KR101592863B1

KR101592863B1 - 왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101592863B1
Application number: KR1020140046887A
Authority: KR
Inventors: 고희종; 박일화; 우미옥
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2016-02-11
Also published as: KR20150120784A

Abstract

본 발명은 왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킴으로써 왜성의 표현형을 갖는 식물체를 얻을 수 있어, 경제작물인 벼의 육종사업에서 수확량 증대를 위한 형질자원으로서 유용할 것으로 기대된다.

Description

왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도{D-h gene showing dwarf phenotype and uses thereof}

본 발명은 왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 왜성(dwarf) 표현형을 나타내는 돌연변이 벼(Oryza sativa) 유래의 D-h 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 D-h 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체 및 종자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 D-h 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 왜성 표현형을 갖는 식물체의 생산용 조성물에 관한 것이다.

왜성(dwarf)과 반왜성(semi-dwarf) 특성은 도복저항성과 많은 수확량을 위한 벼 육종에서 중요한 작물학적 형질이다. 육종 사업을 통한 왜성 유전자의 도입은 곡류의 '녹색혁명'에서 중요하다. 벼에서, 1960년대부터 개발되어 왔고, 열성 반왜성 유전자 1(sd1)을 가지는 반왜성 품종(semi-dwarf varieties)은 현저한 수확량 향상을 가져왔다.

식물체에서 왜성은 다양한 호르몬 결함에 의해 야기될 수 있으나, 많은 단간 유전자들이 이러한 식물 호르몬의 신호 전달과 생합성에 연관된 것으로 동정된 것으로부터, 브라시노스테로이드(brassinosteroids, BR)와 지베렐린(gibberellines, GA)의 결함에 관해서만 널리 연구되어 있다.

GA는 줄기 신장, 잎 분화, 광형태형성, 화분 발달 및 개화를 포함하는 식물 영양 발달과 번식 발달의 조절자 기능을 하는 디테르페노이드(deterpenoid) 화합물의 한 그룹이다. GA와 연관된 돌연변이체의 특징적인 표현형은 진한 녹색의 잎을 나타내지만 왜성을 제외하고 다른 이상 형태를 보이지 않는다. 식물 스테로이드 호르몬의 한 종류인 브라시노스테로이드(Brassinosteroids, BRs)는 세포분열, 세포 신장, 관다발 분화 및 스트레스 반응의 자극을 포함하는 식물 성장과 발달에서 많은 중요한 과정을 조절한다. BR-연관 돌연변이체는 일반적으로 빽빽한 성장, 진한 녹색, 직배치 잎, 변화된 기관 크기, 어둠에서 절간 신장 및 지연된 개화를 포함하는 다면 발현적 표현형을 나타낸다.

60개 이상의 왜성 돌연변이체가 벼(http://www.gramene.org/rice-mutant/)에서 보고되었다. 그러나, 이들의 다수는 열성 대립 형질에 의해 비실용적 다면 발현적 표현형 형질과 많은 재배 환경에 불리한 영향을 주는 방향으로 유발되었다. 그러므로, sd1와 이것의 대립형질적 돌연변이체만이 벼 육종에 널리 이용되어 오고 있다. 제한된 왜성화 자원의 광범위한 사용은 새로운 벼 품종을 위한 유전적 배경에서 병목효과를 야기할 수 있고, 새로운 유용한 왜성의 규명과 개발은, 그러므로 실용적 벼 육종을 위한 중요한 과제이다.

벼 육종 사업으로 왜성화 유전자의 통합은 F1 교잡에서의 형질의 차폐(masking)를 피할 수 있는 우성 대립유전자의 사용으로 용이해질 수 있다. D53, Ssil, Sdd (t), Dx, TID1, LB4D, Slr -d와 본 발명에서 화학적 돌연변이 유발원을 사용하여 개발된 D-h를 포함하는 몇몇 우성 혹은 반-우성 벼 돌연변이체는 앞서 보고되어 왔다(Liang F et al., 2011, Journal of integrative plant biology, 53:312-323). D-h는 짧고 촘촘한 꽃차례와 작고 둥근 낱알의 특징이 있는데, 이 모두는 단일 우성 대립유전자에 의해 조절되는 듯하다. 본 발명에서, D-h 유전자의 유전자 지도에 근거한 분리와 d-h에 일치하는 영역에서 63bp 결손을 확인했다. 이 유전자의 동정과 유전자의 돌연변이체는 작고 둥근 낱알과 반왜성 표현형에 기능을 하는 새로운 기능적 단백질의 분리를 유도할 수 있을 것이다.

