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WO2014208508A1 - 作物の収量に関わる遺伝子及びその利用 - Google Patents

作物の収量に関わる遺伝子及びその利用 Download PDF

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Publication number
WO2014208508A1
WO2014208508A1 PCT/JP2014/066590 JP2014066590W WO2014208508A1 WO 2014208508 A1 WO2014208508 A1 WO 2014208508A1 JP 2014066590 W JP2014066590 W JP 2014066590W WO 2014208508 A1 WO2014208508 A1 WO 2014208508A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
seq
rice
dna
taw1
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/066590
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
経塚　淳子
吉晃 長村
佐藤　豊
Original Assignee
独立行政法人農業生物資源研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人農業生物資源研究所 filed Critical 独立行政法人農業生物資源研究所
Publication of WO2014208508A1 publication Critical patent/WO2014208508A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to rice having an increased number of persimmon grains per ear. More specifically, the present invention relates to rice having increased expression of TAWAWA1 (TAW1) gene.
  • TAW1 TAWAWA1
  • Non-Patent Document 1 describes that the rice MADS22 gene is expressed in the developing rice embryo L1 layer and stamen primordium. However, there is no suggestion of a relationship between the MADS22 gene and the number of pods per ear. Moreover, nothing is described about the rice TAW1 gene.
  • Non-Patent Document 2 describes that the expression level of TAW1 is increased as compared to the wild type by inserting endogenous transposon nDART1 into the 3′UTR region of the TAW1 gene. However, no specific function of the TAW1 gene has been analyzed. In FIG.
  • Non-Patent Document 4 describes Arabidopsis thaliana in which rice MADS22 or MADS55 is introduced and forcibly expressed. However, there is no suggestion of a relationship between the MADS22 gene or the MADS55 gene and the number of pods per rice seed. Moreover, nothing is described about the rice TAW1 gene.
  • the object of the present invention is to increase the yield of rice, more specifically, to increase the number of rice grains per rice spike.
  • the present inventors obtained a TAW1 mutant from a mutant in which the branching pattern of the inflorescence was changed.
  • the TAW1 mutant showed increased rice yield, and the mutants with increased yield showed increased expression of MADS22 and MADS55.
  • transformants of these genes were prepared, an increase in the number of grains was observed.
  • the inventors completed the invention in this way.
  • One embodiment of the present invention includes rice in which the number of grains has increased due to increased expression of MADS22 and MADS55 as a result of increased expression of TAW1.
  • the present invention is as follows. (1) A trait that is transformed with the MADS22 gene or the MADS55 gene, or the MADS22 gene and the MADS55 gene, the introduced gene is expressed, and the number of pods per ear is increased compared to the wild type Transformed rice, wherein the MADS22 gene is any one of the following DNAs (a) to (e) and the MADS55 gene is any one of the following DNAs (f) to (j).
  • A DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
  • B DNA comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6,
  • C A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, and granulation of persimmon per ear DNA encoding a protein having a function of increasing the number
  • D a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and having a function of increasing the number of buds per ear; DNA to encode,
  • E DNA having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, added and / or inserted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6; DNA encoding a protein having a function of increasing the number of grains of
  • a method for producing transformed rice comprising the following steps (a) to (c), wherein the number of persimmon grains per ear is increased compared to the wild type.
  • a method for increasing the number of rice grains per ear of rice as compared with the wild type comprising the following steps (a) to (c): (A) transforming rice cells with MADS22 gene or MADS55 gene, or MADS22 gene and MADS55 gene; (B) a step of regenerating a rice plant from rice cells transformed with the gene; (C) A step of selecting a transformed rice plant in which the introduced gene is expressed and the number of pods per ear is increased compared to the wild type.
  • A DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
  • B DNA comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6,
  • C A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, and granulation of persimmon per ear DNA encoding a protein having a function of increasing the number
  • D a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and having a function of increasing the number of buds per ear; DNA to encode,
  • E DNA having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, added and / or inserted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6; DNA encoding a protein having a function of increasing the number of grains of
  • a DNA in which the endogenous MADS55 gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or a DNA that hybridizes with a complementary sequence of SEQ ID NO: 7 under stringent conditions, and overexpressed in rice The rice according to (6) or (7), which is a DNA encoding a protein having a function of increasing the number of grains of koji.
  • the number of grains per ear of rice increases and the yield increases as a whole.
  • rice having an increased number of grains per ear can be obtained by increasing the expression of TAW1 gene to induce the expression of endogenous MADS22 and MADS55.
  • TAW1 gene, MADS22 gene or MADS55 gene is moderate.
  • the number of spikes can be increased without adversely affecting the growth of the spikes.
  • the present inventors have found a gene that has never been seen before, and the control of the development process is directly linked to the increase in yield, and is likely to be directly linked to the practical use such as the production of rice with increased yield. .
  • the yield can be increased without impairing the taste of Koshihikari.
  • A A schematic diagram of an inflorescence of rice called “ear”. DTP, tip of degenerated cobs; LS, lateral spikelet; PB, primary branch infarct; SB, secondary branch infarct; TS, apical spikelet.
  • B Conceptual diagram for determining meristem specificity. The newly formed meristem (double circle) acquires the spikelet meristem (gray) identity or the branching meristem (BM) identity.
  • SM spike Meristem
  • the BM continues to form the next meristem that repeats the same steps. Eventually, BM acquires SM identity and grows as apical spikelet.
  • Black arrows indicate the occurrence of additional meristems.
  • C Inflorescence of taw1-D mutant (photo).
  • D Number of lateral meristem (LM) formed in the primary branch. The lower bar represents the secondary branch and the upper bar represents the lateral spikelet. Asterisks indicate significant differences from corresponding control (WT) samples (Student t test; ** P ⁇ 0.01).
  • E Frequency of tertiary branch infarction formation. In D and E, WT, taw1-D2 / + and taw1-D2 are 27 cases, 28 cases and 25 cases, respectively. Isolation of TAW1 gene.
  • A The insertion location of nDart1-0 in taw1-D1 and taw1-D2 is shown. The target site replication sequences in taw1-D1 and taw1-D2 are shown as single and double lines, respectively.
  • B Revertant inflorescence (arrow) (photo). Inflorescence including spikelets developed in taw1-D1 homozygous plants. From here, no inflorescence is formed due to suppression of stem elongation.
  • TAW1 genomic region containing a 3 kb promoter region, coding region, and 1 kb 3′UTR was introduced into WT rice.
  • Transgenic plants (GTAW1: Gain of TAW1 copy number) show an increased branching phenotype that mimics the taw1-D mutant.
  • A Inflorescence of WT and transgenic plants (photo). Scale bar is 5cm.
  • B The number of side meristems growing as secondary limbs (lower layer) and the number of side spikelets in the primary limb (upper layer).
  • C Number of side meristems growing as tertiary branch (lower layer) and number of side spikelets in secondary branch (upper layer).
  • TAW1 expression pattern (A and B) Localization of TAW1-GFP fluorescence in rice shoots during vegetative growth (photos). The TAW1-GFP construct was expressed under the control of the regulatory sequence of the TAW1 gene.
  • the construct was introduced into the taw1-3 mutant and confirmed to rescue the mutant phenotype.
  • the part of the young leaf surrounded by the square of A is shown in B.
  • (CG) Vegetative long-term shoot apex (C), inflorescence meristem (D), very young inflorescence in the early stage of primary branch infestation (E), very young inflorescence in the late stage of primary branch infestation in wild type plants (F) and in-situ hybridization analysis of TAW1 expression in immature inflorescence (G) in the spikelet meristem development stage (photo).
  • TAW1 expression in taw1-D1 homozygous inflorescences during SM development was stronger in the taw1-D1 mutant than in the wild type, and the signal continued in the immature ear at the stage where SM was developed (H) and at a later stage (I).
  • J Quantitative RT-PCR analysis of TAW1 expression in inflorescence inflorescence stage. The numerical value represents the mean value of TAW1 expression ⁇ standard deviation (SD) relative to UBIQUITIN (3 cases). The amino acid sequence of TAW1. conserveed regions and nuclear translocation signals are indicated by gray and black underlines, respectively.
