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KR101673389B1 - Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR101673389B1
KR101673389B1 KR1020140085332A KR20140085332A KR101673389B1 KR 101673389 B1 KR101673389 B1 KR 101673389B1 KR 1020140085332 A KR1020140085332 A KR 1020140085332A KR 20140085332 A KR20140085332 A KR 20140085332A KR 101673389 B1 KR101673389 B1 KR 101673389B1
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cancer
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ser
vegf
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이동헌
문경덕
최유빈
강경재
김동인
안진형
유원규
정진원
Original Assignee
에이비엘바이오 주식회사
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Publication date
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Abstract

본 발명은 신규한 델타 유사 리간드 4(Delta like ligand 4, DLL4)에 특이적으로 결합하는 단백질 및 혈관 내피 세포 성장 인자(Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질에 관한 것이다.

Description

DLL4와 VEGF에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도{Novel double-targeting protein that specifically binds to DLL4 and VEGF, and use thereof}
본 발명은 신규한 델타 유사 리간드 4(Delta like ligand 4, DLL4)에 특이적으로 결합하는 단백질 및 혈관 내피 세포 성장 인자(Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질에 관한 것이다.
노치(Notch) 신호전달은 척추 동물에서 무척추 동물에 이르기까지 진화론적으로 잘 보존되어 있으며 발생 초기에 세포의 운명을 결정짓는데 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 노치 신호전달은 신경, 안구, 림프, 근육, 혈구 등의 분화과정을 조절하는 주요 인자로 알려져 있으며, 또한 혈관 발생에도 관여하고 있다. 포유류에서는 4개의 노치 수용체를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3 및 4), 각각의 노치 수용체는 300-350kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 퓨린-유사 전환효소(furin-like convertase)에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포 표면에서 이형이합체(heterodimer)를 형성한다. 또한, 포유류에는 5개의 노치 리간드(Jagged-1/2 및 Delta-유사 리간드 (DLL) 1/3/4)가 확인되었다.
활성화된 노치 신호전달은 여러 암 모델에서 종양형성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 활성 노치인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시키는 경우 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키고, T-ALL(T-cell acute lymphoblastic leukemia)에선 활성화된 노치 1이 50% 정도 발견되었다. 또한, 유방암의 경우에도 MMTV(mouse mammary tumor virus)가 삽입된 쥐(Czech II)에서 활성화된 노치 4 수용체가 과발현된 것이 발견되었고 이들 쥐에서 유선종양이 발생한 것이 보고되었다. 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암과 같은 다양한 암에서 노치 수용체와 리간드 그리고 노치 신호 전달의 타겟이 활성화되어 있는 것이 보고되었다. 노치 1 수용체 발현과 유방암 환자의 좋지 않은 예후가 관련이 있고, 전립선 암에서는 암 전이와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
델타 유사 리간드 4(Delta Like Ligand 4, DLL4)(이하에서는 "DLL4")는 혈관 내피 세포에서 과발현되어 있는 노치 단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 혈관 신생을 조절하는 주요 요소로 알려져 있다. DLL4는 특히, 혈관 내피에 과발현되는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합을 한다. DLL4는 정상적인 혈관에서도 발현되나, 암 혈관에서는 매우 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 신생 혈관 형성 과정(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 특히 종양에 있어서 혈관신생은 암 조직의 저산소(hypoxia) 지역에서 산소와 영양분을 공급받기 위하여 VEGF(Vascular endothelial growth factor)와 같은 혈관 신생 인자에 의해 혈관신생이 일어난다. 종양에 있어서 혈관 신생은 종양의 성장뿐만 아니라 전이(metastasis)에 있어서도 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 종양에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 혈관 신생(angiogenesis)의 조절이 잘 이루어지지 않게 되므로 암의 성장을 억제할 수 있다. 또한, DLL4에 의한 노치 신호전달을 억제시키는 경우, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)의 수를 증가시켜 자가면역질환 (autoimmune diseases)을 치료할 수 있다(미국공개특허 제2011-0189200호). 이러한 이유로 DLL4는 암 및 자가면역질환의 치료에 있어서 새로운 표적이 되고 있다.
한편, 신생 혈관 형성을 억제하는 항암 항체 의약품으로는 VEGF를 타겟으로 하는 아바스틴(Avastin® Genentech/Roche)이 지난 2004년 FDA의 승인을 거쳐 항암 치료제로 대성공을 거두고 있다. 그러나, 최근의 일부 임상 모델과 전임상 동물 모델 연구에서 모든 고형암(Solid tumor)이 VEGF 억제제에 반응하는 것은 아니며, 또한 초기에 VEGF 억제제로 치료가 진행되던 일부 종양이 일정 시간 경과 후 저항성을 띄는 경우가 다수 보고되고 있을뿐더러, VEGF 억제제 투여로 인해 암세포가 보다 공격적이고 전이가 잘 일어나는 암세포로 형질이 변환된다는 연구 결과들이 발표되고 있다. 이와 같은 연구 보고들은 아바스틴 내성을 이겨내거나 아바스틴의 약효를 뛰어넘는 신규 항암 타겟에 대한 연구 개발을 활발하게 추진하도록 만들었는데 이러한 새로운 항암 타겟으로 각광을 받고 있는 것들 중 하나가 DLL4/Notch 신호 전달 경로에 관여하는 단백질들이다. 현재까지 밝혀진 연구 결과에 따르면 VEGF/VGEFR 신호 경로와 DLL4/Notch 신호 경로가 서로 다른 작용 기전으로 신생 혈관 형성에 영향을 미치기 때문에 두 가지 신호 경로를 동시에 억제하였을 경우, 보다 강한 항암 시너지 효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.
이에 본 발명자들은 인간 DLL4와 VEGF에 특이적으로 결합하여 DLL4/Notch 및 VEGF/VEGFR 신호 전달 경로를 효과적으로 저해하고 면역원성의 위험성을 최소화할 수 있는 이중표적 단백질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체로서, IgG 기본형태인 아바스틴 유사체(Avastin similar)의 C-말단 부위에 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 신규한 ScFv(Single-chain variable fragment) 형태를 연결한 이중표적 단백질을 새로이 제작하였고, 이러한 이중표적 단백질이 VEGF와 VEGF 수용체 단백질의 상호작용은 물론, DLL4와 노치 단백질 사이의 상호작용 역시 효과적으로 차단하고, 이에 따라 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질, 및 VEGF(Vascular endotelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 이중표적 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중표적 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중표적 단백질을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중표적 단백질을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중표적 단백질을 이용하는 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는, DLL4의 입체형태적 에피토프를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 입체형태적 에피토프를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질, 및 VEGF(Vascular endotelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 이중표적 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, "이중표적 단백질"이란 서로 다른 두 종류의 항원(표적 단백질)에 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 구체적으로는 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태임이 바람직하다.
본 발명의 목적상 상기 이중표적 단백질은 암세포에서 과발현되는 VEGF 및 내피세포에서 발현되는 DLL4과 결합할 수 있다. 또한, 상기 이중표적 단백질은 항체의 형태일 수 있다. 본 발명의 "이중표적 단백질"은 "이중표적 항체", "이중 항체" 또는 "이중 항체 단백질"과 혼용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 이중표적 단백질은 VEGF 및 DLL4를 항원으로 할 수 있다. 본 발명의 상기 이중표적 단백질의 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나, IgG 형태의 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질이 링커로 연결된 이중표적 단백질의 형태를 포함하며, 그 구조는 도 1a에 간략히 모식도로 나타낸 바와 같다.
본 발명의 이중표적 단백질은 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전장(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전장 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 이가(bivalent), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG 형태일 수 있다.
본 발명에서 이중표적 단백질은 면역글로불린(Immunoglobulin G, IgG) 형태의 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체 및 DLL4(Delta-like ligand 4)에 특이적으로 결합하는 전장 항체, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 또는 scFv 형태의 단백질이 링커로 연결된 형태일 수 있다.
전형적으로, 면역글로불린 및 scFv는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별될 수 있다.
본 발명에 따른 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF에 특이적으로결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질은 인간 유래 DLL4와 VEGF에 대해서 강한 친화력을 나타내며, DLL4를 발현하고 있는 세포(예-암세포나 혈관 내피 세포)가 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 암세포에서 과발현하는 VEGF에 의해 VEGF 수용체를 발현하고 있는 혈관 내피 세포가 활성화되는 신생 혈관 형성 작용을 억제하여, 암과 같은 질병의 치료에 있어 보다 강한 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 이중표적 단백질에서 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 각각의 특이적인 결합을 유지하며, 특히 두 개의 표적(항원)을 동시에 억제시킬 수 있기 때문에 하나의 표적과 결합하여 억제하는 것보다 더욱 효과적일 수 있고, 동시에 두 개의 신호를 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체 단편"은 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 및 scFv를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 특히, 상기 용어는 scFv(single-chain variavle fragment)를 포함하고, 이가(bivalent) 또는 디아바디(Diabody), 트리아바디(Triabody) 및 테트라바디 (Tetrabody)를 포함한다.
