득하였다.

12의 제조

단계 1. V-2을 DMF(15 mL)에 녹이고, 오일 베쓰 상에서 10분 동안 80℃에서 N₂로 퍼징하였다. 이후 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드(69 mg, 0.098 mmol), 트리페닐포스핀(57.6 mg, 0.22 mmol) 및 요오드화 구리(42.5 mg, 0.22 mmol)를 가하였다. N₂ 퍼징 5분 후, 디에틸아민(3.15 mL, 30.31 mmol)을 가한 후 2-피리딜에틴(168 mg, 1.63 mmol)을 가하였다. 용기를 닫고 반응물을 80℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, 침전을 여과로 분리하고, 물로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 산물을 디클로로메탄 내에서 30분간 교반하였다. 침전물을 여과로 분리하고, 디클로로메탄 및 디이소프로필 에테르로 세척하고, 진공하 50℃에서 건조하여 V-12를 수득하였다.

LC-MS m/z = 263 (M-H)

단계 2. THF(50 mL) 내 V-12(300 mg, 1.15 mmol) 용액에 N₂(g) 대기 하에서 10% Pd/C(100 mg)를 넣었다. 반응 혼합물을 16 시간 동안 실온에서 교반하고, 후속하여 패킹된 데칼라이트 상에 여과하였다. 여액의 용매를 감압 하에 제거하고 조산물 V-13을 수득하고 이를 그대로 다음 단계에서 사용하였다.

LC-MS m/z = 267 (M-H)

단계 3. 9를 제조하는 방법에 따라 실시예 12를 제조하였다.

14의 제조

단계 1. 중간체 VI-2 및 VI- 3를 VI-1 제조 방법에 따라 제조하였다. VI-3는 실온에서 디이소프로필에테르와 함께 교반한 후에 분리하였다.

VI-2 : LC-MS m/z = 337 (M+H)

VI-3 : LC-MS m/z = 379 (M+H)

단계 2. 중간체 V-12 제조 방법에 따라 화합물 14를 제조하였다.

15의 제조

단계 1. 마그네틱 교반 막대를 구비한 500 mL 둥근 바닥 플라스크 내에 3-아미노프탈산 하이드로클로라이드(25 g, 115 mmol), 에탄올(250　mL), 시아나미드 (7.25 g, 172 mmol) 및 진한 HCl (6 mL)을 넣었다. 플라스크는 환류 콘덴서를 구비하였으며, 혼합물을 6시간 동안 환류 교반하였다. 1시간 간격으로, 진한 HCl(0.5 mL)을 유리 피펫으로 가하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 용매를 감압 하에 제거하여 황색 오일을 수득하였다. 조산물을 실리카겔 상에서 건조한 후, 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 10% 메탄올 구배를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 부분 정제하였다. 조산물, 황색 고체 V-14는 그대로 다음 단계에서 사용하였다.

LC-MS m/z = 234 (M+H).

단계 2. 마그네틱 교반 막대를 구비한 100 mL 둥근 바닥 플라스크 내에 V-14(1.7 g, 7.29 mmol), 무수 DMF(25 mL), DBU(3.3 g, 21.87　mmol) 및 PyBOP (4.55 g, 8.75 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반였다. 그 후 n-부틸아민(2.1 g, 29.2 mmol)을 가하고, 혼합물을 15 시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조산물을 디클로로메탄 내 20% 메탄올을 사용한 실리카겔을 통해 여과하였다. 여액의 용매를 감압 하에 제거하고, 조오일(15, 4 g)을 역상 칼럼 크로마토그라피(RP Vydac Denali C18 - 10 ㎛, 200 g, 5 cm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)으로 정제하였다.

16의 제조

메탄올(25 mL) 내 10% Pd/C 현탁액에 N₂ 대기 하에서 화합물 14(111 mg, 0.39 mmol)를 가하였다. 질소 대기를 제거하고 수소 가스로 대체하였다. 혼합물을 실온에서 2 당량의 수소 가스가 소비될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 패킹된 데칼라이트 상에서 여과하였다. 여액의 용매를 감압하에 제거하였다. 조산물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 10% 메탄올 구배를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 정제하여 16을 수득하였다.

18의 제조

17(625 mg, 2.28 mmol)을 무수 THF(10 mL)에 녹였다. LAH(THF내 1 M, 3.42 mL, 3.42 mmol)을 적가하고 반응 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반하였다. LC-MS 결과는 원하는 산물로 완전히 전환되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH₄Cl로 퀀칭하고, 고체를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 제조용 HPLC로 정제하여 산물을 백색 고체로 수득하였다.

