CN115851757A - AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的应用 - Google Patents

Abstract

AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的应用属生物技术领域，本发明提供一种水稻AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的超表达载体，其含有OsDREB2B基因表达盒‑‑‑含玉米泛素基因Ubi启动子，目的基因OsDREB2B，终止子为农杆菌的胭脂碱合成酶编码区的3`端非翻译区NOS和筛选标记基因表达盒‑‑‑含花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S，标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT，终止子NOS；AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其能调节水稻的株高，在实际应用中具有显著效果和价值。

Description

AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因在水稻中的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在确保粮食安全方面发挥着重要作用。株高是决定水稻株型的重要因素之一。适当的株高可以降低叶片密度，提高产量，防止倒伏。植物株高受各种激素的调节，如赤霉素(GA)、油菜素类固醇(BR)、吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)和独脚金内酯(SLs)。外源GA3的施用可显著促进缺乏GA含量的OsRPH1超表达水稻的第二叶鞘的伸长。BR可以显著增加水稻旗叶的叶片夹角，与野生型相比，BR不敏感的OsOFP22超表达水稻旗叶中的叶片夹角显著降低。Aux/IAA调节向光/向重性、根系形成、顶端优势、茎/下胚轴伸长和叶片扩展。超表达OsIAA1改变了叶角，而超表达OsIAA4则改变了分蘖角。

赤霉素是影响株高的最重要激素之一。到目前为止，共鉴定出136种赤霉素，其中，GA1、GA3、GA4和GA7已被证明是植物中的内源性生物活性赤霉素，有些至少具有一些固有的生物活性，但它们不存在于营养组织中，因此可能不具有调节功能。许多水稻GA突变体在GA生物合成途径或GA信号感知方面存在缺陷，包括GA缺乏突变体和GA不敏感突变体。GA缺乏突变是由参与GA生物合成途径或GA失活酶的突变引起的，而不是GA信号传导基因的突变引起的，因此，外施GA3的条件下植株株高可以恢复到WT水平。GA不敏感突变体是由参与GA信号传导基因的突变引起的，内源性生物活性赤霉素含量通常远高于WT。

在水稻中，GA代谢基因包括GA生物合成早期步骤中的催化酶，如CPS、KS、KO和KAO，是由单基因编码的。GA生物合成后期基因，如GA20ox、GA3ox和GA2ox由多基因家族编码。其中，GA20ox和GA3ox通过催化氧化级联将GA前体转化为生物活性赤霉素，而GA2ox对GA失活至关重要。在水稻的GA信号途径中，GID1编码可溶性GA受体，GID2是Skp1-Cullin-F盒蛋白(SCF)E3泛素连接酶的F-box亚基，在GA存在下促进26S蛋白酶体降解水稻SLR1。

AP2/ERF家族是一种植物特有的转录因子，在植物的生长发育及非生物胁迫的响应过程中发挥重要作用，如生长发育和非生物胁迫反应。此外，许多AP2/ERF家族转录因子，如OsEATB、OsRPH1和OsAP2-39，通过调节GA代谢基因的转录表达影响GA代谢水平，进而调节植物的生长和发育。据报道，许多DREB亚组基因影响脱落酸(ABA)生物合成和信号传导来调控生物和非生物应激反应信号转导途径，如OsDREB2A、OsDREB1F、OsDREB6和OsARAG1。

OsDREB2B基因属于DREB亚组，有研究表明在拟南芥或水稻中响应非生物胁迫，如干旱、热胁迫和低温胁迫等。有趣的是，低温胁迫应激与GA代谢之间存在相关性。例如，在低温条件下，水稻中OsDREB2B的mRNA表达量上调，而GA生物合成基因GA20ox3和GA3ox1的mRNA表达量下调。有研究表明番茄中的DREB家族基因SlDREB下调GA相关基因的表达，其在转基因番茄中的过量表达导致矮化，缩短节间伸长，然而，OsDREB2B在水稻生长和发育调控方面的研究尚未清晰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其可在水稻株高调节中应用。

本发明的目的还在于提供一种水稻AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的超表达载体，其含有OsDREB2B基因表达盒---含玉米泛素基因Ubi启动子，目的基因OsDREB2B，终止子为农杆菌的胭脂碱合成酶编码区的3`端非翻译区NOS和筛选标记基因表达盒---含花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S，标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT，终止子NOS。

本发明的目的还在于提供一种含有水稻AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的超表达载体的重组细胞。

本发明的目的还在于提供一种检测上述OsDREB2B的引物。

本发明重点研究了OsDREB2B对植物生长发育的调控机理。OsDREB2B超表达水稻植株具有株高矮化、节间长度变短、种子大小和厚度变小的表型。本发明研究了GA介导的第二叶鞘延长的生理过程、各种内源GA含量以及OsDREB2B超表达水稻株系和敲除株系中的GA相关基因的转录水平表达量变化。此外，还阐明了OsDREB2B的下游靶基因和互作蛋白。OsDREB2B与OsWRKY21蛋白互作，并结合于OsAP2-39启动子区域。有研究表明OsAP2-39和OSWRKY11都能调节水稻生长。本发明的结果表明：OsDREB2B通过调节GA代谢基因的表达在水稻生长发育中发挥负调节作用，而GA代谢基因的表达由OsAP2-39和OsWRKY21介导，从而降低GA含量，导致水稻株高的矮化。