본 발명에서 용어, "scFv(single-chain variavle fragment)"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 상기 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있다.
본 발명에서 용어, " 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질, 및 VEGF(Vascular endotelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 이중표적 단백질"은 DLL4 및 VEGF에 의한 두 가지 신호 전달 경로를 동시에 억제할 수 있는 이중표적 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 상기 이중표적 단백질을 구성하는 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체는 상기에서 설명한 전장 항체 및 항체 단편의 형태를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질"은 서열번호 21로 표시되는 DLL4 내의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 암의 성장을 억제하여 암 치료 효과를 나타낼 수 있는 단백질을 의미하며, 높은 친화도로 상기 에피토프에 결합하고 DLL4 활성을 중화시키는 역할을 할 수 있다. 상기 단백질은 노치 수용체에 대한 DLL4 결합을 차단할 수 있으며, DLL4에 의한 신호전달을 억제할 수 있다. 상기 DLL4의 서열번호 21 및 서열번호 22 를 포함하는 입체형태적 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 단백질은 구체적으로는 전장 항체, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 또는 scFv(Single-chain variable fragment) 형태일 수 있다.
상기 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질은 구체적으로는, 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 형태일 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 중쇄는 서열번호 8로 표시되는 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 경쇄는 서열번호 9로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 상기 기술한 CDR 서열을 포함하며, DLL4에 특이적으로 결합하여 암 치료 효과를 나타낼 수 있는 단백질이라면 그 서열은 달라질 수 있다. 상기 중쇄 및 경쇄는 링커를 통해 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 이중표적 단백질의 구성요소인 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 인간 DLL4뿐만 아니라 마우스 DLL4에 특이적으로 결합하면서 DLL4와 노치 단백질 간의 상호작용을 저해시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 DLL4 및 VEGF의 생물학적 저해 활성이 우수한 본 발명의 이중표적 단백질의 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체의 에피토프를 규명하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 DLL4의 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열이 형성하는 DLL4의 연속된 분자표면에 결합함을 규명하였다. 따라서, DLL4의 58번 내지 65번 아미노산 서열(서열번호 22) 및/또는 110번 내지 115번 아미노산 서열(서열번호 23)이 본 발명에 따른 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체의 에피토프가 될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 DLL4의 서열번호 22 및 23번 부위가 형성하는 분자표면 부위가 입체형태적 에피토프가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "델타 유사 리간드 4(delta-like ligand 4, DLL4)"는 노치 단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 구체적으로는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합하는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DLL4는 포유류의 DLL4라면 제한없이 포함될 수 있으나, 구체적으로는 인간 또는 마우스의 DLL4를 의미할 수 있다. DLL4는 암의 혈관(tumor vasculature)을 비롯한 다양한 암 세포에서 과발현되어 있으며, 여러 이종이식(xenograft) 모델에서 비정상적혈관수를 증가시켜 암의 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명의 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 이중표적 단백질은 DLL4의 기능을 억제하여 암치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 DLL4에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 Gene ID:54567, NCBI Reference Sequence: NM_019074.3인 DLL4의 정보일 수 있으며, 상기 DLL4는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "노치(Notch) 수용체"는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질을 의미하며, 노치와 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 노치 수용체는 노치 신호 전달을 매개하는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로는 노치 1 또는 노치 4 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "인간 델타 유사 리간드 4(DLL4)와 노치(Notch) 수용체 간의 상호작용을 저해"는 본 발명의 DLL4에 특이적으로 결합하는 이중표적 단백질이 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미하며, 구체적으로는 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프에 특이적인 이중표적 단백질이 DLL4에 결합하여 DLL4와 노치 1 또는 노치 4 수용체와의 상호작용을 저해시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프에 특이적인 이중표적 단백질의 결합에 의해 DLL4와 노치 수용체 간의 상호작용이 저해되며, DLL4의 노치 수용체 결합에 의한 노치 단백질의 구조적 변화를 가져오지 못하여 가수분해될 수 없어 노치 신호전달을 가져올 수 없게 한다. 암에서 DLL4와 노치 수용체가 결합하게 되면, 혈관 크기를 증대시키고, 혈곤 내피 세포 간의 신호전달 또는 암 세포와 혈관 내피 세포 간의 노치 신호전달을 활성화시켜, 암의 증식과 전이를 억제하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 암에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 특히 혈관 신생 조절이 잘 이루어지지 않게 되어 암의 성장을 억제할 수 있게 된다. 또한, DLL4를 차단하게 되면 혈관신생 부위 말단의 세포에서 외측 억제(lateral inhibition)의 결실이 나타나서 과도한 발아가 이루어지게 되고 그 결과로 지나치게 많으면서도 생산성은 떨어지는 혈관신생 반응이 높아지게 되며, 산소를 공급하는 관류가 나빠져서 암 주변에 저산소 상태가 유도될 수 있어 항암 효과를 가져올 수 있으며, 특히 항 VEGF 치료에서도 저항성을 보이는 암에서도 항암 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, DLL4와 노치 간의 상호작용을 효과적으로 억제하는 본 발명의 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 이중표적 단백질을 암의 치료에 있어 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "VEGF에 특이적으로 결합하는 항체"는 암세포에서 광범위하게 VEGF를 항원으로 하여 이에 특이적으로 결합하는 항체이면 모두 포함한다. 구체적인 예로는 VEGF를 표적으로 하는 치료용 항체인 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 아바스틴®), 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이와 같은 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 기술한 전장 항체 또는 항체 단편의 형태를 모두 포함하며, IgG 항체 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. VEGF는 신생혈관생성에서 중요한 역할을 하는 리간드로 이를 억제하면 신생혈관생성이 이루어지지 않아서 암을 치료할 수 있다. 상기 베바시주맙은 제넨텍사의 아바스틴(Avastin)으로 미국 FDA에 승인을 받은 것으로 안정적으로 사용할 수 있는 치료용 항체이다.
상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 구체적으로, 중쇄 가변 영역은 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, VEGF에 특이적으로 결합하여 암 치료 효과를 나타낼 수 있는 단백질의 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 이중표적 단백질의 구성요소인 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 암세포에서 과발현되는 VEGF에 특이적으로 결합하여, 본 발명의 이중표적 단백질을 VEGF를 발현하는 암세포로 집중시킬 수 있을 뿐만 아니라, VEGF와 결합하여 그 자체로도 항암활성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)"는 혈관내피세포의 생장활성을 증진시키는 성장인자의 일종으로, 대시식세포, 평활근세포, 종양세포 등 여러 세포에 의하여 분비된다. 태생기 혈관 생성에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 빠른 생장과 대사가 이루어지는 종양 조직에서 산소의 공급을 위하여, 혈관신생(angiogenesis)를 유도하는 역할을 한다. 해당 VEGF 단백질과 이의 수용체에 의한 pathway는 성체에서 특히 항암제의 타겟 신호전달 경로로 연구되고 있다.
아울러, 상기 이중표적 단백질의 VEGF 결합부위는 인간 VEGF 와 VEGF 수용체 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미하며, 구체적으로는 VEGF에 특이적인 이중표적 단백질이 VEGF에 결합하여 VEGF와 VEGFR-2 수용체와의 상호작용을 저해시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 VEGF 수용체는 포유류의 VEGF에 결합하는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 구체적으로는 인간 VEGF에 결합하는 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명의 VEGF에 특이적인 이중표적 단백질에 의한 VEGF와 VEGF 수용체 간의 상호작용 저해를 통하여 VEGF의 VEGF 수용체 결합에 의한 VEGF/VEGF 수용체 신호전달을 억제하게 된다. 암에서 VEGF와 VEGF 수용체가 결합하게 되면, 암조직의 혈관 내피 세포(stromal/endothelial cell)에서 VEGF/VEGF 수용체 신호전달이 활성화되고, 이는 DLL4/Notch 신호 전달 경로의 작용 기전과 달리 신생 혈관 형성 과정을 강하게 억제하여 혈관의 수를 감소시키며, 종양 내의 맥관 기능(vascular function)을 약화시켜 암의 증식과 전이를 억제하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 상기 DLL4와 VEGF에 특이적인 이중표적 단백질은 서로 다른 기전의 암조직 신생 혈관 형성 억제능을 보여주어 보다 뛰어난 항암 능력을 가진 치료제로서 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 이중표적 단백질은 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 IgG(Immuniglobulin G) 형태의 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체가 링커로 연결된 형태일 수 있다.