한국등록특허 제0953762호에는 '벼에서 분리된 병 저항성 증진 및 단간 유도 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체, 및 이 형질전환체의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1170348호에는 '단간형의 식미 특성이 개선된 벼 신품종 변종식물 '진상''이 개시되어 있으나, 본 발명의 왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 정밀 유전자지도 작성을 통해 왜성을 나타내는 돌연변이 벼 유래의 D-h 유전자에 야생형의 d-h 유전자에 비해 63bp의 염기서열의 결손 및 단일염기의 치환이 존재하며, D-h 유전자를 과발현시킨 식물체에서 왜성이 나타나는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 왜성(dwarf) 표현형을 나타내는 돌연변이 벼(Oryza sativa) 유래의 D-h 단백질 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 D-h 단백질을 코딩하는 D-h 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 D-h 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 왜성 표현형을 갖는 식물체의 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 벼 유래 돌연변이 D-h 유전자는 벼에 왜성 표현형을 나타내는 유전자로서, 본 발명의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환 시킴으로써 왜성의 표현형을 갖는 식물체를 얻을 수 있어, 경제작물인 벼의 육종사업에서 수확량 증대를 위한 왜성 형질 유전자원으로서 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 돌연변이체 HD1 및 야생형 벼의 특성을 나타낸 것이다. (a); 초장 표현형(바=5㎝), (b); 등숙기 3주 후(바=20㎝), (c); 성숙된 이삭과 종자(하위 바=5㎝, 상위 바=5㎜), (d); 절간 길이, (e); 첫 번째 절간에서 유조직 세포(바=50㎛), (f); 세포길이와 너비의 정량적 측정, (g); GA₃ 반응에서 두번째 잎 집의 신장, (h); GA에 의한 α-아밀라아제 활성의 유도.
도 2는 D-h 유전자 위치와 연관된 클로닝을 나타낸 것이다. (a); STS 마커로 그린 D-h 유전자의 유전적 지도, (b); 추가적인 STS 마커로 그린 D-h 유전자의 정밀지도, (c); 정밀지도에 의해 확인된 48kb의 유전적 DNA 영역 내 후보 유전자, (d); InDel 마커 InDel(표 1의 서열번호 27 및 28)을 사용한 HD1과 화청벼 교잡의 F2 식물에서의 공동분리. 583bp의 PCR 산물은 큰 동형접합체에서 관찰된 반면, 짧은 520bp의 PCR 산물은 왜성 동형접합체에서 관찰되었다. 왜성 이형접합체에서 두 조각 모두 관찰됨. 레인 1; 화청, 레인 2; HD1, 레인 3; HD1과 화청 교잡의 F1, 레인 4-19; 왜성 표현형, 레인 20-34; 키가 큰 표현형. (e); HD1과 일반적인 간장길이를 지니는 33개 벼 품종 중 STS 마커 S10460의 유전형.
도 3은 d-h 및 D-h의 cDNA 염기서열과 예상 아미노산 서열의 비교를 나타낸 것이다. (a); cDNA 염기서열의 비교, (b); RT-PCR 산물의 전기영동도, (c); 옥수수, 수수, 보리 유전자로부터 추정 단백질(hypothetical protein)과 예상된 d-h 단백질의 정렬.
도 4는 과생산 돌연변이 D-h 단백질 형질전환 식물체(우측)와 야생형(좌측)의 성장 형태(바=20㎝)를 나타낸 것이다.
도 5는 D-h 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다. (a); 기관에서 정량적 RT-PCR, (b); 기관에서 반 정량적 RT-PCR, (c)-(i); D-h 프로모터::GUS 형질전환 식물체에서 검출된 GUS 활성.
도 6은 형질전환된 양파 표피세포에서 D-h-GFP 융합 단백질의 세포내 위치를 나타낸 것이다. (a) 및 (b); CaMV35S::GFP 대조구 발현, (c) 및 (d); CaMV35S::d-h-GFP 발현, (e) 및 (f); CaMV35S::D-h-GFP 발현(바=50㎛).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 왜성(dwarf) 표현형을 나타내는 돌연변이 벼(Oryza sativa) 유래의 D-h 단백질 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 D-h 단백질에서, 상기 돌연변이 벼는 야생의 벼에 N-메틸-N-니트로소우레아(N-metyl-N-nitrosourea, MNU)를 처리하여 유도한 돌연변이 벼 HD1을 의미하는 것이다.