本发明的有益效果在于：OsDREB2B能够调节水稻的株高，在实际应用中具有显著价值。并且通过该基因的超表达可进行作物遗传改良，培育出半矮化转基因作物。

附图说明

图1为超表达(OE)和野生型(WT)水稻植株表型的示意图；

其中：(A，B)OE株系的全植物形态和苗期的WT。Bar＝2cm。(C，D)成熟期OsDREB2B-OE和WT的全植株形态。Bar＝10cm。(E)OE-1(右)和WT(左)主秆的圆锥花序和节间。Bar＝5cm。(F)OE株系的节间长度和重量(G)种子表型。Bar＝1cm。(H)OE和WT的种子大小；

图2为OsDREB2B在水稻中的表达模式的示意图；

其中：(A)通过qRT-PCR检测各种组织和器官中OsDREB2B的转录水平。幼穗的转录水平设置为1。数据为平均值±SD(n＝3)。(B，C，D)通过qRT-PCR分析不同浓度的GA3施用对OSDREB2B表达谱的影响。学生t测验用于生成P值**在P＝0.01时，WT和OE之间存在显著差异；

图3为用GA3可以恢复OE植株的矮化表型的示意图；

其中：用0、10、50和100μM GA3处理10天龄的OE和WT幼苗。每个品系至少测量了10个水稻幼苗。数据表示为每个基因型10个样本的平均值(±SD)；

图4为WT和OE株系幼苗中内源GA含量的测定的示意图；

其中：(A)植物中主要赤霉素(GA)生物合成途径的比较。(B)GA12途径和GA53途径中GA物种的含量。FW，鲜重。学生t测验用于确定统计显著性。FW，鲜重；误差条表示±SE(n＝3)。学生t测验用于生成P值**在P＝0.01时，WT和OE之间存在显著差异；

图5为GA代谢基因(A、B、C)和信号传导基因(D)的表达分析的示意图；

其中：WT的转录水平设置为1。数据为平均值±SD(n＝3)。学生t测验用于生成P值**在P＝0.01时，WT和OE之间存在显著差异；

图6为OsDREB2B的反式激活活性和亚细胞定位的示意图；

其中：(A)酵母中OsDREB2B蛋白的反式激活分析。BD、GAL4-DNA结合域。OsRPH1蛋白用作阳性对照。(B)OsDREB2B-GFP融合蛋白在水稻原生质体细胞中的亚细胞定位。D53-RFP用作核标记物。Bar＝10μm；

图7为OsDRE2B对OsAP2-39的直接调节的示意图；

其中：(A)OsAP2-39基因在WT和OE株系中的相对表达。(B)酵母中OsDREB2B和OsAP2-39的组合。GAD-OsDREB2B激活酵母中由OsAP2-39启动子驱动的LacZ报告基因的表达。GAD、GAL4是转录激活域。(C)双荧光素酶报告系统中载体的示意图。(D)体内双荧光素酶报告分析。Flag-OsDREB2B和OsAP2-39pro:FLUC、Flag和OSAP3-39pro:FLUC共转化为水稻原生质体，并在28℃下培养12-14小时。测量FLUC和RLUC活性，并使用Renilla荧光素酶(RLuc)作为内部对照。学生t测验用于生成P值**在P＝0.01时，WT和OE之间存在显著差异；

图8为OsDREB2B在酵母和植物细胞中与OsWRKY21互作的示意图；

其中：(A)在酵母细胞中检测到OsDREB2B和OsWRKY21的相互作用；AD，激活域；BD、GAL4-DNA结合域；(B)BiFC用于检测水稻原生质体中OsDREB2B和OsWRKY21的相互作用；明亮，明亮的领域；YFP，YFP荧光；标记，标记荧光；Bar＝10μm；

图9为OsDREB2B调控水稻株高的机理模型的示意图；

其中：纺锤体表示不同的转录因子，圆圈表示不同的抑制因子。矩形表示顺式元件结合序列；箭头表明OsDREB2B/WRKY21复合物可直接结合GA代谢基因启动子上的顺式元件。黑色箭头表示激活效果，锤线表示抑制效果。黑暗中的曲线箭头表示基因的转录表达，线的厚度表示相对转录水平。

图10为OsDREB2B超表达转基因水稻的发育的示意图；

其中：(A)OsDREB2B植物表达载体的示意图。OsDREB2B在玉米泛素(Ubi)启动子的控制下表达，潮霉素(hgy)基因在水稻中作为选择标记的35S启动子控制下表达。(B)利用构建特异引物对T0转基因水稻进行PCR分析。M、标记；WT，Kitaake；1-18，T0代的独立转化子。(C)通过基因组DNAPCR分析证实了OsDREB2B-OE株系的T3代。(D)在WT和OE中通过qRT-PCR分析OsDREB2B的表达。数据表示为来自两个独立实验的平均±SE值(n＝3)。*，表明在P≤与学生样本t检验中的WT相比为0.01。

