CN115634287A - 一种基于砷化合物的肿瘤疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于砷化合物的肿瘤疫苗及其制备方法和应用。该基于砷化合物的肿瘤疫苗包括经砷化合物处理的肿瘤细胞，可激活抗肿瘤免疫应答，不仅能有效预防肿瘤的发生，而且能显著延缓体内已有肿瘤的快速进展。该基于砷化合物的肿瘤疫苗还能与免疫检查点阻断疗法联用，显示出协同增效。此外，本发明还阐明了决定该肿瘤疫苗的免疫原性及其肿瘤防治效果的关键分子和信号通路，鉴定出多种可用于疗效预测的重要生物标志物。当上述关键分子或信号通路缺陷、低表达或低活化时，本发明还提供了有效的联合治疗药物。本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗效果稳定，安全可靠，且制备工艺简单、成本低廉、质量可控，具有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体的，涉及一种基于砷化合物的肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，对肿瘤的预防和早期干预是降低癌症死亡率的有效手段。肿瘤疫苗能激活机体免疫系统，实现对癌细胞的监视和清除，是降低癌症发病率(预防)和延缓肿瘤进展(治疗)的可行策略。然而，受限于肿瘤细胞的低免疫原性和肿瘤组织内免疫抑制性微环境，现有肿瘤疫苗的临床治疗效果有待突破，其设计和制备的周期较长且耗费不菲。
现有研究表明：部分化疗药物能诱导癌细胞发生免疫原性细胞死亡(immunogeniccell death，ICD)，不仅能杀伤癌细胞，还能引发一系列“危险信号分子”(CALR、HMGB1、ATP等，又称ICD分子)的暴露和释放，进而增强肿瘤的免疫浸润、促进肿瘤抗原的摄取和呈递，提升效应T细胞的活化和抗癌功能。上述的化疗药物包括：米托蒽醌(mitoxantrone，MTX)、奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)、多柔比星(doxorubicin，DOX)等，其在体内发挥抑瘤活性很大程度上依赖于免疫应答的激活。研究显示，将MTX或DOX处理的肿瘤细胞预先注射至小鼠皮下，可显示出预防性疫苗的活性，在一定程度上抑制后续接种的肿瘤细胞在小鼠体内成瘤和生长。然而，已知ICD诱导药物处理的肿瘤细胞注射到荷瘤小鼠体内，尚未能显示出治疗性疫苗活性，无法有效减缓肿瘤的进展。因此，筛选具有广谱细胞毒性、可高效诱导ICD、能大幅提升肿瘤细胞免疫原性的药物，对于优化肿瘤全细胞疫苗的制备、增强其肿瘤防治效果十分必要。申请人团队前期在药物初筛实验中关注到砷化合物。在体外实验中，砷化合物可引发癌细胞死亡，且这一过程中伴随着危险信号分子的释放和暴露(截止本专利申请时，相关数据从未公布、从未发表)。上述初步研究提示：砷化合物是可诱导ICD的药物。基于此，本团队猜测：借助砷化合物在体外预处理自体来源的肿瘤细胞，有激活抗肿瘤免疫的潜力，有制备治疗性全细胞肿瘤疫苗的可能(见《砷剂调控肿瘤细胞命运的机制及激活抗肿瘤免疫的潜力》2021，陈锦锋，马瑜婷)。然而，已知的ICD药物处理的肿瘤细胞往往显示出预防性疫苗的活性，尚无任何研究发现上述细胞具备治疗性疫苗的效果。砷化合物处理的肿瘤细胞是否能预防或治疗肿瘤，尚无体内和体外实验依据。因此，上述论文中的展望仅是一种猜想。鉴于不同类型肿瘤的差异、同类肿瘤不同患者个体的差异、不同砷化合物药物特性的差异，下列问题尚属未知，有待阐明：砷化合物处理的肿瘤细胞是否具有预防性或治疗性肿瘤疫苗的活性？砷化合物预处理肿瘤细胞制备疫苗的最佳条件如何？有无质量控制标准和预测肿瘤防治效果的生物标志物？适用于防治哪些类型的肿瘤？不同砷化合物制备的肿瘤疫苗是否有差别？如何通过药物联合提升该肿瘤疫苗的效果？
发明内容
针对现有ICD诱导药物制备全细胞肿瘤疫苗的研究不足和治疗获益不佳，本发明旨在提供一种基于砷化合物的肿瘤疫苗(尤其是治疗性肿瘤疫苗)，摸索并优化了其制备方法，建立了严格的质量控制标准，并挖掘出能预测其肿瘤防治效果的生物标志物。本发明还阐明了决定肿瘤疫苗效果的特定细胞死亡执行分子及相关信号通路，针对不同个体肿瘤特性的差异(特别是上述关键分子有无缺陷、表达水平，相关信号通路活化程度)，探索了提升全细胞肿瘤疫苗防治效果的策略和特定药物的联合用药方案。研究显示，多种砷化合物都能有效治疗性引发肿瘤细胞死亡，可暴露并释放出大量危险信号分子，可激活机体抗肿瘤免疫应答。本专利申请的基于砷化合物的肿瘤疫苗能促进体内肿瘤抗原特异性免疫应答，对多种类型的肿瘤均有显著的治疗效果，并且可与ICB药物(如PD-1抗体)及多种小分子化合物等组合使用，实现药物治疗的增效联合。
本发明的首要目的是提供一种基于砷化合物的肿瘤疫苗。
本发明的又一目的是提供基于砷化合物的肿瘤疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的又一目的是提供一种防治肿瘤的药物。
本发明的又一目的是提供基于砷化合物的肿瘤疫苗和/或包含基于砷化合物的肿瘤疫苗的药物或包含基于砷化合物的肿瘤疫苗和小分子药物的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的又一目的是提供基于砷化合物的肿瘤疫苗的质量控制指标。
本发明的又一目的是提供检测细胞表面钙网蛋白、腺苷三磷酸、高迁移率族蛋白B1、环状GMP-AMP、肿瘤细胞内I型干扰素、干扰素刺激基因中的一种或多种的试剂在制备预测基于砷化合物的肿瘤疫苗的肿瘤防治效果的试剂盒中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种基于砷化合物的肿瘤疫苗，包括经砷化合物处理的肿瘤细胞。
优选地，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、骨肉瘤细胞、结直肠癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞中的任一种。
更优选地，所述肺癌细胞包括但不限于TC-1肺癌细胞。
更优选地，所述骨肉瘤细胞包括但不限于MCA805骨肉瘤细胞(本团队从原发肿瘤组织中分离获得)、MCA205骨肉瘤细胞。
更优选地，所述结直肠癌细胞包括但不限于CT26结直肠癌(CRL-2638TM)细胞。
更优选地，所述乳腺癌细胞包括但不限于EO771乳腺癌(CRL-3461TM)。
更优选地，所述黑色素瘤细胞包括但不限于B16-F10黑色素瘤(CRL-6475TM)细胞。
更优选地，所述神经母细胞瘤细胞包括但不限于Neuro2A神经母细胞瘤(CCL-131TM)。
更优选地，所述淋巴瘤细胞包括但不限于EL4淋巴瘤(TIB-39TM)细胞、Eμ-Mycp19Arf-/-淋巴瘤细胞、ABE-8.1/2pre-B淋巴瘤(TIB-205TM)细胞。
更优选地，所述白血病细胞包括但不限于L1210白血病(CCL-219TM)细胞。
优选地，所述砷化合物为三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3，ATO)、二硫化二砷(arsenicdisulfide，As2S2)、三硫化二砷(arsenictrisulfide，As2S3)、五硫化二砷(arsenic pentasulfide，As2S5)、三氯化砷(arsenous trichloride，AsCl3)、亚砷酸钠(sodium arsenite，NaAsO2)中的一种或多种。
优选地，所述处理的方法为：将肿瘤细胞和砷化合物共同培养后去除残余砷化合物。
具体地，所述处理的方法为：在体外将肿瘤细胞扩增培养后，向细胞培养基中加入砷化合物，继续培养一段时间后收集砷化合物处理过的肿瘤细胞，清洗去除其中残余的砷化合物制成肿瘤细胞疫苗。
更优选地，所述肿瘤细胞扩增培养至细胞密度为20％～90％(最优选50％～90％)。
更优选地，砷化合物终浓度为1μM～125μM(最优选5～50μM)。
更优选地，所述继续培养的时间为8小时～24小时(最优选10～16小时)。
在实际应用过程中，可结合患者肿瘤的特性，在上述范围内对该肿瘤疫苗的制备条件进行优化调整，以保证肿瘤疫苗的安全性和最佳治疗获益。
本发明还提供了本发明所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的质量控制指标，包括：砷化合物处理后细胞的活性、增殖及克隆形成能力，其激活效应T细胞的能力。
基于此，能够检测/评价上述指标的试剂在制备用于所述肿瘤疫苗的质量控制的试剂盒中的应用，也应在本发明保护范围之内。
具体地，所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的质量控制标准包括如下：
(1)经砷化合物处理后，肿瘤细胞的死亡比例优选在30％-60％(可用CKK-8实验、细胞死亡的流式细胞术检测等方法定量分析)；
(2)经砷化合物处理的肿瘤细胞在体外丧失增殖和克隆形成能力，注射到免疫缺陷小鼠体内不形成肿瘤，无不良反应；
(3)经砷化合物处理的肿瘤细胞能激活效应T细胞(特别是抗原特异性T细胞)增殖，促进其分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子。
另外，本发明还提供检测生物标志物的试剂在制备预测所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的肿瘤防治效果的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为细胞表面钙网蛋白(calreticulin，CALR)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)、环状GMP-AMP(2'3'-cyclic-GMP-AMP，cGAMP)、肿瘤细胞内I型干扰素(IFNα/β)、干扰素刺激基因(interferon-stimulatedgenes，ISGs)中的一种或多种。
具体地，所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的肿瘤防治效果预测标准包括如下：
(1)细胞表面钙网蛋白暴露；
(2)腺苷三磷酸、高迁移率族蛋白B1、环状GMP-AMP释放；
(3)肿瘤细胞内I型干扰素、干扰素刺激基因的表达水平升高。
当本发明提供的基于砷化合物的肿瘤疫苗用作预防性疫苗时，对肺癌的生长抑制率达93.6％(TC-1)，对骨肉瘤的生长抑制率达98.1％(MCA805)和52.0％(MCA205)，对结直肠癌的生长抑制率达45.7％(CT26)。当本发明提供的基于砷化合物处理的肿瘤细胞被用作治疗性肿瘤疫苗时，对肺癌的生长抑制率达50.2％(TC-1)，对骨肉瘤的生长抑制率达67.2％(MCA805)和35.6％(MCA205)。由此可见，本发明提供的基于砷化合物的肿瘤疫苗可有效地预防并治疗肿瘤。因此，该基于砷化合物的肿瘤疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也应在本申请的保护范围内。
