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KR101436794B1 - 다가 ｐｃｖ2 면역원성 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법 - Google Patents

다가 ｐｃｖ2 면역원성 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법 Download PDF

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KR101436794B1
KR101436794B1 KR1020087018734A KR20087018734A KR101436794B1 KR 101436794 B1 KR101436794 B1 KR 101436794B1 KR 1020087018734 A KR1020087018734 A KR 1020087018734A KR 20087018734 A KR20087018734 A KR 20087018734A KR 101436794 B1 KR101436794 B1 KR 101436794B1
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마크 에이크메이어
그렉 니첼
메릴 쉐퍼
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베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
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Abstract

돼지 서코바이러스 2형으로부터 개방 판독 프레임 2에 의해 발현된 단백질을 회수하는 개선된 방법이 제공된다. 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공된다. 또한, PCV2 감염의 발생률을 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 제제, 바람직하게는 PCV2 ORF2 단백질, 또는 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물, 및 다른 돼지 질병 유발 유기체의 하나 이상의 면역원성 활성 성분을 포함하는 다가 복합 백신이 제공된다.
Figure R1020087018734
돼지 서코바이러스 2형, PCV2 ORF2 단백질, PCV2 감염, 이유후 전신성 소모성 증후군(PMWS)

Description

다가 ＰＣＶ2 면역원성 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법{Multivalent PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions}
서열 목록
본 출원은 서면 형식 및 컴퓨터로 판독가능한 형식의 서열 목록을 포함하고, 이의 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 한가지 양상은 돼지 서코바이러스 2형 (PCV2: Porcine CircoVirus type 2)의 개방 판독 프레임 2 (ORF2: Open Reading Frame 2)에 의해 발현되는 단백질의 회수에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 단백질은 돼지 서코바이러스 2형 개방 판독 프레임 2에 대한 재조합 암호화 서열을 함유하는 형질감염된 바이러스에 의해 발현되는 재조합 단백질이다. 보다 더 구체적으로는, 형질전환된 바이러스로 성장 배지 중의 세포를 감염시켜, 개방 판독 프레임 2에 의해 발현된 단백질을 세포 내부로부터 회수하기 보다는 상청액 중에 회수한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 돼지 서코바이러스 2형으로부터 개방 판독 프레임 2 유전자를 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 부분을 제1의 벡터 속으로 클로닝하는 단계, 개방 판독 프레임 2 부분을 상기 제1의 벡터로부터 절단하여 이를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계, 전달 벡터를 바이러스 벡터와 함께 성장 배지 중의 세포 속으로 공동형질감염시켜 세포가 바이러스 벡터에 의해 감염되게 하여 개방 판독 프레임 2를 발현시키는 단계, 및 상청액 중의 개방 판독 프레임 2에 의해 암호화된 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 PCV2에 대해 면역 반응을 유도하는데 효과적인 면역원성 조성물 및 이러한 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 조성물을 투여받는 동물을 보호하고 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키는 면역 반응을 제공하는데 효과적인 면역원성 조성물에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로, 본 발명은 PCV2에 의한 감염에 대해 효과적인 보호를 부여하는 단백질-기제 면역원성 조성물에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로, 본 발명은 PCV2의 ORF2를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, PCV2-ORF2를 투여하면 PCV2에 의한 감염에 대해 보호된다. 가장 구체적으로, 본 발명은 면역원성 조성물을 투여받는 돼지에게 유효한 면역성을 부여하는데 효과적인 면역원성 조성물에 관한 것이고, 이때 상기 조성물은 PCV2의 ORF2에 의해 발현된 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 복합 백신 또는 다가 백신이 제공된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 PCV2 및 하나 이상의 다른 돼지 질병 유발 유기체에 의한 감염에 대해 면역 반응을 유도하는데 효과적인 면역원성 조성물을 제공한다.
돼지 서코바이러스 2형 (PCV2)은 작은 (17 내지 22nm의 직경) 20면체의 외피 비보유 (non-enveloped) DNA 바이러스이고, 일본쇄 원형 게놈을 함유한다. PCV2는 돼지 서코바이러스 1형 (PCV1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 하지만, 일반적으로 비-병독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 통상적으로 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome)이라고 하는 증상을 나타낸다. PMWS는 임상적으로 소모 (wasting), 피부의 창백함, 수척함, 호흡 곤란, 설사, 황달 (icterus) 및 황달 (jaundice)이 특징이다. 감염된 일부 돼지에서는 모든 증상의 조합이 나타날 것이고, 다른 돼지에서는 이러한 증상 중의 한두 가지만 나타날 것이다. 부검하는 동안, 미시적 병변 및 육안 병변이 다수의 조직 및 기관에서 또한 나타나는데, 림프 기관이 가장 흔한 병변 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 미시적 림프 병변의 중증도 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. PCV2에 감염된 돼지의 사망률은 80%에 이를 수 있다. PMWS 외에도, PCV2는 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반한다.
SDS-PAGE 겔 상에서 전개시키는 경우에 대략 30kDa의 분자량을 갖는 PCV2의 개방 판독 프레임 2 (ORF2) 단백질은 과거에 PCV2에 대한 백신에서 항원성 성분으로서 사용되었다. 이러한 백신에 사용하기 위한 ORF2를 수득하는 통상적인 방법은 일반적으로 ORF2를 암호화하는 PCV2 DNA를 증폭시키고, ORF2 DNA로 바이러스 벡터를 형질감염시키고, ORF2 DNA를 함유하는 바이러스 벡터로 세포를 감염시키고, 바이러스가 세포 내에서 ORF2 단백질을 발현하게 하고, 세포 용해를 통해 세포로부터 ORF2 단백질을 추출함으로 이루어진다. 이러한 방법은 일반적으로 바이러스 벡터로 세포를 감염시킨후 최대 약 4일이 소요된다. 하지만, 이러한 방법은 추출 과정에서 비용과 시간이 많이 요구된다는 단점이 있다. 또한, 세포로부터 회수되는 ORF2의 양이 매우 많지 않다; 따라서, 백신 등에 사용하기 위한 충분한 양의 재조합 발현된 단백질을 수득하기 위해서는 많은 수의 세포를 많은 수의 바이러스 벡터로 감염시켜야 한다.
PCV2 면역화를 위한 현재의 접근법에는 미국특허 제6,703,023호에 기술된 것과 같은 DNA-기제 백신이 포함된다. 하지만, 이러한 백신은 PCV2 감염 및 이와 관련된 임상 징후에 대해 보호 면역성을 부여하는데 비효과적이었다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS)은 최근 1991년에 처음 분리되어 아터리바이러스 (arterivirus)로 분류된 바이러스에 의해서 발생한다. 상기 질병 증후군은 1980년대 중반에 미국에서 처음 인식되었고 "돼지 괴질 (mystery swine disease)"이라고 불렸다. 이는 청이병 (blue ear disease)이라고도 불렸다. 돼지 아터리바이러스라는 이름은 최근에 제안되었다. PRRS 바이러스는 대식세포, 특히 폐에서 발견되는 대식세포에 대해 특별한 친화성을 갖는다. 대식세포는 신체 방어의 일부이다. 폐에 존재하는 대식세포를 폐포 대식세포라고 부른다. 이들은 침입하는 세균 및 바이러스를 섭취하여 제거하지만, PRRS 바이러스의 경우에는 그렇지 않다. 대신에, 바이러스가 상기 세포의 내부에서 증식하여 더 많은 바이러스를 생산하고 대식세포를 사멸시킨다. 이는 일단 무리에 들어가면 무한히 잔존하면서 활동하는 경향이 있다. 최대 40%의 대식세포가 파괴되어, 신체 방어 기전의 주요 부분이 제거되고 세균 및 다른 바이러스가 증식하여 손상을 입히게 된다. 이의 일반적인 예로는, PRRS 바이러스에 감염되는 경우에 육성돈/비육돈 무리에서 유행성 폐렴의 중증도가 현저하게 증가하는 것이 있다. 모든 종축, 특히 대규모 무리에 있는 모든 종축의 경우, 처음 감염되는데는 최대 1년이 걸릴 수 있고, 바이러스가 무리에서 빠르게 확산되는 것처럼 보이더라도, 암퇘지의 90% 이상이 혈청 양성이 되기까지는 4 내지 5개월 정도 걸릴 수 있다. 일부 암퇘지는 비경험 (naive) 상태로 남는다. 또한, 감염후 1 내지 2년 후에 암퇘지 무리에 20% 미만의 혈청학적 양성 동물이 존재하는 것은 드물지 않다. 하지만, 이는 암퇘지가 더이상 면역성을 갖고 있지 않다는 것을 반드시 의미하는 것은 아니며, 또한 암퇘지로부터 이들의 새끼에게 면역성이 전달되는 것이 중단되었다는 것을 의미하는 것도 아니다. 1 내지 2개월 동안 바이러스를 배출할 수 있는 육성돈과 비교하여 성체 동물은 더 짧은 기간 (14일) 동안 바이러스를 배출한다. 임상 양상은 무리에 따라 매우 다를 수 있다. 기준으로서, PRRS에 처음으로 노출된 세 무리의 경우, 어느 한 무리는 인지가능한 질병을 보이지 않을 것이고, 두번째 무리는 경증 질병을 보일 것이고, 세번째 무리는 중등증 내지 중증 질병을 보일 것이다. 그 이유는 명확하게 이해되지 않는다. 하지만, 무리의 건강 상태가 좋을수록, 질병의 중증도가 더 낮아진다. 바이러스가 증식하면서 돌연변이가 발생하여, 병독성이 높은 바이러스 주 (strain)와 그렇지 않은 주가 배출되는 것일 수 있다. PRRS는, 건강 상태가 좋거나 보통인 무리 및 축사내 무리와 방목 무리 모두를 포함하여, 크기에 상관없이 모든 종류의 무리를 감염시킨다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae; 엠.하이오 (M hyo))는 마이코플라즈마타세아에 (mycoplasmataceae) 과로 분류되는 작은 세균이다 (400 내지 1200nm). 엠.하이오는 육성돈 및 비육돈에서 통상적으로 나타나는 돼지 호흡기 질병인 유행성 폐렴과 관련이 있다. 엠.하이오는 기관 및 폐의 상피 세포의 섬모에 침범하여, 섬모 운동을 멈추게 하고 (섬모정체; ciliostasis) 결국 폐의 영역이 허탈되게 한다. 질병의 정도에 따라, 감염된 돼지의 일일 증체량이 17%까지 감소될 수 있다. 유행성 폐렴은 돼지 집단에서 광범위하게 확산되어 있고 거의 모든 돼지 무리에 존재한다. 엠.하이오는 PRRSV 및 다른 호흡기 병원체가 폐로 들어오기 쉽게 하는 1차 병원체인 것으로 생각된다. 3개의 별개의 주 (232, J 및 7448)의 게놈 서열이 분석되었다[참조: Minion et al., J. Bacteriol. 186: 7123-33, 2004; Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187: 5568-77, 2005].
돼지 증식성 장염 (porcine proliferative enteritis)은 회장 및 결장의 과증식 및 염증을 특징으로 하는 육성-비육돈 및 어린 종돈의 일반적인 설사병이다. 이는 대개 경증이고 자기-제한적이지만, 때때로 지속성 설사, 중증 괴사성 장염, 또는 사망률이 높은 출혈성 장염을 일으킨다. 병인은 세포내 세균인 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis)로 최근에 분류되었다. 상기 유기체는 세포 배양물 중에서만 배양되었고, 이를 무세포 배지에서 증식시키려는 시도는 실패하였다. 통상적으로 사육된 돼지에 엘.인트라셀룰라리스의 순수 배양물을 접종하여, 상기 질병의 통상적인 병변이 나타났고, 상기 병변으로부터 엘.인트라셀룰라리스가 재분리됨에 따라 코흐 (Koch)의 가설을 만족시켰다. 보다 일반적인 비출혈성 형태의 질병은 종종 18 내지 36kg의 돼지를 감염시키고, 갑자기 설사가 발생하는 것이 특징이다. 분변은 물 내지 풀 같고, 갈색을 띠거나, 희미하게 혈흔이 있다. 약 2일 후, 돼지는 회장에서 형성된 황색 섬유괴사성 변을 배설할 수도 있다. 감염된 돼지의 대부분은 자연적으로 회복되지만, 상당수는 점차 쇠약해지면서 만성 괴사성 장염으로 발전한다. 출혈성 형태는 피부가 창백함, 허약함, 및 출혈성 또는 흑색 타르 분변의 배설이 특징이다. 임신한 미경산돈은 유산할 수도 있다. 병변은 소장의 하반부, 맹장 또는 결장의 어디에서든 발생할 수 있지만, 회장에서 가장 빈번하고 분명하다. 장관 벽이 비후되고 장간막에 부종이 생길 수 있다. 장간막 림프절이 비대된다. 장 점막이 비후하고 주름이 많은 것 같이 보이고, 갈색 또는 황색 섬유괴사성 막으로 덮일 수도 있으며, 종종 점상 출혈이 발생한다. 황색 괴사변은 회장에서 발견되거나 결장을 통과할 수 있다. 만성인 경우에는 미만성 완전 점막 괴사로 인하여 장관이 정원 호스 (garden hose)처럼 경직된다. 증식성 점막 병변은 종종 결장에 존재하지만, 부검시 철저히 검사해야만 발견된다. 과다출혈성 형태에서는, 결장에 적색 또는 흑색 타르 변이 존재하고 회장에 응고된 혈액이 존재한다.
소 바이러스성 설사 바이러스 (BVD; Bovine Viral Diarrhoea Virus) 및 보더병 (Border's Disease)은 돼지 열병 (돼지 콜레라) 바이러스와 동일한 페스티바이러스 그룹에 속하는 두 바이러스이지만, 각각 소 및 양을 주로 감염시킨다. 이들은 돼지 종축 무리 속으로 들어가서 생식 문제를 일으킬 수 있다. 상기 질병은 암퇘지 불임의 통상적인 원인은 아니며, 진단적 관점에서는 가능성 목록에서 낮게 고려될 것이다.
렙토스피라병 (leptospirosis)은 대부분 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans)의 하위그룹이라고 생각되는, 면역학적으로 상이한 다양한 렙토스피라 혈청형에 의해서 발생하는, 사람을 포함한 동물의 전염병이다. 5종의 혈청형 및 그룹이 돼지에서 중요하다: 포모나 (pomona), 아우스트랄리스 (australis), 타라쏘비 (tarassovi), 카니콜라 (canicola), 익테로헤모라지캐 (icterohaemorrhagicae) 및 그립포티포사 (grippotyphosa). 감염은 증상이 없거나, 식욕부진, 발열, 활기 없음, 황달, 유산, 사산 및 다른 불명확한 생식 문제를 포함하는 다양한 징후 및 사망을 일으킬 수 있다. 급성 감염 후, 렙토스피라는 국소성 간질성 신염의 산재된 작은 회색 병소로 이루어진 신장 또는 생식 기관에 주로 위치하고, 종종 수개월 또는 수년 동안 많은 수가 뇨 중에 배출된다. 상기 유기체는 표면수에서 장기간 동안 생존하기 때문에, 상기 질병은 종종 수인성이다. 미국에서, 상기 질병은 주로 렙토스피라 하르드조 (Leptospira hardjo), 렙토스피라 포모나 및 렙토스피라 그립포티포사 혈청형이 원인이다. 항체 역가가 일시적으로 한 달 미만 동안 지속될 수 수 있기 때문에 진단이 어려울 수 있다. 또한, 렙토스피라는 건강한 동물에서도 발견될 수 있다. 엘.아우스트랄리스 혈청형 브라티슬라바 (bratislava)는 가장 일반적으로 생식 문제를 동반한다. 만성적으로 감염된 무리에서는 유산, 사산 및 약한 새끼돼지의 출산이 나타난다.
브루셀라증 (brucellosis)은 브루셀라 (Brucella) 속의 세균에 의해서 발생하고, 유산, 잔류 태반, 불임, 수퇘지의 고환염 및 암퇘지의 중증 자궁염이 특징이다. 새끼돼지에서, 상기 질병은 뒷다리 마비 및 파행이 특징이다. 돼지에서 상기 질병은 거의 예외없이 브루셀라 수이스(Brucella suis) 생물변이형 1, 2 및 3에 의해서 발생한다. 많은 다른 포유동물이 브루셀라 수이스를 보유할 수 있고 이를 돼지에 전염시킬 수 있다. 감염은 급속히 확산되고 백신 비접종된 무리에서 많은 유산을 일으킨다. 전염은 다른 돼지와의 접촉에 의해서 주로 일어나지만, 성교에 의한 전염도 가능하다. 상대적으로 일반적인 유기체인 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) O:9가 브루셀라와 공통 항원을 공유하고 종종 거짓 양성 결과를 나타내기 때문에 혈청학적 진단이 어려울 수 있다. 사후 병변은 일반적으로 자궁염 및 고환염을 포함하고, 종종 간에 있는 괴사 병소와 함께 농양을 포함할 수 있다.
클로스트리디움 (Clostridium)은 일반적으로 토양에서 발견되는 클로스트리디아세아에 (clostridiaceae) 과의 편재성 그람-양성 세균이지만, 대부분의 동물의 장에서도 자연적으로 존재한다. 돼지에서 씨.디피실레 (C. difficile) 감염은 중증 결장간막 부종, 설사 및 다른 조직에서의 부종 (예: 흉수)이 특징이다. 돼지에서 클로스트리디움 장염은 씨.퍼프린젠스 (C. perfringens)에 의해서 발생하고, 만성 장염이 특징이며, 이는 설사, 체중 감소 및 발열을 동반한다. 씨.퍼프린젠스 A, B 및 C형에 감염되면 어린 송아지에서 중증 장염, 이질, 독혈증 및 높은 사망률이 나타난다. B 및 C 형은 모두 매우 치명적인 괴사성 β 독소를 생산하고 이는 심각한 장 손상의 원인이다. 상기 독소는 단백질분해 효소에 대해 민감하고, 상기 질병은 장에서의 단백질분해의 억제와 관련이 있다. 트립신 억제제를 함유하는 암퇘지 초유는 어린 새끼돼지의 감수성의 요인으로서 제안되었다. 상기 질병은 1주령 미만의 새끼돼지에서 급사를 일으킬 수 있고, 생후 3일 이내에 가장 일반적이다. 연령이 더 높은 새끼돼지에서, 클로스트리디움 장염은 소장의 비후를 일으켜 음식물 및 영양분의 흡수를 어렵게 한다. 새끼돼지는 일반적으로 감염 및 영양분 부족의 조합의 결과로 사망한다. 수시간 내에 사망할 수도 있지만, 덜 심각한 경우에는 수일 동안 생존할 수 있고, 수일의 기간에 걸쳐 회복이 가능하다. 점막의 궤양형성을 동반한 출혈성 장염은 모든 종에서의 주요 병변이다. 육안상으로, 감염된 장 부분은 짙은 남색이고 처음에 잠깐 보면 장간막 염전을 동반한 경색인 것처럼 보인다. 장 내용물의 도말표본으로 많은 수의 그람-양성 간균에 대해 검사할 수 있고, 여과액을 만들어 독소를 검출한 후, 특정한 항혈청으로 중화시켜 확인할 수 있다.
클로스트리디움 노비이 (Clostridium novyi)는 고급 곡류 사료로 사육되고 선재하는 간 병변을 검출할 수 없었던 소 및 돼지에서 급사의 원인으로서 의심되었지만 아직 확인되지 않았다. 치명적인 괴사성 독소 (주로 α 독소)는 간의 실질조직을 손상시켜, 세균이 증식하게 하여 치사량의 독소가 생산되게 한다. 일반적으로, 명확한 징후 없이 갑자기 사망한다. 감염된 동물은 무리의 뒤로 처지는 경향이 있고, 흉골 횡와 (sternal recumbency)를 나타내며, 수시간 이내에 사망한다. 대부분의 경우에는 간 흡충 감염이 최고조인 여름 및 초가을에 발생한다. 상기 질병은 1 내지 4년령 양에서 가장 만연해 있고 간 흡충에 감염된 동물에 제한된다. 급성 간질증 (acute fascioliasis)으로부터 구별하기는 어려울 수 있지만, 부검 상에서 통상적인 병변을 보이는 동물의 과급성 사망은 전염성 괴사성 간염을 의심해야 한다. 가장 특징적인 병변은 종종 간에서 작은 흡충의 이동 경로를 따라가는 회황색 괴사 병소이다. 다른 일반적인 소견은 담황색 액으로 채워진 비대한 심낭, 및 복강 및 흉강 내의 과량의 액이다. 일반적으로, 피하 조직에 있는 모세혈관이 광범위하게 파열되어 근처의 피부가 검게 변하게 된다 (따라서 일반명으로 흑피병 (black disease)이다).
클로스트리디움 셉티쿰 (Clostridium septicum)은 전세계적으로 토양 및 동물 (예: 사람)의 장 내용물에서 발견된다. 통상적으로 감염은 죽은 조직, 토양 또는 일부 다른 쇠약 조직을 함유하는 상처의 오염을 통해 발생한다. 사고, 거세, 꼬리자르기, 비위생적인 백신접종 및 분만에 의해 발생한 상처가 감염될 수 있다. 일반적인 징후, 예를 들면 식욕부진, 중독 및 고열뿐만 아니라 국소 병변은 선행 외상 후 수시간 내지 수일 이내에 발생한다. 국소 병변은 누르면 움푹 들어가는 약한 종창이고, 감염된 영역의 피하 및 근육내 결합조직으로 침윤되는 다량의 삼출물이 형성되므로 빠르게 확장된다. 가스의 축적은 드물다. 열상을 동반한 악성 부종은 현저한 부종, 중증 독혈증 및 24 내지 48시간 이내의 사망이 특징이다.
파상풍 독혈증은 괴사 조직에서 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani)에 의해 생산되는 특정한 신경독소에 의해 발생한다. 돼지를 포함한 거의 모든 포유동물은 상기 질병에 걸리기 쉽다. 파상풍은 전세계적으로 분포되어 있지만, 미국 북부 로키산맥 지역과 같은 일부 지역에서는 상기 유기체가 토양에서 거의 발견되지 않고 파상풍이 거의 알려져 있지 않다. 일반적으로, 토양에서의 씨.테타니의 출현율 및 사람에서의 파상풍의 발병률은 여러 대륙의 온난한 지역에서 더 높다. 말단 구형 포자를 갖는 혐기성 세균인 클로스트리디움 테타니는 토양 및 장관에서 발견된다. 대부분의 경우에는, 적당한 혐기성 환경을 제공하는 상처, 특히 깊은 자상을 통해 조직 속으로 들어간다.
살모넬라 종 (Salmonella spp)에 감염되면 모든 연령의 동물, 특히 스트레스를 받거나, 밀집 사육되거나, 심하게 오염된 사료 또는 식수 공급에 노출된 동물에서 설사가 발생할 수 있다. 살모넬라증은 많은 살모넬라 종에 의해 발생하고, 임상적으로 세가지 주요 증상인 패혈증, 급성 장염 및 만성 장염 중 하나 이상을 특징으로 한다. 발병률은 가축 생산의 증대와 함께 증가되었다. 다양한 종류의 살모넬라가 돼지에서 감염을 일으킬 수 있지만, 돼지에서 발견되는 통상적인 살모넬라는 에스.콜레라수이스 (S. choleraesuis) 및 에스.티피무리움 (S. typhimurium)이다. 대부분의 살모넬라에 의한 임상 패턴은 상이하지 않고, 상이한 살모넬라 종은 역학적으로 상이한 경향이 있다. 플라스미드 프로파일 및 약물 내성 패턴은 종종 역학적 연구에 유용한 마커이다. 살모넬라 패혈증은 종종 에스.콜레라수이스와 관련이 있다. 감염된 새끼돼지는 움직이기 싫어함, 식욕부진, 40.5℃ 내지 41.6℃의 고열을 나타내고, 얕은 기침을 할 수도 있다. 새끼돼지는 사지 청색증을 나타내며 사망한 채로 발견될 수도 있다. 에스.콜레라수이스는 폐렴 및 설사를 모두 일으킬 수 있는 희귀병 중의 하나이고, 감염된 새끼돼지의 사망률은 종종 높다. 일반적으로 소장결장염 (enterocolitis)은 보다 일반적인 에스.티피무리움과 관련이 있다. 감염이 진행됨에 따라 혈액 또는 점액을 함유할 수 있는 황색 또는 수양성 설사가 감염의 특징이다. 사망률은 낮고 설사로 인한 탈수 및 칼륨 결핍을 종종 동반한다. 감염된 동물의 분변은 사료 및 물, 도살장으로부터의 정육 및 가공육, 비료 또는 사료로서 사용되는 식물 및 동물 생산물, 목장 및 방목장, 및 많은 불활성 물질을 오염시킬 수 있다. 하지만 에스.콜레라수이스는 사료에서는 거의 발견되지 않는다. 이는 감염된 동물과의 접촉을 통해 직접적으로 전달될 수도 있다. 살모넬라는 양돈 축사 또는 물 웅덩이와 같이 습하고 따뜻한 장소에서 수개월 동안 생존할 수 있다. 설치류 및 야생 조류도 감염원이다. 감염 유병률은 종 및 국가 간에 차이가 있고, 임상 질병의 발생률보다 매우 높으며, 이는 통상적으로 갑작스런 사료의 부족, 운송, 가뭄, 밀집, 분만 및 일부 약물의 투여와 같은 스트레스 상황에 의해 촉진된다.
에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)는 엔테로박테리아세아에 (enterobacteriaceae) 과의 세균이고, 모든 포유동물의 소장에 자연적으로 존재하는 주요 세균 종류 중의 하나이다. 일반적으로는 무해하지만, 일부 이.콜라이 균주는 감염 및 질병을 일으키는 많은 외독소 및 내독소를 생산할 수 있다. 열-불안정성 (LT) 및 열-안정성 (ST) 외독소는 일부 균주에 의해서 활발히 생산되고 설사를 일으키는 원인이다. 시겔라 (Shigela)-유사 독소 2형 변이체 (SLT-IIe), Stx2e 및 베로톡신 (verotoxin) 부종 질환은 소동맥 벽에 작용하여 부종을 일으킨다. 리피드 에이 (Lipid A)와 같은 내독소는 유선염 및 요로 감염에서 일정한 역할을 한다. 이.콜라이 감염은 관련된 특정 균주에 따라 설사, 눈밑 함몰, 성장부진, 가시적 체중 감소, 발육 지연, 우울, 장 부종, 유선염, 방광염, 신우신염 및 사망을 포함하는 많은 상이한 증상이 특징이다. 이.콜라이는 세포벽 (O 항원) 및 섬모 (F 항원)에 의해 분류되고 암호화될 수 있다. 예를 들면, 설사는 종종 이.콜라이 애보츠타운 (Abbotstown): O147, F4, F5와 관련이 있지만, 장 부종은 F18 섬모와 관련이 있다. 코드를 정확하게 확인하는 것은 정확한 백신의 선택에 필수적이다. 이.콜라이 감염은 돼지의 면역 시스템을 손상시키고, 2차 감염 및 질병의 결과로 종종 사망을 일으킨다.
돈두 (swine pox)는 피부 병변, 구진, 농포 및 옴을 일으키는 질병이다.
에페리트로준병 (eperythrozoonosis)은 돼지 적혈구 막에 부착해서 변형 및 손상을 유도하는 세포외 세균 유기체인 에페리트로준 수이스 (Eperythrozoon suis)에 의해서 발생하는 리케차성 (혈액영양성) 질병이다. 상기 질병은 빈혈 및 황달 (점막, 공막 및 내이가 황색으로 변색됨)이 특징이다. 이는 낮은 수태율, 다른 불명확한 생식 문제 및 심지어 사망을 일으킬 수 있다.
돼지 열병 (CSF; Classical Swine Fever) 또는 아프리카 돼지 열병 (ASF; African Swine Fever)이라고도 공지된 돼지 콜레라는 플라비비리다에 (Flaviviridae) 바이러스에 의해 발생하는 질병이고, 이는 외피보유 RNA 바이러스이거나, ASF의 경우에는, 폭스 바이러스 (Pox virus)와 관련된 외피보유 DNA 바이러스이다. 임상적으로, CSF와 ASF는 구별 불가능하다. 첫번째 증상은 일부 식욕부진을 동반한 활동 감소 및 졸음이고, 돼지가 추위를 타는 것처럼 보일 수 있다. 수일 이내에, 돼지는 현저한 열 (41 내지 42℃)을 나타내고, 이는 종종 피부의 홍조를 동반한다. 그 다음에, 돼지에서 결막염 및 변비가 발생하고 황색 설사로 이어진다. 무리에서, 돼지는 추위를 타는 것처럼 보일 것이고, 종종 서로 붙어있을 것이다. 일부 돼지는 사망하기 전에 경련이 일어날 수 있다. 돼지는 피부의 자주색 변색이 확산되면서 사망하기 시작하고, 사망은 종종 감염후 10 내지 20일 이내에 발생한다. 생존한 돼지는 종종 심각한 성장 지연 및 굽은 등의 영향을 받을 것이다. 정착된 무리에서, 임신 동안 어미로부터 감염된 새끼돼지는 유산, 미라화, 기형, 사산이 발생하고 약한 새끼돼지가 태어날 수 있다. CSF-감염된 어미로부터 태어난 새끼돼지는 건강을 유지할 수 있지만, 일생에 걸쳐 계속적으로 질병을 확산시킨다.
파스튜렐라 폐렴 (pneumonic pasteurellosis) 및 연쇄상구균 폐렴 (pneumonic streptococcus)은 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 및 다양한 연쇄상구균 종, 통상적으로 에스.수이스 (S. suis)에 의해서 발생한다. 원인균에 의한 감염은 일반적으로 이유후 호흡기 증후군의 마지막 단계를 나타낸다. 임상 징후는 세가지 형태로 나타나고, 급성 형태는 피.멀토시다 혈청형 B와 가장 일반적으로 관련이 있다. 동물은 호흡곤란, 노작성 호흡, 딸꾹질, 고열 (42.2℃), 쇠약을 나타내고 결국 사망한다. 일부 경우에 복부가 변색되어 자주색이 된다. 두번째 형태는 흉막염, 기침 및 호흡 곤란이 특징인 아급성 형태이다. 돼지의 체중이 상당량 감소할 수 있고, 잘 성장하지 못하거나 전혀 성장하지 못하여 돼지 공급량에 심각한 결과를 초래할 수 있다. 만성 형태는 가끔 기침, 딸꾹질이 나타나고, 발열이 거의 없거나 전혀 없다. 상기 형태는 일반적으로 10 내지 16주령의 돼지를 감염시킨다.
