KR101412057B1

KR101412057B1 - 동백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101412057B1
Application number: KR1020120073095A
Authority: KR
Inventors: 배용태; 이숙영; 김수관
Original assignee: 배용태
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2014-06-26
Also published as: KR20140005552A

Abstract

본 발명은 동백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 노화 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품, 노화 예방 또는 개선용 식품에 관한 것으로서, 동백나무 잎, 꽃, 꽃봉오리 추출물은 암세포를 사멸시키는 효능을 가지며, 특히 대장선암, 대장암, 폐암, 유방암, 위암 세포를 사멸시키는 효능이 우수하여 이들 암 종의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있고, 항산화 활성이 우수하여 노화 방지 또는 노화 억제 용도로도 사용될 수 있다.

Description

동백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating aging or cancer comprising Camellia extract as an active ingredient}

본 발명은 동백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 조성물, 노화 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품, 노화 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.

암은 세계적으로도 심장질환 다음으로 높은 사망률을 나타내는 질병으로 매년 백만 명 이상의 새로운 환자가 발생한다. 많은 나라의 연구팀들이 암의 발생기전이나 치료에 대한 연구를 위해 막대한 연구비를 투자하고 있으나 아직도 암은 난치성 질병으로 남아 있다.

한편, 종양은 아직 그 발생 원인과 과정이 정확히 알려지지는 않았지만 일반적으로 종양은 정상세포가 가지고 있는 세포 분열의 특이성을 상실하여 일어나는 조직의 비정상적인 증식을 말한다. 즉, 암은 세포 증식을 제어하는 DNA가 이상을 일으킨 현상으로 변형된 DNA에 의해 염증, 이상증식, 혈관 생성 등 암의 생성과 관련 있는 유전자들을 활성화시키므로 종양의 생성을 촉진하게 된다.

한편, 20세기 초까지는 노화와 더불어 자연발생적으로 일어나는 피할 수 없는 질병으로 여겨졌으나, 최근 암환자의 80%이 환경적인 요인에 의해 암이 발생되는 것으로 믿어지고 있다. 따라서 최근에는 기존의 불완전한 암치료보다는 암 예방에 관한 새로운 물질에 관한 연구에 많은 노력을 기울이고 있다. 암 예방이란 식품 혹은 보조 식품, 약품 등을 이용하여 발암과정의 초기단계에서 암 발생을 예방하거나 억제시킴으로써, 암으로 진행된 것을 전환시키는 것을 의미한다. 최근까지 800여 종의 물질들이 사용되고 있으며 대부분의 물질은 과일이나 채소 등에서 추출된 것이며 여러 가지 암의 진행을 막아주는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 천연 추출물은 장기 복용에 따른 독성 발생의 위험부담이 적고 원료 생산이 용이하며 보존 상태가 외부 환경에 따라 비교적 안정적이라는 점에서 유리하기 때문에, 암 예방제의 개발에 있어서 천연물로부터의 활성 검색은 높은 효율성과 많은 이점을 가지고 있다

동백나무는 일본으로부터 중국남부에 걸쳐 아시아 원산으로 약 200여종이 분포하고 있으며, 그 중 한국에 자생하는 동백나무는 1종( Camellia japonica L.)이고 동백나무과(Theaceae), 동백속(Camelliae)의 교목이다.

동백나무는 밑에서 가지가 갈라져서 관목으로 되는 것이 많다. 나무껍질은 회백색이며 겹눈은 선상 긴 타원형이고, 잎은 어긋나고 타원형 또는 긴 타원형이며, 잎가장자리에 물결 모양의 잔 톱니가 있고 윤기가 있으며 털이 없다. 꽃은 이른 봄 가지 끝에 1개씩 달리고 적색이다. 꽃잎은 5~7개가 밑에서 합쳐져서 비스듬히 퍼지고, 수술은 많으며 꽃잎에 붙어서 떨어질 때 함께 떨어진다. 암술대는 3개로 갈라진다. 열매는 삭과로 둥글고 지름 3~4cm로서 3실이며, 검은 갈색의 종자가 들어 있다. 식물체와 꽃은 보통 관상용이며, 종자에서는 기름을 짠다.

