KR102048780B1

KR102048780B1 - Ror-감마-t를 억제하는데 유용한 화합물

Info

Publication number: KR102048780B1
Application number: KR1020187006254A
Authority: KR
Inventors: 존 리차드 모피
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2019-11-27
Also published as: CA2994732C; EA201890364A1; CY1122287T1; SV2018005647A; US20170066781A1; MY195903A; NZ739518A; CA2994732A1; BR112018001451A2; MD3347360T2; DK3347360T3; IL257202A; ES2760992T3; WO2017044410A1; JP2018507203A; HRP20192235T1; PT3347360T; PL3347360T3; JO3638B1; HK1249901B

Abstract

본 발명은 신규 ROR 감마-t 억제제 및 그의 제약 조성물을 제공한다.

Description

ROR-감마-T를 억제하는데 유용한 화합물

본 발명은 레티노산 수용체-관련 고아 수용체 감마-t (RORγt)를 억제하는데 유용한 화합물, 제약 조성물, 및 RORγ 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

레티노산 수용체-관련 고아 수용체 (ROR)는 많은 질환에서 중요한 병리학적 조절제로 확인된 핵 수용체 (NR) 슈퍼패밀리의 구성원이다. ROR 서브패밀리는 RORα, RORβ, 및 RORγ로 이루어진다. 마우스 및 인간 RORγ 유전자는 2개의 이소형, γ1 및 γ2를 생성하며, 후자는 가장 일반적으로 γt로서 지칭된다. RORγt 신호전달은, 종종 IL-23/IL-23 수용체 신호전달에 반응하여, 고전적 Th1 및 Th2 세포와 구별되는 T-세포 지정된 Th17의 하위세트 내로 나이브 CD4+ T-세포의 분화를 필요로 하며, 그의 유지를 지지한다. Th17 세포는 인터류킨-17A (IL-17) 및 IL-17F를 생성한다. 게다가, Th17 세포는 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터류킨-6 (IL-6), GM-CSF, CXCL1 및 CCL20을 포함한 염증 반응을 구동하는 것으로 알려진 다른 인자의 범위를 생성한다. NK 세포 및 선천성 림프성 세포 예컨대 림프성 조직 유도인자 (LTi)-유사 세포는 IL-23 수용체 및 RORγt를 발현하고 자극에 반응하는 IL-17 및 IL-23을 생성한다. IL-23-반응성, RORγt, 및 IL-17-발현 세포는 자가면역 질환 (AI), 염증성 질환, 및 암과 연관된다는 실질적인 증거가 있다. 따라서, RORγt의 표적화된 억제는 그러한 질환의 발병기전을 감소시키는데 중요할 수 있다.

AI 질환은 현재 치유법이 존재하지 않는 만성 상태이다. AI 질환의 치료는 전형적으로 항염증, 항통증 또는 면역억제 의약을 투여함으로써 질환의 과정을 제어하고 증상을 감소시키기 위한 시도를 수반한다. 불행하게도, 항염증 및 항통증 의약의 사용은 때때로 비효과적이고 면역억제제의 사용은 종종 파괴적인 장기 부작용으로 이어진다. 면역억제 약물의 가장 유의한 부작용은 감염의 증가된 위험 및 암의 더 높은 위험이다.

RORγt에 대한 천연 및 합성 리간드는 확인된 바 있다. RORγt에 대한 소분자 억제제는 AI에 대한 문헌에서 보고된 바 있다. WO 2015/017335 및 WO 2014/179564를 참조한다. 그러나, 현행 치료의 비효과성 또는 파괴적인 부작용과 연결된 AI 질환의 유병률은 환자에게 이용가능한 더 많은 치료 선택을 요구한다. RORγt를 표적화하는 것은 병원성 면역 세포를 표적화하여 치료 이익을 극대화하면서 숙주 방어의 억제 위험을 최소화함으로써 현행 AI 요법보다 이점을 제공할 수 있다.

본 발명은 RORγt 억제제인 신규 화합물을 제공한다. 이러한 신규 화합물은 포도막염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 이식편 대 숙주 질환, 크론병, 다른 염증성 장 질환, 암, 건선, 및 혈청음성 척추관절증, 예컨대 축성 척추관절염, 강직성 척추염, 및 건선성 관절염의 강력하고 유효한 치료에 대한 필요성을 해결할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 또한 건선의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 건선의 치료 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 혈청음성 척추관절증의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 혈청음성 척추관절증의 치료 방법을 제공한다. 상기 실시양태에서, 혈청음성 척추관절증은 축성 척추관절염, 강직성 척추염 또는 건선성 관절염이다.

본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 건선의 치료를 위한 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합하여 포함하는 혈청음성 척추관절증의 치료를 위한 제약 조성물을 제공한다. 상기 실시양태에서, 혈청음성 척추관절증은 축성 척추관절염, 강직성 척추염 또는 건선성 관절염이다.

추가로, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, 특히 건선의 치료를 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한 추가로, 본 발명은 건선의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 건선의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, 특히 혈청음성 척추관절증의 치료를 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한 추가로, 본 발명은 혈청음성 척추관절증의 치료에서 사용하기 위한, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 혈청음성 척추관절증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 상기 실시양태에서, 혈청음성 척추관절증은 축성 척추관절염, 강직성 척추염 또는 건선성 관절염이다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법을 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" (또는 "치료한다" 또는 "치료")은 기존 증상, 상태, 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지, 또는 역전시키는 것을 지칭한다.

용어 "척추관절증"은 일반적으로 척주, 및 인대 및 건이 골에 부착하는 부위를 수반하는 다수의 만성 관절 질환을 지칭한다. 척추관절증은 때때로 또한 척추관절병증 또는 척추관절염으로 불린다.

용어 "혈청음성"은 류마티스 인자에 대해 음성인 질환을 지칭한다.

본 발명의 화합물은 반응하여 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하는 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2^nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

통상의 기술자는, (I)에 제시된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 하기 *에 의해 나타내어지는 바와 같이 적어도 2개의 키랄 중심을 함유하는 코어로 구성됨을 인지할 것이다.

비록 본 발명이 모든 개별 거울상이성질체 뿐만 아니라, 라세미체를 포함한 이러한 화합물의 거울상이성질체의 혼합물을 고려할지라도, 본 발명의 바람직한 화합물은 하기 (II) 또는 그의 제약상 허용되는 염에 의해 나타내어진다.