연쇄상구균 뇌막염 (streptococcal meningitis)은 뇌를 둘러싸고 있는 막인 뇌막의 염증을 일으킨다. 젖먹이 새끼돼지에서, 이는 일반적으로 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 또는 종종 이.콜라이 및 다른 연쇄상구균과 같은 세균에 의해서 발생한다. 에스.수이스에는 많은 혈청형이 있다. 대부분의 국가에서는 에스.수이스 1형이 젖먹이 새끼돼지에서 주된 종류이지만, 다른 국가에서는 사실이 아닐 수 있다. 예를 들면, 덴마크에서는 7형이다. 에스.수이스, 특히 1형 및 14형은 관절 문제도 일으킨다. 에스.수이스는 장기간 동안 편도선에 존재하고, 암퇘지 또는 다른 새끼돼지로부터 젖먹이 새끼돼지로 전염될 수 있다. 암퇘지는 또한 초유 중에 다양한 수준의 면역성을 제공한다. 젖먹이 새끼돼지에서의 연쇄상구균 뇌막염은 개개의 새끼돼지에서 산발적이다. 유기체가 처음으로 무리 내에 들어온 경우, 또는 PRRS 감염에 대해 2차 감염인 경우, 연쇄상구균 뇌막염은 젖먹이 새끼돼지에서 더 심할 수 있다.
가성광견병 (pseudorabies)은 돼지 공수병 바이러스 (porcine rabies virus), 수이드 헤르페스 바이러스 (Suid herpes virus)로도 공지되어 있고, 원인체는 외피보유 헤르페스 DNA 바이러스이다. 비경험 (naive) 무리에서, 신생돈은 발작에서부터 심각한 조정장애까지 다양한 중증 중추신경 징후를 나타낸다. 뒷다리 마비로 인해 새끼돼지가 개와 같은 방식으로 앉게 될 수 있다. 또한, 사망률이 높다. 이유돈에서는, 중추신경 징후는 감소될 수 있지만, 호흡기 징후의 증가를 동반할 수 있다. 종종, 호흡기 질병은 2차 감염을 동반한다. 이유돈은 쇠약해지고 성장부진을 겪을 수 있으며 종종 발육이 지연된다. 육성돈에서는, 호흡기 징후가 증가하는 동안 중추신경 징후는 계속 감소한다. 호흡기 질병의 정도는 2차 감염의 존재 및 중증도에 따라 달라진다. 성체에서는, 생식기 징후가 현저하다. 암퇘지는 유산할 수 있고, 분만 예정일에 임박해서 감염된 동물은 사산된 새끼돼지 또는 약한 새끼돼지를 낳는 것 같다. 정착된 무리에서는, 임상 징후가 거의 없을 수 있다.
돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine Influenza Virus)는 돼지 인플루엔자를 일으킬 수 있고, 인플루엔자 A형 바이러스 그룹에 속한다. 비경험 (naive) 무리에서, 임상 징후는 모든 또는 많은 동물이 동시에 병에 걸리면서 폭발적인 급증으로 나타날 수 있다. 감염된 동물은 비활동, 우울, 움츠림/몰려다님 및 식욕부진을 나타낼 수 있다. 감염된 동물은 종종 구강 호흡을 하고 노작성 호흡을 한다. 운동시 기침이 날 수 있다. 다른 임상 징후에는 40.5 내지 41.5℃의 직장 온도와 함께 콧물 및 부은 눈이 포함된다. 종축에서의 고온은 유산, 불임, 작고 약한 새끼의 분만 및 사산의 증가를 일으킬 수 있다. 정착된 무리에서는, 매년 재감염이 나타난다.
스피로헤타 결장염 (spirochaetal colitis)은 브라키스피라 필로시콜리 (Brachyspira pilosicoli) 세균에 의해서 발생한다. 이는 일반적으로 10 내지 20주령의 육성돈/비육돈을 감염시킨다. 이는 육성돈의 비치명적 소모성 설사가 특징이고, 이로 인하여 비육완료되는데 필요한 일수가 증가된다. 설사는 또한 사료 효율을 감소시키고 수양성 설사를 일으키거나 무른 변이 만들어지게 한다. 약 절반의 돼지에서 일시적 내지 지속적, 수양성 내지 점액성, 녹색 내지 갈색의 비-혈액성 설사가 나타날 수 있다. 임상 징후는 사료의 혼합 및 변경후 10 내지 14일 후에 더 일반적이다.
돼지 이질은 브라키스피라 히오디센테리애 (Brachyspira hyodysentheriae) 세균에 의해서 발생한다. 현재 12종의 혈청형이 공지되어 있다. 정착된 무리에서의 임상 징후에는, 설사, 일부 돼지의 상태의 빠른 악화, 털이 거친 외관, 탈수, 복통, 및 다른 돼지에서 어떤 징후도 나타나기 전에 1마리 또는 2마리의 돼지가 사망하는 것이 포함된다. 비경험 (naive) 무리에서의 주요 발병시, 젖먹이 새끼돼지부터 성체 암퇘지까지 모든 연령군이 감염될 수 있다.
전염성 위장염 (transmissible gastroenteritis)은 코로나바이러스 (coronavirus)에 의해 발생하는 장 질환이다. 이는 돼지 호흡기 코로나바이러스 (porcine respiratory coronavirus), 유행성 설사 바이러스 (epidemic diarrhea virus) 및 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (hemagglutinating encephalomyelitis virus)와 동일한 과에 속한다. 초기 임상 징후는 수양성 설사, 구토 및 식욕부진이다. 21일령 미만의 새끼돼지는 일반적으로 사망하고, 이유돈은 성장이 부진해지지만, 육성돈, 비육돈 및 성돈은 일반적으로 경증으로 감염되어 적당한 물이 공급되면 생존할 것이다.
파보바이러스 (parvovirus)는 돼지에서 생식 문제를 일으키는 것이 특징인 질병이다. 원인체는 작은 DNA 외피 비보유 바이러스이다. 태아만 감염되며, 태아에 미치는 영향은 감염될 때의 연령에 따라 달라진다. 10 내지 30일령일 때는, 감염되면 태아의 사망 및 재흡수가 일어난다. 30 내지 70일령일 때는, 감염되면 사망 및 미라화가 일어난다. 그리고 70일령부터 분만 예정일까지는, 감염되면 약한 새끼돼지의 분만 및 미라화가 일어난다. 상기 질병은 태반을 통과한 후, 자궁을 따라 각각의 태아로 이동할 수 있다. 암퇘지에서, 임상 징후는 사산, 미라화된 새끼돼지, 배아 사망, 불임 및 살아서 태어나는 새끼의 수가 상당히 감소하는 것이다. 유산은 파보바이러스 감염의 특징은 아니다.
액티노바실러스 흉막폐렴 (Actinobacillus pleuropneumonia)은 APP 및 헤모필루스 흉막폐렴 (Haemophilus pleuropneumonia)으로도 공지되어 있고, 액티노바실러스 플루오뉴모니아 (Actinobacillus pleuopneumonia) 세균에 의해서 발생한다. 현재는 15종의 혈청형이 기술되어 있고, 임상 징후의 중증도는 상이한 혈청형 바이러스 및 다른 요인의 존재에 따라 상이하다. 혈청형 바이러스 1, 5, 9, 10 및 11은 병독성이 더 높은 것으로 생각된다. 또한, 혈청형 바이러스 1과 9와 11; 2와 6과 8; 및 4와 7은 교차 반응할 수 있다. 모든 연령의 돼지가 감염되기 쉽다. 임상 징후는 동물이 많이 눕게 되고 41.5℃의 높은 직장 온도를 나타내는 갑작스러운 질병이다. 동물이 일반적으로 식욕부진을 나타내고 물을 마시지 않으며, 사지에서 청색증이 나타나고 촉진시 차갑게 된다. 청색증은 전신으로 확산될 수 있고, 사망 전에 자주 구강 호흡을 하면서 심각한 호흡 곤란이 나타난다. 입과 콧구멍에서 혈액이 섞인 거품을 볼 수 있고, 일반적으로 24 내지 48시간 이내에 사망한다. 급성 임상 징후에는 그룹 중에서 기운이 없고 누워있는 동물의 비율이 높음, 40.5 내지 41℃의 높은 직장 온도, 식욕부진, 물을 마시지 않음, 중증 호흡 곤란, 기침, 구강 호흡, 청색증, 구토 및 유산이 포함된다. 아급성 임상 징후에는 돼지 그룹에서의 간헐적인 기침, 전반적인 식욕 상실 및 성장 감소가 포함된다. 사이로바 (cyrovar) 3형은 관절염, 심내막염 및 농양을 나타낸다. 만성적으로 감염된 무리에서, 일일 증체량은 영향을 받지 않을 수 있지만, 간헐적인 기침은 들을 수 있다.
글래서병 (Glassers Disease)은 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis)(Hps) 세균에 의해서 발생하고, 상기 세균은 15종 이상의 상이한 종류가 있다. 이는 전세계에서 발견되고 건강상태가 좋은 무리에서도 상기 유기체가 존재한다. SPF 또는 MEW 기술을 사용해서 이러한 무리를 조성하여 Hps가 없는 경우에는, 처음 오염될 때 암퇘지에서 사망률이 높은 탄저균-유사 질병이 발생하여 파괴적일 수 있다. 세균이 풍토성인 대다수의 무리에서는, 암퇘지가 강력한 모계 면역을 생산하고 이는 일반적으로 이들의 새끼에서 8 내지 12주령까지 지속된다. 그 결과, 이유돈에서 감염의 영향은 일반적으로 없거나 최소이다. 하지만, 젖먹이 돼지에서는 질병이 나타날 수 있다. 돼지는 일반적으로 모계 항체에 의해 계속 보호되고 있을 때는 무증상 감염되고 나서, 그들 자신의 면역 반응을 자극시킨다. 그러나, 감염되기 전에 모계 면역이 없어지면 중증 질병이 발생할 수 있다. 이는 일반적으로 이유 후에 발생한다. 이는 다른 주요 질병, 특히 유행성 폐렴 (EP) (마이코플라즈마 하이오뉴모니애)에 대해 2차 병원체로서 작용할 수도 있다. 젖먹이 돼지에서, 특히 미경산돈 무리에서는 종종 질병이 급증한다. Hps는 관절의 매끄러운 표면, 장, 폐, 심장 및 뇌의 외피에 침범하여, 폐렴, 심낭 감염, 복막염 및 늑막염을 일으킨다. 이는 호흡기로 확산된다. 건유기 암퇘지가 비경험 (naive) 상태가 아닌 경우, 암퇘지에서 Hps에 의해 발생하는 질병은 드물다. 파행 또는 경직, 관절 및 힘줄 위의 작은 종기, 및 드물게 뇌막염이 때때로 미경산돈에서 나타난다. 새끼돼지에서는, 급성 질병으로 돼지가 급속히 기운이 없어지면서 체온 상승, 식욕부진 및 일어나기 싫어함을 나타낸다. 한가지 특징은 2 내지 3회의 짧은 기침이다. 건강한 젖먹이 새끼돼지에서의 급사는 드물지 않다. Hps는 발열 및 식욕부진과 함께 관절염 및 파행의 개별 증례를 일으키는 것으로도 공지되어 있다. 만성 질병은 돼지가 창백하고 잘 성장하지 못하는 것이 특징이다. 급사가 일어날 수도 있다. 이유돈 및 육성돈의 경우, 글래서병에 걸린 돼지는 급속히 기운이 없어지거나 사망한 채로 발견될 수 있다. 다른 증상에는 체온 상승, 식욕부진, 일어나기 싫어함, 뇌막염을 포함하는 발작 및 경련과 같은 신경 징후 및 건강이 좋지 않은 돼지가 포함되고, 이는 소모성이며 그 결과 종종 털이 거칠어진다. 어린 육성돈에서는 다음의 증상이 가장 일반적이다: 발열, 경증 뇌막염, 관절염, 파행, 폐렴, 심낭 감염, 복막염 및 늑막염. 또한, 2 내지 3회만 하는 짧은 기침이 특징이다.
삼출성 표피염 (exudative epidermitis)은 일반적으로 피부에서 질병을 일으키지 않고 살고 있는 스타필로코커스 하이쿠스 (Staphylococcus hyicus) 세균에 의해서 발생한다. 이것이 종종 발적하여 피부염을 일으켜 미끈미끈한 액이 스며나오는 이유는 알려져 있지 않다. 상기 세균은 독소를 생산하고 이는 체내로 흡수되어 간 및 신장을 손상시킨다. 젖먹이 새끼돼지에서, 상기 질병은 일반적으로 개개의 동물에 제한되지만, 새로운 미경산돈 무리 및 이유돈에서는 중대한 문제일 수 있다. 분만하기 직전의 기간 동안, 상기 세균이 암퇘지의 질에서 대량으로 증식되어 분만 과정 동안 또는 직후에 새끼돼지가 감염된다. 암퇘지에서의 증상에는 특히 안면 및 안구의 뒤에 나타날 수 있는 드물지만 국한된 병변이 포함된다. 심각하게 감염된 새끼돼지는 사망할 것이다. 새끼돼지에서, 증상에는 옆구리 및 귀의 뒤에 국한된 병변이 포함된다. 병변은 일반적으로 안면 주변 또는 다리에 작고 어두운 국한된 감염 영역으로 시작된다. 옆구리를 따라 복부 및 다리 사이의 피부가 갈색으로 변하고 점차 전신으로 확산된다. 피부는 넓은 영역이 박리되면서 주름이 생기고 미끈미끈한 느낌이다. 심각한 경우에는, 괴사로 인하여 피부가 검게 변하고 새끼돼지가 사망한다. 암퇘지로부터 새끼돼지에게 어느 정도의 면역성이 전달된 경우에는, 보다 국한된 양상이 나타나고, 직경이 대략 5 내지 10mm이면서 확산되지 않는 작은 제한된 병변이 나타난다. 이유돈 및 육성돈의 경우, 증상은 일반적으로 피부가 손상된 안면 주변 또는 다리에서의 국한된 갈색의 감염 영역 또는 피부염으로 이유 약 3일 후에 시작된다. 궤양이 생길 수도 있다. 옆구리를 따라 복부 및 다리 사이의 피부가 갈색으로 변하고 점차 전신으로 확산된다. 피부는 넓은 영역이 박리되면서 주름이 생기고 어둡고 미끈미끈한 피부결로 진행되며 심각한 경우에는 검게 변한다. 이러한 경우에는 일반적으로 포도상구균 유기체에 의해 생산된 독소로 인하여 사망한다. 자돈사에서는 집단의 15%까지 감염될 수 있고 탈수가 일반적이다.
돼지 단독 (swine erysipelas)은 전부는 아니지만 대부분의 양돈장에서 발견되는 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae) 세균에 의해서 발생한다. 최대 50%의 동물이 편도선에 상기 세균을 보유할 수 있다. 상기 세균은 타액, 분변 또는 뇨를 통해 배설되므로 돼지 또는 환경에 항상 존재한다. 이는 조류 및 양을 포함하는 많은 다른 종에서도 발견되고, 돼지 외부에서 수주 동안 생존할 수 있으며 경토에서는 보다 오래 생존할 수 있다. 따라서, 무리로부터 이를 제거하는 것은 불가능하다. 특히 육성사 및 비육사에서는, 감염된 분변이 아마도 주요 감염원일 것이다. 상기 세균은 단독으로 질병을 일으킬 수 있지만, PRRS 또는 인플루엔자와 같은 동시적 바이러스 감염이 급증을 유발할 수 있다. 8 내지 12주령 이하의 돼지에서는 초유를 통해 암퇘지로부터 모계 항체에 의해 제공된 보호로 인하여 질병이 상대적으로 드물다. 가장 감염되기 쉬운 동물은 육성돈, 백신 비접종된 미경산돈 및 출산경력 4회 이하의 암퇘지이다. 상기 유기체는 체내에서 증식하고, 혈류로 침입하여 패혈증을 일으킨다. 이후, 돼지에서의 증식 속도 및 면역 수준이 임상 증상을 결정한다.
에페리트로준병 (eperythrozoonosis) (Epe)은 적혈구 표면에 부착해서 종종 이를 파괴하는 에페리트로주노시스 수이스 (Eperythrozoonosis suis)라고 불리는 세균에 의해 발생하는 질병이다. 이후, 돼지에서 빈혈이 발생할 수 있고, 세포가 파괴된 후 남은 산물이 황달을 일으킬 수 있다. 임상 질병은 어린 육성돈에서 보다 일반적으로 나타난다. 하지만, 이는 종축 무리에서 생식 문제를 일으킬 수도 있다. 암퇘지는 Epe를 보유하면서 상당히 건강한 상태가 유지될 수 있지만, 이는 태반을 통과하여 출산시에 약하고 창백한 돼지가 태어날 수 있다. Epe는 전부는 아니지만 대부분의 무리에 존재하는데, 이것이 병원성이 되어 일부 집단에서는 질병을 일으키고 다른 집단에서는 일으키지 않는 기전은 알려져 있지 않다. 상기 질병의 발병률은 낮다.
뇌심근염 (encephalomyocarditis) 또는 EMC는 광범위한 척추동물을 감염시키고 질병을 일으키지만, 가축 종 중에서 돼지가 가장 감염되기 쉬운 것으로 보인다. 상기 바이러스는 전세계적이지만 여러 국가와 지역에서 병원성 및 병독성이 상이하다. 유럽의 대부분의 국가, 특히 EU에 속한 국가에서는, 상대적으로 약하거나 비-병원성인 경향이 있고 돼지에서 상기 질병이 거의 진단되지 않는다. 호주에서는 상기 바이러스 주 (strain)가 뉴질랜드에 있는 바이러스주보다 돼지에 대해 보다 더 병독성이 있는 것으로 보인다. 플로리다, 캐리비안 및 아마도 중앙 아메리카에 있는 병독성 바이러스주는 심장을 손상시켜 사망을 일으키지만, 미국의 중서부에 있는 바이러스주는 생식 문제를 일으키는 경향이 있다. 래트의 수가 페스트 (plague) 수준으로 증가하는 경우에 돼지에서 임상 질병이 발생하는 경향이 있다. 돼지는 래트로부터 또는 래트에 오염된 사료 또는 식수로부터 감염될 수 있다. 돼지 사이에 매우 쉽게 확산되는 것 같지는 않다. 감염된 무리에서 이유돈 및 육성돈은 일반적으로 임상 징후가 없다.
오제스키병 (Aujeszky's disease) 또는 AD는 헤르페스 바이러스에 의해서 발생하는 중요한 돼지 질병이다. 상기 바이러스는 장기간 동안 보균 상태로 돼지의 신경에 숨어있다가 이후에 재활성화될 수 있다. 일단 무리 내로 들어오면, 상기 바이러스는 일반적으로 그곳에 남아서 계속적으로 다양한 수준에서 생식 능력에 영향을 미칠 수 있다. 상기 바이러스는 돼지 외부에서 최대 3주까지 생존할 수 있다. 병독성 바이러스 주가 백신 비접종된 감염되기 쉬운 무리를 처음 감염시키는 경우에 상기 질병이 급증한다. 상기 바이러스는 자궁 및 태반을 통과하여 태아를 감염시킨다. 돼지가 주요 숙주이다. 하지만, 개와 소도 감염되어, 신경 징후가 나타나고, 사망할 수 있다.
돼지 사이토메갈로바이러스 감염 (PCMV; Porcine Cytomegalovirus Infection)은 염증 (비염)이 발생하는 신생 새끼돼지의 코를 포함하여 전신의 조직에서 발견되는 헤르페스 바이러스에 의해 발생한다. PCMV는 전세계적으로 존재하고, 전부는 아니지만 대부분의 돼지 집단에 존재하는데, 대부분의 감염은 무증상이고 임상 질병이 드물다. 예를 들면, 영국에서 실시한 혈청검사에서는 무리의 90% 이상이 감염에 노출된 것으로 나타난다. 상기 바이러스에 의해 발생하는 비염은 드물고, 주로 신생 돼지에서 발생하며, 독소 생산 세균인 파스튜렐라 멀토시다에 의해 발생하는 위축성 비염과는 관련이 없다. 그러므로, 대부분의 무리에서 상기 감염은 중요하지 않으며, 때때로 가벼운 재채기를 일으키는 것과는 별개로 돼지의 건강상태에는 주요한 영향을 미치지 않는다.
청안병 (blue eye disease)은 신경 증상, 생식 장애 및 각막의 혼탁 또는 블루잉 (blueing)을 일으키는 바이러스 질병이다. 이는 주로 멕시코에서 나타나지만, 다른 국가에서도 보고되었다. 유럽에서는 나타나지 않았다. 증상에는 식욕부진, 각막 혼탁 - 결막염, 신경 징후, 예를 들면 발작 및 경련, 개와 같이 앉는 성향, 발열, 증가된 재귀, 이유시부터 교배시까지의 증가된 간격, 사산, 미라화된 새끼돼지, 새끼돼지의 높은 사망률, 팽대된 고환 및 성욕 상실이 포함된다.
B형 일본 뇌염 바이러스 (JE; Japanese B Encephalitis Virus)는 모기에 의해 확산되는 바이러스이고, 이는 곤충이 만연한 국가에서만 중요하다. 대부분의 가축이 감염된다. 이는 사람에서 뇌염을 일으킨다. 돼지는 중요한 감염원이다. 증상에는 미라화되거나 사산된 새끼돼지, 발작 및 경련과 같은 새끼돼지의 신경 징후 및 새끼돼지의 부종액이 포함된다. 이는 수퇘지에서 불임 및 고환 팽대를 일으킬 수도 있다.
돼지 유행성 설사 (PED; Porcine Epidemic Diarrhoea)는 TGE를 일으키는 바이러스와 다소 유사한 코로나바이러스에 의해서 발생한다. 상기 바이러스는 유럽에서 광범위하게 확산되어 있다. 상기 바이러스는 장에 있는 융모를 손상시켜 흡수 표면이 감소되어, 체액의 손실 및 탈수를 일으킨다. 감염되기 쉬운 종축 무리 내로 바이러스가 들어온 후, 2 내지 3주에 걸쳐 강력한 면역성이 생긴다. 이후, 초유 면역이 새끼돼지를 보호한다. 상기 바이러스는 일반적으로 종축 무리, 특히 작은 종축 무리 (암퇘지 300마리 미만)로부터 자연적으로 사라진다. 상기 바이러스가 감염되기 쉬운 집단 내로 처음 들어오는 경우에 설사가 급증한다. 이러한 경우 최대 100%의 암퇘지가 감염되어, 경증 내지 중증 수양성 설사가 나타날 수 있다. 두 가지의 임상 양상이 인식되어 있다: 제1형 PED는 육성돈만 감염시키지만, 제2형 PED는 젖먹이 돼지 및 성숙한 암퇘지를 포함하여 모든 연령을 감염시킨다. 잠복기는 대략 2일이고 설사는 7 내지 14일 동안 지속된다. 젖먹이 돼지에서, 상기 질병은 경증이거나 사망률이 40%까지 이르는 중증일 수 있다. 큰 종축 무리, 특히 대규모로 유지되는 무리에서는, 모든 암컷이 처음에 감염되지 않을 수 있고, 병이 재발할 수 있다. 이는 모계 항체가 없는 암퇘지로부터 젖을 먹는 새끼돼지에서만 발생하고, 따라서 산발적이다.
돼지 호흡기 코로나 바이러스 감염 (PRCV; Porcine Respiratory Corona Virus Infection)은 유럽에서 약 10년 이상 전에 돼지에서 처음 나타났다. 이는 또다른 코로나 바이러스인 TGE 바이러스와 관련이 있지만 이와는 상이하다. 이는 바람을 타고 사육장 사이에 확산되는 것으로 생각되므로, 무리로부터 이를 제거하는 것은 매우 어렵다. 감염은 주로 2 내지 3주령의 젖먹이 돼지에서 발생하지만 이는 중요하지 않다. 이는 다른 호흡기 병원체가 만성 호흡기 질병 복합체에 존재하는 경우에 폐 조직에 영향을 미칠 수 있다. 암퇘지는 일반적으로 증상이 없지만, 기침과 관련이 있을 수 있는 다른 호흡기 병원체가 존재하는 경우 기침을 할 수 있다. 새끼돼지에서는, 일시적인 기침이 존재할 수 있다. 이유돈 및 육성돈에서, 처음으로 노출된 무리는 질병의 징후가 존재하더라도 거의 존재하지 않는다. 가장 일반적인 증상은 수시간 동안만 지속되는 일시적인 기침이다.
로타바이러스 감염은 돼지 집단에서 광범위하게 확산되어 있는 바이러스 감염이다. 이는 전부는 아니지만 대부분의 돼지 무리에 존재하고, 성체 가축에서 사실상 100%의 혈청전환을 보인다. 추가적인 역학적 특징은 환경 변화 및 많은 살균제에 대해 내성인 돼지 외부에서 잔존하는 것이다. 모계 항체는 3 내지 6주 동안 지속되고, 이후에 돼지는 감염되기 쉬워지지만 노출로 인해서 반드시 질병이 발생하지는 않는다. 돼지에서 설사의 10 내지 15%만 1차 로타바이러스 감염에 의해 시작되는 것으로 추정된다. 성숙한 무리에서, 상기 질병은 새끼돼지가 7 내지 10일령이 된 이후에 나타난다. 이는 연령에 따라 점차 덜 중요해진다. 그러나, 이.콜라이의 병원성 균주가 존재하는 경우, 중증 질병이 발생하여 사망률이 높을 수 있다.
광견병 (rabies)은 바이러스에 의해 발생하고, 돼지에서는 드문 질병으로 생각된다. 이는 사람을 포함하여 모든 종에서 예외없이 치명적이므로 중요하다. 광견병은 영국에는 부재하지만, 전세계의 많은 다른 국가에 존재한다. 새끼돼지 및 암퇘지에서의 감염은 드물다. 암퇘지, 이유돈 및 육성돈에서, 상기 질병은 안면 근육의 신경 연축, 발작 및 경련, 빠른 저작, 타액분비, 근육 경련 가능성을 포함하는 증상과 함께 갑자기 발병하고, 뒷다리 마비가 발생할 수 있다. 일반적으로 3일 이내에 사망한다.
돼지 수포병 (SVD; Swine Vesicular Disease)은 구제역 (FMD; Foot and Mouth Disease)을 일으키는 바이러스와 상이한 바이러스이다. 그러나, 이는 돼지에서 임상적으로 FMD와 구별할 수 없는 질병을 일으킨다. 주둥이, 혀 및 발톱 끝에 수포 또는 물집이 나타나면서 갑자기 파행이 광범위하게 확산되는 경우, 상기 질병을 항상 고려해야 한다.
결핵은 사람을 포함하는 포유동물, 조류 및 돼지를 감염시킨다. 원인 유기체인 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)는 사람형, 소형 및 조류형으로 하위-분류된다. 조류형은 단일 종이 아니기 때문에 엠.아비움 (M. avium) 또는 보다 흔히 아비안/인트라셀룰라레 (avian/intracellulare) 복합체라고 불린다. 엠.아비움 그 자체는 주로 조류를 감염시키지만, 주로 부생성 (saprophytic)이거나 독립 생활하는 엠.인트라셀룰라레와 함께 자연환경에서도 발견된다. 돼지는 사람형 또는 소형에 의해서 거의 감염되지 않지만, 통상적으로 아비안/인트라셀룰라레 복합체에 의해서 감염된다. 아비안/인트라셀룰라레 복합체는 또한 건강한 사람에서 무증상 비-진행성 감염을 일으킨다. 주된 관심은 면역-억제된 사람 및 AIDS 환자에서 더 심각한 질병을 일으킬 수 있다는 것이다. 대부분의 국가에서는 도축시 목에서 병변이 발견되면 머리 전체를 폐기처분하고, 장으로부터 흘러드는 장간막 림프절에서 병변이 발견되면 잡육을 폐기처분한다. 드물지만, 보다 광범위하게 체내에 퍼져있으면, 도축물 전체를 폐기처분하거나 조리할 수 있다. 도축 검사관이 작은 병변을 놓치더라도, 일반적인 주방 요리법으로 상기 유기체가 파괴된다. 모든 돼지에서, 상기 감염은 목의 림프절 및 소장에서 흘러드는 림프절에 작은 결절을 일으킨다. 많은 대다수의 경우에 병변은 비-진행성이고, 전신으로 확산되지 않으며, 돼지에서 병을 일으키지 않고 배출되지 않는다. 임상 증상은 없으며, 감염돈과 비-감염돈 간에 행동의 차이는 없다.
돼지 수포성 발진 바이러스 (VES; virus of vesicular exanthema of swine)는 구제역 (FMD) 및 돼지 수포병 (SVD)을 일으키는 바이러스와는 상이하지만, 이는 돼지에서 임상적으로 FMD 및 SVD와 구별할 수 없는 질병을 일으킨다. FMD와 달리, 이는 돼지만 감염시킨다. 증상에는 낮은 사망률이 포함되지만, 일부 젖먹이 새끼돼지는 사망할 수 있다. 다른 증상에는 타액분비, 식욕부진, 및 주둥이, 코, 혀 및 발 주변의 수포가 포함된다.
수포성 구내염 (VS; Vesicular Stomatitis)은 주로 남아메리카 및 중앙아메리카에서 발생하고, 때때로 미국에서 발생하며, 캐나다와 같은 북부 및 아르헨티나와 같은 남부로 확산될 정도의 전염병이 아닌 질병을 일으킨다. VS 바이러스는 돼지에서 임상적으로 FMD, SVD 및 VES와 구별할 수 없는 질병을 일으킨다. 하지만, 돼지의 가장 빈번한 감염은 무증상이다. 모든 돼지에서, 감염은 침 흘림, 발 병변 및 파행, 성장률의 감소, 40 내지 41℃ (106 내지 107℉)로의 체온 상승, 코, 입술, 및 젖꼭지 및 발의 제관 주위에서 직경이 최대 30mm인 수포 (물집)의 출현 (돼지가 파행이 될 수 있음)이 특징이다. 사망률은 일반적으로 낮고, 대부분의 돼지는 1 내지 2주 내에 회복된다.