19의 제조

DMF (5 mL) 내 VI-2(500 mg, 1.48 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(86 mg, 0.074 mmol) 및 아연 시아나이드(106 mg, 0.89 mmol) 혼합물을 10 mL 튜브에 넣고, 이를 160℃에서 10분 동안 마이크로파 조사하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 진공 농축하였다. 잔류물을 물 및 디클로로메탄에 분배시켰다. 유기층을 분리, 건조(마그네슘 설페이트)하고, 용매를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 진공 농축하였다. 산물을 CH₃CN 내에서 분말화하고, 고체를 여과로 분리하였다. 아실 탈보호는 60℃에서 1시간 동안 메탄올내 소듐 메톡사이드를 처리하여 이루어졌다. 혼합물을 냉각하고 산물이 침전되었다. 백색 고체, 19를 여과로 분리하고 진공 하에서 건조하였다.

20의 제조

마그네틱 교반 막대를 구비하고, 질소 가스로 분무된 50 mL 바이알 내에 VI-3(300 mg, 0.79 mmol)을 넣고, 보론 에스테르(198 mg, 0.95　mmol), 물(3 mL, 가스제거 됨) 및 DME (6 mL, 가스제거 됨), 소듐 바이카보네이트(199 mg, 2.37 mmol) 및 PdCl₂(PPh₃)₂(55 mg, 0.079 mmol)을 가하고, 혼합물을 90℃로 1 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각하고 에틸 아세테이트를 가하였다. 유기층을 분리, 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 10% 메탄올(암모니아 함유) 구배를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 정제하였다. 산물 분획을 수거하고 진공 농축하였다. 아실 탈보호는 60℃에서 1시간 동안 메탄올내 소듐 메톡사이드로 처리로 이루어졌다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 물 및 디클로로메탄에 분배하였다. 유기층을 분리, 건조하고(MgSO₄), 용매를 여과로 제거하고, 여액의 용매를 진공 하에 제거하였다. 산물을 CH₃CN으로부터 결정화하고, 여과로 분리하고 진공 건조하여 백색 고체, 20을 수득하였다.

21의 제조

마그네틱 교반 막대 및 스크류 캡 격막을 구비한 제1 바이알 내에서, 톨루엔 (0.5 mL) 내 Pd₂(dba)₃(6 mg, 0.007 mmol) 및 2-디-t-부틸포스피노-3,4,5,6-테트라메틸-2',4',6'-트리이소프로필-1,1'-바이페닐(6 mg, 0.013 mmol) 용액을 N₂ 가스로 플러싱한 후, 3분간 120℃에서 교반하였다. 마그네틱 교반 막대 및 스크류 캡 격막을 구비한 제2 바이알에 2-메틸이미다졸(104 mg, 1.26 mmol) 및 K₃PO₄ (224 mg, 1.05 mmol), 이후 VI-3(200 mg, 0.53 mmol)를 넣고, 역시 N₂(g)로 플러싱하였다. 미리 혼합한 촉매 용액 이후 무수 톨루엔(0.5 mL) 및 t-부탄올(1.0 mL)을 시린저로 제2 바이알에 가하였다(톨루엔: t-BuOH 1:1 용액 전체 2 mL). 반응물을 120℃로 12 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각하고 소듐 메톡사이드(메탄올 내 30%)를 가하였다. 혼합물을 60℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 진공 농축하였다. 잔류물을 물 및 디클로로메탄에 분배하였다. 유기층을 분리, 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 진공 농축하였다. 조산물을 제조용 HPLC(RP SunFire Prep C18 OBD-10 ㎛,30 x150 mm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)로 정제하였다. 산물 분획을 수거하고 진공 농축하여 화합물 21을 수득하였다.

22의 제조

DMF(10 mL) 내 VI-2(500 mg, 1.48 mmol), 트리부틸(1-에톡시비닐)주석 (0.626 mL, 1.85 mmol), PdCl₂(PPh₃)₂(220 mg, 0.31 mmol) 혼합물을 16 시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고 HCl(1N, 2 mL)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 후 포화 수성 NaHCO₃(100 mL)에 붓고 침전을 여과로 분리하고, 디클로로메탄 내에 재구성, 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 진공 농축하였다. 산물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 5% 메탄올 구배를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 정제하고, 산물 분획을 수거하여 진공 농축하였다. 산물을 DIPE 내에서 분말화, 여과 및 진공 건조하여 연한 황색 고체가 되었다.

