KR102276305B1 - 신규 리비톨 탈수소효소 및 이를 이용한 d-리불로스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 리비톨 탈수소효소 및 이를 이용한 D-리불로스 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 스핑고모나스(Sphingomonas sp.) 균주로부터 유래한 신규 리비톨 탈수소효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리비톨 탈수소효소 제조방법, 상기 리비톨 탈수소효소 등을 이용한 D-리불로스 제조방법, 및 상기 리비톨 탈수소효소 등을 포함하는 D-리불로스 제조용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 저온에서도 효소 활성을 가지므로, 저온에서 리비톨 탈수소효소와 D-리비톨을 반응시켜 D-리불로스를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소를 이용하면 별도의 화학적 공정을 거치지 않고 친환경적인 공정으로 D-리불로스를 제조할 수 있다.

Description

신규 리비톨 탈수소효소 및 이를 이용한 D-리불로스 제조방법 {A novel ribitol dehydrogenase and D-ribulose preparation method using the same}

본 발명은 신규 리비톨 탈수소효소 및 이를 이용한 D-리불로스 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규 리비톨 탈수소효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리비톨 탈수소효소 제조방법, 상기 리비톨 탈수소효소 등을 이용한 D-리불로스 제조방법, 및 상기 리비톨 탈수소효소 등을 포함하는 D-리불로스 제조용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 단당은 폴리히드록실알데히드 구조를 가지는 알도오스(aldose), 폴리히드록실케톤 구조를 가지는 케토오스(ketose) 및 그들을 환원하여 얻어지는 당알콜로 구분된다. 또한, 탄소의 개수에 따라 삼탄당(triose), 사탄당(tetrose), 오탄당(pentose), 육탄당(hexose) 등으로 구분하기도 한다. 예컨대, 육탄당의 알도오스인 알도헥소스(aldohexose)에 속하는 당으로는, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 이도스, 갈락토스 등이 있고, 육탄당의 케토오스인 케토헥소스(ketohexose)에 속하는 당으로는, 프시코스, 프룩토스, 타가토스 등이 있다.

한편, D-리불로스(화학식: C₅H₁₀O₅)는 5개의 탄소로 구성된 단당류 탄수화물로, 케톤(C=O)기를 가지고 있다. D-리불로스는 인간에서는 5탄당 인산경로의 중간 산물이며, 식물에서는 D-리불로스-1,5-비스인산의 형태로 CO₂와 반응하여 광합성을 시작한다. 또한, D-리불로스는 많은 생리활성 물질의 생성에 중요한 역할을 하고, 가지 달린 오탄당들의 합성에 사용되는 원료 의약품으로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 더욱 주목을 받고 있다. 이에, 이러한 희소 당질에 대해 수요가 생기고 있어, 이들 당질의 안정적인 제조 방법의 확립이 요구되고 있다.

D-리불로스의 주 제조방법은 화학 합성방법이나, 낮은 수율, 복잡한 반응, 부산물 생성 등의 문제점이 있다. 생물학적 합성방법으로는 리비톨 탈수소효소를 이용하여 D-리불로스를 제조하는 방법이 있으며, 엔테로박터(Enterobacter)와 같은 미생물로부터 유래된 리비톨 탈수소효소가 보고된 바 있다(일본 공개특허 제1996-056659호).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 생촉매를 사용하여 리불로스를 생산하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 저온에서 효소 활성을 갖는 리비톨 탈수소효소를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0083939호 일본 공개특허 제1996-056659호

본 발명의 목적은 스핑고모나스(Sphingomonas sp.) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리비톨 탈수소효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리비톨 탈수소효소를 암호화하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리비톨 탈수소효소 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 D-리비톨에 상기 리비톨 탈수소효소 또는 상기 형질전환체를 접촉시켜 D-리불로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리비톨 탈수소효소 또는 상기 형질전환체; 및 D-리비톨을 포함하는 D-리불로스 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 스핑고모나스 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리비톨 탈수소효소를 제공한다.

본 발명의 용어 "리비톨"은 결정성 오탄당 알코올(C₅H₁₂O₅)로서, 아도니톨이라는 명칭으로도 불린다.

본 발명의 용어 "탈수소효소"는 유기분자에서 수소를 제거하는 화학반응을 촉매하는 효소이다.　