동백잎(Camellia leaf)은 건선, 인후통증, 화상에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 동백잎 관련 선행기술로는 국내특허공개 2009-0047209호에 동백나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항 알레르기 조성물이 기재되어 있으나 본 발명에서와 같은 동백나무 잎, 꽃, 꽃봉오리 추출물의 노화 또는 암 예방 또는 치료 목적과는 무관하다.

동백꽃(Camellia flower)은 차나무과에 속하며 높이가 7M에 달하는 상록소 교목인 동백나무 (Camellia Japonica L.)의 꽃으로서 말린 것은 한약명으로 산다화, 또는 홍다화라고도 한다. 동백나무는 우리나라의 울릉도, 제주도 및 남부 지방의 바닷가나 섬에서 자라며 개화기는 12월~5월이고 결실기는 9월~10월이다. 동백꽃은 간경, 폐경에 쓰이며 양혈, 지혈, 산 어혈에 효과가 있다고 알려져 있다. 동백꽃 관련 선행기술로는 일본 공개특허 제2002-371092호에는 동백꽃 추출물의 위장점막 보호제로의 용도가 개시되어 있고, 일본 공개특허공보 소55-099180호에는 동백꽃의 발효에 의한 차의 제조방법이 기재되어 있으며, 일본 공개특허공보 소55-111758호에는 동백꽃으로부터의 유사 초콜릿을 제조하는 방법이 기재되어 있고, 국내특허공개 제2009-0075281호에는 동백꽃 추출물을 함유하는 아토피성 피부염 개선용 조성물이 개시되어 있으나, 상기 선행기술들은 모두 본 발명에서 달성하고자 하는 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물의 노화 또는 암 예방 또는 치료 목적과는 무관하다.

본 발명자들은 천연물 유래의 새로운 항암 물질로서, 동백나무에 주목하였다. 동백나무는 한국에 자생하는 식물이나 그 항암 활성에 대해서는 이제까지 알려진 바가 없었다. 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물에 대하여 실험한 결과 여러 암종에 대해 항암 활성이 나타났고, 항산화 활성이 우수한 것으로 확인하였으며, 이를 이용하여 동백나무 잎, 꽃 또는 꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

보다 구체적으로 본 발명은 노화 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하고, 노화 또는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 하며, 노화 예방 또는 개선용 식물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 상기한 바와 같은 목적을 달성할 수 있다.

또한 본 발명은, 물, C₁-C₄의 저급 알코올, 헥산, 에틸 아세테이트, 염화 메틸렌, 아세토니트릴, 아세톤 및 이들의 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 이용하여 제조함으로써, 상기한 바와 같은 목적을 달성할 수 있다.

또한 본 발명은, 특히 대장선암, 대장암, 폐암, 유방암 및 위암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암 종에 대한 예방, 개선 또는 치료용으로 제공됨으로써 상기한 바와 같은 목적을 달성할 수 있다.

동백나무 잎, 꽃, 꽃봉오리 추출물은 암세포를 사멸시키는 효능을 가지며, 특히 대장선암, 대장암, 폐암, 유방암, 위암 세포를 사멸시키는 효능이 우수하여 이들 암 종의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있고, 항산화 활성이 우수하여 노화 방지 또는 노화 억제 용도로도 사용될 수 있다.

도 1은 동백의 신엽, 성엽, 및 꽃 추출물의 5종의 암세포주(Caco-2; 대장선암세포, Calu-6; 폐암세포, HCT116; 대장암세포, MCF-7; 유방암세포, SNU-601 세포주; 위암세포)에 대한 세포독성도를 실험한 결과이다.
도 2는 인간 암 세포 Calu-6에 대한 녹차 추출물의 MTT 활성을 통해 세포 생존도를 측정한 결과이다.
도 3은 인간 암 세포 Calu-6에 대한 동백 추출물의 MTT 활성을 통해 세포 생존도를 측정한 결과이다.
도 4는 인간 암 세포 Calu-6에 대한 녹차 및 동백 추출물의 MTT 활성을 통해 세포 생존도를 측정한 결과이다.
도 5는 동백나무 잎, 꽃봉오리, 꽃의 채취시기별 총 페놀성 화합물의 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 6은 각 채취시기별 동백잎 에탄올 추출물의 농도별 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 각 채취시기별 동백잎 에탄올 추출물의 농도별 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 8은 3월에 채취한 동백잎 에탄올 추출물의 농도별 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 3월에 채취한 동백잎 에탄올 추출물의 농도별 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 10은 동백나무 잎 및 녹차 추출물의 PPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 동백나무 잎(유엽, 성엽), 꽃 및 녹차 추출물의 SOD 활성을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 동백나무 잎(유엽, 성엽), 꽃 및 녹차 추출물의 AXP 활성을 측정한 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 동백나무 잎으로는 유엽 또는 성엽을 사용할 수 있다. 여기에서 유엽이란 가지로부터 새로 나온 연한 잎(신엽)을 말하고, 성엽이란 잎의 조직이 경화되어 성숙해진 잎을 말한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 추출물은 물, C₁-C₄의 저급 알코올, 헥산, 에틸 아세테이트, 염화 메틸렌, 아세토니트릴, 아세톤 및 이들의 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 이용하여 제조될 수 있고, 보다 구체적으로 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 암은 대장선암, 대장암, 폐암, 유방암 및 위암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 보다 구체적으로 상기 암은 폐암이다.

