CN114746110A

CN114746110A - 靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白及其制备方法和使用方法

Info

Publication number: CN114746110A
Application number: CN202080080011.9A
Authority: CN
Inventors: 焕·胡·恩古叶恩
Original assignee: Igy Immune Technology And Life Sciences
Current assignee: Igy Immune Technology And Life Sciences
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-07-12
Also published as: WO2021062212A4; TW202126328A; WO2021062212A1

Abstract

本公开提供了一种分离和制备活非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)和包含完整ASF病毒粒子、病毒组分和/或免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗的方法。所述ASFV疫苗可用于对猪和野猪进行免疫接种，或者可用于对猪或野猪之外的物种例如禽、牛、山羊、兔、驴或马进行免疫接种，以产生对ASFV具有广谱特异性的多克隆免疫球蛋白。然后可以提取并纯化所述ASFV特异性免疫球蛋白。所述ASFV特异性免疫球蛋白可以为ASF感染的猪或野猪提供急性治疗，或者为有ASF风险例如可能已暴露于ASFV或ASFV感染的对象的猪或野猪提供预防性治疗。

Description

靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白及其制备方法和使用方法

技术领域

本公开总的来说涉及在用于治疗和预防非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染的主动和/或被动免疫中使用的组合物。本公开还涉及分离和制备ASF完整病毒粒子与ASF单个病毒成分的组合的方法，所述组合在猪和/或非猪物种宿主中用作疫苗，用于产生ASFV特异性免疫球蛋白。本文公开的ASFV特异性免疫球蛋白为被ASFV感染或易受ASFV感染的猪和野猪提供了广谱免疫。

与相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月26日提交的美国临时申请62/906,357的利益，所述临时申请整体通过参考并入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交并整体通过参考并入本文的序列表。所述创建于2020年9月24日的ASCII副本被命名为Seq_Listings_for_1401870-00006.txt，大小为8,548字节。

背景技术

ASF是由ASFV引起的一种高度传染性出血性疾病(USDA监督计划，第3页)。ASF影响猪科哺乳动物，包括家猪、野化猪和欧亚野猪(USDA监督计划，第3页)。所述病毒于1900年代初在东非首次发现，在大多数撒哈拉以南非洲国家从本地疣猪传播到家猪种群(Sánchez-Cordón等，非洲猪瘟：一种威胁全球养猪业的重新出现的病毒性疾病(African swinefever:A re-emerging viral disease threatening the global pig industry)，233Vet.J.41,41(2018))。非洲疣猪和丛林猪是ASFV的自然贮存宿主，显示出很少的临床征兆并且会持续感染(Dixon等，非洲猪瘟病毒的宿主防御逃避(African swine fever virusevasion of host defences)，266Virus Res.25,25(2019))。相反，家猪、野化猪或野猪的感染会导致急性出血热，具有高死亡率(Dixon等，第25页)。

ASFV在1950年代后期传播到欧洲，后来传播到南美洲和加勒比地区(Sánchez-Cordón等，第41页)。由于没有有效的疫苗，用于控制所述病毒传播的方法仅限于感染和暴露的猪的隔离和屠宰(Netherton等，非洲猪瘟病毒抗原的鉴定和免疫原性(Identification and Immunogenicity of African Swine Fever Virus Antigens)，10Front.Immun.1,1(2019))。在1990年代中期，ASF被成功地从非洲以外的地区根除，但到2007年，所述病毒再次经历了向格鲁吉亚和东欧的第二次跨大陆传播(Sánchez-Cordón等，第41页)。最近，在中国、越南、蒙古、柬埔寨和韩国均已报告了ASF爆发(FAO网站；ASF情况更新(ASF situation update))。由于中国是世界上最大的生猪生产国，因此ASF向中国的传播尤其令人担忧(Netherton等，第1页)。

ASFV本身是一种大型、复杂的双链DNA病毒，可在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的细胞质中复制(Dixon等，第25页)。各个研究组已记录到超过20种基因型，并且已鉴定出至少8种血清型Kolbasov等，非洲猪瘟病毒基因型和血清群的比较性分析(ComparativeAnalysis of African Swine Fever Virus Genotypes and Serogroups)，21Emerg.Infect.Dis.312,312(2015))。传统的灭活疫苗不成功，并且减毒活疫苗也未能产生所需的功效(Sánchez-Cordón等，第44页)。与开发成功的ASF疫苗相关的挑战据认为是由于对所述病毒如何调节宿主对感染的应答缺乏理解和未鉴定到保护性抗原(Sánchez-Cordón等，第44页)。

发明内容

本发明人开发了一种分离活ASFV和病毒组分以制备ASFV疫苗的方法，所述疫苗包含完整病毒颗粒、单个病毒结构蛋白和参与加重感染的病毒组分，所述参与加重感染的病毒组分包括但不限于免疫抑制性因子和/或宿主免疫因子。这种ASFV疫苗在γ-射线辐照后可用于主动免疫或疫苗接种易受ASF感染的猪、野猪或其他物种。此外或可选地，活的或γ-射线辐照的ASFV疫苗可用于主动免疫或疫苗接种猪或野猪之外的物种，例如禽、牛、兔、山羊、驴或马，以产生对ASFV具有广谱特异性的多克隆免疫球蛋白。在一个优选实施方式中，使用所述ASFV疫苗对产蛋禽例如鸡进行疫苗接种，然后可以从蛋黄中提取和纯化抗体或抗体级分。产生的产蛋禽抗体可用于预防病毒粘附、病毒传播、治疗ASF、预防ASF。来自禽或鸟类的IgY同型的抗体在这些应用中特别有用。

可以给药所述ASFV特异性免疫球蛋白以用于ASFV感染的猪或野猪的急性治疗。所述急性治疗可以包括肠胃外和/或口服给药所述免疫球蛋白，例如通过腹膜内偶肌肉内注射和/或在食品组合物中。此外或可选地，可以通过同样的给药途径给药所述免疫球蛋白作为预防性治疗。在一个实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白可以采取液体或冻干粉剂的形式，在重构后可以腹膜内或肌肉内注射，优选地以每kg体重约0.5至约1.0mg的注射剂量每周注射两次共一周或更多周，例如给药到一个或多个ASFV感染或暴露的猪或野猪。或者，ASFV特异性免疫球蛋白可以以每kg体重约1.0mg的口服剂量口服给药，例如添加到饲料，每天一次共连续约5至约7天，例如给药到一个或多个ASFV感染或暴露的猪或野猪。