본 발명의 "스핑고모나스 균주"는 극지(북극)에서 서식하는 지의류(lichen) 공생 세균으로, 구체적으로 Sphingomonas sp. PAMC 26621일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 일 예로 90% 이상, 다른 일 예로 95% 이상, 또 다른 일 예로 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 리비톨 탈수소효소의 활성을 나타내는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(Sambrook et al., 1989, Infra), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

아울러 종래의 스핑고모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다 대장균(E. coli)에서 효율적으로 발현될 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

아울러 종래의 스핑고모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다도 대장균에서 보다 효율적으로 발현될 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 리비톨 탈수소효소의 범주에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 스핑고모나스 균주를 배양하여 수득한 천연형 리비톨 탈수소효소일 수 있고, 형질전환체를 배양하여 수득한 재조합 리비톨 탈수소효소일 수 있다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 Sphingomonas sp. PAMC 26621 균주를 리비톨이 포함된 최소 배지에서 배양시킨 후, 당해 분야에서 공지된 분리 및 정제 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 상기 공지된 분리 및 정제 방법은 파쇄, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 황산 암모늄 침전), 크로마토그래피(예를 들면 양이온 교환, 음이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 황산 암모늄 침전, DEAE 크로마토그래피, SP 컬럼 크로마토그래피 및 Mono Q 컬럼 크로마토그래피 (pH 6.0 및 pH 8.)을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에서 따른 리비톨 탈수소효소는 당해 분야에서 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조되거나, 상기 리비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 medium-chain dehydrogenase/reductase (MDR) 그룹에 속하며, 이 그룹에 속하는 첫 번째 리비톨 탈수소효소이다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소의 분자량은 약 39 kDa이고, 삼량체로 존재하는 경우의 분자량은 약 117 kDa이다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 촉매 작용에 금속이온을 필요로 하지 않으며, 4℃ 내지 60℃의 온도에서 촉매작용을 할 수 있다.

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소의 촉매 효율(catalytic efficiency, k_cat/K_m)은 3.5 mM^-1s^-1로 우수한 효율을 보여, 적은 양으로도 효소 반응을 수행할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 리비톨 탈수소효소를 암호화하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 Sphingomonas sp. PAMC 2662로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다. 구체적으로는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

또한 종래의 스핑고모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다도 대장균에서 보다 효율적으로 발현될 수 있는 단백질을 암호화할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 구체적으로는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 발명의 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)와 같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102(2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 구체적으로, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 재조합 벡터를 사용할 수 있으며, 구체적으로 pET28b를 사용할 수 있다.

상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 본 발명에서 제공하는 신규한 리비톨 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 대장균에 도입하여, 상기 대장균을 리비톨 탈수소효소를 생산할 수 있는 형질전환체로 변이시키는 역할을 수행할 수 있다.

이를 위하여, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 단백질의 배출을 위한 시그널 영역을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수 도있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환체는 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 리비톨 탈수소효소를 생산하는데 사용될 수 있다.

상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 리비톨 탈수소효소를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 피키아 파스토리스 등의 효모 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 구체적으로는 대장균일 수 있다.

아울러, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 리비톨 탈수소효소를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 열충격 방법(heat shock), 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리비톨 탈수소효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 리비톨 탈수소효소를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양 물의 pH를 조절할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 리비톨 탈수소효소는 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 리비톨 탈수소효소를 발현 및 축적시켜, 배양물로부터 상기 리비톨 탈수소효소를 분리 및 정제를 통해 회수하여 제조할 수 있다.

발현된 리비톨 탈수소효소를 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 회수 방법은 본 발명의 리비톨 탈수소효소를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 파쇄, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 황산 암모늄 침전), 크로마토그래피(예를 들면 양이온 교환, 음이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

회수한 물질이 본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소임을 확인하는 것은, 당업계에 알려져 있는 통상의 방법, 구체적으로 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴블로팅 등에 의해 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 D-리비톨에 상기 리비톨 탈수소효소 또는 상기 형질전환체를 접촉시켜, D-리비톨을 D-리불로스로 전환시키는 단계를 포함하는 D-리불로스 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 접촉은 pH 6.0 내지 pH 11.0 조건에서, 4℃ 내지 40℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 접촉은 pH 7.0 내지 pH 10.0 조건, pH 7.0 내지 pH 9.0 또는 pH 8.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 접촉은 4℃ 내지 30℃, 4℃ 내지 20℃, 또는 4℃ 내지 15℃ 온도조건에서 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 D-리불로스 제조방법은 제조된 D-리불로스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 파쇄, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 황산 암모늄 침전), 크로마토그래피(예를 들면 양이온 교환, 음이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 제1항의 리비톨 탈수소효소 또는 제4항의 형질전환체; 및 (ii) D-리비톨을 포함하는 D-리불로스 제조용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 리비톨 탈수소효소 또는 상기 형질전환체에서 발현된 리비톨 탈수소효소의 작용으로 D-리비톨을 D-리불로스로 전환시킬 수 있다. 또한 상기 조성물을 포함하여 키트 형태로 제공함으로써, 상기 키트 내에서 D-리불로스를 제조하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 D-리불로스 제조용 조성물은 당해 D-리불로스 제조용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다