본 발명은 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

동백나무 잎, 꽃 및 꽃봉오리 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물을 함유하는 노화방지용 식품 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 1 내지 200mg/kg으로, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 항암, 항노화 효과를 나타내는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 식용 천연물 추출물 독성을 가지지 않으며, 인체에 무해하다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은, 상기 동백나무 잎, 꽃 또는 꽃봉오리 추출물을 포함하되, 적절한 식품보조첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항노화, 항암 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 추출물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품 조성물은 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 설명하기 위하여 제시되는 것으로 본 발명의 범위가 이로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 에탄올 이용한 동백의 부위별 추출물 제조

용매를 에탄올로 하는 제조의 방법은 다음과 같다. 동백 잎을 채취하여 깨끗한 물에 씻어서 잎 표면의 수분을 최대한 제거한 후, 300g을 취하였다. 세척된 잎을 곱게 세절 또는 파쇄한 후, 둥근 플라스크에 세절된 시료(300g)와 70%~99.9% 에탄올을 2,500~3,000ml 넣고 냉각(cooling) 시스템이 구비된 5L 용량의 히팅 맨틀(heating mantle)을 이용하여 60℃에서 4시간 가열(boiling) 후 여과지(filter paper)로 여과하여 동백잎의 추출액을 얻었다. 동백잎의 추출액으로부터 에탄올 성분을 제거시키기 위해 추출액을 진공증발기(vacuum evaporator)용 플라스크에 넣어 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 농축액을 유리 페트리디쉬에 담아 건조기(40℃)에서 건조하였으며, 에탄올을 완전히 제거해야할 경우에는 건조시료를 증류수로 현탁하여 초저온냉동고(deep freezer)에서 동결시킨 후, 동결건조기(freeze dryer)로 동결건조하였다.

실시예 2. 열수를 이용한 동백의 부위별 추출물 제조방법

용매를 열수로 사용하는 제조방법은 다음과 같다. 신선한 동백 잎 300g을 깨끗한 물에 씻어서 잎을 곱게 세절 또는 파쇄한 후, 내열성 둥근 플라스크에 세절된 시료(300g)와 증류수를 2,500~3,000ml 넣고 냉각(cooling) 시스템이 구비된 5L 용량의 히팅 맨틀(heating mantle)을 이용하여 100℃에서 4시간 가열(boiling) 후, 실온에서 시료를 식힌 후, 여과지로 여과하여 동백잎의 열수추출액을 얻었다. 동백잎의 열수추출액으로부터 증류수를 제거하고 건조분말 상태로 제조하기 위해 추출액을 비닐팩에 담아 초저온냉동기(deep freezer)에 3일간 초저온으로 냉동시켜 선반형 동결건조기(freeze dryer)로 동결건조하였다. 동결건조된 열수추출물의 분말을 코니컬 튜브에 담아 4℃ 저온고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

실험예 1. 인간 암세포에 대한 생육저해도 측정실험

가. 동백의 부위별 세포독성 측정

동백의 신엽, 성엽, 그리고 꽃의 추출물을 상기 실시예 1에서와 같은 방법에 따라 제조하였다.