在一个实施方式中，本文公开了一种在被感染的猪或野猪中治疗ASFV感染的方法，所述方法包括向所述被感染的猪或野猪给药有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

本文中还公开了所述在被感染的猪或野猪中治疗ASFV感染的方法，其中所述组合物的给药量提供的所述特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为所述被感染的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

在另一个示例性实施方式中，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物通过肌肉内或腹膜内注射进行肠胃外给药。

另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物是口服给药的食品。

另一个实施方式是一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

另一方面，所述组合物的给药量提供的所述特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为所述有风险的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

还应该理解，本公开设想了所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物可以被肠胃外给药。

本文公开的另一个实施方式是一种生产ASFV特异性免疫球蛋白的方法，其中将包含完整ASF病毒粒子、病毒组分和/或免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗给药到用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非猪物种宿主。

在一个示例性实施方式中，所述宿主是产蛋禽。

本文公开的另一个示例性实施方式是一种单位剂型，其包含治疗或预防有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

在另一个实施方式中，所述组合物是被配制成用于口服给药的食品。

本文还公开了一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含ASF病毒组分的ASFV疫苗组合物。

一方面，所述ASF病毒组分是无活性的。

另一方面，所述ASFV疫苗组合物通过肌肉内或腹膜内注射进行肠胃外给药。

还公开了一个示例性实施方式，其中所述ASFV疫苗组合物的给药量提供的所述ASF病毒组分的剂量为每只猪或野猪约0.05mg至约1.0mg。

另一个实施方式是一种单位剂型，其包含有效量的包含ASF病毒组分的ASFV疫苗组合物。

一方面，所述ASF病毒组分源自于ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。

另一方面，所述ASF病毒组分被灭活。

另一方面，所述ASFV疫苗用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。

一个实施方式是一种特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白，其用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。

在本文中应该理解并设想所述ASFV疫苗可能在猪或野猪针对ASF感染的预防性治疗中有用。在另一个实施方式中，所述ASFV疫苗和ASFV特异性免疫球蛋白可以在治疗方案中组合使用和/或一起给药到猪或野猪。

附图说明

图1示出了制造ASFV疫苗的方法的示例性实施方式，通过给药所述ASFV疫苗对猪或野猪进行主动免疫的方法的实施方式，免疫或疫苗接种用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非猪或非易感物种宿主的方法的实施方式，以及通过给药所述ASFV特异性免疫球蛋白对猪或野猪进行被动免疫的方法的实施方式。

图2示出了通过向猪或野猪(图2A)或用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非猪或非易感物种宿主(图2B)给药所述ASFV疫苗的主动免疫的示例性实施方式。

图3示出了ASFV特异性免疫球蛋白组合物的示例性实施方式的qPCR结果。分析所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和三种对照中ASFV p72 DNA(NC_001659.2；SEQ ID NO：1)的存在。所述qPCR结果确认了所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物不含ASFV p72 DNA(SEQID NO：1)。

图4示出了使用2种不同的ASFV疫苗组合物和作为对照的盐水(无ASFV疫苗)在第1天、第14天和第28天免疫接种的3组母鸡中ASFV特异性抗体的滴度。收集由免疫接种的母鸡产下的蛋，提取免疫球蛋白，并在第14天(图4A)和第28天(图4B)使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72包被的(ASFV p72；NP_042775.1；SEQ ID NO：2)酶联免疫吸附测定(ELISA)板评估ASFV特异性抗体的滴度。

图5示出了使用2种不同的ASFV疫苗组合物和作为对照的盐水(无ASFV疫苗)在第1天、第14天和第28天免疫接种的3组母鸡中ASFV特异性抗体的滴度。收集由免疫接种的母鸡产下的蛋，提取免疫球蛋白，并在第28天使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72包被的(SEQ IDNO：2)ELISA板评估ASFV特异性抗体的滴度。

具体实施方式

定义

在后文中提供了一些定义。然而，定义也可能位于下面的“实施方式”部分中，并且上述标题“定义”并不意味着此类在“实施方式”部分中的公开不是定义。

当在本文中使用时。“约”、“大约”和“基本上”被理解为是指在数值的一定范围内，例如参考数字的-10％至+10％的范围、优选地参考数字的-5％至+5％的范围、更优选地参考数字的-1％至+1％的范围、最优选地参考数字的-0.1％至+0.1％的范围内的数字。

本文中的所有数值范围应该被理解为包括所述范围内的所有整数或分数。此外，这些数值范围应该被解释为对针对该范围内的任何数字或数字子集的宣称提供支持。例如，从1至10的公开应该被解释为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。

当在本公开和权利要求书中使用时，单数形式包括复数指称物，除非上下文另有明确叙述。因此，例如，对“组分”的指称包括两个或更多个组分。

词语“包含”应该被包含性而不是排他性地解释。同样，术语“包括”、“含有”和“具有”均应被解释为是包含性的，除非上下文明确禁止这种解释。此外，就此而言，这些术语指定了所陈述的特征的存在，但是不排除额外的或其他特征的存在。

然而，本文公开的组合物和方法可能缺少本文中未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包含”的实施方式的公开是(i)具有所述指定组分或步骤以及额外的组分或步骤的实施方式的公开，(ii)基本上由所述指定组分或步骤组成的实施方式的公开，和(iii)由所述指定组分或步骤组成的实施方式的公开。本文公开的任何实施方式可以与本文公开的任何其他实施方式组合。

在“X和/或Y”的上下文中使用的术语“和/或”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。类似地，“X或Y中的至少一者”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。

在本文中使用的情况下，术语“实例”和“例如”，特别是当后面跟有术语的名单时，仅仅是示例和说明性的，不应被视为排他性或全面的。

“对象”或“个体”是哺乳动物，优选为猪或野猪。当在本文中使用时，“有效量”是在个体中预防感染、治疗疾病或医学病症的量，或者更一般来说，减轻症状、管控疾病进展或减弱病毒感染一段时间的量。