혼합물에 메탄올(6 mL) 및 소듐 메톡사이드(0.716 mL)를 가하고 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각하고 진공 농축하였다. 잔류물을 물 및 디클로로메탄에 분배하였다. 유기층을 분리, 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 진공 농축하였다. 산물을 DIPE 내에서 분말화하고, 여과로 분리하고 진공 건조하여 황색 고체, 22가 되었다.

23의 제조

22(59 mg, 0.23 mmol)를 메탄올(2 mL)에 현탁하고 소듐 보로하이드라이드(9 mg, 0.23 mmol)를 가하였다. 혼합물을 N₂(g)하에서 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄(5 mL)으로 희석한 후, 포화 수성 NH₄Cl(0.5 mL)를 가하고, 그 후 NaHCO₃를 가하였다. 유기층을 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 진공 농축하였다. 산물을 DIPE 내에서 분말화하고, 여과로 분리하고 진공 건조하여 황색 고체, 23이 되었다.

24의 제조

단계 1. 75 mL 스텐레스 스틸 오토클레이브내에 질소 대기하에서 VI-2(626 mg, 1.87 mmol), Pd(OAc)₂ (8 mg, 0.037 mmol), 1,3-비스(디페닐포스피노)프로판(31 mg, 0.074 mmol), 포타슘 아세테이트(364 mg, 3.71 mmol), THF(20 mL), 및 메탄올 (20 mL)을 넣었다. 오토클레이브를 닫고 30바 CO(g)로 가압하였다. 반응 혼합물을 16 시간 동안 120℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 진공 농축하였다. 잔류물을 물에 녹이고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 건조하고(MgSO₄), 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 진공 농축하였다. 산물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄 내 5% 메탄올 구배를 사용한 실리카 칼럼 상에서 정제하였다. 산물 분획을 수거하고 진공 농축하여 회백색 고체, VI-4를 수득하였다.

단계 2. 무수 THF(20 mL) 내 VI-4(190 mg, 0.69 mmol) 용액에 LAH(THF 내 1M, 1.04 mL, 1.04 mmol)를 질소 대기하 -75℃에서 가하였다. 반응물을 0℃로 천천히 가온하면서, 2 시간 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 얼음-에탄올 베쓰상에서 냉각하고, 조심스럽게 15 mL 에틸 아세테이트, 이후 Na₂SO₄ 10H₂O(2 g)를 가하여 퀀칭하였다. 혼합물을 한 시간 동안 교반한 후 MgSO₄상에서 건조하고, 고체를 여과로 제거하고 여액의 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 제조용 HPLC(RP Vydac Denali C18-10 ㎛, 200 g, 5 cm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃CN)로 정제하고, 이후 SFC 정제(Chiralpak Diacel AD 30 x 250 mm, 이동상: CO₂, 메탄올과 0.2% 이소프로필아민)하여, 원하는 분획을 수거하고, 용매를 감압 하에 제거하여 24를 수득하였다.

25의 제조

단계 1. 화합물 14 제조 방법에 따라, V-14를 트리메틸아세틸렌과 반응시켜 V-15를 수득하였다.

LC-MS m/z = 258 (M+H)

단계 2. 화합물 9 제조 방법에 따라 VI-5를 제조하였다. TMS기의 탈보호는 NaHCO₃, 물 및 메탄올 혼합물에서 수행되었다.

LC-MS m/z = 357(M+H)

단계 3. 수소화는 16 제조 방법에 따라 수행되었다.

26의 제조

단계 1. 110℃에서 반응을 진행하는 것을 제외하고는 VI-4 제조 과정에 따라 2-브로모-4-이소프로필아닐린의 팔라듐 촉매된 카보닐화를 수행하여 2-아미노-5-이소프로필 벤조산을 수득하였다.

LC-MS m/z = 180 (M+H)

단계 2. V-1 제조 방법에 따라 V- 16를 제조하였다.

LC-MS m/z = 204(M+H)

단계 3. 15 제조 방법에 따라 실시예 26을 제조하였다.