5종의 암세포주(Caco-2; 대장암세포, Calu-6; 폐암세포, HCT116; 대장암세포, MCF-7; 유방암세포, SNU-601 세포주; 위암세포)에 대한 세포독성도를 측정하였다.

본 발명에 따른 동백나무 추출물의 암세포에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 5 종류의 암세포(Caco-2; 대장암세포, Calu-6; 폐암세포, HCT116; 대장암세포, MCF-7; 유방암세포, SNU-601 세포주; 위암세포)를 배지에 배양하여 사용하였으며, 이들 세포주는 서울대학교 세포주 은행에서 분양받은 것을 사용하였다.

사람 유방암 세포 유래 세포주인 MCF-7은 10% FBS(fetal bovine serum)과1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco BRL, USA)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하여 사용하였다.

사람 대장암 세포 유래 세포주인 Caco-2와 HCT116 세포 모두 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles's Medium) 배지(Gibco BRL, USA)에 배양하여 사용하였다.

사람 폐암 세포 유래 세포주인 Calu-6는 10% FBS, 1.5g/ℓ의 탄산수소 나트륨 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 Ham's F21K 배지(Gibco BRL, USA)에 배양하여 사용하였다.

위암 세포주인 SNU-601은 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(웰젠, 서울, 한국)이 첨가된 RPMI 1640 배지(인비트로젠, CA)에서 37℃의 온도 및 5%의 이산화탄소 조건하에서 배양하였다.

상기 암세포 유래 세포주의 배양 방법은 다음과 같은 방법으로 동일하게 실시하였다. -196℃에서 보관 중인 각각의 세포주를 37℃ 중탕에서 해동시킨 후, 100 mm² 조직 배양 페트리 디쉬에 넣고 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 일주일에 2∼3회 동안 배지를 교환하면서 페트리 디쉬 바닥에 암세포가 90% 이상 증식하면 PBS(phosphate buffered solution)로 세척한 후, 0.05% 트립신-EDTA(Gibco BRL, USA)로 3분 동안 처리하여 암세포를 페트리 디쉬 바닥에서 분리하면서 암세포를 계대 배양하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

상기 계대 배양한 암세포주를 96 웰 플레이트(96 well plate)에서 각 웰당 약 2×10⁴ 셀을 분주하고, 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 실험군은 6 시간 동안 배양하여 암세포가 웰 바닥에 부착시킨 후, 동백나무 신엽, 성엽 및 꽃 추출물 500 ㎍/㎖, 400㎍/㎖, 300㎍/㎖, 200㎍/㎖, 100㎍/㎖, 50㎍/㎖, 10㎍/㎖, 5㎍/㎖을 각각 처리하였다.

상기 암세포주를 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다. MTT(Sigma, St. Louis, Mo. USA)를 PBS에 용해시켜 5mg/㎖의 MTT 용액을 제조하고 상기 제조한 MTT 용액을 각 웰당 50㎕씩 첨가한 후 4 시간 동안 배양하였다.

MTT와 산화-환원 효소의 반응에 의해 형성된 보라색의 포르마잔을 얻기 위하여 각 웰당 DMSO(dimethylsulfoxide) 150㎕를 첨가하고 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군으로서 항암제로 사용되고 있는 아드리아마이신(Adriamycin, Sigma, St. Louis, Mo. USA)을 사용하였으며, MTT 분석을 실시하였다.

상기 MTT 분석을 통하여 얻은 흡광도와 하기 수학식 1에 의해 세포 생존율을 측정하였다.

수학식 1

세포의 생존율(%) = (실험군에서의 흡광도/대조군에서의 흡광도) * 100

상기 수학식 1에 의해 구한 세포 생존율이 50%가 되었을 때의 동백나무 신엽, 성엽 및 꽃 추출물의 농도(IC₅₀, ㎍/㎖)를 구하였다.