본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소는 저온에서도 효소 활성을 가지므로, 저온에서 리비톨 탈수소효소와 D-리비톨을 반응시켜 D-리불로스를 생산하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 리비톨 탈수소효소를 이용하면 별도의 화학적 공정을 거치지 않고 친환경적인 공정으로 D-리불로스를 제조하는 것이 가능하게 된다. 뿐만 아니라, 리비톨 탈수소효소의 우수한 촉매 효율(catalytic efficiency)로 인해 적은 양으로도 반응이 가능하며, 빠른 반응 속도로 D-리불로스를 제조할 수 있다.

도 1a는 SpRDH의 정제 단계 별 SDS 겔 사진이다. M: Size marker, 1: 황산암모늄(30~60%) 침전, 2: DEAE 크로마토그래피, 3: SP 컬럼 크로마토그래피, 4 & 5: Mono Q 컬럼 크로마토그래피 (pH 6.0), 6: Mono Q 컬럼 크로마토그래피 (pH 8.0).
도 1b는 정제된 SpRDH의 겔-여과 크로마토그래피(Superdex-200 컬럼) 결과 그래프이다. 분자량 결정에 사용한 표준 단백질은 다음과 같다: Catalase (232 kDa), glutathione reductase (100 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), ovalbumin (44 kDa).
도 1c는 정제된 SpRDH의 Native-PAGE 사진이다. 분자량 비교를 위해 사용한 단백질은 다음과 같다. 1: glutathione reductase, 2: bovine serum albumin, 3: SpRDH.
도 2는 기질에 따른 SpRDH의 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 SpRDH의 효소반응에 있어서 반응 온도에 따른 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 SpRDH의 효소반응에 있어서 반응 pH에 따른 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 SpRDH의 열 안정성을 확인하기 위한 것으로, 각 온도에서 반응시간 후의 잔존 효소 활성정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 SpRDH를 이용한 효소 반응의 생성물 및 대조 물질(NAD⁺, NADH, D-라이보스, D-리불로스, D-리비톨)의 HPLC 결과 그래프이다.
도 5a는 재조합 SpRDH의 정제 단계 별 SDS 겔 사진이다. M: Size marker, 1: 세포 용해물, 2: 세척, 3: His trap으로부터 용출된 분획, 4 : Q-Sepharose 컬럼으로부터 용출된 분획.
도 5b는 재조합 SpRDH의 겔-여과 크로마토그래피(Superdex-200 컬럼) 결과 그래프이다. 분자량 결정에 사용한 표준 단백질은 다음과 같다: Catalase (232 kDa), glutathione reductase (100 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), ovalbumin (44 kDa).
도 5c는 재조합 SpRDH의 Native-PAGE 사진이다. 분자량 비교를 위해 사용한 단백질은 다음과 같다. 1: BSA, 2: 천연형 SpRDH, 3: 재조합 SpRDH.
도 6은 기질에 따른 재조합 SpRDH의 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 재조합 SpRDH의 효소반응에 있어서 반응 온도에 따른 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 재조합 SpRDH의 효소반응에 있어서 반응 pH에 따른 효소 활성도를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 Sphingomonas sp. PAMC 26621 균주는 한국 극지연구소(인천, 대한민국)의 Polar and Alpine Microbial Collection으로부터 제공받아 사용하였고, pET28b (+) 벡터는 Novagen(매디슨, 위스콘신, 미국)에서 구입하여 사용하였으며, ArcticExpress Escherichia coli (DE3)는 Agilent Technologies(산타클라라, 캘리포니아, 미국)에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1: 리비톨 탈수소효소(SpRDH) 수득

실시예 1-1: 스핑고모나스( Sphingomonas sp. PAMC 26621) 균주 배양

Reasoner's 2A 플레이트에서 생장한 Sphingomonas sp. PAMC 26621의 하나의 콜로니를 Reasoner's 2A broth에 접종시키고 15℃에서 이틀동안 배양하였다(OD₆₀₀=0.8-1.0). 이어서, 배양 배지의 1%를 100 mL의 최소 배지(10.5 g/L K₂HPO₄, 5 g/L KH₂PO₄, 1g/L (NH₄)₂SO₄, 0.5 g/L sodium citrate, 2 mM MgSO₄, 15 μM 비타민 B₁ 및 1% 리비톨)로 옮긴 후, 15℃에서 24시간 225 rpm으로 진탕배양하였다.