术语“猪(pig)”是指家猪、野猪或野化猪。

术语“猪(swine)”是指家猪、野猪或野化猪。

术语“禽”是指野生或驯养的产蛋禽，例如鸡、鸭、天鹅、鹅、火鸡、孔雀、珍珠鸡、鸵鸟、鸽子、鹌鹑、雉鸡或鸠。

术语“非易感物种”或“非易感宿主”是指对ASFV感染或一般来说ASF不易感的物种。

术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指由白细胞和淋巴细胞产生的糖蛋白分子，并通过特异性识别并结合特定抗原并帮助它们的中和而参与身体的免疫系统和免疫应答。

术语“抗原”或“免疫原”或“半抗原”是对身体来说是或被认为是外来的，并且单独地或在与较大分子形成复合物后唤起免疫应答的物质或结构或小分子。术语“抗原”、“免疫原”或“半抗原”在本公开中可互换使用。

术语“被动免疫”是指由于将来自于另一个人、动物、物种或其他外部来源的抗体引入到对象中而产生的免疫。

术语“主动免疫”是指由于将抗原自然和/或人工引入到对象中而产生的免疫。

术语“佐剂”或“免疫佐剂”是指可以添加到疫苗以刺激对象免疫系统的应答的物质。

术语“免疫抑制性蛋白因子”和/或“宿主过度反应性免疫因子”是指可以包括但不限于细胞因子(例如TNF家族的细胞因子)、促炎性细胞因子(例如IL-17F和/或干扰素)和/或被下调的抗炎性细胞因子(例如IL-10)的因子。术语“免疫抑制性蛋白因子”和/或“宿主过度反应性免疫因子”在本文中可互换使用，并且通常是指逃避先天性和/或适应性免疫应答的因子。

术语“治疗”既包括预防性或防备性治疗(阻止和/或减缓目标病理状况、感染、障碍或疾病的发展)，也包括治愈性、治疗性或疾病改善性治疗，包括治愈、减缓所诊断的病理状况、感染、障碍或疾病、减轻其症状和/或阻止其进展的治疗措施；和具有染病或感染的风险或疑似染病或感染的对象以及患病或已被诊断为患有病理状况、感染、障碍或疾病的对象的治疗。术语“治疗”并不一定暗示着对对象进行治疗直到完全康复。术语“治疗”还指在未患有病理状况、感染、障碍或疾病但可能易于发生病理状况、感染、障碍或疾病的个体中维持和/或促进健康。术语“治疗”还打算包括增强或以其他方式加强一种或多种初级预防或治疗措施。作为非限制性实例，可以由医生、医疗保健专业人员、兽医、兽医专业人员、动物处理人员或其他人进行治疗。

当在本文中使用时，术语“单位剂型”是指适合作为单一剂量用于对象的物理上分立的单位，每个单位含有与可药用稀释剂、载体或媒介物缔合的预定量的本文公开的组合物，其量足以产生所需效果。单位剂型的规格取决于所使用的具体化合物、待实现的效果以及宿主中与每种化合物相关的药效学。

术语“无菌”应该被理解为不含任何细菌或其他活微生物。

当在本文中使用时，术语“可药用”是指在给药到对象时基本上不引起不良过敏或免疫反应的物质。

除非另有表示，否则本文中表示的所有百分率均以组合物总重量的重量计。当在本文中提到pH时，值对应于使用标准设备在约25℃下测量到的pH。“环境温度”或“室温”在约15℃至约25℃之间，并且环境压力为约100kPa。

当在本文中使用时，术语“mM”是指水溶液的摩尔浓度单位，其为mmol/L。例如，1.0mM等于1.0mmol/L。

当用于指称特定组分时，术语“基本上没有”、“本质上不含”或“基本上不含”意味着存在的任何组分占不超过约3.0重量％，例如不超过约2.0重量％，不超过约1.0重量％，优选地不超过约0.5重量％，或更优选地不超过约0.1重量％。

术语“食物”、“食品”和“食物组合物”意味着旨在供包括人在内的动物摄取并向所述动物提供至少一种营养物的产品或组合物。食品的优选实施方式包括蛋白质、碳水化合物、脂质、维生素或矿物质中的至少一者。

在本公开中，术语“免疫接种”或“疫苗接种”可互换使用。

实施方式

ASFV疫苗

本公开总的来说涉及一种ASFV疫苗，其包含完整的活ASFV粒子与天然表达的ASF病毒组分的组合，并任选地在无菌缓冲液中稀释，例如在无菌盐水溶液中稀释至约10％。所述ASFV疫苗可用于主动免疫或疫苗接种用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非易感物种宿主。非易感物种宿主可以是非猪哺乳动物宿主，例如禽、马、牛、驴、山羊或兔。

本公开的另一方面总的来说涉及一种生产ASFV疫苗的方法。在优选实施方式中，所述ASFV抗原从ASF感染的猪或野猪获得。在一个实施方式中，可以从所述ASF感染的猪或野猪抽取血液并收集在带有抗凝剂的采血管中。可以将所述采血管例如在约4℃下以约1,500x g离心约15分钟，以获得血沉棕黄层。或者，可以通过在Ficoll上的标准梯度离心或本领域技术人员已知的其他方法从血液分离血浆含有的外周血单核细胞(PBMC)。此外，可以将任何红细胞(RBC)用包含约0.83％NH₄Cl的溶液或通过本领域技术人员已知的任何其他方法裂解。

所述收集和/或分离的PBMC可以通过一个或多个冻融循环来破碎和/或裂解，例如在干冰乙醇(约-72℃)浴中放置第一预定时间段，然后在室温放置第二预定时间段。这个过程可以重复一次或多次。可以将所述破碎的PBMC在第二离心步骤中离心，例如在约4℃下以约800x g离心约15分钟。上清液优选地含有完整病毒粒子、病毒组分、免疫抑制性蛋白因子和宿主过度反应性免疫因子，可以被收集并用预定pH的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。得到的ASFV疫苗可以分成一个或多个部分储存在低于室温的温度下，例如分成约1ml的等分试样储存在等于或低于约-20℃下。在一个示例性实施方式中，可以在冷冻和储存之前评估所述上清液的蛋白质含量和/或病毒滴度。