본 발명에 따른 D-h 단백질에서, 상기 왜성 표현형은 작은 키, 짧은 절 길이, 작은 크기 이삭 또는 작은 크기 낱알 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 D-h 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 유전자는 N-메틸-N-니트로소우레아(N-metyl-N-nitrosourea, MNU) 처리에 의한 돌연변이 벼 HD1에서 분리된 것이며, 본 발명에서 STS 마커를 이용한 상기 유전자 영역의 정밀유전자지도 작성을 통해 야생형의 d-h 유전자에 비해 상기 유전자가 63bp의 결손 및 단일 염기 치환이 있음을 확인하였다.

본 발명의 유전자는 D-h 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 D-h 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 D-h 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에서 바람직한 베이너리 벡터는 pMDC83, pH7GWIWG(Ⅱ) 또는 pHGWFS7일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이럿, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 유비퀴틴(Ubiquitin) 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmyl A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 식물체 내로 운반하는 방법은, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환 식물체에 있어서, 상기 왜성 표현형은 작은 키, 짧은 절 길이, 작은 크기 이삭 또는 작은 크기 낱알 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환 식물체에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 D-h 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 왜소형 표현형을 갖는 식물체의 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 상기 D-h 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 돌연변이 벼 유래의 D-h 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물의 왜성 표현형을 나타낼 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물체

우성 왜성 돌연변이체 라인은 자포니카 벼 재배종 야생형 화청(Hwacheong, WT)에 N-메틸-N-니트로소우레아(N-metyl-N-nitrosourea, MNU)를 사용한 화학적 돌연변이에 의해 생산되었고, 고정된 라인을 얻기 위하여 온실 및/또는 포장에서 여러 세대 동안 재배되었다. 본 발명에 사용된 HD1으로 지정된 왜성 화청 돌연변이체의 종자는 M13세대로부터 얻어졌다. HD1(MT)는 밀양 23(인디카, PI 464609), 테텝(인디카, PI 431324) 및 화청(자포니카)와 교배되었다. HD1×밀양23 및 HD1×테텝의 F2 집단 두 개와 HD1과 밀양23 사이의 교잡으로부터 분리된 F3 라인의 세 개가 유전자 클로닝 및 정밀 맵핑에 사용되었다. 선별된 F2 식물체의 이형접합성을 확인하기 위해, F3 자손이 표현형 분리에 관찰되었다. HD1과 야생형 화청벼 사이 교잡으로부터 F2 군집이 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 마커 분석에 사용되었다. 유전자 클로닝을 위한 모든 식물체들은 수원에 있는 서울대학교 실험 농장에서 2007년, 2008년 및 2009년에 걸쳐 재배되었다.

α- 아밀라아제 활성 시험

열 개의 배가 없는 반립 종자는 껍질을 벗겨, 표면을 3% 차아염소산나트륨 용액으로 30분간 소독했고, 세 번 수세하였다. 반립 종자는 10mM 아세트산나트륨과 pH 5.3의 2mM CaCl₂를 포함하는 2% 아가배지에 올려놓았다. GA 공급은 0~10^-4M의 GA₃을 첨가하여 이루어졌다. α-아밀라아제의 활성은 오카모토와 아카자와의 방법(T OKaA, 1978, Agricultural and Biological Chemistry, 42:1379-1384)을 조금 변형한 방법을 사용하여 측정되었다. 특히, 배지는 4일 동안 30℃의 암상태에서 배양되었고, 요오드 증기로 포화된 박스에 놓여졌다. α-아밀라아제가 합성되고 분비된 반립 종자는 플레이트 위 그들 주변의 클리어존으로 구분되었고, 그들의 분비된 α-아밀라아제에 의한 전분의 분해를 야기했다.

신초 신장에서 GA 의 유도

두 번째 잎집 신장에서 GA의 역할을 조사하기 위해서, 10개의 벼 종자는 3% 차아염소산나트륨으로 30분 동안 소독되고, 멸균수에 5번 헹궈졌고, 2일 동안 30℃에서 배양되었다. 종자는 다양한 농도의 GA가 포함된　아가 배지에 올려 지속적인 광이 있는 상태에서 30℃에 배양되었다. 배양 6일 후에, 두 번째 잎의 길이가 측정되었다.

조직의 파라핀 고정 절편

파라핀 절편을 위해, 조직을 앞서 기술한 방법(Piao R 등, 2009, Theoretical and applied genetic, 119:1497-1506)대로 약간 변형하여 준비하였다. 잎, 줄기, 뿌리, 이삭이 등숙기에 수확되었다. 시료는 로타리 마이크로톰을 사용하여 10㎛ 두께로 절단되었다. 준비된 시료는 100배 확대율에서 광학현미경하에 관찰되었다.

