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KR101877840B1 - 암 치료용 화합물을 확인하는 방법 - Google Patents

암 치료용 화합물을 확인하는 방법 Download PDF

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KR101877840B1
KR101877840B1 KR1020127003104A KR20127003104A KR101877840B1 KR 101877840 B1 KR101877840 B1 KR 101877840B1 KR 1020127003104 A KR1020127003104 A KR 1020127003104A KR 20127003104 A KR20127003104 A KR 20127003104A KR 101877840 B1 KR101877840 B1 KR 101877840B1
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마리아 솔레다드 소엔가스 곤잘레스
다미아 토르모 카룰라
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푼다시온 센트로 나시오날 드 인베스티가시오네스 온콜로기카스 카를로스 Iii
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Abstract

암 치료용 화합물을 확인하는 방법. 본 발명은 MDA-5 단백질을 활성화시킬 수 있거나, NOXA 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 자가포식을 일으킬 수 있는 화합물들 중에서 암 치료를 위한 치료제로서 사용하기 위한 후보 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. dsRNA 센서 MDA-5의 활성화는 천연 길항제 NOXA, MCL-I의 안정화를 선동하지 않으면서, 종양 세포에서 자율적이면서 선택적으로 자가포식과 아폽토시스, 둘 모두를 활성화시킴으로써 암 세포를 파괴시킬 수 있다는 것에 기초한다. 본 발명은 또한 암 치료용 의약의 제조를 위한, 캐리어, 예를 들어, 폴리에틸렌이민 폴리양이온 (PEI)과 복합체화된 동일하거나 유사한 성질의 이중 가닥 RNA, 예를 들어, 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC)의 용도에 관한 것이다.

Description

암 치료용 화합물을 확인하는 방법{PROCESS FOR THE IDENTIFICATION OF COMPOUNDS FOR TREATING CANCER}
본 발명은 종양학 분야에 관한 것이며, 이는 주로 상이한 유형의 암, 예를 들어, 흑색종, 췌장암종, 결장암종, 방광암종, 신경아교종, 유방암종, 전립선암종, 폐암종 및 난소암종을 치료하는 데 사용될 수 있는 화합물을 확인하는 데 중점을 두고 있다.
추가로, 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 확인된 화합물로서, 상기에서 언급된 모든 유형의 암 중의 투명 종양 세포의 사멸을 촉진시킬 수 있는 화합물, 예를 들어, 화합물 BO-110 (하기 참조)을 포함한다.
최신 기술 동향
흑색종은 그의 발병률이 여전히 계속 증가하고 있으며, 진행 단계에서의 예후는 극도로 열악한 고형암의 원형으로 남아있다 (문헌 [Jemal et al., 2008]). 흑색종 화학- 및 면역-내성에 대해 기초가 되는 분자 결정기를 확인하기 위해 많은 노력을 해왔다. 전이성 흑색종 치료용으로서 미국 식품 의약국(US Food 및 Drug Administration: FDA)의 승인을 받은 유일의 제제는 알킬화제 다카르바진 (DTIC) 및 면역조절제 IL-2이다 (문헌 [Tawbi and Kirkwood, 2007]). 그러나, 전이성 흑색종에서의 지속적이며 완전한 반응이 환자 중 5% 초과의 환자에게도 이익이 되지 못하며, 2차 독성이 심각할 수도 있다. 결과적으로, 전이성 흑색종을 앓는 환자의 현 평균 생존기간은 6 내지 10개월인 바, 상기 질환에 대한 개선된 요법을 개발하는 것이 우선시되고 있다 (문헌 [Jemal et al. 2007]).
처음에, 인터페론 (IFN)과는 독립적으로 지난 40여 년 동안 면역계를 자극시키는 데 사용되어 왔던 화합물로서, pIC (폴리이노신-폴리시티딜산)로 명명되는 바이러스 dsRNA 합성 유사체 (문헌 [Field et al. 1967])가 흑색종에 대한 유망한 치료제인 것으로 판단되었다. 불행하게도, 나형 pIC를 사용하여 수행된 임상 연구 결과, 그의 안정성은 낮고, IFN 유도도 낮으며, 흑색종에 대한 항종양 효과도 없는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Robinson et al., 1976]). 따라서, 단일 제제로서의 pIC는 흑색종을 위한 것으로는 충분치 못한 제제인 것으로 판단되었다.
고속 대량 조직발생 분석 및 계통적 기능 연구를 통해 흑색종 개시 및 진행 및 치료 실패와 관련된 복잡한 기전에 대한 본 발명자들의 이해는 현저히 발전하였다 (문헌 ([Fecher et al., 2007]; [Gray-Schopfer et al., 2007])). BRAF/MAPK; PI3K/AKT, NF-κB 또는 NOTCH 신호전달 캐스케이드에서의 일관된 결함과 변경에 대해 확인하고 있는 중이며, 이를 통해 합리적인 약물 디자인을 위한 흥미로운 플랫폼을 제공할 수 있다 (문헌 [Gray-Schopfer et al., 2007]). 그러나, 아직은 표적화된 요법이 흑색종 시험에 있어 효과가 있는 것으로 입증되지 못했다 (문헌 [Flaherty, 2006]). 미노콘드리아에 의해, 및/또는 소포체에 의해 조정되는 사멸 프로그램은 비록 생체내에서는 항상 효과가 없지만, 이 또한 현재 평가 중에 있다 (문헌 [Hersey and Zhang, 2008]). 결과적으로, 현 항암 약물은 생산 방식으로는 그의 표적(들)에 도달하지 못하거나, 정상적인 세포 구획에 대해 견딜 수 없는 독성을 일으킬 수 있는 투약 스케줄로 투여되어야 한다 (문헌 [Tawbi and Kirkwood, 2007]). 치료시 보상 기전이 활성화될 수 있고, 이로써 화학내성이 보다 높은 세포 군집을 선택할 수 있다는 점이 중요하다 (문헌 ([Lev et al., 2004]; [Shatton et al., 2008]; [Wolter et al., 2007])).
사실상, 흑색종은 진행할 수 있고, 전이를 형성할 수 있으며, 상이한 요법을 사용한 치료법으로부터 생존할 수 있는 능력을 흑색종에게 부여하는 상이한 여러 경로를 통해 아폽토시스를 회피할 수 있는 강력한 능력을 가지고 있는 것으로 판단된다 (문헌 [Ivanov et al., 2003]를 통해 리뷰).
주로 "내부"에서 이루어지는 (즉, 세포 사멸의 내인성 프로그램을 활성화시킴으로써 이루어지는) 종양 세포를 사멸시키는 것을 목적으로 하는 표준 화학요법과는 달리, 면역요법은 전통적으로 간접적인 세포-세포 상호작용 캐스케이드를 포함하였다. 흑색종의 경우, 대부분의 노력은 2가지 구획: 항원 제시 세포 및 세포독성 T 세포의 수준 또는 기능적 효능을 증강시키는 데 중점을 두었다 (문헌 [Wilcox and Markovic, 2007]). 비록 IV상 임상 시험에서 좌절할 만한 결과를 얻었지만, 억제성 면역조절제 (예를 들어, CTL4)에 대한 항체 뿐만 아니라, 백신 또한 시험 중에 있다 (문헌 [Kirkwood et al., 2008]). 보다 최근에는, 자연살세포 (NK), 가지 세포 (DC) 및 T 세포에 의한 흑색종 세포의 세포독성 파괴를 지원하기 위해 톨 유사 수용체(Toll Like Receptor: TLR)-3, -4, -7 및 -9의 활성화를 통해 이루어지는 선천성 면역계의 자극이 추구된다 (문헌 ([Kirkwood et al., 2008], 및 [Tormo et al. 2007])). 그러나, 면역반응성 표면 마커를 하향조절 (수정)함으로써 면역요법을 우회할 수 있는 세포의 고유한 능력이 본 발명자들의 연구를 비롯한 다수의 연구를 통해 입증되었다. 흑색종은 또한 숙주에 억제 효과를 발휘할 수 있다 (예를 들어, 항원-제시 세포의 성숙화 억제 또는 전체 T-세포 활성화 차단) (문헌 ([Tormo et al., 2006]; [Ilkovitch 및 Lopez, 2008]; [Verma et al., 2008])). 따라서, 흑색종은 면역조절제의 항종양 활성을 회피할 수 있는 고유한 능력을 제시한다.
면역요법 분야에 있어서, 그의 증가가 흑색종 요법을 위한 잠재적인 양성 인자로서 연구되어 왔던 분자들 중 하나는, 초기에 흑색종 분화와 관련이 있는 유전자로서 기술된 생성물인 MDA-5 (흑색종 분화 관련 유전자 5: Melanoma Differentiation Associated Gen 5))이다 (문헌 [Kang et al., 2002]). MDA-5는 장쇄 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 인식하고, 그에 의해 활성화되는 헬리카제이다 (문헌 [Yoneyama et al., 2005]). 다른 RNA 헬리카제로는 단쇄 dsRNA의 나형 3 포스페이트를 인식하는 RIG-1 (레티노산 유도성 단백질 1, Dsx58로도 명명된다), 및 dsRNA 센싱에서 음성 조절인자인 LGP2 (Dhx58로도 명명된다)가 있다.
장쇄 dsRNA는 바이러스 감염시 그에 의해 생성될 수 있는 바, MDA-5는 바이러스 병원체에 대한 선천성 면역의 제1 선으로서의 역할을 한다 (문헌 [Akira et al., 2006]). 추가로, MDA-5는 카스파제 활성화 보충 도메인 (CARD)을 가진다. 헬리카제 및 CARD 도메인은 함께 NF-κB 및 시토카인 조절에 관여하는 다른 전사 인자를 활성화시킨다 (문헌 [Kawai et al., 2005]). 따라서, MDA-5의 기능 중 가장 잘 알려져 있는 것은 면역 자극이다.
치료학상 전향 연구로부터 IFN-β 및 dsRNA가 Mda-5 유전자의 전사를 유도한다는 것이 알려졌다. 따라서, IFN-유도성 성장 억제에서의 Mda-5 발현 증가에 있어 dsRNA가 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 또한, IFN-β에 의한 내인성 MDA-5의 유도는 세포 증식 억제성인 (다시 말해, 세포 주기를 종결시키는) 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Kang et al., 2002]). 따라서, 종양 세포 사멸을 활성화시키기 위해서는 MDA-5가 고도한 수준으로 이소성 과다발현을 하여야 한다 (문헌 [Kovacsovics et al., 2002]). 추가로, 상기와 같은 MDA-5의 이소성 발현의 프로-아폽토시스 활성은 흑색종 사례에서와 같이 (문헌 [Chin et al., 2006]), 과활성 RAS/MEK/ERK 경로를 가진 종양 세포에서는 효과가 없다 (문헌 [Lin et al., 2006]). 따라서, 당 분야에서 계류 중인 과제는 (정상 세포에서는 2차 독성을 유도하지 않으면서) 종양 구획만을 독점적으로 하는 방식으로 화학치료제를 사용하여 내인성 MDA-5를 활성화시키는 방법이었다.
미국 특허 출원 US 2007/0259372는 MDA-5의 발현을 증진시킬 수 있는 화합물에 의해 IFN-β, IFN-α 또는 IFN-γ의 효현제 또는 길항제를 확인하는 방법을 제안한다. 상기 특허는 또한 (Mda-5 유전자 프로모터를 수단으로 한) Mda-5 유전자 발현의 유도제가 종양 세포의 유도성 말기 분화에 대한 후보 화합물로서 간주될 수 있다고 제안한다. 이는 또한 MDA-5의 CARD 도메인을 통한 아폽토시스 신호 발생에서 MDA-5의 가능한 역할을 제안한다. 그러나, 현재까지는 아폽토시스를 유발할 수 있는 MDA-5의 표적이 무엇인지, 및 종양 세포에 대해 추적가능하고 선별가능한 방식으로 MDA-5를 활성화시키는 방법이 무엇인지는 알려진 바 없다. 추가로, 흑색종 세포는 (MDA-5를 억제시키는) 활성을 가진 RAS/MEK/ERK 활성 경로 뿐만 아니라, 아폽토시스 세포 사멸을 회피할 수 있는 뚜렷한 능력을 가지고 있는 바, MDA-5에 의해 매개되는 아폽토시스 신호가 흑색종에 대한 요법을 위한 유효 기전이 될 것이라는 것은 분명치 않다. 그러므로, MDA-5 조절 및 기능에 대한 종래 정보로부터 상기의 단백질이 흑색종에 대한 치료제의 후보를 확인하기 위한 방법에서 강력한 표적은 아닌 것으로 나타났다.
자가포식이 암 세포의 내인성 사멸 기구를 사용하는 대체 전략법으로서 떠오르고 있다.
이러한 방법은 궁극적으로는 리소좀에 의한 추후의 분해를 위해 세포질 성분을 제거하는 이벤트로 이루어진 복잡한 캐스케이드를 포함한다 (문헌 [Xie and Klionsky, 2007]). 포식 기전 및 자가리소좀으로 전달되는 카르고의 성질에 따라, 다중의 자가포식 기전이 기술된 바 있다. 항암 치료와 관련하여, 세포 소기관 및 단백질 응집체의 큰자가포식, 또는 벌크 분해는 주요 소기관 (예를 들어, 소포체 또는 미노콘드리아)의 기능이상 또는 과도한 상실에 의해 세포 생육성을 손상시킬 수 있는 그의 잠재성에 대한 관심을 일으키고 있다 (문헌 [Hoyer-Hansen, 2008]).
그러나, 자가포식이 조절되는 방법은 알려지지 않은 상태이며, 그의 치료학상 잠재능은 분명하지 않으며, 간단하지 않다 (문헌 [Hippert et al., 2006]). 한편, 큰자가포식 (본 발명자들은 이하 상기 용어를 "자가포식"으로 간단하게 언급할 것이다)은 매우 다양한 공격적 세포내 및 세포외 신호 (항암 약물 포함)로부터 세포를 보호할 수 있는 중요한 잠재능을 입증하였다. 이러한 활성을 통해 자가포식은 종양 발생을 촉진시킬 수 있다 (문헌 ([Mizushima et al., 2008]; [Kroemer and Levine, 2008])).
역설적으로, 자가포식은 또한 세포 사멸과도 관련이 있다 (문헌 [Kromer et al. 2009]). 따라서, 과도한 또는 지속적인 자가포식은 주요 소기관 (즉, 소포체 또는 미노콘드리아)의 상실에 의해 세포를 사멸시키는 것을 촉진시킬 수 있고/거나, 생존 신호의 재송신(rewiring)을 촉진시킬 수 있고/거나, 리소좀 효소의 탈조절을 촉진시킬 수 있고/거나, 카스파제-의존성 아폽토시스 프로그램의 활성화를 촉진시킬 수 있다 (문헌 [Xie and Klionsky, 2007]).
결과적으로, 자가포식이 치료 반응을 개선시키는 대신에, 흑색종 화학- 및 면역-내성을 악화시킬지 여부는 불분명하였다. 추가로, 현재까지 포유동물 세포에 존재하는 것으로 기술된 20가지가 넘는 자가포식 유전자들 중 어느 것도 흑색종에서의 특징에 대해서는 규명된 바 없다. 그러므로, 자가포식이 흑색종 및 정상 세포에서 차별화된 방식으로 조절됨으로써 치료학상 개입에 대한 기회를 제공할지 여부는 알려진 바 없다. 공격성 암, 예를 들어, 췌장암, 방광암, 전립선암 및 뇌암에도 유사한 상황이 적용된다.
이러한 상황하에서, 이미 허가받은 치료제에 대한 대안으로서, 특히, 면역손상 환자의 치료에 대해 유효한, 암 치료용 치료제를 확인하는 것이 남아 있다. 가능한 신규의 치료학상 표적들에 대해 작용할 수 있는 화합물 중에서도 암 치료용의 후보 치료제를 확인하는 방법 개발을 위한 상기 표적을 확인하는 것 역시 여전히 필요하다.
따라서, 본 방법은 상기 2가지 문제에 대한 해결안을 제시한다.
상기에서 인용된 바와 같이, 본 발명은 먼저 치료학상 표적, 마커, 또는 파라미터들을 확인하는 데 중점을 두고 있으며, 이는 (상기 치료학상 표적, 마커 또는 파라미터들에 작용할 수 있는 화합물들 중에서도) 암을 치료할 수 있는 화합물을 확인하는 데 유용한 방법 개발에 대한 기초가 된다.
암을 치료할 수 있는 화합물을 확인하는 데 유용한, 본 발명에서 확인되는 마커들 중 하나는 패밀리 헬리카제 MDA-5의 활성화 수준이다. 이러한 파라미터는 단백질의 단백질분해성 절단을 통해 헬리카제 및 카스파제 도메인의 분리가 일어나는지를 체크함으로써 측정될 수 있으며: 암 치료용의 치료제가 되는 후보 화합물은 단백질분해성 절단을 일으킬 수 있어야 하는데, 이러한 단백질분해성 절단은 상기 화합물이 암 세포를 사멸시키는 자가포식 및 아폽토시스 기전을 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다. 상기 시험에 사용될 수 있는 가능한 방법은 세포 배양물의 단백질 추출물을 면역블롯팅 (웨스턴 블롯팅)하고, 전체 단백질 및 헬리카제 도메인 및 카스파제 도메인에 상응하는 단편에 상응하는 신호 밴드를 시험하는 것이다. 구체적으로, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 30 kD 밴드의 출현은 단백질분해성 절단이 일어났음을 시사하는 것이다. 별법으로는 또한 MDA-5의 다른 헬리카제 패밀리, 예를 들어, RIG-I 또는 LGP2의 활성화를 측정할 수도 있다.