本发明还提供了一种防治肿瘤的药物，包括基于砷化合物的肿瘤疫苗。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，包括：基于砷化合物的肿瘤疫苗和小分子药物；所述小分子药物为腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)水解酶的抑制剂、Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)的激动剂、I型干扰素(IFNα/β)应答的诱导剂、干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)的激动剂中的一种或多种。
优选地，针对砷化合物处理后患者肿瘤细胞ATP释放不足，所述小分子药物为ATP水解酶抑制剂。
优选地，针对砷化合物处理后患者肿瘤细胞HMGB1释放不足，所述小分子药物为TLR4激动剂。
优选地，针对砷化合物处理后患者肿瘤细胞IFN-α/β释放不足、ISGs低表达，所述小分子药物为IFN-α/β应答的诱导剂。
优选地，针对砷化合物处理后患者肿瘤细胞cGAMP释放不足，所述小分子药物为STING激动剂。
本发明还提供了基于砷化合物的肿瘤疫苗和/或包含基于砷化合物的肿瘤疫苗的药物或包含基于砷化合物的肿瘤疫苗和小分子药物的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用；所述小分子药物为腺苷三磷酸水解酶的抑制剂、Toll样受体4的激动剂、I型干扰素应答的诱导剂、干扰素基因刺激因子的激动剂中的一种或多种。
具体地，本发明提供了以下应用的技术方案：
基于砷化合物的肿瘤疫苗联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
包含基于砷化合物的肿瘤疫苗的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
包含基于砷化合物的肿瘤疫苗和小分子药物的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用；所述小分子药物为腺苷三磷酸水解酶的抑制剂、Toll样受体4的激动剂、I型干扰素应答的诱导剂、干扰素基因刺激因子的激动剂中的一种或多种。
基于砷化合物的肿瘤疫苗和包含基于砷化合物的肿瘤疫苗的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
基于砷化合物的肿瘤疫苗和包含基于砷化合物的肿瘤疫苗及小分子药物的药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用；所述小分子药物为腺苷三磷酸水解酶的抑制剂、Toll样受体4的激动剂、I型干扰素应答的诱导剂、干扰素基因刺激因子的激动剂中的一种或多种。
优选地，所述肿瘤为肺癌、骨肉瘤、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病中的任一种。
优选地，所述抗肿瘤为治疗肿瘤。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗能有效预防肿瘤在体内的生长，对于已形成的肿瘤能有效延缓其体内进展，提高浸润肿瘤的多种免疫细胞亚群的比例(如CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK、DC、炎性单核细胞和巨噬细胞等)，促进IFN应答(如IFN-α/β释放、IFNAR信号通路活化、多种ISGs表达上调等)，增强效应T细胞的活化(增殖、释放IFN-γ和TNF-α等细胞因子)等。本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗适用于肺癌、骨肉瘤、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病等多种肿瘤，具有显著的预防及治疗效果。
本发明鉴定出决定基于砷化合物的肿瘤疫苗效果的关键细胞死亡执行分子，挖掘出可预测基于砷化合物的肿瘤疫苗效果的生物标志物。针对部分患者肿瘤内特定细胞死亡执行分子(RIP3、MLKL或ACSL4)缺陷、低表达或低活化，本发明还提供了一种有效的肿瘤治疗药物，包括：基于砷化合物的肿瘤疫苗和能弥补ICD分子释放不足的多种小分子药物。通过组合使用上述药物，为患者提供个性化的肿瘤疫苗方案，增强对肿瘤的预防和/或治疗效果。
本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗联合ICB药物(如PD-1抗体)或基于砷化合物的肿瘤疫苗和能弥补ICD分子释放不足的多种小分子药物联合ICB药物，能够显著增强基于砷化合物的肿瘤疫苗的治疗获益。
本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗效果稳定，安全可靠，且制备工艺简单、成本低廉、质量可控，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CCK8检测TC-1肺癌细胞的活性。热图显示在多种浓度梯度(0μM、1μM、5μM、25μM、125μM)和孵育时间(16h、24h、48h)条件下，不同药物处理分别对TC-1肺癌细胞活性的影响。定量分析方法为：分别计算药物处理组、对照组样本吸光度的平均值，再计算二者的比值(独立重复实验2次，每次实验n＝3，结果合并)。
图2为细胞内ATP定量分析，热图代表显示不同药物(25μM，16h)处理组与PBS组细胞内ATP含量平均值的比值(独立重复实验2次，每次实验n＝6，结果合并)。
图3为在不同药物预处理后，表达卵白蛋白(ovalbumin，OVA)的TC-1细胞(TC-1OVA)激活OVA特异性CD8+T细胞(OT1)增殖的能力分析。代表性的OT1细胞增殖荧光象形图(左图)，统计分析(右图)，数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图4为反复冻融(freeze/thaw，F/T)或不同药物预处理程的TC-1OVA细胞与骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)、OT1细胞共同培养3天，检测细胞上清中IFN-γ含量。不同药物处理组与F/T的统计学分析以平均值±SEM显示，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图5为AnexV/DAPI染色分析细胞死亡比例。用ATO(25μΜ，16h)预处理不同类型的肿瘤细胞，图A为代表性的流式细胞术分析图，图B为统计学分析结果。AnexV+DAPI-细胞群的统计学分析显著性用*标记，AnexV+DAPI+细胞群的统计学分析显著性用#标记，数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图6为用砷化合物制备肿瘤疫苗的有效浓度范围、处理时间范围、细胞密度范围摸索。用如图所示不同浓度的ATO在体外预处理TC-1OVA(图A)或MCA205 OVA(图B)16h后，收集上述细胞并与BMDCs和OT1细胞共培养3天，检测细胞上清中IFN-γ的含量；；用如图所示在不同细胞密度、不同处理时间用ATO在体外预处理TC-1OVA(图6C)或MCA205 OVA(图6D)，收集上述细胞与BMDCs和OT1细胞共培养3天，检测细胞上清中IFN-γ的含量；
不同浓度ATO、不同细胞密度、不同处理时间或F/T处理的统计学分析以平均值±SEM显示，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5)。
图7为基于砷化合物的肿瘤疫苗的预防效果测试。用MTX(2μM，16h)或F/T程序预处理TC-1细胞，用ATO(25μM，16h)分别预处理TC-1、MCA805、MCA205和CT26细胞。将上述预处理后的肿瘤细胞分别接种到小鼠皮下(106每只小鼠)，10天后再给小鼠接种同种未经任何药物处理的肿瘤细胞(106每只小鼠)，定期测量小鼠肿瘤体积，绘制其生长曲线。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5-6)。
图8为砷化合物预处理的TC-1(图A)和MCA805(图B)肿瘤细胞用作治疗性疫苗的效果测试。在荷瘤小鼠的皮下分别注射ATO(25μM，16h)或MTX(2μM，16h)预处理的TC-1(图A)或MCA805(图B)细胞。定期测量小鼠肿瘤体积，绘制其生长曲线。ATO预处理制备的全细胞疫苗能显著抑制肿瘤生长，而MTX预处理制备的全细胞疫苗则未显示出治疗获益。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5-6)。
图9为流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞(包括淋巴系和髓系细胞)的圈门策略。
图10为流式细胞术分析多种细胞亚群分泌细胞因子的圈门策略。
图11为基于砷化合物的治疗性肿瘤疫苗对肿瘤免疫微环境的影响。借助流式细胞术，分析肿瘤浸润免疫细胞亚群的比例(图A)、以及CD8+T(图B)和CD4+T(图C)细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平(B、C)。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6-7)。
图12为砷化合物预处理的TC-1细胞在nu/nu小鼠(图A)和Ifnar-/-小鼠(图B)体内用作预防性疫苗的效果测试。ATO(25μM，16h)预处理的TC-1细胞在上述小鼠体内均无法预防肿瘤生长。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图13为基于砷化合物的预防性肿瘤疫苗在清除了特定免疫细胞亚群或阻断了特定免疫效应分子的小鼠体内的效果测试。在注射TC-1肿瘤疫苗的时间(day 0)前后，分别给小鼠注射针对CD8α或NK1.1的抗体(时间为day-1、1和3)清除CD8+T或NK细胞(图A)，或者分别给小鼠注射针对IFNAR的抗体(时间为day 0；day 2；day 4；day 6)或针对IFN-γ的抗体(时间为day 3；day 7；day 10；day 13)阻断IFNα/β受体或中和IFN-γ(图B)。10天后再给小鼠接种TC-1细胞，定期测量小鼠肿瘤体积，绘制其生长曲线。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5-7)。