통상의 기술자는 또한 모든 키랄 중심에 대한 칸-인골드-프렐로그 (R) 또는 (S) 지정이 특정한 화합물의 치환 패턴에 따라 달라다는 것을 인지할 것이다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 시약으로 시작하여 또는 입체선택적 또는 입체특이적 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 본 발명의 화합물의 합성 중 임의의 편리한 시점에서 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 화합물의 단일 거울상이성질체는 본 발명의 바람직한 실시양태이다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)]을 참조한다. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 보다 특히 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 하기 화합물, (5'S)-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-2'-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 하기 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일당 용량은 약 1 ㎎ 내지 1 g의 범위 내에 포함된다. 일부 경우에 상기 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 매우 적합할 수 있는 한편, 다른 경우에도 보다 더 큰 용량이 유리한 이익/위험 프로파일을 유지하면서 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 포함한 관련 상황에 비추어 의사에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다.

개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 화학식 I의 화합물의 합성에서의 임의의 편리한 지점에서, 방법 예컨대 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피에 의해 분리되거나 분할될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 명칭 "이성질체 1" 및 "이성질체 2"는 키랄 크로마토그래피로부터 각각 첫 번째 및 두 번째로 용리되는 화합물을 지칭하며, 키랄 크로마토그래피가 합성 중에 먼저 개시되는 경우에, 동일한 명칭이 후속 중간체 및 실시예에 적용된다.

추가적으로, 본원에 기재된 특정 중간체는 1개 이상의 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 수행될 특정한 반응 조건 및 특정한 변형에 따라 각각의 경우에서 동일하거나 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).

특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "AUC"는 곡선하 면적을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "CFA"는 완전 프로인트 아주반트를 지칭하고; "DBA"는 희석된 갈색 비-아구티를 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DPBS"는 둘베코 포스페이트-완충 염수를 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형된 이글 배지를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EC₅₀"은 절반 최대 반응에서 유효 농도를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "Et₂O"는 에틸 에테르를 지칭하고; "EtOH"는 에틸 알콜 또는 에탄올을 지칭하고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 지칭하고; "Ex"는 실시예를 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "G"는 중력을 지칭하고; "GAL"은 베타-갈락토시다제 DNA 결합 도메인을 지칭하고; "GPI"는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 지칭하고; "HEC"는 히드록시 에틸 셀룰로스를 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산을 지칭하고; "IC₅₀"은 해당 작용제에 대해 가능한 최대한 억제 반응의 50%를 생성한 작용제의 농도를 지칭하고; "IL"은 인터류킨을 지칭하고; "IPA"는 이소프로필 알콜 또는 이소프로판올을 지칭하고; "Kd"는 해리 상수를 지칭하고; "Ki"는 억제 상수를 지칭하고; "MeOH"는 메틸 알콜 또는 메탄올을 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "Prep"는 제조예를 지칭하고; "RAR"은 레티노산 수용체를 지칭하고; "RPMI"는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)를 지칭한다. "R_t"는 체류 시간을 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭한다.

본 발명의 화합물, 또는 그의 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되어 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다. 하기 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.

하기 제조예 및 실시예는 추가로 본 발명을 설명하고 본 발명의 화합물의 전형적 합성을 제시한다.

제조예 및 실시예

제조예 1

1-(3-티에닐)프로판-2-온

아세트산 무수물 (87.9 mL, 913 mmol) 중 2-(3-티에닐)아세트산 (26.5 g, 146.5 mmol)을 현탁하고 1-메틸이미다졸 (7.57 g, 91.3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 질소 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물 (150 mL)을 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 용액을 EtOAc (300 mL)로 희석하고 2 M NaOH (2x200 ml), 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 추출물 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (28.16 g, 77%)을 황색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, CDCl₃) δ 2.14 (s 3H), 3.7 (s, 2H), 6.94 (d, J= 5.1 Hz, 1H), 7.08 (bs, 1H), 7.29-7.26 (m, 1H).

제조예 2

1-(3-티에닐)프로판-2-올

건조 MeOH (63 mL)를 수소화붕소나트륨 (1.61 g, 41.67 mmol)에 첨가하고 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키면서 MeOH를 첨가하였다. 추가로 -20℃로 냉각시키고 건조 MeOH (26.7 mL) 중 1-(3-티에닐)프로판-2-온 (4.92 g, 33.34 mmol)의 용액을 40분에 걸쳐 적가하고 1.5시간 동안 -20℃에서 이어서 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 용액을 -5℃ (내부 온도)로 냉각시키고 염화암모늄 (15 ml)의 포화 용액 이어서 1 N HCl (15 mL)로 켄칭하였다. 물 (30 mL) 및 EtOAc (100 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 감압 하에 총 부피의 1/3로 농축시켰다. 혼합물을 EtOAc (2x100 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 건조 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (4.74 g, 100%)을 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 125 (M-OH+H), 164.8 (M+Na).

대안적 제조예 2a

수소화붕소나트륨 (7.06 g, 182.8 mmol)을 조금씩 30분에 걸쳐 0℃에서 MeOH (282 mL) 중 1-(3-티에닐)프로판-2-온 (28.16 g, 140.6 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 농축 건조시키고, EtOAc (200 mL)로 희석하고 염화암모늄 (150 mL)의 포화 용액으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2x200 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH: DCM (0:100 내지 5:95)로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (12.85 g, 64%)을 연적색 오일로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 125 (M-OH+H).

제조예 3

(2S)-1-(3-티에닐)프로판-2-올

3-브로모티오펜 (6.88 g, 42.2 mmol)을 무수 THF (10 mL) 및 톨루엔 (100 mL) 중에 용해시켰다. -78℃로 냉각시켰다. 이에 시린지를 통해 sec-부틸리튬 (시클로헥산 중 1.3 mol/L, 34 mL, 44 mmol)을 15분에 걸쳐 첨가하였다. 온도를 < -60℃에서 유지하고, 10분 동안 교반한 다음 (2S)-2-메틸옥시란 (4.9 g, 84.4 mmol)을 적가하였다. 5분 후, 삼플루오린화붕소 디에틸 에테레이트 (5.3 mL, 42 mmol)를 15분에 걸쳐 적하 깔때기를 통해 첨가하였다. 온도를 < -55℃에서 유지하였다. 첨가가 완료된 후, -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. -78℃에서 포화 중탄산나트륨으로 켄칭하고, Et2O를 첨가하고, 주위 온도로 가온하였다. 포화 중탄산나트륨 (2x) 이어서 포화 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축하였다. 15% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (3.85 g, 64.2%)을 수득하였다. 혼합된 분획을 재정제하여 총량의 표제 화합물 (4.29 g, 71.5%)을 무색 액체로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, CDCl₃) δ 7.28-7.26 (dd, J=2.9, 5.0, 1H), 7.03-7.01 (m, 1H), 6.96 (dd, J=1.2, 4.9, 1H), 4.04-3.95 (m, 1H), 2.83-2.68 (m, 2H), 1.63 (s, 1H), 1.22 (d, J= 6.2, 3H), OR [α]²⁰D +25.50 (c 1.00, CHCl₃).