위축성 비염, 진행성 및 비-진행성 질병은 코의 염증을 일으키고, 다양한 세균 및 자극성 물질에 의해 발생할 수 있다. 감염이 진행되는 동안, 코의 정교한 구조물 또는 비개골이 손상되어 위축되거나 없어진다. 진행성 위축성 비염은 코 조직이 영구적으로 위축되는 특정 질병을 의미한다. 이는 독소를 생산하는 특정한 파스튜렐라 멀토시다 (PMt) 균주에 의해 발생한다. A형 및 D형의 두 종류가 있다. 젖먹이 돼지에서는, 재채기, 코막힘 및 콧물이 첫번째 증상이지만, 모계 항체가 거의 없는 급성 발병에서는, 코에서 출혈이 발생할 정도로 비염이 매우 심각할 수 있다. 3 내지 4주령까지 그리고 이유기부터는, 눈물 염색의 증거 및 비틀어짐 및 짧아짐과 관련된 코의 변형이 존재한다. 중증 감염된 돼지는 섭식 문제가 있을 수 있다. 일일 증체량이 상당히 감소된다. 심각한 발병의 경우, 돼지가 출하체중으로 성장하지 못할 수 있다.
동부 말 뇌척수염 바이러스 (EEEV; Eastern Equine Encephalomyelitis Virus)는 토가비리다에 (Togaviridae) 과, 알파바이러스 속의 일원이다. EEEV는 감염된 모기에 물리는 동안에 말 및 사람에게 전염될 수 있다. 말 및 사람 외에도, EEEV는 돼지 및 소와 같은 일반적인 가축 종에서 심각한 질병을 일으킬 수 있다. EEEV 또는 바이러스-특이적 항체는, 특히 칠면조, 꿩, 메추라기, 타조 및 에뮤 (emu)와 같은 조류로부터 회수되었다.
마이코플라즈마 관절염 (Mycoplasma arthritis)은 마이코플라즈마 히오시노비애 (Mycoplasma hyosynoviae) 감염에 의해 발생한다. 상기 관절염은 하나 이상의 관절의 염증이 특징이고, 모든 젖먹이 및 육성돈 및 암퇘지에서 일반적이다. 하지만, 새끼돼지에서는 드물다.
돼지에서 감염은 아데노바이러스(adenovirus) 및 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(hemagglutinating encephalomyelitis virus)에 의해서도 발생한다.
따라서, 당업계에서 필요한 것은 감염된 세포내로부터의 ORF2 단백질의 추출을 필요로 하지 않는 ORF2 단백질 수득 방법이다. 추가로 필요한 것은 백신 조성물을 효율적으로 제조하는데 충분한 양으로 재조합 ORF2 단백질을 수득하는 방법이다. 또한 추가로 필요한 것은 현재의 ORF2 단백질 추출 프로토콜에 의해 요구되는 복잡하고 노동 집약적인 방법을 필요로 하지 않는 ORF2 단백질 수득 방법이다. 마지막으로, 조성물과 관련하여, 당업계에서 필요한 것은 PCV2 감염에 대해 보호 면역성을 부여하고 이와 관련된 임상 징후의 중증도를 감소시키거나 이를 예방하는 면역원성 조성물이다.
발명의 요약
본 발명은 선행기술에 내재한 문제를 극복하고, 당업계의 기술 수준에서 분명한 진보를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 한가지 양상은 i) 배양물 중의 감수성 세포를 PCV2 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고 (여기서, ORF2 단백질은 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현됨), ii ) 이후에 상청액 중의 ORF2를 회수하여, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산하고/하거나 회수하는 개선된 방법을 제공한다. 세포내로부터 PCV2 ORF2를 추출하는 기존의 통상적인 PCV2 ORF2 회수 과정을 거쳐 감염 및 이후의 감염된 세포의 배양을 진행시키는 경우, 예상외로 ORF2가 상청액 속으로 대량으로 방출된다는 것이 발견되었다. 또한, 놀랍게도 PCV ORF2 단백질이 생산 세포 외부에서의 전형적인 분해에 대해 강력하다는 것이 밝혀졌다. 상기 두 결과는 모두, PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 감염된 세포 배양물의 상청액으로부터 대량의 PCV2 ORF2 단백질을 회수할 수 있게 한다. 대량의 PCV2 ORF2 단백질은 상청액 1ml 당 약 20㎍ 이상, 바람직하게는 약 25㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 40㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 50㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 60㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 80㎍/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 100㎍/ml 이상, 보다 더 바람직하게는 약 150㎍/ml 이상, 가장 바람직하게는 약 190㎍/ml 이상을 의미한다. 상기 발현율은, 예를 들면 실시예 1 내지 3에 기술된 방법으로 달성될 수도 있다.
바람직한 세포 배양물은 약 0.3 내지 2.0 x 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.9 x 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 x 106 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 x 106 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 x 106 세포/mL의 세포수를 갖는다. 바람직한 세포는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 세포는 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 적당한 재조합 바이러스 벡터로 감염시키기 쉬운 세포이다. 바람직하게는, 세포는 곤충세포이고, 보다 바람직하게는, 상표명 Sf+ 곤충 세포[판매원: Protein Sciences Corporation, Meriden, CT] 하에 시판되는 곤충 세포가 포함된다.
적당한 성장 배지도 당업자에 의해 결정될 수 있을 것이고, 바람직한 성장 배지는 Excell 420[판매원: JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS] 등과 같은 무혈청 곤충 세포 배지이다. 특히, 생산 세포가 곤충 세포인 경우, 바람직한 바이러스 벡터에는 BaculoGold [판매원: BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA]와 같은 배큘로바이러스가 포함된다. 배큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 본 발명의 목적, 즉 PCV2 ORF2를 세포 배양물의 상청액 속으로 발현시키는데 있어서 다른 발현 시스템도 가능할 것이라는 것을 당업자는 이해한다. 이러한 다른 발현 시스템은 배지 속으로 ORF2를 발현시키기 위하여 시그날 서열의 사용을 필요로 할 수 있다. ORF2를 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 생산하는 경우에는, ORF2를 배지 속으로 발현시키기 위한 어떠한 시그날 서열 또는 추가적인 변형도 요구되지 않는다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 상기 단백질은 독립적으로 바이러스-유사 입자를 형성하고[참조: Journal of General Virology Vol. 81, pp. 2281-2287 (2000)], 배양 상청액 속으로 분비될 수 있다고 생각된다. PCV2 ORF2 DNA 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터는, 감수성 세포를 감염시키는데 사용되는 경우, 바람직하게는 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0의 감염다중도 (MOI; Multiplicity Of Infection)를 갖는다. 바람직하게는, 상기한 MOI는 1ml의 세포 배양액에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원에서 기술된 방법은 PCV2 ORF2 DNA 서열을 함유하고 PCV2 ORF 단백질을 발현하며 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0의 MOI (감염다중도)를 갖는 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 0.35 내지 1.9 x 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 x 106 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 x 106 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 x 106 세포/mL를 감염시킴을 포함한다.
이어서, 감염된 세포를 최대 10일의 기간 동안, 보다 바람직하게는 약 2일 내지 약 10일, 보다 더 바람직하게는 약 4일 내지 약 9일, 및 가장 바람직하게는 약 5일 내지 약 8일의 기간 동안 배양한다. 바람직한 배양 조건은 약 22 내지 32℃, 보다 바람직하게는 약 24 내지 30℃, 보다 바람직하게는 약 25 내지 29℃, 보다 더 바람직하게는 약 26 내지 28℃, 및 가장 바람직하게는 약 27℃의 온도를 포함한다. 바람직하게는, 접종후 Sf+ 세포를 특징적인 배큘로바이러스-유도된 변화에 대해 관찰한다. 이러한 관찰은 감염후 기간 동안 세포 밀도 추세 및 생존율의 감소를 모니터함을 포함할 수 있다. 최고 바이러스 역가는 감염 3 내지 5일 후에 관찰되고, 세포로부터 상청액 속으로의 ORF2 방출은 5 내지 8일 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 최대라는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 한가지 양상은 i) 배양물 중의 많은 감수성 세포 (상기 참조)를 상기한 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, ii ) PCV2 ORF2 단백질을 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현시키고, iii ) 이후에, 감염 5 내지 8일 후 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 수득된 세포의 상청액 중에 PCV2 ORF2를 회수하여, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 상기의 양으로 생산하고/하거나 회수하는 개선된 방법을 제공한다. 바람직하게는, 재조합 바이러스 벡터는 PCV2 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 재조합 배큘로바이러스이고, 세포는 Sf+ 세포이다. 또한, 배양물을 감염후 기간 동안에 육안적 및 미시적 오염 증거 또는 세포 형태의 비정형 변화에 대해 주기적으로 검사하는 것이 바람직하다. 임의의 오염을 나타내는 임의의 배양물은 폐기하여야 한다. 바람직하게는, 발현된 ORF2 재조합 단백질은 세포 생존율을 유지시키는 주변의 성장 배지 속으로 세포에 의해 분비된다. 이어서, ORF2를 세포 자체로부터 회수하기보다는 세포 주변의 상청액 중에 회수한다.
회수 과정은 바람직하게는, 배지 중에 발현된 ORF2로부터 분리 단계를 통해 세포 잔해를 분리하는 것으로 시작한다. 바람직한 분리 단계는 여과, 최대 약 20,000 x g의 속도에서의 원심분리, 연속 유동 (continuous flow) 원심분리, 이온 교환 또는 겔 여과를 사용한 크로마토그래피 분리 및 통상적인 면역친화도 방법을 포함한다. 상기 방법은, 예를 들면 문헌[참조: Harris and Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995]에 의해 당업자에게 공지되어 있다. 가장 바람직한 분리 방법은 최대 약 20,000 x g의 속도에서의 원심분리 및 여과를 포함한다. 바람직한 여과 방법은 데드-엔드 정밀여과 (dead-end microfiltration) 및 중공사 (hollow fiber) 여과 데드-엔드 정밀여과를 포함하는 접선 유동 (tangential flow) (또는 횡류 (cross flow)) 여과를 포함한다. 그 중에서, 데드-엔드 정밀여과가 바람직하다. 데드-엔드 정밀여과의 경우 바람직한 공극 크기는 약 0.30 내지 1.35㎛, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.25㎛, 보다 더 바람직하게는 약 0.40 내지 1.10㎛, 및 가장 바람직하게는 약 0.45 내지 1.0㎛이다. 임의의 통상적인 여과막이 본 발명의 목적에 적당할 것이라고 생각되며, 폴리에테르설폰막이 바람직하다. 임의의 저중량 핵산 종류는 여과 단계 동안에 제거된다.
따라서, 본 발명의 한가지 추가적인 양상은 i) 배양물 중의 많은 감수성 세포 (상기 참조)를 상기한 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, ii ) PCV2 ORF2 단백질을 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현시키고, iii ) 감염 5 내지 8일 후 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 수득된 세포의 상청액 중에 PCV2 ORF2를 회수하고, iv ) 발현된 PCV2 ORF2로부터 분리 단계를 통해 세포 잔해를 분리하여, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 상기의 양으로 생산하고/하거나 회수하는 개선된 방법을 제공한다. 바람직하게는, 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 배큘로바이러스이고, 세포는 SF+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 상기한 단계이다. 공극 크기가 약 0.30 내지 1.35㎛, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.25㎛, 보다 더 바람직하게는 약 0.40 내지 1.10㎛, 및 가장 바람직하게는 약 0.45 내지 1.0㎛인 막을 사용한 데드-엔드 정밀여과가 가장 바람직하다.
백신과 같은 면역원성 또는 면역학적 조성물에 사용될 PCV2 ORF2의 회수에 있어서, 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 불활성화 단계를 포함시키는 것이 바람직하다. "면역원성 또는 면역학적 조성물"은 숙주에서 관심대상의 조성물 또는 백신에 대해 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 면역학적 반응을 유도하는 하나 이상의 항원을 포함하는 물질의 조성물을 말한다. 일반적으로, "면역학적 반응"에는 하나 이상의 다음의 효과가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 항원 또는 관심대상의 조성물 또는 백신에 포함된 항원에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 (helper) T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 yd T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 치료 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어, 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질병의 임상적 중증도가 감소될 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 증상의 감소 또는 부재, 보다 빠른 회복 시간 및/또는 감염된 숙주에서 감소된 바이러스 역가에 의해 증명될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 i) 배양물 중의 많은 감수성 세포 (상기 참조)를 상기한 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, ii) PCV2 ORF2 단백질을 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현시키고, iii) 감염 5 내지 8일 후 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 수득된 세포의 상청액 중에 PCV2 ORF2를 회수하고, iv) 발현된 PCV2 ORF2로부터 분리 단계를 통해 세포 잔해를 분리하고, v) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시켜, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 상기의 양으로 생산하고/하거나 회수하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 불활성화는 여과 단계 직전 또는 직후에 실시하고, 여과 단계 후에 불활성화시키는 것이 바람직하다. 임의의 통상적인 불활성화 방법이 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 불활성화는 화학적 및/또는 물리적 처리에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 형태에서는, 회수액의 용적을 측정하고, 온도를 약 32 내지 42℃, 보다 바람직하게는 약 34 내지 40℃, 및 가장 바람직하게는 약 35 내지 39℃로 한다. 바람직한 불활성화 방법에는 고리화된 2원 에틸렌이민 (BEI: Binary EthylenImine), 바람직하게는 농도가 약 1 내지 약 20mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 10mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8mM, 보다 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7mM, 및 가장 바람직하게는 약 5mM인 BEI의 첨가가 포함된다. 예를 들면, 불활성화에는 0.3N NaOH 중의 0.2M 2원 에틸렌이민 (BEI)으로 고리화된 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드의 용액, 바람직하게는 약 0.4M의 용액을 회수액에 첨가하여 최종 농도가 약 5mM BEI가 되게 하는 것이 포함된다. 바람직하게는, 이후에 회수액을 72 내지 96시간 동안 계속 교반하고, 불활성화된 회수액을 -40℃ 이하에서 냉동 보관하거나 약 1 내지 7℃에서 보관할 수 있다. 불활성화가 완료된 후, 나트륨 티오설페이트 용액, 바람직하게는 1.0M의 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다. 바람직하게는, 불활성화를 위하여 앞서 첨가된 BEI와 비교하여, 나트륨 티오설페이트를 등량으로 첨가한다. 예를 들면, BEI가 5mM의 최종 농도로 첨가된 경우, 1.0M 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 최소 농도가 5mM이 되게 하여 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다.
따라서, 본 발명의 한가지 추가적인 양상은 i) 배양물 중의 많은 감수성 세포 (상기 참조)를 상기한 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, ii ) PCV2 ORF2 단백질을 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현시키고, iii ) 감염 5 내지 8일 후 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 수득된 세포의 상청액 중에 PCV2 ORF2를 회수하고, iv ) 발현된 PCV2 ORF2로부터 분리 단계를 통해 세포 잔해를 분리하고, v) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시켜, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 상기의 양으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 배큘로바이러스이고, 세포는 SF+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 상기한 단계이고, 여과 단계가 가장 바람직하다. 바람직한 불활성화 단계는 상기한 단계이다. 바람직하게는, 불활성화는 약 35 내지 39℃에서, 2 내지 8mM BEI, 보다 바람직하게는 약 5mM BEI의 존재 하에서 수행한다. 놀랍게도, 높은 농도의 BEI는 PCV2 ORF2 단백질에 부정적인 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 한가지 추가적인 양상에 있어서, 상기한 방법은 v) 단계 이후에 중화 단계도 포함한다. 이 vi ) 단계는 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등량의 제제를 첨가함을 포함한다. 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트를 등량으로 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 추가적인 양상에 있어서, vi ) 단계는 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 1 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8mM, 보다 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7mM, 가장 바람직하게는 약 5mM이 되게 함을 포함한다.
바람직한 형태에서, 및 특히 재조합 PCV2 ORF2 단백질이 백신과 같은 면역원성 조성물에 사용될 형태에서는, 회수된 각각의 ORF2를 부착 의존성 (anchorage dependent) 배큘로바이러스 감수성 Sf+ 세포에서 계대하여 불활성화에 대해 검사할 것이다. 상기 검사의 바람직한 형태에서는, 150cm2의 적당한 세포 배양 단층을 1.0ml의 불활성화된 PCV2 회수액으로 접종시키고, 25 내지 29℃로 유지시키면서 14일 동안 2회 이상 계대한다. 유지 기간 종료시, 세포 단층을 PCV2 ORF2 배큘로바이러스의 특징적인 세포변성 효과 (CPE)에 대해 검사한다. 바람직하게는, 양성 바이러스 대조군도 사용한다. 이러한 대조군은 비-불활성화된 참조 PCV2 ORF2 배큘로바이러스로 접종된 Sf+ 세포의 하나의 배양물 및 비-접종된 상태를 유지하는 Sf+ 세포의 하나의 플라스크로 이루어질 수 있다. 접종 및 계대 후, BEI 처리된 바이러스 액 중에 바이러스-감염된 세포가 부재하면 만족스러운 불활성화 검사가 될 것이다. 참조 바이러스로 접종된 대조군 세포는 PCV2 ORF2 배큘로바이러스의 특징적인 CPE를 나타낼 것이고, 비-접종된 플라스크는 PCV2 ORF2 배큘로바이러스 CPE의 어떤 증거도 나타내지 않을 것이다. 대안으로, 유지 기간 종료시, 상청액 샘플을 수거하여, Sf+ 세포로 로딩된 (loaded) Sf+ 96 웰 플레이트 상에 접종하고 나서, 25 내지 29℃에서 5 내지 6일 동안 유지시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 고정시키고 FITC에 접합된 항-PCV2 ORF2 항체로 염색한다. IFA 현미경법으로 검출하여, IBE 처리된 바이러스 액 중에 CPE 및 ORF2 발현이 부재하면, 만족스러운 불활성화 검사가 된다. 참조 바이러스로 접종된 대조군 세포는 CPE 및 IFA 활성을 나타낼 것이고, 비-접종된 플라스크는 PCV2 ORF2 배큘로바이러스 CPE의 어떠한 증거도 나타내지 않을 것이고 IFA 활성을 함유하지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상은 i) 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 배양액의 적어도 일부분을 바람직하게는 상기한 불활성화제와 접촉시키는 단계, ii ) 중화제를 첨가하여 바람직하게는 상기한 불활성화제를 중화시키는 단계, 및 iii ) 상기한 검정으로 잔류 감염성을 측정하는 단계를 포함하여, 재조합 바이러스 벡터의 불활성화의 유효성을 측정하기 위한 불활성화 검사에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양상은 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 감수성 세포 속으로 감염시키는 경우에 PCV2 ORF2 단백질을 많은 양으로 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 제공된 재조합 바이러스 벡터는 감수성 세포를 감염시킨 후 PCV2 ORF2를 상기한 바와 같이 많은 양으로 발현한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명은 또한 PCV2 ORF2 단백질을 생산하고/하거나 회수하는 개선된 방법, 바람직하게는 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 재조합 배큘로바이러스이다. PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 본원에서 제공된 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법을 아래에 상세히 기술한다: 바람직한 형태에서 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하면서 세포를 감염시키는데 사용되는 재조합 바이러스 벡터는 클로닝된 ORF2 유전자를 갖는 전달 벡터를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜 생성시킨다. 바람직하게는, ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터의 일부만을 바이러스 벡터 속으로 형질감염시킨다. "바이러스 벡터 속으로 형질감염시킨다"라는 용어는 이종 DNA를 바이러스 벡터 (예: 배큘로바이러스 벡터) 속으로 "도입" 또는 "클로닝"한다는 것을 의미하고 이와 동일한 의미로 사용된다. 바이러스 벡터는 바람직하게는 배큘로바이러스이지만, 반드시 그런 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 이종 PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터와 바이러스 벡터, 바람직하게는 배큘로바이러스, 보다 바람직하게는 선형화된 복제-결핍 배큘로바이러스 (예: Baculo Gold DNA) 사이의 재조합에 의해 생성된다. "전달 벡터"는 하나 이상의 복제 오리진 (origin of replication), 이종 유전자 (이 경우에는 PCV2 ORF2) 및 상기 이종 유전자를 바이러스 벡터 속으로 클로닝할 수 있게 하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 바람직하게는, 이종 유전자를 바이러스 벡터 속으로 클로닝할 수 있게 하는 서열은 이종 유전자를 플랭킹 (flanking)한다. 보다 바람직하게는, 상기 플랭킹 서열은 바이러스 벡터의 서열과 적어도 부분적으로 상동이다. 서열 상동성은 두 분자, 즉 바이러스 벡터 및 전달 벡터의 재조합을 가능하게 하여, 상동 유전자를 함유하는 재조합 바이러스 벡터가 생성되게 한다. 한가지 바람직한 전달 벡터는 BaculoGold DNA와 함께 바람직한 Sf+ 세포주 속으로 공동-형질감염시키기 위하여 설계된 pVL1392 벡터[판매원: BD Biosciences Pharmingen]이다. 바람직하게는, 상기 전달 벡터는 PCV2 ORF2 DNA를 포함한다. 공동-형질감염된 작제물의 길이는 대략 10,387 염기쌍이다.
보다 바람직한 형태에서, 본 발명의 방법은 PCV2 ORF2 DNA의 분리로 시작할 것이다. 일반적으로, 이는 공지되거나 미공지된 바이러스주 유래의 것일 수 있는데, 그 이유는 ORF2 DNA는 상이한 분리주 간의 약 95% 이상의 서열 동일성으로 고도로 보존되어 있는 것 같기 때문이다. 당업계에 공지된 임의의 PCV2 ORF2 유전자는 각각 상청액 속으로 발현될 것이므로 본 발명에 사용될 수 있다. PCV ORF2 DNA는 바람직하게는 PCR 방법을 사용하여 증폭시키고, 보다 바람직하게는 5' 플랭킹 코작 컨센서스 (Kozak's consensus) 서열 (CCGCCAUG) (서열번호 1) 및/또는 3' 플랭킹 EcoR1 부위 (GAATTC) (서열번호 2)의 도입과 함께 증폭시킨다. 이러한 5' 코작 컨센서스의 도입은 바람직하게는 PCV2 ORF2의 천연 개시 코돈 AUG를 제거시킨다. 3' EcoR1 부위는 바람직하게는 PCV2 ORF2의 종결 코돈의 하류에 도입된다. 보다 바람직하게는, 이는 PCV2 ORF2 종결 코돈의 하류에 위치하는 폴리 A 전사 종결 서열의 하류에 도입된다. 코작 컨센서스 서열, 특히 상기한 코작 컨센서스 서열을 사용하면 이후의 PCV2 ORF2 단백질의 발현 수준이 증가된다는 것이 밝혀졌다. 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 이러한 추가적인 서열과 함께 벡터 속으로 클로닝한다. 상기 초기 클로닝 단계에 바람직한 벡터는 pGEM-T-Easy Vector [판매원: Promega, Madison, WI]이다. 일부 pGEM 벡터 서열 (서열번호 7)을 포함하는 PCV2 ORF2 DNA는 바람직하게는 Not1 제한 부위에서 벡터로부터 절단시킨다. 이어서, 생성된 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝한다.
따라서, 본 발명의 한가지 양상에서, PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 i) 재조합 PCV2 ORF2를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; 및 ii ) 재조합 PCV2 ORF2를 함유하는 전달 벡터의 일부를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜, 재조합 바이러스 벡터를 생성시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 전달 벡터는 상기한 전달 벡터이거나, 상기한 바와 같이 또는 도 1에 예시적으로 제시된 바와 같이 작제된다. 따라서, 추가의 양상에 있어서, 본원에서 기술된 재조합 바이러스 벡터의 작제에 사용되는 전달 벡터는 서열번호 7의 서열을 함유한다.
추가의 양상에 있어서, 상기 방법은 i) 단계 전에 다음의 단계를 추가로 포함한다: PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 상기한 바와 같이 변형된다). PCV2 ORF2 DNA를 증폭시키고 플랭킹 서열을 변형시키는 시험관내 방법, 시험관내에서 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 방법 및 적당한 전달 벡터는 위에 기술되어 있고, 도 1에 예시적으로 제시되어 있거나, 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 추가의 양상에 있어서, 본 발명은 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, 상기 PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 변형된다); ii ) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; 및 iii ) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터 또는 이의 일부를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜, 재조합 바이러스 벡터를 생성시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열의 변형은 상기한 바와 같이, 예를 들면, 바람직하게는 상기한 5' 코작 서열 및/또는 EcoR 1 부위를 도입시키는 방법으로 수행한다.
추가의 양상에 있어서, PCV2의 개방 판독 프레임 2에 의해 발현되는 재조합 단백질을 생산하고/하거나 회수하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 일반적으로 i) 재조합 PCV2 ORF2를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; ii ) 재조합 PCV2 ORF2를 함유하는 전달 벡터의 일부를 바이러스 속으로 형질감염시키는 단계; iii ) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계; iv ) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; v) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 vi ) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계를 포함한다.
재조합 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 방법은 위에 기술되어 있다. 바람직하게는, 전달 벡터는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 7의 서열을 함유한다. 하지만, 전달 벡터는, 재조합 바이러스 벡터 속으로 형질감염되는 경우, PCV2 ORF2 DNA가 세포 배양물 중에 발현되는 한, 비-변형되거나 변형된 임의의 PCV2 ORF2 DNA를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 바이러스 벡터는 서열번호 8의 서열을 포함한다. 또한, 세포를 감염시키는 방법, 바람직하게는 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 일정한 수의 재조합 배큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 방법은 위에 상세히 기술되어 있다. 또한, 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계 및 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 회수하는 단계도 위에 상세히 기술되어 있다. 본원에서 기술된 임의의 이러한 특정한 단계는 상기한 바와 같이 PCV2의 개방 판독 프레임 2에 의해 발현된 재조합 단백질을 생산하고/하거나 회수하는 방법의 일부이다. 바람직하게는, 세포는 SF+ 세포이다. 보다 바람직하게는, 세포 배양물은 약 0.3 내지 2.0 x 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.9 x 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 x 106 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 x 106 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 x 106 세포/mL의 세포수를 갖는다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 재조합 바이러스 벡터는, 감수성 세포를 감염시키는데 사용되는 경우, 바람직하게는 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 보다 더 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0, 및 가장 바람직하게는 약 0.5의 감염다중도 (MOI)를 갖는다. 바람직하게는, 감염 5 내지 8일 후 및/또는 세포 생존율이 10% 미만으로 감소될 때 수득된 세포의 상청액 중의 PCV2 ORF2 단백질을 회수한다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 단백질을 생산하기 위하여, 세포를 25 내지 29℃에서 배양한다. 바람직하게는, 분리 단계는 원심분리 또는 여과 단계이다.
임의로, 상기 방법은 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하기 전에 PCV2 ORF2 DNA를 PCV2의 바이러스주로부터 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 형태에서, 5' 코작 서열, 3' EcoR1 부위 및 이의 조합을, 증폭된 서열에, 바람직하게는 증폭 전 또는 증폭 동안에 부가할 수도 있다. 바람직한 5' 코작 서열은 서열번호 1을 포함한다. 바람직한 3' EcoR1 부위는 서열번호 2를 포함한다. 바람직한 PCV2 ORF2 DNA는 뉴클레오티드 서열 Genbank 등록번호 AF086834 (서열번호 3) 및 서열번호 4를 포함한다. 바람직한 재조합 PCV2 ORF2 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열 (이는 서열번호 3 (Genbank 등록번호 AF086834)에 의해 암호화되는 단백질이다) 및 서열번호 6의 아미노산 서열 (이는 서열번호 4에 의해 암호화되는 단백질이다)을 포함한다. 바람직한 배지는 무혈청 곤충 세포 배지이고, 보다 바람직하게는 Excell 420 배지이다. 임의의 증폭 단계를 수행하는 경우, 증폭된 개방 판독 프레임 2를 제1 벡터 속으로 우선 클로닝하여, 개방 판독 프레임 2를 제1 벡터로부터 절단하고, 절단된 개방 판독 프레임을 전달 벡터 속으로 클로닝하는데 사용하는 것이 바람직하다. 공동-형질감염에 바람직한 세포주는 SF+ 세포주이다. 공동-형질감염에 바람직한 바이러스는 배큘로바이러스이다. 상기 방법의 바람직한 형태에서, 전달 벡터의 형질감염된 부분은 서열번호 8을 포함한다. 마지막으로, 상기 방법에 있어서, 세포를 바이러스로 감염시키고 5일 이상 후에 세포 배양 상청액 중의 PCV2 개방 판독 프레임 2 (ORF2) 단백질을 회수하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상은 PCV2 개방 판독 프레임 2를 생산하고/하거나 회수하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 i) 바람직하게는 5' 코작 서열을 부가하고/하거나 3' EcoR1 제한 부위를 부가하여, PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계; ii ) 증폭된 PCV2 ORF2를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; iii ) 재조합 PCV2 ORF2를 함유하는 전달 벡터의 일부분을 바이러스 속으로 형질감염시키는 단계; iv ) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; vi ) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 vii ) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양상은 PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 i) 증폭된 PCV2 ORF2를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; ii ) 재조합 PCV2 ORF2를 함유하는 전달 벡터의 일부를 바이러스 속으로 형질감염시키는 단계; iii ) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스 벡터로 감염시키는 단계; iv ) 감염된 바이러스 벡터가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; v) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; vi ) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계; 및 vii ) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 배큘로바이러스이고, 세포는 SF+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 상기한 단계이고, 여과 단계가 가장 바람직하다. 바람직한 불활성화 단계는 상기한 단계이다. 바람직하게는, 불활성화는 약 35 내지 39℃에서 2 내지 8mM의 BEI의 존재 하에서, 보다 바람직하게는 약 5mM의 BEI의 존재 하에서 수행한다. 높은 농도의 BEI는 PCV2 ORF2 단백질에 부정적인 영향을 미치고, 낮은 농도는 불활성화 24 내지 72시간 이내에 바이러스 벡터를 불활성화시키는데 효과적이지 않다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 바람직하게는, 불활성화는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 수행한다.
추가의 양상에 있어서, 상기한 바와 같이 PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 vii ) 단계 이후에 중화 단계도 포함한다. 이 viii ) 단계는 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등량의 제제를 첨가함을 포함한다. 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트를 등량으로 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 추가의 양상에 있어서, viii) 단계는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 1 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8mM, 보다 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7mM, 가장 바람직하게는 약 5mM이 되게 함을 포함한다.