在另一个实施方式中，所述ASFV疫苗可以从ASFV感染的淋巴器官例如脾脏获得。脾脏可以从ASFV感染的猪或野猪收获，并解剖成多个组织切片。优选地，所述解剖在收获后立即进行。可以将所述组织切片添加到缓冲液中并在冰上匀浆。可以将所述匀浆的组织混合物离心以产生单细胞悬液，例如在预定的时间和预定的温度下例如在约4℃下以约800xg离心约15分钟。所述单细胞悬液可能含有RBC和脾单核细胞(SMNC)。所述RBC可以使用包含约0.83％NH₄Cl的溶液或通过本领域技术人员已知的任何其他方法裂解。SMNC可以通过本领域技术人员已知的任何方法收集并裂解。可以通过离心除去细胞碎片，并且可以收集上清液。

所述上清液优选地含有完整病毒粒子、病毒组分、免疫抑制性蛋白因子，并且可以通过Ficoll梯度离心收集SMNC。可以收集所述上清液和SMNC并进行一个或多个冻融循环，其中可以将所述混合物降低到低温，例如在干冰乙醇浴(约-70℃)中放置第一预定时间段，然后在室温下放置第二预定时间段。可以将上清液与破碎的SMNC的混合物在约4℃下以约800x g离心约15分钟。可以收集所述上清液并用预定pH的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。可以将得到的ASFV疫苗分成一个或多个部分储存在低于室温的温度下，例如分成约1ml的等分试样储存在等于或低于约-20℃、优选地约-70℃下。在另一个示例性实施方式中，可以在冷冻和储存之前评估所述上清液中的蛋白质含量和/或病毒滴度。

在另一个实施方式中，从健康的猪收集新鲜的原代肺泡巨噬细胞(PAM)并铺板在细胞培养瓶中，使用含有胎牛血清(FBS)的完全培养基过夜培养。在约24小时后，可以清洗细胞单层，并且可以向培养物添加含有用ASFV储用物感染的血清的培养基。可以将所述ASF感染的PAM培养至在培养物中观察到至少约75％的细胞病变效应，例如在ASFV感染后约5至约7天后。可以收获、收集PAM和培养上清液并对其进行一个或多个冻融循环，其中可以将所述PAM混合物降低到低温，例如在干冰乙醇浴(约-70℃)中放置第一预定时间段，然后在室温下放置第二预定时间段。可以将上清液与破碎的PAM的混合物在约4℃下以约800x g离心约15分钟。可以收集所述上清液并用预定pH的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。可以将得到的ASFV疫苗分成一个或多个部分储存在低于室温的温度下，例如分成约1ml的等分试样储存在等于或低于约-20℃、优选地约-70℃下。在另一个示例性实施方式中，可以在冷冻和储存之前评估所述上清液中的蛋白质含量和/或病毒滴度。

在优选实施方式中，所述ASFV疫苗组合物包含来自于SMNC、PBMC和/或PAM中的一者或多者的蛋白质混合物、病毒粒子和病毒组分。

在本文中应该理解并设想所述ASFV疫苗组合物含有广范围的ASFV抗原(即全面的ASFV蛋白)。应该理解，可能包含在所述ASFV疫苗组合物中的蛋白质或抗原可能包括完全、完整的ASFV蛋白，和/或也可能包含所公开的ASFV蛋白的部分或片段。

还应该理解，可以通过首先测试被感染的猪来选择ASFV的特定基因型或血清型用于生产所述ASFV疫苗组合物。此外或可选地，本文公开的ASFV治疗方法可以针对密切相关的病毒毒株、ASFV基因型和/或ASFV血清型提供交叉保护。

本文还公开了用于在使用前灭活ASFV疫苗组合物的方法。在一个示例性实施方式中，可以使用γ辐照器以约30kGy的剂量辐照所述ASFV疫苗组合物。在约30kGy的剂量下ASFV DNA被损坏，而病毒形态和病毒蛋白完整性通常得以保留。

此外或可选地，可以使用非辐照ASFV疫苗对非猪哺乳动物宿主例如禽、马、牛、驴、山羊或兔进行疫苗接种或免疫接种，用于例如产生ASFV特异性免疫球蛋白。

ASFV特异性免疫球蛋白

本公开的另一方面总的来说涉及对非易感物种宿主进行免疫接种或疫苗接种以产生ASFV特异性免疫球蛋白的方法。可以将包含完整病毒粒子、病毒组分、免疫抑制性蛋白因子和宿主过度反应性免疫因子的ASFV疫苗，例如在无菌盐水缓冲液中的约10％ASFV疫苗的等分试样(例如约1mL)融化至预定温度，涡旋振荡，并肌肉内注射到非猪哺乳动物宿主例如禽、马、牛、驴、山羊或兔中。在初始和任选的再次免疫接种后，可以通过本领域普通技术人员已知的各种不同方法收集宿主静脉血的样品。

在优选实施方式中，所述抗ASFV免疫球蛋白是由被免疫接种或疫苗接种的产蛋禽例如鸡产生的IgY抗体。可以将包含完整病毒粒子、病毒组分和免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗，例如在无菌盐水缓冲液中的约10％ASFV疫苗的等分试样(例如约1mL)融化至室温，涡旋振荡，并肌肉内注射到产蛋禽中。优选地，将所述ASFV疫苗分成相等的级分(约100μg蛋白质含量/级分)，将一个级分注射到母鸡的左胸中并将第二级分注射到所述母鸡的右胸中，任选地采用大致相等的体积量，例如右胸中约500ml并且左胸中约500ml。此外或可选地，在将ASFV疫苗注射到母鸡中之前，可以将所述ASFV疫苗用完全弗氏佐剂(CFA)以约1:1的比例乳化。在另一个实施方式中，后续的免疫接种可以包括包含ASFV疫苗和不完全弗氏佐剂(IFA)的约1:1溶液的ASFV疫苗组合物。