  • the SVP subfamily MADS box gene functions downstream of TAW1.
  • A 32 MADS box genes (OsMADS14, 15, 18) in inflorescences of taw1-D2 / + (open) and taw1-D2 (colored or italic) plants relative to their expression levels in wild type plants , 20 for AP1 / FUL, OsMADS1, 5, 34, 7, 8 for SEP, OsMADS50 for SOC1, OsMADS16, 2, 4, 3, 13, 58 for P1 / AP3 / AG, OsMADS26, 33 for AGL12
  • OsMADS22, 47, and 55 correspond to SVP
  • OsMADS23, 25, 27, and 61 correspond to AGL17
  • OsMADS6 and 17 correspond to AGL6,
  • OsMADS29, 30, 31, 65, and 32 correspond to Others).
  • CE the sample size is 23 for Koshihikari and 24 for taw1-D2 homozygous BC 5 F 2 plants. All data are shown as mean ⁇ SD. Asterisks indicate significant differences from corresponding Koshihikari control samples (Student t test; * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • One aspect of the rice of the present invention is that the MADS22 gene or the MADS55 gene, or the MADS22 gene and the MADS55 gene are transformed, the introduced gene is expressed, and the number of pods per ear is wild type.
  • the number of transformed rice increased compared to
  • the endogenous MADS22 gene in the inflorescence stage inflorescence is increased by increasing the expression of the endogenous TAWAWA1 (TAW1) gene in the inflorescence stage inflorescence compared to the wild type.
  • the MADS55 gene is overexpressed compared to the wild type, and the number of pods per ear is increased compared to the wild type.
  • the expression of the TAW1 gene can be increased.
  • the TAW1 gene is a gene existing between Os10g0477800 and Os10g0478000 of rice chromosome 10.
  • the rice of the present invention is, for example, taw1-D1 and taw1-D2, and in these rice, an endogenous transposon is inserted between Os10g0477800 and Os10g0478000 of chromosome 10, and the expression of TAW1 gene is increased.
  • the expression of downstream MADS22 gene or MADS55 gene is also increased.
  • the TAW1 gene is preferably a DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (coding region: 612-1223), and the TAW1 gene increases the number of persimmon grains per ear by overexpression in rice. As long as it has a function, it may be a DNA having a sequence that hybridizes with a complementary sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
  • stringent conditions with respect to DNA refers to highly stringent conditions. The basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • stringent hybridization conditions include, for example, hybridization at 60 ° C.
  • TAW1 gene has a function of increasing the number of persimmon grains per ear by overexpression in rice, one or several bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, or added. And / or DNA comprising an inserted base sequence.
  • “1 or several bases” is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, particularly preferably 1 to 9 bases.
  • the TAW1 gene of the present invention preferably encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the TAW1 gene may have a conservative mutation that does not substantially affect the function of the TAW1 gene. That is, it may be a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the “one or several amino acid residues” is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 amino acid residues.
  • the TAW1 gene of the present invention is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as long as it has a function of increasing the number of pods per ear. %, More preferably 95%, most preferably 98% amino acid identity.
  • the cDNA sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the TAW1 gene is a gene that fine-tunes the timing at which the development process of a spike progresses.
  • the gene expression increases, the number of florets (becomes rice) per spike increases, and when the expression decreases, the number of florets decreases. Decrease.
  • branching may be repeated indefinitely. Therefore, in the present invention, in order to increase the yield of rice, a moderate increase in expression of the TAW1 gene is required.
  • a strong signal of the TAW1 gene is expressed in an inflorescence branch incision meristem (BM: Branching Meristem), that is, TAW1 expression in an inflorescence in the spikelet development stage is preferable.
  • BM Branching Meristem
  • the relative ratio of expression between the TAW1 gene and ubiquitin is preferably 0.1 to 0.3.
  • the level of expression of the TAW1 gene in the inflorescence stage inflorescence is preferably 1.5 to 3 times the amount of mRNA compared to the wild type. The expression level can be measured by, for example, quantitative RT-PCR.
  • Increased expression of the TAW1 gene preferably results in a spikelet that results in a phenotype that moderately increases the function of the TAW1 gene, i.e., the generation of tertiary branching caused by the growth of secondary branching. It means that the expression of TAW1 gene in the inflorescence is moderately increased.
  • Elevation of TAW1 gene expression includes promotion of transcription of TAW1 gene, promotion of splicing of transcripts, and promotion of translation into protein.
  • the “increased rice yield” preferably means that the number of lateral meristem (LM) in the inflorescence meristem (IM: Inflorescence Meristem) is the same as that in rice and wild Type rice is equivalent to the number of wild type rice, but due to the fact that LM differentiates as a secondary branch primordium at a high rate, tertiary branch is not formed in wild type plants. Is due to. As a result, the number of pods per rice spike increases.
  • LM lateral meristem
  • IM Inflorescence Meristem
  • the method for producing rice of the present invention is not particularly limited as long as it can produce rice with increased expression of the TAW1 gene and / or MADS22 gene or MADS55 gene described below, but other than transposon transfer, for example, a chemical mutagen in a plant body. It may be a plant body in which mutagenesis, viral infection, or natural mutation is caused by treatment or radiation treatment, resulting in increased expression of these genes.
  • the rice of the present invention may be rice in which the MADS22 gene and / or MADS55 gene is enhanced by enhancing expression of the endogenous TAW1 gene, but independently of rice, the rice in which the MADS22 gene and / or MADS55 gene is overexpressed It may be.
  • the MADS22 gene and / or MADS55 gene may be overexpressed by modification of the expression control region of the MADS22 gene and / or MADS55 gene, or transformation using the MADS22 gene and / or MADS55 gene.
  • the MADS22 gene used in the present invention is preferably DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 4 (genomic sequence) or SEQ ID NO: 6 (coding region), but by overexpression in rice, As long as it has a function of increasing the number of pods, it may be DNA having a sequence that hybridizes with a complementary sequence of SEQ ID NO: 4 or 6 under stringent conditions.
  • the MADS55 gene is preferably DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 7 (genomic sequence) or SEQ ID NO: 9 (coding region), but by overexpressing it in rice, the number of persimmon grains per ear can be increased.
  • stringent conditions for a polynucleotide refers to highly stringent conditions. Basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. In the present invention, stringent hybridization conditions include, for example, 5XSSC, 7% (W / V) SDS, 100 microgram / ml denatured salmon sperm DNA, 5X as described in Japanese Patent No. 5109128.
  • Examples of the conditions include hybridization in a solution containing Denhardt's solution at 60 ° C., and then washing in 0.1XSSC at 65 ° C. with shaking for 2 hours.
  • 1 or several bases are substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. It may be a DNA consisting of a deleted, added, and / or inserted nucleotide sequence.
  • the MADS55 gene has a function of increasing the number of persimmon grains per ear by being overexpressed in rice, one or several bases are substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9. It may be a DNA consisting of a deleted, added, and / or inserted nucleotide sequence.
  • “1 or several bases” is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, particularly preferably 1 to 9 bases.
  • the MADS22 gene or MADS55 gene preferably encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 8.
  • the MADS22 gene or the MADS55 gene may have a conservative mutation that does not substantially affect its activity as long as it has the function of increasing the number of persimmon grains per ear by overexpression in rice. Good. That is, it may be a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 8.
  • the “one or several amino acid residues” is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 amino acid residues.
  • the MADS22 gene or the MADS55 gene is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, still more preferably 95%, most preferably 98% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 8. It may encode a protein having the amino acid identity of
  • the cDNA sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is shown as SEQ ID NO: 6
  • the cDNA sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is shown as SEQ ID NO: 9.
  • the relative ratio of the expression levels of the MADS22 gene and ubiquitin in the rice of the present invention is preferably 2-5.
  • the expression level of the MADS22 gene is preferably 1.5 to 4 times that of the wild type.
  • the relative ratio of the expression of the MADS55 gene and ubiquitin in the rice of the present invention is preferably 0.1 to 0.3.
  • the expression level of the MADS55 gene is preferably 2 to 8 times that of the wild type.
  • the expression of MADS22 gene and / or MADS55 gene can be measured by, for example, quantitative RT-PCR.