图11为OE-2和WT的主茎节长度对比示意图。

图12为水稻Osdreb2b敲除突变体的构建示意图；

其中：(A，B，C)利用一组规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统在水稻中产生了Osdreb2b突变体。(D)在WT和mt中通过qRT-PCR分析OsDREB2B的表达。数据表示为来自两个独立实验的平均±SE值(n＝3)。*，表明在P≤与学生样本t检验中的WT相比为0.01。

图13为WT和Osdreb2b突变体的形态示意图；

其中；(A)WT和Osdreb2b突变体在苗期的全植株形态。Bar＝1cm。(B)WT和Osdreb2b突变体的第二叶鞘。(C)籽粒形态。Bar＝1cm。(D)WT和Osdreb2b突变体大小。**，表明在P≤与学生样本t检验中的WT相比为0.01。

图14为WT和Osdreb2b突变体幼苗中内源生物活性赤霉素(GA1、GA3、GA4)的测量示意图；

其中；对每个样本进行三次生物复制和三次技术复制，并使用学生样本t检验确定统计显著性。FW，鲜重；误差条表示±SE(n＝3)。

图15为酵母自激活抑制试验示意图；

其中；(A)分别重建了pBridge-OsDREB2B和pBridge。在含有不同浓度3-AT的SD/-Trp-Leu-Ade-His辍学补充剂的最小合成定义培养基上对指示蛋白质进行酵母单杂交分析。(B)OsDREB2B、pGBKT7-OsDREB2B-F、pGBKT7-OsDREB2B-N、PGBKC7-OsDREB2B-C的三个截短诱饵载体分别表示插入PGBKT 7的OsDREB2B全长、N端和C端的截短结构。在含有SD/-Trp、SD/-Trp-His、SD/-Trp-Ade-His和SD/--Trp-Leu-Ade His+X-α-gal滴落的最小合成定义培养基上测试所指示的蛋白质。

图16为酵母中的X-α-gal显色反应示意图；

其中：阳性对照和阴性对照对应于+符号和符号。用pGBKT7-53(+)和pGADT7共转化的酵母细胞作为阳性对照，用pGBKT7-Lam(-)和PGADT 7共转化作为阴性对照。将指示的蛋白质在含有SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/--Trp-Leu-Ade-His和SD/-Trp-LeuAde-His+X-α-gal滴落的最小合成定义培养基上培养。

具体实施方式

下面结合附图描述本发明。

1.材料与方法

1.1植物材料

克隆OsDREB2B的全长CDS并将其融合到超表达载体pCUbi1390，该载体由玉米泛素启动子驱动。通过PstI和HindIII位点构建载体pUbi：：OsDREB2B。pUbi：：OsDREB2B通过农杆菌(EHA105-)介导的遗传转化方法转化到粳稻品种Kitaake中(Nishimura等，2006年)，具体方法为：去掉颖壳的水稻种子经过消毒后诱导愈伤组织、继代培养，利用含有pUbi：：OsDREB2B载体的农杆菌菌株EHA105菌液侵染愈伤组织，经过潮霉素抗性筛选、分化、生根，最终移栽获得转基因独立转化植株。后代植株通过分子检测和潮霉素抗性筛选获得T3纯合系。

1.2 osdreb2b突变体的构建与鉴定

使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得osdreb2b突变体。Cas9/gRNA靶点选择和载体构建参考前人的研究(Li等，2017年)。将OSDREB2B-pBGK032载体导入农杆菌EHA105并转化到Kitaake(Nishimura等，2006年)，方法同上。通过PCR检测和OSDREB2B特异性编辑位点的DNA测序分析突变情况，筛选osdreb2b纯合突变体。

1.3表型分析、统计分析和生长条件

水稻植株种植在吉林省长春市吉林大学农业实验基地，正常栽培条件管理。OE和mt株系在黑暗交替(30℃，12h光照/24℃，12h黑暗)条件下，水培14天后评估苗期表型。在水稻生长季节将幼苗移栽到实验田。成熟种子风干后，测量种子长度、宽度和厚度。采用10株植株，用学生t测验进行表型分析。

1.4 GA3处理

WT种子在蒸馏水中发芽，并在kimura B培养液中生长。培养14天后，用10、50和100μM GA3(Sigma-Aldrich，中国，上海)处理幼苗，进行三个生物重复。在处理后0、1、6和12小时收集幼苗。外施GA3恢复实验(Ma等，2020年)中，将三叶期的WT和转基因水稻幼苗在kimura B培养液中培养10天后，分别喷施10、50和100μM浓度的GA3。每6小时测量第二叶鞘的长度，20株/重复，三次生物学重复。数值为平均值±标准差。

1.5内源赤霉素含量的测定

通过高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定WT、OE和mt株系的内源GA含量。从10天龄的水稻幼苗中收集1g芽组织，按照Li等(2017)的方法进行内源赤霉素含量的测定。对每个样本进行三次技术重复三次生物学重复，并使用学生t测验确定统计显著性。

