KR101411920B1

KR101411920B1 - 신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－리불로스의 생산방법

Info

Publication number: KR101411920B1
Application number: KR1020130042439A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 란지타; 김태수
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2014-06-26
Also published as: WO2014171636A1

Abstract

본 발명은 리비톨 탈수소화효소 (Ribitol dehydrogenase) 활성을 갖는 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 균주로부터 유래한 신규 리비톨 탈수소화효소의 유전자로부터 발현되는 리비톨 탈수소화효소효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 리비톨 탈수소화효소효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용한 L-리불로스의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 리비톨 탈수소화효소효소는 특이적으로 리비톨만을 전환시키며, 안정적으로 효소반응을 촉매할 수 있다. 본 발명의 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 L-리불로스의 생산방법은 L-리불로스의 대량 생산에 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 Ｌ－리불로스의 생산방법 {A novel ribitol dehydrogenase and L-ribulose production using the said enzyme}

본 발명은 신규 리비톨 탈수소화효소효소 및 그를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리비톨 탈수소화효소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 리비톨 탈수소화효소를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것이다.

L-리보오스는 많은 L-form 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 주로 L-arabinose, L-xylose, D-glucose, D-galactose, D-리보오스 또는 D-mannono-1,4- lactone로부터 화학합성법에 의해 생산되어 왔다. 그러나, 화학합성법은 낮은 총수율, 많은 화학반응 단계, 복잡한 정제과정 및 부산물 형성 등 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, ribitol 또는 L-리불로스로부터 L-리보오스를 생물학적으로 제조하는 방법이 연구되고 있다.

최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 특히, 몇 가지의 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고 리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제, 항암제 등 의약품의 기본이 되는 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고, 가격이 급격히 상승하고 있으므로 L-리보오스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다. 그를 위해서는 원료인 고가의 L-리불로스를 고효율로 생산할 수 있는 방법이 우선 확립되어야 한다.

최근에는 NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase를 포함하는 재조합 대장균을 사용하여 100 g/L ribitol로부터 발효 72시간에 55% 전환 수율을 얻었지만 L-리보오스의 생산성은 L-arabinose로부터 만드는 화학합성법보다 약 28 배 낮았다. Klebsiella pneumonia 유래 D-arabinose isomerase, Pseudomonas stutzeri 유래 L-rhamnose isomerase, Streptomyces rubiginosus 유래 D-xylose isomease 및 Lactococcus lactis 유래 galactose-6-phosphate isomerase는 광범위한 기질 특이성을 지녀 L-리불로스를 L-리보오스로 전환시킬 수 있지만 그 전환속도는 매우 느려서 생산성이 낮아 경쟁력이 없다. 그러므로 L-리불로스를 고효율로 생산하여 원료에서의 경쟁력을 확보하는 것이 L-리보오스의 경제적인 생물학적 생산에 선행되어야 한다. 생촉매를 사용하여 L-리불로스 및 L-리보오스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 화학합성법의 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

본 발명에서는 리비톨로부터 L-리불로스를 고효율로 생산할 수 있는 리비톨 탈수소화효소 및 그와 같은 효소를 이용하여 L-리불로스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, L-리불로스를 고수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

대한민국특허공개번호 제10-2009-0083939(2009.08.04) 대한민국특허공개번호 제1998069057(1998.10.26)