제조예 4

(5'S)-5'-메틸-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]

tert-부틸 4-옥소피페리딘-1-카르복실레이트 (6.50 g, 32.6 mmol) 및 (2S)-1-(3-티에닐)프로판-2-올 (4.64g, 32.6 mmol)을 DCM (100 mL) 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (20 mL, 264.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시킨 다음, 물 및 Et₂O를 첨가하였다. 유기 층을 물로 세척하고, 수성 세척액과 합한 다음, pH를 고체 탄산나트륨으로 염기성으로 조절하였다. 수성 층을 고체 염화나트륨으로 포화한 다음 수성 층을 EtOAc (5x)로 세척하였다. EtOAc 층을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (4.61g, 63%)을 연황색 오일로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 224.2 (M+H).

제조예 5

tert-부틸 (5'S)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-1-카르복실레이트

(5'S)-5'-메틸-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란] (10.39 g, 46.53 mmol)을 DCM (100 mL) 중에 용해시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (11.52 mL, 51.18 mmol)를 적가하고 혼합물을 주위 온도에서 1.5시간 동안 교반하였다. 추가의 디-tert-부틸 디카르보네이트 (2.00 mL, 9.17 mmol)를 첨가하고 30분 동안 교반한 다음 감압 하에 농축시켰다. 이미다졸 (2.21 g, 32.5 mmol)을 첨가하여 과량의 디-tert-부틸 디카르보네이트를 파괴하였다 (Synthesis, 2001, No. 4, 550). Et₂O를 첨가하고 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 10% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 15% EtOAc/헥산으로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 재-정제하여 표제 화합물 (12.92 g, 86%)을 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, d₆-DMSO) δ 7.33 (d, J=5.1, 1H), 6.77 (d, J=5.1, 1H), 3.92-3.72 (m, 3H), 3.15-2.91 (s, 2H), 2.62 (dd, J=15.8, 3.0, 1H), 2.30 (dd, J=15.8, 10.6, 1H), 2.1 (m, 1H), 1.76-1.63 (m, 2H), 1.51-1.40 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.24 (d, J=6.2, 3H), SFC 크로마토그래피에 기반한 100% ee, 룩스 아밀로스-2, 5 mL/분, 225 nm, Rt = 1.75분, OR [α]²⁰D +82.1 (c 1.00, CHCl₃).

제조예 6

tert-부틸-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-1-카르복실레이트

트리플루오로아세트산 (34.16 mL, 451.8 mmol)을 0℃에서 건조 DCM (135 mL) 중 1-(3-티에닐)프로판-2-올 (12.85 g, 90.35 mmol) 및 tert-부틸 4-옥소피페리딘-1-카르복실레이트 (23.40 g, 117.5 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 17시간 동안 교반하면서 유지하였다. 혼합물을 건조 농축시키고, 잔류물을 MeOH로 희석한 다음 용매를 감압 하에 제거하였다. MeOH 중 잔류물을 취하고 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 층을 합하고 톨루엔 (3x)으로 공증발시키며 감압 하에 농축시켜 조 5-메틸스피로[4,5-디히드로티에노[2,3-c]피란-7,4'-피페리딘]의 연오렌지색 고체를 수득하였다. 4-디메틸아미노피리딘 (2.23 g, 18.07 mmol) 및 트리에틸아민 (37.8 mL, 271.1 mmol)을 0℃로 냉각된 건조 DCM (90.35 mL) 중 5-메틸스피로[4,5-디히드로티에노[2,3-c]피란-7,4'-피페리딘] (20.18 g, 90.35 mmol)의 용액에 적가하였다. 이에 건조 DCM (27.1 mL) 중 디-tert-부틸 디카르보네이트 (30.49 g, 135.5 mmol)의 용액을 적가하였다. 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (100 mL)을 첨가하고, 수성 층을 DCM (3x100 mL)으로 추출하고, 염수 (100 mL)로 세척하고, 감압 하에 농축하였다. EtOAc: 이소-헥산 (0:100 내지 20:80)으로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 잔류물을 DCM (3x)으로 공증발시켜 표제 화합물 (27.64 g, 92.7%)을 백색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 346 (M+Na)

대안적 제조예 6a

트리플루오로아세트산 (20.17 mL, 266.72 mmol)을 0℃에서 건조 DCM (100 mL) 중 1-(3-티에닐)프로판-2-올 (4.74 g, 33.34 mmol) 및 tert-부틸 4-옥소피페리딘-1-카르복실레이트 (7.80 g, 38.34 mmol)의 용액에 적가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 건조 농축시키고 잔류물을 MeOH로 희석하였다. 조 물질을 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 층을 합하고 DCM (3x)으로 공증발시켜 감압 하에 농축시켜 조 5-메틸스피로[4,5-디히드로티에노[2,3-c]피란-7,4'-피페리딘] (8.17 g)을 수득하였다. 4-디메틸아미노피리딘 (0.831 g, 6.67 mmol) 및 트리에틸아민 (9.29 mL, 66.68 mmol)을 0℃로 냉각된 건조 DCM (66.7 mL) 중 5-메틸스피로[4,5-디히드로티에노[2,3-c]피란-7,4'-피페리딘] (8.17 g)의 용액에 첨가하였다. 이에 건조 DCM (16.7 mL) 중 디-tert-부틸 디카르보네이트 (18.19 g, 83.35 mmol)의 용액을 적가하였다. 실온에서 3일 동안 교반하였다. 물 (60 mL)을 첨가하고, 수성 층을 DCM (3x 50 mL)으로 추출하고, 염수 (20 mL)로 세척하고, 상 분리기를 통해 여과하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 EtOAc:이소-헥산 (0:100 내지 20:80)으로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 잔류물을 DCM (2x)으로 공증발시켜 표제 화합물 (9.41 g, 80%)을 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 346 (M+Na)