  • the rice of the present invention can also be obtained by transforming rice using the MADS22 gene and / or MADS55 gene.
  • rice can be transformed with a recombinant vector encoding the MADS22 gene and / or the MADS55 gene.
  • the vector into which the MADS22 gene and / or the MADS55 gene is inserted is not particularly limited as long as it can exert the function of the insert in plant cells.
  • a vector having a promoter eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter or corn ubiquitin promoter
  • plant cells include various forms of plant cells such as seeds, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
  • a vector For introduction of a vector into a plant cell, various methods known to those skilled in the art such as a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation method), an Agrobacterium-mediated method, and a particle gun method can be used.
  • Agrobacterium for example, EHA101, EHA105
  • an ultra-rapid monocotyl transformation method Japanese Patent No. 314084
  • a product from Bio-Rad can be used.
  • Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells.
  • a method for producing a transformed plant body in rice a method for regenerating a plant body (suitable for Indian rice varieties) by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp.
  • the rice of the present invention is a progeny obtained by mating the above-mentioned transformed rice within the transformed rice line or by mating with other rice lines, for example, rice cultivars such as Koshihikari, It may be a transgenic rice in which the number of pods per ear is increased compared to the wild type.
  • the rice used in the present invention is not limited as long as it has a TAW1 gene, MADS22 gene or MADS55 gene, and examples thereof include Koshihikari, Hinohikari, Hinohikari, Kinuhikari and the like.
  • Example 1 tawawa1-D plants form inflorescences with an increased branching phenotype
  • nDart1 an endogenous transposon of rice, actively metastasized
  • TAW1 encodes a nuclear protein belonging to the ALOG family
  • the TAW1 gene was isolated by transposon tagging.
  • the inserted nDart1 completely co-segregated with the (nDart1-0) mutant phenotype, and the inserted nDart1 was identified by transposon display analysis using taw1-D1 / + isolated seedlings (FIG. 2A).
  • the transposon display was performed as follows. Transposon display was performed according to Genes Genet Syst 82 (2): 109-122 (2007).
  • Genomic DNA samples isolated from taw1-D1 mutant seedlings and taw1-D2 mutant seedlings were digested with 4 base pair recognition restriction enzymes and ligated with adapters containing MspI sites. PCR products from two cycles of amplification using adapter primers and Dart 5'-3b-first primer and Dart 5'-1,2,3-second / N primer were visualized by electrophoresis. A band that co-separates with the taw1-D phenotype was isolated from the gel and the band was amplified using an adapter primer and a primer set of Dart5′-1,2,3-second / Nt primer.
  • the DNA sequence of the amplified band was determined according to Mol Genet Genomics 284 (5): 343-355 (2010). As a result, a transposon was inserted between Os10g0477800 and Os10g0478000 of chromosome 10. Interestingly, the insertion sites for taw1-D1 and taw1-D2 were 16 base pairs apart (FIG. 3A). Rough mapping also narrowed the TAW1 locus to this region.
  • Os10g04778000 increased in the inflorescence of the mutant, whereas Os10g0477800 and Os10g0478100 were expressed at similar levels in the inflorescence of the mutant plant and the wild type plant (FIG. 2B).
  • Introduction of a genomic region containing Os10g0478000 into a wild-type rice plant resulted in a weak taw1-D-like mutant phenotype (FIG. 4). Based on these results, we concluded that Os10g0478000 is a TAW1 gene.
  • TAW1 encodes a protein consisting of 205 amino acids belonging to the ALOG family, and ALOG is named after its early identified members (Arabidopsis LSH1 and rice G1) (Plant J 37 (5): 694). -706 (2004), Proc Natl AcadSci USA 106 (47): 20103-20108 (2009)). Rice genome contains 10 kinds of ALOG genes, but Arabidopsis contains 11 kinds (Plant J 37 (5): 694-706 (2004), Proc Natl Acad Sci USA 106 (47): 20103-20108 (2009), Proc Natl Acad Sci USA 108 (5): 2154-2159 (2011), Plant J 66 (6): 1066-1077 (2011), Plant Mol Biol 78 (4-5): 351-359 (2012)).
  • TAW1 is expressed in meristem to suppress conversion to Shoot Meristem (SM) identity
  • TAW1 contains a conserved domain and a nuclear translocation signal (FIG. 6A). Indeed, TAW1 is localized in the cell nucleus and shows a slight but distinct activity as a transcriptional activator (FIGS. 5A and B).
  • SAM shoot apical meristem
  • LM LM
  • young leaves FIGS. 5A and C
  • TAW1 mRNA continued to accumulate in IM (FIG. 5D).
  • TAW1 positively regulates SVP family MADS box genes
  • SVP SHORT VEGETATE PHASE subfamily
  • RNA probe was prepared using the partial cDNA sequence of TAW1 amplified by PCR and cloned into the pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) as a template.
  • the primer set for amplifying TAW1 cDNA was as follows. 5′-CACCGCGTCAGCTACGAGAAGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 10), 5'-ATTAGATGCAGTAGCAGCAGC-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • the probe for OsMADS47 was synthesized using cDNA (J075171C16) provided by the Rice Genome Resource Center (www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html).
  • the cauliflower mosaic virus was constructed as follows. The full length cDNA of SHORT VEGETATICE PHASE (SVP) containing the entire ORF was amplified using the following primer set.
  • pGWB2 a binary vector carrying the cauliflower mosaic virus 35S promoter was used (Hoshikawa K (1989) The Growing Rice Plant (Nosan Gyoson Bunka Kyokai, Tokyo). PENTR-SVP was subjected to LR recombination reaction ( The obtained pGWB2-SVP was introduced into callus derived from mature seeds of rice (cv. Nipponbare) by transformation using the Agrobacterium method.
  • OsMADS22 and OsMADS55 were constitutively overexpressed by the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, an increase in inflorescence branching was caused (FIG. 7E).
  • taw1-D2 is a moderate gain-of-function allele that may be useful in increasing grain yields. Number of grains per ear is one of four major factors that determine rice yield It is.
  • TAW1 mutations we crossed the taw1-D2 allele with moderate phenotype to Koshihikari, a major commercial rice cultivar in Japan (Fig. 8A and B).
  • the plant material was as follows. The taw1-D2 mutation was introduced into Koshihikari by 5 consecutive backcrosses. The resulting BC5F2 plant and Koshihikari seeds were sown on May 28, 2011.
  • the present invention is useful in the field of rice breeding.