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 엔테로박터 에어로게네스로부터 유래된 리비톨 탈수소화효소의 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리비톨 탈수소화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 리비톨 탈수소화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리비톨 탈수소화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 리비톨로부터 L-리불로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 L-리불로스의 생산방법에 있어서, 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes ) 균주의 리비톨 탈수소화효소를 이용하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 엔테로박터 에어로게네스로부터 리비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 리비톨 탈수소화효소를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 리비톨 탈수소화효소는 엔테로박터 에어로게네스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서 상기 리비톨 탈수소화효소는 리비톨에 특이적인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 25.78 kDa인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 상기 효소는 5 mM Ca² ⁺ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 리비톨 탈수소화효소 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 리비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리비톨 탈수소화효소를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 리비톨 탈수소화효소를 이용하여 리비톨로부터 L-리불로스를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 리비톨 탈수소화효소를 유효성분으로 포함하는 L-리불로스 제조용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 리비톨 탈수소화효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 L-리불로스 제조용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 리비톨 탈수소화효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 리비톨 탈수소화효소도 본 발명에 관한 리비톨 탈수소화효소에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 리비톨 탈수소화효소를 코딩하는 리비톨 탈수소화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자 서열로서는 서열번호 3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 리비톨 탈수소화효소를 코딩하는 변이 리비톨 탈수소화효소 유전자도 본 발명에 관한 리비톨 탈수소화효소 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는 상기 리비톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 리비톨 탈수소화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 리비톨 탈수소화효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소 유전자는 엔테로박터 에어로게네스의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 리비톨 탈수소화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 엔테로박터 에어로게네스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 리비톨 탈수소화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 엔테로박터 에어로게네스 균주의 리비톨 탈수소화효소 유전자에 100% 상동성을 가진 단편이다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 리비톨 탈수소화효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 리비톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 3에는 본 발명의 리비톨 탈수소화효소 유전자의 염기서열을 서열번호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명에 관한 재조합벡터는 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터와 리비톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 리비톨 탈수소화효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 리비톨 탈수소화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

리비톨 탈수소화효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수한 후, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명자는 높은 수율로 L-리불로스를 제조할 수 있는 효소를 개발하고자 엔테로박터 에어로게네스로부터 리비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 리비톨로부터 높은 수율로 L-리불로스를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 산업적으로 유용한 리비톨 탈수소화효소를 제조하기 위하여 엔테로박터 에어로게네스의 유전자로부터 리비톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 L-아라비톨을 기질로 하여 탈수소화반응을 촉매하여 L-리불로스를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 탈수소화에 대한 특이성을 갖고 리비톨을 L-리불로스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 리비톨 탈수소화효소를 의미한다.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 분자량이 약 25.78kDa; (ⅱ) NAD⁺와 Ca² ⁺ 존재 시 효소 활성이 나타남.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 5 mM Ca² ⁺ 존재 시 효소 활성 2.4배 증가된다.

기존에 알려진 리비톨 탈수소화효소는 낮은 L-리불로스 전환율을 보이는 반면, 본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 리비톨을 이용하여 높은 수율로 L-리불로스를 생산한다. 따라서 리비톨에서 L-리불로스를 높은 수율로 생산하는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 당 혼합물로부터 L-리불로스의 생산에 유용하게 적용될 것이다.

본 발명의 리비톨 탈수소화효소에 의해 생산된 L-리불로스는 L-리보오스 합성의 중간체이고, L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄당이다. 여기서 유도된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. 따라서 리비톨로부터 L-리불로스의 전환은 L-리보오스의 생산을 위한 기본 단계로서 중요하게 작용할 것이다.

도 1은 벡터 pUC-LAD의 벡터맵으로 엔테로박터 에어로게네스의 염색체에서 리비톨 탈수소화효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝한 것이다.
도 2는 엔테로박터 에어로게네스 균주로부터 유래된 리비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 엔테로박터 에어로게네스 균주로부터 유래된 리비톨 탈수소화효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다. M; 사이즈 마커, 1; pET32 벡터만 형질전환된 균주에서 발현된 불용성 단백질, 2; pET 벡터만 형질전환된 균주에서 발현된 수용성 단백질, 3; 리비톨 탈수소효소의 불용성 단백질, 4; 리비톨 탈수소화효소의 수용성 단백질, 5; 정제된 리비톨 탈수소화효소
도 4는 엔테로박터 에어로게네스 균주로부터 유래된 리비톨 탈수소화효소의 동역학적 매개변수 그래프이다.
도 5는 엔테로박터 에어로게네스 유래의 리비톨 탈수소화효소의 최적화된 조건에서의 반응을 통하여 얻어진 시간대 별 L-리불로스의 생산량을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 리비톨 탈수소화효소 생산균의 선별

리비톨 탈수소화효소효소를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 배양액 10 ul를 생리식염수 10 ml에 현탁하고, 현탁액의 10 ul(1× 10⁴ cfu ml^-1)를 취하여 3% malt extract가 첨가된 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)에 도말한 후, 37 ℃에서 2일간 배양하였다. 고체 펩톤배지에서 콜로니가 형성된 후 콜로니를 취하여 리비톨을 기질로 하여 효소 활성을 가지는 리비톨 탈수소화효소 고활성을 갖는 콜로니들을 선별하는 방법으로 리비톨 탈수소화효소를 생산하는 고활성 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190) 콜로니를 탐색하였다.