27의 제조

단계 1. 시아나미드를 에테르에 녹이고 혼합물을 질소 가스하에서 교반하였다. HCl(에테르 내 2M)을 반응 혼합물에 주변 온도에서 적가하고, 실온에서 2시간 동안 계속 교반하였다. 침전물, A-2를 여과로 분리하고 50℃에서 진공 건조하였다.

단계 2. SO₂(CH₃)₂(20.4 g, 217 mmol)를 가열하여 용융시켰다. A-2(3.3 g, 29　mmol)를 가하고 생성 혼합물을 교반하고 120℃로 가열하여 완전히 녹였다. 메틸 5-(2-클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)안트라닐레이트(5 g, 14.5 mmol)를 일부 반응 혼합물에 가하였다. 30분간 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 물(10 mL)로 처리하고 10분 동안 교반하였다. 침전물 V-17, 백색 고체를 여과로 분리하고 진공 오븐 내에서 건조하였다.

LC-MS m/z = 356 (M+H)

단계 3. 15 제조 방법에 따라 화합물 27을 형성하였다.

28의 제조

단계 1. A-3(101 g, 0.44 mol)를 황산(850 mL)에 녹이고 이 용액을 0℃로 냉각하였다. 황산 (200 mL) 내 HNO₃(18.3 mL, 0.44 mol)을 2 시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 45분 간 -10℃에서 교반한 후, 얼음-물(6 L)에 부었다. 용매를 따라내고 잔류물을 디클로로메탄(1.5 L)에 녹였다. 수층을 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하였다. 유기층을 합하여 건조(MgSO₄)하고, 고체를 여과로 제거하고 용매를 감압 하에 제거하여 A-4 및 부산물 이성체 A-5를 수득하고, 헵탄 내지 에틸 아세테이트 구배를 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 분리하였다.

단계 2. 마그네틱 교반 막대를 구비하고 질소 가스로 분무된 500 mL 삼각 플라스크 내에 메탄올(100 mL, 2% 티오펜 함유), 5% Pt/C(2 g, 0.513 mmol)을 넣고 수소 대기하에 두었다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과로 제거하고 여액의 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 내지 디클로로메탄:메탄올 9:1 구배를 사용하는 실리카 상에서 정제하여 황색 오일, IV-2를 수득하였다.

LC-MS m/z = 244 (M+H)

단계 3. V-17 제조 방법에 따라 중간체 V- 18를 제조하였다.

LC-MS m/z = 254 (M+H)

단계 4. 화합물 9의 제조 과정을 적용하여 V-18으로부터 28을 합성하였다.

화합물 29의 제조

단계 1. 실시예 29는 25 제조에 기술된 방법에 따라 27을 촉매 수소화하여 수득하였다.

90의 제조

단계 1. 17(12.515 g, 45.62 mmol)를 THF(100 mL)에 녹였다. 물(20 mL)에 녹인 LiOH(3.83　g, 91.2 mmol), 이후 메탄올(50 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 고체를 물로 세척하고, DIPE로 분말화하여 VI- 6를 회백색 고체로 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆) δ ppm 0.95 (t, J=7.4 Hz, 3 H), 1.40 (dq, J=14.9, 7.3 Hz, 2 H), 1.68 (quin, J=7.3 Hz, 2 H), 3.54 - 3.65 (m, 2 H), 7.89 - 8.05 (m, 2 H), 8.14 - 8.31 (m, 2 H), 9.11 (br. s., 1 H), 11.10 (br. s., 1 H), 16.37 (br. s., 1 H)

단계 2. 50 mL 바이알 내에 VI-6(200 mg, 0.768 mmol), DMF(10 mL), 트리에틸아민(0.641 mL, 4.61 mmol), 3-아미노피리딘(181 mg, 1.92 mmol) 및 디에틸 시아노포스포네이트(0.233 mL, 1.54 mmol)를 넣었다. 반응물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 조산물을 역상 칼럼 크로마토그라피(Sunfire Prep C18, OBD 10μm, 30 x 150 mm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, 메탄올)로 정제하여 90을 수득하였다.

AA -9 제조를 위한 합성 반응식

중간체 AA -3의 합성

THF(1 L) 내 발레르알데하이드(43 g, 500 mmol) 용액에 AA -2(200 g, 532 mmol)를 가하고 반응 혼합물을 16 시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 석유 에테르 내에 희석하고 여과하였다. 여액의 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류물을 석유 에테르 내지 석유 에테르내 3% 에틸 아세테이트 구배를 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여 AA - 3(90 g)를 무색 오일로 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 6.81-6.77 (m, 1H), 5.68-5.64 (td, J=1.2Hz, 15.6 Hz, 1H), 2.11-2.09 (m, 2H), 1.406 (s, 9H), 1.38-1.26(m, 4H), 0.85-0.81(t, J=7.2Hz, 3H).