또한 암을 치료할 수 있는 화합물을 확인하는 데 유용한, 본 발명에서 확인되는 또다른 마커는 NOXA 발현 수준이다. 이에 대한 이론적 설명은, 자가포식 및 아폽토시스 기전이 활성화되었을 때에 상응하는 유전자의 발현 수준이 증가한다는 것이다. 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 예를 들어, 상응하는 메신저 RNA의 농도를 측정하거나 (이는 예를 들어, 노던 블롯 또는 RT-PCR에 의해 수행될 수 있다), 또는 (예를 들어, 웨스턴 블롯과 같은 이동에 의해) 상응하는 세포 배양물의 단백질 추출물 중 단백질 그 자체의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. 추가로, NOXA는 면역조직화학법에 의해 계내에서 (조직 표본 중에서) 검출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, MDA-5가 자가포식 및 아폽토시스, 이 둘 사이의 연결점이 되는 것으로 간주되는 바, 자가포식 및 아폽토시스 기전의 활성화에 대한 확증으로서 MDA-5 및 NOXA, 이 둘 모두를 조사한다.
추가로, 암에 대해 사용되는 후보 화합물에 의한 자가포식 유도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 자가포식 유도는 수개의 기법에 의해 측정될 수 있으며, 하기를 포함한다:
· 자가포식 유전자 8 (이는 ATG8 또는 LC3으로 지칭된다)에 의해 발현된 단백질의 번역 후 수식을 모니터링하는 것. 자가포식이 일어나는 동안 세포 성분이 포획되는 장소인 막 구조체인 자가포식소체 내로 삽입되었을 때, LC3 단백질은 프로세싱되고, 지질화된다. 지질화에 의해 변화가 일어난 상기 단백질의 입체형태 및 전기영동 이동에 기인하여, 자가포식 유도 확인이 가능한 기법들 중 하나는 상기 단백질에 대한 항체를 사용한 면역블롯 기법을 사용하는 것이다. 이러한 기법을 통해서, 전기영동 수행 이후, 샘플들의 비교시 상기 단백질에 상응하는 밴드가 대조군 샘플과 상이하다는 것을 확인할 수 있으며, 여기서, 화합물이 자가포식을 유도하였다는 것으로 간주된다. 별법으로, 항체가 자가포식소체 형태를 특이적으로 인식할 경우, 항체 결합(union)을 통해 후보 화합물로 처리된 샘플 중의 자가포식 유도를 확인할 수 있게 될 것이다.
· 자가포식의 또 다른 특질은 LC3의 세포질로부터 새로 형성된 자가포식소체로의 배치 전환인 바 (문헌 [Xie and Klionsky, 2007]), LC3 단백질의 세포내 분포 변화를 모니터링하는 것. 따라서, 단백질 초점 형성이 특히 조기 단계에서는 자가포식소체 형성을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 이는 고정 세포 또는 고정 조직에서의 면역형광법 또는 면역조직화학법에 의해 내인성 LC3을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 별법으로, 자가포식은 LC3의 형광성 유도체의 세포 위치화를 측정함으로써 살아있는 세포에서 시각화될 수 있다. 형광성 단백질 GFP (녹색 형광성 단백질) 또는 RFP (적색 형광성 단백질)로서 사용하는 것이 통상적인데, 이를 통해 형광 현미경에 의해서 자가포식을 추적할 수 있으며: 확산형 패턴으로부터 초점 염색으로의 세포 형광 분포 변화가 자가포식 유도를 나타낸다. 본 발명에서, 상기 방법론은 융합 단백질이 일시적으로 발현될 수 있도록 하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스)로 형질감염된 세포, 또는 리포터 단백질 및 LC3에 의해 형성된 융합 단백질을 발현할 수 있는 DNA 세그먼트가 안정적인 방식으로 게놈 내로 통합되어 있는 세포를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 전략법의 일례는, 세포를 재조합 레트로바이러스로 사전에 형질감염시켜 진행된 하기 실시예 1에 제시되어 있다. 이로써, 세포 게놈 DNA 내로 융합된 융합 단백질이 형성될 수 있도록 하는 방식으로 단백질 GFP 및 LC3의 코딩부를 함유하는 DNA 단편이 함께 세포 게놈 내로 삽입되었다. 따라서, 안정적으로 형질감염된 세포를 사용하여 세포내 분포 변화 시험을 수행할 수 있다.
· 후보 화합물의 세포 내로의 이입을 검출하기 위해 투과 전자 현미경검사법을 사용하는 것. 이러한 환경은 자가포식의 과정 중 보다 상급 단계에서의 자가포식소체 형성을 알려준다. (막-결합형의) 조밀한 구조체 축적의 시각화가 자가포식소체 형성을 나타내는 특징으로 간주된다. 자가포식 과정은 상기 과정 후기 단계 (즉, 시험되는 화합물로 처리한 후 24 또는 30시간이 경과한 후)에서 확인될 수 있는데, 상기 단계에서는 전자 현미경을 통해 세포 붕괴를 나타내는 것인 거대 포식 액포의 형성을 볼 수 있어야 한다.
상기 논의한 내용에 유념하면서, 본 발명의 제1 실시양태는
a) 후보 화합물을 암 세포 배양물, 또는 암 세포로부터 유래된 암 세포주와 접촉시키는 단계;
b) 하기 파라미터들:
i. 패밀리 헬리카제 MDA-5의 활성화 수준;
ii. NOXA 발현 수준; 또는
iii. 그의 조합
중 적어도 하나를 측정하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계
를 포함하는, 암 치료를 위해 사용되는 화합물을 확인하는 방법 (이하, 본 발명의 방법)에 관한 것이다.
후보 화합물로 처리된 세포 배양물로부터 수득한 데이터와 비처리군 대조군으로부터 수득한 데이터 사이의 차이는, 분석 결과 값이 p <0.05일 때 통계학상 유의적인 것으로 간주된다는 것에 주의하여야 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 후보 화합물이 암 세포에서, 암 세포로부터 유래된 세포주에서, 또는 암 모델 마우스에서 자가포식을 유도하는지 여부를 측정한다. 상기에서 설명된 바와 같이, 자가포식 단백질의 발현 수준, 그의 번역 후 수식의 존재 또는 세포내 위치화를 체크함으로써 자가포식 유도를 측정할 수 있다. 더욱 구체적으로, 자가포식 유도는 단백질 LC3의 전기영동 이동의 변화, 또는 단백질 LC3의 초점 형성의 검출로부터 선택된 기법에 의해 측정한다. 별법으로, 자가포식 유도는 예를 들어, 투과 전자 현미경검사법을 사용하여 자가포식소체를 현미경으로 관찰함으로써 자가포식소체의 존재를 체크하여 측정한다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 상기 기술된 본 발명의 방법은 MDA-5의 활성화 수준 측정, NOXA 발현 수준 측정, 및 자가포식 유도 측정이라는 3단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 여러 유형의 암, 예를 들어, 흑색종, 췌장암종, 결장암종, 방광암종, 유방암종, 전립선암종, 폐암종 및 난소암종 치료용의 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명이 흑색종 치료용의 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 것을 목표로 할 경우, 본 발명은 하기 단계를 포함할 것이다:
a) 후보 화합물을 흑색종 세포 배양물, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주와 접촉시키는 단계;
b) 하기 파라미터들:
i. 패밀리 헬리카제 MDA-5의 활성화 수준;
ii. NOXA 발현 수준; 또는
iii. 그의 조합
중 적어도 하나를 측정하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계.
유효 세포주와 관련해서는 임의의 흑색종 세포주로부터의 것, 바람직하게는, 인간 기원으로부터의 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용된 유효 세포주의 예로는 인간 세포주 SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 및 SK-Mel-147, 및 뮤린 B16 세포가 있다. 면역계 세포 뿐만 아니라, 정상적인 세포 대조군, 멜라닌세포, 또는 다른 피부 세포는 보통 암의 치료에서 2차 독성 부위를 나타낸다.
별법으로, 본 발명의 방법은 하기 유형의 암: 췌장암, 결장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종 중 적어도 하나를 치료하기 위한 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 데 중점을 두고 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 하기 단계:
a) 후보 화합물을, 상기 언급된 유형의 암들 중 적어도 하나로부터의 암 세포 배양물, 또는 상기 언급된 유형의 암들 중 적어도 하나로부터 유래된 세포주와 접촉시키는 단계;
b) 하기 파라미터들:
i. 패밀리 헬리카제 MDA-5의 활성화 수준;
ii. NOXA 발현 수준; 또는
iii. 그의 조합
중 적어도 하나를 측정하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계를 포함할 것이다.
이러한 경우, 세포주는 췌장암 세포주: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 및 Panc-1로 이루어진 군으로부터; 또는 결장암 세포주: CACO, SW480 및 SW1222로 이루어진 군으로부터; 또는 방광암 세포주: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 및 SW1170으로 이루어진 군으로부터; 또는 신경아교종 세포주: U87MG, U251 및 T98G로 이루어진 군으로부터; 또는 유방암 세포주: MDA231, MCF7 및 T47D로 이루어진 군으로부터; 또는 전립선암 세포주: LNCaP, PC3 및 DU145로 이루어진 군으로부터; 또는 폐암 세포주: H1299 및 NCI H460으로 이루어진 군으로부터; 또는 난소암 세포주: NCI H23, CHQK1 및 SK-OV-3으로 이루어진 군으로부터 선택될 것이다.
본 발명의 방법을 수행하는 바람직한 방법은 하기 본 발명의 실시예에서 기술한다. 그러한 경우, 본 발명의 방법은 이미 언급한 바 있는 3가지 가능한 방법론에 의한 MDA-5 활성화 측정, 유전자 발현 분석 (NOXA 발현 증가 관찰) 및 자가포식 활성화 확인: 면역블롯에 의한 LC3 단백질 번역 후 수식 모니터링, (융합 단백질 GFP-LC3을 발현할 수 있는 구조체를 함유하는 재조합 레트로바이러스로 사전에 형질감염된 세포를 사용하여 이루어지는) 형광성 단백질 GFP에 기인한 형광 검출에 의한 LC3의 세포 분포 변화 추적, 후보 화합물 처리 후 5시간째 투과 전자 현미경검사법에 의한 자가포식소체 형성 확인, 및 처리 후 30시간째 포식 액포 확인의 조합을 사용함으로써 수행된다.
상기 설명된 본 발명의 방법을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA) 또는 그의 유사체, 및 폴리양이온의 조합물을 포함하는 신규의 화합물을 확인할 수 있다는 점이 중요하다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물은 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC) 및 폴리에틸렌이민 (PEI)의 조합물을 포함하는 BO-110 (pICPEI)이다.
하기 본 발명의 실시예 및 도면에서 입증되는 바와 같이, BO-110은 상이한 유형의 암, 예를 들어, 흑색종, 췌장암, 결장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종을 치료하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 BO-110을 포함하는, 암, 예를 들어, 흑색종, 췌장암, 결장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종 치료용 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 제약 조성물은 또한 면역손상 환자를 치료하는 데에도 유용하다.
놀랍게도, pIC 및 PEI의 기능적 상호작용을 통해 기술상의 시너지 효과를 얻게 되는데, 이는 개별 특징의 기술상 효과의 총합을 개선시키고 변형시킨다. 따라서, BO-110은 세포 내로 이입하여, 그의 성분인 PEI 및 pIC와는 다른 방식으로 작용한다. 구체적으로, PEI의 세포 효과는 측정불가능하고, 단리된 pIC 신호는 일시적으로는 면역반응을 유도하나, 궁극적으로는 생체내에서는 생물학상 어떤 영향도 주지 못하지만, BO-110은 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 그러므로, BO-110은 단일 제제로서는 활성이 없지만, 조합되었을 때에는 상이하고, 치료학상 이용가능한 항암 효과를 가진, 유전자 또는 화합물에 대해 기술된 합성 치사의 개념을 설명한다.
그러므로, 본 발명의 가장 중요한 요점들 중 하나는 바이러스 dsRNA 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC)의 모방체가 그의 종양 세포 내로의 이입 및 전달 경로를 변화시킨다는 예상외의 발견이다. TLR-3 (톨-유사 수용체 3)에 의한 표준 인식으로부터, pIC는 (TLR3과는 다른) dsRNA 센서 패밀리가 특이적으로 세포질 전달을 허용하는 캐리어 패밀리와 조합되었을 때에 상기 dsRNA에 표적화될 수 있다. 이러한 활성이 dsRNA의 작용 모드를 중요하지 않은 면역조절제로부터 종양 세포의 대량 살세포로 변화시킨다. 폴리에틸렌이민 (PEI) 뿐만 아니라, 리포펙트아민, 폴리펙트 또는 슈퍼펙트를 사용하여 항암 활성을 입증하였다. 비록 이러한 캐리어들이 그 단독으로는 치료제로서의 생물학상 활성은 없지만, 본 발명을 통해 상기 캐리어들이 pIC 분자를 보호하여, 이들을 자가포식 활성화를 허용하는 안정한 형태로 유지시켜 주는 것으로 나타났다. 그러므로, BO-110으로 예시되는, dsRNA/폴리양이온 조합물이 항암 효능을 지닌 신규한 분자 엔티티를 나타낸다. 보다 중요하게, BO-110의 작용 모드는 예상 밖의 것이었다. 상기 화합물은 이중으로 자가포식 유도 및 아폽토시스를 촉진시켜, 정상 구획의 생육성에는 어떠한 영향도 미치지 않으면서, 특히, 흑색종 세포로만 독점적으로 하는 것이 아닌, 종양 세포를 공동 작용을 통해 선택적으로 사멸시킨다. 아폽토시스 기구는 단백질 NOXA를 통해 사용되었다. 다른 NOXA-유도성 화학치료제와 달리, BO-110은 종양 억제인자 단백질 p53을 필요로 하지 않는다. 대부분의 인간 암에서는 p53이 돌연변이화되어 있거나, 결실되어 있거나, 또는 불활성화되어 있기 때문에 이는 중요한 장점이 된다. 효과는 나형 바이러스 RNA에 대한 고전적 반응보다는 분명 우수하며, 이는 흑색종 치료용으로서의 나형 pIC에 대한 임상 연구에서 보여진 열악한 결과를 설명한다.
따라서, 복합체를 형성하지 않은 dsRNA가 아닌, BO-110은 생체내에서, 심지어는 면역손상 마우스에서 조차 암 세포의 자가-사멸을 촉진시키고, 암 전이를 차단하는 데 충분하였다. 본 발명에서 추후에 기술되는 유전적, 기능적 및 초미세 구조 분석을 통해 자가포식 유도는 pIC에 의해서 세포 보호를 위해 일어나는 것이 아니라, 종양 세포를 선택적으로 파괴시키기 위해 일어난다는 것이 입증되었다. 이러한 결과를 추가로 입증하면서, 비록 pIC가 IFN에 의해 조절되는 면역 유도제로서 간주되기는 하지만, 관찰된 효과는 IFN-α의 생산 및 분비를 위한 경로 활성화와는 무관하다. 이러한 관찰 결과와 일관되게, 자가포식 경로의 활성화는 심지어 면역손상 동물에서조차 일어난다. 이러한 데이터들은 모두 BO-110이 내인성 병원체 인식 프로그램, 자가포식 및 종양 세포 사멸의 임상적 이용을 위한 새로운 개입 점을 표적하고 확인시켜 준다.
유전적 및 기능적 연구를 통해 내인성 MDA-5가 BO-110에 의해 유도된 자가포식 경로와 아폽토시스 경로 사이의 연결점인 것으로 확인되었다. 이는 또한, 외인성 성분에 의한 아폽토시스 세포 사멸로 제한된다는 MDA-5 관련의 이전 개시 내용과도 상이하다. MDA-5/NOXA 상호작용 또한 신규한 것이었다.
따라서, MDA-5는 자가포식소체/리소좀 및 내인성 아폽토시스 프로테아제에 의해 종양 자가-파괴를 일으키는 특이적인 특징을 가진 암 치료용 제제를 스크리닝하는 데 적합한 치료학상 표적으로서 제시된다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 전략법은 상기 기전들 중 어느 것을 독립적으로 사용하는 표준 치료제보다 우수한 장점을 가지고 있다.
유사하게, 상기 경로를 활성화시킬 수 있기 때문에 그의 발견을 가능하게 만든 엔티티는 복합체 BO-110 또는 dsRNA의 유사체와 양이온성 캐리어의 다른 조합물이다. 그러므로, 이러한 제제는 암 치료용 의약 제조를 위해 사용될 수 있는 우수한 후보 물질이 된다.
본 발명에서 사용되는 바, "이중 가닥 RNA의 장쇄 단편"이라는 용어는 단쇄 RNA 또는 간섭 RNA (siRNA)로 알려져 있는 RNA 단편의 반대되는 개념으로 사용된다. 그러므로, 이중 가닥 RNA 단편이 쇄 당 적어도 25개의 뉴클레오티드를 포함할 경우, 이중 가닥 RNA (이중쇄)는 "장쇄"인 것으로 간주된다. 사용되는 단편의 길이는, MDA-5의 헬리카제 패밀리의 천연 기질인 것으로 보이는, 대부분의 RNA 바이러스의 세포 주기 동안에 세포에서 출현하는 이중 가닥 RNA 중간체와 유사한 것이 바람직하며, 따라서, 본 발명의 이중 가닥 RNA는, 특히 쇄 당 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함할 경우, 더욱 특히, 쇄 당 적어도 1000개의 뉴클레오티드를 포함할 경우, "장쇄"인 것으로 간주된다.
천연적으로 발생된 것으로서, 본 발명에 유용하게 사용될 수 있는 이중 가닥 RNA의 단편은 파라믹소바이러스 (예를 들어, 뉴캣슬 병(Newcastle disease) 바이러사 (NDV), 센다이 바이러스(Sendai virus: SDV)), 랍도바이러스 (수포성 구내염 바이러스 (VSV)); 플라보바이러스 (C형 간염 바이러스 (HCV)), 오르토믹소바이러스 (인플루엔자 바이러스) 및 피코르나바이러스 (뇌심근염바이러스 (EMCV))의 세포 주기 동안에 발생하는 이중 가닥 RNA 중간체일 수 있다.