제조예 7

1-(tert-부톡시카르보닐)-5'-메틸-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복실산

tert-부틸-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-1-카르복실레이트 (7.16 g, 21.71 mmol)를 THF (108.5 mL) 중에 용해시키고 -78℃로 냉각시켰다. 이에 부틸리튬 (헥산 중 2.5 M, 13 mL, 32.56 mmol)을 20분에 걸쳐 적가하고 첨가가 완료된 후 혼합물을 추가로 30분 교반하였다. CO₂ 중에 캐뉼라를 통해 버블링시키고 이 온도에서 1시간 동안 CO₂의 연속식 첨가로 교반하면서 유지하였다. 반응물을 2시간에 걸쳐 CO₂의 연속식 첨가로 0℃로 가온되도록 하고 물 (80 mL)로 조심스럽게 켄칭하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고 수성 층을 Et₂O (100 mL)로 추출하였다. 유기 상을 2 N NaOH (3x 15 mL) 및 물 (50 mL)로 세척하였다. 수성 층을 2 N HCl (3x)로 pH= 6로 산성화시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 염수 (50 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (7.89 g, 97%)을 회백색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 390 (M+Na).

제조예 8

1-(tert-부톡시카르보닐)-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복실산

tert-부틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-1-카르복실레이트 (문헌 [J. Med. Chem., 2011, 54, (8), pp 2687-2700] 및 WO2011060035에 기재된 바와 같이 제조됨) (10 g, 32.32 mmol)를 THF (100 mL) 중에 용해시키고 -78℃에서 냉각시켰다. 이에 부틸리튬 (22.22 mL, 35.55 mmol)을 15분에 걸쳐 적가하고 첨가가 완료된 후 혼합물을 추가로 15분 동안 교반하였다. CO₂ 중에 캐뉼라를 통해 버블링시키고 혼합물을 CO₂의 연속식 첨가로 실온으로 가온되도록 하였다. 2시간 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물에 이어서 Et₂O를 첨가하였다. 수성 층을 1 N NaOH로 염기성화시키고 유기 층을 1 N NaOH (3 x)로 세척하였다. 염기 세척액을 합하고 5 N HCl로 pH 2로 산성화시켰다. 수성 층을 EtOAc (3x)로 세척하고, 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (11.11 g, 97.27%)을 백색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 352.2 (M-H).

제조예 9

(5'S)-1-tert-부톡시카르보닐)-5'-메틸-4',5'디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복실산

tert-부틸 (5'S)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-1-카르복실레이트 (11.19 g, 34.60 mmol)를 무수 THF (200 mL) 중에 용해시키고 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (21 mL, 34.64 mmol)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 첨가가 완료된 후, -78℃에서 20분 동안 교반한 다음 CO₂ 기체 중에 캐뉼라를 통해 60분 동안 버블링시켰다. 혼합물을 CO₂의 연속식 첨가로 실온으로 가온되도록 하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 물 (3 mL)로 켄칭하고 감압 하에 25% 부피로 농축시켰다. Et₂O 및 물을 첨가하였다. 물 (2x)로 세척하고 수성 세척액을 합하였다. pH를 1 N HCl로 산성으로 조절하였다. 수성 층을 염화나트륨으로 포화시키고 EtOAc (2x)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (13.40 g, 100%)을 백색 발포체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 366 (M-H).

제조예 10

5-(에틸술파닐)피리딘-2-카르보니트릴

5-브로모피리딘-2-카르보니트릴 (49.42 g, 270.1 mmol) 및 탄산칼륨 (113.5 g, 821.2 mmol)을 1-메틸-2-피롤리디논 (280 mL) 중에 용해시키고 온도가 50℃ 미만으로 유지되도록 에탄티올 (26.4 mL, 356 mmol)을 여러 부분으로 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. EtOAc (1200 mL) 및 물 (2200 mL)로 희석하였다. 유기 층을 수집하고 및 염수 (3x300 mL)로 세척하고, 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (44.87 g, 100%)을 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, d₆-DMSO) δ 8.63 (s, 1H), 7.93 (s, 2H), 3.17 (q, J=7.3, 2H), 1.29 (t, J=7.3, 3H).

제조예 11

5-(에틸술포닐)피리딘-2-카르보니트릴

5-(에틸술파닐)피리딘-2-카르보니트릴 (44.36 g, 270.1 mmol)을 무수 DCM (540 mL) 중에 용해시키고 -20℃로 냉각시켰다. 3-클로로퍼옥시벤조산 (130 g, 565.0 mmol)을 내부 온도를 0℃ 내지 -10℃로 유지하면서 10-12 그램 부분을 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 냉각 조 중에서 교반하여 밤새 실온으로 가온되도록 하였다. 1 N NaOH (1 L), 물, 1 N NaOH (2x500 mL), 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (49.52 g, 93%)을 백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, d₆-DMSO) δ 9.20 (d, J=1.9, 1H), 8.56 (dd, J=2.0, 8.1, 1H), 8.36 (d, J=8.1, 1H), 3.52 (q, J=7.3, 2H), 1.16 (t, J=7.5, 3H).

제조예 12

1-[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메탄아민 히드로클로라이드

5-(에틸술포닐)피리딘-2-카르보니트릴 (49.52 g, 252.4 mmol)을 3개의 16.5 g 부분들로 나누었다. N₂ 하에 2250 mL 파르 병 중에서, 10% Pd/C (1.65 g, 15.5 mmol)를 용기에 첨가하고 MeOH (750 mL)로 습윤시켰다. MeOH (750 mL) 중에 용해된 상기 5-(에틸술포닐)피리딘-2-카르보니트릴 (16.5 g, 84.09 mmol)에 첨가하였다. 이에 HCl (6N 수성, 17.1 ml, 102.6 mmol)을 첨가하였다. 병을 밀봉하고, N₂로 퍼징하고, H₂로 퍼징하고, 68.9 kPa로 실온에서 3시간 동안 가압하였다. N₂로 퍼징한 다음 혼합물을 여과하였다. 5-(에틸술포닐)피리딘-2-카르보니트릴의 잔류 부분들에 대해 반복하였다. 모든 여과물을 합하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (59.61 g, 99%)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 201 (M+H-HCl).