실시예 1-2: 리비톨 탈수소효소(SpRDH) 분리 및 정제

황산 암모늄 침전법 및 4단계 컬럼 크로마토그래피 단계를 사용하여 Sphingomonas sp. PAMC 26621로부터 SpRDH를 정제하였다.

Sphingomonas sp. PAMC 26621을 15℃에서 1%(w/v) 리비톨을 함유하는 최소 배지에서 배양한 후, 20분 동안 세포를 10,000 x g 에서 원심분리하여 수거하고 버퍼 A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KC)에 현탁시켰다. 초음파 처리를 통해 단백질을 추출하였고, 30분동안 20,000 x g에서 원심분리하여 세포 용해물을 수득하였다. 세포용해물을 황산 암모늄으로 침전시킨 후, 30분동안 20,000 x g에서 원심분리하여 30-60% 포화 황산 암모늄을 함유하는 분획을 수집하였다.

이 펠렛을 버퍼 A로 평형화된 HiPrep DEAE EF 16/10 컬럼에 적용된 HiTrap 탈염 26/10 컬럼을 사용하여 2 mL/min의 유속으로 버퍼 A에 재현탁시키고 탈염시켰다. 이어서, KCl-segmented gradient(두개의 CV(column volume)를 갖는 50-200 mM KCl, 15 CV를 갖는 200-500 mM 및 3 CV를 갖는 500-1000 mM KCl)를 사용하여 단백질을 용출시켰다(elute). 활성 분획을 풀링하고 탈염 컬럼에서 버퍼 B (50 mM sodium acetate, pH 5.0, 50 mM NaCl)에 탈염시킨 다음, 버퍼 B로 평형화된 HiPrep SP FF 16/10 컬럼에 로딩하였다. 버퍼 B에서 2 mL/min의 유속으로 50-1000 mM NaCl의 linear gradient에 의해 단백질을 용출시켰다. 활성분획을 풀링하고 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼 C (20 mM L-Histidine, pH 6.0, 50 mM KCl)에서 즉시 탈염시켰다. 이 샘플을 버퍼 C로 평형화된 Mono Q HR 5/5 컬럼(1 mL)에 적용시킨 후, 버퍼 C (50-200 mM: 5 CV; 200-400 mM: 20 CV; 400-1000 mM: 5 CV)에서 0.5 mL/min의 유속으로 KCl의 segmented gradient에 의해 단백질을 용출시켰다. 활성분획을 풀링하고 5 mL-Amicon Ultra 원심분리 필터(10 kDa)로 버퍼 A에 탈염한 후, 버퍼 A를 갖는 Mono Q 컬럼을 사용하여 정제하였다. 버퍼 A(pH 8.0)가 용출 버퍼(elution buffer)로 사용된 것을 제외하고, 최초의 Mono Q 컬럼 정제를 위해 상기 언급한 것과 동일한 조건 하에서 단백질을 용출시켰다. 정제 공정의 모든 단계는 4℃에서 수행되었다.

실험예 1: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 특성 실험

상기 실시예 1에서 수득한 리비톨 탈수소효소의 물리 화학적 특성을 조사하였다.

실험예 1-1: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 분자량 확인

실시예 1-2의 방법으로 정제된 SpRDH의 분자량을 두가지 방법으로 확인하였다.

먼저, 정제된 SpRDH를 AKTA Explorer system (GE Healthcare) 상에서 수행되는 크로마토그래피 단계와 함께 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다.

그 결과, 도 1a의 lane 6에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE에서 SpRDH의 분자량은 약 39 kDa으로 확인되었다.

다음으로, Superdex 200 컬럼을 사용한 겔 여과 크로마토그래피 및 native-PAGE를 수행하여 천연형 SpRDH의 분자량을 측정하였다.

그 결과, 도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 천연형 SpRDH의 분자량은 약 117 kDa이고, 삼량체(trimer)를 형성함을 확인하였다.

실험예 1-2: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 기질 특이성 확인

본 발명에 따른 SpRDH의 효소 활성을 확인하기 위해, 기질 특이성을 조사하였다.