본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너 (예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 구체적으로는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지(hinge)의 역할을 수행할 수 있다. 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커일 수 있으며, 펩티드 결합, 이황화 결합 등에 의해서 직접 연결되는 것도 모두 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 연결할 수 있는 폴리펩티드가 될 수 있고, 더욱 구체적으로는 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질과 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단을 연결할 수 있는 펩타이드 링커가 될 수 있으며, 더욱 더 구체적으로는 GGGGS 모티프가 3번 반복된 형태의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 링커가 될 수 있다. 상기 GGGGS 모티프는 1~10번 반복될 수 있으며, 가장 구체적으로는 하기의 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
링커 펩타이드(서열번호 18): GGGGSGGGGSGGGGS
링커 폴리뉴클레오티드(서열번호 19): GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCA GTCCCGGTGGCGGCTCC
본 발명에서 용어, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유 결합을 통해 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 비펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르과 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 또는 이들의 조합일 수 있다. 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체일 수 있으며, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는 분자량 1 내지 5kDa의 분자량인 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체일 수 있으며, 가장 구체적으로는 3.4kDa 정도의 양 말단에 양기능성 알데히드(bifunctional aldehyde) 형태로 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 연결시킬 수 있는 링커일 수 있다. 특히, 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하는 데 효과적이다.
상기 링커를 통하여 직접 또는 간접적으로 연결되는 부위는 특별히 이에 제한되지 않으나, Fc 부분, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 등이 될 수 있다. 상기 이중표적 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 전체 또는 일부 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 전체 또는 일부가 연결된 형태; 또는 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 전체 또는 일부 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태가 될 수 있다.
또한, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 전체 또는 일부 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태; DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 전체 또는 일부 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IgG 형태의 아바스틴의 중쇄 영역 C-말단과 scFv 형태의 DLL4 결합 단백질을 링커로 연결한 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하고, 이를 동물세포에 도입하여 아바스틴-DLL4 결합 이중표적 단백질을 분리하여, DLL4와 VEGF에 특이적으로 결합하는 이중표적 단백질 아바스틴-DLL4 BsAb를 제작하였다. 상기 이중표적 단백질 분자는 아바스틴 IgG 항체 분자와 DLL4 결합 scFv를 링커로 연결한 구조를 가지고 있다(도 1). 상기 동물세포에 도입·발현한 아바스틴-DLL4 결합 이중표적 단백질을 분리하여 발현 및 순도를 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 또한, 아바스틴-DLL4 결합 이중표적 단백질이 표적인 VEGF 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 3). 또한, 상기 이중표적 단백질은 각 항원에 대한 대조 항체와 유사한 결합 활성을 보여주어 인간 DLL4에 대해서는 30 nM의 KD값을 인간 VEGF에 대해서는 0.126 nM의 KD값을 나타내었으며(표 2 내지 3), 혈관 내피 세포의 DLL4와 인간 노치 1 수용체와의 결합 및 VEGF와 VEGF 수용체와의 결합에 의한 각각의 신호 전달 경로가 이중표적 단백질 처리에 의해 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 10). 이러한 결과는 본 발명의 DLL4와 VEGF에 특이적인 이중표적 단백질이 각각의 수용체인 노치 및 VEGF 수용체와의 결합을 효율적으로 차단하여 항암 효과를 가져올 수 있음을 시사하는 것으로 아바스틴 내성을 가진 인간 위암(SCH) 및 폐암(A549) 세포주 이종이식 모델(xenograft model)에서 이중 항체의 항암 효능을 확인하였다(도 11 및 도 12).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 이중표적 단백질의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 CHO-S 세포를 숙주세포로 이용하였다.
본 발명에서 용어, "도입"은 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로는 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 이중표적 단백질을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 생산된 이중표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF(Vascular endotelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질의 제조방법일 수 있다.
더욱 구체적으로는 (a) VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하고 경쇄가변영역은 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 Fc 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단을 링커로 연결하여 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현 벡터를 제조하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 형질전환체로부터 이중표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 (a) VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하고 경쇄가변영역은 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현 벡터를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 형질전환체로부터 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 DLL4에 결합하는 단백질을 수득하여, VEGF에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단 및 DLL4에 결합하는 단백질의 N-말단을 링커로 연결하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
본 발명의 이중표적 단백질은 상기의 공지의 재조합 수단 또는 생화학적 방법에 의해 제조될 수 있으며, 항체는 적절한 숙주세포에 도입되고, 형질전환체의 배양액으로부터 회수할 수 있다.
구체적으로는 이중표적 단백질은 공지의 분리방법에 의해 분리할 수 있으며, 그 예로 단백질 A-세파로오스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성크로마토그래피와 같은 통상적 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적 단백질을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
상기 이중표적 단백질은 DLL4와 VEGF에 동시에 결합하여 노치 및 VEGF 수용체와의 결합을 저해함으로써 암의 성장 억제에 관여할 수 있다. 상기 DLL4/노치 수용체와 VEGF/VEGF 수용체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 조성물은 DLL4와 VEGF에 특이적으로 결합하는 이중표적 단백질을 포함하는 조성물을 생체 내에 투여하여, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "암"은 암의 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 이중표적 단백질이 VEGF 및 DLL4에 모두 결합하며 (도 3, 도 4a 및 도 4b), DLL4를 중화시킬 수 있고 (도 5), 아바스틴 내성을 가진 인간 위암(SCH) 및 폐암(A549) 세포주 이종이식 모델에서 이중표적 단백질의 항암 효능을 확인하여(도 11 및 도 12), 암 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 통하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 이중표적 단백질 및 약학적으로 유효한 양에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 이중표적 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 사용될 수 있는 담체 및 암은 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함될 수 있다.
이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 필요가 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적 단백질을 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 이중표적 단백질 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 암 진단용 조성물은 본 발명의 이중표적 단백질을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 시료의 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준을 측정하여, 측정된 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 암으로 판단하는데 사용될 수 있다.
이를 위한 단백질의 수준을 측정하는 방법으로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법(badioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony)면역 확산법, 로케트(rocket)면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein Chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 분석 방법들을 통하여 정상 대조군과 암 의심 개체에서의 VEGF 또는 DLL4 단백질 수준을 비교할 수 있으며, 이를 통해 실제 암 의심 환자에서의 암 발병 여부에 대해 진단할 수 있게 된다.
본 발명의 암 진단용 조성물은 본 발명의 이중표적 단백질 외에 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법을 수행하기 위해 필요한 것으로 당업계에 알려진 것을 제한없이 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 이중표적 단백질을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 시료의 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준이 정상 대조군보다 높은 경우 암으로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
상기 이중표적 단백질, 암, 개체, 진단 및 단백질의 수준을 측정하는 단계(방법)에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “시료”란 암 환자에서 VEGF 또는 DLL4의 발현 수준이 차이나는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는, DLL4의 입체형태적 에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 가교화 반응 및 질량분석을 통해 서열번호 21의 DLL4에서 가교화 반응이 일어나는 아미노산 잔기를 규명하였으며, 상기 잔기를 포함하는 58번 내지 65번 아미노산 서열[FRVCLKHF] 및 110번 내지 115번 아미노산 서열(서열번호 23) 두 단편이 도 7에 나타난 바와 같이, 연속된 분자표면을 구성함으로써 DLL4의 에피토프를 형성함을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 입체형태적 에피토프를 인지하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
구체적으로, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 형태일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 중쇄는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 경쇄는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 DLL4, 단일클론항체, 벡터, 형질전환체 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 이중표적 단백질은 VEGF와 DLL4에 동시에 결합하여 암을 치료할 수 있으며, DLL4에 특이적으로 결합하는 신규한 단백질을 이용함으로써, 결합력 및 항암효과가 뛰어나, 암 치료 및 진단 분야에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a 및 도 1b는 DLL4와 VEGF를 동시에 결합할 수 있는 이중표적 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2a는 DLL4 와 VEGF 를 동시에 결합할 수 있는 이중표적 단백질을 CHO 세포에서 발현하여 정제한 후, SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 DLL4 와 VEGF 를 동시에 결합할 수 있는 이중표적 단백질을 CHO 세포에서 발현하여 정제한 후, SEC-HPLC 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DLL4와 VEGF에 대한 이중표적 단백질의 DLL4와 VEGF에 대한 결합능 어세이(Binding assay)를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 이중표적 단백질의 항원인 DLL4에 대한 평형해리상수(equilibrium dissociation constant, KD) 값을 비아코어(Biacore) 분석 방법을 통해 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 이중표적 단백질의 항원인 VEGF에 대한 평형해리상수 (equilibrium dissociation constant, KD) 값을 비아코어(Biacore) 분석 방법을 통해 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 이중표적 단백질의 DLL4 및 VEGF에 대한 중화효과(Neutralizing assay)를 ELISA를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 크로스링커 유무에 따른 인간 DLL4 및 MLCK2 항체의 복합체 형성 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인간 DLL4 C2 도메인(27-174) 표면 상에서 서열번호 21로 표시되는 DLL4의 58-65번 아미노산 잔기[FRVCLKHF] 및 서열번호 22로 이루어진 단편이 연속된 분자표면을 구성하고 있는 모델을 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 및 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편을 코딩하는 돌연변이 단백질의 결합력을 웨스턴블랏팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 VEGF를 타겟으로 하는 항체인 아바스틴을 처리하였을 때, DLL4 의 존재 유무에 관계 없이 농도 의존적으로 혈관 내피 세포의 증식이 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 DLL4 단독에 대한 항체를 처리하였을 때, DLL4가 있는 실험군에서만 DLL4 항체 처리 농도에 의존적으로 혈관 내피 세포의 증식이 나타나는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9c는 이중표적 단백질을 처리하였을 때, DLL4가 존재하지 않는 실험군에서는 아바스틴 항체 처리와 유사한 증식 억제 효능을 나타내고(청색 막대), DLL4가 존재하는 실험군에서는 아바스틴 대비 혈관 증식 억제 효능이 줄어든 결과를 나타낸 것이다(적색 막대).