图14为基于砷化合物的预防性疫苗实验在清除了特定免疫细胞亚群或阻断了特定免疫效应分子的小鼠体内的效果测试，各种抗体的注射时间同图13。在C57BL/6小鼠中，砷化合物预处理的MCA205全细胞疫苗能有效预防肿瘤的生长。在清除了CD8+T细胞后，该肿瘤疫苗的效果显著下降。在清除了NK细胞后，该肿瘤疫苗效果不受影响(图A)。在注射抗体阻断IFNAR或中和IFN-γ后，上述疫苗的治疗效果显著下降(图B)。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图15为基于砷化合物的预防性疫苗实验在清除了特定免疫细胞亚群或阻断了特定免疫效应分子的小鼠体内的效果测试，各种抗体的注射时间同图13。在C57BL/6小鼠中，砷化合物预处理的MCA805全细胞疫苗能有效预防肿瘤的生长。在清除了CD8+T细胞后，该肿瘤疫苗的效果显著下降。在清除了NK细胞后，该肿瘤疫苗效果不受影响(图A)。在注射抗体阻断IFNAR或中和IFN-γ后，上述疫苗的治疗效果显著下降(图B)。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图16为蛋白质印记法分析砷化合物诱导的细胞应激和死亡方式。用砷化合物处理TC-1细胞后，在不同时间点检测多种形式的细胞应激和死亡通路的活化标志物(左侧)。加入砷化合物的同时用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine，NAC)中和砷化合物诱导产生的ROS，发现各种细胞应激和死亡通路的活化明显受阻或延缓(右侧)。
图17为基因敲除TC-1细胞克隆的鉴定结果。借助CRISPR-Cas9技术敲除不同细胞死亡执行分子的编码基因，利用蛋白印迹法比较野生型(WT)和不同基因敲除型(KO)细胞克隆中BECN1、GPX4、ACSL4、GSDME、GSDMD、BAX、BAK、RIP3和MLKL蛋白的表达水平。上述细胞克隆被用于测试不同细胞死亡执行分子对基于砷化合物的肿瘤疫苗效果的影响。
图18为流式细胞术检测细胞死亡的结果。借助AnexV和DAPI对砷化合物预处理的WT和KO细胞进行染色，统计分析其中AnexV+DAPI-和AnexV+DAPI+细胞的比例，AnexV+DAPI-和AnexV+DAPI+细胞群统计学分析的显著性分别用*和#标记，数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图19为WT和KO细胞的克隆形成能力比较结果。经过PBS或砷化合物预处理后，WT和KO细胞铺板观察克隆形成，结晶紫染色后采集图像。砷化合物处理组均不能形成克隆。
图20为WT和KO细胞未经砷化合物处理时克隆形成能力比较结果。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图21为砷化合物预处理的WT和多种KO(Becn1-/-，Gpx4low，Acsl4-/-，Gsdme-/-，Gsdmd-/-，Bax-/-，Bak-/-，Rip3-/-，Mlkl-/-)TC-1细胞用作预防性疫苗的效果比较。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5-7)。
图22为砷化合物处理后WT和多种KO细胞释放至胞外的ATP比较结果。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，(n＝9)。
图23为砷化合物处理后WT和多种KO细胞释放至胞外的HMGB1比较结果。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝4)。
图24为砷化合物处理后WT和多种KO细胞外表面CALR暴露的比较结果。分别用*和#标记CALR+DAPI-细胞群和CALR+DAPI+细胞群统计学分析的显著性。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝3)。
图25为砷化合物处理后WT和多种KO细胞释放至胞外的cGAMP比较结果。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图26为F/T或砷化合物处理后WT和多种KO分泌IFNα/β水平检测。热图显示了L929-ISRE荧光素酶报告系统检测上述濒死细胞释放的IFN-α/β的定量分析。
图27为砷化合物处理前后WT和多种KO细胞内ISGs表达水平的比较结果。热图显示了Ifnb1，Cxcl9，Cxcl10，Mx1，Mx2，Oas2，Dhx58，Ccl5，Ccl7，Rsad2，Trim5，Ifit1，Ifit3，Irf3，Irf7和Il-15的转录分析(n＝6)。
图28为砷化合物处理肿瘤细胞的剂量、时间、细胞密度控制条件摸索。用砷化合物按照如图显示的条件处理TC-1(图A)，MCA805(图B)，CT2(图C)细胞，之后进行AnexV/DAPI染色和流式细胞术分析。分别用*和#标记AnexV+DAPI-细胞群和AnexV+DAPI+细胞群统计学分析的显著性。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图29为不同剂量、时间、细胞密度控制条件下，砷化合物预处理肿瘤细胞的克隆形成能力比较。按如图所示条件预处理TC-1(图A)和MCA805(图B)细胞，胰酶消化后重悬于新鲜培养基并接种至6孔板(200细胞/孔)，培养8天后0.05％结晶紫染色比较克隆的数目和大小。数据显示平均值±SEM，非配对t检验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图30为不同预处理后肿瘤细胞激活效应T细胞的能力比较。F/T程序或砷化合物预处理的TC-1OVA细胞、BMDCs和荧光染料eFluorTM670预染的OT1细胞共同培养3天，流式细胞术检测OT1细胞增殖导致的荧光信号衰减。展示了代表性的流式细胞术直方图(A图)和荧光强度统计学分析图(B图)。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图31为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后ATP释放的定量分析。砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞，分别检测胞内(图A)和胞外(图B)ATP的浓度。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图32为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后HMGB1释放的定量分析。砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞，检测细胞上清中HMGB1的浓度。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝3)。
图33为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后CALR暴露的定量分析。砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞后，借助流式细胞术检测细胞膜表面CALR水平以及膜完整性(DAPI染色)，分别用*和#标记CALR+DAPI-细胞群和CALR+DAPI+细胞群统计学分析的显著性。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图34为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后IFN-α/β分泌的定量分析。砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞后，借助L929-ISRE荧光素酶报告系统检测上述濒死细胞释放的IFN-α/β。F/T作为阴性对照，数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图35为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后cGAMP释放的定量分析。砷化合物或PBS处理TC-1细胞后，在不同时间点(0h，4h，8h，12h，16h)检测胞内外cGAMP含量，绘制时间曲线图。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝3)。
图36为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后ISGs表达水平定量分析。砷化合物或PBS处理预处理TC-1细胞后，借助qRT-PCR检测Ifnb1、Cxcl9、Cxcl10、Mx1、Mx2、Oas2、Dhx58等基因的表达水平。
图37为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后ROS含量检测。PBS或砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26后，借助DCFH-DA探针检测砷化合物诱导ROS生成、以及同时加NAC预处理对ROS积累的影响。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝3)。
图38为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后脂质过氧化水平检测。PBS或砷化合物处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26后，借助脂质过氧化探针BODIPY定量分析砷化合物引发脂质过氧化水平、以及同时加NAC预处理对脂质过氧化的影响。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝3)。
图39为不同肿瘤细胞在砷化合物处理后激活效应T细胞的检测。构建表达OVA抗原的TC-1OVA、MCA205 OVA、MCA805 OVA、CT26 OVA、EO771 OVA、4T1 OVA、B16-F10 OVA、Neuro2A OVA和EL4 OVA细胞，经砷化合物或F/T程序处理后，与BMDCs和OT1细胞共培养3天，检测细胞上清中IFN-γ含量。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5)。
图40为细胞死亡执行分子缺陷阻碍基于砷化合物的治疗性肿瘤疫苗效果的回补策略探索。肿瘤组织中广泛存在RIP3缺陷、低表达或低活化。用砷化合物处理WT或Rip3-/-TC-1细胞制备治疗性肿瘤疫苗，后者对肿瘤的抑制效果远低于前者。联合使用上述肿瘤疫苗与多种小分子药物(简称AMC，包括ATP水解酶抑制剂ARL67156、TLR4激动剂(单磷酰脂质A，monophosphoryl lipid A，MPLA)和STING激动剂cGAMP)，观察其与单独使用肿瘤疫苗、或单独使用小分子药物组小鼠肿瘤生长曲线的差异。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6-7)。