화합물 AA -5의 합성

n-부틸 리튬(290mL, 725mmol, 1.5eq.)을 THF(800 mL) 내 AA-4(165 g, 781 mmol) 교반 용액에 -78℃에서 가하였다. 반응 혼합물을 30 분간 교반한 후 THF (400 mL) 내 AA-3(90 g, 488.4 mmol)를 가하고 반응액을 2 시간 동안 -78℃에서 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 NH₄Cl 용액로 퀀칭하고 실온으로 데웠다. 산물을 에틸 아세테이트 및 물 간에 분배시켰다. 유기상을 소금물로 세척하고 건조 및 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 내 5% 에틸 아세테이트로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일, AA -5(132 g)를 얻었다.

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.36-7.16 (m, 10H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.43-3.39 (d, J=15.2Hz, 1H), 3.33-3.15 (m, 1H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.47-1.37 (m, 2H), 1.32 (s, 9H), 1.26-1.17 (m, 7H), 0.83-0.79 (t, J=7.2Hz, 3H).

AA -6의 합성

AA-5(130 g, 328 mmol)를 THF(1.5 L)에 녹이고 LAH(20 g, 526　mmol)를 소량으로 0℃에서 첨가하였다. 생성 혼합물을 동일 온도에서 2 시간 동안 교반한 후 실온으로 데웠다. 혼합물을 포화 수성 NH₄Cl 용액으로 퀀칭하였다. 산물을 에틸 아세테이트 및 물 간으로 분배하였다. 유기상을 소금물로 세척하고 건조 및 증발시켰다. 합한 유기층을 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 고체를 여과로 제거하고 농축하여 조산물 AA -6(100 g)을 수득하고, 이는 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 7.33-7.14 (m, 10H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.80-3.77 (d, J=13.6Hz, 1H), 3.63-3.60 (d, J=13.6Hz, 1H), 3.43-3.42 (m, 1 H), 3.15-3.10 (m, 1H), 2.70-2.63 (m, 2H), 1.65-1.28 (m, 10H), 0.89-0.81 (m, 3H).

AA -9의 합성

메탄올(200 mL)내 AA-6(38 g, 116.75 mmol) 및 10% Pd/C 용액을 50 PSI 수소하 50℃에서 24 시간 동안 수소화 하였다. 반응 혼합물을 여과하고 용매를 증발하여 조산물 AA - 7(17 g)를 얻었다.

조산물을 디클로로메탄(200 mL)에 녹이고, 트리에틸아민(26.17 g, 259.1 mmol) 및 디-tert-부틸 디카보네이트(84.7 g, 194.4 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄 및 물 간에 분배하였다. 유기상을 소금물로 세척하고 건조 및 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르내 20% 에틸 아세테이트를 용리하는 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 AA-8(13 g)를 무색 오일로 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 4.08-4.03 (br, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.20-2.90(br, 1H), 1.80-1.73 (m, 1H), 1.42-1.17 (m, 15 H), 0.85-0.82(t, J=6.8Hz, 3H).

AA-8(42 g, 0.182 mol)를 디옥산(200 mL)에 녹이고 디옥산/HCl(4M, 200 mL)를 0℃에서 가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발하여 조산물을 수득하였다. 디클로로메탄/석유 에테르 혼합물(50 mL, 1:1, v/v)을 조산물에 가하고, 상등액을 따라내었다. 이 과정을 두 번 반복하여 오일, AA -9 (26.6 g)를 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆ ):δ ppm 8.04 (s, 3H), 3.60-3.49 (m, 2H), 3.16-3.15 (m, 1H), 1.71-1.67 (m, 2H), 1.60-1.55(m, 2H), 1.33-1.26 (m, 4H), 0.90-0.87 (t, J=6.8Hz, 3H).

AA -10의 제조

발레르알데하이드 대신 부티르알데하이드를 사용하여, AA-9의 제조에 따라 AA-10를 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-ｄ ₆): δ ppm 8.07 (s, 3H), 4.85 (br, 1H), 3.57-3.45 (m, 2H), 3.14-3.12 (m, 1H), 1.70-1.64 (m, 2H), 1.56-1.49 (m, 2H), 1.38-1.30 (m, 2H), 0.90-0.80 (t, J=6.8Hz, 3H).

