KR101176794B1

KR101176794B1 - 인간 ｇ?ｃｓｆ 제조 방법

Info

Publication number: KR101176794B1
Application number: KR1020087022969A
Authority: KR
Inventors: 산지브 쿠마르 멘디라따; 비브호르 사라스와트; 판카즈 알. 파텔
Original assignee: 카딜라 핼쓰캐어 리미티드
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2012-08-24
Also published as: AP3142A; DK2182007T3; BRPI0707078A2; JP2011229541A; CN102776261B; CN102776261A; US8021862B2; WO2007102174A2; EP2182007A1; AU2007224331A1; ZA200806978B; CN101410410B; US20090305354A1; AP2008004592A0; PL2182007T3; EA200870320A1; DK1994138T3; US20110070611A1; EP1994138A2; JP4927103B2

Abstract

본 발명은 생산 단계 중 고염 유도된 플라스미드 안정성의 증가를 통해 고수율의 G-CSF를 생산하는 개선된 방법을 개시한다.

Description

인간 Ｇ?ＣＳＦ 제조 방법 {Process for preparing human G-CSF}

본 발명은 생산 단계 중 고염 유도된 플라스미드 안정성의 증가를 통해 고수율의 G-CSF를 생산하는 개선된 방법에 관한 것이다.

사이토카인인 과립구집락자극인자 (Granulocyte Colony Stimulating Factor:G-CSF) 치료는 중증 만성 호중성 백혈구 감소증 환자들의 삶의 질을 크게 향상시킨다 [Jones et al. JAMA 270: 1132-1133 (1993)]. G-CSF는 골수로부터 호중구 방출 및 향상된 항미생물 활성에 대한 그의 활성화의 강력한 내재적 자극이다. G-CSF는 급성 질환의 다양한 전임상 모델에서 광범위하게 평가되어 왔으며 그 결과는 대체로 긍정적이었다[Marshall J.C. Shock 24: 120-9 (2005)]. 화학요법 주기 중에서 입증된 효능으로 인해, G-CSF는 종양학에서 사용되는 중요한 생약학적 약물이다. G-SCF는 다양한 유형의 세포, 예를 들어, 미생물 세포 [Souza L.M. Science 232: 61-65 (1986); Hu Z.Y. et al. Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi (1999), 20: 55-57], 효모 세포 [Lasnik M.A. et al. Biotechnol . Bioeng . 81: 768-774 (2003); Lee S.M. 등. 대한민국 특허 KR 160934 B1 19981116], 쌀 세포 [Hong et al. Protein Expr Purif . Epub ahead of print (2005)], 고양이 세포 [Yamamoto et al. Gene 274: 263-269 (2001)], 중국 햄스터 난소 세포 [Monaco L. et al. Gene. 180:145-150 (1996)], 곤충 세포 [Shinkai et al. Protein Expr Purif . 10: 379-385 (1997)], 및 심지어는 유전자변형 염소 [Ko J.H. et al. Transgenic Res . 9: 215-22 (2000)]에서도 복제 및 발현돼 왔다. 약제학적 용도로서, G-CSF는 일반적으로 생물학적 활성이 없는[Bernardez C.E. Curr . Opin. Biotechnol . 9: 157-163 (1998)] 비자연적 구조로 재조합 단백질의 불용성 응집체 [Baneyx F. & Mujacic M. Nature Biotechnol. 22: 1399-1408 (2004)]인 봉입체(inclusion body)로서 생산되는 대장균 (Escherichia coli)에서 주로 생산된다[Jevsevar S. et al. Biotechnol. Prog . 21: 632-639 (2005)]. 이의 분비성 생산의 기술도[Jeong K.J. & Lee S.Y. Protein Expr Purif . 23: 311-318 (2001); Lee S.Y. et al. Methods Mol . Biol . 308: 31-42 (2005)] 또한 보고된 바 있다. 분비성 발현은 대체로 온전하게 접혀진 형태의 G-CSF의 원형질막 주위 공간 또는 세포외 배지로 방출을 초래하지만, 봉입체로 수득한 것보다 수율이 매우 적다. 따라서 G-CSF를 대장균에서 봉입체로서 발현하는 것이 상업적으로 유익하다. 온전하게 접혀진, 생물학적으로 활성적인 G-CSF 단백질은, 봉입체의 분리 및 용해에 후속적으로 적용되는 변성 및 재자연화(renaturation) 방법을 이용하여, 상업적으로 이용가능한 방식으로 봉입체로부터 용이하게 수득된다 [Rudolph R, In Protein Engineering : Principles and Practice; Cleland, J. L., Craik, S. C., Eds.; Wiley-Liss, Inc.: New York, 1996; pp 283-298; Rathore A.S. et al. J Pharm Biomed Anal . 32:1199-1211 (2003)].