도 10은, DLL4와 VEGF에 결합하는 이중표적 단백질이 혈관내피세포(HUVEC)의 DLL4/Notch 신호 전달 경로와 VEGF/VEGFR 신호 전달 경로를 억제하는 활성을 나타냄을 웨스턴블롯(Western blot) 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 11은, DLL4와 VEGF에 결합하는 이중표적 단백질이 누드 마우스에 구축한 아바스틴 저항성을 가지는 인간 위암 세포주 이종이식 모델(Avastin-resistant human SCH gastric cancer xenograft model)에서 아바스틴에 비해 강한 항암 효능을 가지고 있음을 확인한 것이다.
도 12는, DLL4와 VEGF에 결합하는 이중표적 단백질이 누드 마우스에 구축한 아바스틴 저항성을 가지는 인간 폐암 세포주 이종이식 모델(Avastin-resistant human A549 lung cancer xenograft model)에서 아바스틴에 비해 강한 항암 효능을 가지고 있음을 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항 DLL4 / VEGF 이중표적 단백질의 제조
실시예 1-1: DLL4 항원의 제조
인간 DLL4의 세포외 도메인 항원은 알앤디 시스템사에서 제공된 인간 DLL4 단백질(Cat: 1506-D4/CF)을 사용하였다. 이 DLL4 항원 단백질은 Accession No. Q9NR61의 DLL4 아미노산 서열의 27번째 내지 524번째 아미노산을 포함한다. 상기 단백질 C-말단에는 히스티딘-태그(10-His tag)이 결찰되어 있다.
또 다른 DLL4 세포외 도메인의 특정 영역에 대한 항원을 제조하였다. 이 특정 영역은 아미노산 27 내지 아미노산 251을 포함한다. 이 영역은 Notch1 수용체와 결합하는 것으로 알려진 "DSL(델타/세레이트(Serrate)/lag-2)" 도메인으로 칭해지는 모티프를 함유한다. Fc 단백질에 융합된 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편(아미노산 27 내지 251)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 CMV 프로모터를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 벡터가 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하였다. Fc 단백질에 융합된 인간 DLL4의 키메라인 DLL4의 결실단편을 코딩하는 추가적인 구축물이 일반적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하였다. 상기 제조된 구축물을 HEK 293E 세포에 일시적으로 형질 감염하여, Fc 단백질에 융합된 인간 DLL4 아미노산 27 내지 251을 포함하는 재조합 융합 단백질들을 발현시켰다. 상기 단백질을 수득하기 위해 72시간마다 컨디셔닝 배지를 수집하였고 이를 4번 반복하였다. 이 컨디셔닝 배지로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 1-2: 라이브러리 파아지의 제조
다양성을 가진 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리 세포 2.7 x 1010 개를 2X YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, 이스트 추출물(CONDA, 1702.00) 10g, NaCl(sigma, S7653-5kg) 5g, 클로람페니콜(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% 글루코스(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)를 포함하는 배지(3ℓ)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2X YT CMK(2X YT CM, 카나마이신(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)) 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000rpm, 10분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.
실시예 1-3: 파아지 디스플레이( phage display )를 통한 패닝( panning )
인간 DLL4 결합하는 항 DLL4 항체를 선별하기 위해, 인간 DLL4 항원에 대한 패닝을 3회(round) 진행하였다.
면역시험관(immunotube)에 10 ㎍/mL 농도의 재조합 인간 DLL4(R&D system 사) 용액을 첨가하여 4℃에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 우혈청 알부민 1% 용액을 시험관에 첨가하여 DLL4가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 1% 우혈청 알부민용액에 분산된 1012 CFU의 항체파지 라이브러리를 넣어 항원과 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline - 0.05% Tween 20) 용액으로 5회 씻어낸 후 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다.
상기 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼(pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 한천 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4 mL의 SB(superbroth)-카베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지 중 50㎕를 20 mL의 SB-카베니실린 배양액에 2% 포도당용액(glucose)를 첨가하여 37℃에서 배양하였다.
배양액의 흡광도가 600nm에서(OD600) 0.6이 되면 원심분리하여 배양액을 제거하고, 이를 다시 20mL의 SB-카베니실린 배양액에 현탁한 후 1012 PFU의 VCSM13 헬퍼파지를 넣고 천천히 교반하며 37℃에서 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리한 후 배양액만 취하여 폴리에틸렌글라이콜 8000(PEG8000)을 4%, 염화나트륨(NaCl) 3% 첨가하여 4℃에서 30분간 침전시킨 후 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전된 파지를 PBS 1 mL에 현탁시켜 이를 라이브러리로 사용하여 위의 패닝과정을 반복함으로써 항원특이적 클론을 증폭/농축시켰다.
인간 DLL4 단백질 내 Notch1과 결합하는 부위에 결합하는 항체를 선별하기 위해 패닝시, 인간 DLL4 단백질과 인간 DLL4 특정영역을 지칭하는 결실단편 (아미노산 27 내지 251)을 교차하여 패닝을 진행하였고, 3회(round) 진행하였다. 그 후 항체유전자를 포함하는 LB-카베니실린 한천 배지에 도말, 배양하여 단일 콜로니들을 얻고 이를 400 ㎕ SB-카베니실린 배양액에 접종, 배양한 후 IPTG로 유도하여 scFv형태의 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 대장균을 TES용액(Tris, EDTA, sucrose)에 현탁한 후 4 ℃에서 1시간 방치 후 원심분리하여 페리플라즘을 추출하고, 이를 ELISA 기법을 사용하여 재조합 인간 DLL4 항원과 scFv와의 결합을 확인하는데 사용하였다.
결합한 scFv는 HRP(Horseradish peroxidase)-항-HA 항체와 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 이용하여 검출하였다. 이로부터 확인된 항원 특이적 항체 클론은 염기서열 분석법을 통해 분석하였다. 상기 선별된 scFv의 서열을 분석한 결과는 하기 표 1과 같다.
아미노산 서열 CDR1 CDR2 CDR3
VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKCLEWVSWIYSGSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTlYLQMNSLRAEDTAVYYCARADWPFDYWGQGTLVTVSS
(서열번호 8)		 GFTFSDYAMS
(서열번호 2)		 WIYSGSGNKYYADSVKG
(서열번호 3)		 ADWPFDY
(서열번호 4)
VL QSVlTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVTWYQQlPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGlRSEDEADYYCGTWDYSLSAYVFGCGTKLTVL
(서열번호 9)		 TGSSSNIGSNDVT
(서열번호 5)		 ADSKRPS
(서열번호 6)		 GTWDYSLSAYV
(서열번호 7)
상기 서열을 가지는 항-DLL4 항체를“MLCK-2”로 명명하였다.
실시예 1-4: DLL4 와 VEGF 를 타겟으로 하는 이중표적 단백질(이중 항체)의 제조
상기 실시예 1-3에서 만들어진 인간 DLL4와 결합하는 scFv 형태의 항체를 링커를 이용하여 아바스틴 IgG 형태와 연결하여 인간 VEGF와도 결합할 수 있는 이중표적 단백질 발현 벡터를 제조하였다(도 1b).