추가의 양상에 있어서, 상기한 바와 같이 PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 i) 단계 이전에 다음의 단계를 포함한다: PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 상기한 바와 같이 변형된다). PCV2 ORF2 DNA를 증폭시키고 플랭킹 서열을 변형시키는 시험관내 방법, 시험관내에서 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 방법 및 적당한 전달 벡터는 위에 기술되어 있고, 도 1에 예시적으로 제시되어 있거나, 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 추가의 양상에 있어서, 상기 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, 상기 PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 변형된다); ii ) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; 및 iii ) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터 또는 이의 일부를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜, 재조합 바이러스 벡터를 생성시키는 단계; iv ) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; vi ) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; vii ) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계; viii ) 재조합 바이러스 벡터를, 바람직하게는 약 1 내지 약 20mM의 BEI의 존재 하에서, 가장 바람직하게는 약 5mM의 BEI의 존재 하에서 불활성화시키는 단계; 및 ix ) 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등량의 제제를 첨가하는 단계, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 1 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 5mM이 되게 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, PCV2에 대한 면역 반응을 유발시키기 위한 조성물, 바람직하게는 항원성 조성물 (예: 백신)을 제조하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은 i) PCV2의 ORF2로부터의 재조합 DNA를 포함하는 작제물을 바이러스 속으로 형질감염시키는 단계, ii) 성장 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계, iii) 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계, iv) 발현된 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계, 및 v) 회수된 단백질을 적당한 애주번트 및/또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 "애주번트"에는 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21 [판매원: Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA], GPI-0100 [판매원: Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL], 유중수형 에멀젼, 수중유형 에멀젼, 수중유중수형 에멀젼이 포함될 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 유동 파라핀 오일 (light liquid paraffin oil) (유럽약전형); 이소프레노이드 오일, 예를 들면, 알켄, 특히 이소부텐 또는 데켄의 소중합체화로부터 생성된 스쿠알렌 또는 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 그룹을 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기제로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히 임의로 에톡실화된 소르비탄, 만나이드 (예: 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 플루로닉 (Pluronic) 제품, 특히 L121이다[참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) 및 Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)].
예를 들면, 문헌[참조: "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147 페이지에 기술된 SPT 에멀젼 및 상기 문헌의 183 페이지에 기술된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다.
애주번트의 추가적인 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이 있다. 유리한 애주번트 화합물은, 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 상기 화합물은 카보머 (carbomer)라는 용어로 공지되어 있다[참조: Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]. 당업자는 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖고, 3개 이상의 하이드록실의 수소 원자가 2개 이상의 탄소 원자를 갖는 불포화된 지방족 라디칼로 치환된 폴리하이드록실화된 화합물과 가교결합된 이러한 아크릴성 중합체가 기술되어 있는 미국특허 제2,909,462호를 참조할 수도 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌성 불포화 그룹이다. 불포화 라디칼은 자체에 메틸과 같은 다른 치환기를 함유할 수 있다. 카보폴 (Carbopol)이라는 명칭 하에 시판되는 제품[판매원: BF Goodrich, Ohio, USA]이 특히 적당하다. 이들은 알릴 수크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합되어 있다. 이 중에서, 카보폴 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. 카보폴 971P를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 말레산무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서, 공중합체 EMA[판매원: Monsanto]는 말레산무수물과 에틸렌의 공중합체이다. 이러한 중합체를 물에 용해시키면 산 용액이 되고, 이를 중화시켜, 바람직하게는 생리학적 pH로 중화시켜, 애주번트 용액을 만들어, 이 속에 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체를 혼입시킬 것이다.
추가적인 적당한 애주번트에는, 특히 RIBI 애주번트 시스템[판매원: Ribi Inc.], 블록 공중합체[판매원: CytRx, Atlanta GA], SAF-M[판매원: Chiron, Emeryville CA], 모노포스포릴 리피드 A, 아브리딘 (Avridine) 리피드-아민 애주번트, 이.콜라이로부터의 열-불안정성 장독소 (재조합체 등), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 애주번트는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 애주번트는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 애주번트는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는, 애주번트는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는, 애주번트는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가된다.
따라서, 추가의 양상에 있어서, PCV2에 대한 면역 반응을 유발시키기 위한 항원성 조성물 (예: 백신)을 제조하는 방법은 i) PCV2 ORF2 단백질을 제조하여 회수하고, ii) 이를 적당한 애주번트와 혼합함을 포함한다. 바람직하게는, 애주번트는 카보폴 971P이다. 보다 바람직하게는, 카보폴 971P는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로, 보다 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로, 및 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가된다. 바람직하게는, 상기 i) 단계는 PCV2 ORF2의 제조 및 회수에 대해 기술된 바와 같은 단계를 포함한다. 예를 들면, 상기 방법의 바람직한 형태에서, PCV2 ORF2 DNA를 포함하는 작제물을 전달 벡터 내에 수득한다. 적당한 전달 벡터 및 이를 제조하는 방법은 위에 기술되어 있다. 임의로, 상기 방법은 ORF2를 전달 벡터 속으로 클로닝하기 전에 ORF2를 PCV2의 바이러스주로부터 PCR을 통해 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 개방 판독 프레임 서열, 코작 서열, 3' EcoR1 부위 서열, 재조합 단백질 서열, 형질감염된 작제물 서열, 배지, 세포 및 바이러스는 이전의 방법에 기술된 바와 같다. 상기 방법에 대한 다른 임의의 단계에는 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 제1 벡터 속으로 클로닝하고, ORF2 DNA를 상기 제1 벡터로부터 절단하고, 상기 절단된 PCV2 ORF2 DNA를 사용하여 전달 벡터 속으로 클로닝함이 포함된다. 다른 방법과 마찬가지로, 재조합 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하기 전에 형질감염된 배큘로바이러스로 세포를 감염시킨 후 5일 이상 기다리는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 방법의 회수 단계는 배지를 세포 및 세포 잔해로부터 분리하는 단계도 포함한다. 이는 다양한 방법으로 수행할 수 있지만, 용이함과 편리함을 위하여, 세포, 세포 잔해 및 성장 배지를 공극의 크기가 약 0.45㎛ 내지 약 1.0㎛인 필터를 통해 여과시키는 것이 바람직하다. 마지막으로, 상기 방법에 있어서, 조성물 중의 회수된 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 배합하기 전에 바이러스 불활성화 단계를 포함시키는 것이 바람직하다. 이는 다양한 방법으로 수행할 수 있지만, 본 발명의 실시에서는 BEI를 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 추가의 양상에 있어서, 상기 방법은 i)　PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, 상기 PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 변형된다); ii ) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; 및 iii ) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터 또는 이의 일부를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜, 재조합 바이러스 벡터를 생성시키는 단계; iv ) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; vi ) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; vii ) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계; viii ) 재조합 바이러스 벡터를, 바람직하게는 약 1 내지 약 20mM BEI의 존재 하에서, 가장 바람직하게는 약 5mM BEI의 존재 하에서 불활성화시키는 단계; ix ) 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등량의 제제를 첨가하는 단계, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 1 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 5mM이 되게 하는 단계; 및 x) 적당량의 애주번트, 바람직하게는 카보폴, 보다 바람직하게는 카보폴 971P를, 보다 바람직하게는 상기한 양으로 (예: 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg, 보다 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로, 및 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로) 첨가하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정화제, 희석제, 보존제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함된다. 가장 바람직하게는, 본원에서 제공되는 조성물은 시험관내에서 배양된 세포의 상청액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하고, 이때 상기 세포는 PCV2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 형질감염되었고, 이때 상기 세포 배양물은 약 2 내지 약 8mM의 BEI, 바람직하게는 약 5mM의 BEI로 처리되어 바이러스 벡터를 불활성화시켰고, 등가 농도의 중화제, 바람직하게는 나트륨 티오설페이트 용액으로 처리되어 최종 농도가 약 2 내지 약 8mM, 바람직하게는 약 5mM이 되게 하였고, 카보폴, 보다 바람직하게는 카보폴 971P를, 바람직하게는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로, 보다 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로, 및 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로 처리하였고, 생리 식염수를 바람직하게는 약 50 내지 약 90% (v/v), 보다 바람직하게는 약 60 내지 80% (v/v), 보다 더 바람직하게는 약 70% (v/v)의 양으로 처리하였다.
따라서, 추가의 양상은 PCV2에 대한 면역 반응을 유발시키기 위한 항원성 조성물 (예: 백신)을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 i)　PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭시키는 단계 (여기서, 상기 PCV2 ORF2 DNA의 플랭킹 서열은 변형된다); ii) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 속으로 클로닝하는 단계; 및 iii) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 함유하는 전달 벡터 또는 이의 일부를 바이러스 벡터 속으로 형질감염시켜, 재조합 바이러스 벡터를 생성시키는 단계; iv) 배지 중의 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키는 단계; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하게 하는 단계; vi) 세포를 상청액으로부터 분리하는 단계; vii) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계; viii) 재조합 바이러스 벡터를, 바람직하게는 약 2 내지 약 20mM의 BEI의 존재 하에서, 가장 바람직하게는 약 5mM의 BEI의 존재 하에서 불활성화시키는 단계; ix) 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등량의 제제를 첨가하는 단계, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 최종 농도가 약 0.5 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 5mM이 되게 하는 단계; x) 적당량의 애주번트, 바람직하게는 카보폴, 보다 바람직하게는 카보폴 971P를, 보다 바람직하게는 상기한 양으로 (예: 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg, 보다 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로, 및 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로) 첨가하는 단계; 및 xi) 생리 식염수를, 바람직하게는 약 50 내지 약 90% (v/v), 보다 바람직하게는 약 60 내지 80% (v/v), 보다 더 바람직하게는 약 70% (v/v)의 양으로 첨가하는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 보호제의 첨가를 포함할 수도 있다. 본원에서 사용되는 보호제는, 예를 들면 젠타마이신 (Gentamycin), 메르티올레이트 (Merthiolate) 등과 같은 항-미생물 활성제를 말한다. 특히, 보호제를 첨가하는 것은 다중 용량 조성물을 제조하는데 가장 바람직하다. 이러한 항-미생물 활성제는 관심대상의 조성물을 임의의 미생물 오염으로부터 보호하거나 관심대상의 조성물 내의 임의의 미생물 성장을 억제하는데 효과적인 농도로 첨가된다.
또한, 상기 방법은 당류, 트레할로스, 만니톨, 사카로스 등과 같은 임의의 안정화제를 첨가하여, 제품의 저장수명을 증가시키고/시키거나 유지함을 포함할 수도 있다. 하지만, 생성된 제형은 임의의 추가적인 안정화제를 첨가하지 않아도 24개월 이상의 기간 동안 면역학적으로 유효하다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
본 발명의 추가의 양상은 상기한 방법으로부터 생성되는 산물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합적으로 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합적으로 발현되어 곤충 세포 배양물의 상청액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합적으로 발현되어 곤충 세포 배양물의 상청액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 물질의 조성물은 바이러스 벡터를 불활성화시키는데 적당한 제제도 포함한다. 바람직하게는, 상기 불활성화제는 BEI이다. 또한, 본 발명은 재조합적으로 발현되어 곤충 세포 배양물의 상청액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하고, 바이러스 벡터를 불활성화시키는데 적당한 제제, 바람직하게는 BEI, 및 불활성화제를 중화시키기 위한 중화제를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, BEI가 불활성화제로서 사용되는 경우, 상기 중화제는 나트륨 티오설페이트이다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 면역 반응을 유도하고, 보다 바람직하게는, PCV2 감염의 임상 징후에 대해 보호 면역성을 부여하는 면역원성 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 일반적으로 조성물의 항원성 성분으로서 PCV2의 개방 판독 프레임 2 (ORF2)에 의해 발현된 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다.
조성물의 제조를 위하여 본원에서 사용되고 또한 본원에서 제공된 방법 내에서 사용되는 PCV2 ORF2 DNA 및 단백질은 PCV2 분리주 내의 고도로 보존된 도메인이고, 따라서 임의의 PCV2 ORF2는 본원에서 사용되는 PCV ORF2 DNA 및/또는 폴리펩티드의 공급원으로서 유효할 것이다. 바람직한 PCV2 ORF2 단백질은 서열번호 11의 단백질이다. 바람직한 PCV ORF2 폴리펩티드는 본원에서 서열번호 5로서 제공되지만, 당업자는 상기 서열이 서열 동일성에서 6 내지 10% 만큼 달라질 수 있고, 면역원성 조성물에서 유용한 항원성 특징을 여전히 유지할 수 있다는 것을 이해한다. 면역학적 조성물의 항원성 특징은, 예를 들면, 실시예 4에 제시된 바와 같은 시험감염 (challenge) 실험에 의해 평가될 수 있다. 또한, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2 단백질과 비교하여, 변형된 항원이 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%의 보호 면역성을 부여하는 경우, 변형된 항원의 항원성 특징은 여전히 유지된다. 본원에서 사용되는 "면역원성 조성물"은 숙주에서 PCV2 ORF2 단백질에 대해 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 "면역학적 반응"을 유도하는 PCV2 ORF2 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은 PCV2 감염 및 이와 관련된 임상 징후에 대해 보호 면역성을 부여할 수 있다. 일부 형태에서, PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 부분은 조성물에서 항원성 성분으로서 사용된다. 본원에서 사용되는 "면역원성 부분"이라는 용어는 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드 각각의 절두된 (truncated) 및/또는 치환된 형태 또는 단편을 말한다. 바람직하게는, 이러한 절두된 및/또는 치환된 형태 또는 단편은 전체-길이 ORF2 폴리펩티드로부터의 6개 이상의 연속적인 아미노산을 포함할 것이다. 보다 바람직하게는, 절두되거나 치환된 형태 또는 단편은 전체-길이 ORF2 폴리펩티드로부터의 10개 이상, 보다 바람직하게는 15개 이상, 및 보다 더 바람직하게는 19개 이상의 연속적인 아미노산을 가질 것이다. 이러한 점에서 2개의 바람직한 서열을 본원에서 서열번호 9 및 10으로 제공한다. 이러한 서열은 큰 단편의 일부이거나 절두된 형태일 수 있다는 것을 또한 이해하여야 한다. 본원에서 제공된 보다 바람직한 PCV2 ORF2 폴리펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 그러나, 당업자는 상기 서열이 서열 동일성에서 6 내지 20% 만큼 달라질 수 있고, 면역원성 조성물에서 유용한 항원성 특징을 여전히 유지할 수 있다는 것을 이해한다. 일부 형태에서, ORF2의 절두되거나 치환된 형태 또는 단편이 조성물에서 항원성 성분으로서 사용된다. 바람직하게는, 이러한 절두되거나 치환된 형태 또는 단편은, 예를 들면, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 전체-길이 ORF2 뉴클레오티드 서열로부터의 18개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 보다 바람직하게는, 절두되거나 치환된 형태 또는 단편은, 예를 들면, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 전체-길이 ORF2 뉴클레오티드 서열로부터의 30개 이상, 보다 바람직하게는 45개 이상, 및 보다 더 바람직하게는 57개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 가질 것이다.
당업계에 공지된 바와 같이 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계, 즉 참조 서열 및 참조 서열과 비교할 주어진 서열 간의 관계를 말한다. 서열 동일성은, 서열을 최적으로 정렬시켜 이러한 서열의 간의 매치 (match)에 의해 판정되는 가장 높은 정도의 서열 유사성을 얻은 후, 주어진 서열을 참조 서열에 대해 비교하여 판정된다. 이러한 정렬시, 서열 동일성은 각각의 위치를 기준으로 확인된다 (예: 특정 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일하면 그 위치에서 서열은 "동일하다"). 이어서, 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열 내의 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 수로 나누어, % 서열 동일성을 계산한다. 서열 동일성은 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) (이의 설명은 본원에 참조로서 인용됨)]에 기술된 방법을 포함하는 비제한적인 공지된 방법에 의해 쉽게 계산할 수 있다. 서열 동일성을 계산하는 바람직한 방법은 검사되는 서열 간의 매치가 최대가 되도록 설계되어 있다. 서열 동일성을 계산하는 방법은 주어진 서열 간의 서열 동일성을 계산하는 공개적으로 구할 수 있는 컴퓨터 프로그램에 체계화되어 있다. 이러한 프로그램의 예에는 GCG 프로그램 패키지[참조: Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 FASTA [참조: Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)]가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원으로부터 공개적으로 구할 수 있다[참조: BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990) (이의 설명은 본원에 참조로서 인용됨)]. 이러한 프로그램은 디폴트 갭 가중치 (default gap weight)를 사용하여 서열을 최적으로 정렬시켜, 주어진 서열과 참조 서열 간의 서열 동일성이 가장 높은 수준이 되게 한다. 예로서, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 주어진 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 15개, 바람직하게는 최대 10개, 보다 바람직하게는 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 주어진 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 참조 서열 내의 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5%의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열 내의 총 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5% 정도의 뉴클레오티드가 참조 서열 속으로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이러한 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에 존재하거나 이러한 말단 위치 사이의 어느 위치에서든지 존재할 수 있고, 참조 서열 내의 뉴클레오티드 가운데 개별적으로 산재되어 있거나 참조 서열 내에서 하나 이상의 연속적인 그룹으로 존재할 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 주어진 폴리펩티드 서열이 참조 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산 당 최대 15개, 바람직하게는 최대 10개, 보다 바람직하게는 최대 5개의 아미노산 변화를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리펩티드의 주어진 아미노산 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 말하면, 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩티드 서열을 얻기 위하여, 참조 서열 내의 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5%의 아미노산 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환할 수 있고, 또는 참조 서열 내의 아미노산 잔기의 총 수의 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5% 정도의 아미노산을 참조 서열 속으로 삽입시킬 수 있다. 참조 서열의 이러한 변화는 참조 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카복시 말단 위치에 존재하거나 이러한 말단 위치 사이의 어느 위치에서든지 존재할 수 있고, 참조 서열 내의 잔기 가운데 개별적으로 산재되어 있거나 참조 서열 내에서 하나 이상의 연속적인 그룹으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 하지만, 보존적 치환은 서열 동일성을 계산하는 경우에는 매치로서 포함되지 않는다.
본원에서 사용되는 "서열 상동성"은 두 서열의 관련성을 계산하는 방법을 말한다. 서열 상동성을 계산하기 위하여, 2개 이상의 서열을 최적으로 정렬시키고, 필요에 따라 갭을 도입시킨다. 하지만, "서열 동일성"과는 대조적으로, 서열 상동성을 계산하는 경우에는 보존적 아미노산 치환이 매치로서 계산된다. 달리 말하면, 참조 서열에 대해 95%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 참조 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 85%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%가 매치하거나 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드로의 보존적 치환을 포함해야 하고, 또는 참조 서열 내의 전체 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5% 정도의 아미노산 또는 뉴클레오티드 (보존적 치환은 포함되지 않음)를 참조 서열 속으로 삽입시킬 수 있다. 바람직하게는, 상동 서열은 50개 이상, 보다 바람직하게는 100개 이상, 보다 바람직하게는 250개 이상, 보다 더 바람직하게는 500개 이상의 일련의 뉴클레오티드를 포함한다.
"보존적 치환"은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 유사한 특징 또는 특성 (예: 크기, 소수성 등)을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 치환되어 전체적인 기능성이 상당히 변화하지 않는 것을 말한다.
"분리된"은 자연적인 상태로부터 "사람에 의해" 변화된 것을 의미한다, 즉 자연에 존재하는 경우, 본래의 환경으로부터 변화되거나 제거된 것, 또는 변화되고 제거된 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니지만, 자연 상태에서 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 사용되는 의미와 같이 "분리된" 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상은 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키는데 효과적인 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 단백질은 상기한 것들 중의 어느 하나이다. 바람직하게는, 상기 PCV2 ORF2 단백질은
i) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii) i)의 폴리펩티드와 80% 이상 상동성인 임의의 폴리펩티드;
iii ) i) 및/또는 ii)의 폴리펩티드의 임의의 면역원성 부분;
iv ) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열에 포함된 10개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 iii)의 면역원성 부분;
v) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드;
vi) v)의 폴리뉴클레오티드와 80% 이상 상동성인 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드;
vii ) v) 및/또는 vi)의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 임의의 면역원성 부분;
viii ) vii)의 면역원성 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 포함된 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 상기 vii)의 면역원성 부분이다.
바람직하게는, 임의의 상기 면역원성 부분은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 특징을 가질 것이다.
추가의 양상에 있어서, PCV2 ORF2 단백질은 목적하는 면역 반응을 유도하는데 효과적인, 즉 PCV2 감염에 의한 임상 징후의 발생률을 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키는데 효과적인 항원 포함 수준으로 면역학적 조성물 중에 제공된다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 단백질 포함 수준은 최종 면역원성 조성물 1ml 당 0.2㎍ 이상의 항원 (㎍/ml), 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 400㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 약 100㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 약 50㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.45 내지 약 30㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 약 15㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.75 내지 약 8㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 약 6㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3.0㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 1.4 내지 약 2.5㎍/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2.0㎍/ml, 및 가장 바람직하게는 약 1.6㎍/ml이다.
추가의 양상에 있어서, ORF2 항원 포함 수준은 최종 항원성 조성물의 용량 당, 상기한 바와 같이, 0.2㎍ 이상의 PCV2 ORF2 단백질 (㎍/용량), 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 400㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 약 100㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 약 50㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.45 내지 약 30㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 약 15㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.75 내지 약 8㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 약 6㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3.0㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 1.4 내지 약 2.5㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2.0㎍/용량, 및 가장 바람직하게는 약 1.6㎍/용량이다.
본 발명에 따라 면역원성 조성물 중에 사용되는 PCV2 ORF2 폴리펩티드는 PCV2 ORF2의 분리 및 정제, 표준 단백질 합성 및 재조합 방법론을 포함하는 임의의 방식으로 유래될 수 있다. PCV2 ORF2 폴리펩티드를 수득하는 바람직한 방법은 본원에서 위에 기술되어 있고, 설명 및 내용이 본원에 참조로서 인용된 미국특허원 제11/034,797호에도 제공되어 있다. 간략히 설명하면, 감수성 세포를 PCV2 ORF2 DNA 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, PCV2 ORF2 폴리펩티드를 재조합 바이러스에 의해 발현시키고, 발현된 PCV2 ORF2 폴리펩티드를 상청액으로부터 여과에 의해 회수하여, 임의의 통상적인 방법으로, 바람직하게는 2원 에틸렌이민을 사용하여 불활성화시키고 나서, 이를 중화시켜 불활성화 단계를 중지시킨다.
따라서, 추가의 양상에 있어서, 면역원성 조성물은 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, 및 ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분을 포함한다. 또한, 추가의 양상에 있어서, 면역원성 조성물은 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분, 및 iii ) 세포 배양 상청액의 일부분을 포함한다.
PCV2 ORF2 단백질의 생산 및 회수 방법의 한가지 특정 양태에 있어서, 공극 크기가 바람직하게는 약 0.45 내지 1㎛인 막을 통해 세포 배양 상청액을 여과시킨다. 따라서, 추가의 양상은 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분, 및 iii ) 세포 배양물의 일부분을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 약 90%의 성분은 크기가 1㎛ 미만이다.
추가의 양상에 있어서, 본 발명은 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii ) 세포 배양물의 일부분, 및 iv ) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는 BEI를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 크기가 1㎛ 미만이다. 바람직하게는, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키는데 유효한 농도로 존재한다. 유효 농도는 위에 기술되어 있다.
추가의 양상에 있어서, 본 발명은 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii ) 세포 배양물의 일부분, iv ) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개된 불활성화를 중지시키는 중화제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 크기가 1㎛ 미만이다. 바람직하게는, 불활성화제가 BEI인 경우, 상기 조성물은 나트륨 티오설페이트를 BEI와 등량으로 포함한다.
상기 폴리펩티드는 PCV2에 감염되기 쉬운 동물에게 투여될 수 있는 조성물 속으로 혼입시킨다. 바람직한 형태에서, 조성물은 당업자에게 공지된 추가적인 성분을 포함할 수도 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton]. 또한, 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "수의학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 애주번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함된다.
바람직한 양태에서, 면역원성 조성물은 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 항원성 성분으로서 상기한 농도로 포함하고, 이는 애주번트, 바람직하게는 카보폴, 및 생리 식염수와 혼합된다.
당업자는 공지된 주사가능한, 생리학적으로 허용되는, 멸균 용액을 본원의 조성물에 혼입시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입용으로 즉시 사용가능한 용액을 제조하기 위하여, 수성 등장 용액, 예를 들면 식염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액을 쉽게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 희석제, 등장화제, 안정화제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 희석제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함될 수 있다. 등장화제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 안정화제에는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염이 포함된다. 적당한 애주번트는 앞서 기술된 것이다. 카보폴, 특히 카보폴 971P를, 바람직하게는 상기한 양으로 (예: 용량 당 약 500㎍ 내지 약 5mg, 보다 바람직하게는 용량 당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg, 및 가장 바람직하게는 용량 당 약 1mg의 양으로) 사용하는 것이 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii ) 세포 배양물의 일부분, iv ) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는 BEI, v) 불활성화제에 의해 매개된 불활성화를 중지시키는 중화제, 바람직하게는 BEI와 등량인 나트륨 티오설페이트, 및 vi ) 상기한 양의 적당한 애주번트, 바람직하게는 카보폴 971을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 크기가 1㎛ 미만이다. 추가의 양상에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 인산염을 생리학적으로 허용되는 농도로 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물의 pH는 생리학적 pH, 즉 약 6.5 내지 7.5로 조절된다.
따라서, 본 발명은 또한 1ml 당 i)　1.6㎍ 이상의 상기한 PCV2 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, iii ) 세포 배양물의 일부분, iv ) 약 2 내지 8mM의 BEI, v) BEI와 등량인 나트륨 티오설페이트, vi ) 약 1mg의 카보폴 971, 및 vii ) 생리학적으로 허용되는 농도의 인산염을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 크기가 1㎛ 미만이고, 상기 면역원성 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조절된다.
면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 면역조절제, 예를 들면, 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 젠타마이신 및 메르티올레이트를 포함할 수도 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 애주번트 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있지만, 본 발명은 약 50㎍ 내지 약 2000㎍의 애주번트를 포함하는 조성물, 및 바람직하게는 약 250㎍/ml 용량의 백신 조성물을 고려한다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml의 항생제, 및 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 미만의 항생제를 포함하는 백신 조성물을 고려한다.
따라서, 본 발명은 또한 i) 상기한 임의의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 상기한 농도의 단백질, ii ) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii ) 세포 배양물의 일부분, iv ) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는 BEI, v) 불활성화제에 의해 매개된 불활성화를 중지시키는 중화제, 바람직하게는 BEI와 등량인 나트륨 티오설페이트, vi ) 상기한 양의 적당한 애주번트, 바람직하게는 카보폴 971, vii ) 약제학적으로 허용되는 농도의 식염수 완충액, 바람직하게는 인산염 완충액, 및 viii ) 항-미생물 활성제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 크기가 1㎛ 미만이다.
놀랍게도, 본원에서 제공된 면역원성 조성물은 24개월의 기간 동안 매우 안정하다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 제공되는 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 본원에서 제공되는 면역원성 조성물은 PCV2 감염과 관련된 임상 증상을 감소시키는데 매우 효과적이라는 것도 밝혀졌다. 본원에서 제공되는 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 불활성화된 형태의 전체 PCV2 바이러스 또는 분리된 바이러스 PCV2 ORF2 항원을 포함하는 면역원성 조성물보다 효과적이라는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 특히, 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질은 최대 0.25㎍/용량의 농도를 의미하는 매우 낮은 농도에서 효과적이라는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. PCV2 ORF2 단백질의 이러한 예상외의 높은 면역원성 가능성은 카보폴의 첨가에 의해 추가로 증가될 수 있다.
추가의 양상은 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량을 포함하는 용기에 관한 것이고, 여기서 1회 용량은 2㎍ 이상의 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 2 내지 16㎍의 PCV2 ORF2 단백질을 포함한다. 상기 용기는 1 내지 250회 용량의 면역원성 조성물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 이는 PCV2 ORF2 단백질의 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200 또는 250회 용량의 면역원성 조성물을 함유한다. 바람직하게는, PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량을 포함하는 각각의 용기는 항-미생물 활성제를 추가로 포함한다. 이러한 제제는, 예를 들면, 젠타마이신 및 메르티올레이트 등을 포함하는 항생제이다. 따라서, 본 발명의 한가지 양상은 PCV2 ORF2 단백질의 1 내지 250회 용량의 면역원성 조성물을 포함하는 용기에 관한 것이고, 여기서 1회 용량은 2㎍ 이상의 PCV2 ORF2 단백질, 및 젠타마이신 및/또는 메르티올레이트, 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml, 및 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 미만의 항생제를 포함한다.
추가의 양상은 상기한 임의의 용기를 포함하고, PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키기 위한 PCV2 ORF2 단백질의 1회 이상의 용량의 면역원성 조성물을 새끼돼지에게 근육내 투여하는 것에 관한 정보를 포함하는 사용 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한, 추가의 양상에 있어서, 상기 사용 지침서는 PCV2 ORF2의 1회 이상의 용량의 면역원성 조성물의 2차 또는 그 이상의 투여(들)에 관한 정보를 포함하고, 여기서 2차 투여 또는 임의의 그 이상의 투여는 최초 또는 임의의 이전의 투여후 14일 이상 경과하여 실시한다. 바람직하게는, 상기 사용 지침서는 면역 자극제를 투여하는 것에 관한 정보도 포함한다. 바람직하게는, 상기 면역 자극제는 2회 이상 투여하여야 한다. 면역 자극제의 1차 투여와 2차 또는 임의의 이후의 투여 사이의 기간은, 바람직하게는 3일 이상, 보다 바람직하게는 5일 이상, 및 보다 더 바람직하게는 7일 이상이다. 바람직하게는, 면역 자극제는 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 최초 투여후 10일 이상, 바람직하게는 15일, 보다 바람직하게는 20일, 및 보다 더 바람직하게는 22일 이상 경과하여 투여된다. 바람직한 면역 자극제로는, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH; Keyhole Limpet Hemocyanin), 바람직하게는 불완전 프로인트 애주번트(incomplete Freund's adjuvant)로 유화된 KLH (KLH/ICFA)가 있다. 하지만, 이와 함께, 당업자에게 공지된 임의의 다른 면역 자극제도 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 "면역 자극제"는, 바람직하게는 특이적인 면역 반응 (예: 특정한 병원체에 대한 면역 반응)을 개시시키거나 증가시키지 않으면서, 일반적인 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물을 의미한다. 면역 자극제를 적당한 용량으로 투여하는 것이 추가로 지시된다. 또한, 키트는 1회 용량 이상의 면역 자극제, 바람직하게는 1회 용량의 KLH 또는 KLH/ICFA를 포함하는 용기를 포함할 수도 있다.