구체적으로, Shimadzu UV-1800 분광 광도계를 사용하여 60℃, 340 nm에서 NADH 형성의 흡광도를 측정함으로써 SpRDH 활성을 확인하였다. 반응 혼합물(500 μL)은 pH 8.0에서 100 mM 포타슘 포스페이트에 1 mM NAD+, 40 mM 기질, 그리고 적절한 양의 SpRDH가 함유된 것으로, 기질로는 D-리비톨, D-자일리톨, D-만니톨, 에리스리톨, myo-이노시톨, D-갈리티톨 및 글리세롤을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, D-리비톨에 대한 SpRDH의 효소 활성(2800 U/mg)을 100%로 취하였을 때, D-리비톨 대비 D-자일리톨은 66% 효소 활성, 에리스리톨은 4%의 효소 활성을 나타내어, 에리스리톨에 대한 활성은 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다. 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨 또는 글리세롤을 기질로 사용하였을 때, SpRDH의 효소 활성은 나타나지 않았다.

실험예 1-3: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 최적 온도, 최적 pH, 및 열 안정성 확인

(1) 본 발명에 따른 SpRDH의 최적 온도

상기 실험예 1-2에 기재된 효소 활성 측정 방법을 사용하여, 10℃ 내지 80℃에서 효소 활성을 측정함으로써 겉보기 최적 온도(apparent optimal temperature)를 결정하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, SpRDH는 60℃에서 최대 효소 활성을 나타내었다.

(2) 본 발명에 따른 SpRDH의 최적 pH 조사

상기 실험예 1-2에 기재된 효소 활성 측정 방법에 따라, SpRDH의 최적 온도인 60℃에서 다양한 pH에 따른 효소 활성을 측정하였다. 기질은 40 mM D-리비톨이고, 조효소는 1 mM NAD+를 사용하였다. 100 mM 포타슘 포스페이트 (pH 6.0-8.0), 100 mM 포타슘 포스페이트-NaOH (pH 8.5-11.0), 및 50 mM Tris.HCl (pH 8.0-11.0)의 버퍼를 사용하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 인산 버퍼 조건에서 pH 8.0일 때 SpRDH가 최대 효소 활성을 나타내었다.

(3) 본 발명에 따른 SpRDH의 열 안정성 조사

SpRDH의 열 안정성을 조사하기 위해, 상기 실험예 1-2에 기재된 효소 활성 측정 방법에 따라 SpRDH의 잔류 활성 수준(residual activity level)을 측정하였다. SpRDH를 다양한 온도(4℃, 25℃, 40℃, 50℃, 및 60℃)에서 방치한 후, 최적 조건(60℃, pH 8.0)에서 30분 간격으로 4시간 동안 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, SpRDH는 4 내지 50℃ 온도 구간에서 4시간 동안 70% 이상의 효소활성을 유지하였으나, 60℃ 온도에서는 30분 이내에 SpRDH의 효소활성이 소멸되었다.

실험예 1-4: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 효소반응에 따른 생성물 확인

SpRDH에 의해 촉매된 반응 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 확인하였다.

구체적으로, 1 mL의 반응 혼합물(100 mM 포타슘 포스페이트에 5 mM NAD+, 100 mM 리비톨 및 0.06 μM SpRDH 효소가 함유됨)을 40℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, Waters Alliance HPLC 시스템에 20 μL의 반응 혼합물 또는 실제 화합물(authentic compound) (10 mg/ml NAD+, NADH, 리비톨, 리룰로스 및 리보스)을 Sugar-Pak I 컬럼 (Ø 6.5 X 300 mm)에 각각 로딩하여, 굴절률 검출기(refractive index detector)에 의해 피크를 검출하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 반응물의 HPLC 크로마토그램은 NADH 및 리불로스의 피크와 동일한 위치에서 피크를 나타낸바, SpRDH가 리비톨 및 NAD+를 각각 리불로스 및 NADH로 전환시키는 리비톨 탈수소효소임을 확인하였다.

실험예 1-5: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 kinetics 측정

SpRDH의 kinetic parameter는 25℃에서 NAD+ 농도가 0.05 내지 1 mM 범위에서 변할 때, 10 내지 160 mM 범위 내 여러 고정 농도의 리비톨에서 SpRDH의 초기 속도를 측정함으로써 결정하였고, 그 반대의 경우에도 속도를 측정하였다. SigmaPlot 14.0 (Systat Software Inc., San Jose, USA)의 SigmaPlot Enzyme Kinetic Module을 사용하여 데이터를 분석하였고, 모든 실험은 3 번 수행하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 결과를 얻었으며, SpRDH가 비교적 높은 촉매 효율 (k _cat/K _m=3.5 mM^-1s^-1)로 리비톨을 리불로스로 전환시킴을 확인하였다.