측정 결과, 동백 유엽의 추출물은 저농도에서 5종의 암세포 모두에 대하여 상당한 증식 억제효과를 보였으며, 나머지 성엽과 꽃은 400μg/mL 이내의 농도에서는 유의할 만한 저해활성을 나타내지 않았다. 그 결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

¹⁾인간 대장선암(Human colon adenocarcinoma)

²⁾인간 폐암(Human pulmonary carcinoma)

³⁾인간 대장암(Human colon carcinoma)

⁴⁾인간 유방암(Human breast cancer)

⁵⁾인간 위암(Human gastric carcinoma)

⁶⁾400μg/mL에서의 생존률(%)

⁷⁾세포 성장을 50% 저해하는 추출물의 농도(μg/mL)

⁸⁾약어; YL: 유엽, ML: 성엽, FWB: 꽃 봉오리(Flower Bud), FW: 꽃, BK: 껍질(Bark), BH: 가지(Branch), SD: 종자(Seed).

⁹⁾각 측정치는 SD(meanstandard deviation)(n=3)으로 나타냈다.

나. 폐암세포(Calu-6)에 대한 동백잎 추출물과 녹차잎 추출물의 세포독성 비교

녹차와 동백 추출물의 폐암세포에 대한 세포 독성도를 확인한 결과 녹차는 50 μg/mL 농도에서 98% 이상 사멸되었고 최저농도(25 μg/mL)에서도 94% 이상의 세포를 사멸시키는 것으로 나타나 녹차추출물이 폐암세포의 사멸에 탁월한 효과가 있는 것으로 나타났다. 같은 농도로 동백 성엽에 대한 세포독성도를 확인한 결과 400~200 μg/mL의 농도에서 각각 98%, 89% 정도 세포 생육을 저해하였다. 녹차의 IC₅₀값은 25 μg/mL 이하에서 나타났고 동백은 155.92 μg/mL의 농도에서 확인되었다(도 2, 도 3 및 도 4 참조).

실험예 2. 총 페놀성 화합물 함량 측정시험

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가진다. 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하며, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 본 실험에서는 월별 동백잎과 꽃의 에탄올 추출물에 존재하는 총 페놀함량을 탄닌산을 기준물질로 하여 측정하였다. 그 구체적인 실험과정은 하기와 같다.

동결건조된 시료를 분쇄한 후 1 g을 Davis 변법에 따라 메탄올을 가하여 80℃에서 30분 추출한 후 냉각하여 여과하였다. 이 여과한 추출 검액 100 ㎕에 1㎖의 디에틸 글리콜(diethylene glycol)을 첨가하고 다시 1N-NaOH 용액을 100 ㎕을 넣어 잘 혼합시켜 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨 후 UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer, UV-2401PC, SHIMADZU)를 사용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 메탄올 용액을 동일하게 처리하며, 표준곡선은 나린진(naringin, Sigma Co., USA)의 농도를 0 ~ 200 ㎍/㎖이 되도록 하여 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

실험결과, 7월에 채취한 동백잎에서 766.9 μg/mL으로 가장 높은 페놀함량을 보였고, 그 다음으로는 8월에 채취한 잎에서 753.79 μg/mL, 4월에 채취한 잎에서 747.7 μg/mL, 5월 719.6 μg/mL, 3월 711.2 μg/mL, 6월 710.7 μg/mL, 2월에 채취한 잎이 415.2 μg/mL로 가장 낮은 페놀함량을 보였다. 그리고 5월에 채취한 개화된 꽃과 봉오리를 비교한 결과 봉오리에서 704.4 μg/mL로 개화된 꽃 685.5 μg/mL보다 높은 페놀함량을 보였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

실험예 3. 부위별 및 성숙기별 항산화 활성 측정시험

가. 채취시기별(2월~8월) 동백 잎의 항산화 활성

DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유 라디칼로서 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 탈색되므로 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다. 구체적인 실험과정은 하기와 같다.

항산화활성 검색은 DPPH법을 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하는 Blois의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 1×10^-4M DPPH와 농도별 추출물을 각각 100 ㎕씩 취하여 혼합한 30분간 암 상태에서 방치한 후 잔존 라디칼 농도를 ELISA Reader(Bio-RAD, USA)를 이용하여 517nm에서 측정하였다. 시료의 환원력의 크기는 라디칼 소거활성(Scavenging activity)으로 표시하며, RC₅₀은 DPPH 농도가 1/2로 감소하는데 필요한 시료의 양(㎍)으로 나타내며 항산화 물질로 잘 알려진 BHT(butylated hydroxytoluene)와 Vit C(ascorbic acid)를 비교하였다.