대장균에서의 재조합 단백질의 가장 효율적인 생산 방법 중 하나는, 주기적 또는 비주기적 방식으로 수행될 수 있는 공급-회분법(fed batch)이다. 상기 비주기적 공정은 덜 복잡하고 따라서 산업적 생산에 더 적절하다. 실제로, 종래 기술은 4.2-4.4g/L 의 범위 내인 비주기적 공급-회분식 공정으로부터 가장 높은 G-CSF 수율 중 하나를 기재하고 있다 [Yim SC et al. Bioprocess and Biosystems Engineering (2001), 24, 249-254]. 보다 높은 누적 수율을 수득하기 위해 주기적 방식으로 공급 회분식 발효를 수행하는 것은 플라스미드를 매우 불안정하게 하며, [Choi S.-J. et al. J. Microbiol . Biotechnol. 10: 321-326 (2000)], 따라서 공정의 견고성을 제한한다.

일반적으로, 산물의 고발현을 얻기 위해서, 산물 유전자를 함유하는 염색체 외 플라스미드를 세포 내에 온전한 형태로 유지하는 것이 필수적이다. 이는 일반적으로 적절한 항생제를 배양 브로쓰에 첨가함으로써 재조합 미생물에 선택 압력을 유지함으로써 달성된다. 재조합 균주의 "분리적 불안정성(segregational non- stability)"을 감소시키기 위해 발효 중에 매 1-2시간 항생제(암피실린)의 첨가를 통한 G-CSF의 발현 수준의 증가가 보고되었다 (Krivopalova G.N. et al. Russian Patent RU 2158303 C2 20001027). 최종 산물로부터의 항생제 제거의 증거의 규제적 요건은 그의 사용의 한계를 불가피하게 한다. 항생제 사용이 높을수록, 바람직하지 못한 환경적 영향을 미칠 가능성이 클 수도 있다. 그러나 항생제적 선택 압력의 감소는 종종 감소된 플라스미드 안정성 및 발현 수준을 초래하며, 이는 공정의 견고성을 손상시킨다. 따라서, 항생제의 사용을 제한하는 한편, 특히 생산 단계에서, 산물의 플라스미드 안정성 및 발현 수준을 증가시키는 것이 기술적 과제이 다. 이에 더해, 생산 단계 중에서의 플라스미드의 낮은 안정성은 또한 대사적 스트레스로 인한 것일 수 있고[Saraswat V. et al. FEMS Microbiol . Lett . 179: 367-373 (1999)], 전형적으로 고용량 배양에서 저발현의 수준을 초래할 수 있다[Cheng C. et al Biotechnol . Bioeng . 56: 23-31 (1997)].

높은 항생제 선택 압력을 유지하는 것 이외에, 벡터 구성의 수준에서 플라스미드 안정성이 개선될 수 있다 [Schweder T. et al. Appl Microbiol Biotechnol . 38:91-93 (1992); Pan S.H. and Malcom B.A. Biotechniques. 29:1234-1238 (2000)]. 공정에서 영양분 고갈 (nutrition starvation)을 회피하는 것과 같이 배양 조건을 조절함으로써 개선될 수 있다[Smith & Bidochka Can . J. Microbiol . 44: 351- 355 (1998)]. 대용량 기질-제한 공급 회분식 공정을 수행하는 중에, 영양분 제한/고갈은 임박한 것이며, 항생제를 너무 자주 또는 대량으로 첨가하는 것은 또한 저복잡성 공정에서 산물의 고수율 및 플라스미드의 높은 안정성을 유지하기 위한 비실용적이고 값비싼 해결책이다. 따라서, 간단하고 견고한 공정을 이용하여 플라스미드의 높은 안정성을 유지함으로써 G-CSF를 높은 용적 수율로 제조하기 위한 대안적 방법을 개발할 명백한 필요성이 있다.