상기 제조된 이중표적 단백질은 서열번호 1의 중쇄 아미노산 서열(VEGF-DLL4 BsAb heavy chain) 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 가진다. 상기 이중표적 단백질의 DLL4 결합항체의 중쇄는 서열번호 2로 표시한 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시한 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시한 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄는 서열번호 5로 표시한 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시한 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시한 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하였다.
또한, 이중표적 단백질의 VEGF 결합항체의 중쇄는 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하고, 경쇄는 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하였다.
이중표적 단백질 발현 벡터를 CHO 세포에 항체 생산을 위해서, 세포 내 유전자 전달 효율을 높이는 폴리머를 이용하여 해당 유전자를 형질 주입한 부유 동물 세포를 500 ㎖ 배양용 삼각 플라스크(코닝 코스타)에서 병 1개당 200 ㎖로 배양하여 총 1ℓ를 배양하였다. IgG 함량이 매우 낮은(ultra low IgG) 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, 인비트로젠 코포레이션)을 포함하는 RPMI 배지(인비트로젠 코포레이션)와 CHO 세포 전용 배지의 혼합액 1ℓ를 4일간 세포배양기(산요)에서 배양하여 재조합 단백질을 생산하였다. 세포 배양액을 수득하여 원심분리를 수행하여 부유 세포와 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 분리하고 0.22 ㎛ 진공 필터 장치(Millipore)로 1회 여과하였다.
항체 정제를 위해서, 1차적으로 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼(Hitrap MabSelect Sure, 5 mL, GE healthcare)을 사용하여, 아바스틴-DLL4 BsAb 이중표적 항체를 배양액으로부터 정제하였다. 구체적으로, 상기 여과된 배양 배지를 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM Tris-Cl(pH7.5), 100 mM NaCl로 20배 컬럼 부피만큼 세척하고, 10배 컬럼 부피의 50 mM Na-citrate 완충 용액(pH5.0)로 불순물을 세척하였다. 5 mM Na-citrate 10 mM NaCl 완충 용액 (pH3.4)로 항체를 용출시켜 1M Tris-HCl완충 용액(pH 8.0)으로 중화시켰다.
2차 정제는 HiLoad TM 26/60 Superdex 200 Prep grade GL(GE healthcare)를 사용하여 아바스틴-DLL4 BsAb 이중표적 항체의 침전물(Aggregation)을 제거하는 정제과정을 수행하였다. 컬럼을 50mM Na-Phosphate 완충 용액(pH6.0), 20mM L-Arg 로 2배 컬럼부피만큼 평형화시킨 뒤 1차 정제 완료된 아바스틴-DLL4 BsAb 이중표적 항체를 흘려 크기에 따른 분리 정제를 수행하였다.
상기 컬럼을 이용하여 분리 정제한 분획물들을 SDS-PAGE로 분석(도 2)하여, 양성 분획물을 모아서 원심분리형 농축기(아미콘 울트라, Amicon Ultra, 30,000 MWCO, Millipore)로 농축시켰다. 동일 원심분리형 농축기를 사용하여 인산화 제형 완충 용액으로 완충제 교환 및 농축을 실시하였다. 마지막으로, 항체를 0.22 ㎛ 공극 직경의 시린지 필터로 멸균 여과하고, 흡광도(A280)를 측정하여 항체 농도를 결정하였다.
실시예 2: ELISA 를 통한 이중표적 단백질의 DLL4 와 VEGF 에 대한 결합력 분석
항 DLL4, 항 VEGF 이중표적 단백질에 대해 ELISA 기반 용액 발색 시험을 사용하여 이중표적 단백질의 결합력를 평가하였다. 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)를 4 ℃에서 밤새 50 ng/㎖ 농도의 hVEGF(R&D systems, cat: 293-VE) 및 200 ng/㎖ 농도의 rhDLL4(R&D systems, cat: 1506-D4/CF)로 웰당 100 ㎕씩 코팅한 후, 비특이적 결합부위를 BSA로 2시간 동안 차단시겼다. 96-웰 미세역가 플레이트 상에서 항체를 128 nM 및 64 nM에서 1/5씩 희석을 진행하여 hDLL4 및 hVEGF 단백질로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 접종한 다음, 2시간 항온처리하고 0.05% 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하였다. 플레이트에 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP가 접합된 항 Fab 항체(Pierce, cat: 31414)를 1: 40000으로 희석하여 세척된 96웰 플레이트에 처리한 다음, 1시간 동안 37 ℃에서 반응시킨 후, 비색용 기질(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich)을 사용하여 발색시키고, 효소반응을 0.5 mol/ℓ 황산으로 중지시켰다. 흡광도는 SpectraMax 190(molecular Devices)기기를 이용하여 450 nm의 파장에서 측정하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 이중표적 단백질이 표적인 VEGF 및 DLL4에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 3: DLL4 / VEGF 이중표적 단백질의 DLL4 와 VEGF 에 대한 평형 해리 상수 ( K D ) 분석 어세이
상기 실시예 1에서 분리 정제된 이중표적 단백질(이중 항체)을 아바스틴-DLL4 BsAb로 명명하고, 분리 정제된 항체의 항원에 대한 친화도를 다음과 같이 분석하였다. 아바스틴-DLL4 BsAb 이중표적 항체의 DLL4와 VEGF 에 대한 결합능 차이를 알아보기 위하여 BIACORE 어세이를 실시하였다.
SPR 분석은 T200을 사용하였고, running buffer는 HBS-EP(10 mM HEPES, pH7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.15% surfactant P20)를 사용하였다. 표면 준비는 wizard program의 surface preparation_target immobilization (condition: 25℃, 5 ㎕/min)을 이용하여 리간드인 hVEGF와 hDLL4를 10 mM 소듐아세테이트(sodium acetate) 완충 용액 (pH 4.5) 에 각각 5 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖이 되도록 희석하여 CM5 칩 표면에 각 실험이 목표로 하는 타겟 고정화 레벨만큼 고정시켰다. 고정화는 2개의 유로 (Fc, flow cell)가 하나의 셋트로 진행되며 본 실험에서 첫번째, 세번째 유로는 blank, 두번째 유로는 hVEGF로 고정화하였고 네번째 유로는 hDLL4로 지정하였다. 첫번째, 세번째 유로는 비특이적인 결합 및 버퍼에 의한 변화 수치를 보이는 reference로 실험 결과는 Fc2-Fc1, Fc4-Fc3 의 수치를 사용하였다. hVEGF, hDLL4와 결합하는 물질로 아바스틴-DLL4 BsAb이중표적 항체를 몰농도로 환산하여 running buffer로 100 nM로 희석한 뒤, 1/2 연속 희석하여 5 농도 구간에서 분석하였다. 분석 시료는 최소 희석 배수 100 이상이 되도록 고순도/고농도로 준비하여 완충액 변화에 의한 영향(Buffer effect)을 최소화하였다. 모든 분석은 Wizard 프로그램을 이용하여 한 시료에 대하여 2 배수로 진행되었으며 모든 분석 간에는 재활성화 단계(regeneration step)를 두어 실험의 기준선이 일정하게 유지될 수 있도록 하였다.
결과는 Biaevaluation software 4.0 version으로 분석하였다. Fc2-Fc1, Fc4-Fc3 결과에서 baseline을 0으로 설정 후 완충액 주입(analyte 0 nM) 부분을 전체 sensorgram에서 뺀 후에 결과를 Bivalent binding model을 사용하여 결합친화도 분석을 하였다. 분석 항목은 Ka(M-1s-1), Kd(s-1), KD(M)이다. Ka는 친화도(recognition)를 나타내는 결합 상수(association constant)이고, Kd는 안전성 (stability)을 나타내는 해리 상수(dissociation constant)이다.
하기 표 2에 이중표적 단백질의 hVEGF에 대한 결합능 분석 결과를 나타내었으며, 하기 표 3에 이중표적 단백질의 hDLL4에 대한 결합능 분석 결과를 나타내었다.
항체 Ka(M-1S-1) Kd(S-1) KD
아바스틴-DLL4 BsAb 1.34E04 1.68E-06 1.26E-10
항체 Ka(M-1S-1) Kd(S-1) KD
아바스틴-DLL4 BsAb 1.94E04 5.87E-04 3.02E-08
상기 표 2 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 평형해리상수인 KD(M)는 kd/ka로 환산하였다. hVEGF에 대한 결합능 분석결과, KD값이 0.126 nM 수준으로 아바스틴 IgG의 평형해리상수와 유사한 값을 얻었고(도 4a 및 표 2) hDLL4에 대한 결합능 분석 결과, KD값이 30 nM 수준의 값을 얻었다(도 4b 및 표 3). 이는 본 발명의 이중표적 단백질이 각각의 항원에 대한 결합능이 방해받지 않고 높은 수준을 유지한다는 것을 시사한다.