在初始免疫接种后，可以对所述母鸡进行再次免疫接种，例如在初始免疫接种后约7天和/或初始免疫接种后约14天和/或初始免疫接种后约28天。在初始免疫接种和任何再次免疫接种后(例如在初始免疫接种后约27天)，可以在一天或多天收集由被免疫接种的母鸡产下的蛋，用于纯化IgY抗体。或者，可以在免疫接种期间连续收集蛋。所述IgY抗体可以从收集的蛋黄通过水溶性级分获得。可以将一个或多个蛋黄合并并用冷却的3mM HCl稀释约10倍，以给出最终pH约为5的悬液(用大约10％乙酸调节)。可以将所述悬液在例如约-20℃下冷冻过夜。在融化至预定温度后，可以将所述混合物在大约4℃下以约13,000x g离心约15分钟，并且可以收集含有IgY免疫球蛋白的上清液。所述IgY免疫球蛋白可以通过本领域普通技术人员已知的各种沉淀法进一步纯化，例如使用硫酸铵或生物相容性氯化钠(参见Hodek,P.等，“提供电泳均质制剂的鸡抗体(IgY)纯化的优化方案”(OptimizedProtocol of Chicken Antibody(IgY)Purification Providing ElectrophoreticallyHomogenous Preparations)，8Int.J.Electrochem.Sci.113,113-124(2013))。任选地，所述IgY免疫球蛋白可以从蛋清级分获得。

在某些实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物包含蛋黄或其任何含IgY抗体的级分。蛋黄是蛋的优选部分，因为蛋黄通常含有比蛋清高得多的IgY浓度。然而，蛋清也可能含有足以用于某些应用的IgY浓度。

在抗体组合物的某些实施方式中，所述IgY从蛋的组成成分浓缩、分离或纯化。这可以通过各种不同方法例如本领域普通技术人员已知的方法来实现。如果需要，可以通过免疫测定法例如ELISA确定IgY抗体的滴度。

在抗体组合物的某些实施方式中，所述组合物通过下述方法来制备，所述方法包括获得以前针对ASFV进行过主动疫苗接种的禽产下的蛋，并从蛋黄分离抗体级分。所述禽优选为家禽。所述家禽可以是鸡、鸭、天鹅、鹅、火鸡、孔雀、珍珠鸡、鸵鸟、鸽子、鹌鹑、雉鸡、鸠或其他家禽。所述家禽优选为鸡。所述家禽更优选为主要为了蛋或肉的生产而饲养的家养鸡。

在抗体组合物的某些实施方式中，所述抗体组合物通过下述方法来制备，所述方法包括针对ASFV主动疫苗接种母鸡，在免疫接种期后从所述母鸡收集蛋，并从蛋黄分离抗体级分。任选地，从母鸡收集蛋可以在免疫接种期后连续进行。

生产具有特定靶的IgY的其他方法对于本领域技术人员来说是已知的，尽管不知这些方法以前是否成功用于生产针对ASFV的抗体。本节中公开的抗体适用于本公开中描述的任何方法和组合物。

已发现，来自于禽蛋的IgY抗体一般来说是病毒黏附抑制剂(即免疫球蛋白)的成本效益高且丰富的来源。此类抗体结合到带有抗原的病毒(例如ASFV)的表面，从而阻止病毒与潜在宿主细胞之间的初始接触阶段。正如在本公开中别处解释的，阻止病毒与宿主细胞之间的初始黏附阶段具有大量应用，包括病毒疾病的治疗和病毒疾病的预防。

在所述抑制剂的某些实施方式中，所述抑制剂包含禽蛋的组成成分，其中所述禽蛋包含有效抑制黏附的量的ASFV特异性IgY。所述禽蛋的组成成分可以是在本公开中被描述为适合的抗体组合物的任何组成成分。

提供了阻止病毒黏附到细胞的方法。细胞被病毒感染的第一步是病毒与细胞之间的接触和黏附。尽管这个步骤对于感染的建立来说是至关重要的，但在这个早期阶段阻止感染的方法很少。更通常地使用诸如主动疫苗接种的技术来对抗病毒感染，这导致身体产生中和所述病毒的抗体。如果主动疫苗接种不可行，则病毒疾病最通常地只能对症治疗。本文描述的方法提供了阻止感染过程中的这个早期步骤的有效手段，而无需像主动疫苗接种所要求的那样必须在对象暴露于病原体之前给药。

抗体可以通过与病毒结合并干扰病毒结合其靶膜受体的能力来发挥作用，以阻止病毒与细胞之间的黏附。与哺乳动物抗体相比，禽类抗体(例如IgY)在这种应用中具有明显优势，特别是当对象是哺乳动物时。正如上文陈述的，IgY抗体的优点包括IgY抗体与哺乳动物抗体相比更加特异，更加稳定，并且引起的不需要的免疫应答形式更少。IgY抗体也可以从蛋中容易且廉价地获得。

在所述方法的一个实施方式中，所述方法包括向对象给药有效抑制黏附的量的病毒黏附抑制剂。所述病毒黏附抑制剂可以是本文公开的ASFV特异性免疫球蛋白组合物的任何实施方式。在所述方法的某些实施方式中，所述病毒黏附抑制剂包含禽蛋的组成成分，所述组成成分包含有效抑制黏附的量的ASFV特异性IgY。所述组成成分可以是本文中作为适合的抗体组合物公开的任何组成成分。

在所述方法的某些实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物是包含禽蛋内含物的药品，所述禽蛋内含物包含有效量的ASFV特异性IgY。所述药品可以包含本文中讨论的另外的组分。所述药品可以通过本领域中已知的或本文中描述的任何方法来给药。

治疗方法

本公开的又一方面总的来说涉及ASFV疫苗和ASFV特异性免疫球蛋白的可药用组合物，其可以给药到ASFV感染或暴露的猪或野猪。此外或可选地，所述ASFV疫苗可以给药到如前所述的非猪哺乳动物宿主。

在一个实施方式中，所述ASFV疫苗和/或ASFV特异性免疫球蛋白采取组合物例如但不限于药物组合物的形式。所公开的组合物可以包含一种或多种上文公开的此类组合物与可药用载体的组合。此类载体和配制方法的实例可以在《Remington药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第20版，Lippincott,Williams&Wilkins，Daniel Limmer主编)中找到。为了形成适合于给药的可药用组合物，此类ASFV特异性免疫球蛋白组合物含有治疗有效量的抗体。所述抗体的治疗有效量可以是有效抑制黏附的量和/或在对象(即猪或野猪)中有效产生被动免疫的量。此外或可选地，为了形成适合于给药的可药用组合物，此类ASFV疫苗组合物含有治疗有效量的ASFV抗原(例如ASFV病毒粒子和/或病毒组分)。辐照过的ASFV抗原的治疗有效量可以是在对象(即猪或野猪)中有效产生保护性免疫的量。