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Abstract

イネの収量を増加させること、より詳細には、イネの１穂当たりの籾の着粒数を増加させること。 MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子で形質転換され、該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ。

Description

作物の収量に関わる遺伝子及びその利用
　本発明は、１穂当たりの籾の着粒数が増加したイネに関する。より詳細には、TAWAWA1（TAW1）遺伝子の発現が上昇したイネに関する。
　イネの穂は、その発生過程において、枝梗(しこう)とよばれる枝分かれがまず作られ、その後にすべての枝に花がつき、それぞれの花が１粒のコメになって穂ができあがる。したがって、枝分かれが多く形成されると、１つの穂につくコメの数も増加する。生物の発生過程の進行は、多数の遺伝子の協調的な作用により厳密に制御されている。イネ穂の発生における枝つくりから花つくりへのプログラム進行も遺伝子によって精巧に制御されていると考えられるが、その制御の実態はわかっていない。また、このプログラム進行のタイミングはイネ穂につくられるコメの数に直接的に影響するはずである。
　これまで、花の発生は基礎研究的な観点から多くの研究が行われてきた。また、近年、作物の収量に関する遺伝子レベルでの研究が発展し、収量を左右する遺伝子の単離も報告されている。イネの収量性向上を追求した研究・技術においては、最適な施肥方法・技術の開発、栽植密度、種子の数・形や大きさの改良等、多面的に改善が図られてきた。しかしながら、花の発生メカニズムの解明という基礎研究と収量を直接つなぐ遺伝子レベルでの知見はほとんどなく、この問題が解決できれば、さらに収量の高い米作りが期待できる。
　非特許文献１には、イネMADS22遺伝子が発生中のイネ胚L1層及び雄しべの原基で発現することが記載されている。しかしながら、MADS22遺伝子と１穂当たりの籾の着粒数との関係は示唆されていない。また、イネTAW1遺伝子については何ら記載されていない。
　非特許文献２には、TAW1遺伝子の3'UTR領域に内在性トランスポゾンnDART1が挿入されることにより、TAW1の発現量が野生型よりも増加することが記載されている。しかしながら、TAW1遺伝子の具体的機能については何ら解析されていない。
　非特許文献３の図２では、イネTAW1遺伝子にトランスポゾンnDART1が導入された結果、イネの２次枝梗数が増加し、個体当たりの収量が増加したことが記載されている。しかしながら、TAW1遺伝子の具体的な発現の程度については何ら開示がない。
　非特許文献４では、イネのMADS22またはMADS55を導入して強制発現させたシロイヌナズナが記載されている。しかしながら、MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子とイネの１穂当たりの籾の着粒数との関係は示唆されていない。また、イネTAW1遺伝子については何ら記載されていない。
Mol Gen Genomics (2005)273:1-9 吉田明希子ら、６０４　イネ穂の枝分かれを制御するTAW1遺伝子の解析、育種学研究　日本育種学会第１１９回講演会要旨集　第１３巻別冊１号　２０１１年３月 前川雅彦ら、６１８　機能未知遺伝子TAW1へのnDart1挿入系統における収量増加、育種学研究　日本育種学会第１２１回講演会要旨集　第１４巻別冊１号　２０１２年３月 Plant Science 185-186(2012)97-104
　本発明は、イネの収量を増加させること、より詳細には、イネの１穂当たりの籾の着粒数を増加させることを課題とする。
　本発明者らは、花序の分枝パターンが変化した変異体からTAW1の変異体を得た。TAW1の変異体は、イネの収量が増大しており、収量が増大した変異体においてMADS22、MADS55の発現上昇がみられた。これらの遺伝子の形質転換体を作製したところ、着粒数の増加がみられた。本発明者らはこのようにして発明を完成させた。
　本発明の一態様としては、TAW1の発現上昇の結果、MADS22、MADS55の発現が上昇することにより着粒数が増加したイネが挙げられる。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子で形質転換され、該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネであって、MADS22遺伝子が以下（ａ）から（ｅ）のいずれかのＤＮＡであり、MADS55遺伝子が以下（ｆ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡである、形質転換イネ。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｇ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｊ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネの作製方法。
（ａ）MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子でイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該遺伝子で形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程、
（ｃ）該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ植物体を選抜する工程。
（３）以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、イネの１穂当たりの籾の着粒数を野生型と比較して増加させる方法。
（ａ）MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子でイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該遺伝子で形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程、
（ｃ）該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ植物体を選抜する工程。
（４）MADS22遺伝子が以下（ａ）から（ｅ）のいずれかのＤＮＡであり、MADS55遺伝子が以下（ｆ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡである、（２）に記載の形質転換イネの作製方法又は（３）に記載のイネの１穂当たりの籾の着粒数を野生型と比較して増加させる方法。
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｇ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｊ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）（２）又は（４）に記載の形質転換イネの作製法によって作製された形質転換イネの該形質転換イネ系統内での交配又は該形質転換イネ系統と他のイネ系統との交配によって得られた後代であって、導入されたMADS22遺伝子又はMADS55遺伝子を有し、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ。
（６）小穂発生期の花序での内在性TAWAWA1(TAW1)遺伝子の発現を野生型と比較して上昇
させることにより、小穂発生期の花序での内在性MADS22遺伝子または内在性MADS55遺伝子が野生型と比較して過剰に発現され、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加したイネ。
（７）内在性TAW1遺伝子の発現制御領域の改変によって該TAW1遺伝子の発現が上昇した、（６）に記載のイネ。
（８）内在性TAW1遺伝子が配列番号１で示される配列を有するＤＮＡ、または、配列番号１の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、
　内在性MADS22遺伝子が配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、または、配列番号４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、
　内在性MADS55遺伝子が配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、または、配列番号７の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、（６）または（７）に記載のイネ。
　MADS22又はMADS55を形質転換で導入し発現させることによって、イネの１穂当たりの着粒数が増え、全体として収量が増加する。本発明の一形態においては、TAW1遺伝子の発現を上昇させて内在性MADS22、MADS55の発現を誘導することにより、１穂当たりの着粒数が増加したイネを得ることができる。
　通常、生物の発生は高度な調節を受けており、TAW1作用の過度の増強は穂の正常な生育を阻害するが、本発明のイネでは、TAW1遺伝子、MADS22遺伝子もしくはMADS55遺伝子の発現の適度な上昇により穂の成長が悪影響を受けることなく、穂の粒数を増加できる。
　本発明者らは、これまでに例がない、発生過程の制御が収量の増加にそのまま結びつく遺伝子を見出したものであり、収量が増加したイネの作出等の実用化に直結する可能性が高い。
　本発明のイネを、例えば、コシヒカリと交配することにより、コシヒカリの食味を損なうことなく収量を増加させることができる。