물리적 맵핑을 위한 PCR -기반 마커 및 InDel 마커 분석

정밀 맵핑을 위하여, 12개 STS(sequence-tagged site) 마커는 인디카와 자포니카 벼 아종(인디카를 위한 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 및 자포니카를 위한 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/) 사이에 DNA 염기서열 차이에 기초하여 개발되었다. InDel 마커는 원조 화청과 HD1 사이에 후보유전자의 염기서열 정렬에 기초하여 개발되었다. 본 발명에 사용된 InDel 마커와 STS 마커의 프라이머 염기서열은 표 1에 나열되었다. 연관 분석은 MAPMAKER 버전 3과 QTL Mapper 2.0을 사용하여 수행되었다.

STS 마커 및 InDel 마커

마커		정방향(5'-3')	서열 번호	역방향(5'-3')	서열 번호
STS	1013.1-1	TTTCTTTAGCTCCGCCTTGA	3	CTTTCGCACAAGGACGTG	4
	1022.6-1	CATGGATGATGCTTCCCTCT	5	TTGACAGTGGCTCCACAAAG	6
	1024.0-1	TTCAGAGCAGCAGAGCATGT	7	TTTTTCACCATTTCTTTGCCTTA	8
	1027.3-2	GTGCTGTTCCATGCTCCAC	9	GGGGAGGGGTTAAGATGACT	10
	1027.3-1	AGCGGTAGTACCATCGGAGA	11	AGTACAGATGGAAAATCCAACG	12
	AP3105-1	TTTTAGGACGGAGGAAGTAACTTTT	13	TGGTGGAGAATTGTGATTGA	14
	D-h-4	TTGGCAAGAAAAGTTGACCA	15	CCAAACATTCGTTTCTGAGC	16
	D-h-3	AAGCTTATCCTGCCACTTTTT	17	TTTTGCATGTCTCCCTTTCC	18
	AP3197-1	AGCCGAGTTAGCATTTCAGC	19	TTCTTCACGAGCACACATCC	20
	1028.4-3	TCCTCGAGATTGGAGACAGC	21	CTCCAAATGCCGAGAAAATC	22
	1028.9-1	GATGAAACTCTGGGCAGGAA	23	CAGGAAACCCAAAATCCTGA	24
	1038.8	AAGTCTTGCAGACGACACCA	25	CAAAGCTGCCACTGATGAAA	26
InDel		GGAAGGGTGGAGGTAGAACC	27	TCTCTCTCTCCCTTGCCAAA	28

RACE - PCR

게놈 서열은 FGENESH와 GENESCAN을 사용하여 예상된 ORF로 검색되었다. 그 후, 추정의 ORF 서열이 BLAST를 사용한 GenBank 검색에 사용되었다. PCR에 의한 5'과 3' RACE(rapid amplification of cDNA ends)가 SMART RACE cDNA 증폭 키트를 사용하여 수행되었고, RNA는 야생형 및 HD1 화서에서 주형으로서 추출되었다. RACE는 제1가닥(first strand) cDNA 합성은 SMART 유니버셜 프라이머로 준비되었다. 유전자-특이적 프라이머 5-GSP1 및 5-GSP2는 5' RACE에 사용되었고, 3-GSP1 및 3-GSP2가 3' RACE에 사용되었다. 최종 RACE 산물은 서브클론(subcloned)되어 서열이 분석되었다.

RNA 분리 및 정량적 실시간 PCR

출수기에 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, USA)을 사용하여 야생형과 HD1의 다른 조직으로부터 총 RNA가 추출되었다. 총 RNA는 DNase(RNase-free DNase set, Takara, Japan)로 처리되어 Rever Tra Acc(R) qPCR RT 키트(Toyobo, Japan)로 역전사가 수행되었다. 사용된 프라이머는 표 2와 같으며, 실시간 PCR은 C1000 thermal cycler(Bio-Rad, USA)로 수행되었다.

실시간 PCR에 사용된 프라이머

DNA	Primer		서열번호
d-h	Forward	5'-GCGGCCGAGGACCGCGCCAT-3'	29
d-h	Reverse	5'-CTTTAAGCTCGGCGATCAATTAATC-3'	30
Actin	Forward	5'-TGTCATGGTTGGAATGGGCCA-3'	31
Actin	Reverse	5'-AGGCAGTCAGTCAGATCACGA-3'	32

D-h 단백질의 세포내 위치

야생형 및 HD1으로부터 D-h 유전자의 증폭된 예상의 코딩 영역이 PCR/GW/TOPO 벡터(인비트로젠)에 클론되었고, 그 후, pMDC83 게이트웨이 바이너리 벡터(binary vector)로 삽입되었다. 발현 구축물은 PDS-1000 헬륨 입자총을 사용하여 양파 상피세포로 처리되었다. 형질전환 24시간 후에, GFP 형광은 이미지 복원 현미경으로 조사되었다.