이중 가닥 RNA 유사체와 관련하여, 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC) 이외에도, 본 발명에는 다른 dsRNA 모방체: a) 그의 골격이 리보스와 유사한 화합물에 의해 형성된 것인 dsRNA 모방체, 예를 들어, LNA (잠금 핵산: 가수분해에 대해 내성을 띤다), 모르폴리노 및 PNA (펩티드 핵산)계의 dsRNA 모방체, b) RNA의 뉴클레오티드의 전형적인 질소 염기 중 적어도 하나가 유사체에 의해 대체됨으로써, 이를 통해서 또한 천연 현상과는 다른 쌍이 형성될 수 있는 것인 dsRNA 모방체, 예를 들어, 디아미노퓨리나 (이는 3개의 수소 결합에 의해 우라실과 쌍을 형성한다), 크산틴/디아민피리미딘 쌍 (퓨린의 케토형/케토형인 크산틴은 아민/아민 피리미딘과 3개의 수소 결합을 형성), 또는 이소구아닌/이소시토신(퓨린의 아민형/케토형인 이소구아닌은 피리미딘 케토-아민인 이소시토신과 3개의 수소 결합을 형성)이 유용할 수 있다.
폴리양이온 캐리어와 관련하여, 본 발명의 목적을 위해서는 형질막의 투과성을 변경시킬 수 있는 것들 모두를 사용하고/거나, 이중 가닥 RNA 또는 그의 유사체의 세포 내로의 이입을 촉진시키고, 이를 세포질로 방출시킴으로써 세포내이입을 유도하여 이중 가닥 RNA의 세포질 센서, 예를 들어, 헬리카제 MDA-5의 활성화를 증가시키는 것이 적합하다. 이러한 정의하에서 폴리에틸렌이민I (PEI) 및 리포펙트아민 이외에도, 폴리-L-리신, 폴리실라잔, 폴리디히드로이미다졸리니움, 폴리알릴아민 및 에톡실화된 폴리에틸렌이민 (ePEI)가 포함된다.
이에, 본 발명은 하기 실시예 및 도면을 통해 하기에서 보다 상세히 설명될 것이다.
도 1. BO-110에 의한 큰자가포식의 유도가 흑색종 세포 사멸을 일으킨다.
패널 a는 12h 동안 1 ㎍/ml의, PEI와 복합체화된 pIC (BO-110)로 처리된 SK-Mel-103 흑색종 세포에서 eGFP-LC3의 자가포식소체-유사 초점 염색의 표면형광에 의해 시각화한 것을 나타낸다. 단일 제제로서의 PEI로 처리된 세포는 참조 대조군으로서 제시되어 있다.
패널 b는 SK-Mel-103 세포를 BO-110 또는 위약 대조군으로 처리하였을 때 eGFP-LC3의 점 모양의 형광 방출을 보이는 SK-Mel-103 세포의 시간-의존성 축적을 나타낸 것이다. 라파마이신은 고전적 자가포식 유도제로서 사용되었다.
패널 c는 명시된 바와 같이 처리된 SK-Mel-103 세포로부터 단리된 전체 세포 추출물의 면역블롯을 나타낸 것이다. 처리는 각 라인의 상단에 명시되어 있다: 대조군 (비처리군: 오직 비히클의 존재하에서만 인큐베이션된 세포 군집), pIC 또는 BO-110으로 처리된 세포. 분석된 단백질은 각 패널들 좌측에 명시되어 있다: 비변형 ATG8 (LC3 I), 지질화된 ATG8 (LC3 II) 및 로딩 대조군 (β-액틴). 각 패널들 우측에는 분자량 (kDa)이 명시되어 있다.
패널 d는 BO-110 또는 PEI 대조군으로 처리된 SK-Mel-103 세포의 전자 현미경에 의한 현미경 사진을 나타낸 것이다. 화살표 표시는 막-결합 자가포식소체 및 자가리소좀을 가리킨다.
패널 e는 비히클 (좌측 칼럼) 또는 BO-110 (우측 칼럼)과 함께 인큐베이션시킨 후 5시간이 경과하였을 때의 SK-Mel-103 세포를 고배율 (상단) 및 저배율 (하단)로 확대시킨 마이크로사진을 나타낸 것이다.
패널 f는 사진에 명시되어 있는 바와 같이 처리한 후 30시간이 경과하였을 때의 세포 콜로니의 명시야 현미경검사법 (좌측 및 중간) 및 전자 현미경검사법 (우측)에 의한 대표적인 마이크로사진을 나타낸 것이다.
도 2. 흑색종 세포에서 BO-110에 의한 자가포식 유도에 대해 시간 간격을 두고 실시한 현미경 검사
eGFP-LC3을 발현하는 SK-Mel-103 흑색종 세포를 PEI (대조군) 또는 BO-110으로 처리한 후, 명시된 시간 간격을 두고 촬영된 연속 마이크로사진. 초점 응집체는 자가포식소체 형성을 나타낸다. 화살표 표시는 처리 동안 일어난 세포 붕괴 및 분리 (사멸 세포)를 나타낸다.
도 3. PEI 존재에 기인한 pIC의 세포질로의 전달이 선택적인 방식으로 흑색종 세포 사멸을 일으킨다.
패널 a는 명시된 바와 같이 처리한 후, 24 및 48시간이 경과하였을 때의, 트립판 블루 배제법에 의해 추정된 세포 사멸율(%)을 나타낸 그래프를 제시한 것이다 (NT: 흰색 막대, PEI 처리: 암회색 막대, pIC 처리: 밝은 회색 막대, BO-110: 검은색 막대). 데이터는 그래프 상단에 명시된 다른 세포주를 사용하여 실시된 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다. 제시되어 있는 바와 같이, 오직 BO-110으로 처리된 흑색종 세포 군집만이 효율적으로 사멸하였다.
패널 b: 비히클 (Ctr), PEI, pIC 또는 BO-110으로 처리하고, 처리 후 12시간이 경과하였을 때 시각화한 SK-Mel-28 및 SK-Mel-103 세포의 전자 현미경에 의한 현미경 사진. 각 세포주에 대해, 2개의 다른 확대 배율로 촬영한 사진이 제시되어 있다. 화살표 표시는 오직 BO-110으로 처리된 세포에서만 관찰된 자가리소좀을 가리킨다.
도 4. BO-110의 종양 세포에 대한 선택적인 세포독성 활성
패널 a는 명시된 바와 같이, 인간 포피로부터 단리된 멜라닌세포 (맨 윗줄), 인간 흑색종 세포 SK-Mel-103 (가운데 줄) 및 뮤린 B 16 흑색종 세포주 (맨 아랫줄)를 비히클, PEI, pIC 또는 BO-110로 처리한 후의 대표적인 명시야 영상을 나타낸 것이다.
패널 b는 FM (포피 멜라닌세포) 및 SK-Mel-103의, 개별 제제로서의 PEI 및 pIC 처리 또는 조합물 (BO-110) 처리 (각 그래프에서 우측 막대군)에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸다. 반응은 처리 후 24시간이 경과하였을 때의 사멸 세포의 비율(%)로서 나타내었다.
패널 c의 그래프는 처리 수행 후 24시간이 경과하였을 때의, 트립판 블루 배제법에 의해 추정된 세포 사멸율(%)을 나타낸 것이다 (Ctrl: 비처리; PEI, pIC, 및 BO-110). 데이터는 명시된 세포주 (SK-Mel-103 또는 포피 섬유아세포)를 사용하여 실시된 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다. 패널 a에서와 같이, 오직 BO-110으로 처리된 흑색종 세포 군집만이 효율적으로 사멸하였다.
도 5. MDA-5는 흑색종 세포에서 BO-110의 세포독성의 센서 및 유도제이다.
패널 a는 각기 다른 라인에 명시된 바와 같이, 비처리되거나 (NT), 또는 PEI, pIC, BO-110 또는 보르테조밉 (Bor)로 처리된 SK-Mel-28 (상단 사진) 및 SK-Mel-147 (하단 사진)로부터 단리된 전체 세포 추출물의 면역블롯을 나타낸 것이다. 별표 표시는 비특이 밴드에 상응하는 것이다. 화살표 표시는, 30 kDa 밴드가 관찰되어야 하는 위치를 가리키는데, 이는 MDA-5 절단을 시사하는 것이다.
패널 b: 명시된 바와 같이, pIC, BO-110 또는 비히클 처리 후 세포 추출물의 면역블롯팅을 통해 시각화된, 감염되지 않은 SK-Mel-147 세포, 또는 스크램블된 또는 MDA-5 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 SK-Mel-147 세포에서의 MDA-5의 프로세싱. 패널 a에 나타낸 바와 같이, 별표 표시는 비특이 밴드를 나타내고, 화살표 표시는, 30 kDa 밴드의 위치를 가리키는데, 이는 MDA-5 절단을 시사하는 것이다.
패널 c는 pIC 단독으로 처리된 세포 (회색 막대, ▩), BO-110I 복합체로 처리된 세포 (검은색 막대, ■) 또는 비처리 세포 (흰색 막대)에서의 상기와 같은 처리 후 24시간이 경과하였을 때의, 트립판 블루 배제법에 의해 다루어진, BO-110에 의해 유도된 표적화된 독성에 대한 MDA-5 shRNA의 억제 효과를 나타낸다. 대조군 shRNA로 감염시킨 것으로부터 얻은 결과 ("sh 대조군") 또한 제시되어 있다. 데이터는 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다.
도 6. BO-110의 세포독성 활성에 대한 자가포식 약리학상 억제제의 효과.
패널 a는 BO-110 (검은색 막대)으로 처리 또는 완충액 대조군 (흰색 막대)으로 처리한 후 12h이 경과하였을 때, GFP-LC3에 기인하여 형광 초점을 가진 SK-Mel-103 세포의 비율(%)로부터 평가된, 자가포식소체에서의 EGFP-LC3 배치 전환에 대한 3-메틸아데닌 (3-MA) 및 클로로퀸 (Chlor)의 효과를 나타낸 것이다.
패널 b는 비히클 (흰색 막대) 또는 BO-110 (검은색 막대)으로 처리한 후 20시간이 경과하였을 때의, 트립판 블루 배제법에 의해 추정된, 세포 사멸에 대한 클로로퀸 (Chlor), 펩스타틴 A (PEP) 또는 E64d의 억제 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다.
패널 c는 BO-110 또는 25 nM 라파마이신 처리 후, 자가포식소체 형성 (35 적색 및 녹색 초점) 및 자가리소좀 (오직 적색 초점만)을 검출하기 위해 체리-GFP-LC3으로 형질감염된 SK-Mel-103 세포에 대한 형광 공초점 현미경 사진을 나타낸 것이다.
패널 d는 비히클 (흰색 막대) 또는 BO-110 (검은색 막대)으로 처리한 후 20시간이 경과하였을 때의, 트립판 블루 배제법에 의해 추정된, 세포 사멸에 대한 100 μM 100 바필로마이신 (Bafil), 20 μM 클로로퀸 (Chlor) 또는 10 ㎍/ml 펩스타틴 (PEP)의 억제 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다.
패널 e는 BO-110으로 처리되거나 (상단 사진), 또는 클로로퀸의 존재하에서 BO-110으로 처리되고 (아랫줄 사진), EGFP-Rab5 야생형으로 안정적으로 형질감염되거나 (도에서 좌측 칼럼), 또는 BO-110 레드 플루오르로 표지된 BO-110과 인큐베이션된 (가운데 칼럼의 사진) SK-Mel-103 세포에 대한 공초점 형광 영상을 나타낸 것이다. 흑색종 세포에서 BO-110의 내재화는 클로로퀸의 부재 또는 존재하에서 관찰할 수 있었다.
패널 f는 (비히클 (대조군) 및 BO-110으로 처리된 2개의 SK-Mel-103 세포 모두에서 녹색 형광을 방출하는) 형광성 DQ-BSA의 절단 및 유리의 존재를 통해 리소좀-의존성 단백질분해를 보여주는 공초점 형광 영상을 나타낸 것이다. 클로로퀸 (Chlor: 가운데 줄에 있는 사진)의 존재하에서, DQ-BSA 칼럼 (가운데 칼럼)에서는 어떤 형광 신호도 관찰되지 않았다. 동시에, 리소트랙커-레드 (LTR-Red: 좌측 칼럼의 사진)의 존재하에서의 세포의 영상은 리소좀 구획을 나타내는데, 이는 3줄의 사진 모두에서 신호가 방출된 것으로 보였다.
패널 g는 패널 f의 시험 세포에서 DQ-BSA 및 리소트랙커-레드 신호에 상응하는 것이 동일 위치에 존재한다는 것을 제시하는 막대 그래프를 나타낸 것이다 (Ctrl: 대조군, 검은색 막대, ■; Chl: 클로로퀸, 흰색 막대; BO-110, 회색 막대, ▩). 동일 위치에 존재한다는 것은 2개의 독립된 실험에서 실험된 최소 150개의 세포로부터 추정된 것이며, 이는 대조군 세포에서 수득된 값에 대한 상대적인 값으로 표시하였다 (AU: 형광 임의 단위).
패널 h는 영상에서 나타낸 바와 같이, SK-Mel-103이 BO-110 또는 완충액 대조군으로 처리된 후, 상기 SK-Mel-103에서 GFP-LC3 (원래 신호는 녹색, 이는 자가포식소체의 위치를 나타낸다) 및 리소트랙커 (원래 신호는 적색, 이는 리소좀 존재를 나타낸다)에 기인한 형광 초점의 공초점 면역형광 영상을 나타낸 것이다. 훽스트(Hoescht) (상단 사진, 원래 신호는 청색이다)로 핵을 염색하였다. 맨 아랫줄에서 상기 3가지 영상이 중첩되어 나타났는데, 이는 각각 GFP-LC3 및 리소트랙커에 상응하는 영상인 녹색 및 적색 신호를 가진 영역은 황색 또는 오렌지색을 방출하였으며, 이는 GFP-LC3 및 리소트랙커에 상응하는 신호가 같은 영역에 위치한다는 것을 시사한다.
패널 i는 pIC를 포함하는 완충액 대조군으로 ("대조군") 또는 BO-110으로 처리되고, 영상에 제시되어 있는 바와 같이, 리소트랙커 (원래 신호는 적색) 또는 훽스트(원래 신호는 청색)의 존재하에서 인큐베이션된 EGFP-LC3 (원래 신호는 녹색) 발현 SK-Mel-103 세포를 실시간으로 촬영한 공초점 현미경검사법에 의한 영상을 나타낸 것이다. 3가지 영상이 중첩되어 나타났는데 (각 처리, 대조군 또는 BO-110의 우측 하단), 이를 통해 나형 pIC 처리 후인 것을 제외한 BO-110 처리 후의 것인 GFP-LC3 및 리소좀 사이는 강력하게 동일 위치에 존재 (자가리소좀 형성을 통해 예측)한다는 것이 밝혀졌다. 중복 영상을 나타내는 결과 아래쪽에 있는, 패널의 세번째 줄에는 주어진 평면에서 녹색 채널 (EGFP-LC3에 대해서는 "GFP"로 표지된 그래프) 또는 적색 채널 (리소트랙커에 대해서는 "LYSO"로 표지된 그래프)로서 제시된 전체 세포 형광 강도를 정량화함으로써 수득된 그래프가 제시되어 있다. BO-110으로 처리한 세포로부터 얻은 그래프의 경우, eGFPLC3 및 리소트랙커의 두 신호 모두에 대해 유사한 분포는 동일 위치에 존재한다는 것을 나타내는 것이며, 이는 곧 자가포식소체 및 리소좀의 융합을 시사하는 것이다.
패널 j는 pIC (대조군) 또는 BO-110으로 처리된 SK-Mel-103 세포로 구성된 군집-기반 분석의 대표도를 나타낸 것으로서, 이는 EGFP-LC3 (녹색 형광, x축) 및 리소트랙커 (적색 신호, Y축)의 신호 강도로서 표시되어 있다. 사각형으로 표시된 것은 상기 두 마커 모두로 이중으로 염색된 세포를 포함한다.
도 7. BO-110 처리시 엔도좀 수송 및 엠피좀의 생성 및 분해
패널 a는 BO-110 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 명시된 시간만큼 시간이 경과하였을 때의, 실시간 형광 현미경검사법에 의해 포착된, EGFP-Rab7 발현 SK-Mel-103 흑색종 세포의 연속 영상을 나타낸 것이다. BO-110으로 다수의 소포가 생성되었다는 점은 주목할 만하다. 별표 표시는 엔도좀-엔도좀 융합물을 표시한 것이다 (명확하게 하기 위해 오직 몇몇 일례만을 제시하였다).
패널 b는 레트로바이러스로 안정적으로 형질감염되고, 이로써 EGFP-Rab7 wt 융합 단백질 (야생형 Rab7) (좌측으로부터 첫번째 및 세번째 칼럼, 2번째 것의 경우, 칼럼 위에 명시되어 있는 바와 같이 리소트랙커-레드의 존재하에서 수득한 것이다)) 또는 리소트랙커의 존재하에서 인큐베이션된 융합물 EGFP-Rab7 T22N (우측 칼럼의 사진)에 의해 녹색 형광을 발현한 SK-Mel-103 세포의 공초점 현미경검사법에 의한 사진을 나타낸 것이다. 세포를 추가로 BO-110 (아랫줄 패널)으로 또는 비히클 대조군 (상단 패널)으로 처리하였다. BO-110으로 처리한 후 10시간이 경과하였을 때 영상을 포착하였다. 사진 중 우측에 있는 2개의 칼럼은 Rab7로 표지된 소포에 포함된 평균 면적에 상응하는 값을 포함한다.
패널 c는 사진 상에 명시된 시간만큼 시간 (초 (s)) 간격을 두고 촬영된 연속 공초점 현미경 사진을 나타낸 것으로서, 이는 BO-110 처리 후 리소좀과 Rab7-양성 소포의 융합 및 혼입을 도시하고 있다.
패널 d는 BO-110으로 처리되고, GFP-Rab7wt (사진에서 GFP-Rab7), 체리-LC3 (사진에서 Ch-LC3)에 의해 녹색 또는 적색 형광을 방출하거나, 또는 리소트랙커-블루 (사진에서 LTR-블루)에 기인하여 청색 형광을 방출하도록 레트로바이러스로 안정적으로 형질감염된 SK-Mel-103의 실시간 형광 현미경검사법에 의한 영상을 나타낸 것이다. 처리 후 1시간이 경과하였을 때 명시된 시간 (분 (min))에 영상을 촬영하였다. 화살표 표시는 표시된 각 마커가 시각화될 수 있는 제1 순서를 나타낸 것이다.