본 발명은 생산 배지 및 배양 브로쓰(broth)에 마그네슘 또는 나트륨 이온과 고농도로 조합한 칼륨을 사용하여 배양 내의 플라스미드의 고안정성을 유지시킴으로써 과립구집락 자극인자 (G-CSF)를 대장균에서 높은 용적의 수율로 생산하기 위한 비주기적 공급 회분식 공정을 기술한다.

본 발명은 개선된 수준의 용적 수율로 과립구집락 자극인자 (G-CSF)를 생산하기 위한 개선된 발효 공정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 G-CSF의 높은 용적 수율을 더 초래하는 개선된 플라스미드 안정성을 위한 배양 조건을 개시한다. 본 발명의 공정은 생산 배지에 고농도의 나트륨, 마그네슘 등과 같은 다른 무기염과 조합된 고농도의 칼륨의 존재 하에서 수행되는, 다수회 유도를 통한 비주기적 공급-회분식 공정을 포함한다. 놀랍게도, 이하 상세하게 설명되는 본 발명의 염을 그대로 사용한 방법이, 높은 비증식률(specific growth rate)과 합하여 사용될 때에도, 용적 수율의 증가를 더 초래하는 높은 플라스미드 안정성을 유지하였다.

본 발명은 하기에 보다 상세하게 설명된다:

임의의 과립구집락자극인자 (여기서 'G-CSF'로도 불린다) 펩티드가 활용될 수 있다. 용어 "과립구집락자극인자" 또는 "G-CSF"는 천연 G-CSF, 또는 천연 hG-CSF의 60% 이상의 생물학적 또는 수용체 결합 활성을 나타내거나 약 80% 이상의 아미노산 상동을 보유하는 그의 뮤테인, 단편, 융합체, 유사체 및 유도체를 가리킨다. 그러한 G-CSF 서열의 예는 Genbank 서열 ID GI:27437048 및 미국 특허 제 4810643호에 기재된 것들을 포함한다.

대장균 세포는 G-CSF 코딩 서열 및 t7, tac 및 유사 프로모터에서 선택된 적절한 프로모터와 함께 다른 벡터 구성요소를 포함하는 적절한 발현 벡터로 공지된 형질전환 기법을 사용하여 형질전환된다.

하기 기술된 방법에서 발효는 G-CSF의 생산을 위한 미생물, 바람직하게는 재조합 대장균의 호기성 증식을 의미한다. 이러한 방법에서, 증식의 회분 단계는 접종 후 (필요할 경우) 수산화 암모늄 이외의 영양분을 발효기 내의 배양 브로쓰에 첨가하지 않는 시기를 의미한다. 상기 배양 브로쓰는 세포 현탁물, 배지, 및 배지와 세포의 유도체 (존재할 경우)이다. 증식 단계에서의 기질 제한적인 공급 회분은 생물체량의 주요적 증가 (2배가 이상)가 주요 탄소/에너지원 (예: 글루코스)의 농도가 제한적인 방식으로 배양 브로쓰에 공급 회분 증식 배지를 첨가함으로써 이루어지는 증식기의 그 부분을 의미한다. 상기 배지의 유속이 배양의 비증식률을 결정한다. 전유도(pre-induction) 배지는, 증식 배지와 다른 조성을 갖고, 유도인자(예: IPTG)를 첨가하기 전에 배양 브로쓰에 첨가되는 배지를 의미한다. 유도는, 종래기술에서 알려진 도구를 통해 결정되는 바와 같이, 유도인자(예: IPTG 또는 락토스)의 첨가를 통해 세포에서 G-CSF의 농도를 가시적으로 증가시키는 방법이다. 생산 배지는 증식 배지와 다른 조성을 가지며, G-CSF 유전자를 유도하는 중에 발효기 내의 배양 브로쓰에 첨가된다. 상기 생산 배지는 또한 기질 (예: 글루코스)의 농도가 제한적으로 남아있도록 첨가된다. 생산 배지의 유속은 생산 단계 중에서 배양물의 비증식률을 결정한다.