벡터 구축물과 벼 형질전환

과발현 벡터를 제조하기 위해, PCR 증폭된 야생형 및 HD1의 총 길이 cDNA를 KpnΙ과 XbaΙ로 절단하고 35S 프로모터 및 nos 터미네이터를 보유하는 pCAMBIA 1300 변형 벡터에 삽입하였다. 제조된 야생형의 cDNA 과발현 구축물은 35s::d-h-W로 나타내었고, 돌연변이체의 cDNA 구조는 35S::D-h-M으로 나타내었다. D-h 유전자 억제를 위한 RNAi::d-h-W 구축물을 생산하기 위해, d-h cDNA 염기서열 217부터 553 사이의 336bp의 조각을 pDONR201에 클로닝하고, 게이트웨이 BP와 LP 클로네이즈 효소 혼합물을 사용하여 센스와 안티센스 방향으로 바이너리 형질전환 벡터 pH7GWIWG(Ⅱ)로 클로닝시켰다. pH7GWIWG(Ⅱ)와 유도체는 하이그로마이신 저항성 유전자(Hyg)를 포함한다. 프로모터-GUS 분석을 위해, 게놈 염기서열이 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. D-h 프로모터 절편은 바이너리 벡터 pHGWFS7으로 클로닝되었다. 위 구축물을 가지는 형질전환 식물체가 야생형 동진(자포니카 품종) 종자와 HD1 종자를 사용하여 아그로박테리움-매개 동시 배양방법을 통해 제조되었다.

실시예 1. 우성 왜성 돌연변이체의 특징

야생형과 HD1 식물체의 형태는 도 1에 나타냈다(a-d). 돌연변이체는 묘목 시기와 등숙기에서 모두 야생형보다 작았다. 더욱이, 돌연변이체의 작은 이삭과 낱알은 조사한 모든 돌연변이체 군집에서 야생형의 것보다 현저히 짧았다(도 1C). 출수기에, HD1 식물체는 야생형 식물체 신장의 74~78%였다. 두 식물체 사이에 절간의 길이가 비교되었는데, HD1의 모든 절간이 야생형의 것들보다 더 짧았다. 벼 왜성 돌연변이체는 앞서 타케다에 의해 절간의 신장 패턴에 따라 N-, dn-, dm-, d6-, nl- 및 sh- 여섯 타입으로 분류되었다. 이들 중 dn-타입은 모든 절간의 길이가 감소하는 것으로 확인되므로, 이에 따르면 HD1은 dn-타입의 왜성 돌연변이체이다(도 1d).

줄기와 잎, 뿌리 단면의 현미경 관찰은 세포 및 조직의 전체 발달이 야생형과 HD1 사이의 현저한 차이가 없음을 보여주었다. 그러나 HD1에서 최상위 절간의 종단면은 야생형 식물의 것과 비교하여 줄어든 길이와 너비의 더 작아진 유조직 세포를 나타내었다(도 1e 및 f).

돌연변이 식물체의 왜성 표현형이 GA₃ 결핍 또는 무감각에 의해 야기된 것인지 확인하기 위해서, 두번째 잎집(leaf sheath) 성장 및 배유 α-아밀라아제 활성의 유도에서 외인성 GA의 영향을 조사하였다. 10^-9M 부터 10^-5M 사이의 다양한 농도의 GA₃가 야생형과 돌연변이 식물체에 적용되었다. 10^-7M과 10^-5M 농도 사이의 GA₃가 처리된 돌연변이 식물체에서 두번째 잎집의 길이에서 두드러진 증가가 관찰되었다. 그러나, 증가비율은 동일한 조건에서 야생형 잎집의 것과 현저하게 다르지 않았는데(도 1g), 이는 HD1의 왜성화(dwarfism)가 내인성의 GA 수준에서 결함과 연관되어 있지 않은 것을 나타낸다. GA 반응에서 D-h 유전자의 가능한 관련성을 더 밝히기 위하여, GA가 포함된 아가 배지 위의 야생형 및 돌연변이 무배 반립종자에서 α-아밀라아제 활성이 조사되었다. 야생형 무배 반립종자와 대조적으로, HD1은 GA처리에 대한 반응에서 어떠한 α-아밀라아제 활성도 보이지 않았으며, 이는 HD1이 GA 신호전달 경로에서 결함이 있을 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2. D-h 유전자의 분자적 클로닝