패널 e는 LC3이 엔도좀 Rab7과 함께 소포의 표면 상에 혼입된 후, 그의 내재화가 일어나고 이어서 분해되는 것을 나타낸 것이다. 이러한 엔도좀/LC3 하이브리드 구조체 (엠피좀)는 EGFP-Rab7 또는 체리-LC3 (사진에서 Ch-LC3)을 발현하는 세포 SK-Mel-103의 실시간 현미경검사법에 의한 형광에 의해 시각화되었다.
도 8. BO-110의 세포독성은 효과기 및 조절형 카스파제의 활성화에 의존한다.
패널 a는 각 그래프 하단에 열거된 화합물: 비히클 (PEI를 포함하지 않는 대조군 완충액) (좌측 그래프), 비타민 E (+ Vite, 가운데 그래프) 또는 카스파제 억제제 ZVAD-fmk (+ZVAD, 우측 그래프)의 존재하에서 완충액 대조군으로서의 PEI (Ctr, 흰색 막대로 표시), pIC (회색 막대), 또는 복합체 BO-110 (검은색 막대)으로 SK-Mel-147 세포를 처리하였을 때 유발되는 세포 사멸율(%)을 나타낸 것이다. 상기 비율은 모든 경우에서 트립판 블루 배제법에 의해 측정되었다.
패널 b는 (좌측에 명시된 바와 같은) 전이성 흑색종 세포주 추출물의 면역블롯 결과를 나타낸 것이다. 처리 후 명시된 시간만큼 시간이 경과하였을 때 (시간 (h), 각 래인상에 표시) 세포를 수집함으로써 수득하였다. 처리는 시간 위에 명시되어 있다: NT (비처리: 완충액 존재하에서 인큐베이션된 대조군 세포 군집), PEI, pIC, 복합체 BO-110 또는 Bor (보르테조밉 25 mM). 각 사진 측면에는 분석된 단백질: casp-9 (카스파제 9), casp-8 (카스파제 8) 또는 튜불린 (로딩 대조군)이 제시되어 있다. 우측에 기재된 숫자는 상대적인 질량 (kDa)을 나타내는데, 이는 각 높이에 존재하는 단백질 밴드에 상응한다.
패널 c는 처리 후 명시된 시간 (24 및 48 시간)만큼 시간이 경과하였을 때 세포를 수집하여 수득한 SK-Mel-103 세포주 추출물의 면역블롯 결과를 나타낸 것이다. 처리는 시간 아래의 레일 위에 명시되어 있다: NT (비처리: 유일하게 완충액만이 존재하는 환경하에서 인큐베이션된 대조군 세포 군집), PEI, pIC 및 복합체 BO-110. 각 사진 측면에는 분석된 단백질: casp-9 (카스파제 9), casp-8 (카스파제 8), casp-7 (카스파제 7), Casp-3 (카스파제 3) 또는 튜불린 (로딩 대조군)이 제시되어 있다.
도 9. BO-110은 p53 상태와는 상관없이, MCL-1의 보상성 활성화는 유도하지 않으면서, NOXA를 통해 아폽토시스를 일으킨다.
패널 a는 처리 후 명시된 시간만큼 시간 (시간 (h))이 경과하였을 때, 세포를 수집함으로써 얻은 SK-Mel-28 세포 (상단) 또는 SK-Mel-147 (하단)로부터의 면역블롯에 대한 사진을 나타낸 것이다. 처리는 시간 위쪽에 명시되어 있다: NT (비처리: 완충액의 존재하에서 인큐베이션된 대조군 세포 군집), PEI, pIC, 복합체 BO-110 또는 Bor (보르테조밉 25 mM). 각 사진 측면에는 단백질: NOXA, Mcl-1 또는 튜불린 (로딩 대조군)이 제시되어 있는데, 상기 단백질들의 수준을 분석하였다.
패널 b는 SK-Mel-28 세포로부터 수득된, 면역블롯팅 후 밀도측정에 의해 계산된 Mcl-1 (상단 그래프) 및 NOXA (하단 그래프)의 상대 수준을 시간의 함수로서 나타낸 2개의 별개의 그래프를 나타낸 것으로서, 처리는 명시된 바와 같고, 상기 상대 수준은 비처리된 대조군 세포에서 수득된 상응하는 값을 참조로 하여 계산된 상대적인 비율을 나타낸 것이다. 각 커브 다음에, 상응하는 처리를 나타내었다.
패널 c는 각 처리군별로 처리한 후 (명시된 시간만큼 시간 (시간 (h))이 경과하였을 때) 세포를 수집하여 수득된, SK-Mel-103 전체 세포 추출물의 면역블롯팅으로부터 촬영된 사진을 나타낸 것이다. 처리는 각 래인 상에 명시되어 있다: NT (비처리: 완충액의 존재하에서 인큐베이션된 대조군 세포 군집), PEI, pIC, 복합체 BO-110 또는 Bor (보르테조밉 25 mM). 각 사진 측면에는 단백질: NOXA, Bcl-xL, Bcl-2 또는 튜불린 (로딩 대조군)이 제시되어 있는데, 상기 단백질들의 수준을 분석하였다. 패널 하단에는 처리 후 관찰된 세포 사멸율(%)이 명시되어 있다.
패널 d는 NOXA 단백질의 발현을 평가하기 위해 디자인된 면역블롯에 대한 사진을 나타낸 것이다. 불활성 shRNA (sh Ctrl) 또는 NOXA에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시킨 후 2일이 경과하였을 때, pIC 또는 BO-110으로 24h 동안 처리한 SK-Mel-103 흑색종 세포로부터 추출물을 수득하였다.
패널 e는 대조군 shRNA (회색 막대, ▩) 또는 NOXA에 대한 shRNA (검은색 막대, ■)를 형질도입하고, 24h 동안 pIC 또는 BO-110과 함께 인큐베이션시킨 (NT: 비처리, 비히클 투여로 그와 함께 인큐베이션된 세포) SK-Mel-103 흑색종 세포의 사멸율(%) (사멸 세포 비율로서 표시)을 나타낸 그래프를 나타낸 것이다.
패널 f는 shRNA 대조군 또는 MDA-5에 대한 shRNA가 형질도입된 SK-Mel-103 세포에서 MDA-5 하향조절이, BO-110에 의한 NOXA 유도에 미치는 억제 효과 (NOXA 수준으로 나타내었다 (임의 단위 (au)로 표시))에 상응하는 것이다. NOXA 수준은 밀도측정으로 측정하였고, 비처리 대조군에 대한 상대적인 값으로 나타내었다 (N Inf: 비간섭, 나형 pIC로 처리된 경우, 그 수준의 값을 1로 정하였고, BO-110 처리된 경우에는 100으로 정하였다).
도 10. 면역적격 마우스에서 BO-110의 항-흑색종 활성
패널 a.
상위 패널. 동계 C57BL/6에서 B16 흑색종 세포의 s.c. 이종이식편을 생성하기 위한 실험적 접근법을 나타낸 개략도. 50 ㎍ (100 ㎕ 중) (2 ng/kg)의 나형 pIC 및 PEI와 복합체화된 pIC를 종양주변에 주사하는 처리 시간 또한 명시되어 있다. 대조군은 100 ㎕의 5% 글루코스 또는 오직 PEI만을 투여받았다.
하위 패널. 명시된 시점에 캘리퍼로 측정하여 추정된 종양 성장을 나타낸 것이다. 1개의 실험군당 10개의 종양을 분석하였다. 통상, 종양 용적이 1000 ㎣를 초과하였을 때 마우스를 희생시켰다. 실험을 2회에 걸쳐 반복하였고, 유사한 결과를 얻었다.
패널 b는 명시된 시점에 동계 C57BL/6에서 B16-EGFP 흑색종 세포를 정맥내 이식시킨 후, 이어서 10 ㎍ (100 ㎕ 중) (1 ng/kg)의 pIC 또는 BO-110으로 정맥내 처리한 것을 나타낸 것이다. 대조군은 5% 글루코스 중의 PEI를 투여받았다. 세포 접종 후 14일이 경과하였을 때, 마우스를 안락사시키고, 형광 영상화를 위해 폐를 프로세싱하였다.
패널 c는 외부 전이를 수작업을 통해 계수하여 수득한, 각 처리군에서 관찰된 폐 전이의 개수를 나타내는 막대 그래프를 제시한 것이다 (C). (NT/PEI 및 BO-110 사이의 P*<0.01; n=5; 일반 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정).
도 11. IFN-α가 BO-110에 의해 유도되지만, 흑색종 세포 사멸을 촉진시키는 데에는 충분하지 않다.
패널 a는 pIC 또는 BO-110으로 처리된 B16 흑색종 세포 및 골수 유래 대식세포를 나타낸다. RNA를 단리시키고, IFN 표적 IFIT-1에 대한 정량적 PCR을 수행하였다. 대조군 비처리된 세포에 대하여 추정된 IFIT-1의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 것이다.
패널 b는 SK-Mel-103 흑색종 세포를 ELISA에 의해 측정된 바, 이미 보다 다량의 IFN-α가 분비된, BO-110으로 처리된 세포에서, 10 pg/ml에서 시작하는 명시된 농도의 인간 재조합 IFN-α로 처리한 것을 나타낸 것이다. 처리 후 24h이 경과하였을 때 세포 사멸을 측정하였다. 대조군으로서, 세포를 동시에 BO-110으로 처리하였다(24h). 보다 고수준의 IFN-α는 흑색종 세포에 대해 세포독성은 아니며, BO-110에 의한 효율적인 사멸의 발생을 반복시키지는 못한다는 점에 주의한다.
도 12. 면역억제가 BO-110의 흑색종의 전이성 파종을 차단할 수 있는 능력을 손상시키지는 않는다.
패널 a는 (NK, B 및 T 세포에 대한 중증 면역결핍성인) SCID를 앓는 베이지 마우스에서 B16 유도성 흑색종 폐 전이의 생성 및 처리를 나타낸 것이다. 영상은, B16 흑색종 세포를 i.v.로 접종받고, PEI, pIC 또는 BO-110으로 처리된 마우스의 대표적인 폐의 가시광 또는 형광빛 하에서 촬영된 사진에 상응하는 것이다. 영상은 세포 주사 후 14일째 포착하였다.
패널 b는 패널 a에서 명시된 바와 같이 B16에 의해 유도된 전이의 평균 개수를 나타낸 것이다 (PEI, pIC 및 BO-110 처리군 사이의 P*<0.01; n=5; 일반 만-휘트니 검정).
패널 c는 PEI, pIC 또는 BO-110으로 처리된 마우스에서 B16 유도성 폐의 조직학적 분석을 나타낸 것이다. 명시된 처리군으로부터으로부터 얻은 폐 중 H&E로 염색된 대표적인 지점을 나타낸 것이며, 2개의 상이한 확대 배율 (10x 및 40x)로 시각화한 것이다.
패널 d는 (NK, B 및 T 세포에 대한 중증 면역결핍성인) SCID를 앓는 베이지 마우스에서 SK-Mel-103 유도성 흑색종 폐 전이의 생성 및 처리를 나타낸 것이다. 영상은, SK-Mel-103 흑색종 세포를 i.v.로 접종받고, PEI, pIC 또는 BO-110으로 처리된 마우스의 대표적인 폐의 형광빛 하에서 또는 가시광하에 H&E로 염색된 지점 (하위 라인)에 대해 촬영된 사진에 상응하는 것이다.
패널 e는 패널 d에서 명시된 바와 같이 SK-Mel-103에 의해 유도된 전이의 평균 개수를 나타낸 것이다 (P*<0.01; n=5; 일반 만-휘트니 검정).
도 13. Tyr::NRASQ61K x INK4a/ARF-/- 마우스에서 BO-110에 의한 전이성 파종 확산 억제
패널 a는 유색 병변을 유도하기 위해 DMBA로 처리된 후, 5% 글루코스 중 PEI (대조군: Ctrl.), pIC 또는 BO-110으로 처리된 Tyr:: Tyr::RasQ16K x INK4a/ARF-/- 마우스에서 전이의 무진행 생존에 대한 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 플롯을 나타낸것이다.
패널 b는 패널 a의 각 시험군에 의해 발생된 피부 멜라닌세포 신생물의 누적 평균 개수에 대한 막대 그래프를 나타낸다. 매 5일마다 계수하고, 그래프 상에 명시된 크기 범위에 따라 종양을 분류하였다.
패널 c는 5% 글루코스 중 PEI (대조군), 나형 pIC 또는 BO-110으로 처리된 대표적인 마우스의 일례의 대사 활성 (18F-FDG 혼입)을 시험하기 위해 PET/CT에 의해 수득된 횡단면 (좌측 칼럼) 및 관상단면 (우측 칼럼)을 나타낸 대표적인 영상을 나타낸 것이다. 종양 둘레를 흰색 점선으로 표시하였다. 별표 표시는 동물의 심장 위치를 나타낸다.
패널 d는 패널 a에 기술된 각 처리군으로부터 채취한 멜라닌세포 병변 샘플을 헤마톡실린-에오신으로 염색한 것을 나타낸다.
패널 e는 5% 글루코스 비히클 (대조군) 또는 BO-110으로 처리된 마우스의 피부 조직 샘플, 심장, 간, 또는 폐 (사진 좌측에 명시된 바와 같다)를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 것을 나타내며, 이를 통해 정상적인 세포 구획에서는 어떤 독성도 BO-110 처리와는 관련이 없다는 것이 입증되었다.
도 14. 다양한 종양 세포에 대한 BO-110의 세포독성 활성.
패널 a는 BO-110 처리 후 18 시간 (좌측 막대) 및 30 시간 (우측 막대)이 경과하였을 때 수행된 트립판 블루 배제법에 의해 추정된, 상이한 종양 세포주: 췌장암종 (Pa), 결장암종 (C), 방광암종 (Bl), 신경아교종 (G), 유방암종 (Br), 흑색종 (M), 전립선암종 (Pr), 폐암종 (L) 및 난소암종(O)에서의 세포 사멸율(%)을 나타낸 것이다. 데이터는 명시된 세포주를 사용하여 실시된 3개의 독립된 실험의 평균± SEM 값으로 나타내었다.
패널 b는 명시된 바와 같이, 비히클 또는 BO-110으로 처리한 후 24시간이 경과하였을 때의 하기 종양 세포주: MiaPaCa (췌장암), BT549 (유방암), 639V (방광암) 및 T98G (아교모세포종)의 대표적인 명시야 영상을 나타낸 것이다. 비록 BT549가 처음에는 BO-110에 대해 내성을 보였지만, 최종적으로 장기간 생육성 분석에서는 붕괴되었다 (패널 b 참조). 639V 및 T98G는 BO-110의 세포독성 효과에 대해 고도한 감수성을 보였다.
패널 c는 비히클 또는 BO-110으로 처리한 후 24h이 경과하였을 때의 명시된 종양 세포주의 생육성 분석을 나타낸 것이다. 단기간의 생육성 분석을 위해서는 처리 후 24시간째에 처리된 세포를 고정시키고, 콜로니 세포 형성을 시각화를 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 장기간의 생육성 분석을 위해서는 24시간 동안 처리된 세포 중 1/10을 프레이팅시키고, 고정시키고, 48h 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 15. BO-110에 의해 유도된 세포 사멸은 종양 세포주에서 MDA-5, Noxa 및 자가포식 활성화에 의존한다.
상기 도면은 하기 종양 세포주: BT549 (유방암), 639V (방광암) 및 T98G (아교모세포종)를 비히클 ("-"로 표시) 또는 BO-110 ("+"로 표시)으로 처리한 후 24시간이 경과하였을 때, 상기 세포주들로부터 단리된 전체 세포 추출물의 면역블롯을 나타낸 것이다. 분석된 단백질은 MDA-5FL (전장의 MDA-5), MDA-5C (MDA-5 절단), NOXA, 카스파제-9 또는 튜불린 (로딩 대조군)이었다. BO-110에 대해 감수성이 던 큰 종양 세포에서 NOXA 및 MDA-5FL의 유도 및 카스파제-9 및 MDA-5C 절단이 더 많이 일어난다는 것에 주목한다.
실시예
하기 기술하는 실시예의 분석법은 하기의 물질 및 실험 기법을 사용하여 수행하였다:
세포 및 세포 배양물
인간 전이성 흑색종 세포주 SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 및 SK-Mel-147 및 마우스 B16 세포는 앞서 기술된 바 있다 (문헌 [Soengas et al. 2001]). 10% 우태아혈청 (노바-테크 인크.(Nova-Tech Inc.: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드))으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies: 미국 메릴랜드주 로크빌)) 중에서 상기 세포를 배양하였다.
(문헌 [Fernandez et al., 2005])에 기술된 바와 같이 인간 신생아 포피로부터 인간 멜라닌세포를 단리시키고, 10 ng/ml 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (캐스케이드 바이올로지스(Cascade Biologies: 미국 오레건주 포틀랜드))를 함유하는 멜라닌세포 성장 인자 (HMG-1)로 보충된 배지 254(Medium 254) 중에 유지시켰다.
인간 신생아 포피로부터 인간 섬유아세포를 단리시키고, 10% 우태아혈청으로 보충된 DMEM 배지 중에 유지시켰다.
추가로, 다른 종양 유형으로부터의 세포는 9개의 종양 조직 유형을 나타내는 60개의 인간 종양 세포주로 이루어진 패널 (미국 국립 암 센터(National Cancer Institute: NCI)의 항암 약물 스크리닝 프로그램(Anticancer Drug Screening Program)에 사용)으로부터 수득하였다. 췌장 종양의 경우, 선택된 세포주는 IMIMPC2, MiaPaCa, Aspc1, A6L, SKPC-1 및 Panc-1이고; 결장암의 경우, 선택된 세포주는 CACO, SW480 및 SW1222이고; 방광암의 경우, 선택된 세포주는 RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 및 SW1170이고; 신경아교종 및 아교모세포종의 경우, 선택된 세포주는 U87MG, U251 및 T98G이고; 유방암의 경우, 선택된 세포주는 MDA-231, MCF7 및 T47D이고; 전립선암의 경우, 선택된 세포주는 LNCaP, PC3 및 DU145이고; 폐암의 경우, 선택된 세포주는 H1299 및 NCIH460이고; 및 난소암의 경우, NCI H23 및 SK-OV-3이었다.