본 발명에 따른 SpRDH의 kinetic parameters

K m , ribitol (mM)	K m , NAD+ (mM)	k cat , ribitol (s-1)	k cat /K m , ribitol (mM-1 s-1)
8.5	0.3	29	3.5

실험예 1-6: 효소 작용 억제제에 따른 리비톨 탈수소효소(SpRDH)의 활성 변화 확인

본 발명에 따른 SpRDH의 촉매 작용에 금속이온이 관여하는지 여부를 확인하기 위하여, 효소 작용 억제제에 따른 SpRDH의 활성 변화를 조사하였다.

구체적으로, 1 mM 또는 5 mM의 억제제 (N-Ethylmaleimide, NEM; Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF; Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)를 SpRDH 반응 혼합물에 첨가한 후, 실험예 1-2에 기재된 효소 활성 측정 방법과 같이 리비톨 탈수소효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, NEM 1 mM 및 5 mM에서 SpRDH 활성이 각각 32% 및 4.3%로 감소하였다. NEM에 의한 효소 활성의 감소는 효소 활성 부위에 아미노산 시스틴 잔기가 있음을 의미한다. 또한, PMSF를 사용한 경우, 5 mM PMSF에서는 SpRDH의 활성이 81%로 감소하였으나, 1 mM PMSF에서는 SpRDH의 활성에 변화가 없었다. 그러나, EDTA를 사용한 경우, 1 mM 및 5 mM 모두에서 SpRDH의 활성 감소가 관찰되지 않았다. EDTA에 의한 SpRDH 효소 작용의 감소 효과가 없으므로, 이 결과는 SpRDH의 촉매작용에 금속이온이 관여하지 않음을 의미한다.

SpRDH 활성에 대한 효소 작용 억제제의 효과

Inhibitor	Relative activity (%)
	1 mM	5 mM
None	100±1	100±1
N-Ethylmaleimide (NEM)	31.6±0.1	4.3±0.4
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	99±1.4	81.1±0.2
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	100±0.8	99±0.5

실험예 1-7: 리비톨 탈수소효소(SpRDH)에서 금속 이온 검출 여부 확인

시료에 존재하는 원소에 대한 분석을 위해 한국기초과학지원연구원(KBSI) 서울센터에 의뢰하여 정제한 SpRDH 시료의 금속이온을 조사하였다.

그 결과, Mg가 소량 (3 ㎍/L) 검출되었으며, Zn을 포함한 금속이온은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 실험예 1-6의 EDTA 처리 결과와 같이, SpRDH의 효소 작용에 금속이온이 관여하지 않음을 의미한다.

Elements	Concentration (㎍/L)
Mg	3.0
Mn	< 1.0
Fe	< 1.0
Co	< 1.0
Ni	< 1.0
Cu	< 1.0
Zn	< 1.0

실시예 2: 재조합 리비톨 탈수소효소(SpRDH) 제조

실시예 2-1: 리비톨 탈수소효소(SpRDH) 유전자 클로닝 및 형질전환체 제조

서열번호 3 및 4에 따른 서열의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 Sphingomonas sp. PAMC 26621의 게놈으로부터 SpRDH를 암호화하는 서열목록 2의 염기서열을 갖는 rdh 유전자를 증폭시킨 후, pET28b 발현 벡터에 클로닝 하였다. pET28b-rdh 구조체(construct)를 DNA 서열 분석에 의해 확인한 후, Arctic Express E. coli (DE3)로 형질전환하였다.

Primer 1: TACCATGGATGCGGTCGTCTGCCACG (Nco I site underlined)

Primer 2: ATCTCGAGTGTCGACGGGCTCAGCACGA (Xho I site underlined)

실시예 2-2: 재조합 리비톨 탈수소효소(SpRDH) 발현 및 정제

재조합 SpRDH를 Arctic Express E. coli에서 발현시켰다. 대장균을 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 함유하는 Luria-Bertani (LB) broth에서 세포밀도 OD₆₀₀ = 0.6-0.8까지 30℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 12℃에 15분 동안 놓은 후, 최종 농도 1 mM로 IPTG 유도(IPTG induction)하고, 12℃에서 추가로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 10,000 x g, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 수확하였다. 펠렛을 50 mM Tris·HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸에 재현탁시킨 후, 초음파 분쇄하였다. 세포 용해물을 15,000 x g, 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다.