1.6 RNA提取和实时定量PCR分析

使用RNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司，中国，北京)从14天龄水稻幼苗的叶片中提取总RNA，并使用上标II试剂盒(TaKaRa，日本，东京)进行反向转录。实时PCR使用一种SGExcel FastSYBR qPCR混合物(生工生物科技有限公司，中国，上海)在ABI一步加PCR系统(美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)上进行。每个反应包含10μL SGExcelFastSYBR qPCR混合物、0.2μM引物和1μL模板cDNA。PCR反应参数为95℃2min(1个循环)、95℃15S和60℃20S(40个循环)，然后在95℃下进行60S、55℃30S和95℃30S的熔解曲线分析。将水稻OsUbiquitin和OsActin基因用作内参基因(Zheng等，2015；Mao等，2019)。每个qRT-PCR分析进行三个技术重复和三个生物重复。。

1.7酵母反式激活活性测定

将OsDREB2B的全长开放阅读框(ORF)插入pBridge载体中构建pBridge-OsDREB2B。将pBridge-OsRPH1用作阳性对照，并将空pBridge载体用作阴性对照(Ma等，2020年)，转化到酵母菌株AH109(Clontech)中。阳性转化体在三缺培养基(SD/-Trp-Ade-His)上进行验证，并滴在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)中。

1.8 OsDREB2B的亚细胞定位

将OsDREB2B的编码区连接到CaMV35S启动子驱动的pAN580 GFP载体中构建OsDREB2B-GFP载体。D53-RFP融合蛋白被用作核标志物(Zhou等，2013)。水稻原生质体的制备和转化采用Wang等(2016)的方法进行。将瞬时表达载体转化到水稻原生质体细胞中，在28℃的黑暗条件下培养12-14小时。使用共聚焦激光显微镜观察荧光图像(Carl Zeiss，aJena，德国)。

1.9 CDNA文库构建

利用从2周龄水稻幼苗中提取总RNA，构建水稻cDNA文库。使用SMARTM cDNA文库构建试剂盒(Clontech)，以1μg总RNA为模板，通过寡核苷酸(dT)引物合成第一链cDNA。通过长距离PCR(LD PCR)合成双链cDNA。在质量检查后，在SfiI消化后将dscDNA插入pGADT7SfiI载体，然后转化到大肠杆菌宿主菌株中。随机选择在LB培养基(Amp 100g/L)上生长的六个单阳性菌落，用pGADT7引物进行PCR扩增：正向引物为5'-TAATACGACTAGG-3'；反向引物为5'-GGCAAACGATGTATAATGA-3'。用pGBKT7-53(+)和pGADT7共转化的酵母作为阳性对照，用pGBKT7-Lam共转化的酵母菌作为阳性对照(-)，pGADT7用作阴性对照(Chen等，2017)。将上述载体转化到酵母菌株AH109(Clontech)，并在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上验证阳性转化体，并滴入加入X-gal的四缺培养基中(SD/-Trp-Leu-Ad-His+X-gal)。

1.10酵母双杂交(Y2H)分析

将编码OsDREB2B的cDNA片段扩增并克隆到pGBKT7载体中，使用gateway系统构建“bait”载体pGBKT7-OsDREB2B。使用从水稻幼苗制备的cDNA文库进行Y2H筛选，并通过DNA测序鉴定阳性克隆。OsWRKY21的编码区作为“prey”插入pGADT7载体。将“bait”和“prey”构建体共转化到酵母菌株AH109(Clontech)。阳性转化体在三缺培养基(SD/-Trp-Leu-His)上得到验证，转到四缺培养基内(SD/-Trp-Leu-Ade-His)。所有步骤根据制造商的用户手册(Clontech Laboratories)执行。

1.11双分子荧光互补(BiFC)分析

将编码OsWRKY21的cDNA片段扩增并克隆到在CaMV35S启动子控制下携带YFP(nYFP)-N端半部的pXY105载体中，以形成nYFP-OsWRKY21，并将编码OsDREB2B的cDNA克隆到在CaMV35S激活子控制下带有YFP-C端半部(cYFP)的pxy103载体中构建以形成cYFP-OsDREB2B。将nYFP-OsWRKY21和cYFP-OsDREB2B共转移到水稻原生质体中。D53-RFP融合蛋白用作核标记物。将转化的水稻原生质体在23℃的黑暗中培养12-14小时。使用AxioObserver D1(Carl Zeiss,Jena，德国)观察荧光图像。

1.12酵母单杂交(Y1H)分析

将OsDREB2B的全长CDS扩增并克隆到pJG4-5载体中构建pJG5-OsDREB2B，并将OsAP2-39启动子(～1500bp)克隆到报告载体pLacZi-2μ中。将pJG4-5-OsDREB2B和OsAP2-39pro:LacZ与融合蛋白共转化到酵母菌株EGY48(Clontech)中。将转化体在30℃的SD/TrpUra板上培养3-4天。DNA测序用于鉴定假定的阳性克隆。将单个阳性菌落在SD/-Trp-Ura显色板上划线，并在30℃下培养3天(Lin等，2007年)。