ｔａｗ１優性変異体の特性解析。（Ａ）「穂」と呼ばれるイネの花序の模式図。ＤＴＰ、退化した穂軸の先端；ＬＳ、側性小穂；ＰＢ、一次枝梗；ＳＢ、二次枝梗；ＴＳ、頂端小穂。（Ｂ）メリステム特異性決定の概念図。新規に形成されたメリステム（二重丸）は小穂メリステム（灰色）アイデンティティか枝梗メリステム（ＢＭ：Branching Meristem）（白抜き）アイデンティティを獲得する。シュートメリステム（ＳＭ：Shoot Meristem）は花と頂端を形成する。ＢＭは、同じステップを繰り返す次のメリステムを形成し続ける。最終的には、ＢＭはＳＭアイデンティティを獲得し、頂端小穂として成長する。黒矢印は付加的なメリステムの発生を示す。（Ｃ）ｔａｗ１－Ｄ変異体の花序（写真）。（Ｄ）一次枝梗に形成された側部メリステム（LM：Lateral Meristem）の数。下側の棒は二次枝梗を表し、上の棒は側性小穂を表す。アスタリスクは対応する対照（ＷＴ）試料からの有意差を示す（スチューデントのｔ検定；**Ｐ＜０．０１）。（Ｅ）三次枝梗形成の頻度。ＤおよびＥにおいて、ＷＴ、ｔａｗ１－Ｄ２／＋およびｔａｗ１－Ｄ２は、それぞれ、２７例、２８例および２５例。 ＴＡＷ１遺伝子の単離。（Ａ）花序表現型と共分離する４番染色体上の領域へのｎＤａｒｔ１－０の挿入。（Ｂ）挿入部位周辺の遺伝子の未成熟花序における発現レベル。ヘテロ接合性（ｔａｗ１－Ｄ１／＋）変異体およびホモ接合性（ｔａｗ１－Ｄ１）変異体の野生型植物に相対的な発現レベルが数値で表される。（Ｃ）ｔａｗ１－３およびそのＷＴ植物であるＴ６５（台中６５）の花序（写真）。（Ｄ）花序当たりの一次枝梗の数。ＷＴ（Ｔ６５）、ｔａｗ１－３、ＷＴ（Ｎ）、およびｔａｗ１－４は、それぞれ、７例、５例、９例および７例である。アスタリスクは対応する対照試料からの有意差を示す（スチューデントのｔ検定；**Ｐ＜０．０１）。（Ｅ）ＲＮＡｉ植物およびＷＴ植物の花序（写真）。 nDart1の挿入および切除。（Ａ）taw1-D1およびtaw1-D2におけるnDart1-0の挿入箇所を示す。taw1-D1およびtaw1-D2における標的部位の複製配列をそれぞれ一重線および二重線で示す。（Ｂ）復帰変異体花序（矢印）（写真）。taw1-D1ホモ接合性植物において発生した小穂を含む花序。ここからは、茎の伸長の抑制に起因して、花序が形成されない。小穂は、taw1-D1ホモ接合性植物では生じない。従って、小穂を有する花序は、挿入されたnDart1の切除によって引き起こされる体細胞復帰変異を含む細胞から生じたようである。白色のボックスは花序を示す。左側の画像は、花序の拡大図である。スケールバーは１０ｃｍである。（Ｃ）復帰変異体におけるTAW1遺伝子の配列解析は、独立した復帰変異事象での、nDart1の切除および６ｋｂまたは８ｋｂの外部配列の挿入を示す。 TAW1ゲノム領域のＷＴイネへの導入。３ｋｂプロモーター領域、コード領域、および１ｋｂ　３’ＵＴＲを含むTAW1ゲノム領域をＷＴイネへ導入した。トランスジェニック植物（GTAW1：Gain of TAW1 copy number）は、taw1-D変異体を模倣する分岐表現型の増加を示す。（Ａ）ＷＴおよびトランスジェニック植物の花序（写真）。スケールバーは５ｃｍ。（Ｂ）二次枝梗として成長する側部メリステムの数（下層）および一次枝梗における側部小穂の数（上層）。（Ｃ）三次枝梗として成長する側部メリステムの数（下層）および二次枝梗における側部小穂の数（上層）。（Ｄ）花序当たりの二次枝梗の総数。（Ｅ）花序当たりの三次枝梗の総数。（Ｆ）花序当たりの小穂の総数。全てのデータは平均値±ＳＤで示される；ｎ＝３植物（＃２８）、４植物（ＷＴ）、５植物（＃３および＃４）。アスタリスクは対応する対照ＷＴからの有意差を示す（スチューデントのｔ検定；**Ｐ＜０．０１）。 ＴＡＷ１の発現パターン。（ＡおよびＢ）栄養生長期のイネシュートにおけるＴＡＷ１－ＧＦＰ蛍光の局在（写真）。ＴＡＷ１遺伝子の調節配列の制御下でＴＡＷ１－ＧＦＰコンストラクトが発現した。コンストラクトはｔａｗ１－３変異体に導入され、変異体の表現型をレスキューすることが確認された。Ａの四角で囲んだ幼葉の部分がＢに示される。（Ｃ～Ｇ）野生型植物における、栄養生長期の茎頂（Ｃ）、花序メリステム（Ｄ）、一次枝梗発生初期の非常に若い花序（Ｅ）、一次枝梗発生後期の非常に若い花序（Ｆ）、および小穂メリステム発生期の未成熟な花序（Ｇ）でのＴＡＷ１の発現のin situハイブリダイゼーション解析（写真）。白色矢頭、葉原基；灰色矢頭、一次枝梗メリステム。（ＨおよびＩ）ＳＭ発生期のｔａｗ１－Ｄ１ホモ接合性花序でのＴＡＷ１の発現（写真）。ＴＡＷ１シグナルは野生型よりもｔａｗ１－Ｄ１変異体で強く、ＳＭが発生するステージで（Ｈ）および後のステージでも（Ｉ）未成熟な穂においてシグナルが続いた。（Ｊ）小穂発生期の花序でのＴＡＷ１発現の定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析。数値はＵＢＩＱＵＩＴＩＮに相対的なＴＡＷ１の発現の平均値±標準偏差（ＳＤ）（３例）を表す。 ＴＡＷ１のアミノ酸配列。保存領域および核移行シグナルは、それぞれ灰色および黒色の下線で示す。Taw1-3, taw1-4では、７５番目のＥが変異していた。 ＳＶＰサブファミリーＭＡＤＳボックス遺伝子はＴＡＷ１の下流で機能する。（Ａ）野生型植物での発現レベルに相対的な、ｔａｗ１－Ｄ２／＋（白抜き）およびｔａｗ１－Ｄ２（色付きまたは斜体）植物の花序での３２種類のＭＡＤＳボックス遺伝子（ＯｓＭＡＤＳ１４、１５、１８、２０はＡＰ１／ＦＵＬに、ＯｓＭＡＤＳ１、５、３４、７、８はＳＥＰに、ＯｓＭＡＤＳ５０はＳＯＣ１に、ＯｓＭＡＤＳ１６、２、４、３、１３、５８はＰ１／ＡＰ３／ＡＧに、ＯｓＭＡＤＳ２６、３３はＡＧＬ１２に、ＯｓＭＡＤＳ２２、４７、５５はＳＶＰに、ＯｓＭＡＤＳ２３、２５、２７、６１はＡＧＬ１７に、ＯｓＭＡＤＳ６、１７はＡＧＬ６に、ＯｓＭＡＤＳ２９、３０、３１、６５、３２はＯｔｈｅｒｓに該当する。）の発現レベル。（ＢおよびＣ）二次枝梗発生期の野生型（Ｂ）およびｔａｗ１－Ｄ１（Ｃ）の未成熟花序におけるＯｓＭＡＤＳ４７の発現（写真）。（Ｄ）ＴＡＷ１によるＯｓＭＡＤＳ２２およびＯｓＭＡＤ５５の転写誘導。デキサメタゾン処理有り（＋）、または、デキサメタゾン処理無し（－）での野生型植物およびｐＩＮＤＥＸ－ＴＡＷ１植物におけるＴＡＷ１、ＯｓＭＡＤＳ２２およびＯｓＭＡＤＳ５５発現の相対値が示される。数値は平均値±ＳＤ（３例）である。（Ｅ）３５Ｓ：ＯｓＭＡＤＳ２２（ＯｓＭＡＤＳ２２ｏｘ）植物および３５Ｓ：ＯｓＭＡＤＳ５５（ＯｓＭＡＤＳ５５ｏｘ）植物における花序の形態（写真）。図中のアスタリスクは二次枝梗を示す。 ｔａｗ１－Ｄ２遺伝子移入コシヒカリＢＣ5Ｆ2植物の表現型。（ＡおよびＢ）コシヒカリ（Ｋ）植物（左）およびｔａｗ１－Ｄ２ＢＣ5Ｆ2植物（右）の植物体（Ａ）および穂（Ｂ）（写真）。白色のアスタリスクで三次枝梗に印をつけてある。（Ｃ）植物当たりの総粒重（グラム）。（Ｄ）１穂当たりの穀粒数。（Ｅ）千粒重（グラム）。Ｃ～Ｅにおいて、試料数はコシヒカリについて２３植物およびｔａｗ１－Ｄ２ホモ接合性ＢＣ5Ｆ2植物について２４植物である。全てのデータは平均値±ＳＤで示される。アスタリスクは対応するコシヒカリ対照試料からの有意差を示す（スチューデントのｔ検定；*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１）。
　本発明のイネの一つの態様は、MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子で形質転換され、該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネである。
　本発明のイネの他の態様は、小穂発生期の花序で内在性TAWAWA1(TAW1)遺伝子の発現が野生型と比較して上昇することにより、小穂発生期の花序での内在性MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子が野生型と比較して過剰に発現され、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加したイネである。より詳細には、TAW1遺伝子の発現制御領域に変異導入されることにより、例えば、TAW1遺伝子の発現制御領域に内在性トランスポゾンが挿入されることにより、TAW1遺伝子の発現を上昇させることができる。
　TAW1遺伝子は、イネ１０番染色体のOs10g0477800とOs10g0478000との間に存在する遺伝子である。本発明のイネは、例えば、taw1-D1及びtaw1-D2であり、これらのイネは、１０番染色体のOs10g0477800とOs10g0478000との間に内在性トランスポゾンが挿入され、TAW1遺伝子の発現が上昇し、その下流のMADS22遺伝子またはMADS55遺伝子の発現も上昇している。
　TAW1遺伝子は、好ましくは、TAW1遺伝子が配列番号１（コード領域は612～1223）で示される配列を有するＤＮＡであり、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号１の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するＤＮＡであってもよい。本発明でＤＮＡに関し「ストリンジェントな条件下」というときは、高程度にストリンジェントな条件をいう。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、5XSSC、7%(W/V)SDS、100マイクログラム/ml変性サケ精子DNA、5Xデンハルト液を含む溶液中、60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後65℃で0.1XSSC中、振蘯しながら２時間洗浄する条件が挙げられる。TAW1遺伝子は、さらに、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号１の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。ここで、「１または数個の塩基」とは、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、特に好ましくは１～９個の塩基である。
　本発明のTAW1遺伝子は、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする。また、TAW1遺伝子は、TAW1遺伝子の機能に実質的に影響しない保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個のアミノ酸残基」とは、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個のアミノ酸残基である。なお、本発明のTAW1遺伝子は、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。なお、本発明において、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号３で示す。