DPPH radical scavenging activity(%) = (Ac-As)/Ac × 100

Ac : 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도

As : 시료를 첨가한 반응구의 흡광도

각 시기별 동백 잎 추출물의 항산화 작용을 DPPH법에 의해 측정한 결과는 도 6과 표 3에 나타냈다. 최고 농도인 400 μg/mL일 때 DPPH 라디칼 소거능은 2월 동백 잎을 제외한 모든 추출물에서 88% 이상의 소거율을 보여 상당히 높은 수준의 항산화 활성을 나타내었고 그중 4월에 채취한 동백 잎이 50 μg/mL의 농도에서 DPPH 라디칼 소거능이 93% 이상으로 가장 높은 효과를 보였다. DPPH 농도를 1/2로 감소하는데 필요한 시료의 양인 RC₅₀ 값은 4월에 채취한 동백 잎이 15.49 μg/mL로 가장 높은 활성을 보였고 5월 잎은 23.33 μg/mL 이었으며 6, 7, 8월 동백 잎 또한 47 μg/mL 미만의 농도에서 RC₅₀ 값이 확인되어 높은 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 반면 2월에 채취한 동백 잎은 198.52 μg/mL 농도에서 RC50 값이 나타나 가장 저조한 효과를 보였다. 이와 같은 결과는 대조군인 천연 항산화제인 아스코르브산보다 낮은 효과를 보였지만 유의할 만한 수준의 높은 효과가 있음을 확인할 수 있었고 합성 항산화제인 BHT보다는 월등히 높은 항산화 효과를 보였다(도 6 및 도 7 참조).

나. 동백의 부위별 항산화 활성(3월)

완도수목원에서 2006년 3월에 채취한 동백의 부위별 항산화 활성을 측정한 결과는 도 8 및 도 9에 나타냈다. 동백의 잎, 꽃, 꽃봉오리를 각각 채취하여 동결건조한 후 에탄올 추출하여 시료로 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능에 의한 항산화 활성을 측정한 결과 꽃봉오리 > 잎 > 꽃 순으로 RC₅₀ 값이 각각 54.36 μg/mL, 59.69 μg/mL, 80.40 μg/mL 순으로 나타나 세 가지 부위별 추출물 중 꽃봉오리에서 가장 높은 효과를 보였다. 이는 합성항산화제인 BHT(RC₅₀; 198.93)보다 각 부위별 추출물의 항산화 효과가 월등히 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

다. DPPH 라디칼 소거활성 측정

4월에 수집한 동백꽃과 5월에 수집한 동백 유엽, 그리고 7월에 수집한 동백 성엽과 7월에 수집한 차나무 잎을 약탕기에서 1시간 열수 추출하여 시료로 사용하였다. 그 결과는 도 10 및 표 4에 나타낸 바와 같다.

라. SOD (Superoxide dismutase) 활성 측정시험

SOD는 내포 내 활성산소인 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)을 가수분해시켜 과산화수소(H₂O₂, hydrogen peroxidase) 로 전환시키는 생체 내 항산화 효소중의 하나이다. SOD는 원핵세포의 세포질에 존재하는 Cu/Zn SOD와 원핵, 진핵세포의 미토콘드리아에 존재하는 Mn SOD, 남조류등에 존재하는 FeSOD 등이 존재한다. 대부분의 호기성 생물이나 혐기성 생물에서 생성되어 과산화수소를 발생하고 이는 카탈라아제(catalase)와 퍼옥시다아제(peroxidase)에 의해 물과 산소로 전환되어 독성을 상실하게 된다.

동백의 신엽(유엽)과 성엽 그리고 화기 부분을 채취하여 SOD 활성을 측정하였다. 그 구체적인 실험과정은 하기와 같다. SOD 활성은 Beauchamp 및 Fridovich(1971)의 방법을 응용하여 측정하였다. 50 mM 탄산 완충액(carbonic buffer, pH 10.2), 0.1 mM EDTA,,0.1mM 잔틴, 0.025 mM 니트로블루테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT), 효소액이 포함된 용액을 25°C에서 10분간 반응한 후 잔틴 옥시다아제(Xanthine oxidase, 3.3·10-6mM)를 참가하여 반응을 측정하였다. SOD 활성 측정은 550nm에서 30초 단위로 5분간 흡광도를 측정하였다.