실시예 2: 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)로부터 신규 리비톨 탈수소화효소 유전자의 클로닝

리비톨 분해 효소인 리비톨 탈수소화효소 유전자의 염기서열을 얻기 위해 효모균 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)를 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 리비톨 탈수소화효소의 유전자도 약 700 bp 정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 효모균의 이미 알려진 리비톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 리비톨 탈수소화효소 전체 유전자를 클로닝 하였다.

클로닝에는 대장균 XL1-Blue와 pUC18 벡터를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고, 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 배양에는 상기 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar)와 3～5% 설탕, 0.3～0.5% 쇠고기 추출물, 0.9～1.1% 박토 펩톤, 1.3～1.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin)을 첨가하였다.

배양 방법은 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 1일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다.

대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장지(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 RNA 추출은 Qiagen plant total RNA kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다.

리비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하기 위하여 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)염색체를 분리하였다. 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)리비톨 탈수소화효소 유전자의 일부분을 증폭하기위해 다른 효모균에서 이미 알려진 리비톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer), DhRDH F-5'- RTN ACC GGC GCT GSN TCC GGC VTN GGT C -3' (서열번호 1)와 DhRDH R-5'- TTT TGA NGC NGT ATA DAT AGG YTC -3' (서열번호 2)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 440bp 크기에 해당하는 리비톨 탈수소화효소 유전자 일부를 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190) 염색체에서 증폭하였다.

그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, XbaI을 이용하여 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190)의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 만들었다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다. BamHI, HindIII, XbaI으로 염색체를 자른 경우에 있어서는 서어던 하이브리다이제이션의 결과 나타난 리비톨 탈수소화효소의 유전자를 지닌 DNA의 크기가 약 20～23 kb정도 되어 너무 큰 관계로 이용하지 않았고, 2.5 kb 정도의 EcoRI으로 잘린 조각과 약 5.5 kb정도의 SalI으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 전체 염색체를 EcoRI으로 절단한 후 분리한 2.6kb 정도 크기의 DNA 조각과 SalI으로 절단한 5.5 kb 정도의 DNA 단편들을 pUC18에 클로닝하고 이를 pUC-RDH라고 명명하였다 (도 1).

pUC-RDH 라이브러리에서 앞서 만든 1.0 kb 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 리비톨 탈수소화효소효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 리비톨 탈수소화효소효소의 전체 유전자 염기서열 729bp를 밝혔다 (서열번호 3). 이는 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 효모균에서 밝혀진 리비톨 탈수소화효소 유전자와 크기가 비슷하였다. 또한 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190) 리비톨 탈수소화효소는 다른 리비톨 탈수소화효소에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 지니고 있음을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조

실시예 2에 따른 리비톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 리비톨 탈수소화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a(Novagen, 미국)의 BamHⅠ과 XhoI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)CodonPlus (NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 2).

실시예 4: 재조합 리비톨 탈수소화효소의 발현 및 순수 분리

상기 실시예 3에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 3).

상기 실시예 4의 방법으로 발현시킨 재조합 리비톨 탈수소화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA His-tag 결합 크로마토그래피(Qiagen, 독일)를 수행하여, 재조합 리비톨 탈수소화효소를 순수 분리하였다.

실시예 5: 재조합 리비톨 탈수소화효소의 특성 실험

상기 실시예 4에서 분리된 리비톨 탈수소화효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 리비톨을 사용하였다.

실시예 5-1: 조효소

상기 실시예 4의 방법으로 정제한 제조한 리비톨 탈수소화효소의 조효소를 알아보기 위하여, 효소 반응실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 리비톨을 기질로 하여 NAD⁺, NADP⁺를 조효소로 첨가한 뒤 효소 활성을 측정하였다. 균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 4과 같이 수행하였으며, 200 mM의 리비톨 기질 용액, 2 mM NAD⁺, 2 mM NADP⁺의 존재 하에 25℃에서 효소와 기질을 반응시켰다. NAD⁺존재 시 리비톨 탈수소화효소의 활성이 나타났으며, NADP⁺존재 시에는 그 활성이 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 L-리불로스 생산 방법에서 리비톨 탈수소화효소의 조효소로는 NAD⁺가 필요함을 알 수 있었다.