실시예 4: DLL4 / VEGF 이중표적 단백질의 중화효과 어세이
상기 아바스틴-DLL4 BsAb이중표적 항체에 대해 ELISA-기반 용액 경쟁실험을 통하여 중화효과를 평가하였다. 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY)에 PBS로 희석된 500 ng/㎖ 농도의 hNotch-1-hFc 단백질(R&D systems)을 웰당 100㎕씩 첨가한 후 4℃에서 밤새 코팅한 다음, BSA로 2시간 동안 처리하여 비특이적 결합부위를 차단시켰다.
96-웰 미세역가 플레이트 상에서 아바스틴-DLL4 BsAb 이중표적 항체(정제된 단백질)를 0 nM 내지 140 nM 범위의 농도에서 항체를 항원 단백질(인간 DLL4-His, 600 ng/mL)의 계열 희석액과 예비 혼합시켰다. 상기 항원과 항체를 30분간 항온처리한 후에 유리 항체의 측정을 위해서 상기 혼합 용액을 DLL4 수용체인 hNotch-1-hFc 단백질로 미리 코팅(50 ng/well)된 미세역가 플레이트에 옮겼다.
그 다음, 상기 플레이트를 2시간 항온처리하고 0.05% 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5번 세척하고, 플레이트에 결합된 DLL4 항원을 HRP-접합된 His 항-마우스 IgG 다클론 항체 시약(Roche applied science)으로 검출하기 위해 1:800 비율로 상기 HRP-접합된 His 항-마우스 IgG 다클론 항체를 세척된 미세역가 플레이트에 처리한 다음, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 비색용 기질 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; Sigma-Aldrich co.)을 사용하여 발색시키고, 효소반응을 0.5mol/l 황산으로 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 기록하여 그 결과를 도 5에 나타내었으며, 플레이트-코팅된 hNotch-1-hFc 단백질에 결합된 인간 DLL4-His의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 양(IC50)을 하기 표 4에 나타내었다.
클론 IC50(nM)
VEGF-DLL4 BsAb 1.12
상기 표 4과 같이, 본 발명의 이중표적 단백질은 DLL4에 대하여 1.12nM의 낮은 IC50값을 가져, 단독 항-DLL4 항체에 못지 않은 DLL4 저해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 5: 가교화 반응과 질량분석 통한 에피토프 지도 작성
복수의 불연속적인 서열로 구성된, 그러나 입체구조적으로 단일한 분자표면을 형성하는 구조적 에피토프를 규명하기 위하여 가교화 반응과 질량분석을 통한 가교화 반응의 위치 확인하는 기법을 사용하였다.
실시예 5-1: 가교화 복합체의 형성
항원 단백질 인간 델타 유사 리간드 4(human DLL4, hDLL4, R&D Systems) 와 실시예 1-3의 MLCK2 항체를 몰비가 2:1 되도록 혼합한 다음 K200 크로스링커(CovalX AG.)를 최종농도 0.2 mg/ml이 되도록 넣어주었다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 반응시켜 항원-항체 복합체를 만든 후 Ultraflex II MALDI ToF(Bruker Daltonics) 장비를 이용하여 반응 생성물의 분자량을 분석하였다. 도 6에 나타난 바와 같이 크로스링커를 사용하지 않은 대조 실험에 비해 크로스링커를 사용한 경우 인간 DLL4와 MLCK2 항체간의 1:1 및 2:1 복합체가 형성되었음을 알 수 있었다. 반면, 인간 DLL4 혹은 MLCK2 항체 단독으로 크로스링커와 반응시켰을 경우에는 어떠한 다량체나 복합체도 검출되지 않았으며, 이로부터 상기 인간 DLL4 및 MLCK2 항체 복합체 형성이 상호 특이적인 반응임을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 가수분해효소에 의한 단편의 형성
가교화된 펩타이드 절편을 구분해 내기 위해서 중수소로 표지되어 있지 않은 d0-DSS(disuccinimidyl suberate)와 12개의 중수소로 표지된 d12-DSS를 1:1로 섞고 DMF로 녹여 2 mg/ml 용액을 만들었다. 이 용액을 인간 DLL4: MLCK2 = 2:1 혼합용액에 최종농도 0.2 mg/ml이 되게 넣고 상온에서 3시간 동안 가교화 반응을 시켰다. 반응물은 효과적인 분해반응을 위해 DTT(dithiothreitol)와 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 이용하여 환원 및 알킬화를 시켜 변성시켰고 트립신, 알파-카이모트립신, ASP-N 프로테아제 등의 단백질 가수분해 효소를 각각 사용하여 단편화를 시켰다. 생성된 단편화 반응물은 Ultimate 3000 nano-liquid 크로마토그래피 시스템(Dionex) 과 LTQ Orbitrap XL 질량분석기(Thermo)를 통해 질량분석을 하였고 얻어진 질량분석 데이터는 Xquest(버전 2.0) 소프트웨어, Stavrox (버전 2.1) 소프트웨어를 통해 가교화된 펩타이드 쌍을 분별해냈다. 그 결과 표 5에 나타난 바와 같이 hDLL4과 MLCK2 사이의 가교화된 펩타이드 쌍을 검출할 수 있었다.
인간 DLL4상의 가교화 반응이 일어난 지점은 59, 63, 64 및 110 번 아미노산 잔기였으며 이들 잔기를 포함하는 [58-65, FRVCLKHF](서열번호 22) 및 [110-115,TWPGTF] (서열번호 23) 두 단편은 인간 DLL4 C2 도메인(27-174) 모델상에서 도 7에서 보이는 바와 같이 연속된 분자표면을 구성하고 있어 이 두 서열을 MLCK2 항체에 대한 인간 DLL4의 에피토프로 추정할 수 있었다.
Figure 112014064240926-pat00001
실시예 6: 웨스턴블랏팅을 통한 에피토프 지도 확인
인간 DLL4의 알라닌 치환 돌연변이체 패널을 다음과 같이 제조하였는데 이러한 패널에서 인간 DLL4 세포외 단백질 영역의 64번(Histidine, 히스티딘), 65번(phenylalanine, 페닐알라닌) 및 69번(Valine, 발린) 아미노산을 각각의 아미노산을 알라닌(Alanine)으로 치환하였다. 알라닌 치환 돌연변이체를 위한 발현 벡터는 상기 실시예 1-1에 나타낸 바와 같이 DLL4 세포외 도메인의 특정 영역에 대한 항원 제조에 사용한 벡터를 이용하였다. 구체적으로 상기 벡터는 인간 DLL4 특정영역의 아미노산 27 내지 아미노산 251의 유전자를 포함하는 벡터이며, 이 영역은 Notch1 수용체와 결합하는 것으로 알려진 "DSL(델타/세레이트(Serrate)/lag-2)" 도메인으로 칭해지는 모티프를 함유한다.
표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, Fc 단백질에 융합된 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편(아미노산 27 내지 251)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 CMV 프로모터를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 벡터를 제조하였다. 이 벡터에서 아미노산 64번, 65번 및 69번을 각각 알라닌(Alanine)으로 치환할 수 있도록 재조합 DNA 기술(QuikChange Site-Directed Mutagenesis, Agilent) 을 활용하였으며, 돌연변이체를 HEK293E 동물세포에 리포펙타민 2000(인비트로젠, Invitrogen)을 사용하여 트렌스펙션을 시키고 4 일간 배양한 후 발현배지를 수득하였다. 이때 대조군으로 야생형(Wild type) DLL4의 세포외 도메인의 결실단편 (아미노산 27 내지 251)을 코딩하는 단백질을 사용하였다.
4 일간 배양한 돌연변이체 발현 배지를 1000 rpm, 상온에서 10분간 원심 분리하여 부유물을 제거한 후 0.45 μm 시린지여과(syringe filtration)하였다. 웨스턴 블랏팅 실험을 위해 돌연변이체 발현 배지에서의 발현 정도를 Octet system(ForteBio)을 사용하여 정량하였고, 이를 이용하여 SDS-Gel 로딩시 일정한 단백질 양이 되도록 하였다. 이후 Novex 4~12% Bis/Tris 젤에 동일하게 돌연변이체 발현 배지 20 μl씩 2개의 젤에 로딩하고 MOPS 완충액을 사용, 140V로 50분간 젤 전기영동을 수행하였다. 이때 대조군으로 야생형의 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편(아미노산 27 내지 251)을 코딩하는 단백질을 사용하였다. 전기영동이 끝난 후 폴리비닐리덴디플루오라이드 막으로 단백질 밴드를 트랜스퍼(transfer) 하였다. 총 2개의 방법으로 진행하는데, 하나는 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편 (아미노산 27 내지 251)의 SDS-Gel 로딩시 일정한 양의 돌연변이 및 야생형 단백질들을 로딩했는지 확인하기 위하여 HRP-컨쥬게이션 된 항 인간 Fc 항체 (1:10000)(Pierce cat: 31413)를 활용하여 트랜스퍼된 막에 결합을 시킨 후 PBS-T로 3번 세척을 진행하였고, 또 다른 하나는 돌연변이체에 대한 MLCK2 항체의 결합력을 알아보기 위해 MLCK2 항체(1μg/mL)를 트랜스퍼된 막에 결합을 1차 시키고, PBS-T로 3번 세척한 후 다시 HRP-컨쥬게이션 된 항 인간 Fab 항체(1:10000)을 이용하여 2차 결합을 시키고 PBS-T로 3번 세척하였다. 그 다음에 막을 ECL 및 웨스턴블랏팅 검출 시약(GE Healthcare)을 사용하여 진행하였다. 그 후 막에 Amersham ECL 웨스턴블랏팅 검출 시약(GE Healthcare)을 도포하고 ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare) 장비를 사용하여 신호를 검출하였다.