버퍼 A에서 100 mM 및 500 mM 이미다졸 step gradient를 갖는 1-mL HisTrap 컬럼을 사용한 후, 버퍼 A에서 50 내지 1000 mM KCl linear gradient를 갖는 5-mL Q-Sepharose FF 컬럼을 사용한 음이온-교환 크로마토그래피를 AKTA Explorer System (GE Healthcare) 상에서 사용하여 재조합 SpRDH를 정제하였다. 재조합 SpRDH(SpRDH)는 Arctic Express E. coli (DE3) 세포에서 C-말단에 융합된 6 x His-tag를 갖는 가용성 단백질로서 발현되었다.

모든 정제 단계를 4℃에서 수행하였고, 순수한 재조합 SpRDH를 액체 질소에 동결시키고 추가 실험을 위해 -80℃에 저장하였다.

실험예 2: 재조합 리비톨 탈수소효소(rSpRDH)의 특성 실험

상기 실시예 2에서 수득한 재조합 리비톨 탈수소효소(rSpRDH)의 물리 화학적 특성을 조사하였다.

실험예 2-1: 재조합 리비톨 탈수소효소(rSpRDH)의 분자량 확인

실시예 2-2의 방법으로 정제된 재조합 SpRDH의 분자량을 실험예 1-1에 기재된 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 5a의 lane 4에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE에서 재조합 SpRDH의 분자량은 천연형 SpRDH와 동일하게 약 39 kDa으로 확인되었다.

또한, 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이, 겔 여과 크로마토그래피 및 native-PAGE에서 천연형 재조합 SpRDH의 분자량은 약 117 kDa이고, 삼량체(trimer)를 형성함을 확인하였다.

실험예 2-2: 재조합 리비톨 탈수소효소(rSpRDH)의 기질 특이성 확인

본 발명에 따른 재조합 SpRDH의 효소 활성을 확인하기 위해, 실험예 1-2에 기재한 방법으로 rSpRDH의 기질 특이성을 조사하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 천연형 SpRDH와 마찬가지로 재조합 SpRDH도 D-리비톨에 대한 기질 특이성이 있고, 에리스리톨에 대한 활성은 거의 나타나지 않음을 확인하였다. 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨 또는 글리세롤을 기질로 사용하였을 때, rSpRDH의 효소 활성은 나타나지 않았다.