图41为基于砷化合物的治疗性肿瘤疫苗和PD-1单抗联合对肿瘤治疗效果的测试。定期测量小鼠肿瘤体积，绘制其生长曲线。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6-7)。
图42为基于砷化合物的治疗性肿瘤疫苗和PD-1单抗联合治疗对浸润肿瘤的T细胞活化的影响。借助免疫酶联斑点(ELISPOT)技术，定量分析了肿瘤内分泌IFN-γ的T细胞的丰度。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝10-12)。
图43为基于砷化合物的治疗性Rip3-/-TC-1细胞疫苗联合2种小分子药物(简称AM，包括ARL67156和MPLA)和PD-1联用治疗TC-1肿瘤，观察其与单独使用WT TVAC或Rip3-/-TVAC组小鼠肿瘤生长曲线的差异。数据显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝6-7)。
图44为不同砷化合物在不同剂量条件下诱导肿瘤细胞死亡的比较。借助AnexV/DAPI染色和流式细胞术进行定量分析。分别用*和#标记AnexV+DAPI-细胞群和AnexV+DAPI+细胞群统计学分析的显著性。数据显示平均值±SEM，非配对t检验，*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001，ns无显著性(n＝6)。
图45为多种砷化合物预处理的肿瘤细胞对抗原特异性T细胞激活作用的分析。TC-1OVA(图A)或MCA205 OVA(图B)在体外用不同砷化合物预处理后，分别与BMDCs和OT1共同培养3天，检测细胞上清中IFN-γ含量。F/T处理的肿瘤细胞作为阴性对照。统计以平均值±SEM显示，非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns无显著性(n＝5)。
具体实施方式
为了进一步说明本发明基于砷化合物的肿瘤疫苗及其制备方法、质控、应用以及联合运用策略，下面基于三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)的实施例，结合说明书附图和具体实施例，进一步进行清楚、完整地描述本发明技术方案。需要强调的是，以下所述的实施例仅是实施方式一部分，实施例并不对本发明做任何形式的限定，本发明并不限于这些内容。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下为本发明实施例所使用的部分材料：
一、肺癌、骨肉瘤、结直肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病肿瘤细胞分别对应选择下述细胞系：
肺癌细胞：TC-1肺癌，由INSERM U1138Guido Kroemer实验室提供；
骨肉瘤细胞：MCA805骨肉瘤，由本发明所在实验室从小鼠原发骨肉瘤组织中分离并单克隆化后建立；MCA205骨肉瘤由INSERM U1138Guido Kroemer实验室提供；
结直肠癌细胞：CT26结直肠癌(CRL-2638TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；
乳腺癌细胞：EO771乳腺癌(CRL-3461TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；
黑色素瘤细胞：B16-F10黑色素瘤(CRL-6475TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；
神经母细胞瘤细胞：Neuro2A神经母细胞瘤(CCL-131TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；
淋巴瘤细胞：ABE-8.1/2pre-B淋巴瘤(TIB-205TM，ATCC)、EL4淋巴瘤(TIB-39TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；Eμ-Mycp19Arf-/-小鼠淋巴瘤，由姜海博士(中国科学院细胞生物学国家重点实验室)提供；
白血病细胞：L1210白血病(CCL-219TM，ATCC)，购自北京中源合聚生物科技有限公司；
猴病毒40/T抗原转化永生小鼠胚胎成纤维细胞WTSV40MEF(CRL-2907TM)，购自北京中源合聚生物科技有限公司。
所有细胞系在含L-谷氨酰胺和HEPES(01-172-1A，生工生物工程)的DMEM(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)高糖培养基中培养，添加10％胎牛血清(FBS-12A，CAPRICORN)和100U·mL-1青霉素/链霉素(5140163，Gibco)，37℃，5％二氧化碳；贴壁细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA(BL512A，Biosharp)传代。
二、小鼠模型
雌性C57BL/6、BALB/c和6-8周龄的无胸腺裸鼠购自维通利华。
B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax(Ifnar-/-，H2Kb)小鼠购自Jackson实验室，作为纯合子在本所实验动物中心饲养。
CD45.1+OT-1小鼠经MTA授权由中国科学院上海巴斯德研究所获得。
所有小鼠均在SPF级实验动物中心饲养和实验，光/暗循环设定为12h/12h，可自由获得食物和水。
实施例1药物筛选发现ATO为强效ICD诱导剂
本实施例通过基于脱氢酶活性(CKK8法)的细胞活力测定、细胞内ATP含量定量检测、体内诱导抗原特异性T细胞增殖、体外共培养诱导抗原特异性T细胞分泌IFN-γ四个实验对11种药物进行筛选，确定了ATO为强效的ICD诱导剂。具体实验过程如下所述：
一、基于脱氢酶活性的细胞活力测定
本实验通过CKK8法，比较了柔红霉素(daunorubicin，DNR)、长春瑞滨(vinorelbine，VNR)、表柔比星(epirubicin，EPI)、长春新碱(vincristine，VCR)、顺铂(cisplatin，CDDP)、ATO、青蒿素(artemisinin，ART)、秋水仙碱(colchicine，COL)、多柔比星(doxorubicin，DOX)、米托蒽酮(mitoxantrone，MTX)、奥沙利铂(Oxaplatin，OXA)共11种药物对小鼠肺癌细胞TC-1的抑制作用。
1、实验分组
(1)实验组：上述11种药物都按照药物处理时间梯度(即孵育时间16h、24h、48h)设置实验组，在每个时间梯度下再按照药物处理浓度梯度(1μM、5μM、25μM、125μM)设置实验组。
(2)对照组：无药物处理的TC-1细胞，即在每个药物处理时间梯度(16h、24h、48h)下，药物处理浓度为0μM的组别。
2、实验方法
(1)肿瘤细胞的培养与处理
用上述药物按照实验分组对应的药物处理浓度和时间在体外处理TC-1细胞，具体步骤如下：
a、取对数期生长的TC-1细胞，胰酶消化后，重悬到1mL培养基中。
b、取少量细胞，用台盼蓝染色、计数活细胞数目。
c、将细胞按照104/孔铺入96孔板中，每孔加培养基100μL，每组至少3个复孔。
d、2h后，待细胞完全贴壁，按照上述的实验分组，加入不同浓度的药物，药物提前稀释至设定的浓度，给药体积均为10μL。
(2)基于脱氢酶活性的细胞活力测定，具体步骤如下：
a、将给药时的时间点定义为0h，加入10μL CCK8溶液，细胞孵育箱中反应2h。
b、记录450nm和600nm条件下测定的吸光度(OD值)，计算二者差值(即OD450-OD600)。
c、在不同检测时间点(对应实验分组相应的药物处理时间)，加入10μL CCK8溶液，细胞孵育箱中反应2h，测定OD450-OD600。
3、实验结果
实验结果显示，能以剂量和时间依赖性的方式有效杀死TC-1细胞的药物包括MTX、DNR、VNR、EPI、ATO、OXA、DOX；不能以剂量和时间依赖性的方式有效杀死TC-1细胞的药物为CDDP、VCR、ART和COL(图1)。
二、细胞内ATP含量检测
本实验通过测定细胞内ATP的含量，比较上述11种药物对TC-1细胞活性的抑制作用。
1、实验分组
(1)实验组：上述11种药物均单独设置实验组，按照对应的组别分别单独加入不同的药物，药物终浓度均为25μM，药物处理时间为16h。
(2)对照组：PBS处理组。
2、实验方法
a、铺板：在48孔板中细胞铺板过夜(5×104/孔/300μL DMEM完全培养基)。
b、按实验分组加入不同的药物(25μM)，培养16h。
c、离心孔板并移取200μL细胞上清后，加入100μL CellTiler-Glo 2.0 Assaybuffer，振荡10分钟。
d、转移上述200μL细胞上清至白色96孔板中，借助多功能酶标仪进行化学发光检测，借助标准曲线计算出胞内ATP含量。
3、实验结果
对TC-1细胞活力抑制作用最强的药物是DNR和ATO，抑制作用较弱的药物有MTX、VNR、EPI和OXA，未显示出明显抑制作用的药物有DOX、CDDP、VCR、ART和COL(图2)。
三、诱导抗原特异性T细胞增殖的体内实验
针对CKK8实验中显示出可抑制细胞活性的7种药物，本实验分别用其预处理肿瘤细胞并注射到小鼠体内，借助流式细胞术分析抗原特异性T细胞活化的情况。
1、实验分组
(1)实验组：TC-1OVA细胞在培养皿中融合度达到90％时，分别加入7种药物(DNR、VNR、EPI、ATO、DOX、MTX、OXA)进行预处理(25μM，16h)后，注射到
小鼠足掌皮下，分别设置为7个实验组。
(2)对照组：F/T循环3次处理的TC-1OVA细胞注射到
小鼠足掌皮下，设为对照组。
2、实验方法
(1)荧光染料标记的OT1细胞过继
在实验组和对照组小鼠的足掌皮下注射经过药物预处理的肿瘤细胞或F/T预处理的肿瘤细胞，同时通过静脉注射5μMeFluor670预染的OT1细胞(5×106/小鼠)。
(2)流式细胞术分析
上述细胞注射3天后，处死小鼠，取小鼠腘窝淋巴结，制备单细胞悬液，100μm滤膜过滤后，按照如下方案(表1)进行荧光标记抗体染色。
表1
设门圈选CD45.1+CD3+CD8+TCR-Vα2+CD4-细胞群，分析eFluor670的荧光强度变化，依此对OT1细胞分裂次数和比例进行定量分析。
3、实验结果
与F/T预处理的TC-1相比，上述7种药物预处理的TC-1可显著促进OT1细胞的增殖，提示上述药物可增强肿瘤细胞的免疫原性，促进抗原特异性T细胞应答(图3)。
四、体外共培养诱导抗原特异性T细胞分泌IFN-γ
本实验比较了7种药物(DNR、VNR、EPI、ATO、DOX、MTX、OXA)预处理的TC-1OVA细胞在体外促进抗原特异性T细胞分泌IFN-γ的能力，由此比较不同药物处理后的TC-1OVA细胞免疫原性的强弱。
1、实验分组
(1)实验组：TC-1OVA细胞在培养皿中融合度达到90％时，分别加入7种药物(DNR、VNR、EPI、ATO、DOX、MTX、OXA)预处理(25μM，16h)后，分别与BMDCs和OT1细胞共培养，分别设置为7个实验组。