도 8에 나타난 바와 같이 웨스턴블랏팅 분석 결과를 토대로 보면, 야생형 및 DLL4의 세포외 도메인의 결실단편(아미노산 27 내지 251)을 코딩하는 돌연변이 단백질들을 일정한 양으로 로딩하였음을 확인하였다. 또한, MLCK2 항체의 돌연변이체에 대한 결합력을 확인하였을 때, 64번 아미노산 돌연변이체의 경우 MLCK2 항체의 결합력이 상실되었으며, 65번 아미노산 돌연변이체도 MLCK2 항체의 결합력이 현저하게 낮아진 것을 알 수 있었다. 또한, 69번 아미노산 돌연변이체의 경우에는 MLCK2항체의 결합력에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실시예 7: DLL4 / VEGF 이중 항체의 혈관내피세포( HUVEC ) 증식에 대한 영향 분석
DLL4와 VEGF에 결합하는 이중 항체의 혈관내피세포(HUVEC) 증식에 대한 영향을 분석하기 위하여 혈관 내피세포(HUVEC, Human umbilical vein endothelial cell)을 Lonza사에서 구매하여 실험에 사용하였다.
HUVEC의 배양은 1% 젤라틴(Sigma)이 용해된 PBS 완충 용액(Gibco)으로 T-플라스크(Nunc)를 상온에서 4~6 시간 코팅시킨 후 PBS로 세척하여 사용하였다. 사용된 배지는 EGM-2 Single Quot(Lonza)가 포함된 EBM-2(Lonza)로 세포의 배양은 밀집도가 80%가 넘지 않는 한도에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 계대배양을 진행하였고, 패시지(passage) 6 이내의 세포들을 이용하여 실험하였다.
혈관 내피 세포 증식 어세이(HUVEC proliferation assay)는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. hDLL4가 코팅된 플레이트를 준비하기 위하여, 실험 전날 96웰 플레이트(BD)에 rhDLL4(R&D systems)를 1 mg/mL로 Carbonate 완충 용액을 사용하여 희석시킨 후 100 mL/웰로 접종하여 4 ℃ 에서 밤샘 정치시켜 놓았다. 또한, HUVEC은 0.1% FBS가 첨가된 EBM-2 최소배지에서 24 시간 동안 방치하여 혈청에 의한 효과를 최소화하고자 하였다. 실험당일 rhDLL4가 코팅된 플레이트는 각각의 웰을 PBS로 2회 세척 후, 각각의 실험군 별로 hVEGF(50 ng/mL), 항체(아바스틴: 20 mg/mL, DLL4 단독 항체: 20 mg/mL, 아바스틴-DLL4 BsAb 이중 항체: 26 mg/mL)를 앞서 사용한 EBM-2 최소 배지로 희석하여 처리(triplicate)하고 상온에서 20분간 정치시켰다. 전날부터 24 시간 동안 굶주림된 HUVEC은 단일 세포화시킨 후, EBM-2 최소배지를 사용하여 4 x103 cells/웰이 되도록 희석하여 항체가 처리된 웰에 접종하여 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 정치하였다. 세포증식이 종료되었을 때 cell counting kit-8(CCK-8, Dojino)를 각 웰에 10 mL씩 처리하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5시간 동안 정치하였다. SpectraMax 190(molecular Devices)기기를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식 정도를 각 군별로 비교하였다(도 9).
도 9의 모든 도면 (PBS 처리군)에서 보여주듯이, DLL4/Notch 신호 전달이 활성화 되면 혈관 내피 세포의 증식이 약 30% 정도 억제가 되며 이는 VEGF 에 의해 혈관 내피 세포 증식이 활성화되는 작용과 반대되는 현상이라 할 수 있다. In vivo 기전 역시, 앞서 설명하였듯이 VEGF 항체는 종양의 혈관 형성이 억제되어 종양 성장과 전이를 막는 반면에 DLL4 항체는 종양의 비정상적 혈관(비활성형 혈관) 생성을 과도하게 유도함으로써 종양의 성장을 억제하는 것으로 밝혀져 있으며 도 9의 결과는 VEGF 와 DLL4 의 서로 다른 신생 혈관 형성 작용 기전을 in vitro 에서 반영하고 있다고 할 수 있다.
도 9a에서 확인할 수 있듯이, 혈관 내피 세포의 증식에 중요한 역할을 하는 VEGF와 그 수용체, VEGFR의 신호 전달 경로를 VEGF-targeting 항체(아바스틴, Avastin)를 처리할 경우 DLL4의 존재 유무에 관계없이 농도 의존적으로 혈관 내피 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 반면, 도 9b 의 경우, DLL4 단독 항체를 처리한 실험 결과로 DLL4 가 존재하지 않는 실험군에서는 항체 처리 농도에 관계없이 혈관 내피 세포의 증식에 별다른 영향을 주지 않았으며, DLL4가 있는 실험군에서는 DLL4 항체 처리 농도에 의존적으로 혈관 내피 세포의 증식이 다시 재개되는 현상을 밝혀내었다. 이중표적 단백질을 처리한 경우는 DLL4가 존재하지 않는 실험군에서는 아바스틴 항체 처리와 유사한 증식 억제 효능을 보여주었으나 (도 9c, 청색 막대) DLL4 가 존재하는 실험군에서는 아바스틴 대비 혈관 증식 억제 효능이 줄어들어 있음을 확인 할 수 있었다 (도 9a, 9c, 적색 막대).
DLL4 처리군에서 VEGF 단독 항체 처리만큼의 증식 억제 효과를 보여주지 않았다는 것은 본 발명의 이중 항체가 VEGF 및 DLL4 의 신호 전달 체계를 모두 효과적으로 억제하고 있다는 실험 결과로 해석할 수 있다.
실시예 8: DLL4 / VEGF 이중 항체의 DLL4 / Notch 및 VEGF / VEGFR 신호 전달 경로 억제활성 분석
DLL4와 VEGF에 결합하는 이중 항체의 DLL4/Notch 및 VEGF/VEGFR 신호 전달 경로 억제 활성을 알아보기 위하여 실시예 4에 사용된 동일한 방법으로 HUVEC을 이용하였다. 실험 전날 6 웰 플레이트(BD)에 재조합 인간 DLL4(rhDLL4, recombinant human DLL4, R&D systems)를 1 mg/mL로 Carbonate 완충 용액을 사용희석시킨 후 1 mL/웰로 첨가한 다음 4 ℃에서 밤샘 정치시켰다. rhDLL4를 처리하지 않는 대조 실험군에는 Carbonate 완충 용액 단독으로 1 mL/웰로 처리하여 동일하게 4 ℃에서 밤새 정치시켰다. 다음날, 4 ℃ 냉장고에서 DLL4가 코팅된 플레이트를 꺼내어 PBS로 1회 세척한 후, EGM-2 배지를 각 웰에 1 mL씩 처리하고, 각 웰 별로 항체(아바스틴: 20 mg/mL, DBZ: 0.08mM, DLL4 단독 항체: 20 mg/mL, Oncomed 사 DLL4 단독 항체: 20 mg/mL, 아바스틴-DLL4 BsAb 이중 항체: 26 mg/mL)를 처리하였다. 최종 배양액의 양은 2 mL이므로 항체 처리를 2배로 하여 상온에서 20분간 정치하였다. 항체 처리시간 동안 패시지 #2 내지 #5(passage #2 ~#5)의 75T 플레이트에서 배양된 HUVEC을 꺼내어 배지제거 후 단일세포화 시켰다. 원심분리 과정을 통하여 세포를 세척하고 신선한 EGM-2 배지를 사용하여 재부유시키고, 세포의 개수를 세어 5x 105 cells/mL로 희석한 다음 각각에 웰에 1 mL씩 접종하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻동안 배양하였다. 0.2% FBS가 포함된 EBM-2 최소배지를 준비하고, 하루동안 배양된 HUVEC의 각 웰에서 배지를 제거하고, PBS 1회 세척 후 0.2% FBS 가 포함된 EBM-2 최소배지를 2 mL 처리하였다. 또한, 각각의 well에 전날 처리한 동일한 농도의 항체(아바스틴: 20 mg/mL, DBZ: 0.08mM, DLL4 단독 항체: 20 mg/mL, Oncomed 사 DLL4 단독 항체: 20 mg/mL, 아바스틴-DLL4 BsAb 이중 항체: 26 mg/mL)를 처리하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하루동안 배양하였다. 항체가 처리된 HUVEC들의 각 웰에 hVEGF(R&D systems)를 100 ng/mL로 처리하고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5분간 반응시킨 다음 플레이트를 꺼내어 재빨리 배지를 버리고, PBS 1회 세척한 후, 세포용해완충 용액 (1% NP-40, 20mM Tris, 137mM NaCl, 10% Glycerol, 2mM EDTA, 1mM Sodium orthovanabate, 1x Protease & phosphatase inhibitor coctail)을 준비하여 각각의 웰에 150 mL를 첨가한 다음 고루 퍼지도록 흔들어 주었다.