HD1은 화학적 돌연변이에 의해서 얻어졌고, 앞서 최초로 보고되었는데(Koh h HM, 1993, Rice Genetics Newsletters, 10:77-79), 이 보고에서는 왜성화에 더하여 짧은 이삭과 작고 둥근 낱알의 우성 표현형을 기술하였다. 이 원인이 되는 유전자는 벼에서 우성의 왜성 특징으로 앞서 보고된 유전자 위치와 다른 것이고, 그래서 D-h로 지정되었다. 본 발명에서, 우리는 HD1과 밀양23(인디카) 사이의 교잡으로부터 유도된 군집을 사용하여 D-h 위치를 맵핑하였다. 초기에 D-h 유전자는 집단분리분석(bulked segregant analysis, BSA)에 의해 염색체 1의 쇼트 암(short arm)까지 추적되었고, 그 위치와 연관된 S1022.6과 S1013 STS 마커가 확인되었다. 그 후, 801 F2 식물로부터 분리된 총 166개의 왜성 표현형은 주요 유전자 맵핑에 사용되었다. 연관 분석은 D-h 위치가 염색체 1에서 STS 마커 S1027.3과 S1028.9 사이에 위치한다는 것을 나타낸다(도 2a). D-h 위치의 맵핑을 더 수행하기 위해서, 원래의 F2 군집으로부터 유도된 큰 F3 군집과 HD1과 테텝(인디카) 사이에 교잡으로부터 유도된 다른 F2 군집이 사용되었다. 본 발명자는 D-h 위치와 근접하게 연결된 추가적인 마커를 확인하기 위해 벼 게놈 데이타베이스(인디카를 위한 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 와 자포니카를 위한 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp)를 사용하여 니폰베어(nipponbare, 자포니카)와 9311(인디카)의 타겟 영역의 제노믹 서열을 확인한 후에 여섯개의 STS 마커를 디자인했다. 8개의 마커를 사용한 차후 연관 분석과 1,839 F3과 F2는 D-h 유전자가 STS 마커 S3197-1과 D-h-3이 측면에 있다는 것을 나타냈다. 이 두 마커 사이의 물리적 거리는 니폰베어 백(BAC) 클론 AP003197에서 48kb였다(도 2b 및 c). 다섯 개의 예상된 유전자들은 이 영역에 위치되었다(도 2c).

D-h에 대한 최상의 후보를 찾기 위하여, 본 발명자는 HD1과 야생형에서 5개의 후보유전자 모두를 시퀀싱하고 그들을 공개적으로 이용 가능한 니폰베어 재배종의 서열과 일치하는 영역을 비교하였다. 야생형과 HD1 사이에 서열 차이가 LOC-Os1g10460(B1015E06.28)에서 영역의 예외로 표시되는 것은 없었다. 위치는 네 개의 엑손과 세 개의 인트론을 구성하는 3,113bp 유전자를 포함하는 것으로 예상되었다. 추정의 첫번째 엑손에서 203-265 뉴클레오타이드 사이의 63bp의 결손뿐만 아니라 동일 엑손 내에 다른 곳에서 단일 염기 치환이 HD1에서 발견되었다.

63bp 결손이 다른 품종에서 자연적 변이로서 존재하는지 조사하기 위하여, 30개의 대표적인 오리자 세티바(Oryza sativa)와 4개의 오리자 루피포곤(O. rufipogon) accession의 InDel 마커 분석을 수행했다. 이들 중 63bp의 결손을 보이는 것은 없었다. 더욱이, InDel 마커의 유전형이 F2 군집에서 왜성 표현형으로 동시 분리되었다는 것을 발견했는데(도 2d), 이는 LOC-Os01g10460 유전자에서 확인된 63bp 결손이 HD1 왜성 표현형에 영향을 준다는 것을 뒷받침해 주었다.