(2)对照组：F/T循环3次处理的TC-1OVA细胞与BMDCs、OT1细胞在体外共培养。
2、实验方法
(1)体外共培养
药物或F/T预处理的TC-1OVA细胞、BMDCs和OT1细胞按照1﹕1﹕5的比例共培养3天。
(2)IFN-γ含量检测
将上述细胞培养板离心(500×g，5分钟)后，收集上清，借助ELISAMAXTMStandardSet Mouse IFN-γ(Cat 430801，Biolegend)试剂盒对OT1细胞分泌的IFN-γ进行定量分析。
3、实验结果
就激活OT1细胞分泌IFN-γ的能力而言，ATO预处理组最强，DOX或VNR预处理组也较强，MTX或OXA预处理组稍弱。然而，F/T、DNR或EPI预处理组则无法激活OT1细胞分泌IFN-γ(图4)。
综合上述实验结果，ATO既可以有效的杀伤肿瘤细胞，同时可以显著增强肿瘤细胞的免疫原性，是一种强效ICD诱导剂。
实施例2砷化物的广谱细胞毒作用
本实施例拓展分析了ATO对多种实体瘤和血液瘤细胞的胞毒作用，包括：肺癌细胞TC-1、骨肉瘤细胞MCA805和MCA205、结直肠癌细胞CT26、黑色素瘤细胞B16-F10、淋巴瘤细胞(EL4、ABE-8.1/2pre-B、Eμ-Mycp19Arf-/-)、白血病细胞L1210、转染了SV40的小鼠胚胎成纤维细胞MEF。
1、实验方法
采用AnexV/DAPI染色和流式细胞术定量检测ATO对上述细胞的毒性，具体步骤如下：
a、铺板：取对数生长的细胞，计数后于24孔板中铺板(PBS组105细胞/孔，给药组2×105细胞/孔)，补足完全培养体积至1mL，培养过夜。
b、给药：ATO终浓度25μM，PBS组加入等体积的PBS作为对照。
c、测试：收集细胞上清，贴壁细胞用胰酶消化后与上清合并，离心弃上清(500×g，5分钟)，细胞沉淀用预冷PBS和1×binding buffer各洗一遍，最后重悬至含有2μg·mL- 1DAPI+10μg·mL-1PE-AnexV的1×binding buffer中，室温避光10分钟染色后流式细胞仪检测。
2、实验结果
ATO预处理能引发TC-1、MCA805、MCA205、CT26、B16-F10、EL4、ABE-8.1/2pre-B、Eμ-Mycp19Arf-/-、L1210、MEF细胞的磷酯酰丝氨酸外翻(可结合AnexV)，并破坏细胞膜的完整性。这提示ATO能广谱杀伤多种实体肿瘤和血液瘤细胞(图5)。
实施例3基于砷化合物的肿瘤疫苗制备条件的优选设计
基于砷化合物的肿瘤疫苗的制备方法，具体步骤是：在肿瘤细胞扩增培养过程中，向培养基中添加砷化合物共同培养，之后收集细胞沉淀和上清，清洗去除砷化合物，制备成全细胞肿瘤疫苗(基于砷化合物的肿瘤疫苗)。其中，影响肿瘤疫苗效果的主要因素有：砷化合物浓度、砷化合物处理时间、加入砷化合物时肿瘤细胞密度。本实施例借助ATO预处理的肿瘤细胞(TC-1OVA或MCA205OVA)与BMDCs、OT1细胞共培养，模拟肿瘤抗原摄取和呈递、以及激活抗原特异性T细胞的过程。通过检测效应分子IFN-γ分泌水平来评估ATO处理的最佳条件。
1、实验分组
a、按照ATO浓度：分为1μM、5μM、25μM、50μM、75μM、100μM、125μM，本条件下细胞融合度为90％，药物处理时间为16h。
b、按照ATO处理时肿瘤细胞密度：分为20％、50％、90％，本条件下ATO处理浓度为25μM，时间为16h。
c、按照ATO处理时间：分为8h、16h、24h，本条件下细胞融合度为90％，ATO处理浓度为25μM。
d、对照组：F/T处理组
2、实验方法
按照上述实验分组条件，先将TC-1OVA或MCA205 OVA按所需的细胞密度铺板(依据经验，2×105细胞培养过夜后密度为90％)。培养过夜后，在培养基中加入不同浓度的ATO，在设定的时间点收集细胞上清，与消化的细胞悬液合并离心，获得的细胞沉淀用PBS洗涤，并与BMDCs和OT1细胞共培养3天，检测细胞上清中IFN-γ分泌水平。检测方法与实施例1中相同。
3、实验结果
与F/T预处理制备的肿瘤疫苗相比，ATO处理TC-1细胞的优选浓度范围是1μM～75μM(最优为1μM～50μM)，处理时间8h～24h，细胞密度为20％-90％。ATO处理MCA205细胞的优选浓度范围是1μM～100μM(最优为1μM～25μM)，处理时间8h～24h，细胞密度为20％-90％。上述条件下制备的肿瘤细胞疫苗能激活更强的T细胞应答(图6)。
综合上述不同肿瘤细胞的实验结果，在制备肿瘤疫苗过程中，优选地，可在肿瘤细胞密度达到90％时，用1μM～50μMATO处理16h时收集细胞和上清。对于不同肿瘤细胞，可基于上述优选条件设计预实验，确定最佳的砷化合物使用剂量。
实施例4基于ATO的肿瘤疫苗的安全性评估
本实施例的目的是确定基于ATO的肿瘤疫苗的安全性，特别是ATO处理后细胞的成瘤能力是否丧失、是否引发机体不良反应。
1、实验方法
将C57BL/6小鼠随机分为空白对照组和实验组，分别在皮下注射100μLPBS或100μL基于砷化合物的TC-1肿瘤疫苗(106细胞/小鼠)。记录小鼠体重、进食、饮水、存活等情况。疫苗注射14天后，常规病理切片观察注射部位皮肤、肝脏、肺、脾脏、肾、胃肠道是否有坏死或炎症。
2、实验结果
实验结果如表2所示：
表2基于砷化合物的肿瘤疫苗安全性评估实验结果
表中“－”表示：未出现异常反应。
结果显示：实验小鼠在接受基于砷化合物的肿瘤疫苗皮下注射后，全身以及局部未见异常反应，饮食和进水正常，体重无下降，存活不受影响，皮下注射部位无红肿、溃疡等现象，病理切片分析未见肝脏、肺、脾脏、肾、胃肠道发生组织坏死和炎症。
实施例5基于砷化合物的肿瘤疫苗对肿瘤的预防效果
本实施例是测试ATO预处理的多种肿瘤细胞是否具有预防肿瘤生长的活性。
一、实验分组
按照实施例3的方法，分别用ATO预处理TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞，制备基于ATO的预防性肿瘤疫苗(ATO VAC)并注射至naive小鼠皮下，设置为实验组。皮下注射等体积PBS的小鼠设置为空白对照组。在TC-1模型中，F/T或MTX预处理的肿瘤细胞另设为阴性对照组和阳性对照组。各实验分组具体给药设置如表3所示：
表3基于砷化合物的预防性肿瘤疫苗实验给药设置
表中：ATOVAC是依据实施例3所获的最优选条件下制备的。
二、实验方法
将PBS、F/T、MTX或ATO预处理的TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞接种至
小鼠左侧皮下(106细胞/100μL/小鼠)。9-10天后，给小鼠右侧皮下分别注射未经任何药物处理的TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞(106细胞/100μL/小鼠)。用游标卡尺记录肿瘤大小，计算其体积并绘制生长曲线。
3、实验结果：
基于砷化合物的肿瘤疫苗(TC-1、MCA805、MCA205、CT26)对相应肿瘤的生长具有显著的预防效果。F/T预处理的TC-1疫苗或PBS不具有肿瘤预防效果，而MTX预处理的TC-1细胞也能显著抑制后续肿瘤生长(图7)。
实施例6基于砷化合物的肿瘤疫苗对已形成肿瘤的治疗效果
本实施例是测试ATO预处理的多种肿瘤细胞是否对已形成的肿瘤具有治疗活性。
一、实验分组
按照实施例3的方法，分别用ATO预处理TC-1或MCA805细胞，制备基于ATO的治疗性肿瘤疫苗(ATO TVAC)并注射至已荷瘤小鼠的皮下，设置为实验组。在TC-1模型中，MTX预处理的肿瘤细胞制备基于MTX的治疗性肿瘤疫苗(MTXTVAC)，另设为实验组。小鼠皮下注射等体积PBS设置为对照组。各实验分组的具体给药设置如表4所示：
表4基于砷化合物的治疗性肿瘤疫苗实验给药设置
表中：ATO TVAC是依据实施例3所获的最优选条件下制备。
二、实验方法
在小鼠皮下接种TC-1或MCA805肿瘤细胞(106细胞/100μL/小鼠)，成瘤3天后，在另一侧皮下分别注射TC-1 ATO TVAC、TC-1MTX TVAC或MCA805 ATO TVAC(106细胞/100μL/小鼠，如表4所示)。PBS对照组为皮下注射100μL PBS。用游标卡尺记录肿瘤大小，计算其体积并绘制生长曲线。
在另一批实验中，注射治疗性肿瘤疫苗后的第13天(对照组和实验组肿瘤生长曲线刚有分开趋势时)，收集肿瘤组织并分析其中免疫细胞浸润情况，所述免疫细胞包括：CD3+T、CD4+T、CD8+T、调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)、B细胞、NK细胞、γδT细胞、DCs、中性粒细胞(neutrophil)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)。借助胞内抗体染色和流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞活化和细胞因子分泌(CD69、IFN-γ、TNF-α表达)。
上述肿瘤免疫浸润、CD4+T和CD8+T细胞活性的检测方法如下所述：
(1)肿瘤免疫浸润的流式细胞术分析：
a、处死小鼠，收集肿瘤组织、剪碎并加入适量消化液(含有3.6mg·mL-1LiberaseTL和200U·mL-1DNAse I的无血清DMEM培养基)，37℃摇床孵育30分钟。
b、用40μm滤膜过滤消化后的组织细胞悬液，离心收集细胞沉淀并重悬至1mL培养基中。
c、加入多种荧光标记的抗体进行染色，4℃孵育20分钟，离心洗涤后流式细胞仪检测。染色方案如表5所示。
表5
d、流式结果圈门策略如图9所示，选取Vivid yellow染色阴性的活细胞，分析如下细胞亚群所占的比例：CD3+T细胞(CD11b-CD3+)，CD4+T细胞(CD11b-CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD11b-CD3+CD8+)、B细胞(CD11b-CD3-CD19+)、NK细胞(CD11b-CD3-NK1.1+)、中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)、DCs(CD11b+Ly6G-CD11c+IA/IE+Ly6C+)、单核细胞(CD11b+Ly6G-CD11c-I-A/I-E-Ly6C+)、巨噬细胞(CD11b+Ly6G-CD11c-IA/IE-F/480+)。
(2)CD4+T和CD8+T cells活性检测方法：
a、在肿瘤组织剪碎消化后的单细胞悬液中加入100ng·mL-1佛波12烷酸13酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，50ng·mL-1离子霉素(ionomycin)，10μg·mL-1莫能霉素(monesin)和10μg·mL-1布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)，37℃培养箱孵育4小时。
b、上述细胞离心洗涤(500×g，5分钟)后用PBS重悬，按表6所示抗体组合完成表面标志物染色(4℃，20分钟)