또한, 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을, 바람직하게는 카보폴과 함께 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성 가능성은 IngelVac PRRS MLV 백신 (실시예 5를 참조)의 투여에 의해 추가로 향상될 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. PCV2의 임상 징후 및 질병 양상은 PRRS 감염이 존재하는 경우에 크게 악화된다. 하지만, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물 및 백신접종 방법은 이러한 효과를 예상보다 크게 감소시켰다. 달리 말하면, 동물, 바람직하게는 돼지를 본원에서 제공되는 임의의 PCV2 ORF2 면역원성 조성물 및 Ingelvac PRRS MLV 백신[판매원: Boehringer Ingelheim]으로 처리하는 경우에 예상외의 상승 효과가 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상은 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2의 면역원성 조성물 및 사용 지침서를 포함하는 상기의 키트에 관한 것이고, 여기서 사용 지침서는 PRRS 항원, 바람직하게는 면역보강된 (adjuvanted) PRRS 항원을 포함하는 면역원성 조성물과 함께, 또는 이와 대략 동일한 시간에 PCV2 ORF2 면역원성 조성물을 투여하는 것에 관한 정보를 추가로 포함한다. 바람직하게는, PRRS 항원은 IngelVac® PRRS MLV[판매원: Boehringer Ingelheim]이다.
본 발명의 추가의 양상은 또한 i) 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2의 1회 용량 이상의 면역원성 조성물을 함유하는 용기, 및 ii ) PRRS 항원, 바람직하게는 면역보강된 PRRS 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, PRRS 항원은 IngelVac® PRRS MLV[판매원: Boehringer Ingelheim]이다. 보다 바람직하게는, 키트는 약제학적 조성물 둘 모두를 투여하는 것에 관한 정보를 포함하는 사용 지침서를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이는 PCV2 ORF2 함유 조성물을 PRRS 함유 조성물보다 시간상 먼저 투여한다는 정보를 함유한다.
추가의 양태는 본원에서 제공된 임의의 조성물의 약제로서의, 바람직하게는 수의용 약제로서의, 보다 바람직하게는 백신으로서의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PCV2 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 임의의 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 약제는 PCV2 감염의 예방, 보다 바람직하게는 새끼돼지에서 상기 감염의 예방을 위한 것이다.
추가의 양상은, 본원에서 제공된 임의의 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, (i) PCV2의 감염 또는 재감염의 예방 또는 (ii) 피험체에서 PCV2에 의해 발생하는 임상 증상의 감소 또는 제거 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 피험체는 돼지이다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 근육내로 투여한다. 바람직하게는, 1회 용량 또는 2회 용량의 면역원성 조성물을 투여하고, 여기서 1회 용량은 바람직하게는 약 2㎍ 이상, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 16㎍의 PCV2 ORF2 단백질, 및 적어도 약 0.1 내지 약 5mg의 카보폴, 바람직하게는 약 1mg의 카보폴을 포함한다. 추가의 양상은 상기한 치료 방법에 관한 것이고, 여기서 면역원성 조성물의 2차 투여가 실시된다. 바람직하게는, 2차 투여는 동일한 면역원성 조성물, 바람직하게는 동량의 PCV2 ORF2 단백질을 갖는 조성물을 사용하여 실시된다. 바람직하게는, 2차 투여도 근육내로 실시된다. 바람직하게는, 2차 투여는 최초 투여후 14일 이상 경과하여, 보다 바람직하게는 최초 투여후 4주 이상 경과하여 실시된다.
추가의 양상에서, 치료 방법은 면역 자극제의 투여도 포함한다. 바람직하게는, 상기 면역 자극제는 2회 이상 투여된다. 바람직하게는, 면역 자극제의 1차 투여와 2차 투여 사이의 기간은 3일 이상, 보다 바람직하게는 5일 이상, 보다 더 바람직하게는 7일 이상이다. 바람직하게는, 면역 자극제는 PCV2 ORF2 면역원성 조성물의 최초 투여후 10일 이상, 바람직하게는 15일, 보다 바람직하게는 20일, 보다 더 바람직하게는 22일 이상 경과하여 투여된다. 바람직한 면역 자극제로는, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 보다 바람직하게는 불완전 프로인트 애주번트로 유화된 KLH (KLH/ICFA)가 있다. 하지만, 이와 함께, 당업자에게 공지된 임의의 다른 면역 자극제도 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 면역 자극제를 적당한 용량으로 투여하는 것은 당업자의 일반적인 지식 내에 있다.
추가의 양상에 있어서, 상기한 치료 방법은 PRRS 항원의 투여도 포함한다. 바람직하게는, PRRS 항원은 IngelVac® PRRS MLV[판매원: Boehringer Ingelheim]이다. 바람직하게는, 상기 PRRS 항원은 시간상 PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 조성물의 투여 이후에 투여된다.
추가의 양상에 있어서, 본 발명은 PCV2 감염의 발생률을 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 제제 및 기타 돼지 질병 유발 유기체에 대한 하나 이상의 면역원성 활성 성분을 포함하는 다가 복합 백신을 제공한다.
특히, PCV2 감염의 발생률을 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 제제는 PCV2 항원이다. 바람직하게는, 상기 PCV2 항원은 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2 단백질 또는 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기한 임의의 면역원성 조성물이다.
하지만, 이와 함께, PCV2 항원은 또한, 돼지에게 투여되는 경우, PCV2 감염에 대한 면역 반응을 유도하거나, 자극하거나 향상시킬 수 있는 하나 이상의 항원을 포함하는 임의의 물질의 조성물을 말한다는 것을 이해하여야 한다. 바람직하게는, 상기 PCV2 항원은 전체 PCV2 바이러스, 바람직하게는 불활성화된 형태의 바이러스, 변형되거나 약독화된 살아있는 PCV2 바이러스, PCV2의 면역원성 아미노산 서열을 적어도 포함하는 키메릭 (chimeric) 바이러스, PCV2의 면역원성 아미노산 서열을 적어도 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 성분이다. 본원에서 사용되는 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"이라는 용어는, 상기 면역원성 단백질, 면역원성 폴리펩티드 또는 면역원성 아미노산 서열을 포함하여, 병원체에 대해 숙주에서 면역 반응을 유도하는 임의의 아미노산 서열을 말한다. 본원에서 사용되는 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"에는 임의의 단백질의 전체-길이 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편이 포함된다. "면역원성 단편"은 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 포함하고 이에 의해 관련된 병원체에 대한 면역학적 반응을 유도하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 익히 공지된 임의의 수의 에피토프 매핑 (mapping) 기술을 사용하여 확인될 수 있다[참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]. 예를 들면, 선형 에피토프는, 예를 들면 단백질 분자의 일부분에 상응하는 많은 수의 펩티드를 고체 지지체 상에 동시에 합성하고, 펩티드가 여전히 지지체에 부착된 상태에서 펩티드를 항체와 반응시키는 방법으로 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: 미국특허 제4,708,871호; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기술되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프 (conformational epitope)는, 예를 들면, x-레이 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체구조를 측정하여 쉽게 확인된다[참조: Epitope Mapping Protocols, 상기와 동일]. 합성 항원도 상기 정의 내에 포함된다 (예: 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프 및 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원) [참조: Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998].
추가의 양태에 있어서, 상기 PCV-2 항원은 Ingelvac® CircoFLEXTM[판매원: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA], CircoVac®[판매원: Merial SAS, Lyon, France], CircoVent [판매원: Intervet Inc., Millsboro, DE, USA] 또는 Suvaxyn PCV-2 One Dose®[판매원: Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, USA]이다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 또는 면역 반응"은 숙주에서 관심대상의 조성물 또는 백신에 대해 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응이 발생하는 것이다. 일반적으로, "면역 반응"에는 하나 이상의 다음의 효과가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 항원 또는 관심대상의 조성물 또는 백신에 포함된 항원에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 yd T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 치료 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어, 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질병의 임상적 중증도가 감소될 것이다. 이러한 보호는 상기한 숙주 감염과 관련된 증상의 감소 또는 부재에 의해 증명될 것이다.
바람직하게는, 다른 돼지 질병 유발 유기체는 액티노바실러스 플루로뉴모니아 (1); 아데노바이러스 (2); 알파바이러스, 예를 들면 동부 말 뇌척수염 바이러스 (3); 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) (4); 브라키스피라 종 (5), 바람직하게는 비.히오디엔테리애 (6); 비.피오시콜리(B. piosicoli) (7), 브루셀라 수이스, 바람직하게는 생물변이형 1, 2 및 3 (8); 돼지 열병 바이러스 (9); 클로스트리디움 종 (10), 바람직하게는 클.디피실레 (11), 클.퍼프린젠스 A, B 및 C형 (12), 클.노비이 (13), 클.셉티쿰 (14), 클.테타니 (15); 코로나바이러스 (16), 바람직하게는 돼지 호흡기 코로나 바이러스 (17); 에페리트로주노시스 수이스 (18); 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (19); 에스케리키아 콜라이 (20); 헤모필루스 파라수이스, 바람직하게는 아형 1, 7 및 14 (21); 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (22); 일본 뇌염 바이러스 (23); 로소니아 인트라셀룰라리스 (24); 렙토스피라 종 (25), 바람직하게는 렙토스피라 아우스트랄리스 (26); 렙토스피라 카니콜라 (27); 렙토스피라 그립포티포사 (28); 렙토스피라 익테로헤모라지캐 (29); 및 렙토스피라 인테로간스 (30); 렙토스피라 포모나 (31); 렙토스피라 타라쏘비 (32); 마이코박테리움 종 (33), 바람직하게는 엠.아비움 (34), 엠.인트라셀룰라레 (35) 및 엠.보비스 (36); 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (엠.하이오) (37); 파스튜렐라 멀토시다 (38); 돼지 사이토메갈로바이러스 (39); 돼지 파보바이러스 (40); 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 (41); 가성광견병 바이러스 (42); 로타바이러스 (43); 살모넬라 종 (44), 바람직하게는 에스.티히무리움 (45) 및 에스.콜레라수이스 (46); 스타필로코커스 하이쿠스 (47); 스타필로코커스 종 (48), 바람직하게는 스트렙토코커스 종 (49), 바람직하게는 스트렙토코커스 수이스 (50); 돼지 헤르페스 바이러스 (51); 돼지 인플루엔자 바이러스 (52); 돈두 바이러스 (53); 돈두 바이러스 (54); 수포성 구내염 바이러스 (55); 돼지 수포성 발진 바이러스 (56); 렙토스피라 하르드조 (57); 및/또는 마이코플라즈마 히오시노비애 (58)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
아래에서 돼지 병원체와 관련하여 언급하는 경우에는 병원체의 이름 (예: 엠.하이오)을 언급하거나, 위에 제시된 병원체 이름 다음의 () 안에 있는 숫자를 언급할 수 있다. 예를 들면, 엠.하이오는 엠.하이오 또는 (37)로 언급할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PCV2 감염의 발생률을 감소시키거나 이의 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 제제, 바람직하게는 PCV2 항원, 및 임의의 돼지 병원체 (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) 및/또는 (58)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 상기 돼지 병원체(들)의 면역학적 활성 성분인 추가의 면역학적 활성 성분을 포함하는, 돼지의 치료 및/또는 예방을 위한 복합 백신에 관한 것이다 [콤보 1].
본원에서 사용되는 "면역학적 활성 성분"은 상기 성분을 투여받는 동물에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는 성분을 의미한다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 성분 또는 상기 성분을 포함하는 미생물에 대한 것이다. 보다 바람직한 양태에 있어서, 면역학적 활성 성분은 변형된 살아있는 바이러스 (MLV), 사멸시킨 미생물 또는 적어도 미생물의 면역학적 활성 부분을 포함하는, 약독화된 미생물이다.
본원에서 사용되는 "미생물의 면역학적 활성 부분"은 상기 성분을 투여받는 동물에서 면역 반응을 유도하거나 자극시키는 하나 이상의 항원을 포함하는 미생물의 단백질-, 당- 및/또는 당단백질-함유 분획을 의미한다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 미생물의 면역학적 활성 부분 또는 상기 면역학적 활성 부분을 포함하는 미생물에 대한 것이다.
바람직하게는, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (41)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (41)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (37)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (37)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (7)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (7)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (24)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (24)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (38)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (38)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (40)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (40)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (2)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (2)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (44)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (44)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (50)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (50)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (19), 바람직하게는 (20) 및/또는 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (19), 바람직하게는 (20) 및/또는 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (22)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (22)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (41) 및 (37)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (41) 및 (37)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1) 및 (41)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1) 및 (41)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1) 및 (37)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1) 및 (37)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1), (41) 및 (37)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1), (41) 및 (37)의 면역학적 활성 성분이다. 바람직한 형태에서, 상기 조합물은 카보폴을 사용하여 면역보강된다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (21) 및 (41)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (21) 및 (41)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (21) 및 (37)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (21) 및 (37)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (21) 및 (38)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (21) 및 (38)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (7) 및 (19)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (7) 및 (19)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (38) 및 (33), 바람직하게는 (34), (35) 및/또는 (36)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (38) 및 (33), 바람직하게는 (34), (35) 및/또는 (36)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (38) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (38) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (33) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (33) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (38), (33) 및 (21)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (49), 바람직하게는 (50), (20), (38), (33) 및 (21)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (41), (40) 및 (19)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (41), (40) 및 (19)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (38), (4) 및 (19)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (38), (4) 및 (19)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (38), (4), (21) 및 (19)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (38), (4), (21) 및 (19)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (20), 바람직하게는 (20), (31) 및 (38)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (20), (31), (38)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (5), 바람직하게는, (5) 및 (24)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (5) 및 (24)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (1), 바람직하게는, (1) 및 (5)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1) 및 (5)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (41), 바람직하게는, (40), (27), (28), (29), (31), (19) 및 (59)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (41), (40), (27), (28), (29), (31), (19) 및 (57)의 면역학적 활성 성분이다.
다른 양상에 있어서, [ 콤보 1]의 추가의 면역학적 활성 성분은 돼지 병원체 (6), 바람직하게는, (6), (19), (38) 및 (58)에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적이거나, 돼지 병원체 (1) 및 (5)의 면역학적 활성 성분이다.
추가의 양상에 있어서, 복합 백신의 추가의 면역학적 활성 성분은 Enterisol® Ileitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parsius [상기 모든 제품의 판매원: Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA]; Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® 및 Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG-Emune® Rota 및 Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG-Emune® 및 Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ 및 Spur®, MaGESTic® 7 및 Spur®, MaGESTic® 8 및 Spur®, End-FLUence® 및 Imugen® II, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia 및 Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® 및 Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo [상기 모든 제품의 판매원: Intervet Inc., Millsboro, DE, USA]; Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- [상기 모든 제품의 판매원: Merial LTD, Duluth, GA]; ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®, ER BAC® Leptoferm-5®, Farrowsure®, Farrowsure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ER BAC PLus®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE™/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/RespiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE™/RESPISURE 1 ONE®, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure®, Respisure 1 ONE®, Respisure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (예전에는 Baypamune으로 공지되었음), Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm-5™Parvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plus™ [상기 모든 제품의 판매원: Pfizer Inc., New York, NY, USA]; Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha + Diluent, Suvaxyn Aujeszky Bartha + o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot [상기 모든 제품의 판매원: Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, USA (Wyeth)]; SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® H1N1, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, MaxiVac®-M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plus, M-Parapac™, SS PAC® [상기 모든 제품의 판매원: Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA]; AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS [상기 모든 제품의 판매원: Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Spain]; Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 [상기 모든 제품의 판매원: IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany]; Mypravac Suis [판매원: Albrecht GmbH, Germany]; Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield™ TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Clostratox® C, Clostratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield™+C, Porcine Pili Shield™, Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™, Ery Shield™, Ery Vac Oral, Ery Shield™+L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™, Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™, Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, Amitox Tet™, C. Perfingens Type A Toxoid [상기 모든 제품의 판매원: Novartis Animal Health, Basel, Switzerland]; Nitro-Sal [판매원: Akro]; 또는 상기한 조성물 중에 포함되는 임의의 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로, PCV2 항원이 임의의 상기 백신 중에 이미 존재하는 경우에는, (i) 본원에서 기술되는 PCV2 항원을 임의의 상기 조성물/항원에 첨가하거나, (ii) 임의의 상기 백신 중에 존재하는 PCV2 항원을 본원에서 기술되는 PCV2 항원으로 대체한다.
추가의 양상에 있어서, 복합 백신의 추가의 면역학적 활성 성분은 Enterisol® Ileitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parsius [상기 모든 제품의 판매원: Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA]; Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® 및 Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG-Emune® Rota 및 Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG-Emune® 및 Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ 및 Spur®, MaGESTic® 7 및 Spur®, MaGESTic® 8 및 Spur®, End-FLUence® 및 Imugen® II, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia 및 Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® 및 Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo [상기 모든 제품의 판매원: Intervet Inc., Millsboro, DE, USA]; Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- [상기 모든 제품의 판매원: Merial LTD, Duluth, GA]; ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®, ER BAC® Leptoferm-5®, Farrowsure®, Farrowsure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ER BAC PLus®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE™/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/RespiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE™/RESPISURE 1 ONE®, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure®, Respisure 1 ONE®, Respisure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (예전에는 Baypamune으로 공지되었음), Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm-5™Parvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plus™ [상기 모든 제품의 판매원: Pfizer Inc., New York, NY, USA]; Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha + Diluent, Suvaxyn Aujeszky Bartha + o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot [상기 모든 제품의 판매원: Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, USA (Wyeth)]; SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® H1N1, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, MaxiVac®-M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plus, M-Parapac™, SS PAC® [상기 모든 제품의 판매원: Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA]; AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS [상기 모든 제품의 판매원: Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Spain]; Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 [상기 모든 제품의 판매원: IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany]; Mypravac Suis [판매원: Albrecht GmbH, Germany]; Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield™ TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Clostratox® C, Clostratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield™+C, Porcine Pili Shield™, Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™, Ery Shield™, Ery Vac Oral, Ery Shield™+L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™, Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™, Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, Amitox Tet™, C. Perfingens Type A Toxoid [상기 모든 제품의 판매원: Novartis Animal Health, Basel, Switzerland]; Nitro-Sal [판매원: Akro]; 또는 상기한 조성물 중에 포함되는 임의의 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로, PCV2 항원이 임의의 상기 백신 중에 이미 존재하는 경우에는, (i) 본원에서 기술되는 PCV2 항원을 임의의 상기 조성물/항원에 첨가하거나, (ii) 임의의 상기 백신 중에 존재하는 PCV2 항원을 본원에서 기술되는 PCV2 항원으로 대체한다.
제형
본 발명의 중요한 양상은 복합 백신(들)의 제법이다. 당업자는 상기 조성물에 포함될 수 있는 추가적인 성분을 알고 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton]. 전문가는 공지된 주사가능한, 생리학적으로 허용되는, 멸균 용액을 사용할 수 있다. 비경구 주사 또는 주입용으로 즉시 사용가능한 용액을 제조하기 위하여, 수성 등장 용액, 예를 들면 식염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액을 쉽게 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 동결건조물 또는 건조 제제로서 존재할 수 있고, 이는 사용 직전에 멸균 상태 하에서 공지된 주사가능한 용액을 사용하여 재구성시킬 수 있다 (예: 부품 키트로서).
또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "수의학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 애주번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함된다.
희석제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 안정화제에는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염이 포함된다.
바람직한 애주번트는 앞서 기술된 것이다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 면역조절제, 예를 들면, 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 젠타마이신 및 메르티올레이트를 포함할 수도 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 애주번트 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있지만, 본 발명은 약 50㎍ 내지 약 2000㎍의 애주번트를 포함하는 조성물, 및 바람직하게는 약 250㎍/ml 용량의 백신 조성물을 고려한다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml의 항생제, 및 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 미만의 항생제를 포함하는 백신 조성물을 고려한다.
추가의 양태에 있어서, 복합 백신을 우선 탈수시킨다. 조성물이 다른 방법에 의해 먼저 동결건조되거나 탈수된 경우에는, 백신접종 전에, 상기 조성물을 수성 용액 (예: 식염수, PBS (인산염 완충 식염수)) 또는 비-수성 용액 (예: 오일 에멀젼 (미네랄 오일 또는 식물성/대사가능한 오일 기제/단일 또는 이중 에멀젼 기제), 알루미늄-기제, 카보머 기제 애주번트) 중에 재수화시킨다.
용량 및 투여
본 발명에 있어서, 돼지에게 투여되는 복합 백신의 유효량은 PCV2 및 앞서 열거한 하나 이상의 추가적인 병원체에 의해 발생하는 미생물 감염에 대해 효과적인 면역성을 제공한다. 미생물 질병의 치료 및 예방을 위한 항원의 바람직한 조합은 위에 열거되어 있다.
추가의 양태에 있어서, 복합 백신은 1회 또는 2회 용량으로 약 2 내지 4주 간격으로 돼지에게 투여된다. 예를 들면, 1차 투여는 동물이 약 2 내지 3주령 내지 약 8주령일 때 실시한다. 2차 투여는 1차 백신접종의 제1 투여후 약 1 내지 약 4주 후에 실시한다. 추가의 양태에 있어서, 재백신접종은 제2 용량의 투여후 3 내지 12개월의 간격으로 실시한다. 이후의 백신 용량의 투여는 바람직하게는 6개월 내지 1년 기준으로 실시한다. 다른 바람직한 양태에서, 약 2 내지 3주령 전에 백신접종된 동물은 재백신접종해야 한다. 이후의 백신 용량의 투여는 바람직하게는 1년 기준으로 실시한다.
복합 백신의 유효량은 백신의 성분 및 투여 스케줄에 따라 달라진다. 통상적으로, 불활성화된 바이러스 또는 변형된 살아있는 바이러스 제제를 복합 백신에 사용하는 경우, 백신의 양은 용량 당 약 102 내지 약 109 TCID50, 바람직하게는 용량 당 약 103 내지 약 108 TCID50, 보다 바람직하게는 용량 당 약 104 내지 약 108 TCID50을 함유한다. 일반적으로, 불활성화된 항원은 살아있는 변형된 바이러스보다 일반적으로 많은 양으로 사용된다. 통상적으로, 세균 항원을 복합 백신에 사용하는 경우, 백신은 용량 당 약 103 내지 약 109 콜로니 형성 단위 (CFU), 바람직하게는 용량 당 약 104 내지 약 108 CFU, 보다 바람직하게는 용량 당 약 105 내지 약 106 CFU의 양을 함유한다. 서브유닛 백신은 일반적으로 용량 당 0.2㎍ 이상의 항원, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 400㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 약 100㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 약 50㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.45 내지 약 30㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 약 15㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 0.75 내지 약 8㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 약 6㎍/용량, 및 보다 더 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3.0㎍/용량의 항원 포함 수준으로 투여된다. 예를 들면, PCV ORF2 항원, 바람직하게는 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2 단백질의 항원 포함 수준은 약 2㎍ 내지 약 150㎍, 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 60㎍, 보다 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 50㎍, 보다 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 40㎍, 보다 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 30㎍, 보다 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 25㎍, 보다 바람직하게는 약 2㎍ 내지 약 20㎍, 보다 바람직하게는 약 4㎍ 내지 약 20㎍, 및 보다 더 바람직하게는 약 4㎍ 내지 약 16㎍을 함유한다. (37)을 포함하는 복합 백신의 경우에는, 적어도 1 내지 10 log, 보다 바람직하게는, 5 내지 10 log, 및 가장 바람직하게는 6 내지 8 log를 사용하는 것이 바람직하다. (41)을 포함하는 복합 백신의 경우에는, 적어도 1 내지 10 log, 보다 바람직하게는 3 내지 10 log, 및 가장 바람직하게는 5 내지 6 log를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물은 피내, 기관내 또는 질내로 투여될 수 있다. 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 비강내로 투여될 수 있다. 동물의 신체에서, 상기한 약제학적 조성물을 정맥내 주사를 통해 또는 표적 조직으로의 직접 주사에 의해 투여하는 것이 유리하다고 확인될 수 있다. 전신 투여의 경우, 정맥내, 혈관내, 근육내, 비강내, 동맥내, 복강내, 경구 또는 수막강내 (intrathecal) 경로가 바람직하다. 보다 국부적인 투여는 피하, 피내, 피부내, 심장내, 폐엽내 (intralobal), 연수내, 폐내로 또는 치료할 조직 (결합-, 골-, 근육-, 신경-, 상피 조직)의 내부 또는 근처로 직접 실시할 수 있다. 치료의 목적하는 지속기간 및 유효성에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들면 1일 기준으로 수일, 수주 또는 수개월 동안, 상이한 용량으로 투여될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 또 다른 중요한 양태는 PCV2 및 하나 이상의 돼지 병원성 미생물(들)에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료 방법이고, 여기서 PCV2 항원, 바람직하게는 본원에서 제공되는 PCV2 ORF2 단백질, 및 상기의 추가적인 돼지 병원성 미생물에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적인 추가의 면역학적 활성 성분을 이를 필요로 하는 동물에게 적당한 용량으로 투여한다. 추가의 양상에 있어서, 상기 PCV2 ORF2 단백질은 상기한 바와 같이 항원성 조성물의 일부이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은, 본원에서 제공된 항원성 조성물 중의 어느 하나를 포함하고, PCV2 ORF2 단백질, 및 상기의 다른 돼지 병원성 미생물에 의해 발생하는 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적인 다른 면역학적 활성 성분을 포함하는 복합 백신에 관한 것이다.
도 1은 PCV2 ORF2 재조합 배큘로바이러스의 바람직한 작제의 도식적인 흐름도이다.
도 2a 및 2b는 각각 본 발명에 따른 조성물을 생산하는 방법에 관한 도식적인 흐름도이다.
다음의 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 재료 및 방법을 제시한다. 하지만, 이러한 실시예는 예로서만 제공되고, 어느 것도 본 발명의 전체 범위를 제한하 는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 방법을 사용한 경우와 선행 기술에 공지되어 있는 방법을 사용한 경우의 ORF2의 상대적인 수율을 비교한다. 4개의 1000mL 스피너 플라스크 (spinner flask)에 곤충 무혈청 배지인 Excell 420 [판매원: JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS] 300mL 중의 대략 1.0x106 Sf+ 세포/ml로 각각 접종하였다. 마스터 세포 배양물은 SF+ (스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)) Master Cell Stock, 19회 계대배양, Lot#N112-095W로서 확인된다. SF+ 마스터 세포 스톡 (Master Cell Stock)을 생성시키는데 사용된 세포는 판매원[Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT]로부터 입수하였다. 본 실시예를 위한 SF+ 세포주는 19회 내지 59회 계대배양으로 한정되었다. 다른 계대배양도 본 발명에 사용될 수 있을 것이지만, 대규모 생산으로 규모를 확대시키기 위하여, 19회 이상의 계대배양이 아마도 필요할 것이고, 59회를 초과하는 계대배양은 조사된 것은 아니지만 발현에 영향을 미칠 것이다. 보다 상세히 설명하면, 액체 질소 저장물로부터의 최초의 SF+ 세포 배양물을 일정하게 교반하면서 멸균 스피너 플라스크 내에서 현탁액 중의 Excell 420 배지에서 성장시켰다. 배양물을 25 내지 150ml의 Excell 420 무혈청 배지가 있는 100mL 내지 250mL 스피너 플라스크에서 성장시켰다. 세포가 1.0 내지 8.0 x 106 세포/ml의 세포 밀도로 증식되었을 때, 0.5 내지 1.5 x 106 세포/ml의 식재 밀도 (planting density)로 새로운 용기에 분할시켰다. 이후의 확장 배양액을 크기가 최대 36리터인 스피너 플라스크 또는 최대 300리터인 스테인리스 스틸 생물반응기 내에서 2 내지 7일 동안 25 내지 29℃에서 성장시켰다.
접종한 후, 플라스크를 27℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, 각각의 플라스크에 PCV2 ORF2 유전자 (서열번호 4)를 함유하는 재조합 배큘로바이러스로 접종하였다. PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스는 다음와 같이 생성시켰다: PCV2의 North American 바이러스주로부터의 PCV2 ORF2 유전자를 PCR 증폭시켜, 5' 코작 서열 (서열번호 1) 및 3' EcoR1 부위 (서열번호 2)를 함유하게 하고, 이를 pGEM-T-Easy 벡터[판매원: Promega, Madison, WI] 속으로 클로닝하였다. 이어서, 이를 절단하여, 전달 벡터 pVL1392 [판매원: BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA] 속으로 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 부분은 본원에서 서열번호 7로 나타낸다. PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 pVL1392 플라스미드를 N47-064Y로 명명하고 나서, BaculoGold®[판매원: BD Biosciences Pharmingen] 배큘로바이러스 DNA와 함께 Sf+ 곤충 세포[판매원: Protein Sciences, Meriden, CT] 속으로 공동-형질감염시켜, PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 생성시켰다. 상기의 새로운 작제물을 본원에서 서열번호 8로 제공한다. PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 플라크-정제(plaque-purification)하고, 마스터 시드 바이러스(MSV; Master Seed Virus)를 SF+ 세포주에서 증식시켜, 분취하고, -70℃에서 보관하였다. MSV는 배큘로바이러스 특이적 프라이머를 사용한 PCR-RFLP 에 의해 PCV2 ORF2 배큘로바이러스로서 양성으로 확인되었다. MSV 또는 워킹 시드 바이러스(Working Seed Virus)를 생성시키기 위하여 PCV2 ORF2 배큘로바이러스로 감염시킨 곤충 세포는, 간접 형광 항체 검정에서 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바와 같이, PCV2 ORF2 항원을 발현한다. 또한, PCV2 ORF2 배큘로바이러스의 동일성을 N-말단 아미노산 서열분석으로 확인하였다. PCV2 ORF2 배큘로바이러스 MSV를 또한 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28 및 113.55에 따라 순도에 대해 검사하였다. 스피너 플라스크 안에 접종한 각각의 재조합 배큘로바이러스의 감염다중도(MOI)는 다양하였다. 플라스크 1에는 7.52ml의 .088 MOI의 시드(seed)를 접종하였고; 플라스크 2에는 3.O1ml의 0.36 M0I의 시드를 접종하였고; 플라스크 3에는 1.5ml의 0.18 MOI의 시드를 접종하였고; 플라스크 4에는 0.75ml의 0.09 M0I의 시드를 접종하였다. PCV2 ORF2 재조합 배큘로바이러스를 작제하는데 사용된 기본 단계를 설명하는 도식적인 흐름도는 본원에서 도 1에 제시되어 있다.