실시예 3. RACE - PCR 에 의한 D-h 유전자 전사 방향( orientation )의 확인

다수의 발현된 서열이 63bp 결손 서열을 오버랩핑(overlapping)하는 영역에서 확인되었다. D-h 유전자의 정확한 구조를 확인하기 위하여, 첫 번째로 FGENESH와 그 다음 GENESCAN이 컴퓨터 보조 유전자 예측(computer-aided gene prediction)에 의해 잠재적인 유전자 동정에 사용되었다. 정반대 방향(orientation)의 두개의 잠재적 유전자 ORF1과 ORF2가 돌연변이 위치를 포함하는 것으로 예상되었다. ORF1는 RAP-DB(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)에 공개된 전사체(Os01t0201250)와 일치했고, ORF2는 Gramene 데이타베이스에서 개시된 LOC-OS01g10460에 대한 유전자와 일치했고, 이것은 몇몇 중첩으로 서로 안티센스 방향에서 전사되는 것으로 예상되었다. 두 전사체의 발현을 확인하기 위해서, 5'-과 3'-RACE-PCR 분석이 야생형과 HD1의 ORF1과 ORF2 모두에서 수행되었다. 야생형과 HD1에서 단일 PCR 산물만이 얻어졌고, 이것은 ORF1와 일치했다. 이것은 Gramene와 미시간 주립대학 벼 게놈 주석 데이터베이스(Rice Genome Annotation database)에서 LOC-Os01g10460 주석이 RAP-DB의 OS01t021250의 특징에서 수정이 필요할지도 모른다. RACE-PCR 산물의 서열은 ORF1(Os01t0201250)과 서열 매칭으로 야생형 및 HD1에서 각각 858bp 및 795bp cDNA 절편을 나타냈다. 특히, 5'-과 3'-RACE에 의해 유도된 야생형의 cDNA 크기는 RAP-DB의 Os01t0201250에서 예상된 크기보다 각각 50bp 및 230bp가 짧았다(도 3a). 유전자의 정확한 전사 개시 자리를 확인하기 위하여, 여러 번의 5'-RACE 분석을 반복했으나, 계속적으로 이 짧은 전사체만 얻어졌다. 전사체 구조에 의해, HD1에서 63bp 결손은, ORF의 두 번째 ATG로부터 시작된 번역 때문에 코딩된 단백질의 N-말단에서 38개 아미노산의 절단을 야기할 수도 있다(도 3a, b). 이 결손된 전사체를 발현하는 D-h 유전자의 돌연변이 대립유전자로부터 우성의 왜성 표현형의 유도가 가능한 것으로 판단되어, 본 발명자는 돌연변이체와 야생형의 대립유전자를 D-h와 d-h로 각각 지정했다.

실시예 4. 형질전환 식물체에서 D-h 에 의해 획득된 왜성 표현형

D-h 유전자에서 63bp 결손이 돌연변이 왜성 표현형에 실제로 기능을 하는지 확인하기 위하여, 35S 프로모터 하에 돌연변이 D-h 대립유전자(35S::D-h)를 발현하는 형질전환 벼 식물체가 야생형 동진(d-h)으로부터 제조되었고, 그들의 표현형이 관찰되었다. 모든 형질전환 식물체는 야생형의 동진의 것보다 왜성 표현형과 작은 낱알크기를 보였다(도 4). 대조적으로, 야생형 d-h(35::d-h)를 과발현하거나 또는 야생형의 RNAi-d-h의 구축물을 포함하는 형질전환된 동진(d-h) 식물체는 식물 구조나 낱알 크기에서 어떠한 눈에 띄는 변화가 관찰되지 않았다. 그러므로, 우성 왜성 표현형은 벼 d-h 유전자에서 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이의 결과일 수도 있다는 것이 가능하다.

실시예 5. 벼 식물체에서 다른 기관과 조직에서 D-h 의 발현 양상

벼 발달에서 d-h 유전자의 기능을 더 이해하기 위해서, 다른 기관 및 조직에서 d-h의 발현 양상이 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)과 d-h 프로모터의 조절하에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 사용하여 조사되었다. RT-PCR을 위한 RNA는 성숙한 뿌리와 엽신(leaf blade), 줄기, 절, 이삭으로부터 분리되었다. 야생형 및 돌연변이체 모두에서 d-h 유전자 발현은 이삭과 절에서 가장 높았고, 줄기, 잎, 뿌리에서는 약하게 검출가능한 발현이 관찰되었다(도 5a 및 b). qRT-PCR 결과를 확증하기 위해, GUS 염색은 이삭, 줄기 하부, 절에서 주로 검출되었다. 상대적으로 강한 GUS 염색 신호는 신장 부위(elongation zone), 분화부위, 줄기의 분열조직 부위에서 검출되었고, 발육 부위(muturation zone)에서는 검출되지 않았다(도 5C 및 5d). 이삭에서, GUS 신호는 꽃 부위에서만 확인되었고, 꽃대와 가지에서는 검출가능한 발현이 없었다(도 5e-i).