그 결과 성엽 추출물의 활성이 가장 높았으며 신엽(유엽)과 화기의 경우 거의 비슷한 활성을 나타내었다. 이는 녹차잎과 비교시 가장 낮은 활성도를 나타내었다.

지금까지의 보고의 경우 녹차의 SOD 활성도는 높게 보고되고 있다. 이 결과 동백의 성엽은 지금까지의 보고된 녹차의 활성도보다 3배에 가까운 높은 활성도를 보이고 있어 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 제거능이 높은 물질을 함유하고 있다고 사료된다 (도 11 참조).

마. APX (ascorbate peroxidase) 활성 측정시험

식물체내의 다양한 활동이 의해 생성되어지는 H₂O₂는 카탈라아제와 퍼옥시다아제에 의해 제거될 수 있다. 아스코르베이트 퍼옥시다아제(APXs)는 세포질과 엽록체에서 작용하는 가장 중요한 제거제의 역할을 한다. 이들은 환원용 기질로 아스코르브산을 이용한다. 또한 글루타티온 퍼옥시다아제(GPXs)가 H₂O₂를 제거하고 리피드 퍼옥시데이션(lipid peroxidation)의 생성에서 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다.

세포는 세포의 구성성분을 보호하고 산화환원상태(redox)를 유지하기 위해 효소학적 및 비효소학적 방어시스템을 지니고 있다. 식물에서 비효소학적 방어시스템에는 아스코르브산(Vitamin C), 글루타티온(GSH), α-토코페롤, 카로티노이드 등이 다량 검출되고 효소적 방어시스템에는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 아스코르베이트 퍼옥시다아제(ascorbate peroxidase), 글루타티온 리덕타아제(glutathione reductase) 등이 있다.

동백에서의 APX의 활성을 측정하였다. APX 활성은 Nacano 및 Asada(1981)의 방법으로 측정하였다. 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.0), 0.5mM 아스코르베이트(ascorbate), 0.1mM H₂O₂, 0.1 mM EDTA의 혼합용액 1㎖를 100㎕의 샘플과 함께 37℃에서 5분 동안 놔두었다. 290nm에서 용액의 변화된 흡광도를 측정하였다.

APX은 SOD 활성측정과 비슷하게 성엽에서 높은 활성을 나타내었다. 그러나 신엽과 화기의 활성과 비교해 볼 때 많은 차이를 나타내지 않았으며 녹차잎과의 활성 비교 또한 많은 차이를 나타내지 않았다. 동백에서의 수소 퍼옥시다아제(hydrogen peroxidase) 소거활성은 녹차와 비교하여 거의 비슷한 활성을 보였다.

제조예 1. 산제의 제조

동백나무 추출물 10mg

수크로즈 100mg

탈크 10mg

상기 성분들을 분말화하여 혼합한 후 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제조예 2. 정제의 제조

동백나무 추출물 10mg

전분 100mg

수크로즈 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 정제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 이를 타정하여 정제를 제조한다.

제조예 3. 캅셀제의 제조

동백나무 추출물 10mg

결정성 셀룰로오즈 3mg

락토오즈 15mg

스테아린산 마그네슘 1mg

통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

제조예 4. 과립제의 제조

동백나무 추출물 10mg

대두 추출물 50mg

포도당 200mg

전분 500mg

상기 성분들을 혼합한 후 30% 에탄올 100mL를 첨가하여 60℃에서 건조시켜 과립을 형성한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.

제조예 5. 환제의 제조

동백나무 추출물 20mg

유당 1,500mg

글리세린 1,500mg

전분 980mg

상기 성분들을 혼합한 후 통상의 환제의 제조방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조한다.

제조예 6. 주사제의 제조

동백나무 추출물 10mg

만니톨 180mg

주사용 멸균 증류수 2,970mg

Na₂HPO₄·12H₂O 30mg

통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플당 (2mL)가 되도록 상기 성분을 혼합하여 제조한다.

제조예 7. 액제의 제조

동백나무 추출물 10mg

이성화당 10,000mg

만니톨 5,000mg

정제수 적량

통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 상기 성분을 용해시키고, 적절한 향을 가한 다음 병에 충진하여 멸균시켜 제조한다.

Claims

동백나무 유엽의 수추출물을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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동백나무 유엽의 수추출물을 함유하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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