배큘로바이러스를 접종한 후, 플라스크를 100rpm에서 교반하면서 27±2℃에서 7일 동안 배양하였다. 플라스크는 환기되는 뚜껑을 사용하여 공기 흐름이 가능하게 하였다. 각각의 플라스크로부터 다음 7일 동안 24시간마다 샘플을 채취하였다. 추출한 후, 각각의 샘플을 원심분리하고, 펠릿과 상청액을 분리하고 나서, 0.45 내지 1.0㎛ 공극 크기 막을 통해 미세여과시켰다.
이어서, 생성된 샘플 내에 존재하는 ORF2의 양을 ELISA 검정을 통해 정량하였다. ELISA 검정은 0.05M 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중에 1:6000으로 희석시킨 정제된 포획 항체(capture antibody) 돼지 항-PCV2 Pab IgG 단백질 G (PBS 중에 1:250 희석됨)를 사용하여 수행하였다. 이어서, 100㎕의 항체를 미세역가 플레이트의 웰에 위치시켜, 밀봉하고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 0.5ml의 Tween 20[판매원: Sigma, St. Louis, MO], 100ml의 l0X D-PBS[판매원: Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA] 및 899.5ml의 증류수를 포함한 세척 용액으로 3회 세척하였다. 이후, 250㎕의 차단 용액(blocking solution) [1Oml의 D-PBS QS 중에 5g의 Carnation 탈지분유(판매원: Nestle, Glendale, CA)를 넣고 증류수를 첨가하여 100ml가 되게 함]을 각각의 웰에 첨가하였다. 다음 단계는 검사 플레이트를 세척하고나서 예비희석된 항원을 첨가하는 것이었다. 예비희석된 항원은 희석 플레이트 상의 각각의 웰에 200㎕의 희석 용액 (999.5ml의 D-PBS 중의 0.5ml의 Tween 20)을 첨가하여 생성되었다. 이어서, 샘플을 1:240 비 및 1:480 비로 희석시키고 나서, 100㎕의 각각의 상기 희석된 샘플을 희석 플레이트 상의 상부 웰 중의 하나에 첨가하였다 (즉, 하나의 상부 웰에 100㎕의 1:240 희석액을 첨가하고, 다른 웰에는 100㎕의 1:480 희석액을 첨가하였다). 이어서, 각각의 연속적인 웰로부터 100㎕를 채취하고 이를 플레이트 상의 다음 웰로 이동시켜, 플레이트의 나머지에 대해 연속 희석을 수행하였다. 다음 이동을 수행하기 전에 각각의 웰을 혼합하였다. 검사 플레이트 세척은 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척함을 포함하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 세척 완충액으로 3회 추가로 세척하기 전에 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 사용된 검출 항체는 PCV ORF2에 대한 모노클로날 항체였다. 이를 희석 용액 중에 1:300으로 희석시키고 나서, 100㎕의 희석된 검출 항체를 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 세척 완충액 으로 3회 세척하기 전에 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이어서, 일반적인 토끼 혈청[판매원: Jackson Immunoresearch, West Grove, PA]을 희석 용액에 첨가해서 1% 농도가 되게 하여 접합체 희석액을 제조하였다. 접합체 항체 염소 항-마우스 (H+l)-HRP[판매원: Jackson Immunoresearch]를 접합체 희석액 중에 1:10,000으로 희석시켰다. 이어서, 100㎕의 희석된 접합체 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 세척 완충액으로 3회 세척하기 전에 45분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 동일한 용적의 퍼옥시다제 기질 B (KPL)와 혼합된 100㎕의 기질 (TMB 퍼옥시다제 기질, 판매원: Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분동안 항온처리하였다. 이어서, 100㎕의 1N HCl 용액을 모든 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 플레이트를 ELISA 판독기에서 측정하였다. 본 검정의 결과를 아래의 표 1에 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00001
상기 결과는 배양 시간이 연장되면, 원심분리된 세포 및 배지의 상청액 속으로의 ORF2의 발현량이 원심분리된 세포 및 배지의 펠릿 내의 발현량보다 많다는 것을 나타낸다. 따라서, 5일 미만으로 발현시키고 세포로부터 ORF2를 회수하는 것보다는 ORF2를 5일 이상 동안 발현시키고 상청액 중의 ORF2를 회수하는 것이 ORF2 수율을 크게 증가시키고, 기존 방법 이상의 상당한 개선을 제공한다.
실시예 2
본 실시예는 본원에서 청구하는 본 발명의 효능에 관한 데이터를 제공한다. l000mL 스피너 플라스크에 300ml의 Excell 420 배지 중의 대략 1.0x106 Sf+ 세포/ml을 접종하였다. 이어서, 플라스크를 27℃에서 배양하고 100rpm으로 교반하였다. 이어서, 24시간 배양한 후, 0.1 MOI의 PCV2 ORF2/Bac p+6 (Sf9 곤충 세포에서 6회 추가로 계대배양된 PCV2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스) 바이러스 시드(virus seed) 10ml를 플라스크에 접종하였다.
이어서, 플라스크를 27℃에서 총 6일 동안 배양하였다. 배양한 후, 플라스크를 원심분리하고, 생성된 상청액의 3개 샘플을 회수하여 불활성화시켰다. 상청액의 온도를 37±2℃로 조절하여 상청액을 불활성화시켰다. 첫번째 샘플에는, 0.3N NaOH 중의 0.2M 2원 에틸렌이민(BEI)으로 고리화된 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드의 0.4M 용액을 상청액에 첨가하여 최종 농도가 5mM의 BEI가 되게 하였다. 두번째 샘플에는, 10mM BEI를 상청액에 첨가하였다. 세번째 샘플에는, BEI를 상청액에 첨가하지 않았다. 이어서, 샘플을 48시간 동안 계속 교반하였다. 5 mM의 최종 최소 농도가 되도록 1.0M 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시켰다. 이어서, 각각의 샘플 내의 ORF2의 양을 실시예 1에 기술된 바와 동일한 ELISA 검정 방법을 사용하여 정량하였다. 이의 결과를 아래의 표 2에 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00002
본 실시예는 BEI를 사용한 중화에 의해 재조합 PCV2 ORF2 단백질 산물이 제거되거나 이의 상당량이 분해되지 않는다는 것을 증명한다. 이는 BEI 또는 상승된 온도에 의해 상청액 중의 ORF2가 많이 손실되지 않는다는 사실에 의해 증명된다. 당업자는 회수된 ORF2가 안정한 단백질 산물이라는 것을 인식할 것이다.
실시예 3
본 실시예는 본 발명이 재조합 PCV2 ORF2의 소규모 생산에서부터 재조합 PCV2 ORF2의 대규모 생산까지 규모를 조절할 수 있다는 것을 증명한다. 7000ml의 ExCell 420 배지 중의 5.0 x 105 세포/ml의 SF+ 세포/ml를 20000mL Applikon 생물반응기 내에 식재하였다. 이어서, 배지 및 세포를 27℃에서 배양하고, 이후 68시간 동안 100RPM에서 교반하였다. 68시간 시점에, 41.3ml의 PCV2 ORF2 배큘로바이러스 MSV+3을 7000ml의 ExCell 420 배지에 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 생물반응기에 첨가하였다. 이후 7일 동안, 혼합물을 27℃에서 배양하고 100RPM에서 교반하였다. 감염후 4일부터 시작해서 24시간 마다 생물반응기로부터 샘플을 추출하여, 각각의 샘플을 원심분리하였다. 샘플의 상청액을 보존하고 나서, SDS-PAGE 농도측정법을 사용하여 ORF2의 양을 정량하였다. 이의 결과를 아래의 표 3에 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00003
실시예 4
본 실시예는 7개의 PCV2 후보 백신의 효능을 검사하고, PCV2의 병독성 바이러스주에의 노출후 효능 변수를 추가로 정의한다. 9 내지 14일령의 108마리의 CDCD (Cesarean Derived Colostrum Deprived) 새끼돼지를 동일한 크기의 9개 그룹으로 무작위 나누었다. 표 4에 본 실시예에 대한 전반적인 연구 설계를 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00004
7개의 그룹 (그룹 1 내지 7)에는 PCV2 ORF2 폴리펩티드를 투여하였고, 한 그룹은 시험감염 대조군으로서 역할을 하여 PCV2 ORF2를 투여하지 않았으며, 다른 한 그룹은 엄격한 음성 대조군으로서 역할을 하여 마찬가지로 PCV2 ORF2를 투여하지 않았다 . 0일에, 그룹 1 내지 7을 지정된 백신으로 처리하였다. 그룹 7의 새끼돼지는 14일에 부스터(booster) 처리를 하였다. 새끼돼지를 백신접종 후의 부작용 및 주사 부위 반응에 대해 관찰하고, 19일에 새끼돼지를 2차 연구 장소로 이동시켰다. 2차 연구 장소에서, 그룹 1 내지 8을 한 건물 내에서 사육하고, 그룹 9는 별도의 건물에서 사육하였다. 모든 돼지에게 21일 및 27일에 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)/불완전 프로인트 애주번트(ICFA)를 투여하고, 24일에 그룹 1 내지 8을 병독성 PCV2로 시험감염시켰다.
시험감염 전후에, PCV2 혈청검사를 위하여 혈액 샘플을 채취하였다. 시험감염 후, 평균 일일 증체량(ADWG; Average Daily Weight Gain)의 측정을 위한 체중 데이터 및 임상 증상 뿐만 아니라, PCV2의 코를 통한 배출(nasal shedding)을 측정하기 위한 비강 면봉 샘플을 수집하였다. 49일에, 생존한 모든 돼지를 부검하여, 폐를 병변에 따라 점수를 부여하고, 선택된 조직을 후일에 실시할 면역조직화학(IHC) 검사를 위하여 포르말린 중에 보존하였다.
재료 및 방법
이는 0일에 9 내지 14일령의 CDCD 돼지에서 수행한 부분 맹검 백신접종-시험감염 실행가능성 연구였다. 연구에 포함되기 위하여, 암퇘지의 PCV2 IFA 역가는 ≤1:1000이었다. 또한, 암퇘지의 혈청학적 상태는 공지된 PRRS-음성 무리로부터의 혈청학적 상태였다. 28마리의 암퇘지를 PCV2 혈청학적 상태에 대해 검사하였다. 14마리의 암퇘지는 PCV2 역가가 ≤1000이었고, 이들을 1차 연구 장소로 이동시켰다. 110마리의 새끼돼지가 제왕절개 수술에 의해 출산되었고, -4일에 본 연구에 이용가능하였다. -3일에, 1차 연구 장소에서 108마리의 CDCD 돼지의 체중을 측정하여, 귀 태그로 식별하고, 체중으로 블로킹(blocking)하여, 상기 표 4에 제시된 바와 같이, 9개의 그룹 중 하나에 무작위로 배정하였다. 포함 기준을 충족하는 임의의 검사 동물이 본 연구에 등록되었다가 이후에 어떤 이유로 제외된 경우에는, 연구자와 감독자가 상의하여 최종 분석에서 상기 동물로부터 수집된 데이터를 사용할지 결정하였다. 등록된 새끼돼지가 제외된 일자 및 제외 이유를 문서로서 기록하였다. 초기에는, 어떤 암퇘지도 제외되지 않았다. 이용가능한 110마리의 돼지 중에서 총 108마리를 -3일에 9개의 그룹 중 하나로 무작위로 배정하였다. 가장 작은 2마리의 돼지 (17번 및 19번)는 특정 그룹으로 배정되지 않고, 필요에 따라, 여분으로서 이용가능하였다. 연구 과정 동안, 다수의 동물이 제거되었다. -1일에 82번 돼지 (그룹 9), 3일에 56번 돼지 (그룹 6), 4일에 53번 돼지 (그룹 9), 8일에 28번 돼지 (그룹 8), 7일에 69번 돼지 (그룹 8) 및 9일에 93번 돼지 (그룹 4)는 각각 시험감염 전에 사망한 것으로 밝혀졌다. 이들 6마리 돼지는 최종 연구 결과에 포함되지 않았다. 17번 돼지 (여분의 돼지 중 한마리)를 그룹 9에 배정하였다. 나머지 여분의 19번 돼지는 본 연구에서 제외시켰다.
각각의 그룹에 투여된 제형은 다음과 같았다: 그룹 1은 16㎍ ORF2/ml를 함유하는 1ml의 바이러스 ORF2 (vORF2)가 투여되도록 설계하였다. 이는 10.24ml의 바이러스 ORF2 (256㎍/25㎍/ml = 10.24ml vORF2)를 3.2ml의 0.5% 카보폴 및 2.56ml의 인산염 완충 식염수 (pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 1을 위한 16ml의 제형이 생성되었다. 그룹 2는 8㎍ vORF2/ml를 함유하는 1ml의 vORF2가 투여되도록 설계하였다. 이는 5.12ml의 vORF2(128㎍/25㎍/ml = 5.12ml vORF2)를 3.2ml의 0.5% 카보폴 및 7.68ml의 인산염 완충 식염수 (pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 2를 위한 16ml의 제형이 생성되었다. 그룹 3은 4㎍ vORF2/ml를 함유하는 1ml의 vORF2가 투여되도록 설계하였다. 이는 2.56ml의 vORF2 (64㎍/25㎍/ml = 2.56ml vORF2)를 3.2ml의 0.5% 카보폴 및 10.24ml의 인산염 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 3을 위한 16ml의 제형이 생성되었다. 그룹 4는 16㎍ rORF2/ml를 함유하는 1ml의 재조합 ORF2 (rORF2)가 투여되도록 설계하였다. 이는 2.23ml의 rORF2 (512㎍/230㎍/ml = 2.23ml rORF2)를 6.4ml의 0.5% 카보폴 및 23.37ml의 인산염 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 4를 위한 32ml의 제형이 생성되었다. 그룹 5는 8㎍ rORF2/ml를 함유하는 1ml의 rORF2가 투여되도록 설계하였다. 이는 1.11ml의 rORF2 (256㎍/230㎍/ml = 1.11ml rORF2)를 6.4ml의 0.5% 카보폴 및 24.49ml의 인산염 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 5를 위한 32ml의 제형이 생성되었다. 그룹 6은 8㎍ rORF2/ml를 함유하는 1ml의 rORF2가 투여되도록 설계하였다. 이는 0.56ml의 rORF2 (128㎍/230㎍/ml = 0.56ml rORF2)를 6.4ml의 0.5% 카보폴 및 25.04ml의 인산염 완충 식염수(pH 7.4)와 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 6을 위한 32ml의 제형이 생성되었다. 그룹 7은 MAX PCV2 KV를 함유하는 2ml의 PCV2 사멸시킨 전체 세포 백신 (PCV2 KV)이 투여되도록 설계하였다. 이는 56ml의 PCV2 KV를 14ml의 0.5% 카보폴과 혼합하여 달성되었다. 이를 통해 그룹 7을 위한 70ml의 제형이 생성되었다. 마지막으로, 그룹 8은 2ml 용량 당 0.5 ㎍/ml 또는 1.0 ㎍/ml의 KLH가 투여되도록 설계하였다. 이는 40.71ml의 KLH (0.5㎍/ml에서 7.0㎍ 단백질/ml = 570ml (7.0 ㎍/ml)(x) = (0.5)(570 ml)), 244.29ml의 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 및 285ml의 프로인트 애주번트를 혼합하여 달성되었다. 표 5에 본 실시예의 주요 활동에 관한 시간 구성을 기술한다.
Figure 112008054816983-pct00005
본 연구의 생존기의 완료 후, 포르말린 고정된 조직은 면역조직화학(IHC)으로 병리학자에 의해 PCV2 항원의 검출에 대해 검사하고, 혈액 샘플은 PCV2 혈청검사에 대해 평가하고, 비강 면봉 샘플은 PCV2 배출에 대해 평가하고, 평균 일일 증체량(ADWG)은 24일에서부터 49일까지 측정하였다.
동물을 출생시부터 대략 11일령(대략 연구 0일차)까지 1차 연구 장소에서 5개의 방 안에 개별 우리에서 사육하였다. 각각의 방은 배치가 동일하고, 가열 여과된 공기가 각각의 분리 단위에 개별적으로 공급되는 쌓아 올려진 개개의 스테인리스 스틸 우리로 구성되었다. 각각의 방은 개별적으로 난방 및 환기시켜, 방 사이의 공기의 교차-오염을 방지하였다. 동물을 2차 연구 장소에서 2개의 상이한 건물 내에서 사육하였다. 그룹 9 (엄격한 음성 대조군)는 개조된 비육돈 건물에서 개별적으로 사육하고, 그룹 1 내지 8은 개조된 자돈 건물에서 사육하였다. 각각의 그룹을 별개의 축사 (축사 당 11 내지 12마리의 돼지)에서 사육하였고, 각각의 축사는 돼지 1마리당 대략 3.0 평방피트를 제공하였다. 각각의 축사는 플라스틱 슬레이트 바닥으로 된 높여진 덱(deck) 상에 위치하였다. 축사 아래의 구덩이는 배설물 및 폐기물용 오수 탱크로서 역할을 하였다. 각각의 건물은 별도의 난방 및 환기 시스템을 갖추어, 건물 사이의 공기의 교차-오염의 가능성이 거의 없었다.
1차 연구 장소에서, 새끼돼지는 출생시부터 대략 3주령까지 특제 우유 식이를 공급받았다. 모든 새끼돼지는 19일 (대략 4½ 주령)까지 특별 혼합된 고형 식이를 소비하였다. 2차 연구 장소에서, 모든 새끼돼지는 연령과 체중에 적합한 맞춤식 비-의료용 시판 혼합 식이를 자유롭게 공급받았다. 물도 두 연구 장소에서 모두 자유롭게 섭취하게 하였다.
모든 검사 돼지를 -2일에 비타민 E로 처리하고. -1일에는 철 주사로 처리하고, 16, 17, 18 및 19일에는 NAXCEL®(1.0 mL, IM, 허벅다리에 교대로)로 처리하였다. 또한, 다양한 건강상의 이유로, 돼지 52번 (그룹 9)은 3일에 철 주사로 처리하고, 돼지 45번 (그룹 6)은 11에 철 주사로 처리하고, 돼지 69번 (그룹 8)은 6일에 NAXCEL®로 처리하고, 돼지 74번 (그룹 3)은 14일에 덱사메타존 및 페니실린으로 처리하고, 돼지 51번 (그룹 1)은 13일에 덱사메타존 및 페니실린으로 처리하고 14일에 NAXCEL®로 처리하였다.
두 연구 장소에서 모두, 돼지는 수의학적 관리 하에 있었다. 동물 건강 검사를 0일에 수행하여 "건강 검사 기록 양식"에 기록하였다. 모든 동물은 0일차 관찰에서 판정된 바와 같이 백신접종 전에 건강 상태와 영양 상태가 우수하였다. 모든 검사 동물은 시험감염 전에 건강 상태와 영양 상태가 우수한 것으로 관찰되었다. 사체 및 조직은 렌더링(rendering)으로 처분하였다. 연구 동물의 최종 처분은 "동물 처분 기록"에 기록하였다.
0일에, 그룹 1 내지 6에 배정된 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락(Luer-lock) 주사기 및 멸균 20g x ½" 바늘을 사용하여 왼쪽 목 부위에 각각 1.0ml의 PCV2 백신 1 내지 6을 IM 투여하였다. 그룹 7에 배정된 돼지에는 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x ½" 바늘을 사용하여 왼쪽 목 부위에 2.0ml의 PCV2 백신 7번을 IM 투여하였다. 14일에는, 그룹 7에 배정된 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x ½" 바늘을 사용하여 오른쪽 목 부위에 2.0ml의 PCV2 백신 7번을 IM 투여하였다.
21일에는, 모든 검사 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 오른쪽 허벅다리 부위에 2.0ml의 KLH/ICFA를 IM 투여하였다. 27일에는, 모든 검사 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 왼쪽 허벅다리 부위에 2.0ml의 KLH/ICFA를 투여하였다.
24일에는, 그룹 1 내지 8로 배정된 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 왼쪽 목 부위에 1.0ml의 PCV2 ISUVDL 시험감염 물질 (5.11 log10 TCID50/mL)을 IM 투여하였다. 추가의 1.0ml의 동일한 물질을 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 비강 캐뉼러(nasal canula)를 사용하여 각각의 돼지에 IN 투여하였다 (콧구멍 당 0.5ml).
검사 돼지를 -4일 및 0일 내지 19일에 전반적인 건강상태 및 부작용에 대해 매일 관찰하였다. 관찰 결과를 "임상 관찰 기록"에 기록하였다. 모든 검사 돼지를 주사 부위 반응에 대해 0일 내지 7일에 관찰하였고, 그룹 7은 14일 내지 21일에 추가로 관찰하였다. 평균 일일 증체량은, -3, 24 및 49일에, 또는 시험감염 후 돼지가 사망한 일자에, 보정된 체중계에서 각각의 돼지의 체중을 측정하여 계산하였다. 체중을 "체중 양식"에 기록하였다. -3일의 체중을 사용하여, 무작위화하기 전에 돼지를 블로킹하였다. 24일 및 49일의 체중 데이터를 사용하여, 이 시점 동안의 각각의 돼지에 대한 평균 일일 증체량(ADWG)을 계산하였다. 시험감염 후 및 49일 이전에 사망한 돼지의 경우, 24일에서부터 사망일까지의 ADWG를 나타내도록 ADWG를 조정하였다.
PCV2 혈청검사를 위하여, -3일 및 14일에 각각의 새끼돼지의 안와 정맥동(orbital venous sinus)으로부터 정맥 전혈을 채취하였다. 각각의 새끼돼지에서, 멸균 모세관을 한쪽 눈의 내측 안각(medial canthus) 속으로 삽입하고 대략 3.0ml의 전혈을 4.0 mL 혈청 분리관(SST; Serum Separator Tube) 속으로 유출시켜 안와 정맥동으로부터 혈액을 채취하였다. 24, 31 및 49일에, 멸균 18g x 1½" Vacutainer 바늘[판매원: Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey], Vacutainer 바늘 홀더 및 13 mL SST를 사용하여 각각의 돼지에서 전대정맥(anterior vena cava)으로부터 정맥 전혈을 채취하였다. 각 시점에서의 혈액 채취를 "샘플 채취 기록"에 기록하였다. 각각의 SST 내의 혈액을 응고시키고 나서, 각각의 SST를 스핀 다운(spin down)시키고 혈청을 회수하였다. 회수된 혈청을 멸균 스냅 관(snap tube)으로 이동시키고, 후일에 검사할 때까지 -70±10℃에서 보관하였다. 혈청 샘플을 BIVI-R&D 인력에 의해 PCV2 항체의 존재에 대해 검사하였다.
돼지를 20일에서부터 49일까지 매일 1회 임상 증상을 관찰하고, 임상 관찰결과를 "임상 관찰 기록"에 기록하였다.
코를 통한 PCV2 배출을 검사하기 위하여, 24, 25일 및 최대 49일까지 홀수 연구일에, 멸균 데이크론(dacron) 면봉을 가능한 무균상태로 각각의 돼지의 왼쪽 또는 오른쪽 콧구멍 속으로 비강내 삽입하여 (돼지 당 1개의 면봉), 수초 동안 돌리고 나서 제거하였다. 이어서, 각각의 면봉을 2% IFBS, 500 단위/ml의 페니실린, 500㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2.5㎍/ml의 펀지존(Fungizone)을 함유하는 1.0ml의 EMEM 배지를 함유하는 단일 멸균 스냅-캡(snap-cap) 관 속에 넣었다. 면봉을 관 안에서 부러뜨리고, 스냅 관을 밀봉하여, 동물 번호, 연구 번호, 수거 일자, 연구일 및 "비강 면봉"으로 적당하게 표지하였다. 밀봉된 스냅 관을 얼음 상에서 하룻밤 동안 BIVI-St. Joseph으로 수송될 때까지 -40±10℃에서 보관하였다. 비강 면봉 수거는 "비강 면봉 샘플 수거 양식"에 기록하였다. BIVI-R&D에서 비강 면봉 샘플에 대해 PCV2에 대한 정량적 바이러스 분리(VI) 검사를 수행하였다. 결과를 log10 값으로 표현하였다. 1.3 log 이하의 값은 음성으로 간주하고, 1.3 log를 초과하는 임의의 값은 양성으로 간주하였다.
1차 연구 장소에서 사망한 돼지 (28, 52, 56, 69, 82 및 93번)를 확진하는데 필요한 수준까지 부검하였다. 육안 병변을 기록하고, 이들 돼지로부터의 조직은 유지시키지 않았다. 2차 연구 장소에서, 49일 이전에 사망한 돼지 (45, 23, 58, 35번), 49일에 안락사 전에 사망한 돼지 (2, 43번) 및 49일에 안락사시킨 돼지를 부검하였다. 임의의 육안 병변을 관찰하고, 병변이 존재하는 폐엽의 %를 "부검 기록 양식"에 기록하였다.
2차 연구 장소에서 부검된 각각의 103마리의 돼지로부터, 편도선, 폐, 심장, 간, 장간막 림프절, 신장 및 서혜부 림프절의 조직 샘플을 채취하여 완충된 10% 포르말린을 함유하는 단일 용기 안에 넣고, 앞서 언급한 동일한 기관으로부터의 다른 조직 샘플은 Whirl-pak[판매원: M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK] 안에 넣어, 각각의 Whirl-pak을 얼음 위에 위치시켰다. 각각의 용기를 적당하게 표지하였다. 샘플 채취를 "부검 기록 양식"에 기록하였다. 이후, IHC 검사를 위하여, 포르말린-고정된 조직 샘플 및 진단 요청 양식을 제출하였다. IHC 검사는 샘플 접수, 샘플과 슬라이드의 제조 및 염색 기술에 관한 표준 ISU 실험실 절차에 따라 수행하였다. Whirl-pak 내의 새로운 조직을 보관(-70±10℃) 및 이후의 사용을 위하여 얼음 팩과 함께 연구 감독자에게 발송하였다. 포르말린-고정된 조직을 병리학자가 IHC로 PCV2의 검출에 대해 검사하고, 다음의 점수부여 시스템을 사용하여 점수를 부여하였다: 0 = 없음; 1 = 매우 적은 부위에서 불충분한 양성 염색; 2 = 다수의 부위에서 보통의 양성 염색; 및 3 = 조직 전체에 산재한 충분한 양성 염색. 병리학자가 서혜부 LN을 장간막 LN으로부터 명확하게 구별할 수 없었다는 사실로 인하여, 이들 조직에 대한 결과를 단순히 림프절로서 표지하였고, 점수는 동물 당 2개의 각각의 조직에 대한 가장 높은 점수로서 부여하였다.
결과
본 실시예의 결과는 아래에 제시되어 있다. 그룹 9로부터의 1마리 돼지는 0일 전에 사망하였고, 백신접종후 5마리가 추가로 사망하였다는 것을 유의하여야 한다 (그룹 4로부터의 1마리 돼지; 그룹 6으로부터의 1마리 돼지; 그룹 8로부터 2마리 돼지; 및 그룹 9로부터 1마리 돼지). 사후 검사에서 상기 6마리 모두는 백신접종 또는 PMWS와 관련이 없는 기초 감염으로 인하여 사망한 것으로 나타났다. 또한, 어떤 그룹에서도 부작용 또는 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다.
평균 일일 증체량(ADWG) 결과를 아래의 표 6에 제시한다. 엄격한 음성 대조군인 그룹 9의 ADWG가 가장 높았고 (1.06±0.17 lbs/일), 8㎍의 rORF2의 1회 용량을 투여받은 그룹 5가 그 다음으로 높았다 (0.94±0.22 lbs/일). 4㎍의 vORF2의 1회 용량을 투여받은 그룹 3의 ADWG가 가장 낮았고 (0.49±0.21 lbs/일), 2회 용량의 사멸시킨 백신을 투여받은 그룹 7이 그 다음으로 낮았다 (0.50±0.15 lbs/일).
Figure 112008054816983-pct00006
PCV2 혈청검사 결과는 아래의 표 7에 제시되어 있다. 9개의 그룹 모두는 -3일에 PCV2에 대하여 혈청음성이었다. 14일에, vORF2 백신을 투여받는 그룹은 역가가 187.5 내지 529.2의 범위로 가장 높았다. 사멸시킨 바이러스 백신을 투여받는 돼지는 역가가 그 다음으로 높았고, rORF2 백신을 투여받는 그룹이 그 다음이었다. 그룹 8 및 9는 이 시점에 여전히 혈청음성이었다. 24일 및 31일에, vORF2 백신을 투여받는 돼지는 강한 혈청 반응을 계속적으로 나타내었고, 2회 용량의 사멸시킨 바이러스 백신을 투여받은 그룹이 바로 그 다음이었다. rORF2 백신을 투여받는 돼지는 느리게 혈청 반응을 나타내었고, 그룹 8 및 9는 계속 혈청음성이었다. 49일에, vORF2 백신, 2회 용량의 사멸시킨 바이러스 백신 및 가장 낮은 용량의 rORF2를 투여받는 돼지는 가장 강한 혈청 반응을 나타내었다. 16㎍ 및 8㎍의 rORF2 백신을 투여받는 돼지는 시험감염 대조군보다 IFA 역가가 약간 높았다. 그룹 9는 49일에 강한 혈청 반응을 나타내었다.