本公开的药物组合物可用于本公开的治疗和预防方法中。将此类组合物以足以递送治疗有效量的ASFV特异性免疫球蛋白或ASFV疫苗的量给药到猪或野猪，以便在本文公开的治疗和预防方法中有效。所述治疗有效量可以随着各种不同因素而变，例如但不限于对象的状况、体重、性别和年龄。其他因素包括给药的方式和部位。所述药物组合物可以以本领域中已知的任何方法提供给对象。示例性的给药途径包括但不限于腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、局部、表皮、口服、骨内、鼻内。所述ASFV特异性免疫球蛋白的口服给药可以通过添加到对象的饲料(固体或液体)来实现。

本公开的组合物可以仅向对象给药一次或向对象给药超过一次。此外，当所述组合物向对象给药超过一次时，可以使用各种不同的方案，例如但不限于每天一次、每周一次、每月一次或每年一次。所述组合物也可以每天超过一次给药到所述对象。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和/或ASFV疫苗组合物的治疗有效量和适合的给药方案可以通过常规测试来鉴定，以便获得最佳活性，同时将任何潜在副作用降至最低。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和ASFV疫苗组合物可以单独给药到分开的对象。此外或可选地，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和ASFV疫苗组合物可以以各种不同的治疗方案共同给药到有需要的个体对象。此外，其他药剂的共同给药或顺序给药可能是合乎需要的。

本公开的组合物可以系统性给药，例如通过腹膜内、静脉内或肌肉内给药。

本公开的组合物还可以包含改善所述抗体的溶解性、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开的组合物还可以包含减弱所述抗体的不想要的副作用和/或降低其毒性的试剂。此类试剂的实例描述在各个教科书中，例如但不限于《Remington药物学科学与实践》(第20版，Lippincott,Williams&Wilkins，Daniel Limmer主编)。

本公开的组合物可以以广泛种类的给药用剂型给药。例如，所述组合物可以以例如但不限于注射液、冻干粉或颗粒剂的形式给药。

在本公开中，所述药物组合物还可以包含可药用载体。此类载体包括但不限于媒介物、佐剂、悬浮剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、缓冲剂、崩解剂和载体。通常，所述可药用载体对活性抗体是化学惰性的并且在使用条件下没有有害副作用或毒性。所述可药用载体可以包括聚合物和聚合物基质。所述可药用载体的性质可以根据所使用的具体剂型和组合物的其他特性而有所不同。

例如，对于采取固体形式例如但不限于粉剂或颗粒剂的ASFV特异性免疫球蛋白的口服给药来说，可以将所述抗体与口服、无毒性可药用惰性载体组合，例如但不限于惰性填充剂、适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂和助剂。适合的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

适合用于肠胃外给药的制剂包括水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与对象的血液等渗的溶质，以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性悬液。所述组合物可以在生理上可接受的稀释剂中给药，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液。

可用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于肠胃外制剂的适合的脂肪酸包括聚乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加成物，其通过环氧丙烷与丙二醇、油酸、硬脂酸和异硬脂酸的缩合形成。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。用于肠胃外制剂的适合的皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，并且适合的去污剂包括(a)阳离子去污剂例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和甘油单酯硫酸盐和磺基琥珀酸盐，(c)非离子去污剂例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂例如β-氨基丙酸烷基酯和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及(e)它们的混合物。

在此类制剂中可以使用适合的防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位处的刺激，此类组合物可以含有一种或多种亲水亲油平衡值(HLB)为约12至约17的非离子型表面活性剂。

本公开的组合物还可以与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可以包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的抗体可以与一类可用于实现药物的受控释放的生物可降解聚合物偶联，例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。

本公开的药物组合物可以被改良以防止在对象中的不良反应。此类潜在的不良反应包括宿主识别、变态反应、局部炎症和其他形式的过敏反应。

与均质抗体治疗中相比，在非均质抗体治疗中对免疫球蛋白组合物的不良反应更加常见，尽管已解释过IgY抗体在这一方面的优势。在药物组合物的某些实施方式中，所述抗体被修饰以改变分子的Fc区。在其他实施方式中，对所述抗体进行处理以防止抗体的Fc区与细胞的Fc受体之间的结合。

本公开的药物制剂可以以任何可药用形式储存，包括水溶液、冷冻的水溶液、冻干粉剂或本文中描述的任何其他形式。

所述可药用ASFV特异性免疫球蛋白组合物和/或ASFV疫苗组合物的非限制性实例优选地还包含抗炎剂。

所述可药用ASFV特异性免疫球蛋白组合物的非限制性实例优选地还包含抗体的抗原结合片段例如Fab或Fab2片段，它们可以代替所述抗体。例如，所述抗原结合片段可以是包含原始IgY的抗原结合区的任何片段。在组合物和方法的某些实施方式中，可以用IgY抗体的修饰版本代替IgY抗体，只要所述IgY抗体的抗原结合区保留其识别ASFV的能力即可。

所述可药用ASFV疫苗组合物的非限制性实例优选地还包含冻干粉组合物，例如用于长期储存和/或运输。所述冻干的疫苗可以在用于免疫接种或疫苗接种之前在溶液例如盐水中重构至大约原始体积。

本公开的一个方面是一种治疗ASFV感染或暴露的猪或野猪的优选方法，所述方法包括在ASFV感染或暴露的猪或野猪中产生被动免疫(图1)。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物可以包含另外的组分作为本公开中别处讨论的药物组分。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物可以通过腹膜内或肌肉内注射，以每kg体重约0.5至约1.0mg的剂量，每周两次共一周或多周给药到有需要的ASFV感染或暴露的猪或野猪。

本公开的一个方面是一种通过给药包含ASFV特异性免疫球蛋白的组合物来治疗ASFV感染或暴露的猪或野猪的方法。所述ASFV特异性免疫球蛋白可以以每kg体重约1.0mg的剂量添加到饲料，每天约一次连续约5至约7天口服给药到有需要的ASFV感染或暴露的猪或野猪。