제조예 13

tert-부틸 2'-({[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}카르바모일)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-1-카르복실레이트

1-[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메탄아민 히드로클로라이드 (3.1 g, 13 mmol), 1-(tert-부톡시카르보닐)-5'-메틸-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복실산 (3.9 g, 10 mmol)을 무수 DCM (52 mL) 중에 용해시켰다. 0℃로 냉각시키고 트리메틸아민 (10 mL, 73 mmol) 이어서 EtOAc 중 2,4,6-트리프로필-1,3,4,2,4,6-트리옥사트리포스포리난-2,4,6-트리옥시드 (8.6 g, 14 mmol)의 1.67 M 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 조심스럽게 물 (50 mL)을 첨가하고 10분 동안 실온에서 교반하였다. 수성 층을 DCM (2x)으로 추출한 다음 유기 추출물을 합하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축하였다. 조 물질을 50% 내지 100% EtOAc/헥산 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (4.89 g, 83%)을 황색 발포체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 550 (M+H).

제조예 14

tert-부틸 (5'S)-2'-({[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}카르바모일)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-1-카르복실레이트

1-[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메탄아민 히드로클로라이드 (2.86 g, 10.5 mmol), (5'S)-1-tert-부톡시카르보닐)-5'-메틸-4',5'디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복실산 (3.50 g, 9.52 mmol), 및 1-히드록시벤조트리아졸 (1.44 g, 10.5 mmol)을 무수 THF (100 mL) 및 디메틸포름아미드 (50 mL) 중에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (4.98 mL, 28.6 mmol) 이어서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 첨가하고 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 감압 하에 ~40% 부피로 농축시킨 다음 EtOAc를 첨가하였다. 포화 중탄산나트륨 (2x), 물 (2x), 염수 (2x)로 세척하고, 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축하였다. 실리카 겔 상에서 80% EtOAc/헥산으로 크로마토그래피하여 표제 화합물 (4.51 g, 86%)을 회색 발포체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 550 (M+H).

제조예 15

N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-4',5',디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-2'-카르복스아미드 디히드로클로라이드

tert-부틸 2'-({[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}카르바모일)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-1-카르복실레이트 (0.95 g, 1.68 mmol)를 MeOH (10 mL) 중에 용해시키고 디옥산 중 4 M HCl (4.5 mL, 18 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.86 g, 100%)을 백색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 450 (M+H-2HCl)

제조예 16

(5'S)-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-4',5',디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-2'-카르복스아미드 디히드로클로라이드

tert-부틸 (5'S)-2'-({[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}카르바모일)-5'-메틸-4',5'-디히드로-1H-스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-1-카르복실레이트 mmol (1.14 g, 2.0 mmol)를 1,4 디옥산 (10 mL) 및 MeOH (5 mL) 중에 용해시켰다. 디옥산 중 4 M HCl (5.0 mL, 20 mmol)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 약 10 mL로 농축한 다음 Et₂O를 첨가하고 격렬히 밤새 교반하였다. 헥산을 첨가하고 여과하고 헥산으로 헹궈 표제 화합물 (0.99 g, 91%)을 담황색 고체로서 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 450 (M+H-2HCl).

제조예 17

1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에탄올

2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카르브알데히드 (11.31 mmol, 1.992 g)를 THF (56.56 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 메틸마그네슘 브로마이드 (Et₂O 중 3 M) (33.94 mmol, 11.31 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되도록 하고 2.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 1 N HCl로 켄칭하였다. EtOAc를 첨가하고 1 N HCl로 세척하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (1.663g, 76.5%)을 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 193.0 (M+H).

제조예 18

5-(1-브로모에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘

1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에탄올 (8.655 mmol, 1.663 g) 및 트리페닐포스핀 (12.98 mmol, 3.405 g)을 DCM (86.55 mL) 중에 용해시키고 N-브로모숙신이미드 (12.98 mmol, 2.311 g)를 실온에서 첨가하였다. 3시간 후, 반응물을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 10% EtOAc / 헥산으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물 (1.641 g, 74.34%)을 수득하였다. ¹H NMR (400.13 MHz, d₆-DMSO) δ 9.26 (s, 2H), 5.63 (q, J= 7.0 Hz, 1H), 2.09 (d, J= 7.0 Hz, 3H).

실시예 1

N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드

N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-4',5',디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-2'-카르복스아미드 디히드로클로라이드 (1.12 g, 2.31 mmol)를 아세토니트릴 (11.6 mL) 및 디이소프로필에틸아민 (2.42 mL, 13.9 mmol) 중에 용해시키고 5-(1-브로모에틸)-2-(트리플루오로메틸) 피리미딘 (0.71 g, 2.77 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 90분 동안 가열한 다음 주위 온도에서 냉각시키고 감압 하에 농축하였다. 조 혼합물을 MeOH (5 mL) 중에 용해시킨 다음 50 g SCX 칼럼 상에 로딩하였다. MeOH (150 mL)로 플러싱한 다음 생성물을 2 N 암모니아/MeOH (150 mL)로 용해시켰다. 암모니아/MeOH 세척물을 감압 하에 오렌지색 발포체로 농축하였다. 조 물질을 100% DCM 내지 95% DCM/MeOH 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 크로마토그래피하여 표제 화합물 (1.54 g, 43%)을 수득하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H).

실시예 2

(5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1S)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드