表6
c、加200μL Fixation buffer，4℃固定30分钟，离心去上清(500×g，5分钟)后用200μL Permeablization buffer洗涤1遍。
d、细胞沉淀重悬于100μL Permeablization buffer，按表7所示抗体组合完成胞内细胞因子染色。
表7
e、流式结果圈门策略如图10所示，选取Vivid yellow染色阴性的活细胞，分析如下细胞亚群所占的比例：CD3+T细胞(CD11b-CD3+)，CD4+T细胞(CD11b-CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD11b-CD3+CD8+)、T(CD11b-CD3+TCR+)、Treg(CD11b-CD3+CD4+CD25+)。此外，分析T细胞早期活化标记物CD69、效应细胞分子IFN-γ和TNF-α在CD4+T和CD8+T细胞群中的表达水平。
2、实验结果：
(1)与PBS对照相比，基于ATO的TC-1治疗性肿瘤疫苗能有效抑制体内已有TC-1肿瘤的快速进展，而基于MTX的TC-1治疗性肿瘤疫苗则无法阻碍已有肿瘤的生长。基于ATO的MCA805治疗性肿瘤疫苗对体内已有的MCA805肿瘤也具有明显的抑制效果(图8)。图8中WTTVAC即为TC-1ATO TVAC。
(2)图9和图10为流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞和活性的圈门策略。图11A结果显示：基于ATO的治疗性肿瘤疫苗能显著促进CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK、DCs、单核细胞和巨噬细胞浸润肿瘤组织，促进局部抗肿瘤免疫应答。图11B-C显示，基于ATO的治疗性肿瘤疫苗显著提升了CD8+T细胞中CD69的表达，促进CD8+T和CD4+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α，增强了肿瘤局部效应T细胞的抗肿瘤活性(图11)。
实施例7鉴定宿主免疫系统对基于砷化合物的肿瘤疫苗效果的决定作用
一、在免疫缺陷小鼠中ATO VAC的肿瘤预防效果
1、实验分组
(1)nu/nu小鼠分组：
a、对照组：注射PBS；
b、ATO VAC实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的TC-1肿瘤疫苗。
(2)Ifnar-/-小鼠分组：
c、对照组，注射PBS；
d、ATO VAC实验组，注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的TC-1肿瘤疫苗。
2、实验方法
在nu/nu小鼠或Ifnar-/-小鼠左侧皮下分别注射PBS(对照组)或TC-1VAC(实验组，106细胞/100μL/小鼠)。9-10天后，在上述小鼠右侧皮下注射未经任何药物处理的TC-1细胞(106细胞/100μL/小鼠)，游标卡尺记录数据肿瘤大小，计算肿瘤体积并绘制其生长曲线图。
3、实验结果
在免疫缺陷的nu/nu小鼠和Ifnar-/-小鼠中，与PBS对照组相比，ATO VAC实验组的肿瘤生长并无明显差异。这表明，基于ATO的TC-1肿瘤疫苗抑制肿瘤生长需要依赖T细胞亚群和IFNAR信号通路的激活(图12)。
二、特定免疫细胞亚群和信号通路对ATO-VAC预防肿瘤效果的影响
1、实验分组
a、对照组：注射PBS；
b、VAC实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的肿瘤疫苗；
c、VAC CD8 Ab实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的肿瘤疫苗和CD8单抗；
d、VA CNK Ab实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的肿瘤疫苗和NK1.1单抗；
e、VAC IFNAR Ab实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的肿瘤疫苗和IFNAR单抗；
f、VAC IFN-γAb实验组：注射按照实施例3所获的最优选条件下制备的基于ATO的肿瘤疫苗和IFN-γ单抗。
2、实验方法
ATO分别预处理TC-1、MCA205和MCA805肿瘤细胞，制备基于ATO的预防性肿瘤疫苗，注射到
小鼠皮下(106细胞/100μL/小鼠)，该时间点记为day0。分别给小鼠注射针对CD8α或NK1.1的抗体(时间为day-1、1和3)清除CD8+T或NK细胞，或者分别给小鼠注射针对IFNAR的抗体(时间为day0；day2；day4；day6)或针对IFN-γ的抗体(时间为day3；day7；day10；day13)阻断IFNα/β受体或中和IFN-γ(图B)。抗体剂量为200μg/20g体重。10天后再给小鼠接种相应的未经任何药物处理的肿瘤细胞，定期测量小鼠肿瘤体积，绘制其生长曲线。
3、实验结果
如图13、图14、图15所示，在TC-1、MCA205和MCA805肿瘤模型中，借助抗体清除CD8+T细胞可完全阻断ATOVAC对肿瘤的预防效果，但借助抗体清除NK细胞不影响ATOVAC对上述肿瘤的预防效果(图13A，14A，15A)。在上述3个肿瘤模型中，借助抗体阻断IFNAR或中和IFN-γ，ATOVAC对肿瘤的预防效果完全丧失(图13B，14B，15B)。
实施例8 ATO可激活的细胞应激和死亡通路分析
基于砷化合物显示出广谱的细胞毒性、可高效诱导ICD，本实施例分析了ATO触发不同细胞应激反应和细胞死亡通路的动态过程。经蛋白质应激法检测，TC-1细胞表达多种细胞应激反应的关键分子、以及不同细胞死亡途径的执行分子，包括：①自噬相关基因(autophagy-related gene 6，又称BECN1)、ATG5和ATG7；②凋亡通路执行分子，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3，CASP3)和CASP8；③焦亡通路执行分子，焦孔素E(gasderminE，GSDME)和GSDMD；④铁死亡通路关键调控分子：ACSL4和谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)；⑤程序性坏死通路执行分子RIP3和MLKL。因此，本实施例优选ATO处理的TC-1细胞为研究对象，
一、实验分组
(1)ATO实验组：ATO刺激TC-1细胞后，不同时间点收集的细胞沉淀；
(2)ATO+NAC实验组：NAC和ATO共同刺激TC-1细胞后，不同时间点收集的细胞沉淀；
(3)对照组：未经ATO或ATO+NAC刺激的TC-1细胞(均标记为0h)。
二、实验方法
(1)细胞培养及给药：按4×105细胞/孔将TC-1肺癌细胞铺于6孔板中，培养过夜。ATO实验组加入终浓度为25μM的ATO，ATO+NAC实验组加入终浓度为25μM的ATO和5mM的NAC(NAC可抑制ATO诱导的ROS积累)。在给药后的不同时间点(0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h)收集蛋白样本。
(2)检测不同死亡程序相关蛋白的表达：
a、裂解细胞沉淀后，离心收集上清中的蛋白样本，加入上样缓冲液并煮沸变性。借助聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本，再将蛋白电泳转移至硝酸纤维素(NC)膜上。
b、用含2.5％牛血清白蛋白的PBS溶液稀释待测蛋白的特异性抗体(一抗1：1000)，4℃过夜孵育NC膜。TBST缓冲液漂洗NC膜数次，每次5-10分钟。1：5000稀释辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗，室温孵育NC膜1小时，TBST缓冲液继续漂洗数次后，加入显色液并用化学发光蛋白印迹成像仪采集图像。
c、ATO处理后不同时间点，分析细胞应激和死亡途径的标志物分子水平：①p62的降解、LC3脂化引发LC3-Ⅱ/Ⅱ比值上调提示自噬；②CASP3被切割，总量下降提示凋亡；③GSDME和GSDMD总量下降，N端片段被切割提示焦亡；④RIP3和MLKL磷酸化提示程序性坏死；⑤GPX4降解提示铁死亡。所有指标的检测以β-actin为内参。
三、实验结果
LC3脂化和p62的降解标记的自噬从ATO处理后的2h启动，并在8h～12h达到峰值，提示自噬通路的激活。CASP3切割(Cl-CASP3)标记的凋亡出现在ATO处理后8h，并在12h达到顶峰，提示凋亡通路的激活；全长GSDME(GSDME-FL)和全长GSDMD(GSDMD-FL)的降解分别在ATO处理后4h和8h出现降解，但其N端切割片段在ATO处理后一直未能检测到，提示ATO可能无法诱导GSDME或GSDMD介导的焦亡。磷酸化RIP3(p-RIP3)和磷酸化MLKL(p-MLKL)出现在ATO处理后6h，并在16h～20h达到顶峰，提示程序性坏死通路的激活。GPX4的降解出现在ATO处理后8h，并在16h达到顶峰，提示铁死亡通路的激活。上述结果表明：ATO可首先激活自噬通路，随后可启动铁死亡、凋亡、程序性坏死通路，但ATO不会触发焦亡通路。值得注意的是，上述细胞应激和死亡通路的启动在ATO+NAC实验组显著减缓或被阻断，提示ATO触发的氧化应激是启动细胞应激和死亡通路的上游事件和先决条件(图16)。
实施例9决定基于ATO的肿瘤疫苗效果的关键死亡执行分子鉴定
鉴于实施例8中发现ATO可激活多种细胞应激方式和细胞死亡途径，本实施例借助CRISPR-Cas9技术逐一敲除如下基因，建立多种KO细胞系(Becn1-/-、Bax-/-、Bak-/-、Rip3-/-、Mlkl-/-、Acsl4-/-、Gpx4low、Gsdme-/-、Gsdmd-/-)，旨在分析ATO对WT与KO细胞毒性有无差异，ATO预处理的WT和KO细胞制备的肿瘤细胞疫苗效果有无差异。
一、敲除细胞系的构建
具体步骤如下：
a、通过http：//chopchop.cbu.uib.no/设计对应靶基因的gRNA，一般选靠前的外显子序列，脱靶效应少，通过全基因组比对，不存在目的基因以外能全部匹配的其他基因。
靶基因对应的gRNA序列如下所示：
Becn1：GCCATTTATTGAAACTCGCC
Bax：GCTTGTCTGGATCCAAGACC
Bak：CTGGTACCTGGAGGCGATCT
Rip3：AGCCGACATGTCGGCGGCCA
Mlkl：AGGAACATCTTGGACCTCCG
Acsl4：GATTACTAGTGTTGAGCTTC
Gpx4：CCCCTCCCAGTGCCATCAAA
Gsdme：CTACAGAGAGTTCGCCTTTC
Gsdmd：TGCGTGTGACTCAGAAGACC
b、将上述设计的gRNA连接到质粒LentiCRISPR V2中，并于质粒psPAX2、pMD2.G共转染到HEK293细胞中，48小时～72小时收集细胞上清中的慢病毒。