실험예 2-3: 재조합 리비톨 탈수소효소(rSpRDH)의 최적 온도 및 최적 pH 확인

본 발명에 따른 재조합 SpRDH의 최적 온도 및 최적 pH를 실험예 1-3에 기재된 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 재조합 SpRDH 또한 60℃ 및 pH 8.0에서 최대 효소 활성을 나타내었다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Daegu University <120> A novel ribitol dehydrogenase and D-ribulose preparation method using the same <130> KPA01456 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Sphingomonas sp. <400> 1 Met Thr Ala Val Val Cys His Gly Pro Lys Asp Tyr Arg Val Glu Glu 1 5 10 15 Ile Ala His Pro Thr Ala Gly Ala Leu Glu Phe Val Ile Arg Val Thr 20 25 30 Ala Cys Gly Ile Cys Ala Ser Asp Cys Lys Cys Trp Ser Gly Ala Lys 35 40 45 Met Phe Trp Gly Asp Asp Pro Trp Val Lys Ala Pro Val Val Pro Gly 50 55 60 His Glu Phe Phe Gly Val Val Asp Glu Leu Gly Glu Gly Ala Gly Glu 65 70 75 80 His Phe Gly Val Ala Val Gly Asp Arg Val Ile Ala Glu Gln Ile Val 85 90 95 Pro Cys Glu Arg Cys Arg Tyr Cys Arg Ser Gly Gln Tyr Trp Met Cys 100 105 110 Glu Val His Asn Ile Phe Gly Phe Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Gly 115 120 125 Met Ala Gln Phe Met Arg Leu Pro Arg Thr Ser Arg Val His Leu Ile 130 135 140 Pro Ala Glu Ile Pro Asp Asp Asp Ala Val Ile Ile Glu Pro Leu Ala 145 150 155 160 Cys Ala Leu His Thr Val Arg Arg Gly Thr Ile Gly Phe Glu Asp Val 165 170 175 Val Val Ile Ala Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Met Met Val Gln Ala 180 185 190 Ala Arg Leu Gln Thr Pro Arg Lys Leu Val Val Ile Asp Met Val Pro 195 200 205 Glu Arg Leu Ala Leu Ala Thr Thr Phe Gly Ala Asp Val Val Ile Asn 210 215 220 Pro Ala Thr Asp Asp Ala Leu Ala Ile Val His Gly Leu Thr Asp Gly 225 230 235 240 Tyr Gly Cys Asp Val Tyr Ile Glu Ala Thr Gly Ser Pro Ala Gly Val 245 250 255 Val Gln Gly Leu Asn Leu Ile Arg Arg Leu Gly Arg Phe Val Glu Phe 260 265 270 Ser Val Phe Gly Ser Asp Thr Thr Val Asp Trp Ser Ile Ile Gly Asp 275 280 285 Arg Lys Glu Leu Asp Val Arg Gly Ala His Leu Gly Pro Tyr Cys Tyr 290 295 300 Pro Ile Ala Ile Asp Leu Leu Ser Arg Gly Leu Ile Thr Ser Asn Gly 305 310 315 320 Ile Val Thr His Arg Phe Pro Leu Ile Gln Trp Ala Glu Ala Ile Ala 325 330 335 Val Ala Asp Ser Leu Glu Ser Ile Lys Val Val Leu Ser Pro Ser Thr 340 345 350 <210> 2 <211> 1059 <212> DNA <213> Sphingomonas sp. <400> 2 atgacggcgg tcgtctgcca cggcccgaag gattaccgcg tcgaagagat cgcccatccc 60 acggcgggcg cgcttgagtt cgtcatccgc gtgacggcct gcggcatctg cgcgagcgac 120 tgcaaatgct ggtcgggggc gaagatgttc tggggagacg atccctgggt gaaggcgcca 180 gtcgtacccg gccacgagtt cttcggcgtg gtggacgagc tcggcgaagg tgccggcgaa 240 cacttcggcg tcgccgtcgg cgaccgagtg atcgccgagc agatcgtgcc gtgcgaacgc 300 tgccgctact gccgctccgg ccaatattgg atgtgcgagg tccacaacat cttcggcttc 360 caacgcctgg tggccgacgg tgggatggcg cagttcatgc gcctgccgcg aacgtcgcgc 420 gtgcacctca tcccggccga aattccggac gacgacgcgg tgatcatcga gccgctcgcc 480 tgcgcgctcc acaccgtccg gcgcggaacg atcggcttcg aggacgtcgt cgtgatcgcc 540 ggcgcgggac cgatcggcct gatgatggtg caggcggcaa ggctccagac cccgcgcaag 600 ctggtggtta tcgacatggt cccagaacgg ctggcgctcg cgaccacgtt cggcgccgac 660 gtcgtcatca accccgcgac ggacgacgca ctcgcgatcg tgcacgggct gacggacggt 720 tacggctgcg acgtctacat agaggcgacc ggatcgcctg ccggcgtcgt gcagggacta 780 aacctcatcc gccgcctcgg ccggttcgtg gagttctccg tgttcgggag cgacaccacg 840 gtcgattggt cgatcatcgg ggaccggaag gagctcgacg tccgcggcgc gcatttgggc 900 ccctactgct atccgatcgc gatcgacctg ctctcacgcg gcctgatcac gtccaacggc 960 atcgtcacgc acaggtttcc tctgatccaa tgggcggaag ccatcgcggt cgccgactcc 1020 ctggagtcga tcaaggtcgt gctgagcccg tcgacatga 1059

Claims (9)

1. 스핑고모나스(Sphingomonas sp.) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리비톨 탈수소효소; 또는 상기 리비톨 탈수소효소를 발현하는 스핑고모나스 균주 또는 형질전환체를 D-리비톨에 접촉시켜, 상기 D-리비톨을 D-리불로스로 전환시키는 단계를 포함하는 D-리불로스 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 4℃ 내지 40℃ 온도에서 수행되는, D-리불로스 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 D-리불로스를 분리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, D-리불로스 제조방법.
4. (i) 스핑고모나스(Sphingomonas sp.) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리비톨 탈수소효소; 또는 상기 리비톨 탈수소효소를 발현하는 스핑고모나스 균주 또는 형질전환체; 및 (ii) D-리비톨을 포함하는 D-리불로스 제조용 조성물.
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