실시예 3

(5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드

실시예 4

(5R')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 이성질체 1

실시예 5

(5R')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 이성질체 2

N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 (1.28 g, 2.05 mmol)를 MeOH (58.5 mL) 중에 용해시켰다. SFC [AD-IC 칼럼 (30 x 250 mm, 5 μ) 및 120 mL/분으로 50% IPA (20 mM NH₃)로 용리, 10분마다 4.5 mL (200 mg)의 주입]에 의한 키랄 크로마토그래피를 통해 분리하여 실시예 5, (5R')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 이성질체 2, 및 실시예 2, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1S)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드, 실시예 3, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 및 실시예 4, (5R')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 이성질체 1을 함유하는 혼합된 분획을 수득하였다. 혼합된 분획을 농축시키고 이들을 MeOH (55.5 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물을 SFC [OJ-H 칼럼 (30 x 250 mm, 5 μ) 및 160 mL/분으로 22% MeOH (20 mM NH₃)로 용리, 5분마다 5.0 mL의 주입]에 의한 키랄 크로마토그래피를 통해 분리하여 실시예 4, (5R')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 이성질체 1, 및 실시예 3, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 및 실시예 2, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1S)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드의 혼합물을 수득하였다. 혼합된 분획을 농축하고 이들을 MeOH (30.0 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물을 SFC [AD-H 칼럼 (50 x 250 mm, 5 μ) 및 200 mL/분으로 50% IPA (20 mM NH₃)로 용리, 32분마다 3.0 mL의 주입]에 의한 키랄 크로마토그래피를 통해 분리하여 실시예 2, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1S)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드 및 실시예 3, (5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'티에노[2,3-C]피란]-2'-카르복스아미드를 수득하였다. 각각의 세트의 순수한 분획을 농축시킨 다음 분리된 생성물을 아세토니트릴 (0.6 mL) 중에 용해시키고, 물을 첨가하고, -78℃로 동결시키고, 동결건조시켜 실시예 2, 0.214 g, 16%, 99.5% ee, Rt = 2.94분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H)를 수득하였다. 실시예 3, 0.203 g, 15%, 98.9% ee, Rt = 2.75분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H). 실시예 4, 0.251 g, 17%, 98.3% ee, Rt = 4.75분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H). 실시예 5, 0.272 g, 18%, 100% ee, Rt = 4.33분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H). 분석 조건: SFC (220 nm UV), 칼럼: AD-IC 30 x 250 mm, 5 μ, 이동상: 50% IPA (20 mM NH₃). 키랄 LC 분석 조건: SFC (225 nm UV), 칼럼 키로셀 OJ-H, 20% MeOH (0.2% 이소프로필아민)/CO₂, 5 mL/분.

실시예 2의 대안적 제조예

및 실시예 3의 대안적 제조예

(5S')-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-4',5',디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3,c]피란]-2'-카르복스아미드 디히드로클로라이드 (28.28 g, 58.19 mmol)를 아세토니트릴 (280 mL) 및 디이소프로필에틸아민 (50 mL, 290.9 mmol) 중에 용해시키고 5-(1-브로모에틸)-2-(트리플루오로메틸) 피리미딘 (0.71 g, 2.77 mmol)을 첨가한 다음 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축한 다음 조 혼합물을 DCM 중에 용해시키고 100% EtOAc로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물의 혼합물을 수득하였다. 키랄 크로마토그래피 [키랄팩 IA 칼럼 (8 x 40.5 cm, 225 nm) 및 400 mL/분으로 40% 아세토니트릴/60% 이소프로필알콜 (0.2% 디메틸에틸아민 포함)로 용리, 20 mL (2000 mg)의 주입]을 통해 분리하였다. 각각의 부분입체이성질체를 감압 하에 농축시킨 다음, 뜨거운 에탄올 (250 mL) 중에 용해시키고, 뜨거운 상태로 여과한 다음 주위 온도로 냉각되도록 하고, 차가운 에탄올로 헹궜다. 고체를 진공 오븐에서 55℃에서 건조시켜 실시예 2, 9.94 g, 27%, 90.8% ee, Rt = 3.93분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H) 및 실시예 3, 9.42 g, 26%, 98.8% ee, Rt = 9.25분, 질량 스펙트럼 (m/z): 624 (M+H))을 결정질 물질로서 수득하였다. 분석 조건: 키랄팩 IA 칼럼 (4.6 x 150 mm, 225 nm) 및 1 mL/분으로 40% 아세토니트릴/60% 이소프로필알콜 (0.2% 디메틸에틸아민 포함)로 용리.

X-선 회절, 실시예 3

23℃에서 단결정을 얇은 MiTeGen 섬유에 탑재하였다. CuKα 방사선원 (λ = 1.54178 Å) 및 SMART 6000CCD 영역 검출기 (브루커-AXS. SHELXTL (V2013 6.2), 미국 위스콘신주 매디슨)가 장착된 브루커 D8 기반 3-서클 측각기 회절계를 사용하여 데이터를 수집하였다. SAINT 프로그램 V8.32b를 사용하여 세포 정련 및 데이터 축소를 수행하였다 (Sheldrick, G.M., (2008), SHELXS-97, Acta Cryst. A64, 112-122). a = 10.1624(2) Å, b = 9.9080(2) Å, c = 15.1085(3) Å, 및 α = 90°, β = 100.6879(14)°, γ = 90°의 단사정 파라미터를 갖는 단위 셀을 지수화하였다. 결정 구조의 셀 부피는 1494.87(5) Å³이었다. 구조의 밀도 계산치는 23℃에서 1.386 g/cm³이었다. 직접적 방법에 의해 구조를 해결하였다 (Sheldrick, G.M., (2008), SHELXS-97, Acta Cryst. A64, 112-122). 모든 원자 파라미터를 독립적으로 정제하였다. 공간군 선택, 즉, P2₁은 최종 적합도 1.088을 갖는 F²에 대한 완전-행렬 최소-제곱 정밀화의 성공적인 수렴에 의해 확증된다 (Sheldrick, G. M., (2013), SHELXL-2013, Program for crystal structure refinement, Institute fur anorg chemie, Goettingen, Germany). 최종 잔류 인자, R₁은 0.0771이고 최종 정제 주기 후 최대 차이 피크 및 홀은 각각 0.315 및 -0.333 (e.A-3)이었다. 절대 구조 파라미터가 0.072(17)로 정련되었다.

실시예 3의 구조는 결정되고 분자 구조는 실시예 3에 대해 제시된 것과 일치하였다. 결정 구조가 고품질의 것이고 구조에서 중원자 (황)의 변칙적 산란 기여를 사용함으로써 피페리딘 기에서 떨어져 (S)로서 C5 및 (R)로서 C1인 실시예 3의 키랄 중심의 절대 입체화학을 설립한다는 것이 주목되어야 한다. 절대 배위는 (5'S)-N-{[5-(에틸술포닐)피리딘-2-일]메틸}-5'-메틸-1-{(1R)-1-[2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸}-4',5'-디히드로스피로[피페리딘-4,7'-티에노[2,3-c]피란]-2'-카르복스아미드 배위인 결정 구조로부터 결정하였다.

생물학적 검정

RORa, b 및 g 결합 억제제

His-태깅된 인간 RAR-관련 고아 수용체 알파 (hRORa), 인간 RAR-관련 고아 수용체 베타 (hRORb), 및 인간 RAR-관련 고아 수용체 감마 (hRORg)는 K_i 값을 결정하기 위한 수용체-리간드 경쟁 결합 검정에 사용된다. 전형적인 절차는 하기에 제공된다.