G-CSF를 코딩하는 적절한 발현 벡터로 사전 형질전환된 숙주 세포 대장균은, 진탕기-플라스크에서 초기에 37℃에서 배양되어 발효를 위한 종자를 개발하였다. 상기 종자 배양물은 발효기 내의 멸균된 증식 배지에 접종하기 위해 사용되었다. 발효의 증식 단계의 기질-제한적 공급 회분식 모드는, 재조합 대장균 배양물이 증식하기 시작하고 배양 브로쓰 중의 글루코스 농도가 0.5g/L 이하로 하락하면 시작된다. 기질 제한적 공급 회분식으로 첨가되는 공급 회분 증식 배지의 공급은, 증식 단계에서 연속적 (기하급수 또는 일정율로)으로 유지되거나 불연속적으로 유지된다. 상기 배양 브로쓰에서 1-60g/L의 건조 세포 중량의 세포 밀도 및 0.5g/L 미만의 글루코스 농도를 달성한 후, 전생산(pre-production) 배지의 첨가가 완료되고 후속적으로 생산 배지의 공급이 시작되고 연속 또는 비연속적 기질 제한적 방식으로 계속된다. G-CSF 유전자의 다수회 유도는 IPTG로 수행된다. 평균 비증식률은 유도인자의 첨가 중 또는 첨가 이후에 감소하지 않는다. pH는 약 5-7로 유지된다. 온도는 약 30-42℃로 유지된다. 전생산 배지를 첨가한 2 내지 48시간 후, 배양 배지를 제거하고, 당해 기술에서 기재된 기법에 따라 하류 공정(downstream processing)으로 처리된다.

증식 단계의 배지는 글루코스, 글리세롤 등 또는 그의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 탄소 및 에너지 원, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 카세인 효소 가수분해물, 대두 카세인 가수분해물 등 또는 그의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 복합성 배지 구성요소, 구연산, 염화칼륨, 염화나트륨, 황산마그네슘, 수소인산이암모늄, 이수소인산칼륨, 부티르산 나트륨, 티아민, 글리신, 및 염화아연을 포함하는 군으로부터 선택되는 적절한 염/영양분을 포함한다.

통기(aeration), 교반, 접종물, 접종의 시간 등과 같은 다른 발효 조건들은 종래 기술에 알려진 대로 편의에 따라 선택된다.

전생산 배지는, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 카세인 효소 가수분해물, 대두 카세인 가수분해물로부터 선택된 복합 배지 구성요소와 함께 티아민, 글리신 등과 같은 영양분 또는 그의 혼합물; 카나마이신 및 암피실린 등과 같은 항생제를 포함한다. 적절한 염은 구연산, 염화칼륨, 염화나트륨, 황산마그네슘, 수소인산이암모늄, 이수소인산칼륨, 부티르산나트륨 및 염화아연을 포함하는 군으로부터 선택되어 상기 배지가 고농도의 K 이온을 Na 또는 Mg 이온과 함께 함유하도록 한다.

생산 배지는 전생산 배지의 구성원에 더하여 탄소원을 포함한다. 적절한 탄소원은 글리세롤, 글루코스, 프락토스 등 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에서 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 생산 단계 중, 배양 브로쓰는 고수준의 K 이온과 함께 Na 또는 Mg 이온을 조합하여 유지된다. 배양 브로쓰 내에서 K 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 300mM로, Na 이온은 약 60mM 내지 약 300mM로, 및 Mg 이온은 약 150mM 내지 약 250mM로 유지된다. 바람직한 구현예에서, 배양 브로쓰에서의 K 이온 농도는 90mM 내지 150mM, Na 이온 농도는 60mM 내지 120mM, 및 Mg 이온 농도는 180mM 내지 220mM의 범위 내에 있다.

또 다른 구현예에 있어서, 고농도의 티아민(5g/L 내지 10g/L의 범위)을 첨가하는 것은 5-6g/L 범위의 G-CSF의 수율을 제공한다.

본 발명의 방법은 증식 및 생산 단계에 걸친 플라스미드의 고안정성(75-90%)의 유지와 함께 고수율의 G-CSF(5-9.5g/L)의 생산을 초래한다.

도 1은 회분의 수확 시점에서 BL21 (DE3) 내의 G-CSF 유전자-함유 플라스미드의 안정성에 대한 생산단계에서 고농도의 칼륨 및 나트륨 양이온 이용의 영향을 나타낸다. 회분 2는 고농도의 칼륨 및 나트륨 염으로 수행된 반면, 회분 1은 생산단계에서 고농도의 칼륨 및 나트륨 염 없이 수행되었다. 상기 회분들은 30L 발효기 에서 별도로 수행되었다.