Figure 112008054816983-pct00007
시험감염후 임상 관찰 결과를 아래의 표 8에 제시한다. 이 결과의 요약에는 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침 및 설사에 대한 관찰결과가 포함되어 있다. 표 9는 임상 증상의 그룹 전체 발생률의 요약 결과를 포함하고, 표 10은 시험감염후 그룹 사망률의 요약 결과를 포함한다. 본 연구에서 관찰된 가장 일반적인 임상 증상은 비정상적 행동이었고, 이는 경증 내지 중증 무기력으로 점수부여되었다. 두가지의 낮은 용량의 vORF2를 투여받는 돼지, 16㎍의 rORF2를 투여받는 돼지 및 2회 용량의 KV 백신을 투여받는 돼지의 발병률은 27.3% 이상이었다. 8㎍의 rORF2를 투여받는 돼지 및 엄격한 음성 대조군은 비정상적 행동을 보이지 않았다. 본 연구에서 어떤 돼지도 비정상적 호흡을 나타내지 않았다. 기침은 모든 그룹에서 빈번하게 관찰되었고 (0 내지 25%), 설사도 마찬가지였다 (0 내지 20%). 관찰된 어떤 임상 증상도 PMWS에 대해 특징적이지 않았다.
임상 증상의 전체 발생률은 그룹 간에 차이가 있었다. 임의의 vORF2 백신을 투여받는 그룹, 16㎍의 rORF2를 투여받는 그룹, 2회 용량의 KV 백신을 투여받는 그룹 및 시험감염 대조군의 전체 임상 증상 발생률이 가장 높았다 (≥36.4%). 엄격한 음성 대조군, 8㎍의 rORF2를 투여받는 그룹 및 4 ㎍의 rORF2를 투여받는 그룹의 전체 임상 증상 발생률은 각각 0%, 8.3% 및 9.1%였다.
전체 사망률도 그룹 간에 차이가 있었다. 2회 용량의 KV 백신을 투여받는 그룹의 사망률이 가장 높았고 (16.7%); 4㎍의 vORF2, 16㎍의 rORF2 또는 8㎍의 rORF2를 투여받는 그룹 및 엄격한 음성 대조군의 사망률은 모두 0%였다.
Figure 112008054816983-pct00008
Figure 112008054816983-pct00009
Figure 112008054816983-pct00010
코를 통한 PCV2 배출의 결과를 아래의 표 11에 제시한다. 24일에 시험감염시킨 후, 그룹 7의 한마리는 27일에 PCV2를 배출하기 시작하였다. 다른 그룹은 33일까지 배출을 나타내지 않았다. 코를 통한 배출의 대부분은 35일 내지 45일에 관찰되었다. 임의의 3가지의 vORF2 백신을 투여받는 그룹 및 4 또는 8㎍의 rORF2를 투여받는 그룹은 코를 통한 PCV2 배출의 발생률이 가장 낮았다 (≤ 9.l%). 시험감염 대조군(그룹 8)의 배출률이 가장 높았고 (80%), 엄격한 음성 대조군(그룹 9)의 발생률은 63.6%로 그 다음이었다.
Figure 112008054816983-pct00011
황달의 그룹 발생률, 위궤양의 그룹 발생률, 그룹 평균 폐 병변 점수 및 폐 병변의 그룹 발생률의 요약을 아래의 표 12에 제시한다. 6마리의 돼지는 본 연구의 백신접종후 단계 동안 1차 검사 장소에서 사망하였다 (그룹 4, N=1; 그룹 6, N=1; 그룹 8, N=2; 그룹 9, N=2). 6마리 돼지 중에서 4마리는 한곳 이상의 체강에 섬유소성 병변이 있었고, 1마리 돼지(그룹 6)는 클로스트리디움병과 일치하는 병변이 있었으며, 1마리 돼지(그룹 9)는 육안 병변이 없었다. 본 연구의 백신접종후 단계 동안 사망한 어떤 돼지에도 PMWS와 일치하는 병변이 없었다.
시험감염후 사망한 돼지 및 49일에 안락사시킨 돼지를 부검하였다. 부검에서, 어느 그룹에도 황달 및 위궤양이 존재하지 않았다. 평균 % 폐 병변과 관련하여, 그룹 9의 평균 % 폐 병변이 가장 낮았고 (0%), 그 다음으로 그룹 1은 0.40±0.50%였고, 그룹 5는 0.68±1.15%였다. 그룹 2, 3, 7 및 8의 평균 % 폐 병변이 가장 높았다 (≥ 7.27%). 이들 4개의 그룹에는 % 폐 병변이 71.5% 이상인 돼지가 각각 1마리씩 있어서, 이들 4개의 그룹의 결과값이 높아졌다. 0% 폐 병변이 관찰된 그룹 9를 제외하고, 나머지 8개 그룹의 폐 병변 %는 ≤36%였다. 관찰된 거의 모든 폐 병변은 적색/자색이었고 경화되어 있었다.
Figure 112008054816983-pct00012
그룹 IHC 양성 발생률 결과의 요약을 아래의 표 13에 제시한다. 그룹1 (vORF2 - 16㎍) 및 그룹 5 (rORF2 - 8㎍)의 IHC 양성 결과 비율이 가장 낮았다 (16.7%). 그룹 8 (시험감염 대조군) 및 그룹 9 (엄격한 음성 대조군)의 IHC 양성 결과 비율은 각각 90% 및 90.9%로 가장 높았다.
시험감염후, 8㎍의 rORF2 항원의 1회 용량을 투여받은 그룹 5는 다른 6개의 백신 그룹보다 결과가 우수하였다. 그룹 5는 ADWG가 가장 높았고 (0.94±0.22 lbs/일), 비정상적 행동 발생률이 가장 낮았으며 (0%), 기침 발생률은 두번째로 낮았고 (8.3%), 전체 임상 증상 발생률은 가장 낮았고 (8.3%), 사망률은 가장 낮았고 (0%), 코를 통한 PCV2 배출률은 가장 낮았고 (8.3%), 평균 % 폐 병변 발생률은 두번째로 낮았고 (0.68±1.15%), 양성 조직 발생률은 가장 낮았다 (16.7%). 다양한 수준의 rORF2 항원을 투여받는 그룹은 다양한 수준의 vORF2를 투여받는 그룹보다 결과가 전반적으로 우수하였고, 2회 용량의 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신을 투여받는 그룹의 결과가 가장 좋지 않았다. 표 14 및 15에 그룹 시험감염후 데이터의 요약을 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00014
Figure 112008054816983-pct00015
본 연구의 결과는 앞으로의 모든 백신 개발 노력을 rORF2 백신에 집중시켜야 한다는 것을 나타낸다. 전체적으로, 코를 통한 PCV2 배출이 시험감염 후에 검출되었고, PCV2 백신을 사용한 백신접종으로 배출이 감소되었다. 선택된 림프 조직의 면역조직화학도 백신 효능에 대한 변수로서 중요한 역할을 하였지만, 그룹 간에 ADWG, 임상 증상 및 육안 병변의 큰 차이는 검출되지 않았다. 본 연구는, 엄격한 음성 대조군인 그룹 9에서의 코를 통한 PCV2 배출, PCV2 혈청전환 및 양성 IHC 조직에 의해 증명되는 바와 같이, 연구 동안의 어느 시점에 외부로부터 PCV2가 도입되었다는 사실에 의해 복잡하게 되었다.
고찰
7개의 PCV2 백신을 본 연구에서 평가하였고, 여기에는 0일에 1회 투여된 3가지의 상이한 용량 수준의 vORF2, 0일에 1회 투여된 3가지의 상이한 용량 수준의 rORF2 항원 및 0일과 14일에 투여된 1가지 용량 수준의 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신이 포함되었다. 전체적으로, 8㎍의 rORF2 항원을 함유하는 1회 용량의 백신을 투여받은 그룹 5의 결과가 가장 우수하였다. 그룹 5는 ADWG가 가장 높았고, 비정상적 행동 발생률은 가장 낮았으며, 비정상적 호흡 발생률은 가장 낮았고, 기침 발생률은 두번째로 낮았고, 전체 임상 증상 발생률은 가장 낮았고, 사망률은 가장 낮았고, 코를 통한 PCV2 배출률은 가장 낮았고, 평균 % 폐 병변 발생률은 두번째로 낮았고, 양성 IHC 조직 발생률은 가장 낮았다.
흥미롭게도, 그룹 5보다 높은 용량의 rORF2 항원을 투여받은 그룹 4의 결과는 그룹 5보다 좋지 않았다. 그룹 4는 그룹 5보다 ADWG는 약간 낮았고, 비정상적 행동 발생률은 더 높았고, 전체 임상 증상 발생률은 더 높았고, 코를 통한 PCV2 배출률은 더 높았고, 평균 % 폐 병변은 더 높았고, 양성 IHC 조직 발생률은 더 높았다. 이들 두 그룹 간의 차이가 통계학적으로 유의적이지 않다는 것을 나타낼 수 있는 통계 분석은 이들 데이터에 대해 수행되지 않았지만, 그룹 4의 결과가 그룹 5만큼 좋지 않다는 경향이 관찰되었다.
백신접종 후, 6마리의 돼지가 1차 연구 장소에서 사망하였다. 이들 6마리 중 4마리는 백신을 투여받지 않은 그룹 8 또는 그룹 9의 돼지였다. 이들 6마리는 모두 PMWS와 일치하는 병변을 나타내지 않았고, 부작용이 보고되지 않아, 종합적으로, 7개의 백신 모두는 대략 11일령의 돼지에게 투여되는 경우 안전한 것 같다. 본 연구의 백신접종후 단계 동안, 3가지 용량 수준의 vORF2 백신 또는 사멸시킨 전체 세포 백신을 투여받는 돼지의 IFAT 수준이 가장 높았고, 그룹 5의 IFAT 수준은 시험감염 직전에 백신 그룹 중에서 가장 낮았다.
공식적으로 입증되지는 않았지만, 이유 직후에 어린 돼지로의 PCV2의 주요 전염 경로는 구비강(oronasal) 직접 접촉인 것으로 생각되고, 생산 시설에서 코를 통한 PCV2 배출을 감소시키는 효능있는 백신은 감염의 확산을 통제하는데 도움이 될 것이다. 3가지의 vORF2 항원 수준 중 하나를 투여받는 그룹 및 8㎍의 rORF2를 투여받는 그룹은 코를 통한 PCV2 배출률이 가장 낮았다 (8.3%). 예상대로, 시험감염 대조군은 코를 통한 배출률이 가장 높았다 (80%).
PCV2 감염에 대해 2차적인 PMWS를 나타내는 돼지에서 육안 병변은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 동반한 전신 림프절병증으로 이루어진다: (1) 소엽사이 부종을 동반한 간질성 폐렴, (2) 창백한 피부 또는 황달, (3) 반점이 있는 위축성 간, (4) 위궤양 및 (5) 신장염. 부검에서, 황달, 간염, 신장염 및 위궤양은 어느 그룹에서도 관찰되지 않았고, 림프절병증은 구체적으로 검사되지 않았다. 평균 % 폐 병변 점수는 그룹 간에 차이가 있었다. 16㎍의 vORF2 항원을 투여받는 그룹의 평균 % 폐 병변 점수가 가장 낮았고 (0.40±0.50%), 8㎍의 rORF2를 투여받은 그룹이 그 다음으로 낮았다 (0.68±1.15%). 예상된 바와 같이, 시험감염 대조군의 평균 % 폐 병변 점수가 가장 높았다 (9.88±29.2%). 4개의 그룹 모두에서, 이들 그룹에 폐 병변 점수가 매우 높은 돼지가 한 마리씩 있어서 평균 % 폐 병변 점수가 상승하였다. 대부분의 폐 병변은 적색/자색이었고 경화되어 있었다. 통상적으로, PMWS와 관련된 폐 병변은 황갈색이었고, 소엽사이 부종이 있으며 비-허탈성(non-collapsible)이었다. 본 연구에서 관찰된 폐 병변은 PCV2 감염과 관련이 없거나, 2차적인 폐 감염원이 존재했을 수 있다. 본 연구에 있어서, % 폐 병변 점수는 아마도 PCV2로 인한 폐 감염의 정확한 측정량을 반영하지 못할 것이다.
다른 연구자들은 IHC에 의한 PCV2 항원의 존재와 조직병리검사 사이의 직접적인 상관관계를 증명하였다. 선택된 조직에 대한 조직병리검사는 본 연구에서 수행되지 않았다. 그룹 1 (16㎍의 vORF2) 및 그룹 5 (8㎍의 rORF2)는 PCV2 항원에 대해 양성인 돼지의 발생률이 가장 낮았고 (8.3%), 그룹 9 (엄격한 음성 대조군 - 90.9%) 및 그룹 8 (시험감염 대조군 - 90.0%)은 PCV2 항원에 대해 양성인 돼지의 발생률이 가장 높았다. 본 시험의 비-주관적인 특성으로 인하여, IHC 결과는 아마도 백신 효능을 판단하는데 가장 좋은 변수 중 하나일 것이다.
따라서, 본 발명의 한가지 양상에서, 추출된 PCV2 ORF2 (rORF2) 항원을 함유하는 1ml/1회용량의 재조합 산물의 PCV2 시험감염에 대한 최소 보호 용량(MPD; Minimum Portective Dosage)을 CDCD 돼지 모델에서 측정하였다. 다양한 수준의 rORF2 항원을 투여받은 3개의 그룹 중에서, 그룹 5 (8㎍의 rORF2 항원)의 보호 수준이 명확하게 가장 높았다. 그룹 5는 검사한 모든 변수와 관련하여 결과가 가장 우수하거나 가장 유리한 결과에 필적하였다. 시험감염후 그룹 5를 다른 6개의 백신 그룹과 비교한 경우, 그룹 5는 ADWG가 가장 높았고 (0.94±0.22 lbs/일), 비정상적 행동 발생률은 가장 낮았으며 (0%), 기침 발생률은 두번째로 낮았고 (8.3%), 전체 임상 증상의 발생률은 가장 낮았고 (8.3%), 사망률은 가장 낮았고 (0%), 코를 통한 PCV2 배출률은 가장 낮았고 (8.3%), 평균 % 폐 병변 발생률은 두번째로 낮았고 (0.68±1.15%), 양성 IHC 조직 발생률은 가장 낮았다 (16.7%).
본 발명의 다른 양상에서, 부분 정제된 PCV2 ORF2 (vORF2) 항원인 1ml/1회용량의 통상적인 산물의 PCV2 시험감염에 대한 MPD를 CDCD 돼지 모델에서 측정하였다. 다양한 수준의 vORF2 항원을 투여받은 3개의 그룹 중에서, 그룹 1 (16㎍의 vORF2 항원)의 보호 수준이 가장 높았다. 그룹 1은 ADWG, 평균 % 폐 병변 및 IHC와 관련하여 그룹 2 및 3보다 결과가 우수하였다. 그룹 1 및 2 (8㎍의 vORF2 항원)는 임상 증상의 전체 발생률과 관련하여 결과가 동등하였고, 그룹 3 (4㎍의 vORF2 항원)의 사망률이 가장 낮았으며, 3개의 그룹 모두는 코를 통한 배출과 관련하여 결과가 동등하였다. 전체적으로, vORF 백신은 rORF 백신만큼 우수하지 않았다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 2ml/2회용량의 통상의 사멸시킨 PCV2 백신의 최대 용량의 PCV2 시험감염에 대한 효능을 CDCD 돼지 모델에서 측정하였다. 본 연구에서 평가된 7개의 백신 중에서, 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신의 결과가 가장 좋지 않았다. 2회 용량의 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신을 투여받는 새끼돼지는 ADWG가 가장 낮았고, 비정상적 행동 발생률은 두번째로 높았으며 (58.3%), 임상 증상의 전체 발생률은 두번째로 높았고 (58.3%), 사망률은 가장 높았고 (16.7%), 코를 통한 배출률은 두번째로 높았고 (41.7%), 평균 % 폐 병변은 가장 높았고 (9.88±29.2%), 관찰된 폐 병변의 발생률은 높았고 (75%), 조직 내의 IHC 발생률은 보통이었다 (41.7%). 하지만, 이는 면역 반응을 유발하는데 여전히 효과적이었다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 코를 통한 PCV2 배출을 효능 변수로서 평가하였고, 이전의 연구로부터의 이전의 PCV2 효능 변수를 재확인하였다. 본 연구로부터의 결과는 코를 통한 PCV2의 배출이 비강내 시험감염 후에 발생하고, PCV2 백신은 시험감염후 코를 통한 PCV2의 배출을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 본 연구로부터의 결과 및 기존 문헌상의 보고는 IHC가 이후의 PCV2 백신 시험에서도 계속 평가되어야 한다는 것을 나타낸다.
본 연구로부터 도출되는 일부 추가적인 결론은 림프절병증이 PMWS의 특징 중의 하나라는 것이다. PMWS의 특징 중의 또다른 하나는 림프 고갈 및 다핵화/거대 조직구이다. 또한, 7개의 모든 PCV2 백신에 대하여 부작용 또는 주사 부위 반응이 관찰되지 않았고, 7개의 PCV2 백신 모두는 어린 돼지에 투여되는 경우에 안전한 것 같다.
실시예 5
본 실시예는 8개의 PCV2 후보 백신의 효능을 검사하고, PCV2의 병독성 바이러스주에의 노출 후 이전의 시험감염 연구로부터의 PCV2 시험감염 변수를 재확인한다. 6 내지 16일령의 CDCD(Cesarean Derived Colostrum Deprived) 새끼돼지 150마리를 체중으로 블로킹하여 같은 크기의 10개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 표 16에 본 실시예에 대한 전반적인 연구 설계를 제시한다.
Figure 112008054816983-pct00016
각각의 그룹에 투여된 백신 제형은 다음과 같았다. 그룹 1에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 1번은 IMS 1314로 면역보강된 고용량 (16㎍/2ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다 (16㎍ rORF2 - IMS 1314). 그룹 2에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 2번은 카보폴로 면역보강된 고용량 (16㎍/2ml 용량)의 부분 정제된 VIDO R-1 생성된 PCV2 ORF2 항원이었다 (16㎍ vORF2 - 카보폴). 그룹 3에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 3번은 카보폴로 면역보강된 고용량 (16㎍/2ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다 (16㎍ rORF2 - 카보폴). 그룹 4에 1 x 1ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 4번은 카보폴로 면역보강된 고용량 (16㎍/1ml 용량)의 부분 정제된 VIDO R-1 생성된 PCV2 ORF2 항원이었다 (16㎍ vORF2 - 카보폴). 그룹 5에 1 x 2ml 용량으로 투여된 백신 5번은 카보폴로 면역보강된 4㎍/2ml 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다 (4㎍ rORF2 - 카보폴). 그룹 6에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 6번은 카보폴로 면역보강된 1㎍/2ml 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다 (1㎍ rORF2 - 카보폴). 그룹 7에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 7번은 카보폴로 면역보강된 저용량 (0.25㎍/2ml 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원이었다 (0.25㎍ rORF2 - 카보폴). 그룹 8에 1 x 2ml 용량으로 투여된 PCV2 백신 8번은 카보폴로 면역보강된 고용량 (불활성화전 역가 > 8.0 log/2ml 용량)의 불활성화된 통상의 사멸시킨 VIDO R-1 생성된 PCV2 Struve 항원이었다 (>8.0 log KV - 카보폴). 0일에, 그룹 1 내지 8을 지정된 백신으로 처리하였다. 그룹 1 내지 3 및 5 내지 8은 14일에 다시 각 그룹 백신의 부스터 처리를 받았다. 단일 용량의 16㎍의 vORF2 - 카보폴의 유효성을 14일에 부스터 처리를 받지 않은 그룹 4에 대해 검사하였다. 새끼돼지를 2회의 백신접종후 부작용 및 주사 부위 반응에 대해 관찰하였다. 21일에, 새끼돼지를 2차 연구 장소로 이동시켜, 여기서 그룹 1 내지 9는 한 건물 내에서 집단 사육하고, 그룹 10은 별도의 건물에서 사육하였다. 모든 돼지에 22일과 28일에 불완전 프로인트 애주번트로 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH/ICFA)을 투여하였다. 25일에, 그룹 1 내지 9를 대략 4 log의 병독성 PCV2 바이러스로 시험감염시켰다. 46일까지, 시험감염 대조군에서는 사망이 거의 발생하지 않았다. 돼지를 면역촉진시키고 PCV2 시험감염 물질의 병독성을 증가시키기 위하여, 모든 그룹을 46일에 INGELVAC® PRRSV MLV (돼지 생식기 및 호흡기 백신, 변형된 살아있는 바이러스)로 처리하였다.
PCV2 혈청검사를 위하여 시험감염 전후에 혈액 샘플을 채취하였다. 시험감염 후, 평균 일일 증체량(ADWG)의 측정을 위한 체중 데이터 및 임상 징후의 관찰결과를 수집하였다. 50일에, 생존한 모든 돼지를 부검하여, 육안 병변을 기록하고, 폐를 병리학적 상태에 따라 점수를 부여하였으며, 선택된 조직을 후일에 실시할 PCV2 항원의 검출을 위한 면역조직화학(IHC) 검사를 위하여 포르말린 중에 보존하였다.
재료 및 방법
이는 0일에 6 내지 16일령의 CDCD 돼지에서 수행한 부분 맹검 백신접종-시험감염 실행가능성 연구였다. 연구에 포함되기 위하여, 암퇘지의 PCV2 IFA 역가는 ≤1:1000이었다. 또한, 암퇘지의 혈청학적 상태는 공지된 PRRS-음성 무리로부터의 혈청학적 상태였다. 16마리의 암퇘지를 PCV2 혈청학적 상태에 대해 검사하였고, 16마리 모두는 PCV2 역가가 ≤1000이었으며, 이들을 1차 연구 장소로 이동시켰다. 150마리의 새끼돼지가 제왕절개 수술에 의해 출산되었고, -3일에 본 연구에 이용가능하였다. -3일에, 1차 연구 장소에서 150마리의 CDCD 돼지의 체중을 측정하여, 귀 태그로 식별하고, 체중으로 블로킹하여, 상기 표 16에 제시된 바와 같이, 10개의 그룹 중 하나에 무작위로 배정하였다. 혈액 샘플을 모든 돼지로부터 채취하였다. 포함 기준을 충족하는 임의의 검사 동물이 본 연구에 등록되었다가 이후에 어떤 이유로 제외된 경우에는, 연구자와 감독자가 상의하여 최종 분석에서 상기 동물로부터 수집된 데이터를 사용할지 결정하였다. 등록된 새끼돼지가 제외된 일자 및 제외 이유를 문서로서 기록하였다. 포함 기준을 충족하여 본 연구를 위하여 선택되고 1차 연구 장소로 이동된 암퇘지 중 어느 암퇘지도 제외되지 않았다. 어느 새끼돼지도 본 연구로부터 제외되지 않았고, 어느 검사 동물도 연구종결 전에 연구로부터 제거되지 않았다. 표 17에 본 실시예의 주요 활동에 관한 시간 구성을 기술한다.
Figure 112008054816983-pct00017
본 연구의 생존기의 완료 후, 포르말린 고정된 조직은 면역조직화학(IHC)으로 병리학자에 의해 PCV2 항원의 검출에 대해 검사하고, 혈액 샘플은 PCV2 혈청검사에 대해 평가하고, 평균 일일 증체량(ADWG)은 25일에서부터 50일까지 측정하였다.
동물을 출생시부터 대략 11일령(대략 연구 0일차)까지 1차 연구 장소에서 7개의 방 안에 개별 우리에서 사육하였다. 각각의 방은 배치가 동일하고, 가열 여과된 공기가 각각의 분리 단위에 개별적으로 공급되는 쌓아 올려진 개개의 스테인리스 스틸 우리로 구성되었다. 각각의 방은 개별적으로 난방 및 환기시켜, 방 사이의 공기의 교차-오염을 방지하였다. 동물을 2차 연구 장소에서 2개의 상이한 건물 내에서 사육하였다. 그룹 10 (엄격한 음성 대조군)은 개조된 자돈 건물에서 개별적으로 사육하고, 그룹 1 내지 9는 개조된 분만 건물에서 사육하였다. 각각의 그룹을 별개의 축사 (축사 당 14 내지 15마리의 돼지)에서 사육하였고, 각각의 축사는 돼지 1마리당 대략 2.3 평방피트를 제공하였다. 그룹 2, 4 및 8은 한쪽 통로의 3개의 인접한 우리에서 사육하였고, 그룹 1, 3, 5, 6, 7 및 9는 반대쪽 통로의 6개의 인접하는 우리에서 사육하였다. 그룹을 분리한 것은 그룹 2, 4 및 8에 투여된 백신이 완전하게 불활성화되지 않았다는 연구 감독자의 우려 때문이었다. 각각의 축사는 플라스틱 슬레이트 바닥으로 된 높여진 덱(deck) 상에 위치하였다. 축사 아래의 구덩이는 배설물 및 폐기물용 오수 탱크로서 역할을 하였다. 각각의 건물은 별도의 난방 및 환기 시스템을 갖추어, 건물 사이의 공기의 교차-오염의 가능성이 거의 없었다.
1차 연구 장소에서, 새끼돼지는 출생시부터 대략 3주령까지 특제 우유 식이를 공급받았다. 모든 새끼돼지는 21일 (대략 4½ 주령)까지 특별 혼합된 고형 식이를 소비하였다. 2차 연구 장소에서, 모든 새끼돼지는 연령과 체중에 적합한 맞춤식 비-의료용 시판 혼합 식이를 자유롭게 공급받았다. 물도 두 연구 장소에서 모두 자유롭게 섭취하게 하였다.
모든 검사 돼지를 19, 20 및 21일에 1.0 mL의 NAXCEL®을 사용하여 허벅다리에 교대로 IM 처리하였다. 또한, 다양한 건강상의 이유로, 돼지 11번 (그룹 1)은 10일에 0.5 mL의 NAXCEL®로 IM 처리하고, 돼지 13번 (그룹 10)은 10일에 1 mL의 페니실린 및 1 mL의 PREDEF® 2X로 처리하고, 돼지 4번 (그룹 9)은 11일에 1.0 mL의 NAXCEL®로 IM 처리하고, 돼지 1번 (그룹 1), 4번 및 11번은 각각 14일에 1.0 mL의 NAXCEL®로 처리하였다.
두 연구 장소에서 모두, 돼지는 수의학적 관리 하에 있었다. 동물 건강 검사를 -3일에 수행하여 "건강 검사 기록 양식"에 기록하였다. 모든 동물은 0일차 관찰에서 판정된 바와 같이 백신접종 전에 건강 상태와 영양 상태가 우수하였다. 모든 검사 동물은 시험감염 전에 건강 상태와 영양 상태가 우수한 것으로 관찰되었다. 사체 및 조직은 렌더링(rendering)으로 처분하였다. 연구 동물의 최종 처분은 "동물 처분 기록"에 기록하였다.
0 및 14일에, 그룹 1 내지 3 및 5 내지 8에 배정된 돼지에 각각 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x ½" 바늘을 사용하여 오른쪽과 왼쪽 목 부위에 각각 2.0 mL의 지정된 PCV2 백신 1 내지 4를 IM 투여하였다. 그룹 4에 배정된 돼지는 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x ½" 바늘을 사용하여 0일에만 오른쪽 목 부위에 1.0 mL의 PCV2 백신 2번을 IM 투여하였다.
22일에는 모든 검사 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 왼쪽 목 부위에 2.0 mL의 KLH/ICFA를 IM 투여하였다. 28일에는 모든 검사 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 오른쪽 허벅다리 부위에 2.0 mL의 KLH/ICFA를 투여하였다.
25일에는 그룹 1 내지 9에 배정된 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 오른쪽 목 부위에 1.0 mL의 PCV2 ISUVDL 시험감염 물질 (3.98 log10 TCID50/ml)을 IM 투여하였다. 추가적인 1.0 mL의 동일한 물질을 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 비강 캐뉼러를 사용하여 각각의 돼지에 (콧구멍 당 0.5 mL) IN 투여하였다.
46일에는 모든 검사 돼지에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1" 바늘을 사용하여 오른쪽 목 부위에 2.0 mL의 INGELVAC®PRRS MLV를 IM 투여하였다. PRRSV MLV는 PCV2 시험감염 물질의 병독성을 증가시키기 위하여 투여하였다.
검사 돼지를 -3일 및 0일 내지 21일에 전반적인 건강상태 및 부작용에 대해 매일 관찰하였다. 각각의 돼지를 정상적인 또는 비정상적인 행동, 호흡 또는 기침에 대하여 점수를 부여하였다. 관찰 결과를 "임상 관찰 기록"에 기록하였다. 주사 부위 반응에 대하여, 모든 검사 돼지를 0일 내지 7일에 관찰하고, 그룹 7은 14일 내지 21에 추가로 관찰하였다. 평균 일일 증체량은, -3, 25 및 50일, 또는 시험감염 후 돼지가 사망한 일자에, 보정된 체중계에서 각각의 돼지의 체중을 측정하여 계산하였다. 체중을 "체중 양식"에 기록하였다. -3일의 체중을 사용하여, 무작위화하기 전에 돼지를 블로킹하였다. 25일 및 50일의 체중 데이터를 사용하여, 이 시점 동안의 각각의 돼지에 대한 평균 일일 증체량(ADWG)을 계산하였다. 시험감염 후 및 50일차 이전에 사망한 돼지의 경우, 25일차부터 사망일까지의 ADWG를 나타내도록 ADWG를 조정하였다.
PCV2 혈청검사를 위하여, -3일 및 14일에 각각의 새끼돼지의 안와 정맥동으로부터 정맥 전혈을 채취하였다. 각각의 새끼돼지에서, 멸균 모세관을 한쪽 눈의 내측 안각 속으로 삽입하고 대략 3.0 mL의 전혈을 4.0 mL 혈청 분리관(SST) 속으로 유출시켜 안와 정맥동으로부터 혈액을 채취하였다. 25, 32 및 50일에, 멸균 20g x 1½" Vacutainer® 바늘[판매원: Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey], Vacutainer® 바늘 홀더 및 13 mL SST를 사용하여 각각의 돼지에서 전대정맥으로부터 정맥 전혈을 채취하였다. 각 시점에서의 혈액 채취를 "샘플 채취 기록"에 기록하였다. 각각의 SST 내의 혈액을 응고시키고 나서, 각각의 SST를 스핀 다운(spin down)시키고 혈청을 회수하였다. 회수된 혈청을 멸균 스냅 관(snap tube)으로 이동시키고, 후일에 검사할 때까지 -70±10℃에서 보관하였다. 혈청 샘플을 BIVI-R&D 인력에 의해 PCV2 항체의 존재에 대해 검사하였다.