실시예 6. d-h 유전자는 새로운 단백질을 코딩한다

5'-RACE 결과에 기초하여, d-h 유전자의 CDS(coding sequence)가 235bp 5' 비번역 영역(5'-UTR)과 269bp 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 지닌 354bp 길이일 것으로 예상되었는데, 이는 117개 아미노산의 단백질을 코딩하고 있다. 앞서 언급한 것처럼, 야생형과 HD1의 d-h cDNA 염기서열의 비교는 D-h 대립 유전자가 63bp 게놈 결손이 있다는 것을 나타냈다. 이것은 31bp의 코딩 영역과 32bp의 5'-UTR를 구성하고, 야생형 d-h 전사체에 의해 코딩된 117개 아미노산 단백질 대신에 절단된 79개 아미노산 단백질의 결과가 예측되었다(도 3a 및 c).

d-h 유전자에 의해 코딩된 예상 단백질은 그 아미노산 서열 내에 확인된 모티브나 보존 도메인이 없어 알려지지 않은 기능을 하는 새로운 단백질이었다. d-h 유전자의 오솔로그는 옥수수(Zea mays, NP_001147534, 90% 아미노산 동일성), 수수(Sorghum bicolor, XP_002454989; 64% 아미노산 동일성), 보리(Hordeum vulgare, AK360345, 67% 아미노산 동일성)를 포함하는 여러 곡류에서 발견되었다(도 3c).

실시예 7. d-h 단백질의 세포내 위치

단백질 산물을 입증하고 그 기능을 더 이해하기 위하여, 35S 프로모터 조절 하에 돌연변이 D-h 유전자 또는 야생형 d-h의 C-말단에 번역적으로 융합된 GFP의 키메릭 구축물을 제조한 후에, d-h 단백질의 세포내 위치가 조사되었다. 입자 충격 방법에 의해 야생형 d-h::GFP 융합과 돌연변이체 D-h::GFP 구축물을 양파 표피세포에 형질주입함에 따라, GFP 신호가 핵뿐만 아니라 세포질에서 검출되었다. 그러나, 핵 내에서 돌연변이체의 D-h::GFP의 위치 패턴은 야생형 d-h::GFP 융합 단백질의 것과 다소 차이가 있었는데, 핵막의 안쪽 표면에 제한되었고 전체적으로 약한 신호를 지녔다(도 6).

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> D-h gene showing dwarf phenotype and uses thereof <130> PN14020 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 240 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggaggtgc tgtccccgag catgctggac ttcccgtcgc tggcgctggg cagccccgtg 60 acgccgctcc cgccgctgcc cgggtccgac gaggccgccg cggccgagga ccgcgccatc 120 gccgagaagg ggttctacct ccacccttcc cctcgcggca atgccggcgc cgccggcgag 180 ctccagccgc ctcccaggct cctccccctc ttccccctcc agtctcctgg tcggcagtga 240 240 <210> 2 <211> 79 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Val Leu Ser Pro Ser Met Leu Asp Phe Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ser Pro Val Thr Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ser Asp Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Glu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Lys Gly Phe Tyr Leu His 35 40 45 Pro Ser Pro Arg Gly Asn Ala Gly Ala Ala Gly Glu Leu Gln Pro Pro 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Pro Leu Phe Pro Leu Gln Ser Pro Gly Arg Gln 65 70 75 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tttctttagc tccgccttga 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctttcgcaca aggacgtg 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 catggatgat gcttccctct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgacagtgg ctccacaaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttcagagcag cagagcatgt 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttttcacca tttctttgcc tta 23 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtgctgttcc atgctccac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggggaggggt taagatgact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agcggtagta ccatcggaga 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agtacagatg gaaaatccaa cg 22 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttttaggacg gaggaagtaa ctttt 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tggtggagaa ttgtgattga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttggcaagaa aagttgacca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccaaacattc gtttctgagc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aagcttatcc tgccactttt t 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttttgcatgt ctccctttcc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agccgagtta gcatttcagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttcttcacga gcacacatcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tcctcgagat tggagacagc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ctccaaatgc cgagaaaatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gatgaaactc tgggcaggaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 caggaaaccc aaaatcctga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aagtcttgca gacgacacca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caaagctgcc actgatgaaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ggaagggtgg aggtagaacc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tctctctctc ccttgccaaa 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gcggccgagg accgcgccat 20 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ctttaagctc ggcgatcaat taatc 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tgtcatggtt ggaatgggcc a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aggcagtcag tcagatcacg a 21

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 왜성(dwarf) 표현형을 나타내는 돌연변이 벼(Oryza sativa) 유래의 D-h 단백질.
제1항의 D-h 단백질을 코딩하는 D-h 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제6항의 방법에 의해 제조된 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 왜성 표현형을 갖는 형질전환 식물체.
제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 D-h 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 왜성 표현형을 갖는 식물체의 생산용 조성물.