10% 우태아혈청 (노바-테크 인크.(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드))으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(라이프 테크놀로지스 (미국 메릴랜드주 로크빌)) 중에서 상기 세포 모두를 배양하였다.
PEI 와 복합체화된 pIC ( BO -110) 생성
dsRNA의 합성 유사체인 pIC를 인비보겐(InvivoGen: 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 구입하였다. 반응성 제트PEI(jetPEI)™, 제트PEI-플루오르(jetPEI-Fluor)™ 및 인비보-제트PEI(invivo-jetPEI)™는 폴리플러스-트랜스펙션(Polyplus-transfection) (프랑스 이키르크)으로부터 입수하였다. 폴리에틸렌이민의 선형 유도체를 포함하는 상기 제품을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 시험관내 및 생체내에서 N/P 비 (RNA 포스페이트 1개당 제트PEI의 질소 잔기) 1 내지 5로 pIC 복합체를 형성하였다.
달리 명시하지 않는 한, 배양된 세포에 사용되는 pIC의 농도는 1 ㎍/ml 및 1-2 ng/kg (마우스)이었다.
약물 치료법 및 세포 사멸 분석법
보르테조밉 (벨케이드(Velcade), 이전 명칭 PS-341)은 밀레니엄 파마슈티칼즈 인크(Millenium Pharmaceuticals Inc.: 미국 매사추세츠주 케임브리지)로부터; 아드리아마이신(Adriamycin) (독소루비신)은 시그마 케미칼(Sigma Chemical: 미국 미주리주 세인트루이스)로부터, 및 에토포시드는 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb: 미국 뉴욕주 뉴욕)로부터 입수하였다. 항산화제 티론(Tiron) 및 Vit-E는 시그마 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터, pan-카스파제 억제제 ZVAD는 R&D 시스템(R&D System: 미국 미네소타주 미니애폴리스)으로부터 구입하였다. 3-메틸 아데닌 (3-MA)은 시그마 케미칼 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다. 클로로퀸은 시그마 케미칼 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다.
약물로 처리하기 적어도 12시간 전에 멜라닌세포 및 흑색종 세포를 시딩한 후, 약물 처리에 대한 반응으로 세포 생육성 분석을 수행하였다. 이전 기술된 바와 같이, (문헌 ([Wolter et al., 2007]; [Fernandez et al., 2005])) 표준 트립판 블루 배제법에 의해 지정 시점 및 처리 농도에서의 세포 사멸율(%)을 추정하였다.
약물로 처리하기 적어도 12시간 전에 종양 세포를 시딩한 후, 약물 처리에 대한 반응으로 세포 증식 분석을 수행하였다. 크리스탈 바이올렛 염색 분석법에 의해 지정 시점 및 처리 농도에서의 세포 성장을 추정하였다.
단백질 면역블롯팅
단백질 수준 변화를 측정하기 위해 2x106개의 세포를 명시된 바와 같이 처리하고, 처리 후 다른 시점에 수거하였다. 세포 용해물 전체를 환원 조건하에 10, 12 또는 4-15% 구배 SDS 겔 중에서 전기영동시킨 후, 이모빌론(Immobilon)-P 막 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 베드포드))으로 옮겨 놓았다. 단백질 밴드를 ECL 시스템 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 영국 버킹햄셔))에 의해 검출하였다.
1차 항체로는 노부스 바이올로지컬(Novus Biological: 미국 콜로라도주 리틀턴)로부터의 casp-9 및 -3; 온코진 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터의 casp-8 (Ab-3); 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology: 미국 매사추세츠주 비벌리)로부터의 casp-7; BD 트랜스덕션 라보라토리즈(BD Transduction Laboratories: 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로부터의 Bcl-xL; 다코 다이애그나스틱스(Dako Diagnostics: 덴마크 글로스트)로부터의 Blc-2; 칼바이오켐(Calbiochem: 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 NOXA; 노보캐스트라 라보라토리즈(Novocastra Laboratories: 영국 뉴캐슬)로부터의 MDAp53; 및 시그마 케미칼 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터의 뉴불린 (클론 AC-74)을 포함하였다. MDA-5 항체는 앞서 기술된 바 있다.
2차 항체는 GE 헬쓰케어로부터의 항-마우스 또는 항-토끼였다. 비처리 대조군을 기초 발현에 대한 참조로서 간주하면서, 다른 처리에 의해 유도되는 단백질 수준 변화를 정량하기 위해 영상 J를 사용하였다.
RNA 간섭
NOXA를 하향조절하는 데 사용되는 shRNA 렌티바이러스 벡터는 앞서 보고된 바 있다 (문헌 [Fernandez et al., 2005]). MDA-5 (표적 서열, 서열 1)를 하향조절하는 데 사용되는 plko 렌티바이러스 벡터는 오픈바이오시스템즈(OpenBiosystems: 미국 앨러배마주 헌츠빌)로부터 구입하였다. 대조군 shRNA를 생성하기 위해 스크램블된 올리고뉴클레오티드 또한 디자인하였다. 기술된 바와 같이 293FT 세포로부터 바이러스를 생성하고, 감염율이 > 80%가 되도록 하는 조건하에서 사용하였다 (문헌 [Denoyelle et al., 2006]). 면역블롯팅 및 RT-PCR (정방향 프라이머 - 서열 2 및 역방향 프라이머 - 서열 3)에 의해 MDA-5의 하향조절을 확인하였다. 권고시, 상응하는 shRNA-발현 바이러스로 감염시킨 후 3일 경과하였을 때에 pIC 또는 BO-110을 사용한 처리를 개시하였다.
발현 프로파일링 마이크로어레이
적어도 2개의 독립된 실험으로부터 전체 RNA를 단리시키고, RNeasy 키트 (퀴아진(Quiagen))로 정제하였다. BO-110으로 처리된 샘플은 2.5 mg Cy5-UTP로 표지하고, PIC 또는 PEI와의 인큐베이션으로부터 생성되는 Cy3-dUTP로 표지된 2.5 g의 RNA와의 혼성화 반응에서의 참조로서 사용하였다. 마킹된 RNA를, 제조사의 설명서에 따라 2가지 색상의 올리고 전체 인간 게놈 마이크로어레이 (4x44K) (애질런트(Agilent: 미국 캘리포니아주 산타클라라)로부터 입수)와 혼성화시켰다. 세척한 후, 스캔어레이(Scanarray) 10 5000 XL (GSI 루모닉스 카나타(GSI Lumonics: 캐나다 온타리오주 카나타))을 사용하여 슬라이드를 스캐닝하고, 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Alonso et al., 2007]), 진픽스 4.0(GenePix 4.0) 프로그램 (엑손 인스트루먼츠 인크(Axon Instruments Inc.: 미국 캘리포니아주 유니언 시티))을 사용하여 영상을 분석하였다. 형광 강도 측정값에서 자동으로 배경값을 감산하였다. Cy3:Cy5의 관계는 모든 지점의 중간비 값으로 정규화하였다. 정규화한 후, 두 채널 모두에 대한 강도 (중간값의 합)가 국소 지점의 배경값보다 낮은 지점은 폐기하였다. 남은 지점들의 관계를 로그 변환시키고 (밑 2), 및 이중 지점 어레이를 중간값으로 조정하였다. 유전자 발현 패턴 분석 슈트(Gene Expression Pattern Analysis Suite: GEPAS)를 사용하여 대조군과 시험 샘플 간에 차별적으로 발현된 유전자의 가중치가 부과되지 않는 쌍 분류 (UPGMA: 비가중 쌍-군)를 수행하였다.
생체내에서의 처리 반응
NIH (미국 매사추세츠주 베네스다)로부터 암컷 C57BL/6 마우스를 구입하였다. NK, T 및 B 세포 림프구 기능이 손상된 암컷 SCID를 앓는 베이지 마우스는 찰스 리버스(Charles Rivers: 미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 입수하였다. 실험 개시시 모든 동물은 6-12주령째였다. 미시간 대학 산하 암 센터(University of Michigan Cancer Center)의 시설 절차에 따라 동물을 보호하였다.
105개의 B16 흑색종 세포를 피부내 주사하여 피부에 생착시켰다. 종양 이식 후 7, 11, 15 및 21일이 경과하였을 때 2 ng/kg pIC만을 단독으로, 또는 인비보-제트PEI와 복합체를 형성한 pIC를 종양주변에 주사하여 투여하였다. 추가의 처리군으로는 단일 제제로서의 제트PEI 및 위약 대조군을 포함하였다. 종양 용적은 캘리퍼 측정에 의해 추정하고, V= L x W 2 /2 (여기서, L 및 W는 각각 종양 길이 및 폭을 나타낸다)로 계산하였다.
4x105개의 B16-eGFP 또는 5x105개의 SK-Mel-103-eGFP 흑색종 세포를 i.v. 주사하여 폐 전이를 나타내는 대용 모델을 생성하였다. 3, 6, 및 9일째 1 ng/kg의 pIC만을 단독으로, 또는 인비보 -제트PEI와 복합체를 형성한 pIC를 i.v. 주사하여 처리하였다. 시험감염 후 14일째 폐를 수거하고, 수작업을 통해 외부 전이를 계수하고, 개수 및 크기로 점수를 매겼다. 별법으로, 일루마툴(Illumatool) TLS LT-9500 형광 시스템 (라이트툴즈 리서치(Lightools Research: 미국 캘리포니아주 엔시니타스))을 사용하여 종양 세포로부터의 방출된 형광은 하마마츠 오르카(Hamamatsu Orca) 100 CCD 카메라를 사용하여 포착하였다. 파라핀 박편을 헤마톡실린-에오신 염색을 통해 분석함으로써 독립적으로 전이성 병발을 모니터링하였다. 5마리의 마우스로 구성된 군에서 실험을 수행하고, 2 내지 4회에 걸쳐 상기 실험을 반복하였다. 대조군 군집이 불편감의 징후를 보이거나, 호흡기 장애의 징후를 보일 때, 마우스를 안락사시켰다.
C57BL/6 배경하에서 Tyr:: N-RasQ61K 마우스를 Ink4a/Arf 넉아웃 마우스와 교배시켜 자발성 흑색종을 생성시켰다 (문헌 [Ackermann et al., 2005]). 피부에서 흑색종이 발생될 수 있도록 유도하기 위해, 마우스가 8-10주령째 되었을 때에 220 mg의 7,12-디메틸벤[a]안트라센 (DMBA)을 사용하여 1회에 걸쳐 페인팅하였다. 조기 멜라닌세포 신생물 (직경이 적어도 1 mm인 병변)이 발생된 후, 주 2회에 걸쳐 로 1 ng/kg의 pIC만을 단일 제제로서, 또는 인비보-제트PEI와 복합체를 형성한 pIC를 복강내로 주사하여 마우스를 처리하였다. 흑색종 및 사마귀 (모반)를 계수하고, 캘리퍼를 사용하여 2개의 직경을 통해 그 크기를 측정하고, 종양의 평균 크기를 ㎣로 표시하였다.
종양의 크기는 또한 PET-CT (양전자 방출 단층 촬영술-컴퓨터 단층 촬영술)에 의해 평가하였다. 소형 동물용 PET-CT 시스템 뷰 익스플로러 제너랄 일렉트릭스(View Explore General Electrics) (페어필드(Fairfield: 미국 캘리포니아주))를 사용하여 PET-CT 영상을 검사하고 획득하였다. PET 영상의 영상화 및 획득을 위해 15 MBq의 18F-FDG (2-플루오로-2-데옥시-D-글루코스)를 주사하고, 알고리즘 3DOSEM을 사용하여 재구성하였다. 35 KeV 및 200 uA 에너지를 사용하여 CT 영상을 16개의 사진으로 획득하고, FDK 알고리즘을 사용하여 영상을 재구성하였다. 헤마톡실린-에오신으로 염색된 파라핀 박편을 분석함으로써 독립적으로 흑색종, 전이, 및 다른 기관을 모니터링하였다.
투과 전자 현미경검사법
투과 전자 현미경검사법 (TEM)을 위해, 0.1 소렌센 완충액(Sorensen's buffer) (pH 7.5)으로 명시된 세포 군집을 세정하고, 1.5h 동안 2.5% 글루타르알데히드 중에서 고정시킨 후, 탈수시키고, 스퍼(Spurr) 수지에 포매시켰다. 이어서, 블록을 60-100 nm의 초박층의 박편으로 만들고, 구리 그리드에 붙였다. 통상의 분석을 위해 초박층의 박편을 2% 우라닐 아세테이트 및 시트르산납으로 염색하였다. 필립스(Philips) CM-100 투과 전자 현미경 (FEI: 미국 오리건주 힐즈브로) 및 코닥 1.6 메가플러스(Kodak 1.6 Megaplus) 디지털 카메라를 사용하여 전자 현미경 사진을 획득하였다.
공초점 및 형광 현미경검사법:
GFP-LC3의 구두점형 도트에 대한 정량화. pCNA 발현 벡터로 클로닝된 eGFP-LC3 융합물은 가브리엘 누네즈(Gabriel Nunez) (미시간 대학 산하 암 센터)로부터 기증받았다. 유전자가 안정하게 전달될 수 있도록 eGFP-LC3 및 단편 eGFP-Rab7wt, eGFP-Rab7 T22N, eGFP-Rab5wt, eGFP-체리-LC3 및 체리-LC3을 pLVO-퓨로 렌티바이러스 벡터로 클로닝하였다. 흑색종 유래 세포 (즉, SK-Mel-103)를 pLVO-eGFP-LC3으로 감염시키고, 퓨로마이신으로 선별하였다. GFP-LC3-관련 형광 방출은 레이카(Leica) AF6000 형광 현미경을 사용하여 영상화하고, 영상을 LAS AF V1.9 (레이카: 독일 졸름스)로 분석하였다. 공초점 실시간 현미경검사법을 위해, 본 발명자들은 CO2 및 온도가 조절되는 인큐베이션 챔버와 커플링된 레이카 TCS-SP2-AOBS-UV 울트라-스펙트럼 현미경을 사용하였다. 영상은 LCS (레이카: 독일 졸름스)로 분석하였다. 동일 위치에 존재 여부에 대한 실험을 위해, 리소트랙커™ 레드 또는 블루 (인비트로겐(Invitrogen: 캘리포니아주 칼즈배드))를 50 nM 또는 200 nM 농도로, 및 훽스트 33342 (인비트로겐: 캘리포니아주 칼즈배드)를 5 ug/ml의 농도에서 영상화하기 10분 전에 첨가하였다. 동일 위치에 존재 여부에 대한 영상은 LAS AF V1.9 (레이카: 독일 졸름스)로 분석하였다.
시토카인 발현.
효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 세포 상등액 중의 인간 인터페론 알파를 측정하였다. 인간 IFN-α ELISA 키트 및 재조합 hIFN-α는 PBL 인터페론 소스(PBL Interferon Source: 미국 뉴욕주 피스카타웨이)로부터 구입하고, 제조사의 프토토콜에 따라 사용하였다. IFN-α 발현 수준은 실시간 PCR에 의해 골수-유래 대식세포 (BMDM) 및 B16 흑색종 세포로부터 측정하였다. 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Celada et al., 1984]) BMDM를 준비하고, 플레이팅하고, 처리하였다. β-액틴으로 정규화한 후, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7700 서열 검출기 상에서 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수한 택맨(TaqMan) 프라이머 및 프로브를 사용하여 IFIT-1 RNA 전사체에 대한 실시간 정량 PCR 분석을 수행하였다.
통계학적 분석
생육성 데이터는 평균 +/- s.e.m으로 표시하고, 양측 스튜던츠 t-검정에 의해 차이에 대한 통계학적 분석을 판정하였다. P < 0.05인 것을 유의적인 것으로 간주하였다. 생체내 종양 성장 및 전이에 대한 통계학적 평가를 위해, 일반 만-휘트니 윌콕슨(Mann-Whitney Wilcoxon) 검정법을 사용하여 두 군들간의 연속 변수값을 비교하였다. P 값 < 0.05인 것을 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 1. LC3 형광에 기초하여 이루어진 구별적 분석에 의한 흑색종 세포에서의 자가포식 유도제 확인. 초미세 구조 분석을 통한, BO-110에 의한 자가포식 세포 사멸 확인
상기 논의된 바와 같이, (세포 사멸 및 생존 유도, 둘 모두를 위한) 자가포식의 특질은 자가포식 단백질 유전자 8 (ATG8)/LC3의 세포질로부터 새로 생성된 자가포식소체로의 배치 전환이다. 이러한 관찰 결과에 기초하여 (즉, 확산형 패턴으로부터 초점 염색으로의) GFP-LC3 융합 단백질의 세포 분포 변화를 자가포식의 조기 단계의 마커로서 사용하였다. 자가포식소체의 존재 여부를 또한 전자 현미경검사법 또는 광학 현미경검사법에 의해 확인할 수 있었다.
1.1. LC3 에 기초한 형광 분석
약물에 대한 흑색종의 반응에서 자가포식의 역할에 대해 다루기 위해, GFP-LC3에 기초하여 이루어진 구별적 분석을 사용하여 상업적으로 이용가능한 화학치료 약물 및 면역조절제를 스크리닝하였다. GFP와, 자가포식소체 LC3 마커의 유도체를 발현하는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, pLVO-eGFP-LC3으로 흑색종 세포를 안정적으로 형질감염시켰다.
인간 세포주 SK-Mel-103은 그의 고도한 전이성 및 화학내성 표현형에 기초하여 초기 스크리닝을 위한 모델 시스템으로서 선택하였다 (문헌 [Soengas et al., 2001]). 이어서, 다양한 유전적 배경을 가진 인간 세포주의 패널에 대해 확인 연구를 수행하였다 (하기 참조).