　TAW1遺伝子は、穂の発生過程が進行するタイミングを微調整する遺伝子であり、遺伝子の発現が上昇すると１穂あたりの小花（コメになる）の数が増加し、発現が低下すると小花の数が減少する。しかし、TAW1遺伝子が過剰に発現されすぎると、枝分かれが無限に繰り返されることがある。従って、本発明において、イネの収量を増加させるためには、TAW1遺伝子の適度の発現上昇が必要とされる。
　本発明においては、花序の枝梗メリステム（ＢＭ：Branching Meristem）で、TAW1遺伝子の強いシグナルが発現されること、すなわち、小穂発生期の花序でのTAW1発現が好ましい。例えば、TAW1遺伝子とユビチキンとの発現の相対比は、好ましくは、０．１～０．３である。また、小穂発生期の花序でのTAW1遺伝子の発現の程度は、野生型と比較して、ｍＲＮＡの量が、好ましくは、１．５～３倍である。発現量は、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定できる。
　TAW1遺伝子の発現の上昇とは、好ましくは、TAW1遺伝子の機能、すなわち、二次枝梗の成長に起因する三次枝梗の生成を適度に増加させるようにする表現型を生じるように、小穂発生期の花序でのTAW1遺伝子の発現を適度に上昇させることをいう。「TAW1遺伝子の発現の上昇」には、TAW1遺伝子の転写の促進、転写物のスプライシングの促進、およびタンパク質への翻訳の促進が含まれる。
　「イネの収量の増加」とは、好ましくは、花序分裂組織（IM：Inflorescence Meristem）のうち小花原基の側部メリステム（LM：Lateral Meristem）の数は、TAW1遺伝子発現が上昇したイネと野生型イネとで、野生型イネの数と同等であるが、LMが高い割合で二次枝梗原基として分化することに起因して、野生型植物では形成されない三次枝梗が形成されることによるものである。その結果として、イネの１穂当たりの籾の着粒数が増加する。
　本発明のイネの製造方法は、TAW1遺伝子及び／または後述のMADS22遺伝子もしくはMADS55遺伝子の発現が上昇したイネを作製できれば特に制限されないが、トランスポゾン転移以外にも、例えば、植物体に、化学変異原処理または放射線処理による変異誘発、ウイルス感染、自然突然変異を生じさせ、その結果これらの遺伝子の発現が上昇した植物体であってもよい。
　本発明のイネは、内因性TAW1遺伝子の発現増強によりMADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子が増強したイネでもよいが、TAW1遺伝子とは独立して、MADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子が過剰発現されたイネであってもよい。詳細には、MADS22遺伝子および／もしくはMADS55遺伝子の発現制御領域の改変、または、MADS22遺伝子および／もしくはMADS55遺伝子を用いた形質転換によって、MADS22遺伝子および／もしくはMADS55遺伝子が過剰発現されていてもよい。
　本発明で使用されるMADS22遺伝子は、好ましくは、配列番号４（ゲノム配列）または配列番号６（コード領域）で示される配列を有するＤＮＡであるが、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号４または配列番号６の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するＤＮＡであってもよい。
　MADS55遺伝子は、好ましくは、配列番号７（ゲノム配列）または配列番号９（コード領域）で示される配列を有するＤＮＡであるが、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号７または配列番号９の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するＤＮＡであってもよい。
　本発明でポリヌクレオチドに関し「ストリンジェントな条件下」というときは、高程度にストリンジェントな条件をいう。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、特許第5109128号公報に記載されるような、5XSSC、7%(W/V)SDS、100マイクログラム/ml変性サケ精子DNA、5Xデンハルト液を含む溶液中、60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後65℃で0.1XSSC中、振蘯しながら２時間洗浄する条件が挙げられる。
　MADS22遺伝子は、さらに、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号４または配列番号６の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　MADS55遺伝子は、さらに、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、配列番号７または配列番号９の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　ここで、「１または数個の塩基」とは、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、特に好ましくは１～９個の塩基である。
　MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子は、好ましくは、配列番号５または配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする。また、MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子は、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有する限り、その活性に実質的に影響しない保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号５または配列番号８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個のアミノ酸残基」とは、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個のアミノ酸残基である。なお、MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子は、配列番号５または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。なお、本発明において、配列番号５に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号６で示し、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号９で示す。
　本発明のイネにおけるMADS22遺伝子とユビチキンとの発現量の相対比は、好ましくは、２～５である。また、MADS22遺伝子の発現量は、野生型と比較して、ｍＲＮＡの量が、好ましくは、１．５～４倍である。
　本発明のイネにおけるMADS55遺伝子とユビチキンとの発現の相対比は、好ましくは、０．１～０．３である。また、MADS55遺伝子の発現量は、野生型と比較して、ｍＲＮＡの量が、好ましくは、２～８倍である。
　MADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子の発現は、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定することができる。
　本発明のイネは、MADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子を用いてイネを形質転換することによっても得ることができる。例えば、MADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子をコードする組み換えベクターを用いてイネを形質転換することができる。
　MADS22遺伝子および／またはMADS55遺伝子が挿入されるベクターは、植物細胞内で挿入物の機能を発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターやトウモロコシユビキチンプロモーターなど）を有するベクターや、外的な刺激により誘導されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
　植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101、EHA105）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。
　形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg、 Eds）pp.66-74、1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S、etal: Plant Physiol 100: 1503、1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P、et al: Biotechnology 9: 957、1991）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y、et al: Plant J 6: 271、1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
　本発明のイネは、上述の形質転換イネを、該形質転換イネ系統内で交配させること又は他のイネ系統、例えば、コシヒカリなどのイネ栽培種と交配させることによって得られた後代であって、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネであってもよい。
　本発明において使用されるイネとしては、TAW1遺伝子、MADS22遺伝子またはMADS55遺伝子を有するものであれば限定されないが、例えば、コシヒカリ、ヒノヒカリ、ひのひかり、キヌヒカリ等が挙げられる。
　以下に実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
実施例１：tawawa1-D植物は分枝が増加した表現型を示す花序を形成する