돼지를 22일에서부터 50일까지 매일 1회 임상 증상에 대해 관찰하고, 정상적인 또는 비정상적인 행동, 호흡 또는 기침에 대해 점수를 부여하였다. 임상 관찰결과를 "임상 관찰 기록"에 기록하였다.
돼지 46번 (그룹 1) 및 98번 (그룹 9)은 1차 연구 장소에서 사망하였다. 이들 사망은 모두 출혈사로 분류되었고, 이들 2마리 돼지에 대한 부검은 실시하지 않았다. 2차 연구 장소에서, 시험감염후 및 50일차 이전에 사망한 돼지 및 50일에 안락사시킨 돼지를 부검하였다. 육안 병변을 관찰하고, 병변이 존재하는 폐엽의 %를 "부검 기록 양식"에 기록하였다.
2차 연구 장소에서 부검된 각각의 돼지로부터의 편도선, 폐, 심장 및 장간막 림프절의 조직 샘플을 완충된 10% 포르말린을 함유하는 단일 용기 안에 넣고, 앞서 언급한 동일한 기관으로부터의 다른 조직 샘플은 Whirl-pak®[판매원: M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK] 안에 넣어, 각각의 Whirl-pak®을 얼음 위에 위치시켰다. 각각의 용기를 적당하게 표지하였다. 샘플 채취를 "부검 기록 양식"에 기록하였다. 이후, IHC 검사를 위하여, 포르말린-고정된 조직 샘플 및 진단 요청 양식을 제출하였다. IHC 검사는 샘플 접수, 샘플과 슬라이드의 제조 및 염색 기술에 관한 표준 실험실 절차에 따라 수행하였다. Whirl-pak® 내의 새로운 조직을 보관(-70±10℃) 및 이후의 사용을 위하여 얼음 팩과 함께 연구 감독자에게 발송하였다.
포르말린-고정된 조직을 병리학자가 IHC로 PCV2의 검출에 대해 검사하고, 다음의 점수부여 시스템을 사용하여 점수를 부여하였다: 0 = 없음; 1 = 매우 적은 부위에서 불충분한 양성 염색; 2 = 다수의 부위에서 보통의 양성 염색; 및 3 = 조직 전체에 산재한 충분한 양성 염색. 분석을 위하여, 0점은 "음성"으로 간주하고, 0점을 초과하는 점수는 "양성"으로 간주하였다.
결과
본 실시예의 결과를 아래에 제시한다. 돼지 46번 및 98번은 각각 14일 및 25일에 사망하였다. 이들 사망은 출혈사로 분류되었다. 돼지 11번 (그룹 1)은 15일에 빠른 호흡으로 헐떡거렸다. 이외에, 모든 돼지는 상기 관찰 기간 동안에 행동, 호흡 및 기침에 대해 정상이었고, 어떤 그룹에서도 전신 부작용이 관찰되지 않았다. 0일에 백신접종한 후 주사 부위 반응은 관찰되지 않았다. 14일에 백신접종한 후, 15일에 14마리의 그룹 1 돼지 중 7마리(50.0%)는 점수가 "2점"인 부종이 있었다. 16일에는 14마리의 그룹 1 돼지 중 4마리(28.6%)에 여전히 "2점"의 부종이 있었다. 다른 그룹에서는 2회의 백신접종후 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다.
평균 일일 증체량(ADWG) 결과를 아래의 표 18에 제시한다. 출혈로 인하여 사망한 돼지 46번 및 98번은 그룹 결과로부터 제외시켰다. 16㎍ vORF2 - 카보폴의 1회 용량을 투여받은 그룹 4의 ADWG가 가장 높았고 (1.16±0.26 lbs/일), 그룹 1, 2, 3, 5, 6 및 10의 ADWG는 1.07±0.23 lbs/일 내지 1.11±0.26 lbs/일의 범위로 그 다음이었다. 그룹 9의 ADWG가 가장 낮았고 (0.88±0.29 lbs/일), 그 다음은 그룹 8 및 7로서 ADWG가 각각 0.93±0.33 lbs/일 및 0.99±0.44 lbs/일이었다.
Figure 112008054816983-pct00018
PCV2 혈청검사 결과를 아래의 표 19에 제시한다. 10개 그룹 모두는 -3일에 PCV2에 대해 혈청음성이었다. 14일에, 10개의 그룹 모두는 PCV2 역가가 여전히 낮았다 (50 내지 113의 범위). 25일에, 사멸시킨 전체 세포 바이러스 백신을 투여받은 그룹 8의 PCV2 역가가 가장 높았고 (4617), 16㎍ vORF2 - 카보폴을 투여받은 그룹 2, 16㎍ vORF2 - 카보폴의 단일 용량을 투여받은 그룹 4 및 16㎍ rORF2 - 카보폴을 투여받은 그룹 3의 역가는 각각 2507, 1920 및 1503으로 그 다음이었다. 32일 (시험감염 1주일후)에, 그룹 1 내지 6 및 그룹 8의 역가는 2360 내지 7619였고; 그룹 7 (0.25㎍ rORF2 - 카보폴), 그룹 9 (시험감염 대조군) 및 그룹 10 (엄격한 음성 대조군)의 역가는 각각 382, 129 및 78이었다. 50일(부검일)에, 10개의 그룹 모두는 PCV2 역가가 높게 나타났다 (≥1257).
25, 32 및 50일에, 16㎍ rORF2 - 카보폴의 2회 용량을 투여받은 그룹 3의 항체 역가는 16㎍ rORF2 - IMS 1314의 2회 용량을 투여받은 그룹 1보다 높았다. 25, 32 및 50일에, 16㎍ vORF2의 2회 용량을 투여받은 그룹 2의 역가는 동일한 백신의 1회 용량만을 투여받은 그룹 4보다 높았다. 각각 16, 4, 1 및 0.25㎍의 감소하는 수준의 rORF2 - 카보폴을 투여받은 그룹 3, 5, 6, 7은 25일 및 32일에 상응하게 감소하는 항체 역가를 나타내었다.
Figure 112008054816983-pct00019
시험감염후 임상 관찰로부터의 결과를 아래에 제시한다. 표 20에는 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침 및 설사에 대한 관찰 결과가 포함되어 있다. 표 21은 임상 증상의 그룹 전체 발생률의 요약 결과를 포함하고, 표 22는 시험감염후 그룹 사망률의 요약 결과를 포함한다. 시험감염후 비정상적 행동, 호흡 및 기침의 발생률은 16㎍ rORF2-IMS 1314 (그룹 1), 16㎍ rORF2-카보폴 (그룹 3), 1㎍ rORF2-카보폴 (그룹 6), 0.25㎍ rORF2-카보폴(그룹 7)을 투여받는 돼지 및 시험감염 대조군 (그룹 9)의 돼지에서 낮았다. 16㎍ vORF2-카보폴 (그룹 2), 단일 용량의 l6㎍ vORF2-카보폴 (그룹 4), 4㎍ rORF2-카보폴 (그룹 5), > 8 log KV-카보폴(그룹 8)을 투여받는 돼지 및 엄격한 음성 대조군 (그룹 10)의 돼지에서 시염감염후 비정상적 행동, 호흡 및 기침의 발생수는 0이었다.
임상 증상의 전체 발생률은 그룹 간에 차이가 있었다. 16㎍ vORF2-카보폴 (그룹 2), 단일 용량의 16㎍ vORF2-카보폴(그룹 4)을 투여받는 돼지 및 엄격한 음성 대조군 (그룹 10)의 돼지는 발생률이 0%였고; 16㎍ rORF2-카보폴 (그룹 3) 및 1㎍ rORF2-카보폴(그룹 6)을 투여받는 돼지는 발생률이 6.7%였으며; 16㎍ rORF2-IMS 1314 (그룹 1)를 투여받는 돼지는 전체 발생률이 7.1%였고; 4㎍ rORF2-카보폴 (그룹 5), 0.25㎍ rORF2-카보폴(그룹 7) 및 >8 log KV 백신을 투여받는 돼지는 발생률이 13.3%였으며; 시험감염 대조군(그룹 9)의 돼지는 발생률이 14.3%였다.
전체 사망률도 그룹 간에 차이가 있었다. 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 그룹 8의 사망률이 20.0%로 가장 높았고; 시험감염 대조군인 그룹 9 및 0.25㎍ rORF2-카보폴을 투여받은 그룹 7의 사망률은 각각 14.3% 및 13.3%로 그 다음이었다. 1회 용량의 16㎍ vORF2-카보폴을 투여받은 그룹 4의 사망률은 6.7%였다. 다른 모든 그룹 1, 2, 3, 5, 6 및 10은 사망률이 0%였다.
Figure 112008054816983-pct00020
Figure 112008054816983-pct00021
Figure 112008054816983-pct00022
그룹 평균 % 폐 병변 및 임시 진단의 요약을 아래의 표 23에 제시한다. 시험감염 대조군인 그룹 9의 % 폐 병변이 평균 10.81±23.27%로 가장 높았고, 그 다음으로 0.25㎍ rORF2-카보폴을 투여받은 그룹 7은 평균 6.57±24.74%였고, 4㎍ rORF2-카보폴을 투여받은 그룹 5는 평균 2.88±8.88%였으며, KV 백신을 투여받은 그룹 8은 평균 2.01±4.98%였다. 나머지 6개의 그룹의 평균 % 폐 병변은 0.11±0.38% 내지 0.90±0.15% 범위로 낮았다.
폐렴의 임시 진단은 그룹 간에 차이가 있었다. 2회 용량의 16㎍ rORF2-카보폴을 투여받은 그룹 3은 폐렴의 임시 진단이 13.3%로 가장 낮았다. 시험감염 대조군인 그룹 9는 50%가 폐렴으로 임시 진단되었고, 그 다음으로는 엄격한 음성 대조군인 그룹 10 및 2회 용량의 16㎍ vORF2-카보폴을 투여받은 그룹 2에서 각각 46.7% 및 40%가 폐렴으로 임시 진단되었다.
그룹 1, 2, 3, 5, 9 및 10은 0%가 PCV2에 감염된 것으로 임시 진단되었지만; 2회 용량의 KV 백신을 투여받은 그룹 8은 PCV2 감염의 임시 진단율이 20%로 가장 높았다. 2회 용량의 0.25㎍ rORF2-카보폴을 투여받은 그룹 7 및 1회 용량의 16㎍ vORF2-카보폴을 투여받은 그룹 4는 PCV2 감염의 임시 진단율이 각각 13.3% 및 6.7%였다.
위궤양은 그룹 7의 1마리 돼지에서만 진단되었고 (6.7%); 다른 9개 그룹은 위궤양이 관찰되지 않았다.
Figure 112008054816983-pct00023
그룹 IHC 양성 발생 결과의 요약을 아래의 표 24에 제시한다. 그룹 1 (16 ㎍ rORF2 - IMS 1314)은 PCV2에 대해 양성인 돼지가 0%로 IHC 양성 발생률이 가장 낮았고, 그룹 2 (16㎍ vORF2 - 카보폴) 및 그룹 4 (단일 용량 16㎍ vORF2 - 카보폴)의 IHC 양성 발생률은 각각 6.7% 및 13.3%로 그 다음이었다. 시험감염 대조군인 그룹 9는 PCV2에 대해 양성인 돼지가 100%로 IHC 양성 발생률이 가장 높았고, 엄격한 음성 대조군인 그룹 10 및 그룹 8 (KV 백신)은 PCV2에 대해 양성인 돼지가 각각 93.3% 및 80%로 그 다음이었다.
Figure 112008054816983-pct00024
고찰
7개의 PCV2 백신을 본 실시예에서 평가하였고, 여기에는 IMS 1314로 면역보강된 고용량 (16㎍)의 rORF2 항원 (2회 투여), 카보폴로 면역보강된 고용량 (16㎍)의 vORF2 항원 (한 그룹에는 1회 투여하고 두번째 그룹에는 2회 투여), 카보폴로 면역보강된 고용량 (16㎍)의 rORF2 항원 (2회 투여), 카보폴로 면역보강된 4㎍ 용량의 rORF2 항원 (2회 투여), 카보폴로 면역보강된 1㎍ 용량의 rORF2 항원 (2회 투여), 카보폴로 면역보강된 저용량 (0.25㎍)의 rORF2 항원 (2회 투여), 및 카보폴로 면역보강된 고용량 (> 8 log)의 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신이 포함되었다. 전체적으로, 2회 용량의 16㎍ rORF2 - IMS 1314를 투여받은 그룹 1은 카보폴로 면역보강된 다양한 수준의 vORF2 또는 rORF2 항원을 함유하는 백신을 투여받은 그룹 2 내지 7보다 결과가 약간 더 우수하였고, 2회 용량의 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신을 투여받은 그룹 8보다는 훨씬 우수하였다. 그룹 1은 ADWG가 세번째로 높았고 (1.80±0.30 lbs/일), 비정상적 행동 발생률은 가장 낮았으며 (0%), 비정상적 호흡 발생률은 가장 낮았고 (0%), 기침 발생률은 낮았으며 (7.1%), 전체 임상 증상의 발생률은 낮았고 (7.1%), 다른 3개의 그룹에 필적하여 사망률이 가장 낮았고 (0%), 평균 % 폐 병변 발생률이 두번째로 가장 낮았으며 (0.15±0.34%), 폐렴 발생률이 두번째로 가장 낮았고 (21.4%), 양성 IHC 조직 발생률은 가장 낮았다 (0%). 하지만, 그룹 1은 주사 부위 반응이 관찰된 유일한 그룹이었고, 여기에는 2차 백신접종 1일 후에, 백신접종된 개체의 50%가 포함되었다. 그룹 2 내지 7에 투여된 다른 백신은 사멸시킨 백신보다 우수하였고, 거의 그룹 1에 투여된 백신만큼 우수하였다.
카보폴로 면역보강된 2회 용량의 사멸시킨 PCV2 백신을 투여받은 그룹 8은 백신 그룹 중에서 결과가 가장 좋지 않았다. 그룹 8은 ADWG가 가장 낮았고 (0.93±0.33 lbs/일), 비정상적 행동 발생률은 두번째로 높았으며 (6.7%), 비정상적 호흡 발생률은 가장 높았고 (6.7%), 다른 3개의 그룹에 필적하여 임상 증상의 전체 발생률이 가장 높았고 (13.3%), 모든 그룹 중에서 사망률이 가장 높았으며 (20%), 모든 백신 그룹 중에서 양성 IHC 발생률이 가장 높았다 (80%). 사멸시킨 전체 세포 PCV2 백신은 그룹 8에 투여되기 전에 완전하게 불활성화되지 않았을 수 있다는 우려가 있었는데, 이것으로 상기 그룹의 좋지 않은 결과가 설명될 수 있다. 불행하게도, 한정된 데이터로는 이러한 우려를 확인할 수 없었다. 전체적으로, 본 실시예와 관련하여, 통상의 사멸시킨 PCV2 백신은 PCV2 관련 질병의 감소에 도움이 되지 않았다.
앞서 언급된 바와 같이, IMS 1314로 면역보강된 백신을 제외하고는 검사 백신은 부작용을 동반하지 않았다. 주사 부위 반응은, IMS 1314로 제형화된 백신을 사용한 2차 백신접종 1일 후 돼지의 50.0%에서 관찰되었고, 2차 백신접종 2일 후에는 돼지의 28.6%에서 관찰되었다. 카보폴 면역보강된 백신을 투여받는 모든 돼지에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다. IMS 1314 면역보강된 백신으로 백신접종된 돼지를 포함하는 임의의 추가적인 연구는 계속해서 주사 부위 반응에 대해 돼지를 면밀히 모니터해야 한다.
모든 돼지는 -3일에 PCV2에 대해 혈청음성이었고, 14일에 그룹 2의 역가만 100을 초과하였다. 25일(시험감염일)에, 그룹 8의 PCV2 항체 역가가 가장 높았고 (4619), 그룹 2가 그 다음이었다 (2507). 그룹 7, 9 및 10을 제외하고, 모든 그룹은 32일까지 강한 항체 반응을 나타내었다. 50일까지, 그룹 7, 9 및 10을 포함한 모든 그룹이 강한 항체 반응을 나타내었다.
후기 PCV2 감염 및 이후의 PMWS 발생의 특징 중의 하나는 이유돈에서의 성장 지연이고, 심각한 경우에는, 체중 감소가 관찰된다. 그룹의 평균 일일 증체량은 성장 지연 또는 체중 감소를 증명하는 정량적인 방법이다. 본 실시예에서, 그룹 간에 ADWG의 큰 차이는 없었다. 그룹 8의 ADWG가 0.88±0.29 lbs/일로 가장 낮았고, 그룹 4의 ADWG가 1.16±0.26 lb/일로 가장 높았다. 본 연구와 관련하여, 앞으로의 백신의 효능을 ADWG를 근거로 하기에 충분한 그룹 간의 차이는 존재하지 않았다.
체중 감소 외에도, 호흡 곤란, 무기력, 창백한 피부 및 때때로 황달이 PMWS와 관련된 임상 증상이다. 본 실시예에서, 비정상적 행동 및 비정상적 호흡 및 기침이 각 그룹에서 드물게 관찰되었다. 본 연구에서 증명된 바와 같이, 상기 시험감염 모델 및 시험감염 바이러스주는 압도적인 임상 증상을 일으키지 않아, 이는 백신 효능의 근거가 되는 강력한 변수가 아니다.
전체적으로, 본 실시예에서 사망률이 높지 않았고, 시험감염 대조군에서 사망률이 충분히 높지 않아 백신 효능의 근거가 되는 상기 변수가 제한된다. 46일 전에, 그룹 4 및 7은 각각 15마리 돼지 중 1마리가 사망하고, 그룹 9는 14마리 돼지 중 2마리가 사망하고, 그룹 8은 15마리 돼지 중 3마리가 사망하였다. 시험감염 대조군인 그룹 9가 PCV2 임상 증상을 나타내지 않았고, 이 그룹에서 46일까지 2마리만이 사망했다는 사실로 인하여, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) MLV 백신을 46일에 모든 돼지에 투여하였다. 기존의 연구에서는 PCV2-관련 PMWS 질병을 악화시키기 위한 면역자극제로서 INGELVAC®PRRS MLV를 사용하였고, 이러한 기존 연구에서는 사망률이 더 높았다. 46일에 PRRS 백신을 투여한 직후 2마리가 사망하였다 - 그룹 4는 46일에 1마리가 사망하고 그룹 7은 47일에 1마리가 사망하였는데, 이는 아마도, PRRS 백신의 투여와 관련이 없었을 것이다. 50일까지, 2회 용량의 사멸시킨 백신을 투여받은 그룹 8의 사망률이 가장 높았고 (20%), 그룹 9 (시험감염 대조군) 및 그룹 7 (0.25㎍ rORF2 - 카보폴)의 사망률이 각각 14.3% 및 13.3%로 그 다음이었다. 전체적으로, 본 실시예의 시험감염후 관찰 단계에서 후기에 시험감염 모델에 PRRS 백신을 투여한 것은 사망률을 유의적으로 증가시키지 않았다.
PCV2 감염에 대해 2차적인 PMWS를 나타내는 돼지에서 육안 병변은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 동반한 전신 림프절병증으로 이루어진다: (1) 소엽사이 부종을 동반한 간질성 폐렴, (2) 창백한 피부 또는 황달, (3) 반점이 있는 위축성 간, (4) 위궤양 및 (5) 신장염. 부검에서 (50일), 황달, 간염 및 신장염은 어느 그룹에서도 관찰되지 않았다. 위궤양은 그룹 7의 1마리 돼지에서 관찰되었지만, 림프절병증은 구체적으로 검사되지 않았다. PCV2 감염과 일치하는 병변의 존재에 따라, 3개 그룹은 1 마리 이상의 돼지가 PCV2(PMWS)로 임시 진단되었다. 2회 용량의 사멸시킨 백신을 투여받은 그룹 8은 20%가 PCV2로 임시 진단되었지만, 그룹 7 및 그룹 4는 각각 13.3% 및 6.7%가 PCV2로 임시 진단되었다. 평균 % 폐 병변 점수는 부검에서 그룹 간에 차이가 있었다. 그룹 1, 2, 3, 4, 6 및 10은 % 폐 병변 점수가 0.11±0.38% 내지 0.90±0.15%의 범위로 낮았다. 예상된 바와 같이, 시험감염 대조군인 그룹 9의 평균 % 폐 병변 점수가 가장 높았다 (10.81±23.27%). 4개의 그룹에서, 평균 % 폐 병변 점수는 폐 병변 점수가 매우 높은 1 내지 3마리의 돼지가 각 그룹에 존재하여 상승되었다. 폐 병변은 적색/자색이었고 경화되어 있었다. 통상적으로, PMWS와 관련된 폐 병변은 황갈색이고, 소엽사이 부종이 있으며 비-허탈성이다. 본 연구에서 관찰된 폐 병변은 PCV2 감염과 관련이 없거나, 2차적인 폐 감염원이 존재했을 수 있다. 본 연구에 있어서, % 폐 병변 점수는 아마도 PCV2로 인한 폐 감염의 정확한 측정량을 반영하지 못할 것이다. 마찬가지로, 폐렴의 임시 진단도 과용되었을 수 있다. 폐 병변을 보인 0.10% 정도의 돼지가 폐렴으로 임시 진단되었다. 본 실시예에서, 백신 효능의 근거가 되는 육안 병변 및 % 폐 병변과 관련하여 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다.
IHC 결과는 그룹 간에 가장 큰 차이를 보였다. 그룹 1 (16㎍ rORF2 - IMS 1314)은 PCV2 항원에 대한 양성 IHC 결과가 가장 낮았고 (0%), 그룹 9 및 그룹 10은 각각 100% 및 93.3%의 발생률로 양성 IHC 결과가 가장 높았다. 카보폴로 면역보강된 16, 4, 1 또는 0.25㎍의 rORF2 항원을 각각 투여받은 그룹 3, 5, 6 및 7은 IHC 양성 발생률이 각각 20%, 20%, 40% 및 46.7%였다. 카보폴로 면역보강된 2회 용량의 16㎍ vORF2를 투여받은 그룹 2는 IHC 양성 발생률이 6.7%였고, 1회 용량의 동일한 백신을 투여받은 그룹 4는 IHC 양성 발생률이 13.3%였다. 본 검사의 객관적인 특성 및 IHC 결과가 예측된 결과와 서로 관련된다는 사실로 인하여, IHC 검사는 아마도 백신 효능의 근거가 되는 가장 우수한 변수 중의 하나일 것이다.
따라서, 본 발명의 한가지 양상에서, 카보폴로 면역보강된 PCV2 rORF2 항원의 PCV2 시험감염에 대한 최소 보호 용량(MPD)을 CDCD 돼지 모델에서 측정하였다. 그룹 3, 5, 6 및 7에 카보폴로 면역보강된 2회 용량의 rORF2 항원을 각각 투여하였지만, rORF2 항원의 수준은 각 그룹마다 차이가 있었다. 그룹 3, 5, 6 및 7에 각각 16, 4, 1 또는 0.25㎍의 rORF2 항원을 투여하였다. 일반적으로, rORF2 항원의 수준이 감소함에 따라 PCV2 항체 역가가 감소되고, 사망률, 평균 % 폐 병변 및 IHC 양성 조직의 발생률이 증가하였다. 다양한 수준의 rORF2 - 카보폴을 투여받는 4개의 그룹 중에서, 2회 용량의 16 또는 4㎍의 rORF2 항원을 각각 투여받은 그룹 3 및 5는 IHC 양성 발생률이 단지 20%였고 항체 역가가 유사하였다. 전체적으로, IHC 양성 결과를 근거로 하여, 2회 투여되는 rORF2 항원의 최소 보호 용량은 대략 4㎍이다.
본 발명의 다른 양상에서, 재조합(rORF2) 및 VIDO R-1(vORF2) PCV2 항원의 항원성을 평가하였다. 그룹 2는 2회 용량의 16㎍ vORF2를 투여받았고, 그룹 3은 2회 용량의 16㎍ rORF2를 투여받았다. 두 백신은 모두 카보폴로 면역보강된 것이었다. 두 백신 모두 안전한 것으로 밝혀졌고 사망률이 0%였다. 그룹 2는 25일에 PCV2 항체 역가가 2507이었지만, 그룹 3의 PCV2 항체 역가는 1503이었다. 그룹 3의 평균 % 폐 병변 점수는 그룹 2보다 낮았지만 (0.11±0.38% 대 0.90±0.15%), 그룹 2의 IHC 양성 발생률은 그룹 3보다 낮았다 (6.7% 대 20%). 전체적으로, 두 백신은 유사한 항원성을 나타내었지만, vORF2의 IHC 결과가 약간 더 우수하였다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 2개의 상이한 애주번트 (카보폴 및 IMS 1314)의 적합성을 판정하였다. 그룹 1 및 3은 모두 16㎍의 rORF2 항원을 함유하는 2회 용량의 백신을 투여받았지만, 그룹 1은 IMS 1314로 면역보강된 항원을 투여받았고, 그룹 3은 카보폴로 면역보강된 항원을 투여받았다. 두 그룹은 ADWG가 실질적으로 동일하였고, 시험감염후 임상 징후의 발생률이 실질적으로 동일하였고, 사망률이 동일하였고, 평균 % 폐 병변이 실질적으로 동일하였지만, 그룹 1의 IHC 양성 발생률은 0%였고, 그룹 3의 IHC 양성 발생률은 20%였다. 하지만, 카보폴로 면역보강된 백신을 투여받은 그룹 3은 IMS 1314로 면역보강된 백신을 투여받은 그룹 1보다 25, 32 및 50일에 IFAT PCV2 역가가 더 높았다. 전체적으로, IMS 1314로 면역보강된 PCV2 백신이 보다 우수한 IHC 결과를 제공하였지만, 이는 PCV2 감염으로부터 압도적으로 우수한 보호를 제공하지 못했고 주사 부위 반응을 유도하였다. 반면에, 카보폴로 면역보강된 PCV2 백신은 IMS 1314 면역보강된 백신에 거의 필적하였고, 어떤 부작용도 수반되지 않았다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 1 ml, 1회 용량 산물로서의 PCV2 ORF2의 실행가능성을 판정하였다. 그룹 2 및 4는 모두 0일에 카보폴로 면역보강된 16㎍의 vORF2 백신을 투여받았지만, 그룹 2는 14일에 2차 투여를 받았다. 그룹 4는 그룹 2보다 ADWG가 약간 높고 평균 % 폐 병변이 낮았지만, 그룹 2는 25, 32 및 50일에 IFAT PCV2 역가가 더 높았고, IHC 양성 조직의 발생률이 약간 더 낮았다. 이들 두 그룹에 대한 모든 다른 결과는 유사하였다. 전체적으로, 카보폴로 면역보강된 1회 용량의 vORF2는 2회 용량의 동일한 백신과 결과가 유사하였다.
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agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760 aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820 ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940 aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000 aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060 aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120 gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180 atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240 ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300 aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360 catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420 aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480 tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540 aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600 tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660 tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720 aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780 acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840 ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900 ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960 atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080 aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg 4140 cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa 4200 gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc 4260 cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca 4320 ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380 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attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180 acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6240 ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6300 ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6360 ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6420 accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6480 tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6540 gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6600 ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6660 accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 6720 ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 6780 gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 6840 ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta 6900 cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa 6960 aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt 7020 tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt 7080 gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc 7140 tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa 7200 actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta 7260 ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt 7320 ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa 7380 tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc 7440 ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata 7500 ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg 7560 acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt 7620 acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta 7680 gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt 7740 aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 7800 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 7860 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 7920 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7980 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8040 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8100 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8160 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8220 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8280 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8340 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8400 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8460 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8520 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8580 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agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9480 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9540 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9600 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9660 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9720 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9780 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9840 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9900 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9960 aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10020 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10080 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 10140 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 10200 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 10260 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Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims (27)

  1. 용량당 2㎍ 이상의 재조합 배큘로바이러스 발현된 돼지 서코바이러스 2형 (PCV2) ORF2 단백질 및 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스에 대해 효과적인 하나 이상의 면역원성 활성 성분을 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는 단일 용량의 다가 복합 백신으로서, 상기 PRRS 바이러스에 대해 효과적인 면역원성 활성 성분이 PRRS 변형된 살아있는 바이러스 (PRRS MLV)이고, 상기 면역원성 조성물이 PCV2 감염과 관련된 임상적 증상의 중증도를 경감시키기 위해 1회 용량으로 돼지에게 투여되는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 불활성화된 바이러스 벡터 및 세포 배양물 상청액을 추가로 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  5. 제4항에 있어서, 상기 불활성화된 바이러스 벡터가 PCV2 ORF2 단백질을 암호화하는 재조합 배큘로바이러스인, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 2원 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 나트륨 티오설페이트를 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 애주번트를 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  9. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 아크릴산, 메타크릴산 및 이의 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 애주번트를 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  10. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 용량당 500㎍ 내지 5mg의 카보폴을 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  11. 제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 상기 면역원성 조성물이 용량당 4㎍ 내지 200㎍의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  12. 제1항 또는 제4항에 있어서, PCV2 ORF2를 포함하는 상기 면역원성 조성물이 24개월 이상의 기간 동안 안정한, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  13. 제1항에 있어서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae: M. hyo)의 항원을 추가로 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 복합 백신이 Ingelvac PRRS MLV에 포함되는 항원을 포함하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  16. 제13항에 있어서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 항원이 Ingelvac M. hyo에 포함되는 항원인, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  17. 제1항, 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PCV2 및 PRRS에 의해 유발되는 감염을 예방하기 위한 단일 용량의 다가 복합 백신.
  18. 제13항 또는 제16항에 있어서, PCV2 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 의해 유발되는 감염을 예방하기 위한 단일 용량의 다가 복합 백신.
  19. 제13항 또는 제16항에 있어서, PCV2, PRRS 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 의해 유발되는 감염을 예방하기 위한 단일 용량의 다가 복합 백신.
  20. 제1항 또는 제4항에 있어서, 복합 백신의 첫 번째 투여를 동물이 2주령 내지 8주령일 때 수행하는, 단일 용량의 다가 복합 백신.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질이
    i) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    ii) 상기 i)의 폴리펩티드의 면역원성 부분;
    iii) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드; 또는
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 면역원성 부분인, 단일 용량의 다가 복합 백신.
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