각종의 항암 약물은 세포 생육성에는 유의적인 영향을 미치지 않으면서 초점 GFP-LC3 형광 방출을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 사멸 유도제들 중, PEI 및 dsRNA 모방체 폴리이노신-폴리시티딜산의 복합체 (BO-110)는 GFP-LC3 초점을 이용함에 있어 특히 효율적인 것으로 나타났다. 소량의 투여량 (0.5-1 ㎍/ml)의 BO-110으로 인큐베이션 4-6h 이내에 약 50%의 세포가 점 모양의 뚜렷한 GFP-LC3 염색을 보였다 (도 1a, 도 1b에서 대표적인 현미경 사진 및 정량 참조). 실제로, 역학적 분석을 통해서는 자가포식 유도에 대한 고전의 양성 대조군인 라파마이신 (문헌 [Klionsky et al., 2008])보다 BO-110에 의해서 더 빠르게 GFP-LC3 초점이 생성되는 것으로 나타났다 (도 1b).
흥미롭게도, 후기 시점에서도 BO-110 처리는 세포 사멸을 유도할 수 있었으며, SK-Mel-103의 경우와 같이, 표준 DNA 손상 제제, 예를 들어, 독소루비신 또는 에토포시드에 대해 내인적으로 내성을 띠는 흑색종 세포주에서도 조차 세포 사멸을 유도할 수 있었다.
내인성 LC3 분석을 통해 자가포식소체가 형성되는 동안 상기 단백질의 특징적인 지질화, 및 GFL-LC3 초점 형성이 생성될 수 있도록 하는 데 필요한 ATG5 요구에 상응하는, 전기영동 이동의 변화가 나타났다 (도 1c).
본 발명자들은 pIC가 암 세포에서의 자가포식과 연관이 있을 것이라는 종래 보고에 대해서는 알지 못했다. 그러므로, 자가포식 및 종양 세포 사멸을 유도하는 dsRNA의 잠재적인 세포내 센서에 대한 이해를 증진시킬 수 있는 새로운 요소를 밝혀낼 수 있는 바, 하기 시험들은 상기 화합물에 중점을 두었다.
1.2. 세포에의 BO -110 효과에 대한 초미세 구조 분석
이전 문단에서 기술된, BO-110으로 처리된 세포에서의 GFP-LC3 초점 염색은 자가포식소체 형성과 일치한다. 그러나, 이소성 발현으로 발현된 GFP-LC3의 가능한 비특이적인 응집은 배제시키기 위해 (문헌 [Klionsky et al., 2008]), 반응을 전자 현미경검사법에 의해 독립적으로 분석하였다 (도 1d).
BO-110에의 조기 반응 (5h)으로는, 자가포식소체의 뚜렷한 특징인, 세포 파편을 격리시키는 막-결합형 전자 조밀 구조체의 뚜렷한 축적을 포함하였다 (도 1d). 이러한 구조체의 크기 및 개수는 심지어 광학 현미경검사법에 의해서도 세포내 과립으로 보였다 (도 1e).
이보다 더 늦은 후기 시점에 BO-110으로 처리하여 세포 붕괴를 유도하였고 (도 1f, 가운데 패널), 이는 전자 현미경검사법에 의해 직경이 500 nm 초과인 거대 포식 액포 형성과 관련이 있는 것으로 나타났다 (도 1f, 우측 패널).
도 2는 다른 시점에서 촬영된, 선택된 형광 현미경 사진으로 나타낸 자가포식 유도의 시간에 따른 진화에 대한 요약도로서, 현미경 사진을 통해 시간 경과에 따른 EGFP의 확산형 염색으로부터 초점 응집체로의 재분포를 관찰할 수 있으며, 이는 일반 세포 붕괴에서 최종 과정인 자가포식소체 형성을 나타낸다. 대조군 세포는 시험 기간내내 확산형 염색을 나타내었는데, 이는 LC3의 축적 수준이 기초 수준인 것을 나타낸다.
혈장막 및 핵막의 완전성은 그대로 유지되었고, BO-110으로 처리된 세포는 아폽토시스 프로그램의 특징적인 크로마틴 응축을 보였다는 점은 흥미로운 사실이다. PEI (대조군)는 자가포식소체의 개수 또는 크기에 최소한의 영향을 미치는 바 (도 1d-f), 자가포식 유도는 BO-110에 의존적이었다. 종합하면, 상기의 관찰 결과들은 자가포식소체 형성 후, 아폽토시스-유사 특징을 가진 세포 사멸을 포함하는 BO-110의 세포독성 효과를 입증한다.
실시예 2. 양이온 분자에 접합된 pIC를 사용한 상이한 인간 및 뮤린 흑색종 세포주의 감수성 분석 및 멜라닌세포에 대한 감수성
SK-Mel-103 세포를 사용하여 수행된 초기 연구에서 발견된 BO-110의 전-자가포식 활성이 보다 광범위한 항-흑색종 활성을 반영하는 것인지 여부를 판단하기 위해 추가의 세포주 세트를 시험하였다.
흑색종 진행 및 화학내성에 기여하는 것으로 알려져 있는, 빈번히 일어나는 흑색종 관련 이벤트, 예를 들어, BRAF 또는 NRAS 돌연변이, INK4a / ARF 또는 PTEN 유전자좌 결실, 또는 각종 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 구성원의 상향조절과 상관 관계에 있는 흑색종 세포를 선택하였다.
p53 돌연변이는 흑색종에서는 흔하지는 않다 (문헌 [Soengas and Lowe, 2003]). 그러나, p53는 아폽토시스 및 자가포식 프로그램의 활성화에서 중요한 역할을 할 수 있는 바, 본 발명자들은 또한 상기 종양 억제인자가 BO-110의 항흑색종 활성에 절대적으로 필요한지 여부를 판단하기 위해 돌연변이체 p53을 발현하는 SK-Mel-28 세포주에 대해서도 시험을 실시하였다. 또한, 종간의 차이와 관련이 있을 것으로 추정되는 처리 반응상의 차이를 평가하기 위해 뮤린 전이성 흑색종 세포주 B16 또한 흑색종의 면역요법에 광범위하게 사용되는 모델의 일례로서 본 분석에 포함시켰다 (문헌 [Wenzel et al., 2008]). 동시에, 본 발명자들은 또한 인간 포피로부터 단리된 멜라닌세포도 분석하였다.
하기 표 1에는 인간 전이성 흑색종 세포주의 유전적 배경이 제시되어 있다:
Figure 112012009186810-pct00001
RT-PCR에 의해 엑손 2-10의 서열을 직접 분석함으로써 p53의 돌연변이 상태를 측정하였다. 다형태 P72R을 가진 샘플은 R로 명시하였다. 독소루비신 (0.5 mg/ml, 12h)으로 처리된 추출물을 면역블롯팅에 의해 p53의 유도능을 측정하였다. p53의 내인성 수준이 높은 세포주는 별표로 표시하였다. PTEN, Apaf-1, Casp-8, Bcl-2, Bcl-xL 및 Mcl-1 수준은 면역블롯팅에 의해 측정하고, 대조군 멜라닌세포로 정규화하였다. 각각 PCR로 증폭된 엑손 15 및 3의 게놈 단편의 서열을 직접 분석함으로써 BRAF 및 NRAS의 돌연변이 상태를 측정하였다. 독소루비신 (DOX; 0.5 ㎍/ml, 30h)에 대한 반응은 각각 세포 사멸율(%)이 100-70, 70-50, 50-30 및 <30%인 것에 대해 ++, +, -/+, -로 분류하였다. BO-110 (1 ug/ml, 30h)에 대한 반응은 각각 세포 사멸율(%)이 100-90, 90-60 및 60-40%인 것에 대해 +++, ++, +로 분류하였다. p53의 내인성 수준이 높은 세포주는 별표로 표시하였다.
이들 세포주를 사용하여, 실시예 1에 기술된 SK-Mel-103 세포주에 대한 시험과 유사한 시험을 수행함으로써 독립 제제로서의 pIC 및 PEI, 또는 조합물로 사용된 pIC 및 PEI에 대한 이들 각각의 세포의 감수성을 확인하였다. 결과는 도 3에 요약되어 있다.
시험된 5개의 흑색종 세포주 (SK-Mel-19, -28, -103, -147, 및 B16)는 BO-110 처리 후 사멸하였는데, 이들은 유사한 역학적 성질 및 감수성을 보였다 (도 3a. 중요하게는, 시험이 수행된 모든 흑색종 세포주 모두에서 BO-110에 의한 자가포식의 조기 활성화 이후에는 항상 세포 사멸이 일어났다는 언급할 수 있다.
p53 돌연변이체 세포주인 SK-Mel-28의 경우에서도 전자 현미경검사법을 통해 뚜렷한 자가포식소체를 볼 수 있었다 (도 3b). 도 3a 및 (4개의 독립된 단리물에 상응하는 세포주의 대표적인 데이터를 나타낸) 도 4b에 도시된 용량-반응 곡선에 제시되어 있는 바와 같이, 중요하게는, 처리 후 24시간째 SK-Mel-103 흑색종 세포의 70%를 사멸시키는 조건하에서 정상적인 멜라닌세포는 생존가능하였고, 자가포식에 대한 어떤 마커도 보이지 않았다는 점에 주목할 수 있다.
추가로, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 매우 광범위한 농도의 BO-110에 걸쳐 멜라닌세포의 형태, 과립화, 또는 세포질 GFP-LC3 분포에서의 유의적인 변화는 없는 것으로 관찰되었다. 도 4c 또한 정상적인 인간 피부 섬유아세포도 흑색종 세포보다는 BO-110에 대해 내성이 크다는 것을 시사한다.
흥미롭게도, PEI가 종양 세포에 대한 그의 선택성에 있어 중요하다는 점을 발견하게 되었다. 따라서, PEI가 처리에 포함되지 않은 경우, pIC의 항흑색종 활성은 70-80% 만큼 감소하였다 (도 3a). PEI를 포함하지 않는 나형 pIC는 흑색종 세포 및 멜라닌세포에서는 거의 효과가 없었으며, 자가포식의 유도제로서 최소한의 활성만을 보였다 (도 3b).
PEI는 세포내이입에 의한 DNA 및 RNA 분자의 흡수를 촉진시킬 수 있는 그의 능력에 따라 유전자 요법에 사용되는 고전적 비히클이다 (문헌 [Payne, 2007]에서 리뷰). 실제로, BO-110으로 처리된 흑색종 세포에서 발견된 다층 구조 (도 2의 하단 사진 참조)는 엔도좀-리소좀 하이브리드 (엠피좀)의 자가포식소체에의 도달에 관여하는 다중 융합 이벤트와 일치한다 (문헌 [Maiuri et al., 2007]).
실시예 3. PEI의 부재 및 존재하에서의 pIC에 의한 MDA-5의 정량적으로 상이한 활성화.
PEI는 DNA 또는 RNA 분자의 세포내이입을 유리하게 하는 것 이외에도, 엔도좀의 팽윤과, 유전 물질이 세포질로 효율적으로 전달될 수 있도록 하는 것을 촉진시킬 수 있다 (문헌 [Payne, 2007] 개정판). 그러므로, PEI는 pIC가 세포질내 센서로 접근하는 것을 유리하게 할 수 있다. 흑색종 분화 관련 유전자 5 (MDA-5)가 이러한 센서들 중의 하나인 바 (문헌 [Akira, 2006]), 이에 본 발명자들은 상기 단백질이 흑색종 세포의 BO-110 매개성 사멸에 대한 유도제인지 여부를 시험하였다.
기술된 바와 같이 (문헌 ([Kovasovics et al. 2002]; [Barral et al., 2007])), 세포 사멸 동안 MDA-5의 헬리카제 및 카스파제 활성화 보충 도메인 (CARD)을 분리시키는 단백질분해성 절단을 모니터링함으로써 MDA-5의 활성화를 분석하였다.
PEI, pIC 또는 BO-110으로 처리된 SK-Mel-28 및 SK-Mel-147 세포로부터의 추출물을 전기영동시킨 후, 이들 추출물을 면역블롯팅시킴으로써 상기 분석을 수행하였다. 효율적인 세포 사멸 유도를 위한 양성 대조군으로서 보르테조밉을 사용하였다. 그 결과는 도 5에 제시되어 있다.
흥미롭게도, 단백질 면역블롯팅을 통해 MDA-5의 프로세싱을 유도할 수 있는, PEI-pIC 복합체인 BO-110의 강력하고 지속적인 능력이 밝혀졌다 (도 3a). 나형 pIC도 비록 유의적으로 더 낮은 수준으로 유도하기는 하지만, 상기 프로세싱을 유도할 수는 있고, 시험된 모든 세포에서 유도하는 것도 아니고, 지속적인 방식으로 유도하거나 (단백질분해성 절단이 일어났음을 나타내는 특징인 30 kD 밴드는 도 5의 패널 a 및 B에서는 화살표 표시되어 있는 높이에서 출현하여야 하는데, 이러한 30 kD 밴드는 SK-Mel-28 세포에 상응하는 래인들 중 어느 것에서도 나타나지 않았다) 지속되거나 하는 것은 아니었다 (SK-Mel-147 세포에서 30 kD 밴드의 강도는 pIC 처리 시점에서 감소하였다: 도 5a 참조).
MDA-5를 안정적으로 넉아웃시키기 위해 렌티바이러스 벡터를 통해 BO-110의 세포독성 활성에 대한 MDA-5의 기여를 정의하기 위해, MDA-5에 상보적인 단쇄 헤어핀 RNA (shRNA)를 흑색종 세포 내로 형질도입시켰다 (도 3b의 단백질 면역블롯 참조). MDA-5 shRNA는 BO-110 유도성 흑색종 세포 사멸을 유의적으로 감소시켰으며, 대조군 세포에 대해서는 어떤 검출가능한 비특이적인 효과는 없었다 (도 3c, p<0.05).
MDA-5의 유도 및 프로세싱이 단순히 흑색종 세포에서 사멸 기구의 활성화의 결과는 아니라는 점이 중요하다. 흑색종에서 내인성 및 사멸 수용체 아폽토시스 경로, 둘 모두를 활성화시킬 수 있는 프로테오좀 억제제인 보르테조밉으로 처리하였을 때, MDA-5 수준 또는 프로세싱에는 어떤 효과도 없었다 (도 5a). 이러한 결과는 BO-110 및 다른 프로-아폽토시스 유도제에 의한 사멸 프로그램 실행에서의 주된 기계론적인 차이를 설명한다.
실시예 4. 자가포식의 약리학상 억제제가 BO-110의 세포독성 활성을 손상시킨다
이어서, 본 분석은 BO-110 유도성 세포 사멸을 실행하는 데 관여하는 기전에 중점을 두었다. 3-메틸아데닌 (3-MA) 및 클로로퀸은 각각 자가포식소체 형성 또는 자가리소좀 활성을 간섭할 수 있는 그들의 능력에 의해 자가포식 기전을 독립적으로 확인하는 데 빈번하게 사용된다 (문헌 ([Maiuri et al., 2007]; [Klionsky et al., 2008])).
이러한 간섭이 BO-110으로 처리된 흑색종 세포에서 발생하는지 여부를 체크하기 위해, SK-Mel-103 흑색종 세포를 BO-110으로, 또는 완충액 대조군 (비히클)으로 처리한 후 12시간 경과하였을 때 3-메틸아데닌 또는 클로로퀸으로 처리하였다. 그 결과는 도 6에 제시되어 있다.
형광 현미경검사법에 의해 나타난 바와 같이 (도 6a 및 도 6b), 3-MA는 BO-110에 의한 GFP-LC3 초점 형성을 차단시켰다. 클로로퀸의 존재하에서 자가포식소체가 축적되기는 하였지만, 흥미롭게도 이러한 유도가 사멸 유도제 만큼 생산적이지는 않았다 (도 6c, 클로로퀸의 존재하에서 관찰된 사멸 세포 비율(%)은 펩스타틴 A, E64d, 또는 상기 둘의 조합물을 사용하였을 때 관찰된 것보다 낮았다). 그러므로, 이러한 결과는 BO-110의 세포독성 활성이 자가포식소체 형성의 수동적인 부산물이 아니며: 리소좀의 분해 활성은 흑색종 세포를 사멸시키는 BO-110의 활성을 위해 필수적인 매개인자라는 시나리오를 지지한다.
실시예 5. BO-110은 추후 사멸 프로그램을 이용할 수 있도록 자가포식소체/리소좀 융합을 유도한다.
자가리소좀이 BO-110의 중요한 유도제일 경우, 리소좀 히드롤라제를 차단하면 BO-110 처리시 흑색종 세포는 보호되어야 한다. 중복된 표적을 가진 다중 효소가 상기 소기관 내에 위치할 수 있기 때문에 모든 리소좀-의존성 활성을 차단한다는 것을 불가능하다 (문헌 [Fehrenbacher and Jaattella, 2005]). 또한, 광범위한 프로테아제 억제제 E64d 및 펩스타틴 A는 자가리소좀에서 각종 카텝신 (B, D 및 L)을 효율적으로 차단하는 바 (문헌 [Klionsky et al., 2008]), 이들 화합물에 의해 리소좀 활성에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 그러므로, 완충액 대조군 또는 BO-110으로 처리한 후 20시간이 경과하였을 때 클로로퀸, 펩스타틴 A 또는 E64d가 세포 사멸에 미치는 효과에 대하여 비교하는 시험을 수행하였다. 그 결과는 도 6c에 제시되어 있으며, 앞서 언급된 바와 같다. 펩스타틴 A 및 E64d가 BO-110에 의한 세포 사멸 정도를 50% 만큼 감소시켰다는 점이 주목할 만하다.