此类用于ASFV特异性免疫球蛋白的口服给药方法另外包括单独地或与蛋清相组合口服给药未煮过的蛋黄或蛋黄级分。生蛋黄或蛋黄级分的口服给药可以例如通过进食蛋黄级分来进行。所述蛋黄级分可以与其他成分相组合给药，以使其更加可口或更有营养。因此，所述蛋黄级分可以被对象作为食物摄入；或者，所述蛋黄级分可以作为药物组合物的一部分摄入。它优选为未煮过或非常轻微煮过的蛋黄级分，因为蒸煮会使抗体失活。

治疗方法的非限制性实例包括提高通过肠胃外或口服给药的ASFV特异性免疫球蛋白的剂量，并组合地或可选地以提高的给药频率给药。本公开的一个方面是一种治疗ASFV感染或暴露的猪或野猪的妊娠母猪、母猪的胎猪和/或仔猪的优选方法。将ASFV特异性免疫球蛋白通过本公开中别处讨论的方法给药到所述妊娠母猪。所述仔猪和/或胎猪在妊娠和/或哺乳期间直接或间接地接受所述ASFV疫苗。

本公开的另一方面是一种用于对ASF感染易感的猪或野猪的优选的预防性治疗方法(图1)。优选地可以将辐照过的ASFV疫苗组合物给药到对象(即猪或野猪)，包括但不限于已暴露于ASFV的对象、对ASF感染易感的对象和/或被ASFV感染的对象。所述ASFV疫苗组合物可以包含另外的组分，例如本公开中别处讨论的药物组分。所述ASFV疫苗组合物可以通过腹膜内、皮下或肌肉内注射，以对于体重大约20kg的小猪(即非老猪)来说约0.05mg/剂至约1.0mg/剂的剂量给药到对象。优选地，所述ASFV疫苗组合物以大约100μg的剂量给药。此外或可选地，所述ASFV疫苗组合物可以超过一次给药到个体对象。例如，在首次或初次免疫接种14天后，可以进行一次加强免疫接种。此外，在首次或初次免疫接种后第21天可以进行第三次免疫接种。

本文公开了图2A中图解的示例性实施方式，具体来说是一种治疗对象的方法，所述方法包括将第一剂ASFV疫苗组合物与CFA以1:1的比例给药。然后在约两周后，可以将第二剂ASFV疫苗组合物与IFA以1:1的比例给药到所述对象。在所述首次或初次免疫接种约四周后，所述猪或野猪可以经受ASFV激惹，以确定免疫接种过的对象是否可以从致命的ASF感染存活。所述辐照过的ASFV疫苗的剂量可以在等同于约10⁴HAD₅₀(50％红细胞吸附剂量)至约10⁵HAD₅₀的活病毒的范围内。

实施例

下述非限制性实施例支持了使用可药用ASF疫苗组合物来产生可用于治疗感染的猪和/或野猪或预防猪和/或野猪的感染的抗体的概念。

实施例1

在第1天、第14天和第28天，将三组鸡(每组n＝3)用ASFV疫苗进行免疫接种。第1组接受作为对照的盐水(无疫苗)，第2组接受含有完整病毒粒子和免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗制剂1，第3组接受包含完整病毒粒子、病毒组分和免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗制剂2。在第二和第三次免疫接种后，获取血样，使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72包被的ELISA板(SEQ ID NO：2)评估ASFV特异性抗体滴度。实施例1的结果证实所述ASFV疫苗是免疫原性的并且实现了免疫。此外，实施例1证实了在14天后(图4A)和28天后(图4B)，所述ASFV疫苗诱导的抗体池对ASF病毒组分例如ASFV主要衣壳蛋白p72(SEQ ID NO：2)具有全面的特异性。

实施例2

从来自于ASFV感染的猪的ASFV感染的脾脏的匀浆液和ASFV感染的含有PBMC的血沉棕黄层制备ASFV疫苗组合物。将所述PBMC混合物在干冰乙醇浴中冷冻，并融化至室温。将所述冻融程序重复两次。使用qPCR评估所述ASFV疫苗组合物的活性ASFV。结果证实所述ASFV疫苗组合物不含ASFV DNA。将三组产蛋母鸡(n＝3/组)用对照或两种不同的ASFV疫苗制剂之一给药。第1组接受作为对照的盐水(无疫苗)，第2组接受ASFV疫苗制剂1(从SMNC制备)，第3组接受ASFV疫苗制剂2(从SMNC和PBMC制备)。所述母鸡在第1天、第14天和第3天通过给药ASFV疫苗(通过肌肉内注射)或给药对照进行主动免疫。在第三次免疫接种后每天收集鸡蛋。使用简单的水稀释法从蛋黄提取免疫球蛋白。在第二次免疫接种后，在第14天从鸡获取血样，qPCR确定没有病毒脱落。

将从接受制剂2的母鸡收集的鸡蛋用于产生ASFV特异性免疫球蛋白。来自于接受盐水或制剂1的母鸡的鸡蛋不被用于产生ASFV特异性免疫球蛋白。使用qPCR分析所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物，并确定了没有活性ASFV(即所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物不含ASFV DNA)(图3)。还评估了所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物的IgY抗体的特异性。使用ELISA来检测特异性针对重组ASFV衣壳蛋白p72(SEQ ID NO：2)的抗体，并检测到ASFVp72特异性IgY的水平为6log₂(图5)。

将3组成年猪命名为A、B和C。A组由6只成年猪(每只大约20kg)组成，并在暴露于ASFV之前一天接受100mg ASFV特异性免疫球蛋白组合物。B组由3只成年猪组成，其在暴露于ASFV之后一天接受100mg ASFV特异性免疫球蛋白组合物。最后，C组由3只成年猪组成，其暴露于ASFV并且不接受所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物。

临床观察揭示出在ASFV暴露后4天，C组中的所有3只猪均显示出最初的ASF症状包括活动量低(即嗜睡)，并表现出食物摄入量减少。在ASFV暴露后6天，C组中的所有3只猪都停止进食。A组的猪在ASFV暴露后6天继续表现正常且健康，而B组的动物表现出食欲降低(即食物摄入量减少)和深黄色尿液，但是没有观察到ASF的其他征兆或症状，没有观察到疾病的征兆。结果表明，在ASFV暴露之前或之后给药ASFV特异性免疫球蛋白组合物均成功地产生被动免疫。