1.13双荧光素酶报告分析

将OsAP2-39启动子(～1500bp)插入含有荧光素酶报告基因(LUC)的载体pGreenII 0800以生成报告载体，并将OsDREB2B的CDS插入标记载体以生成效应载体。随后，通过PEG将报告载体与空标记载体(阴性对照)或效应载体(Flag-OsDREB2B)共转化到水稻原生质体中(Yoo等，2007年)。在28℃培养12-14小时后，使用双荧光素酶报告分析系统(E1910，Promega)测量水稻原生质体的LUC和reniral-siferase(REN)活性水平。由OsAP2-39启动子驱动的LUC的瞬时表达被标准化为内部对照报告子(REN)的表达。

2结果与分析

2.1在水稻中过量表达OsDREB2B具有矮秆表型

发明人在前期工作中，克隆了多个转录因子基因(pUBI:OsTFs)，并将其转化到受体水稻品种“Kitaake”中，构建了转录因子超表达(TF-OE)水稻文库。通过表型评估，从TF-OE水稻文库中筛选出具有矮化表型的OE株系。通过测序，发现它们是OsDREB2B(LOC_Os05g27930)基因的超表达株系。获得了14个独立的T0代OsDREB2B-OE株系，并检测了目的基因的mRNA表达量。最终筛选两个OsDREB2B基因超表达转基因株系(OE-1和OE-2)T3纯合系，作为后续研究材料(图10)。两个OE株系均表现出矮秆表型，如株高、节间长度和厚度、粒径和产量显著降低(图1和11)。在苗期，OE-1(3.07cm)和OE-2(2.95cm)的第二鞘的平均长度分别仅为野生型(4.33cm)的70.9％和68.1％(图1的A和B)。在成熟期，OE-1(68.76cm)和OE-2(64.16cm)的平均株高分别仅为野生型(84.56cm)的81.3％和75.9％(图1的C和D)。OE株系和野生型之间的节间长度比较分析表明，OE株系中的四个节间(第一、第二、第三和第四)比野生型明显缩短(图1的E和F)。

为了进一步探究OsDREB2B在植物生长调节中的作用，发明人使用CRISPR/Cas9系统，对野生型水稻品种kitaake基因组中编辑OsDREB2B基因，获得了Osdreb2b敲除突变体(Osdreb2b)(图12)。通过DNA测序和分子检测，筛选出两个OsDREB2B敲除的独立纯合株系(mt-1和mt-2)(图12的B和C)。mt-1和mt-2幼苗的第二叶鞘长度与10天龄幼苗的WT长度相似(图13的A和B)。mt-1和mt-2种子的长度、宽度和厚度与WT相似(P≤0.01)(图13的C和D)。这些结果表明，OsDREB2B对水稻株高具有负调节作用。

2.2 OsDREB2的组织特异性和GA响应性表达谱

有研究表明，OsDREB2B是一种在逆境条件下诱导的AP2/ERF转录因子，如拟南芥中的低温胁迫(Sakata等，2014年)、干旱、盐和热(Matsukura等，2010年)。超表达OsDREB2B，有效提高了水稻对干旱胁迫的耐受性(Chen等，2008年)，以及拟南芥对高温和干旱胁迫的耐受性(Matsukura等，2010年)。RNA序列数据库(https://genevestigator.com)还证实了水稻在低温胁迫、干旱、盐和高温胁迫下，OsDREB2B表达量显著提高(数据未显示)。根据研究结果，推测OsDREB2B不仅与非生物胁迫有关，还与植物生长发育有关。因此，发明人专注于OsDREB2B在水稻生长中的新功能，并进行了深入研究以阐明其机制。

在本研究中，使用qRT-PCR检测OsDREB2B的组织特异性和GA调节的表达模式。如图2的A所示，OsDREB2B的转录本在许多器官中表达，如叶鞘、幼叶、茎、剑叶、幼穗和穗。值得注意的是，它在叶鞘中显著高表达，达到幼穗的至少八倍，而在其他器官中的表达量很低(图2的A)。GA是一种促进水稻生长发育的激素，主要调节叶鞘和节间的伸长。为了分析OsDREB2B的GA应答表达，用不同浓度的外源GA3处理的WT水稻进行qRT-PCR。随着GA3浓度的增加，OsDREB2B的转录水平增加：在100μM时，它在1小时内迅速增加到2.9倍(图2的B-D)。因此，可推测OsDREB2B参与GA调节的生物过程，可能参与植物的生长和发育。

2.3水稻施用外源GA3恢复了OsDREB2B幼苗的矮秆表型

内源赤霉素含量低的水稻表现出矮化表型，第二叶鞘的短长度通过外源赤霉素施用得以恢复(Spielmeyer等，2002年；Ma等，2020年)。为了阐明超表达OsDREB2B株系的矮化表型是否是由于内源GA含量降低所致，研究了外源GA3处理下OE株系和WT水稻的幼苗生长情况。用不同浓度的GA3(0、10、50和100μM)处理10天龄的幼苗，观察处理后不同时间点的第二叶鞘的延伸情况(图3的A-D)。第二叶鞘的延伸率随着GA3浓度的增加而增加，OE株系的延伸率快于WT。用100μM的GA3处理后，OE株系第二叶鞘的长度在处理后48小时内几乎与WT植物的长度一样(图3的D)。此外，外源GA3也应用于mt系，但和WT无显著差异(数据未显示)。因此，外源GA3施用可以使OE株系的第二叶鞘长度完全恢复到WT水平，说明OE株系矮化不是由GA信号通路的阻断引起的，而是由内源GA含量低引起的。