도 2는 수확된 회분에서 G-CSF 용적 수율에 대한 생산 단계에서 고농도의 칼륨 및 나트륨 양이온 사용의 영향을 나타낸다. 회분 2는 고농도의 칼륨 및 나트륨 염으로 수행된 반면, 회분 1은 생산 산계에서 고농도의 칼륨 및 나트륨 염 없이 수행되었다. 회분은 30L 발효기에서 별도로 수행되었다.

도 3은 회분의 수확 시점에서 BL21(DE3) 내의 G-CSF 유전자-함유 플라스미드의 안정성에 대한, 생산단계에서 고농도의 마그네슘 및 칼륨 양이온 이용의 영향을 나타낸다. 회분 4는 고농도의 마그네슘염으로 수행된 반면, 회분 3에서는 생산 단계에서 고농도의 마그네슘염을 사용하지 않았다. 두 회분 모두 고농도의 칼륨을 이용하여, 30L 발효기에 별도로 수행하였다.

도 4는 수확된 회분에서 G-CSF의 용적 수율에 대한 생산 단계에서의 고농도의 마그네슘 및 칼륨 양이온 사용의 영향을 나타낸다. 회분 4는 고농도의 마그네슘염으로 수행된 반면, 회분 3에서는 생산 단계에서 고농도의 마그네슘염이 사용되지 않았다. 두 회분 모두 고농도의 칼륨을 이용하여, 30L 발효기에 별도로 수행하였다.

도 5는 수확된 회분에서 G-CSF의 용적 수율에 대한 생산 단계에서의 높은 비증식률(specific growth rate) 사용의 영향을 나타낸다. 생산 단계 중에서 회분 4는 약 0.04l/h의 평균 비증식률을 가진 반면, 회분 5는 약 0.07l/h의 평균 비증식률을 가졌다. 두 회분 모두 고농도의 칼륨 및 마그네슘 염으로 30L 발효기에서 별도로 수행하였다.

도 6은 생산 단계에서 고농도의 티아민 사용이 수확된 회분에서 G-CSF의 용적 수율에 미치는 영향을 나타낸다. 생산 단계 중에서 회분 1은 생산 배지에 7g/L의 티아민을 함유한 반면, 회분 6은 생산 배지에 티아민을 전혀 사용하지 않고 수행하였다. 두 회분 모두 30L 발효기에서 별도로 수행하였다.

실시예 1: 고농도의 Na 및 K 이온이 플라스미드 안정성과 용적 수율에 미치는 영향

상기 실험은 30L 발효기에서 수행하였다. 인간 G-CSF 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 종자 배양물을 하기 조성의 증식 배지에 접종하였다.

성분 접종 이전의 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코스 10.0 g/L

구연산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량 성분 용액 20.0 mL/L

카나마이신 50 mg/L

미량 금속 용액:

구성요소 농도

FeCl₃.6H₂O 0.162 g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144 g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12 g/L

Na₂MoO₄.2H₂O 0.012 g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006 g/L

CuCl₂ 1.9 g/L

H₃BO₃ 0.5 g/L

하기의 '공급 회분 증식 배지'를 기질 제한적 공급 회분 방식으로의 첨가는 생물체량에 두드러진 증가를 초래하였다:

성분 농도

글루코스 700 g/L

MgSO₄.7H₂O 20 g/L

미량 성분 용액 20 mL/L

카나마이신 500 mg/L

증식 단계에서 pH를 6.8 내지 7.0의 범위로 유지하기 위해 수산화암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 회분 2에서 약 50 AU (600nm에서)의 광학 밀도에 도달한 다음, 하기 조성으로 이루어지는 전유도 배지를 배양 브로쓰에 첨가하였다:

성분 농도

효모 추출물 84.38 g/L

염화 칼륨 75.41 g/L

염화 나트륨 123.13 g/L

염산 티아민 8.44 g/L

배양 브로쓰에서의 칼륨과 나트륨 양이온의 최종 농도는 각각 약 120mM와 250mM였다.