　メリステムの相転換の制御と花序構造の間の分子的な関連を理解するために、本発明者らは、花序の分枝パターンが変化した変異体を同定した。イネの内在性トランスポゾンであるｎＤａｒｔ１が活発に転移するスクリーニング集団から分枝が増加した表現型を有する２つの株を単離した（Plant J 45(1):46-57 (2006)）。両方の株でその変異は半優性的に遺伝し、その後の解析により同じ遺伝子内の変異であることが明らかになった。「実りが非常に多い」という意味の日本語の古い言葉から、その遺伝子をTAWAWA1(TAW1)と名付けた。ｔａｗ１－Ｄ１はｔａｗ１－Ｄ２よりも重い欠損を示す。両方の変異株は栄養生長期に正常な成長パターン、例えば、メリステムのサイズ、葉の発生の日時および形成される葉の数を示す。しかしながら、ｔａｗ１－Ｄ１ホモ接合性植物では、生殖生長に移行した後では茎の伸長が抑制され、葉から花序が現れない。一次枝梗で形成されるLMの数は、両方の変異株で野生型植物のものに匹敵するが、LMが高い割合で二次枝梗として成長する（図１Ｄ）。このパターンの反復によって、野生型植物では形成されない三次枝梗が形成することになる（図１Ｅ）。
実施例２：ＴＡＷ１はＡＬＯＧファミリーに属する核タンパク質をコードする
　トランスポゾンタギングによりＴＡＷ１遺伝子を単離した。挿入したｎＤａｒｔ１は（ｎＤａｒｔ１－０）変異体の表現型と完璧に共分離し、ｔａｗ１－Ｄ１／＋の分離した実生苗を用いるトランスポゾンディスプレイ解析により挿入したｎＤａｒｔ１を同定した（図２Ａ）。
　トランスポゾンディスプレイは以下の通り行った。Genes Genet Syst 82(2):109-122 (2007)に従ってトランスポゾンディスプレイを実行した。ｔａｗ１－Ｄ１変異体実生苗およびｔａｗ１－Ｄ２変異体実生苗から単離されたゲノムＤＮＡ試料４塩基対認識制限酵素で消化し、そして、ＭｓｐＩ部位を含むアダプターとライゲーションした。アダプタープライマーとＤａｒｔ５′－３ｂ－ファースト・プライマーおよびＤａｒｔ５′－１、２、３－セカンド／Ｎプライマーを用いる２サイクルの増幅によるＰＣＲ産物を電気泳動により視覚化した。ｔａｗ１－Ｄ表現型と共分離するバンドをゲルから単離し、アダプタープライマーとＤａｒｔ５′－１、２、３－セカンド／Ｎｔプライマーのプライマーセットを用いてバンドを増幅した。Mol Genet Genomics 284(5):343-355 (2010)に従って、増幅したバンドのＤＮＡ配列を決定した。
　その結果、１０番染色体のＯｓ１０ｇ０４７７８００とＯｓ１０ｇ０４７８０００の間にトランスポゾンが挿入されていた。興味深いことに、ｔａｗ１－Ｄ１とｔａｗ１－Ｄ２の挿入部位は１６塩基対だけ離れていた（図３Ａ）。おおまかなマッピングによってもＴＡＷ１の遺伝子座がこの領域に狭められた。さらに、ｔａｗ１－Ｄ１ホモ接合体から得られた（ｔａｗ１－Ｄ１／＋となった）復帰突然変異体およびｔａｗ１－Ｄ１／＋から得られた（野生型に復帰した）復帰突然変異体にはｎＤａｒｔ１－０の切出しが伴った（図３ＢおよびＣ）。ｔａｗ１－Ｄ欠損はＯｓ１０ｇ０４７７８００とＯｓ１０ｇ０４７８０００の間の領域のｎＤａｒｔ１－０挿入により引き起こされることをこれらの結果は示した。変異体の花序ではＯｓ１０ｇ０４７８０００の発現が上昇したが、Ｏｓ１０ｇ０４７７８００とＯｓ１０ｇ０４７８１００は変異体植物と野生型植物の花序で同様のレベルで発現した（図２Ｂ）。Ｏｓ１０ｇ０４７８０００を含むゲノム領域の野生型イネ植物への導入によって、弱いｔａｗ１－Ｄ様の変異体表現型（図４）がもたらされた。これらの結果に基づき、我々は、Ｏｓ１０ｇ０４７８０００がＴＡＷ１遺伝子であると結論付けた。
　ＴＡＷ１はＡＬＯＧファミリーに属する２０５アミノ酸からなるタンパク質をコードするが、ＡＬＯＧはその初期に同定されたメンバー（アラビドプシスＬＳＨ１およびイネＧ１）にちなんで命名されたものである（Plant J 37(5):694-706 (2004), Proc Natl AcadSci USA 106(47):20103-20108 (2009)）。イネゲノムは１０種のＡＬＯＧ遺伝子を含むが、アラビドプシスは１１種を含む（Plant J 37(5):694-706 (2004), Proc Natl Acad Sci USA 106(47):20103-20108 (2009), Proc Natl Acad Sci USA 108(5): 2154-2159 (2011), Plant J 66(6):1066-1077 (2011), Plant Mol Biol 78(4-5):351-359 (2012)）。ＴＡＷ１の機能をより理解するために、発明者らは２つの独立した機能欠損型変異体であるｔａｗ１－３およびｔａｗ１－４をTilling集団から得た。詳細には、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（Mol Genet Genomics 279(3):213-223 (2008), Breed Sci 60(5):475-485 (2010)）で突然変異誘導したスクリーニング集団から機能欠損型変異体を得た。
　これらの変異体はそれぞれ同じ位置にミスセンス変異を有する（図６Ａ）。ｔａｗ１－４変異体は明確な欠損は持たないが、ｔａｗ１－３変異体は一次枝梗の数が減少した小さい花序を形成する（図２ＣおよびＤ）。ＲＮＡｉによるＴＡＷ１の発現低下によって、小さい花序について同様の、しかし、より強い表現型がもたらされ、一次枝梗と二次枝梗の両方が減少した（図２Ｅ）。
実施例３：ＴＡＷ１は、シュートメリステム（SM：Shoot Meristem）アイデンティティへの転換を抑制するためにメリステムで発現する
　ＴＡＷ１は保存的ドメインおよび核移行シグナルを含む（図６Ａ）。実際、ＴＡＷ１は細胞核に局在し、転写活性化因子としてのわずかだが明確な活性を示す（図５ＡおよびＢ）。本発明者らは、ＴＡＷ１ｍＲＮＡの蓄積の経時的組織特異的パターンをin situハイブリダイゼーションにより調査した。栄養生長期では、ＴＡＷ１は専ら茎頂分裂組織（ＳＡＭ：shoot apical meristem）、LMを含むメリステムおよび幼葉で発現した（図５ＡおよびＣ）。生殖生長期への移行後、ＴＡＷ１　ｍＲＮＡはＩＭで蓄積し続けた（図５Ｄ）。成長している花序（図５Ｅ）のＢＭで最も強いシグナルが観察された。一次ＢＭの発生後、ＴＡＷ１の発現は、ＩＭの発生過程が進むにつれＩＭから徐々に消えた（図５Ｆ）。野生型花序では、メリステムでのシグナルの強度は徐々に減少し、ＳＭの発生時点で検出できなくなった（図５Ｇ）。一方、ｔａｗ１－Ｄ花序では、野生型植物でＳＭが形成されるステージでも、より強いＴＡＷ１のシグナルが検出された（図５ＨおよびＩ）。変異体花序におけるＴＡＷ１の発現レベルはそれらの表現型と大まかに一致することが定量的ＰＣＲ解析により示された（図５Ｊ）。これらの結果は、ＴＡＷ１はＳＭアイデンティティを抑制するように機能し、ＳＭ特異性決定を可能にするにはTAW1の活性は一定の閾値よりも下でなくてはならないことを意味する。
実施例４：ＴＡＷ１はＳＶＰファミリーＭＡＤＳボックス遺伝子を正に制御する
　本発明者らは、ＴＡＷ１の下流で機能する遺伝子を発見するために、ゲノムワイドなｃＤＮＡを含むマイクロアレイを使用するトランスクリプトーム解析を行った（図７Ａ）。
　マイクロアレイに存在する３２種のＩ型ＭＡＤＳボックス遺伝子のうち、３種の遺伝子（ＯｓＭＡＤＳ２２、ＯｓＭＡＤＳ４７およびＯｓＭＡＤＳ５５）はｔａｗ１－Ｄ変異体で著しく発現が増加した。これらの３種の遺伝子はＳＨＯＲＴ　ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ　ＰＨＡＳＥ（ＳＶＰ）サブファミリー（Mol Genet Genomics 273(1):1-9 (2005), BMC Genomics 8:242 (2007), Plant J 54(1):93-105 (2008)）に属する。対照的に、小穂発生および小穂器官発生に関与する、ＯｓＭＡＤＳ７（ＳＥＰ３）、ＯｓＭＡＤＳ８（ＳＥＰ３）、ＯｓＭＡＤＳ１６（ＡＰ３）、ＯｓＭＡＤＳ４（ＰＩ）、ＯｓＭＡＤＳ３（ＡＧ）およびＯｓＭＡＤＳ５８（ＡＧ）などの遺伝子は発現が著しく低下したが、分枝期が延長する表現型に合っていた。ＴＡＷ１が発現するＢＭでのＯｓＭＡＤＳ４７の異所的な発現がin situハイブリダイゼーション解析により確認された（図７ＢおよびＣ）。
　in situハイブリダイゼーションは以下の通り行った。Plant Cell '(8):1143-1155 (1995)に記載されるように、in situハイブリダイゼーションを実行した。ベクタボンド（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、１０μｍの厚みのミクロトーム切片をスライドグラスに取り付けた。
　プローブの作成は以下の通り行った。PCRで増幅し、pENTR/D-TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングしたTAW1の部分cDNA配列を鋳型として使用してＲＮＡプローブを作成した。TAW1 cDNAを増幅するためのプライマーセットは、以下の通りであった。
5'-CACCGCGTCAGCTACGAGAAGAAG-3'（配列番号１０）、
5'-ATTAGATGCAGTAGCAGCAGC-3'（配列番号１１）
　OsMADS47についてのプローブは、イネゲノムリソースセンター(www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html)によって提供されたcDNA (J075171C16)を使用して合成した。
　これらの結果は、開花および花序発生の抑制因子としてのＳＶＰ遺伝子の既知の機能（Plant J 21(4):351-360 (2000), Genes Dev 21(4):397-402 (2007), Development 134(10)1901-1910 (2007), Development 131(23):5981-5990 (2004)）と併せると、３種のＳＶＰ遺伝子がＴＡＷ１の下流で機能してＳＭアイデンティティを抑制することを示唆する。ＴＡＷ１の転写誘導が実際にその３種のＳＶＰ遺伝子の活性化を導くことを我々はtwo-component誘導システムを用いて確認した（図７Ｄ）。
　さらに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターによるＯｓＭＡＤＳ２２とＯｓＭＡＤＳ５５の恒常的過剰発現の影響を検討した。
　カリフラワーモザイクウイルスの構築は以下のとおり行った。全ＯＲＦを含むSHORT VEGETATICE PHASE (SVP)の全長cDNAを以下のプライマーセットを用いて増幅した。