c、慢病毒按照感染复数(MOI)>3感染TC-1细胞。48h后，使用4μg·mL-1 puromycin进行细胞筛选3-5天，从其中分选出单细胞克隆，测序并蛋白质印记法鉴定有效的KO细胞克隆(图17)。
二、特定基因缺陷对ATO细胞毒性的影响
1、实验分组
每个细胞系下均设置两个组别，分别为：
a、对照组：PBS处理WT和上述所有KO细胞克隆；
b、实验组：ATO(25μM)处理WT和上述所有KO细胞克隆。
2、实验方法
(1)细胞死亡检测方法同实施例2(AnexV/DAPI染色法)。
(2)体外克隆形成实验
a、铺板：取对数生长的TC-1WT和KO细胞，计数后铺板(PBS组105个细胞/孔，给药组2×105个细胞/孔)，补足完全培养体积至1mL，培养过夜。
b、给药：实验组ATO给药终浓度为25μM，处理时间16h。对照组加入等体积PBS作为对照。
c、克隆形成：收集ATO处理后的细胞，计数台盼蓝染色阴性细胞，在6孔板铺板(200活细胞/孔，3mL完全培养基培养)。
d、结晶紫染色：8天后，弃培养基，1mL PBS洗板孔2遍，0.05％结晶紫室温染色15分钟，弃染液并PBS洗涤3遍，通风橱晾干板孔，拍照计算细胞克隆数和克隆大小。
3、实验结果
ATO对Acsl4-/-、Bax-/-、Rip3-/-、Mlkl-/-细胞的毒性显著下降，但对其它KO细胞的毒性没有改变(图18)。PBS或ATO处理后的WT和KO细胞在体外克隆形成的代表结果图，可见ATO处理后WT和所有KO细胞均无法形成克隆(图19)。统计学分析显示，PBS处理后WT和KO细胞在体外克隆形成能力并无显著差异(图20)。
三、特定基因缺陷对基于ATO的肿瘤疫苗效果的影响
1、实验分组
(1)PBS对照组：直接给小鼠皮下注射PBS；
(2)实验组：注射用WT或KOTC-1细胞按照实施例3所获的最优选条件下条件制备的肿瘤疫苗；
2、实验方法
(1)基于ATO的WT或KO细胞肿瘤疫苗的制备
ATO分别预处理WT或KO TC-1细胞(25μM，16h)，制备出WTVAC、Becn1-/-VAC、Gpx4lowVAC、Acsl4-/-VAC、Gsdmd-/-VAC、Gsdme-/-VAC、Bax-/-VAC、Bak-/-VAC、Rip3-/-VAC、Mlkl-/-VAC。
(2)基于ATO的WT或KO细胞疫苗的预防效果比较
给免疫健全的C57BL/6小鼠左侧皮下注射上述WT或KOVAC(106/小鼠/100μL)。9-10天后，在右侧皮下注射未经任何药物处理的TC-1细胞(106/小鼠/100μL)，观察小鼠肿瘤生长情况，计算肿瘤体积并绘制其生长曲线。
3、实验结果
如图21所示，与WTVAC相比，Becn1-/-VAC、Bax-/-VAC、Bak-/-VAC的肿瘤预防效果下降(图21A，图21D)，Acsl4-/-VAC、Rip3-/-VAC、Mlkl-/-VAC的肿瘤预防效果完全丧失(图21B、图21E)，而Gpx4low VAC、Gsdmd-/-VAC、Gsdme-/-VAC则依然能有效预防肿瘤的快速生长(图21C)。上述结果提示：Acsl4、Rip3、Mlkl对基于砷化合物ATO的肿瘤疫苗的效果至关重要，其缺陷、低表达或低活化可导致疫苗无效。BECN1、BAX、BAK及相关信号通路也对该疫苗的效果有重要贡献。
实施例10特定基因缺陷对ATO引发ICD暴露或释放的影响
一、实验分组
对照组：PBS处理WTTC-1和上述所有KOTC-1细胞克隆；
实验组：ATO(25μM)处理TC-1和上述所有KOTC-1细胞克隆。
上述KOTC-1细胞包括：Becn1-/-、Acsl4-/-、Gpx4low、Bax-/-、Bak-/-、Gsdme-/-、Gsdmd-/-、Rip3-/-、Mlkl-/-细胞。
二、实验方法
1、细胞的处理方式
将WT与上述KOTC-1细胞铺板至48孔板中，PBS组2.5×104/孔，ATO组5×104/孔，加入300μLDMEM完全培养基培养过夜。ATO终浓度为25μM，PBS组中加同体积PBS，继续培养16h。
2、ATP与HMGB1释放的测定
将48孔板离心(500×g，5分钟)，取上清新鲜测定胞外释放的ATP(Sigma-FLAA-1KT试剂盒)及HMGB1(IBL-ST51011试剂盒)。
3、CALR暴露的测定
收集细胞上清，贴壁细胞用胰酶消化后与上清细胞合并，离心弃上清(500×g，5分钟)。细胞沉淀用预冷PBS清洗后加入calreticulin一抗(1：500)，冰上孵育30分钟，PBS清洗后加入Alex 647标记的二抗(1：1000)染色30分钟，加入DAPI后流式细胞术分析。
4、IFN-α/β的测定
将L929-ISRE荧光素酶报告细胞预先铺于48孔中(5×104/孔/500μL完全培养基)。分别收集砷化合物ATO预处理的WT或KO肿瘤细胞，与已铺板的L929-ISRE荧光素酶报告细胞共孵育4h(5×104/孔/500μL完全培养基培养)。PBS处理的细胞计数后反复冻融3次(F/T)，加入L929中作为阴性对照。弃细胞上清，加入100μL 1×Passive lysis buffer振摇30分钟。取50μL上述裂解液和50μL含有Luciferase substrate的Luciferase assay buffer混合，借助多功能酶标仪进行化学发光检测。
5、cGAMP释放的测定
将48孔板离心(500×g，5分钟)，取上清转移到1.5mL EP管中，真空冷冻干燥。获得的产物重新溶解于50μL ddH2O，借助ELISA检测cGAMP含量(Cayman-501700试剂盒)。
6、ISGs表达的测定
收集细胞上清，贴壁细胞用胰酶消化后与上清细胞合并，离心弃上清(500×g，5分钟)。从细胞沉淀中提取RNA，逆转录(500ng RNA/样本)成cDNA，实时定量PCR检测靶基因的表达。Ppia为内参，-2-ΔΔCt法计算相对表达量并对数转化后作图分析。
三、实验结果
ATO处理后，WTTC-1可释放大量ATP、HMGB1、cGAMP、IFNα/β，可检测到CALR暴露于细胞外表面，其ISGs表达显著升高。Becn1-/-、Acsl4-/-、Gsdme-/-、Bax-/-、Bak-/-、Rip3-/-、Mlkl-/-TC-1细胞的ATP释放显著下降(图22)。Rip3-/-、Mlkl-/-TC-1细胞的HMGB1释放受到显著抑制(图23)。Acsl4-/-、Bax-/-、Bak-/-、Rip3-/-、Mlkl-/TC-1-细胞的CALR暴露显著降低(图24)。Acsl4-/-、Rip3-/-，Mlkl-/-TC-1细胞的cGAMP释放受到显著抑制(图25)。Becn1-/-、Acsl4-/-、Gsdme-/-、Gsdmd-/-、Bax-/-、Bak-/-、Mlkl-/-TC-1细胞的IFNα/β分泌不同程度地被抑制(图26)。Becn1-/-、Acsl4-/-、Rip3-/-，Mlkl-/-TC-1细胞的ISGs表达并未显著上调(图27)。综上所述，不同细胞应激反应的关键调控分子、不同细胞死亡通路的执行分子对ATO诱导的ICD分子暴露和释放的影响不尽相同。其中，铁死亡的关键分子ACSL4和程序性坏死的执行分子RIP3、MLKL发挥了至关重要的作用。
实施例11基于砷化合物的肿瘤疫苗的质控标准构建
基于对砷化合物制备肿瘤疫苗的大量前期研究，总结该肿瘤疫苗的质控标准，具体如下：
(1)经砷化合物预处理后肿瘤细胞死亡比例在30％-60％；
(2)经砷化合物预处理的肿瘤细胞在体外丧失克隆形成能力，经砷化合物预处理的肿瘤细胞注射到皮下不形成肿瘤，无不良反应；
(3)经砷化合物预处理的肿瘤细胞能促进效应T细胞的增殖，可促进效应T细胞分泌IFN-γ和TNF-α(体外或/和体外实验体系)。
(4)砷化合物预处理后的肿瘤细胞有显著的CALR暴露，可释放ATP、HMGB1和cGAMP，可分泌IFNα/β，ISGs的表达显著上调。
在制备基于砷化合物的肿瘤疫苗用于临床治疗的过程中，可参照上述质控标准来调整优化砷化合物处理肿瘤细胞的条件。本实施例中选取TC-1、MCA805、CT26肿瘤细胞为研究对象，以ATO为砷化合物代表，显示了该类肿瘤疫苗制备最优条件的选取过程，以及质控标准的建立依据。
二、质控标准的建立
本实施例选取不同肿瘤细胞系，通过下列实验对实施例3中建议的基于砷化合物的肿瘤疫苗制备条件进行了摸索和优化，验证上述质控标准。
1、ATO处理引发细胞死亡的检测
(1)实验方法
采用AnexV/DAPI染色法对PBS或ATO处理后不同肿瘤细胞的死亡率进行定量分析，具体步骤如实施例2所述。
(2)实验结果
TC-1、MCA805、CT26细胞死亡与ATO剂量和处理时间均呈正相关，而与肿瘤细胞铺板密度呈反相关。ATO处理下列肿瘤细胞制备疫苗的优化条件为：TC-1(25μM、16h、90％密度)、MCA805(15μM～25μM、16h、90％密度)、CT26(25μM、16h、20％～50％密度)(图28)。
2、体外克隆形成实验
实验方法同实施例9。
结果显示：ATO处理对TC-1、MCA805克隆形成的抑制作用与ATO剂量和处理时间均正相关，与肿瘤细胞的密度无关(图29)。
3、基于ATO的肿瘤疫苗激活抗原特异性CD8+T增殖的检测
实验方法同实施例1。与PBS对照、F/T处理的TC-1OVA细胞相比，ATO处理的TC-1OVA细胞(25μM、16h、90％细胞密度)具有更强的免疫激活能力，能更好的启动OT1细胞的增殖(图30)。
4、ICD分子释放或暴露的检测
ICD分子检测方法同实施例10。按照预先摸索的肿瘤疫苗最优制备条件，用ATO处理TC-1、MCA805、MCA205和CT26细胞，分别测试其胞内及胞外ATP波动(图31)、HMGB1释放(图32)、CALR暴露(图33)，IFNα/β分泌(图34)情况，分析了TC-1细胞在ATO处理后，胞内和胞外cGAMP浓度的波动(图35)，ISGs表达的改变(图36)。上述结果显示，对不同肿瘤细胞的ATO处理方案进行优化，可获得最佳的肿瘤疫苗制备方案，能有效诱导ICD的释放和暴露、提升该肿瘤疫苗的免疫原性。
5、ATO引发的氧化应激和脂质过氧化水平的检测
鉴于氧化应激和ROS积累是ATO触发多种细胞应激反应和死亡通路的必要上游事件。本实施例也分析了优化后的ATO处理对不同肿瘤细胞氧化应激和脂质过氧化水平的影响。
(1)实验方法
a、将TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞分别铺板到12孔板中，PBS对照组(105/孔)和ATO实验组(2×105/孔)、ATO+NAC组(2×105/孔)加入1mLDMEM完全培养基，培养过夜。
b、按分组标记加入ATO(终浓度25μM)、NAC(终浓度5mM)或同体积的PBS，处理16小时。
c、收集细胞后，加入ROS探针DCFH-DA(1μM，Ab113851，Abcam)或脂质过氧化探针BODIPYTM581/591C11(1μM，D3861，Thermo Fisher)，37℃孵育30min染色。流式细胞仪对DCF和BODIPY荧光强度进行定量分析。
(2)实验结果：
ATO能促进TC-1、MCA805、MCA205、CT26细胞产生ROS(图37)，并导致上述细胞发生脂质过氧化，引发后续铁死亡(图38)。ROS抑制剂NAC可有效阻断ATO引发的ROS累积和脂质过氧化(图37、38)。