수용체 경쟁 결합 검정은 DPBS (1 L) (하이클론 #SH30028.03), 2.2 g BSA 분획 v (로슈 #9048-46-8), 100 mL 글리세롤 (피셔 #56-81-5) 및 40 mL DMSO (시약 등급)로 구성된 완충제 중에서 수행한다. 최종 웰은 20 μg/mL 아프로티닌 및 20 μg/mL 류펩틴 및 10 μM 페파블록을 함유한다. 전형적으로, 수용체 결합 검정은 웰당 방사선 표지된 리간드, 예컨대 알파 결합의 경우에 7 nM [3H]-25-히드록시콜레스테롤, 베타 결합의 경우에 20 nM [3H]-3-[[4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-이소프로필-이속사졸-4-일]메톡시]-N,2-디메틸-아닐리노]메틸] 벤조산, 및 감마 결합의 경우에 6 nM [3H]-25-히드록시콜레스테롤, 및 0.5 μg RORa 수용체, 0.03 μg RORb 수용체, 또는 0.13 μg RORg 수용체를 포함한다. 검정은 전형적으로 96-웰 포맷으로 수행한다. 경쟁 시험 화합물을 약 0.4 nM 내지 25 μM 범위의 다양한 농도로 첨가한다. 비-특이적 결합은 RORa 및 RORg 결합의 경우에 250 nM 25-히드록시콜레스테롤, RORb 결합의 경우에 250 nM 3-[[4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-이소프로필-이속사졸-4-일]메톡시]-N,2-디메틸-아닐리노]메틸]벤조산의 존재 하에 결정한다. 샘플, 표지 및 수용체 용액을 96 웰 검정 플레이트 (코스타 3632)에서 조합하고, 밤새 실온에서 인큐베이션한 다음, 1 mg/웰의 최종 비드 농도를 위해 25 μl 비드 (아머샴(Amersham) YSi (2-5 마이크로미터) 구리 His-태그 Spa 비드, #RPNQ0096)를 각각의 반응물에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 오비탈 진탕기 상에서 30분 동안 혼합한다. 4시간 인큐베이션 후, 플레이트를 왈락 마이크로베타(Wallac MICROBETA)® 계수기에서 판독한다.

데이터는 4 파라미터 로지스틱 피트를 사용하여 예측되는 IC₅₀을 계산하는데 사용된다. RORa 및 RORg의 경우에 [3H]-25-히드록시콜레스테롤 및 RORb의 경우 [3H]-3-[[4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-이소프로필-이속사졸-4-일]메톡시]-N,2-디메틸-아닐리노]메틸]벤조산에 대한 Kd는 포화 결합에 의해 결정한다. 화합물에 대한 IC₅₀ 값은 쳉-프루소프 식을 사용하여 Ki로 전환시킨다.

하기 예시된 화합물의 결과는 하기 표 2에 제시된다.

표 2

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 결과는 표 2의 화합물이 RORa 및 RORb에 비해 RORg에 대해 선택적이라는 것을 입증한다.

HEK293 RORg GAL4 수용체-리포터 검정

역 효능제 활성의 지시자로서, RAR-관련 고아 수용체 감마 (RORg) 수용체-리포터 검정 (RORg-GAL4/pGL4.31)을 HEK293 세포에서 수행한다. HEK293 세포를 퓨진(Fugene)™ 시약을 사용하여 공동-형질감염시킨다. GAL4 결합 도메인 및 반딧불이 루시페라제 유전자의 최소 아데노바이러스 프로모터 상류를 함유하는 리포터 플라스미드를 효모 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합된 인간 RORg 리간드 결합 도메인이 구성적으로 발현하는 플라스미드와 함께 공동-형질감염시킨다. 세포를 T150 cm² 플라스크 중에서 FBS가 없는 MEM 배지에 형질감염시켰다. 18시간 인큐베이션 후, 형질감염된 세포를 트립신처리하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 10% FBS를 함유하는 3:1 DMEM-F12 배지에 플레이팅하고, 4시간 동안 인큐베이션한 다음 약 0.05 nM 내지 10 μM 범위의 시험 화합물의 다양한 농도에 노출시킨다. 화합물과 함께 18시간 인큐베이션한 후, 세포를 용해시키고 루시페라제 활성을 표준 기술을 사용하여 정량화한다. 데이터를 4 파라미터-피팅 로지스틱에 피팅시켜 IC₅₀ 값을 결정한다.

하기 예시된 화합물의 결과는 하기 표 3에 제시된다.

표 3

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 결과는 표 3의 화합물이 인간 RORg 수용체에 대한 역 효능제이라고 입증한다.

PBMC IL-17 분비 ELISA 및 세포 타이터글로 생존율 검정

먼저 새로운 버피 코트를 동등 부피의 포스페이트 완충 염수와 조합함으로써 PBMC를 전혈 버피 코트로부터 단리한다. 이어서 35 mL의 PBS/버피 코트 용액을 50 mL 원추형 튜브 중 15 mL의 피콜 상에 온화하게 오버레이한다. 30분 동안 500xg (느린 가속 및 감속)로 원심분리한 후 혈장의 상부 층을 폐기하고 피콜 계면을 따라 세포의 층을 수집하고 풀링한다. 각각의 250 mL 튜브를 실온 RPMI-1640 배지로 상부까지 충전한다. 튜브를 10분 동안 500xG (느린 가속 및 감속)로 스피닝시키고, 매질을 흡인에 의해 제거하고, 세척 단계를 반복한다. 세포를 얼음 상에 라이프 테크놀로지스로부터의 빙냉 리커버리 셀 컬쳐 프리징 미디엄 (카탈로그 번호 12648-010) 중에 재현탁시킨다. 세포 농도를 66.7백만개 세포/mL로 조정하였다. 세포를 100백만개의 세포를 갖는 바이알 중에서 -1℃/분으로 천천히 냉동시키고 액체 질소에서 저장한다.