소포가 이전의 거대 엔도좀을 포함하는 것으로 확인된 큰 다중소포 구조체로서 결국에는 (엠피좀으로 공지된 하이브리드 구조체를 생성하는) 다중 자가포식소체를 동원하는 것에 사응하고, 이러한 소포는 리소좀이 동원되지 않거나, 기능이상인 중단형 자가포식소체로부터의 결과물은 아니거나, 자가포식소체가 부적절한 분해 물질의 축적 결과물이라는 것을 확인하기 위해 흑색종 세포를 GFP 및 체리-LC3의 융합물로 형질감염시켰다. 체리-GFP-LC3 신호는 2가지 형광 단백질 (체리 및 GFP)에 기인하여 적색 및 녹색 형광 자가포식소체를 나타내었지만, 자가리소좀의 산성 환경하에서는 GFP 신호 (녹색)를 나타내었다.
이러한 전략법을 사용함으로써 실제로, 라파마이신과 유사한 BO-110은 도 6c에서의 오직 적색으로만 표시되는 LC3 초점의 존재에 의해 명시되는 바와 같이, 흑색종 세포에서 자가리소좀의 형성을 유도하였다. 이전 시험과 일관되게, (플루오레드-표지 BO-110과 GFP-융합된 조기 엔도좀 단백질 Rab5의 동일 위치에 존재 여부를 측정함으로써 확인된 바 (도 6e), 클로로퀸은 상기 dsRNA 모방체의 엔도좀 흡수에는 어떤 영향도 미치지 않으면서 BO-110에 의해 일어나는 흑색종 세포 사멸을 차단시켰다 (도 6d). 광범위한 범위의 프로테아제 억제제 E64d 및 펩스타틴 A 및 액포 ATPase 차단제인 바필로마이신을 사용함으로써 유사한 억제 효과를 관찰할 수 있었고 (도 6d), 이는 리소좀에 의존하는 BO-110의 새로운 작용 모드를 입증한다.
BO-110 처리 동안의 리소좀 활성을 독립적으로 모니터링하기 위해, DQ-BSA (단백질분해성 효소에 의해 절단되지 않으면 녹색 형광이 소광되는 BSA의 유도체)를 프로세싱할 수 있는 능력에 대해 세포를 시험하였다. 도 6f에 제시되어 있는 바와 같이, DQ-BSA는 BO-110의 존재하에서는 효율적으로 절단되었다. 그의 세포 투과성은 pH에 의존하며, 작용성의 리소좀성 산 내로 혼입되었을 때에는 적색 형광을 방출하는 염료인 리소트랙커-레드와 함께 동일 위치에 존재하는 것으로 명시되는 바와 같이, DQ-BSA는 리소좀에서 검출되었다는 점에 주목하였다. 상기 결과는, 리소좀 활성이 클로로퀸으로 차단되었을 때 BO-110으로 처리된 SK-Mel-103 세포에서 DQ-BSA에 기인한 형광 방출이 최소인 것으로 관찰된 결과와는 대조적인 차이를 보였다 (도 6f 및 도 6g).
자가포식 프로세스의 개시 및 완전한 발생을 일으킬 수 있는 BO-110의 능력에 대한 특징을 추가로 규명하기 위해, 공초점 현미경검사법에 의해 자가포식소체 및 리소좀 융합물을 시각화하였다. 이러한 목적을 위해, GFP-LC3을 안정적으로 발현하는 SK-Mel-103 세포를 BO-110 또는 대조군으로서의 상응하는 완충액으로 처리하고, 리소트랙커-레드의 존재하에서 인큐베이션시켰다. 개별 세포 및 세포 군집에 기초한 (각각 GFP-LC3 융합물 및 리소트랙커에 대한) 녹색 및 적색 형광의 이중 방출에 대한 분석을 통해 자가포식소체 및 리소좀이 뚜렷히 동일 위치에 존재하는 것으로 나타났다 (도 6h 및 6i의 대표적인 형광 사진용 현미경 사진, 및 도 6j의 상응하는 정량화 참조). 이와 같이 동일 위치에 존재한다는 것은 BO-110에 의해 유발된 반응에서 조기에 일어나는 이벤트이며 (이는 이미 처리 후 4-8시간 경과하였을 때에 검출가능하다), 조직화된 세포 붕괴에 앞서 일어났다는 점이 중요하다.
자가포식소체는 BO-110에 대한 반응으로 활성 리소좀에 융합된다는 것을 확인한 후, 본 발명자들은 상기 소기관이 엔도좀과 상호작용하는지 여부 또는 엔도좀으로 동원되는지 여부를 평가하였다. 먼저, 후기 엔도좀 마커 Rab7에 융합된 GFP를 발현하는 흑색종 세포에서 엔도좀의 동적 성질을 평가하였다 (문헌 [Luzio et al., 2007]). 기초 엔도좀 생성 및 분해 (즉, 크기의 점진적 감소)를 비처리 흑색종 세포에서 검출하였다 (도 7a의 좌측 패널). 그러나, BO-110 처리는 엔도좀의 지속적이며 멀티웨이브형의 생성을 유도하면서, 엔도좀 활성을 현저하게 증진시켰다 (도 7a의 중간 및 우측 패널). GFP-Rab7 및 리소트랙커-레드의 이중 영상화하에 의해 측정된 바 (도 7b), 상기 엔도좀은 리소좀으로 꽉 채워져 있는 것으로 나타났다 (도 7b). 추가로, 도 7c에서도 연속된 일련의 융합 이벤트로 나타난 바와 같이, 리소좀이 GFP-Rab7로 표지된(decorated) 엔도좀으로 다수 동원되는 빠른 역동학적 성질이 저속 촬영 현미경검사법을 통해 밝혀졌다. 도 7b (우측 패널)에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 단백질의 공지된 우성-음성 돌연변이체인 Rab7-T22N을 세포가 과다발현한 경우, 엔도좀-리소좀 융합물은 현저하게 억제되었다. 종합하면, 이러한 결과를 통해 BO-110으로 처리된 종양 세포에서 엔도/리소좀 구획의 동적 이동이 밝혀졌다.
실시예 6. BO-110은 자가포식을 아폽토시스 카스파제와 연결시킨다.
리소좀 프로테아제는 여러 수준에서 사멸 프로그램에 영향을 줄 수 있다 (문헌 ([Maiuri et al., 2007]; [Hoyer-Hansen and Jaatella, 2008]). 미노콘드리아의 경우, 리소좀 프로테아제는 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 조절장애를 일으킬 수 있고/거나 고전적 아폽토시스 카스파제 (조절형 casp-9 및 효과기 casp-3 및 -7)를 이용할 수 있다. casp-8에 의존하는 외인성 경로 또한 리소좀 활성화에 반응할 수 있다 (문헌 [Fehrenbacher and Jaattella, 2005]). BO-110 작용 모드에서의 ROS의 연루에 대해 다루기 위해서, 비타민 E, 트롤록스(Trolox) 또는 티론(Tiron), 상이한 항산화제 활성을 가진 스캐빈저 및 pan-카스파제 억제제 z-VAD-fmk의 존재하에 처리하였다. 이들 각 경우에서 세포 사멸에 대한 결과 분석 결과를 도 8a에 나타내었는데, 비타민 E를 사용하여 얻은 데이터는 ROS에 의해 조절되는 흑색종에서의 아폽토시스를 차단하는 상기 시약들을 일정 용량으로 사용하였을 때 상기 언급한 화학적 항산화제의 사용으로 수득되는 결과의 대표적인 경로로서 제시되었다 (문헌 [Fernandez, 2006]). 도면에 나타낸 바와 같이, 이들 항산화제의 존재는 BO-110에 의한 세포 사멸에서는 어떤 유의적인 효과도 없는 것으로 나타났다. 대신, pan-카스파제 억제제 z-VAD-fmk는 BO-110에 의한 사멸을 70% 만큼 억제시켰다. 종합하면, 이러한 결과들은 자가포식 프로그램의 하류에 존재하는 활성화된 카스파제-의존성 기전을 지지한다.
실제로, PEI없이 완충액 말고는 비처리된 완충액 대조군 (NT) 또는 PEI, pIC, 복합체 BO-110, 또는 공지된 카스파제 절단 유도체인 보르테조밉 처리 후 각기 다른 경과 시점에 수집된 세포 추출물의 면역블롯팅에 의해 측정된 바, 카스파제 프로세싱은 BO-110에 의해 효율적으로 촉진되었다 (도 8b 및 도 8c). 도 8b는 상이한 전이성 흑색종 세포주에서 카스파제 8 및 9의 아폽토시스 프로세싱을 유도할 수 있는 PEI, pIC 및 BO-110을 비교하는 것이다: 시험된 인간 흑색종 세포주 모두에서 BO-110 처리 후 20h이 경과하였을 때, 카스파제 9 및 8의 효과적인 활성화가 뚜렷히 분명하게 나타났다: 보르테조밉의 경우에도 그와 유사한 결과가 관찰되었다. 추가로, BO-110에 의한 카스파제 프로세싱의 동력학적 성질 및 정도는 BRAF (예를 들어, SK-Mel-19), NRAS (SK-Mel-103, -147), 또는 p53 (SK-Mel-28)의 돌연변이 상태와는 상관없이, 고도한 일관성을 가졌다 (도 5b).
도 8c는 아폽토시스 카스파제 9 및 8 이외에도 효과기 카스파제 3 및 7을 포함한, 보다 완전한 분석에 착수한 것으로서 SK-Mel-103 세포주를 사용하여 수행된 시험과 유사한 결과를 보여준다. SK-Mel-147 세포주를 사용하여 같은 시험을 수행하였으며, 이를 통해 유사한 결과를 얻었다. SK-Mel-103 및 -147에서 casp-9, -3 및 -7의 효율적인 프로세싱이 특히 관련이 있었다. 이들 세포주에는 Apaf-1이 낮은 수준으로 존재하였고, 고전적 항암제, 예를 들어, 독소루비신, 에토포시드 또는 시스플라틴에 대한 반응으로 casp-9/Apaf-1 아포프토좀을 사용하는 데 있어 그 효율은 매우 낮았다 (문헌 ([Fernandez et al., 2005]; [Soengas et al., 2006])) (도 1c의 그래프 참조). 그러므로, 이러한 결과는 아폽토시스 프로그램을 활성화시킬 수 있고, 표준 화학치료 약물에 대한 내성의 고유한 기전을 우회할 수 있는 BO-110의 우수한 능력을 제시한다.
실시예 7. 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 구성원에 대한 보상적 효과의 부재하에서 BO-110에 의한 세포 사멸의 활성화
BO-110의 작용 모드를 더욱 상세하게 분석하기 위해, 그리고 상기 제제에 의해 독특하게 활성화될 수 있는 이벤트를 확인하기 위해, 약물 반응을 보르테조밉의 효과와 비교하였다. 상기 제제는 흑색종 세포에서 아폽토시스 기구의 강력한 활성제이기도 한 바 (문헌 [Wolter et al., 2007]; [Fernandez et al., 2006])), 이를 선택하였다.
그러나, 본 발명자들은 보르테조밉 및 BO-110이 기계론적으로 상이할 것으로 예측하였다. 보르테조밉은 프로테아좀을 표적하지만, 리소좀은 표적하지 않는다 (문헌 [Qin et al., 2005]). 추가로, 도 5a에 제시되어 있는 바와 같이, 보르테조밉은 MDA-5를 유도하거나 프로세싱하지 않으면서 흑색종 세포를 사멸시킨다. 보르테조밉은 또한 프로-아폽토시스 NOXA의 대량 축적을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그의 항-아폽토시스 길항제 인자 MCL-1 (Bcl-2 패밀리의 구성원)의 신속하고 급격한 상향조절을 유도할 수 있다는 점에서 흥미로운 대상이 된다 (문헌 [Fernandez et al., 2005]). MCL-1이 프로테아좀 억제를 위한 내부 보상 기전으로서의 역할을 하고, 시험관내 및 생체내에서 보르테조밉의 항종양발생 효과를 차단시킨다는 점이 중요하다 (문헌 ([Wolter et al., 2007]; [Qin et al., 2006])).
보르테조밉 및 pIC (나형 pIC 또는 PEI와 복합체화된 pIC) 사이의 유사성 및 차이를 평가하기 위해, 흑색종 세포를 각각의 상기 화합물들과 함께 인큐베이션시키고, 처리 후 상이한 시점에 추출물을 수집하고, NOXA, MCL-1, 및 다른 Bcl-2 패밀리 구성원 (Bcl-xL 또는 Bcl-2)의 수준을 평가하였다. 그 결과는 도 9에 제시되어 있다.
도 9의 패널 a 및 B에 제시되어 있는 바와 같이, 나형 pIC는 SK-Mel-28 또는 SK-Mel-147 흑색종 세포 (각각 p53 L145R 돌연변이 또는 p53wt을 발현하는 세포)에서 일관되게 또는 지속적인 방식으로 NOXA를 유도하지 못했다. 한편, BO-110은 각각 SK-Mel-28, SK-Mel-147 및 SK-Mel-103에서 기초 수준의 35, 10 및 5배 만큼 NOXA를 유도하였으며 (도 9의 패널 a 및 c의 면역블롯, 및 SK-Mel-28 세포에서 수득한 결과로부터의 도 9b의 대표적인 정량 참조), 이는 다시 나형 pIC와 PEI와 복합체화된 pIC의 차별화된 활성을 강조한다.
NOXA의 억제성 조절제와 관련하여, MCL-1 수준은 BO-110에 의해 최소한도로 유도되었다 (도 9a 및 도 9b의 첫번째 그래프). 이는 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Fernandez et al., 2005]), NOXA를 강력하게 활성화시키지만, 동시에 MCL-1이 축적될 수 있도록 유도하는 것인 보르테조밉과는 대조를 이룬다. 다른 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 구성원, 예로서, Bcl-2 및 Bcl-xL 또한 BO-110에 의해 어떤 영향도 받지 않았다 (도 9c의 SK-Mel-103에 대한 면역블롯 참조).
보상 기전의 부재하에서는 상대적으로 낮은 수준의 BO-110 유도성 NOXA가 세포 사멸을 촉진시키는 데 충분할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 앞서 NOXA mRNA 및 단백질을 특이적으로 억제시키는 것으로 입증된 shRNA를 흑색종 세포에 형질도입시키고 (문헌 [Fernandez et al., 2005]), 이때 대조군으로서는 불활성 shRNA 대조군을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염된 세포를 사용하였다. 도 9d에 제시되어 있는 바와 같이, shRNA에 의한 NOXA 단백질 발현의 50% 감소가 BO-110에 의한 NOXA의 상향조절을 또한 거의 50% 만큼 억제시켰고, BO-110 독성도 억제시켰다 (도 9e).
이어서, 본 발명자들은 BO-110에 의한 NOXA 조절을 위한 MDA-5 단백질의 요건을 정의하기 위해 MDA-5에 대한 shRNA를 사용하였고, 앞서 기술된 바와 같이, 단, NOXA 수준을 정량하는 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 9f의 그래프에 제시되어 있다. 흥미롭게도, MDA-5 shRNA는 다른 Bcl-2 패밀리 구성원에 대해서는 2차적인 효과없이, NOXA 단백질 수준을 70% 만큼 억제시켰다 (도 9f).
종합하면, 이러한 결과들을 통해 NOXA 유도에 의해 유도된 아폽토시스 기구에서 MDA-5의 작용과 관련된 새로운 사실이 밝혀졌다.
실시예 8. 면역적격 마우스에서 나형 pIC 및 BO-110의 차별적인 효능.
이어서, 생체내에서 pIC 및 BO-110의 항-흑색종 활성에 대해 평가하였다. 흑색종 모델에서, 나형 pIC는 선천성 면역 프로그램의 효과적인 활성화를 위해서는 고용량으로 투여하거나, 다른 제제 (예를 들언, 단백질 합성 억제제)와 함께 조합하여 투여되어야 한다. 이전 실시예에서 얻은 데이터를 통해 pIC는 PEI의 존재하에서는 유의적으로 더욱 강력한 효능을 발휘할 것으로 제안되었다.
먼저, 면역적격 배경하에서 처리 반응을 분석하였다. 형질도입되지 않은 B16 마우스 흑색종 세포, 또는 (형광 영상화에 의해 용이하게 검출할 수 있도록) GFP가 형질도입된 B16 마우스 흑색종 세포를 동계의 정상적인 마우스에 이식하였다. 각각 국소 부위에서의 종양 진행, 또는 원거리 전이로서의 종양 진행을 평가하기 위해 (i) 피하로 (s.c.) 또는 (ii) 정맥내로 종양 세포를 주사하는 2가지 전략법을 사용하였다. 마우스를 PEI, pIC 또는 BO-110 또는 100 ul 글루코스 5% (NT 군)으로 처리하였다.
도 10a에는 B16 생성 및 투약 및 처리 스케줄을 포함한, s.c. 이종 이식에 대한 실험상 전략법이 요약되어 있다. 처리시, 2 ng/kg의 나형 pIC 또는 PEI와 복합체화된 pIC를 종양주변에 주사하였다.
놀랍게도, BO-110은 연구된 모든 경우에서 pIC보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 비히클, PEI 또는 pIC만을 단독으로 투여받은, 피하로 성장하는 B16 흑색종을 가진 마우스는 과도한 종양 성장으로 인해 이식 후 경과일수 15-25일 이내에 희생시켜야 했다 (도 10a). 같은 조건하에서, BO-110 처리군에서의 피하 흑색종은 검출불가능하거나, 유의적으로 더 작았다 (도 10a).
도 10b에는 정맥내로 B16-eGFP 흑색종 세포를 이식한 후, pIC, PEI, BO-110 또는 글루코스 5% (NT 군)로 처리한 실험상 전략법이 요약되어 있다. 상기 도면에는 또한 희생된 동물 페로부터 얻은 형광 영상 (도 10b) 및 폐 전이 정량 (도 10c)도 제시되어 있다. BO-110은 형광 영상화에 의해 측정된 바, 흑색종 폐 전이를 나타내는 대용 모델에서도 또한 나형 pIC보다 5배 더 강력한 효능을 나타내었다.