2.4水稻中的生物活性GA含量降低

为了证实发明人的假设，发明人使用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析OE株系和WT中的内源GA含量。共分析15种GA含量和分布模式，包括活性态及其代谢物和前体产物(图4的A)。比较OE和WT之间的GA含量，在GA12途径中，四种GA即生物活性GA4及其前体(GA15、GA24和GA9)的含量减少，而GA51(GA9的分解代谢产物)含量增加，未检测到GA12(生物活性GA4的初始前体)和GA34(GA4的代谢物)。在GA53途径中，五种GA(包括生物活性GA1和GA3)及其前体(GA44、GA19和GA20)含量减少；然而，GA53(生物活性GA1的第一前体)和两个分解代谢产物GA29和GA8的含量增加(图4的A和B)。

引人注目的是，三种生物活性气体(GA1、GA3和GA4)的含量显著降低(P≤0.01)，分别降低了62.5％、75％和68.7％(图4的B)；然而，在突变株系(mt-1和mt-2)和WT之间未观察到显著差异(图14)。OsDREB2B的超表达导致内源性生物活性GA含量降低，但OsDREB2B的抑制表达对GA含量变化没有影响，表明OsDREB2B负调节GA含量。

2.5 OsDREB2B下调GA生物合成基因，但上调GA失活基因

为了证实OsDREB2B作为GA含量的负调节因子，通过qRT-PCR在10天龄OE株系和WT水稻幼苗中检测了大多数GA生物合成早期和晚期步骤的催化酶的转录水平，以及GA信号因子。有趣的是，在OE株系中，GA生物合成早期步骤中的OsCPS1、OsKS、OsKO2和OsKAO基因的表达显著下调(P≤0.01)，与WT相比分别降低了44.4％、51.8％、55.5％和83.7％(图4的A和图5的A)。类似地，晚期GA生物合成基因，包括OsGA20ox1–OsGA20ox2和OsGA3ox1–OsGA3ox2的表达水平在OE中显著下调(P≤0.01)(图4的A和5的B)。相比之下，GA失活相关基因的表达水平，如OsEUI(图5的A)、OsGA2ox1、OsGA2ox3-6、OsGA2ox8和OsGA2ox9，与WT相比在OE中显著上调(P≤0.01)(图4的A和5C)。此外，与野生型相比，OE株系中GA信号因子OsGID1、OsGID2和OsSPY的转录本未显示出显著差异表达(图5的D)，这意味着GA信号通路未被OsDREB2B阻断。这与外源GA3处理后的短叶鞘恢复现象一致(图3)。综上所述，OsDREB2B通过下调GA生物合成基因和上调GA失活基因，而不是阻断GA信号因子，负调节生物活性GA含量。

2.6 OsDREB2B作为转录激活子在水稻内发挥作用

转录因子通过结合细胞核基因组DNA序列上的顺式元件来调节下游基因的表达水平。为了确定OsDREB2B蛋白是否具有反式激活活性，将OsDREB2B与pBridge体中的GAL4-DNA结合域融合，在酵母中表达。pBridge-OsDREB2B和阳性对照pBridge-OsRPH1的转化体在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上生长良好，而阴性对照pBridge未能生长(图6的A)。在缺少pBridge的GAL4激活域的情况下，OsDREB2B融合到GAL4 DNA结合域，有效激活酵母细胞的转录。此外，将pBridge-OsDREB2B的转化体转移到含有不同浓度3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)的四缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)中，30℃下培养3天。与阴性对照相比，pBridge-OsDREB2B在75mM的3-AT上仍然正常生长(图15的A)，表明OsDREB2B在酵母中起到转录激活剂的作用。

为了验证OsDREB2B的亚细胞定位模式，构建CAMV35S启动子(p35S：：OsDREB2B-GFP)控制下表达的OsDREB2B-GFP融合蛋白，并在水稻原生质体中进行瞬时表达。如图6的B所示，对照smGFP均匀分布于整个细胞质中，而OsDREB2B-GFP融合蛋白仅定位于细胞核内。由此可以推断，OsDREB2B在水稻中起着转录激活剂的作用。

2.7 OsDREB2B通过与OsAP2-39启动子的直接结合调控其转录水平表达量

超表达AP2/ERF家族转录因子基因OsAP2-39可以通过上调GA分解代谢基因OsEUI(Elongated Uppermost Internode)降低转基因水稻的株高(Yaish等，2010)，该基因编码细胞色素P450单加氧酶，通过环氧化反应使GA失活(Ma等，2006；Zhu等，2006年；Zhang等，2008年)。与WT相比，OsDREB2B超表达株系中OsAP2-39的转录表达水平显著上调(图7的A)。使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析启动子结果显示，OsAP2-39启动子区具有DRE/CRT顺式元件，然而，OsEUI在启动子区域不具有DRE/CRT或GCC box。因此，发明人推测OsDREB2B直接结合OsAP2-39的启动子并激活其表达，排除了OsEUI可能是OsDREB2B的直接下游靶点的可能性。