IL-17 분비의 자극 및 화합물 첨가

PBMC를 1 mL의 완전 배지 (30 mM HEPES, 100 유닛/ml 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 3.25 mM L-글루타민, 0.2 μM 베타-메르캅토에탄올, 및 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640)로 재현탁시킨 후 온화하게 와동시키면서 2 mL, 4 mL, 8 mL, 및 16 mL의 완전 배지를 적가하여 해동시킨다. 세포는 5분 동안 스핀 다운시키고 세포 펠릿을 완전 배지 중에 재현탁시킨다. 세포의 덩어리를 23 게이지 시린지 바늘 및 40 μM 세포 스트레이너를 통하여 세포 용액을 전개시켜 파괴한다. 웰당 십만개의 세포를 총 30 μL의 384 웰 폴리스티렌 조직 배양물 처리된 편평 바닥 플레이트에 첨가한다. 완전 배지에서 제조된 항-인간 CD3 항체, 항-인간 CD28 항체, IL-23 및 화합물을 함유하는 자극 칵테일을 30 μL의 총 부피로 동시에 세포에 첨가한다. 첨가된 자극제의 최종 농도는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL-23 각각에 대해 160 ng/mL, 500 ng/mL, 및 5 ng/mL, 및 DMSO에 대해 0.3%이다. 플레이트를 아레사씰(AERASEAL)® 밀봉 필름으로 밀봉하고 48시간 동안 37℃, 95% 습도, 및 5% CO₂에서 인큐베이션한다.

인큐베이션 기간 후에 플레이트를 5분 동안 200xg에 스피닝한다. 상청액을 동일한 부피의 1% BSA/PBS로 1:1로 희석하고 하나의 예외 (비색 기질 OPD (o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드, 시그마 Cat #P6912)를 키트에 공급된 기질 대신에 사용함)로 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라 알앤디 시스템 (R&D system) (카탈로그 #D317E)로부터의 인간 IL-17 ELISA 키트로 IL-17에 대해 시험한다. 492 nm에서 흡광도를 엔비전 다중-라벨 플레이트 판독기로 측정한다. A492 값을 하기 제시된 바와 같이 IL-17 표준 곡선을 기반으로 IL-17의 농도로 전환시킨다:

pg/mL IL-17 = EC50*[[(상부-하부)/(A492-하부)]-1](1/-Hill). IL-17 분비의 억제에 대한 IC₅₀은 표준 4-파라미터 피트를 사용하여 자극제가 첨가되지 않고 화합물도 첨가되지 않은 웰의 평균 값으로부터 결정된 최대 억제 및 첨가제가 단독으로 첨가되고 화합물은 첨가되지 않은 웰의 평균 값으로부터의 최소 억제를 갖는 전환된 값을 기반으로 계산한다.

동일한 부피의 셀 타이터글로(Cell TITERGLO)® 세포 생존율 시험 시약 (프로메가 Cat# G7573)을 플레이트 중에 남아있는 세포에 첨가하고, 실온에서 완만하게 진탕하면서 15분 동안 인큐베이션한 후 엔비전 다중-라벨 플레이트 판독기로 발광을 측정한다. 0 발광 단위에 대한 100% 활성 (세포 사멸) 및 자극제를 단독으로 함유하고 화합물은 첨가되지 않은 웰의 평균 발광으로서 최소 활성 (생존 세포의 최대 수)을 설정하여 퍼센트 세포 사멸을 계산한다. IC₅₀을 표준 4 파라미터 피트를 사용하여 계산한다.

하기 예시된 화합물의 결과는 하기 표 4에 제시된다.

표 4

평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차

이들 결과는 표 4의 화합물이 측정가능한 세포독성 효과 없이 PBMC에서 항-CD3/항-CD28/IL-23 자극된 IL-17 분비를 억제한다는 것을 제시한다.

글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (GPI) 유도된 관절염 모델:

GPI 유도된 관절염 모델은 문헌 [K. Iwanami et al. Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008 및 D. Schubert et al. J Immunology 172, 4503-4509, 2004]으로부터 채택하였다. 마우스 (8-9주령 수컷 DBA/1 마우스) (하를란)를 면역화날 (제0일)에 수집된 체중을 기반으로 치료 그룹으로 무작위로 할당한다. 면역화날 (제0일)에, 재조합 인간 GPI (PBS 중에 4 mg/mL로 희석됨, 깁코) 및 완전 프로인트 아주반트 (CFA, 시그마)의 1:1 (v:v) 혼합물을 고속 균질화기 (옴니 (Omni)) 상에서 40분 동안 냉장실에서 혼합한다. 2 mg/mL GPI의 최종 농도를 에멀젼 중에서 달성한다. 마우스의 꼬리 기부에 GPI 에멀젼을 주입한다 (2개 부위의 주입, 피하, 각각의 부위에 100 μL). 시험 화합물을 면역화와 동일한 날 (제0일)에 경구로 투여한다. 제0일에 시작하여, 각각의 발을 0 내지 3 점수화 시스템에 기반하여 관절 종창의 중증도에 대해 점수화한다 (문헌 [K. Iwanami et al. Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008] 참조). 임상 점수는 모든 4개 발의 총 점수를 나타낸다 (최대 점수 = 12). 임상 점수를 제0일, 제2일, 제4일, 제7일, 제8일, 제9일, 제10일, 제11일, 제12일, 제14일, 제16일, 제18일 및 제21일에 평가한다.

AUC를 면역화일 (제0일)부터 제21일까지의 시간 경과에 따른 임상 점수에 대한 사다리꼴 방법에 의해 계산한다. 시험 p-값을 스튜던트 t-검정으로부터 유도하였다.

실시예 3 (1000 mg/Kg) 및 비히클 (정제수 중 1% HEC, 0.25% 폴리소르베이트 80, 및 0.05% 소포제) 처리 (n=8/그룹)를 제0일에 시작하고 경구로 1일 1회 투여한다. 실시예 3은 발 종창의 중증도를 감소시키고 비히클 그룹과 비교 시 질환의 과정을 통해 더 낮은 평균 임상 점수를 유지한다. 이 효과는 임상 점수 AUC에서 75% 감소를 유발하며, 시간 경과에 따른 발 종창의 누적 척도는 표 5에 제시된 바와 같이 비히클 그룹과 비교 시 통계적으로 유의하다.

표 5

값은 평균 ± SEM으로 제시된다. *p<0.05 vs. 비히클 (스튜던트 t-검정). SEM = 평균의 표준 오차

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
건선의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
혈청음성 척추관절증의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
제5항에 있어서, 축성 척추관절염, 강직성 척추염 또는 건선성 관절염의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
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