[표 1]

화학식 (I)의 화합물

분석 방법.

모든 화합물들은 LC-MS에 의해 특성화되었다. 하기 LC-MS 방법이 사용되었다:

방법 A. 역상 UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피)를 가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드(BEH) C18 컬럼(1.7　㎛, 2.1 x 50　mm; Waters Acquity)상에서 0.8 ml/분의 유속으로 수행하였다. 두 개의 이동상(H₂O 내 10 mM 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 95/5; 이동상 B: 아세토니트릴)을 사용하여 1.3 분에 95% A 및 5% B 부터 5% A 및 95% B까지의 구배 조건을 주고 0.7 분간 유지시킨다. 0.75 ㎕의 주입 용적이 사용되었다. 콘 전압은 포지티브 이온화 모드의 경우 30 V이고 네거티브 이온화 모드의 경우 30 V이었다.

방법 B. 역상 HPLC는 Xterra MS C18 칼럼(3.5㎛, 4.6 x 100　mm)상에서 1.6 mL/분의 유속으로 수행하였다.

세 개의 이동상(이동상 A: 95% 25　mM 암모늄아세테이트 + 5 % 아세토니트릴; 이동상 B: 아세토니트릴; 이동상 C: 메탄올)을 사용하여 6.5 분에 100% A 부터 50% B 및 50% C, 0.5분에 100% B, 1분에 100% B 까지의 구배 조건을 수행하고 1.5분간 100% A로 다시 평형화시킨다. 10 ㎕의 주입 용적을 사용하였다.

방법 C. 역상 UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피)를 가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드(BEH) C18 컬럼(1.7　㎛, 2.1 x 50　mm; Waters Acquity)상에서 0.8 ml/분의 유속으로 수행하였다. 두 개의 이동상(이동상 A: H₂O 내 10mM 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 95/5; 이동상 B: 아세토니트릴)을 사용하여 1.3 분간 95 % A 및 5% B부터 5% A 및 95% B 까지의 구배 조건을 수행하고 0.2 분간 유지하였다. 0.5 ㎕의 주입 용량을 사용하였다.

화학식 (I) 화합물의 생물학적 활성

생물학적 어세이의 기술

TLR7 및 TLR8 활성 평가

화합물의 인간 TLR7 및/또는 TLR8을 활성화시키는 능력을 TLR7 또는 TLR8 발현 벡터 및 NF_К-luc 리포터 구축체로 일시적으로 트랜스펙션한 HEK293 세포를 사용하여 세포 리포터 어세이에서 평가하였다. 일 예로 TLR 발현 구축체는 각 야생형 서열 또는 TLR의 두번째 루이신-풍부 반복체에서 결실을 포함하는 돌연변이 서열을 발현한다. 이러한 돌연변이 TLR 단백질은 작용제 활성화에 더 높은 감수성을 보인다(US 7498409).

간략하게, HEK293 세포를 배양 매질(10% FCS 및 2 mM 글루타민으로 보충한 DMEM)에서 성장시켰다. 10 cm 접시에서 세포를 트랜스펙션하기 위해, 세포를 트립신-EDTA로 분리시키고, CMV-TLR7 또는 TLR8 플라즈미드(750 ng), NF_К-luc 플라즈미드(375 ng) 및 트랜스펙션 시약의 혼합물로 트랜스펙션하고 습윤한 5% CO₂ 대기에서 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후 트랜스펙션된 세포를 트립신-EDTA로 분리시키고, PBS에서 세척하고 매질 내 1.67 x 10⁵ 세포 /mL의 밀도로 재현탁하였다. 이후 4% DMSO 내 화합물 10 μ30 마이크로리터의 세포를 분배하였다. 그 후 37℃, 5% CO₂에서 6 시간 인큐베이션하고,15 ㎕의 스테디 라이트 플러스 기질(Perkin Elmer)을 각 웰에 가하고 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마져(Perkin Elmer) 상에서 판독하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 사중으로 수행된 측정으로부터 용량 반응 곡선을 생성하였다. 각 화합물에 대해 최저효과농도(LEC)값을 결정하였으며, LEC는 어세이의 표준편차 위로 적어도 두 배의 효과를 유발하는 농도로 정의된다.