실시예 5-2: 금속이온의 효과

순수 정제된 리비톨 탈수소화효소의 금속 이온이 효소 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다. 최종농도 1 mM의 MgCl₂, MnCl₂, CoCl₂, ZnCl₂, FeCl₃, CuSO4, HgCl2, BaCl, KCl 또는 CaCl₂를 효소 반응액에 첨가한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 1 mM 및 5 mM 농도에서 다양한 금속의 리비톨 탈수소화효소효소 활성에 대한 영향은 표 1에 나타내었다. 본 발명의 리비톨 탈수소화효소는 5 mM Mg² ⁺존재 시 효소 활성이 2.4배 증가하는 것을 확인 하였다 (표 1).

금속이온	상대적 활성 (%)	상대적 활성 (%)
금속이온	1 mM	5 mM
None	100 ± 2	100 ± 4
MgCl₂	148 ± 4	162 ± 6
MnCl₂	161 ± 6	109 ± 8
ZnCl₂	139 ± 3	61.9 ± 5.0
CaCl₂	193 ± 7	245 ± 8
FeCl₃	45.5 ± 4.8	27.2 ± 2.4
CuSO₄	90.1 ± 3.1	50.5 ± 6.1
CoCl₂	119 ± 2	108 ± 4
HgCl₂	0	0
BaCl	142 ± 3	209 ± 6
KCl	95.7 ± 7.0	73.6 ± 3.5

실시예 5-3: 리비톨 탈수소화효소의 고유 활성도

다양한 농도의 기질의 리비톨 200 mM을 이용하여 실시예 4-1과 같이 효소 반응을 시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 고유 활성을 측정하였다 (도 4). 리비톨 탈수소화효소의 리비톨에 대한 고유 활성도는 159 Unit/mg-protein으로 결정되었다. 이는 현재까지 보고된 리비톨 탈수소화효소 중 가장 높은 활성에 해당한다 (표 2).

균주	고유 활성 (Units/ mg-protein)	K_m(mM)	효소상태
균주	고유 활성 (Units/ mg-protein)	기질 (리비톨)	효소상태
Klebsiella aerogenes 1033	83	8	Purified
Rhodobacter sphaeroides Si4	59	6.3	Purified
Enterobacter agglomerans	144	32.2	Purified
Gluconobacter oxydans IFO 12528	29.2	1.2	Purified
Zymomonas mobilis	5.65	11.8	Recombinant
Enterobacter aerogenes	159	10.3	Recombinant

표 2는 리비톨 탈수소화효소의 고유 활성도에 대한 표이다.