为了证实OsDREB2B与OsAP2-39启动子的体内结合，进行了酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶测定实验。在Y1H分析中，全长OsDREB2B融合蛋白与GAL4转录激活域(GAD)融合，OsAP2-39启动子与LacZ报告基因融合。当GAD-OsDREB2B和OsAP2-39Pro:LacZ共转化到酵母细胞中时，发生蓝色反应(图7的B)。在双荧光素酶分析中，OsAP2-39启动子与荧光素蛋白酶(LUC)报告基因融合，OsDREB2B由35S作为效应子驱动(图7的C)。与空载体共转化时相比，与OsAP2-39pro:FLuc共转化时，携带Flag-OsDREB2B的水稻原生质体中的相对FLuc/RLuc活性比显著增加(图7的D)。这些结果显示，OsDREB2B直接结合OsAP2-39的启动子并激活其表达。

2.8 OsDREB2B与OsWRKY21互作

一些AP2/ERF转录因子与各种蛋白质相互作用以发挥冗余功能。为了鉴定OsDREB2B的潜在相互作用蛋白，利用水稻cDNA文库进行了酵母双杂交(Y2H)筛选。三种截短诱饵载体(OsDREB2B的全长、N端和C端)的自激活活性验证表明，OsDREB2B的自激活活动需要C端。因此，使用不含C末端的截短型OsDREB2B-N进行筛选(图15的B)。

总共筛选了49种蛋白作为与OsDREB2B-N相互作用的潜在蛋白质。大多数蛋白质在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上正常生长，其中7种具有深蓝色反应(图16)。其中，确定了一种与水稻生长发育有关的蛋白质OsWRKY21图16中的7)。超表达OsWRKY21水稻具有半矮秆表型，抽穗期较早，茎节间较短(Wei等，2021)，这与发明人的超表达OsDREB2B株系的表型非常一致(图1)。

为了进一步验证OsDREB2B和OsWRKY21之间的物理相互作用，进行了一对一Y2H分析。如图8的A所示，当共转化为酵母时，OsDREB2B-pGBKT7和AD-OsWRKY21相互作用。此外，水稻原生质体中的双分子荧光互补(BiFC)分析也证实了OsDREB2B和OsWRKY21之间的相互作用。有趣的是，当OsDREB2B-nYFP和OsWRKY21-cYFP共转化时，在原生质体的细胞核中明显检测到YFP的荧光信号，而在OsDREB2-nYFP和cYFP或OsWRKY11-cYFP和nYFP的共转化反应中未检测到信号(图8的B)。因此，OsDREB2B在酵母和水稻原生质体的细胞核中与OsWRKY21发生物理相互作用。

3讨论

AP2/ERF转录因子OsDREB2B属于DREB亚组，据报道，该亚组可应对非生物胁迫，如拟南芥或水稻中的干旱、热胁迫和低温胁迫。然而，关于OsDREB2B在水稻生长发育中的分子机制知之甚少。在本研究中，OsDREB2B作为由OsAP2-39和OsWRKY21介导的GA代谢基因表达的双重调节因子，降低了GA含量并导致水稻株高降低。

GA是一种促进水稻生长发育的激素，主要调节叶鞘和节间的伸长。在发明人的研究中，OE株系表现出矮化表型，主要表现为叶鞘缩短和节间长度缩短(图1和图11)，而mt系的表型与WT相似(图13)。这些观察结果表明，超表达OsDREB2B干扰了植物生长发育的许多方面，而由于基因冗余，其敲除株系对水稻生长没有影响。

此外，外源GA3施用显著促进了水稻叶鞘的伸长，并影响了OsDREB2B的转录(图3)。这种现象类似于GA缺陷突变体。此外，许多GA代谢基因的表达发生了变化，而GA信号基因的表达在OE株系和WT之间没有差异(图4的A和图5)。这些结果表明，OsDREB2B参与植物生长迟缓相关的GA代谢，而不是GA信号通路。在GA代谢基因中，GA20ox和GA3ox通过一系列催化氧化反应将GA前体转化为生物活性赤霉素，而GA2ox被认为是GA失活的关键因素。水稻矮秆突变体d18和绿色革命品种半矮秆1(sd1)分别由GA生物合成基因OsGA3ox2和GA20ox2的突变产生。玉米(dwarf1)和大麦(sdw1/denso)中GA20ox和GA3ox的突变和水稻中失活基因(OsGA2ox1、OsGA2ox6和OsGA2ox9)的超表达，通过降低GA含量导致植株高度中度降低。这些情况同时发生在发明人的超表达OsDREB2B水稻株系中，这与发明人先前确定的AP2/ERF转录因子OsRPH1相似。与WT相比，OE株系中的生物活性GA含量显著减少(P≤0.01)(图4)，而mt中的含量与WT无显著差异(图14)。此外，与WT相比，大多数生物活性GA前体减少，而在OE系中，GA53和一些非活性分解代谢产物增加(图4)。大多数GA20ox和GA3ox的下调可能导致GA1的初始前体物GA53的积累，而GA2ox的上调可能导致三种分解代谢产物的增加，如GA29、GA8和GA51(图4和图5)。