화합물 독성은 384-웰 플레이트에서 CMV-TLR7 구축체 단독(1.67 x 10⁵ 세포/mL)으로 트랜스펙션된 세포 웰 당 30μＬ로 유사한 일련의 희석 화합물을 사용하여 병렬로 측정하였다. 웰당 15μＬ의 ATP 라이트(Perkin Elmer)를 가하고 37℃, 5% CO₂에서 6 시간 인큐베이션한 후ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마져(Perkin Elmer) 상에서 판독하여 세포 생육성을 측정하였다.데이터는 CC₅₀으로 보고되었다.

HCV 리플리콘 복제 억제

인간 TLR7 활성화는 인간 혈액에 존재하는 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 의한 확고한 인터페론 생성을 결과한다. 인터페론을 유도하는 화합물의 잠재력은 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 조건화된 매질과 인큐베이션할 때 HCV 리플리콘 시스템에서의 항바이러스 활성을 관찰하여 평가되었다. HCV 리플리콘 어세이는 비시스토론(bicistronic) 발현 구축체에 기초한 것으로, 이는 Krieger et al. (Journal of Virology (2001) 75: 4614-4624)에 의한 변경과 함께 Lohmann et al. (Science (1999) 285: 110-113; Journal of Virology (2003) 77: 3007-15 3019)에 의해 기술된 바와 같다. 어세이는 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(EMCV)로부터의 내부 리보좀 유입 부위(IRES)에서 번역된 HCV 타입 1b 의 야생형 NS3-NS5B 영역, 선행하는 리포터 유전자(개똥벌레-루시퍼라제) 및 선택적 마커 유전자(neoR, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제)를 포함하는 비시스트로닉 발현 구축제를 인코딩하는 RNA를 포함하는 안정하게 트랜스펙션된 세포주 Huh-7 luc/neo을 사용하였다. 구축체는 HCV 타입 1b 유래 5'및 3' NTR(비-번역 영역)이 측면에 배치된다. G418(neoR) 존재 하에서 리플리콘 세포의 계속적인 배양은 HCV RNA의 복제에 의존한다. HCV RNA를 자체적으로 고수준으로 복제하는 특히 이중에서도 루시퍼라제를 인코딩하는 안정하게 트랜스펙션된 리플리콘 세포들이 조건화된 세포 배양 매질의 프로파일링에 사용되었다.

간략하게, PBMC는 표준 피콜 원심분리 프로토콜을 사용하여 적어도 두 도너의 버피코트로부터 제조하였다. 분리된 PBMC들을 10% 인간 AB 세럼으로 보충한 RPMI 매질내에 재현탁하고, 2 x 10⁵ 세포/웰을 화합물(전체 용적 70μＬ)을 함유하는 384-웰 플레이트내로 분배하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 10μＬ의 상등액을 30 μ³ 리플리콘 세포/웰을 함유하는 384-웰 플레이트내로 옮겼다. 후속하여 24 시간 동안 인큐베이션하고, 40μＬ/웰 스테디 라이트 플러스 기질(Perkin Elmer)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 어세이하고 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마져(Perkin Elmer)로 측정하여 복제를 측정하였다. Huh7-luc/neo 세포에 대한 각 화합물의 저해 활성은 EC₅₀ 값으로 보고하였으며, 이는 루시퍼라제 활성의 50% 감소를 결과하는 PBMC에 적용된 화합물 농도로 정의되며, 차례로 정의된 함량의 PBMC 배양 매질의 이송에 리플리콘 RNA의 복제 정도를 나타낸다. 재조합 인터페론 α-2a(Roferon-A)를 표준 대조 화합물로서 사용하였다.

화학식 (I) 화합물의 생물학적 활성. 모든 화합물들은 전술한 HEK 293 TOX 어세이에서 24 μ₅₀을 나타내었다.

ISRE 프로모터 요소의 활성화

IFN-I 를 유도하는 화합물의 잠재력은 또한 PBMC로부터의 조건화된 매질에 의해 인터페론-자극된 반응성 요소(ISRE)의 활성화를 측정함으로써 평가되었다. 서열 GAAACTGAAACT의 ISRE 요소는 IFN-I의 그 수용체 IFNAR(클론테크, PT3372-5W)에 대한 결합에 의해 활성화된 STAT1-STAT2-IRF9 전사 인자에 매우 반응성이다. 클론테크(ref. 631913)로부터의 플라즈미드 pISRE-Luc는 5 카피의 ISRE 요소를 포함하고, 개똥벌레 루시퍼라제 ORF가 후속하였다. pISRE-Luc(HEK-ISREluc)로 안정하게 트랜스팩션된 HEK293 세포주는 조건화된 PBMC 세포 배양 매질의 프로파일로 수립되었다.