실시예 6: 엔테로박터 에어로게네스(KCTC2190) 유래 신규 리비톨 탈수소화효소를 이용한 최적 조건에서의 L-리불로스 생산

신규 리비톨 탈수소화효소를 이용한 최대 L-리불로스 생산을 위하여 최적 조건에서 이성화 반응을 수행하였다. 0.1 M Tris-glycin-NaOH pH 10 buffer에서 반응을 진행하였고, 20 mM의 NAD+, 150 U/ml의 리비톨 탈수소화효소, 25℃, 기질인 리비톨 100 mM의 존재 하에 180rpm으로 교반배양하여 L-리불로스의 생산 실험을 수행하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, L-리불로스의 최대 생산 시간은 5시간 이었으며 리비톨로부터 L-리불로스의 전환율은 80%이었다. 이러한 최종 수율은 리비톨부터 L-리불로스 생산에서 매우 우수한 수치이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A ribitol dehydrogenase and L-ribulose production using the said enzyme <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 rtnaccggcg ctgsntccgg cvtnggt 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ttttgangcn gtatadatag gytc 24 <210> 3 <211> 729 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 3 atgaacacct ctctgtctgg taaagtcgcg gcggttaccg gtgcggcgtc tggtatcggt 60 ctgcaatgcg cgaaaaccat gctgggtgcg ggtgcgaaaa ttgttctgat cgaccgtgat 120 ggtgaaaaac tgaccaaaat cgttgcggaa ctgggtgaaa acgcgttggc gctggaggtt 180 gacctgatgc aaggtgacca ggttgacaaa atcatcgacg gtatcctgca gctggcgggt 240 cgtctggaca tcttccacgc gaacgcgggt gcgtacatcg gtggtccggt tgcggaaggt 300 gacccggacg tttgggaccg tgttctggac ctgaacacca acgcggcgtt cggttgcgtt 360 cgttctgttc tgccgcacat gatcgcgcag aaatctggtg acatgatctt cacctcttct 420 atcgcgggtg ttgttccggt tatctgggaa ccgatctaca ccgcgtctaa attcgcggtt 480 caggcgttcg ttcacaccac ccgtcgtcaa gtttctcagc acggtgttcg tgttggtgcg 540 gttctgccgg gtccggttgt taccgcgctg ttggacgact ggccgaaaga aaaaatggaa 600 gaagcgctga cgaacggttc tctgatgcag ccgctcgaag ttgcggaatc tgttcttttc 660 atggttaccc gttctaaaaa cgttaccgtt cgtgacctgg ttatcctgcc gaactctgtt 720 gacctgtaa 729 <210> 4 <211> 242 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 4 Met Asn Thr Ser Leu Ser Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ile Gly Leu Gln Cys Ala Lys Thr Met Leu Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Lys Ile Val Leu Ile Asp Arg Asp Gly Glu Lys Leu Thr Lys Ile Val 35 40 45 Ala Glu Leu Gly Glu Asn Ala Leu Ala Leu Glu Val Asp Leu Met Gln 50 55 60 Gly Asp Gln Val Asp Lys Ile Ile Asp Gly Ile Leu Gln Leu Ala Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Ile Phe His Ala Asn Ala Gly Ala Tyr Ile Gly Gly Pro 85 90 95 Val Ala Glu Gly Asp Pro Asp Val Trp Asp Arg Val Leu Asp Leu Asn 100 105 110 Thr Asn Ala Ala Phe Gly Cys Val Arg Ser Val Leu Pro His Met Ile 115 120 125 Ala Gln Lys Ser Gly Asp Met Ile Phe Thr Ser Ser Ile Ala Gly Val 130 135 140 Val Pro Val Ile Trp Glu Pro Ile Tyr Thr Ala Ser Lys Phe Ala Val 145 150 155 160 Gln Ala Phe Val His Thr Thr Arg Arg Gln Val Ser Gln His Gly Val 165 170 175 Arg Val Gly Ala Val Leu Pro Gly Pro Val Val Thr Ala Leu Leu Asp 180 185 190 Asp Trp Pro Lys Glu Lys Met Glu Glu Ala Leu Thr Asn Gly Ser Leu 195 200 205 Met Gln Pro Leu Glu Val Ala Glu Ser Val Leu Phe Met Val Thr Arg 210 215 220 Ser Lys Asn Val Thr Val Arg Asp Leu Val Ile Leu Pro Asn Ser Val 225 230 235 240 Asp Leu

Claims

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리비톨 탈수소화효소.
제 1항에 있어서, 상기 리비톨 탈수소화효소는 엔테로박터 에어로게네스에서 유래한 것을 특징으로 하는 리비톨 탈수소화효소.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리비톨 탈수소화효소는 리비톨에 특이적인 것을 특징으로 하는 리비톨 탈수소화효소.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소의 분자량은 25.78 kDa인 것을 특징으로 하는 리비톨 탈수소화효소.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 NAD⁺존재 시 활성이 나타나고, Ca²⁺ 존재 시 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 리비톨 탈수소화효소.
제 1항의 효소를 코딩하는 리비톨 탈수소화효소 유전자.
제 6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 리비톨 탈수소화효소 유전자.
제 6항 또는 제7항의 리비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리비톨 탈수소화효소를 제조하는 방법.
제 1항의 리비톨 탈수소화효소를 이용하여 리비톨로부터 L-리불로스를 제조하는 방법.
제 1항의 리비톨 탈수소화효소를 유효성분으로 포함하는 L-리불로스 제조용 조성물.
제 6항의 리비톨 탈수소화효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 L-리불로스 제조용 조성물.