이 플레이트를 얼음 위에 얹고 스크립퍼로 각각의 웰의 HUVEC들을 긁어 모은 후 1.5 mL 튜브에 모은 다음, 얼음에 정치시켜 놓았다. 5분 단위로 얼음에서 1.5 mL 튜브를 꺼내어 볼텍싱(Vortexing) 3회 후 다시 얼음에 담궈 놓아 세포용해를 진행한 다음, 이것을 원심분리(4 ℃, 14000rpm, 10분)하고 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 후 정량을 진행하고, 5x SDS sample buffer에섞고 100 ℃에서 10분간 끓인 후 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 준비된 단백질 시료를 4% to 12% bis-TRIS 젤을 통하여 SDS-PAGE를 진행하고 크기별로 분리시킨 후, NICD(Cell signaling), P-ERK(Cell signaling), ERK(Cell signaling), VEGFR2(Cell signaling), P-VEGFR2(Cell signaling),Actin(Santa Cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 진행하였다(도 10).
도 10과 같이, 본 발명의 이중표적 단백질은 DLL4/Notch 및 VEGF/VEGFR 신호 전달 경로를 각각의 단독 항체만큼이나 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9: 아바스틴 저항성을 가지는 인간 위암 세포주 이종이식 모델( Avastin - resistant human SCH gastric cancer xenograft model )에서의 이중 항체 항암 활성 분석
보고된 문헌에 의하면 SCH 인간 위암 세포주(human gastric cancer)는 아바스틴에 대해 내성을 가지고 있는 것으로 개시되어 있어, SCH 세포주를 이용한 누드 마우스 이종이식 모델(nude mouse xenograft model)에서 이중 항체의 항암 효능 시험을 수행하였다.
구체적으로는, 아바스틴 내성 SCH 위암 세포주를 암컷 누드 마우스(female nude mouse)에 접종한 후 종양 크기(tumor size)가 평균 200 mm3에 도달하였을 때 일주일에 1회 각 항체들을 투여하여 본 발명에 따른 이중 타겟 항체의 in vivo 항암 활성을 확인하였다 (도 11). 본 누드 마우스 이종이식 모델(Nude mouse xenograft model)의 in vivo 시험에서는 인간 DLL4를 표적하는 아바스틴-DLL4 이중 항체 대신에 인간 DLL4 에피토프(DSL 도메인)와 동일한 마우스 DLL4 에피토프(DSL 도메인)에 결합하는 이중 항체인 아바스틴-마우스 DLL4 surrogate 이중표적 단백질을 투여하여 이중 항체의 우수한 항암 효능 검증을 입증하였다.
도 11과 같이, 아바스틴에 대하여 내성을 가지는 위암 세포주에 대하여, 본 발명의 이중표적 단백질이 항암 효과를 현저히 증가시키는 것을 in vivo 실험으로 확인하였다.
실시예 10: 아바스틴 저항성을 가지는 인간 폐암 세포주 이종이식 모델 (Avastin-resistant human A549 lung cancer xenograft model )에서의 이중 항체 항암 활성 분석
A549 세포주를 누드 마우스에 접종한 후, 아바스틴(2.5 mg/kg/week)을 3개월간 처리하여 아바스틴 처리 후에도 종양의 크기가 줄어들지 않고, 종양이 성장하는 아바스틴 투여에 내성을 지닌 A549 암세포를 확보하였다. 이 종양을 떼어낸 다음 아바스틴 내성 A549 세포를 Ex - vivo 배양을 진행하여 이중 타겟 항체의 효능 분석을 위해 사용하였다.
구체적으로는, 아바스틴 내성 A549 폐암 세포주를 암컷 누드 마우스(female nude mouse)에 접종한 후 종양 크기가 평균 200 mm3에 도달하였을 때 일주일에 2회 각 항체들을 투여하여 이중 타겟 항체의 in vivo 항암 활성을 확인하였다(도 9). 아바스틴 저항성 A549 세포를 이용한 in vivo 시험에서도 인간 DLL4를 표적하는 아바스틴-DLL4 이중 항체 대신에 인간 DLL4 에피토프와 동일한 부위의 마우스 DLL4에 결합하는 이중 항체인 아바스틴-마우스 DLL4 surrogate 을 투여하여 이중 항체의 우수한 항암 효능 검증을 입증하였다.
도 12와 같이, 아바스틴에 대하여 내성을 가지는 폐암 세포주에 대하여, 본 발명의 이중표적 단백질이 항암 효과를 현저히 증가시키는 것을 in vivo 실험으로 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Novel double-targeting protein that specifically binds to Dll4 and VEGF and use thereof <130> PA130435-KR-P1 <150> KR 10-2013-0080523 <151> 2013-07-09 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 713 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avastin-anti-Dll4 BsAb VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Val Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Tyr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg His Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr 465 470 475 480 Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile 485 490 495 Gly Ser Asn Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro 500 505 510 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 515 520 525 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 530 535 540 Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp 545 550 555 560 Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val 565 570 575 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 595 600 605 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 610 615 620 Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 625 630 635 640 Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr 645 650 655 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 660 665 670 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 675 680 685 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Trp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 690 695 700 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-DLL4 VH CDR1 <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-DLL4 VH CDR2 <400> 3 Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala 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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 19 ggtggaggtg gcagcggtgg tggcggcagt cccggtggcg gctcc 45 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avastin-anti-Dll4 BsAb VL <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(685) <223> human DLL4 <400> 21 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hDLL4 epitope1 <400> 22 Phe Arg Val Cys Leu Lys His Phe 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hDLL4 epitope2 <400> 23 Thr Trp Pro Gly Thr Phe 1 5

Claims (24)

  1. DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질로,
    상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 이중표적 단백질.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 이중표적 단백질은 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF에 특이적으로 결합하고 IgG(Immuniglobulin G) 형태의 항체가 링커로 연결된 형태인, 이중표적 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커인, 이중표적 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 18의 펩타이드인 것인, 이중표적 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 서열번호 8로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 9로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이중표적 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하고,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 것인, 이중표적 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이중표적 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab)인 것인, 이중표적 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이중표적 단백질은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이중표적 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질은 전장 항체, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 또는 scFv(Single-chain variable fragment) 형태인 것인, 이중표적 단백질.
  12. 제1항, 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항의 벡터가 도입된 in vitro 형질전환체.
  15. (a) 제14항의 형질전환체를 배양하여 이중표적 단백질을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 생산된 이중표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, DLL4에 특이적으로 결합하는 단백질 및 VEGF(Vascular endotelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 이중표적 단백질의 제조방법.
  16. 제1항, 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중표적 단백질을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 및 다발성 골수종혈액암으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  18. 제1항, 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중표적 단백질을 포함하는, 암 진단용 조성물.
  19. (a) 제1항, 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중표적 단백질을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 시료의 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 VEGF 또는 DLL4 단백질의 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 암으로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법.
  20. 서열번호 21로 표시되는 DLL4(Delta-like ligand 4) 단백질의 아미노산 서열에서 58번 내지 65번 아미노산 서열 및 110번 내지 115번 아미노산 서열을 포함하는 DLL4의 입체형태적 에피토프에 결합하고, 서열번호 2로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체.
  21. 삭제
  22. 제20항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  24. 제23항의 벡터가 도입된 in vitro 형질전환체.
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