OE株系中GA代谢基因表达量的变化与生物活性GA含量降低的结果一致，表明GA生物合成基因下调，GA失活基因上调。这些结果表明，OsDREB2B作为GA代谢基因的双重调节器，负调节GA合成基因的表达，而正调节GA失活基因，导致水稻中生物活性赤霉素含量的减少。

AP2/ERF蛋白通过与靶基因启动子区的生物和非生物应激反应顺式作用元件结合，如乙烯反应元件(GCC-box，核心基序：A/GCCGCC)和脱水反应元件/C-重复序列(DRE/CRT，核心基元：G/ACCGAC)(Allen等，1998年)。DREB亚组蛋白质包含一个AP2保守结构域，该结构域特异性地结合于其调控基因的DRE/CRT顺式作用元件(Shi等，2018)。番茄中DREB亚组蛋白之一SlDREB的超表达通过下调GA生物合成的关键基因影响GA的生物合成，从而限制节间伸长并导致矮化。SlDREB可能通过结合SLCP的DRE/CRT元件，在植物中充当SLCP的直接阻遏子(Li等，2012)。因此，发明人假设OsDREB2B可能具有与SlDREB类似的功能。OsAP2-39是一种属于ERF亚组的AP2/ERF蛋白，可与目标GA失活基因OsEUI启动子中的GCC-box结合，OsEUI是一种对非13-羟基化气体的16α，17环氧化进行催化的酶，已证明可使水稻中的赤霉素失活(Yaish等，2010)。OsDREB2B蛋白具有反式激活活性，定位于细胞核(图6)。在发明人的OE株系中，OsAP2-39的转录表达上调(图7的A)，OsDREB2B直接与OsAP2-39启动子结合(图7的B-D)。OsDREB2B可以特异性结合到DRE/CRT元件(Chen等，2008年)，并且OsAP2-39的启动子区域存在DRE/CRT顺式元件，表明OsDREB2B通过结合其启动子中的DRE/CRT元件直接调节OsAP2-39的转录水平表达量。在本研究中，在转录表达发生改变的基因中(图5)，四个GA代谢基因至少具有一个GCC-box，5个基因在其启动子区具有DRE/CRT顺式元件，这表明OsDREB2B可能直接调节含有DRE/CRT元件的基因，并通过与OsAP2-39启动子的结合，间接调节含有GCC-box的基因。

许多AP2/ERF转录因子通过与其他转录因子的相互作用调节植物生长发育和应激反应，例如BR调节、WRKY、MYB和锌指转录因子。在本研究中，OsDREB2B与WRKY转录因子OsWRKY21发生物理相互作用，并通过Y2H分析和BiFC分析得到验证(图8)。OsWRKY21超表达水稻表现出矮化表型，并调节GA代谢和细胞壁生物合成相关基因的表达。有趣的是，在15个表达发生变化的基因中，10个基因在其启动子区中至少具有一个W-box的重复序列。OsDREB2B和WRKY21相互作用可调节GA代谢基因的表达，这些基因在其启动子中含有W-box和/或DRE/CRT顺式元件。在未来的研究中，创制以Oswrky21敲除突变体为背景的OsDREB2B超表达水稻或/和以osdreb2b敲除突突变体为背景的OsWRKY21超表达水稻，阐明蛋白互作对植物生长和发育的分子机制。

发明人提出了通过调节GA代谢途径控制水稻株高的OsDREB2B模型(图9)。OsDREB2B通过与OsWRKY21相互作用直接结合DRE/CRT-box或W-box元件，或通过激活OsAP2-39基因与GCC-box间接结合的方式上调GA失活基因。相反，未鉴定的转录抑制因子抑制OsAP2-39，WRKY21/OsDREB2B复合物结合于GA生物合成基因的启动子区域，导致转录抑制。GA代谢基因的正调控和负调控导致生物活性赤霉素的减少，从而降低水稻的株高。

总之，OsDREB2B是一种AP2/ERF转录因子，通过下调GA生物合成基因来调节生物活性GA含量，并通过与OsAP2-39启动子结合并与OsWRKY21相互作用的方式上调GA失活基因，从而负向调节水稻植株高度。OsDREB2B对植物生长和胁迫响应的串扰机制将在未来的研究中进一步阐明。

Claims (3)

1.一种AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于，在水稻株高调节中的应用。

2.一种水稻AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的超表达载体，其特征在于，含有OsDREB2B基因表达盒---含玉米泛素基因Ubi启动子，目的基因OsDREB2B，终止子为农杆菌的胭脂碱合成酶编码区的3`端非翻译区NOS和筛选标记基因表达盒---含花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S，标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT，终止子NOS。

3.一种含有权利要求2所述水稻AP2/ERF转录因子OsDREB2B基因的超表达载体的重组细胞。

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