OsMADS22
5'-CACCGCGCCGCGCCTCGCCTCGCC-3'（配列番号１２）、
5'-GAACGCTGCAAAAGACGCAT-3'（配列番号１３）
OsMADS55
5'-CACCGTTTCTCTCTCTCCTTGTCT-3'（配列番号１４）、
5'-GATGAGAATGACTAGCTTAA-3'（配列番号１５）
　ＰＣＲフラグメントをpENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングしてpENTR-SVPを作成した。過剰発現構築物pGWB2を作成するために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを保有するバイナリーベクターを使用した(Hoshikawa K (1989) The Growing Rice Plant (Nosan Gyoson BunkaKyokai, Tokyo)。PENTR-SVPをLR組換え反応(Invitrogen)によってpGWB2に挿入した。得られたpGWB2-SVPを、アグロバクテリウム法での形質転換によってイネ(cv. Nipponbare)の成熟種子に由来するカルスに導入した。
　カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターによってＯｓＭＡＤＳ２２とＯｓＭＡＤＳ５５を恒常的に過剰発現したところ、花序の分枝の増加を引き起こした（図７Ｅ）。
　ＳＶＰ遺伝子はＴＡＷ１の下流で機能するという仮説をこれらの結果は裏付ける。興味深いことに、オオムギおよびトウモロコシでのＳＶＰ遺伝子の異所的発現もまたＳＭアイデンティティの重度の抑制をもたらしたが、これは、ＳＶＰの機能がイネ科草本の間で保存されているかもしれないことを示唆する（Plant Physiol 143(1):225-235 (2007), Plant Cell 24(7):2733-2744 (2012), Proc Natl Acd Si USA 109(18):7115-7120 (2012)）。結論として、本発明者らのデータは、ＴＡＷ１がＳＶＰ遺伝子の誘導を介してＳＭアイデンティティの獲得を抑制し、結果として、ＢＭアイデンティティを促進または延長することを示している。
実施例５：ｔａｗ１－Ｄ２は穀粒の収量の増加に有用であり得る適度な機能獲得型対立遺伝子である
　１穂当たりの穀粒数はイネの収量を決定する４つの主要な要素の１つである。穀粒収量の増加についてのＴＡＷ１変異の有用性を試験するために、我々は、表現型が中程度であるｔａｗ１－Ｄ２対立遺伝子を、日本での主要な商用イネ栽培種であるコシヒカリに掛け合わせにより遺伝子移入した（図８ＡおよびＢ）。
　植物材料は以下の通りとした。５回の連続的な戻し交配によりコシヒカリにｔａｗ１－Ｄ２変異を導入した。それにより生じたＢＣ５Ｆ２植物とコシヒカリの種子を２０１１年５月２８日に播種した。２０１１年６月２２日に岡山大学資源植物科学研究所の水田（北緯３４．６度、東経１３３．８度）に株間に１５ｃｍ、条間に４０ｃｍの間隔で実生苗を移植した。元肥として、Ｎ：Ｐ2Ｏ5：Ｋ2Ｏを５：５：５ｋｇ／１０ｈａの割合で与えた
。２回の反復実験を行った。
　戻し交配第５代（ＢＣ５Ｆ２）の植物の自家受粉による、農地で育てられた子孫株は植物体あたりの粒重の約４５％の増加を示した（図８Ｃ）。食味には影響がなかった。これらの増加は主に、一次枝梗、二次枝梗および三次枝梗の数の増加の結果、１穂当たりの穀粒数がかなり増加したためであった（図８Ｄ）。稔性と粒重のわずかな減少もまた観察された（図８Ｅ）。穂のサイズの上昇にもかかわらず、ＢＣ５Ｆ２植物では植物全体の草丈はわずかに低下した。穀粒数の増加は、イネでは、「分げつ」と呼ばれる分枝したシュートの数の減少とよく関連付けられる（Nat Genet 42(6):541-544 (2010), Nat Genet 42(6): 545-549 (2010)）。しかしながら、ｔａｗ１－Ｄ２遺伝子移入株ではこのトレードオフ効果は観察されなかった。
　本発明は、イネの育種の分野で有用である。

Claims (8)

  1. MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子で形質転換され、該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネであって、MADS22遺伝子が以下（ａ）から（ｅ）のいずれかのＤＮＡであり、MADS55遺伝子が以下（ｆ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡである、形質転換イネ。
    （ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｂ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
    （ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｄ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｅ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｇ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
    （ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｊ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  2. 以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネの作製方法。
    （ａ）MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子でイネ細胞を形質転換する工程、
    （ｂ）該遺伝子で形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程、
    （ｃ）該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ植物体を選抜する工程。
  3. 以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、イネの１穂当たりの籾の着粒数を野生型と比較して増加させる方法。
    （ａ）MADS22遺伝子若しくはMADS55遺伝子、又はMADS22遺伝子およびMADS55遺伝子でイネ細胞を形質転換する工程、
    （ｂ）該遺伝子で形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程、
    （ｃ）該導入された遺伝子が発現しており、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ植物体を選抜する工程。
  4. MADS22遺伝子が以下（ａ）から（ｅ）のいずれかのＤＮＡであり、MADS55遺伝子が以下（ｆ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡである、請求項２に記載の形質転換イネの作製方法又は請求項３に記載のイネの１穂当たりの籾の着粒数を野生型と比較して増加させる方法。
    （ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｂ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
    （ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｄ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｅ）配列番号４又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｆ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｇ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
    （ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｊ）配列番号７又は配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであって、１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  5. 請求項２又は請求項４に記載の形質転換イネの作製法によって作製された形質転換イネの該形質転換イネ系統内での交配又は該形質転換イネ系統と他のイネ系統との交配によって得られた後代であって、導入されたMADS22遺伝子又はMADS55遺伝子を有し、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加した形質転換イネ。
  6. 小穂発生期の花序での内在性TAWAWA1(TAW1)遺伝子の発現を野生型と比較して上昇させることにより、小穂発生期の花序での内在性MADS22遺伝子または内在性MADS55遺伝子が野生型と比較して過剰に発現され、１穂当たりの籾の着粒数が野生型と比較して増加したイネ。
  7. 内在性TAW1遺伝子の発現制御領域の改変によって該TAW1遺伝子の発現が上昇した、請求項６に記載のイネ。
  8. 内在性TAW1遺伝子が配列番号１で示される配列を有するＤＮＡ、または、配列番号１の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、
    　内在性MADS22遺伝子が配列番号４で示される配列を有するＤＮＡ、または、配列番号４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、
    　内在性MADS55遺伝子が配列番号７で示される配列を有するＤＮＡ、または、配列番号７の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、イネで過剰発現させることにより１穂当たりの籾の着粒数を増加させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項６または請求項７に記載のイネ。
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