실시예 9. IFN이 BO-110의 사멸-유도성 특징을 반복시키지는 못한다.
pIC는 IFN-유도성 세포 면역의 고전적 유도제이다 (문헌 [Wenzel et al., 2008]). 그러나, 이전 실시예에서 보여진 데이터를 통해, pIC는 또한 PEI와 복합체화된 경우에 세포 자율 방식으로 작용할 수 있다는 것이 제안되었는데, 이는 "전문적인" 면역 세포에서의 IFN-매개성 반응과는 상이할 수 있다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, IFN-α을 분비하고, 그에 대해 반응할 수 있는 능력에 대해 B16 흑색종 세포 및 대식세포를 시험하였다. RT-PCR을 통해 두 세포 유형 모두 BO-110 처리 후 고전적 IFN-α의 표적, 예를 들어, IFIT-1 (테트라트리코펩티드 반복부를 가진 IFN-유도성 단백질)을 활성화시켰다는 것이 밝혀졌다 (도 11a). PEI는 대식세포에서는 pIC-매개성 IFN 표적 유도를 위해서는 불필요하였다 (도 11a). 이상기 세포는 바이러스 dsRNA를 효율적으로 센싱할 수 있는 바, 상기와 같은 사실은 예측된 것이다. 그러나, 흑색종 세포는 단지 나형 pIC만으로는 IFIT-1을 유도할 수 없었다 (도 11a).
흑색종 세포에 대한 IFN-α 생산을 직접 평가하기 위해, 참조 대조군으로서는 재조합 인간 IFN-α를 사용하여 Elispot 분석법을 수행하였다. BO-110 처리 후 흑색종 세포에 의해 분비된 IFN-α 수준은 10 pg/ml 보다 낮았다. IFN-α가 BO-110을 대신할 수 있는지 여부 (즉, IFN-α 분비가 흑색종 세포 사멸의 주된 유도제가 될 수 있는지 여부)를 판단하기 위해, 상기 시토카인의 양을 증가시키면서 흑색종 세포에 첨가하였다. 흥미롭게도, 고용량의 IFN-α (BO-110 처리 후 분비되는 수준의 10배)가 흑색종 세포 생육성에는 어떠한 영향을 미치지 못했다 (도 11b).
도 11c에 제시된 바와 같이, 매우 일시적인 것은 제외하고, pIC에 대한 반응으로 관여하는 유전자들 모두는 인터페론에 대해 인터페론 반응을 보일 것으로 예측된다고 마이크로어레이 시험을 통해 밝혀졌다는 점도 흥미롭다. 대조적으로, 지속적으로 유지되는 것 이외에도 BO-110의 효과는 추가의 전사체로 확장되었다.
그러므로, 이러한 결과는 대식세포 및 흑색종 세포에서 dsRNA 모방체의 인식 및 센싱에서의 내인적인 차이를 설명한다.
실시예 10. BO-110은 중증의 면역손상 배경하에서 전이성 성장을 억제시킬 수 있다.
흑색종 세포는 빈번하게는 면역내성을 보이는 바, 흑색종 세포에 대한 BO-110의 직접적인 독성이 고도의 면역결핍 배경하에서도 여전히 효율적인지 여부를 시험하였다. 흑색종의 면역내성과 관련되는 가장 빈번한 효과 또는 기전은 NK, T 및 B 세포 신호전달의 결함이다 (문헌 [Kirkwood et al., 2008]). 그러므로, NK, T 및 B 세포 림프구 기능이 손상된 마우스 SCID를 앓는 베이지 마우스에서 흑색종 성장을 차단하는 pIC (단일 제제로서의 pIC 또는 PEI와 복합체화된 pIC)의 효능을 시험하였다.
폐 전이 대조군에서의 처리 효능을 모니터링하기 위해, 흑색종 세포를 GFP로 표지하고, 도 10에 기술되어 있는 처리 스케줄에 따라 정맥내로 주사하였다. B16-흑색종 (도 12 패널 a, b 및 c) 및 SK-Mel-103 (도 12, 패널 d 및 e)을 각각 뮤린 및 인간 흑색종의 대표적인 일례로서 분석하였다.
두 세포 모델 모두에서, BO-110은 폐에서의 흑색종 성장을 억제시킬 수 있었다. 도 12a는 BO-110 처리 후 폐 표면상의 B16 전이 개수는 육안으로도 뚜렷한 차이를 나타낸다 (도 12b의 정량화 참조). 조직학적 분석을 통해 BO-110 군에서 B16-유도성 폐 결절의 개수 및 크기 감소 또한 확인하였다 (도 12c). 유사 분석을 통해 SK-Mel-103의 파종성 성장을 보이는 대조군에서 BO-110 (복합체를 형성하지 않은 pIC 제외)의 뚜렷한 항-종양 효과가 밝혀졌다 (도 12 패널 d 및 e). 요약컨대, 본 발명자들의 데이터를 통해 적격 면역계가 없는 SCID를 앓는 베이지 마우스의 생체내에서 강력한 항-흑색종 활성을 유도하는, dsRNA 모방체의 신규한 작용 모드가 입증되었다 (문헌 [Cray and Chapeau, 1990]).
실시예 11. 인간 흑색종 동물 모델에서 BO-110에 의한 전이성 성장의 억제
pIC 및 BO-110 사이의 차이를 비교하기 위해 보다 관련성이 큰 설정 환경을 사용하였다. Tyr::NRASQ16K x INK4a/ARF-/- 마우스는 인간 질환과 유사한 특징을 가진 흑색종을 발생시킨다 (문헌 [Ackermann et al. 2005]). 마우스를 DMBA (7,12-디메틸벤[a]안트라센, 시그마로부터 입수)로 단일 국소 처리하였다. 색소성 병변의 직경이 일단 1 mm에 도달하고 나면, 생체내 전달용으로 제제화된 대조군 PEI, 나형 pIC 또는 PEI에 접합화된 pIC를 주 2회에 걸쳐 복강내 주사 (i.p.)에 의해 투여하였다.
또한, 직접 측정한 종양 크기 측정 결과 (도 13a 및 13b), PET-CT에 의한 종양의 대사 활성 (도 13c) 및 조직학적 분석 (도 13a)에 의해 나타난 바와 같이, BO-110의 항종양 활성은 나형 pIC보다 유의적으로 더 높은 것으로 관찰되었다.
흥미롭게도, 2차 독성 신호없이 사용된 처리 용량에서 (도 13d의 분석 참조) BO-110에서의 무진행 병변의 시간 프레임은 2배였다 (도 13a).
이러한 결과는 흑색종 세포의 침습적인 작용과 싸우는 dsRNA 유사체의 투여에 기초한 처리시의 생육성을 입증한다.
실시예 12. BO-110의 다양한 종양 세포에 대한 세포독성 활성
흑색종에 존재하며, dsRNA 센싱 및 자가포식에 영향을 미치는 유전적 및 후생적 변화는 상이한 유형의 암들 간에 보존될 수 없는 바, BO-110이 다른 신생물성 악성종양에서도 치료학상 유익한지는 불명확하였다. 특히, 췌장 종양, 결장 종양, 방광 종양, 뇌 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 폐 종양 및 난소 종양은 침습성이고, 부분적으로는 사멸 프로그램의 다면발현성 불활성화로 인해 각종 처리에 대해 내성을 띤다.
BO-110이 광범위한 작용을 가진 신규한 항암 전략법을 나타낼 수 있는지 여부를 정의하기 위해, 상기 언급된 유형의 암과 관련된, 독립적으로 단리된 일련의 세포주를 주지의 NCI-60 패널로부터 선택하였다 (도 14). 따라서, 종합하면, 이들 세포주는 유전적 배경이 상이한 다양한 종양 (즉, 췌장 종양, 결장 종양, 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 폐 종양 및 난소암종)을 포함하였다. 도 14에 제시되어 있는 바와 같이, 분석된 세포주는 BO-110에 대하여 흑색종 참조 대조군과 유사한 감수성을 나타내었다. 상기 데이터로부터 BO-110은 이중으로 자가포식 유도 및 아폽토시스를 이용할 수 있으며, 이를 통해 (정상적인 구획의 생육성에는 어떤 영향도 미치지 않으면서) 흑색종 뿐만 아니라, 기타 다른 종양 유형, 예를 들어, 췌장 종양, 결장 종양, 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 폐 종양 및 난소암종과 관련된 세포도 공동으로 협동하여 선택적으로 사멸시킬 수 있다는 결과를 얻었다.
실시예 13. BO-110에 의해 유도된 세포 사멸은 종양 세포주에서 MDA-5, Noxa 및 자가포식 활성화에 의존한다.
BO-110에의 감수성은 (즉, 종양 세포 유형에 근거하여) 연역적으로는 예측이 불가능하기 때문에, BO-110에의 반응을 매개하는 신호전달 캐스케이드를 정의하는 것이 필요하였다. 흑색종 세포에서 수행된 (cDNA 어레이에 기초한) 고속 대량 유전자 분석을 통해 BO-110이 dsRNA 센서 MDA-5 뿐만 아니라, 프로아폽토시스 인자 NOXA의 강력한 상향조절을 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 면역블롯팅 분석법을 사용함으로써 본 발명자들은 실제로 (예를 들어, 세포주 HCT116 또는 MiaPaCa2에서) BO-110에의 감수성 및 내성은 MDA-5 및 NOXA를 유도할 수 있는 세포의 능력과 상관 관계에 있다는 것을 입증하였다 (도 15). 상기 언급된 BO-110의 프로-아폽토시스 역할과 일관되게, 감수성 세포주는 카스파제-9의 뚜렷한 프로세싱을 나타내었고, 이는 전기영동 이동 변화로서 시각화될 수 있었다 (도 15).
참조 문헌
Figure 112012009186810-pct00002
Figure 112012009186810-pct00003
Figure 112012009186810-pct00004
Figure 112012009186810-pct00005
Figure 112012009186810-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Fundacion Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas Carlos III. <120> Process for the identification of compounds for treating cancer. <130> PCT-03837 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Target sequence of shRNA used to down regulate MDA-5. <400> 1 cgcaaggagt tccaaccatt t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR forward primer to detect MDA-5 expression. <400> 2 ggcaccatgg gaagtgatt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR reverse primer to detect MDA-5 expression. <400> 3 atttggtaag gcctgagctg 20

Claims (30)

  1. a) 후보 화합물을 암 세포 배양물, 또는 암 세포로부터 유래된 암 세포주와 접촉시키는 단계;
    b) 암 세포에서 또는 암 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식 유도를 측정하는 것과 함께, MDA-5 패밀리로부터의 헬리카제의 활성화 수준 및 NOXA 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
    d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계
    를 포함하고,
    상기 후보 화합물은 이중 가닥 RNA (dsRNA) 및 폴리양이온의 조합물을 포함하는, 암 치료를 위한 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 자가포식 유도 측정이 발현 수준, 번역 후 수식의 존재 또는 단백질 자가포식의 세포내 위치화를 체크함으로써 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 자가포식 유도가
    i. 단백질 LC3의 전기영동 이동의 변화, 또는
    ii. 단백질 LC3의 초점 형성의 검출
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 기법에 의해 측정되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 자가포식 유도가 자가포식소체에 대한 현미경 관찰에 의해 자가포식소체의 존재를 체크함으로써 측정되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 자가포식소체의 존재를 투과 전자 현미경검사법을 사용하여 체크하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 암 모델 마우스에서 자가포식을 유도하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 후보 화합물을 흑색종 세포 배양물, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주와 접촉시키는 단계;
    b) 암 세포에서 또는 암 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식 유도를 측정하는 것과 함께, MDA-5 패밀리로부터의 헬리카제의 활성화 수준 및 NOXA 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
    d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 흑색종 치료를 위한 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 세포주가 인간 세포주: SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 및 SK-Mel-147, 및 B16 마우스 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 후보 화합물을, 하기 유형의 암: 췌장암, 결장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종 중 적어도 하나로부터의 암 세포 배양물, 또는 상기 언급된 유형의 암들 중 적어도 하나로부터 유래된 세포주와 접촉시키는 단계;
    b) 암 세포에서 또는 암 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식 유도를 측정하는 것과 함께, MDA-5 패밀리로부터의 헬리카제의 활성화 수준 및 NOXA 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 단계 b)에서 수득한 데이터를, 유사하게, 단, 후보 화합물의 부재하에서 처리된 동일한 세포의 대조군에서 관찰된 데이터와 비교하는 단계;
    d) 대조군과의 비교시 단계 b)에서 측정된 파라미터 또는 파라미터들을 유의적으로 증가시킨 화합물을 선별하는 단계
    를 포함하는, 상기 유형의 암 중 적어도 하나의 치료를 위한 치료제로서 사용되는 화합물을 확인하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포주가 췌장암 세포주: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 및 Panc-1로 이루어진 군으로부터; 또는 결장암 세포주: CACO, SW480 및 SW1222로 이루어진 군으로부터; 또는 방광암 세포주: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 및 SW1170으로 이루어진 군으로부터; 또는 신경아교종 세포주: U87MG, U251 및 T98G로 이루어진 군으로부터; 또는 유방암 세포주: MDA231, MCF7 및 T47D로 이루어진 군으로부터; 또는 전립선암 세포주: LNCaP, PC3 및 DU145로 이루어진 군으로부터; 또는 폐암 세포주: H1299 및 NCI H460으로 이루어진 군으로부터; 또는 난소암 세포주: NCI H23, CHQK1 및 SK-OV-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 선별된 화합물이, 길이가 쇄 당 적어도 1000개의 뉴클레오티드인 이중 가닥 RNA (dsRNA), 및 폴리양이온의 조합물로 구성된 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 선별된 화합물이, 길이가 쇄 당 적어도 1000개의 뉴클레오티드인 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC), 및 폴리에틸렌이민 (PEI)의 조합물로 구성된 것인 방법.
  13. 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC) 및 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)의 조합물인 화합물이고, 상기 화합물은
    a) 흑색종 세포, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식을 유도하고,
    b) 정상적인 멜라닌세포에 영향을 미치지 않으며,
    c) 흑색종 세포, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식 및 아폽토시스의 이중 유도를 촉진시키고,
    d) 폴리이노신-폴리시티딜산 포스페이트 당 선형 폴리에틸렌이민의 질소 잔기의 N/P 비가 1 내지 5인 폴리이노신-폴리시티딜산 및 선형 폴리에틸렌이민의 복합체인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC)은 길이가 쇄 당 적어도 25 뉴클레오티드인 화합물.
  15. 제13항에 있어서, 흑색종 세포로부터 유래된 세포주가 인간 세포주 SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 및 SK-Mel-147, 및 뮤린 B16 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  16. 제13항에 있어서, 길이가 쇄 당 적어도 1000개의 뉴클레오티드인 폴리이노신-폴리시티딜산 (pIC), 및 폴리에틸렌이민 (PEI)의 조합물을 포함하는 화합물.
  17. 제15항에 있어서, 하기 유형의 암: 췌장암, 결장암, 방광암, 신경아교종, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종 중 적어도 하나에 대한 세포에서 자가포식 및 아폽토시스의 이중적 유도를 촉진시키는 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유래된 세포주는
    a) 췌장암 세포주 IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspe1, A6L, SKPC1 및 Panc-1,
    b) 결장암 세포주 CACO, SW480 및 SW1222,
    c) 방광암 세포주 RT1 12, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 및 SW1 170,
    d) 신경아교종 세포주 U87MG, U25 1 및 T98G,
    e) 유방암 세포주 MDA231, MCF7 및 T47D,
    f) 전립선암 세포주 LNCaP, PC3 및 DU145,
    g) 폐암 세포주 H1299 및 NCI H460, 또는
    h) 난소암 세포주 NCI H23, CHQK1 및 SK-OV-3
    의 그룹으로부터 선택되는 것인 화합물.
  19. 자가포식의 유도와 관련되는 바이오마커와 조합하여 바이오마커 MDA-5 헬리카제의 활성화 또는 NOXA의 발현을 보여주는 것으로 특징지워지는 암 유형의 치료에서 의약으로서 사용하기 위하여 어떤 화합물을 포함하는 제약 조성물로서,
    상기 화합물은 폴리이노신-폴리시티딜산 포스페이트 당 선형 폴리에틸렌이민의 질소 잔기의 N/P 비가 1 내지 5인 폴리이노신-폴리시티딜산(pIC) 및 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 조합이고, 상기 화합물은 흑색종 세포, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식을 추가로 유도하는 것인 제약 조성물.
  20. 흑색종의 치료에서 의약으로서 사용하기 위하여 어떤 화합물을 포함하는 제약 조성물로서,
    상기 화합물은 폴리이노신-폴리시티딜산 포스페이트 당 선형 폴리에틸렌이민의 질소 잔기의 N/P 비가 1 내지 5인 폴리이노신-폴리시티딜산(pIC) 및 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 조합이고, 상기 화합물은 흑색종 세포, 또는 흑색종 세포로부터 유래된 세포주에서 자가포식을 추가로 유도하는 것인 제약 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 폴리이노신-폴리시티딜산(pIC)는 길이가 쇄 당 적어도 25 뉴클레오티드인 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  22. 삭제
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 정상적인 멜라닌세포에 영향을 미치지 않는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 흑색종 세포로부터 유래된 세포주는 인간 세포주의 그룹 SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 및 SK-Mel-147, 및 B16 마우스 세포로부터 선택되는 것인 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 길이가 쇄당 적어도 1000 뉴클레오티드인 폴리이노신-폴리시티딜산(pIC) 및 폴리에틸렌이민(PEI)의 조합을 포함하는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 자가포식 및 아폽토시스의 이중적 유도를 촉진시키는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  27. 제19항 또는 제20항에 있어서, 전이성 암의 치료에 사용하는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  28. 제20항에 있어서, 자가포식 유도와 관련된 바이오마커와 함께, 바이오마커 MDA-5 헬리카제의 활성화 또는 NOXA의 발현을 나타내는 것을 특징으로 하는 암 유형의 치료에 사용하는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  29. 제19항에 있어서, 흑색종의 치료에 사용하는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
  30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하기 유형의 암: 췌장암, 결장암, 방광암, 신경아교종, 유방암, 전립선암, 폐암 및 난소암종 중 적어도 하나의 치료에 사용하는 의약으로 사용하기 위한 제약 조성물.
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