实施例12基于砷化合物的肿瘤疫苗适用于多个癌种
为测试基于砷化合物的肿瘤疫苗适用于防治哪些癌种，本实施例选取不同肿瘤模型(肺癌TC-1、骨肉瘤MCA205和MCA805、结直肠癌CT26、乳腺癌EO771和4T1、黑色素瘤B16-F10、神经母细胞瘤Neuro2A、淋巴瘤EL4)。在上述肿瘤细胞中转染编码了OVA抗原的质粒，筛选出可稳定表达OVA抗原的单细胞克隆。优化ATO处理不同肿瘤细胞的条件，选定最优条件制备基于ATO的肿瘤疫苗，在体外与BMDCs、OT1细胞共同培养。
结果显示：在优化条件下，ATO预处理的上述肿瘤细胞均能有效激活抗原特异性OT1细胞分泌IFN-γ(图39)。因此，基于ATO的肿瘤疫苗能有效激活抗肿瘤免疫应答，该策略不仅可以防治肺癌，也可以用于多种其它癌种，包括但不限于：肺癌、骨肉瘤、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病等。
实施例13回补特定基因缺陷、低表达、低活化导致肿瘤疫苗无效的策略探索
鉴于部分患者肿瘤内特定细胞死亡执行分子(RIP3、MLKL或ACSL4)缺陷、低表达或低活化，并引发ICD分子暴露或释放受阻的情况，本实施例探索了回补其肿瘤治疗效果的联合用药策略，如下研究以TC-1肿瘤为例。
一、实验分组
a、PBS对照组：给成瘤后的小鼠皮下注射PBS；
b、WT TVAC实验组：给成瘤后的小鼠皮下注射ATO预处理的WTTC-1，标记为WTTVAC；
c、Rip3-/-TVAC实验组：给成瘤后的小鼠皮下注射ATO预处理的Rip3-/-TC-1，标记为Rip3-/-TVAC；
d、Rip3-/-TVAC+AMC实验组：给成瘤后的小鼠皮下注射ARL67156(3.2mg·Kg-1)、MPLA(0.5mg·Kg-1)、cGAMP(0.5mg·Kg-1)、以及ATO预处理的Rip3-/-TVAC的混合物。ARL67156+MPLA+cGAMP标记为AMC；
e、AMC实验组：给成瘤后的小鼠皮下注射AMC。
二、实验方法
基于ATO的治疗性肿瘤疫苗WTTC-1(WTTVAC)和Rip3-/-TC-1(Rip3-/-TVAC)的制备方案和治疗效果测试方案同实施例3和实施例9。
三、实验结果
结果显示，WTTVAC能有效抑制已形成的TC-1肿瘤的快速生长，而PBS、Rip3-/-TVAC、或单独使用AMC均未显示出对已形成的TC-1肿瘤的治疗效果。值得关注的是，联合Rip3-/-TVAC和AMC能有效抑制肿瘤生长(图40)。
实施例14基于砷化合物的肿瘤疫苗和PD-1抗体的联合治疗探索
基于砷化合物的肿瘤疫苗能有效促进抗原特异性T细胞的活化，因此，本实施例进一步探索了可能增强肿瘤疫苗效果的药物联合，特别是ICB药物。本实施例重点显示PD-1抗体与该肿瘤疫苗的联合使用，具体如下：
实验1：基于砷化合物的TC-1疫苗PD-1联用
1、实验分组
a、空白对照组：给已成瘤小鼠皮下注射PBS；
b、PD-1Ab单药实验组：给已成瘤小鼠静脉注射PD-1Ab；
c、WTVAC单药实验组：给已成瘤小鼠皮下注射ATO处理的WTTC-1；
d、WT TVAC+PD-1Ab联合给药实验组：给已成瘤小鼠皮下注射ATO处理的WTTC-1，静脉注射PD-1Ab。
2、实验方法：
基于ATO的治疗性肿瘤疫苗制备和注射方法同实施例6。对于PD-1Ab单药组和联合用药组，在注射疫苗后的第7天和第9天，静脉注射PD-1抗体(10mg·Kg-1)，其它组注射同体积的PBS，继续检测肿瘤大小，记算肿瘤体积并绘制其生长曲线。在实验终点处死所有组别小鼠，取肿瘤组织、消化后制备单细胞悬液，借助ELISPOT分析肿瘤中IFN-γ的分泌情况(Mouse IFNg ELISPOT Set，551083，BDBioscience)。
3、实验结果：
与PBS、单独使用ATO TVAC、或单独使用PD-1抗体相比，两种药物的联合治疗效果更为显著，表现出协同效应或叠加效果(图41)。值得关注的是，上述两种药物联合后，肿瘤浸润CD8+T细胞可分泌更多的IFN-γ(图42)。
实验2：基于砷化合物的Rip3-/-TC-1疫苗与小分子药物和PD-1联用
1、实验分组
a、空白对照组：给已成瘤小鼠皮下注射PBS；
b、WT TVAC单药实验组：给已成瘤小鼠皮下注射ATO处理的WTTC-1；
c、Rip3-/-TVAC单药实验组：给已成瘤小鼠皮下注射ATO处理的Rip3-/-TC-1；
d、Rip3-/-TVAC+AM+PD-1Ab联合给药实验组：给成瘤后的小鼠皮下注射ARL67156(3.2mg·Kg-1)、MPLA(0.5mg·Kg-1)以及ATO预处理的Rip3-/-TVAC的混合物。ARL67156+MPLA标记为AM，静脉注射PD-1Ab。
2、实验方法：
基于ATO的治疗性肿瘤疫苗制备和注射方法同实施例6。联合用药组，在注射疫苗后的第7天和第9天，静脉注射PD-1抗体(10mg·Kg-1)，其它组注射同体积的PBS，继续检测肿瘤大小，记算肿瘤体积并绘制其生长曲线。
3、实验结果：
与PBS、单独使用Rip3-/-TVAC相比，Rip3-/-TVAC联合AM与PD-1表现出协同效应或叠加效果(图43)。
实施例15具有制备肿瘤疫苗潜力的砷化合物探索
除了上述实施例中重点研究的ATO(As2O3)，本实施例旨在探索能有效杀伤肿瘤细胞、有望用于肿瘤全细胞疫苗制备的其它砷化合物，包括但不限于：NaAsO2、AsCl3、As2S2、As2S3、As2S5等。
一、不同砷化合物对肿瘤细胞毒性的检测
1、实验方法
按照不同的浓度梯度(0μM、0.5μM、1μM、5μM、25μM、100μM)，用上述砷化合物分别处理TC-1细胞16h，借助AnexV/DAPI染色法分析细胞死亡比例，方法同实施例2。
2、实验结果
结果显示：NaAsO2、AsCl3、As2S2、As2S3、As2S5浓度低于5μM时，无法有效诱导细胞死亡。当上述砷化合物浓度为25μM时，均能有效诱导细胞死亡(图44)。
二、不同砷化合物制备肿瘤疫苗的免疫激活效果比较
将TC-1OVA细胞铺板在六孔板中，待细胞密度达到90％后，分别加入终浓度为25μM的NaAsO2、AsCl3、As2S2、As2S3、As2S5处理16小时，收集细胞后PBS洗涤，分别与BMDCs和OT1细胞共培养，ELISA检测上清中IFN-γ分泌，检测方法同实施例1。该条件下，用上述砷化合物制备的肿瘤全细胞疫苗能有效激活抗原特异性CD8+T细胞(图45)。
综合上述全部实施例的实验及结果，显示了砷化合物ATO处理的TC-1、MCA805、MCA205、或CT26肿瘤疫苗在体内激活抗肿瘤免疫，预防及治疗相应肿瘤发生进展的效果。此外，ATO处理的EO771 OVA、4T1 OVA、B16-F10 OVA、Neuro2A OVA和EL4 OVA细胞能在体外激活肿瘤抗原特异性T细胞。将ATO换为其它砷化合物，预处理的肿瘤细胞同样可以激活肿瘤抗原特异性T细胞。机理研究揭示了，砷化合物ATO能引发多种细胞应激反应，触发多种细胞死亡通路，诱导ICD分子的暴露和释放。其中，程序性坏死执行分子RIP3和MLKL、铁死亡关键分子ACSL4对ATO诱导ICD分子释放、基于ATO的预防性和治疗性疫苗的效果至关重要。当RIP3、MLKL、或ACSL4缺陷、低表达、低活化时，可通过回补相应ICD分子的不足回补肿瘤疫苗的治疗效率。对于上述分子表达和活化正常的肿瘤，可联合基于砷化合物的肿瘤疫苗和ICB药物(如PD-1抗体)，增强治疗效果。此外，本发明建立了基于砷化合物的肿瘤全细胞疫苗的制备质控标准，确立了预测其肿瘤防治效果的一系列生物标志物。本发明的方案适用于肺癌、骨肉瘤、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病等多个类型肿瘤的预防和治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，包括经砷化合物处理的肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、骨肉瘤细胞、结直肠癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞中的任一种。
3.根据权利要求1所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述砷化合物为三氧化二砷、二硫化二砷、三硫化二砷、五硫化二砷、三氯化砷、亚砷酸钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述处理的方法为：将肿瘤细胞和砷化合物共同培养后去除残余砷化合物。
5.根据权利要求4所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤细胞扩增培养至细胞密度优选为20％～90％，最优选为50％～90％。
6.根据权利要求4所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述砷化合物终浓度优选为1μM～125μM，最优选为5μM～50μM。
7.根据权利要求4所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗，其特征在于，所述共同培养的时间优选为8小时～24小时，最优选为10～16小时。
8.权利要求1-7任一所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
9.一种防治肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1-7任一所述基于砷化合物的肿瘤疫苗。
10.一种防治肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1-7任一所述基于砷化合物的肿瘤疫苗和小分子药物；所述的小分子药物为：腺苷三磷酸水解酶的抑制剂、Toll样受体4的激动剂、I型干扰素应答的诱导剂、干扰素基因刺激因子的激动剂中的一种或多种。
11.权利要求1-7任一所述基于砷化合物的肿瘤疫苗和/或权利要求9-10任一所述药物联合ICB药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
12.权利要求1-7任一所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的质量控制指标，包括：砷化合物处理后细胞的活性、增殖及克隆形成能力，其激活效应T细胞的能力。
13.检测生物标志物的试剂在制备预测权利要求1-7任一所述的基于砷化合物的肿瘤疫苗的肿瘤防治效果的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为细胞表面钙网蛋白、腺苷三磷酸、高迁移率族蛋白B1、环状GMP-AMP、肿瘤细胞内I型干扰素、干扰素刺激基因中的一种或多种。
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