간략하게, PBMC는 표준 피콜 원심분리 프로토콜을 사용하여 적어도 두 도너의 버피코트로부터 제조하였다. 분리된 PBMC들을 10% 인간 AB 세럼으로 보충한 RPMI 매질내에 재현탁하고, 2 x 10⁵ 세포/웰을 화합물(전체 용적 70μＬ)을 함유하는 384-웰 플레이트내로 분배하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 10μＬ의 상등액을 30 μ³ HEK-ISREluc 세포/웰을 함유하는 384-웰 플레이트내로 옮겼다. 후속하여 24 시간 동안 인큐베이션하고, 40μＬ/웰 스테디 라이트 플러스 기질(Perkin Elmer)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 어세이하고 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마져(Perkin Elmer)로 측정하여 ISRE 요소의 활성화를 측정하였다. HEK-ISREluc 세포에 대한 각 화합물의 자극 활성은 어세이의 표준 편차 위로 적어도 두배의 루시퍼라제 활성을 결과하는 PBMC에 적용된 화합물 농도로 정의되는 LEC 값으로 보고하였다. LEC 값은 차례로 정의된 함량의 PBMC 배양 매질의 이송에 ISRE 활성화 정도를 나타낸다. 재조합 인터페론α-2a(Roferon-A)를 표준 대조 화합물로서 사용하였다.

주어진 화합물에 대해, 이 어세이에서 수득된 LEC 값은 "HCV 복제 억제 어세이"에서 수득된 EC₅₀값과 동일한 범위 내 이었다. 따라서 두 어세이 중 어느 것에 의해서 측정된, PBMC에 의해 IFN-I를 유도할 수 있는 화합물의 잠재력을 비교할 수 있다.

* 분석은 48 시간에 시행하였다

Claims

하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 제조방법:

상기 식에서,
R₁은 하이드록실로 치환된 C_4-8알킬이고;
R₂는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1-7알킬, C_1-7알킬아미노, C_1-6알콕시 또는 (C_1-4)알콕시-(C_1-4)알킬이고;
R₃는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1-7알킬, C_1-7알케닐, C_1-7알키닐, C_1-7알킬아미노, C_1-6알콕시 또는 (C_1-4)알콕시-(C_1-4)알킬이고;
R₄는 수소, 할로겐, 하이드록실, 아민, C_1-7알킬, C_1-7알킬아미노, C_1-6알콕시 또는 (C_1-4)알콕시-(C_1-4)알킬이고;
R₅는 수소, 불소, 염소 또는 메틸이고;
단, R₂, R₃, R₄ 및 R₅가 모두 H일 수는 없으며;
상기 제조방법은
a-1) 화학식 (A-1)의 화합물을 산 및 시안아미드(cyanamide)와 반응시켜 화학식 (B-1)의 화합물을 형성하는 단계; 및

상기 식에서, R₆은 H 또는 Me이며;
b-1) 상기 화학식 (B-1)의 화합물을 염기, 커플링제 및 R₁-NH₂와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하거나,
또는 상기 제조방법은
a-2) 화학식 (A-2)의 화합물을 염기 및 R₁-NH₂와 반응시켜 화학식 (B-2)의 화합물을 형성하는 단계; 및

;
b-2) 상기 화학식 (B-2)의 화합물을 NH₃ 및 구리 촉매제와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.
제1항에 있어서, 단계 (a-1)의 산이 HCl인 제조방법.
제1항에 있어서, 단계 (b-1)의 염기가 DBU인 제조방법.
제1항에 있어서, 단계 (b-1)의 커플링제가 BOP 또는 PYBOP인 제조방법.
제1항에 있어서, 단계 (a-2)의 염기가 DIPEA인 제조방법.
제1항에 있어서, 단계 (b-2)의 구리 촉매가 CuO인 제조방법.
제1항에 있어서, R₆이 H인 제조방법.
제1항에 있어서, R₆이 Me인 제조방법.
제1항에 있어서, R₁이 하기로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인 제조방법:

.
제1항에 있어서, R₅가 수소 또는 불소인 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인 제조방법:
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 화합물인 제조방법:

.