序列表

<110>

IGY免疫技术和生命科学公司（IGY Immune Technologies and Life Sciences Inc.）

<120> 靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白及其制备方法和使用方法

<130> 1401870.00006

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1941

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 1

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgcttaa tagcaggatt tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg accccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggttcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca ccatatattg ggtgcatgtc attcgtcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacggccca gatgggggcc catggtcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccttta gagggcgccg tttacacgct tgtagatccc 480

tttggaagac ctattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggtcggccag gaggtatcgg tggagggaac tagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgcagccat accaacccga aattcctttc acaacatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagctgc gcttttggtt taacgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc ggtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttatacg ccagtcgcgt 1140

tttatacctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgatttt ccctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagcct 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatcgg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataagtttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgca attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

<210> 2

<211> 646

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 2

Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn

20 25 30

Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe

50 55 60

Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His

65 70 75 80

Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln

85 90 95

Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala

100 105 110

Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ala Gln Met

115 120 125

Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp

130 135 140

Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro

145 150 155 160

Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu

165 170 175

Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg

180 185 190

Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr

195 200 205

Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr

210 215 220

Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro

225 230 235 240

Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro

245 250 255

Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn

260 265 270

Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln

275 280 285

Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu

290 295 300

Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp

325 330 335

Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe

340 345 350

Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val

355 360 365

Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Ile Arg Gln Ser Arg Phe Ile Pro Gly

370 375 380

Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly

385 390 395 400

Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn

405 410 415

Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg

420 425 430

Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn

435 440 445

Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu

450 455 460

Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn

465 470 475 480

Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala

485 490 495

Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp

500 505 510

Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val

515 520 525

Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala

530 535 540

His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser

545 550 555 560

Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp

565 570 575

Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile

595 600 605

Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val

610 615 620

Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala

625 630 635 640

Val Leu Arg Tyr Ser Thr

645

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种在被感染的猪或野猪中治疗非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染的方法，所述方法包括向所述被感染的猪或野猪给药有效量的组合物，所述组合物包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物的给药量提供的所述特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的剂量为所述被感染的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物通过肌肉内或腹膜内注射进行肠胃外给药。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物是口服给药的食品。

6.一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物的给药量提供的所述特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的剂量为所述有风险的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物被肠胃外给药。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物是口服给药的食品。

11.一种生产ASFV特异性免疫球蛋白的方法，其中将包含完整的活ASF病毒粒子、天然表达的ASF病毒组分和/或免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗给药到用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非猪物种宿主。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述宿主是产蛋禽。

13.一种单位剂型，其包含治疗或预防有效量的包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白的组合物。

14.根据权利要求13所述的单位剂型，其中所述组合物是被配制成用于口服给药的食品。

15.一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述天然表达的ASF病毒组分和完整的活ASF病毒粒子用γ-射线辐照灭活。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述ASFV疫苗组合物通过肌肉内或腹膜内注射进行肠胃外给药。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述ASFV疫苗组合物的给药量提供的所述天然表达的ASF病毒组分的剂量为每只猪或野猪约0.05mg至约1.0mg。

19.一种单位剂型，其包含有效量的包含天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗组合物。

20.根据权利要求19所述的单位剂型，其中所述天然表达的ASF病毒组分和完整的活ASF病毒粒子源自于ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。

21.根据权利要求19所述的单位剂型，其中将所述天然表达的ASF病毒组分用γ-射线辐照灭活。

22.一种ASFV疫苗，其包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白，所述ASFV疫苗用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。

23.一种组合物，其包含特异性针对(a)天然表达的ASF病毒组分、(b)完整的活ASF病毒粒子和/或(c)免疫抑制性蛋白因子的IgY免疫球蛋白，所述组合物用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子源自于ASFV感染的猪或野猪的细胞、组织和/或器官。

25.根据权利要求1所述的方法，其中将所述天然表达的ASF病毒组分和完整的活ASF病毒粒子通过γ-射线辐照灭活。

26.根据权利要求6所述的方法，其中所述天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子源自于ASFV感染的猪或野猪的细胞、组织和/或器官。

27.根据权利要求11所述的方法，其中所述天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子源自于ASFV感染的猪或野猪的细胞、组织和/或器官。

28.根据权利要求13所述的方法，其中所述天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子源自于ASFV感染的猪或野猪的细胞、组织和/或器官。

29.根据权利要求13所述的方法，其中将所述天然表达的ASF病毒组分和完整的活ASF病毒粒子通过γ-射线辐照灭活。

30.根据权利要求19所述的单位剂型，其中所述天然表达的ASF病毒组分、完整的活ASF病毒粒子和/或免疫抑制性蛋白因子源自于ASF感染的脾单核细胞(SMNC)和/或ASF感染的外周血单核细胞(PBMC)。

Claims

1.一种在被感染的猪或野猪中治疗非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染的方法，所述方法包括向所述被感染的猪或野猪给药有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物的给药量提供的所述特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为所述被感染的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物通过肌肉内或腹膜内注射进行肠胃外给药。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物是口服给药的食品。

6.一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物的给药量提供的所述特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为所述有风险的猪或野猪的每kg体重约0.5mg至约1.0mg。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物给药的时间段包括每周或连续7天至少一次。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物被肠胃外给药。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物是口服给药的食品。

11.一种生产ASFV特异性免疫球蛋白的方法，其中将包含完整ASF病毒粒子、病毒组分和/或免疫抑制性蛋白因子的ASFV疫苗给药到用于生产ASFV特异性免疫球蛋白的非猪物种宿主。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述宿主是产蛋禽。

13.一种单位剂型，其包含治疗或预防有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。

15.一种在有风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发病率和/或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪给药有效量的包含ASF病毒组分的ASFV疫苗组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述ASF病毒组分是无活性的。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述ASFV疫苗组合物的给药量提供的所述ASF病毒组分的剂量为每只猪或野猪约0.05mg至约1.0mg。

19.一种单位剂型，其包含有效量的包含ASF病毒组分的ASFV疫苗组合物。

20.根据权利要求19所述的单位剂型，其中所述ASF病毒组分源自于ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。

21.根据权利要求19所述的单位剂型，其中所述ASF病毒组分被灭活。

22.一种ASFV疫苗，其用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。

23.一种特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白，其用于在有风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。