후속적으로 하기 생산 배지의 공급이 시작되었다:

성분 농도

글루코스 270 g/L

MgSO₄.7H₂O 1 g/L

효모 추출물 214 g/L

염산 티아민 7 g/L

염화 칼륨 8.94 g/L (회분 2에서만)

염화 나트륨 17.5 g/L (회분 2에서만)

여과멸균된 IPTG 용액을 배양 브로쓰에 다수회 첨가함으로써 G-CSF 유전자의 발현을 유도하였다. 생산 단계에서 pH를 6.8로 유지하기 위해 수산화 암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 카나마이신을 배양물에 첨가하여 선택 압력을 가하였다. 회분 2의 생산 단계 중에서 사용된 카나마이신의 양 (37.5mg, 1회 첨가)은 플라스미드 안정성에 대한 염의 효과를 크게 도전하기 위해 회분 1에서 사용된 양의 약 1% (2925mg, 다수회 첨가)였다.

플라스미드 안정성은 먼저 무균적으로 회분말단(end-of-the-batch) 시료를 멸균 튜브에 수집하고, 무균적으로 적절한 용량의 적절한 희석된 시료를 루리아-베르타니 배지에 카나마이신의 존재(50mg/L) 또는 부재 하에서 평판함으로써 결정하였다. 상기 플레이트들은 37℃에서 48시간 동안 배양되고, 통계적으로 유의적인 집락(colony)을 갖는 플레이트들을 계수하였다. 카나마이신 함유 플레이트에 수득된 집락의 수를 카나마이신 비함유 플레이트의 집락 수로 나눔으로써 얻어진 값을 플라스미드 안정성을 계산하는 데 사용하였다. 회분 2의 플라스미드 안정성(96.8%)은 회분 1의 플라스미드 안정성(45.0%)과 비교하여 2배 이상이었고, 따라서 이는 플라스미드 안정성을 개선시키는 데 나트륨과 칼륨 양이온의 중요성을 보였다 (도 1).

G-CSF의 용적 수율은, SDS-PAGE 후 인증된 표준의 표준 그래프에 대해 G-CSF 밴드의 농도계측적 정량을 통해 결정된 바와 같이, 회분 1에서 5.38g/L 및 회분 2에서 5.81g/L이었다. 회분 2에서의 용적 수율은 회분 1에서보다 약 8% 더 높았다 (도 2).

실시예 2: 고농도의 마그네슘 및 칼륨 양이온이 플라스미드 안정성과 용적 수율에 미치는 영향

실험은 30L 발효기에서 수행하였다. 양 회분(회분 3 및 회분 4)의 생산 단계 배지는 마그네슘 양이온의 농도만을 제외하고는 칼륨 양이온의 농도를 포함하여 동일하였으므로, 결과는 칼륨과 마그네슘 양이온의 조합의 효과를 반영하였다. 인간 G-CSF 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 종자 배양물을 하기 조성의 증식 배지에 접종하였다.

성분 접종 이전의 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코스 10.0 g/L

구연산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량 성분 용액 20.0 mL/L

카나마이신 50 mg/L

미량 금속 용액:

성분 농도

FeCl₃.6H₂O 0.162 g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144 g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12 g/L

Na₂MoO₄.2H₂O 0.012 g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006 g/L

CuCl₂ 1.9 g/L

H₃BO₃ 0.5 g/L

하기 '공급 회분식 증식 배지'를 기질 제한적 공급 회분 방식으로의 첨가는 생물체량에 두드러진 증가를 초래하였다:

성분 농도

글루코스 700 g/L

MgSO₄.7H₂O 20 g/L

미량 성분 용액 20 mL/L

카나마이신 500 mg/L

성분 농도

효모 추출물 84.38 g/L

염화 칼륨 75.44 g/L

염산 티아민 8.38 g/L

황산 마그네슘 187.06 g/L (회분 4에서만)

후속적으로 하기 생산 배지의 공급을 시작하였다:

성분 농도

글루코스 270 g/L

황산 마그네슘 1 g/L (회분 3에서만)

황산 마그네슘 50.3 g/L (회분 4에서만)

효모 추출물 214 g/L

염산 티아민 7 g/L

염화 칼륨 8.94 g/L

여과멸균된 IPTG 용액을 배양 브로쓰에 다수 회 첨가함으로써 G-CSF 유전자의 발현을 유도하였다. 생산 단계에서 pH를 6.8로 유지하기 위해 수산화 암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 카나마이신을 배양물에 첨가하여 선택 압력을 가하였다. 생산 단계 중에 동량의 카나마이신 (37.5mg, 1회 첨가)을 사용하였다. 생산 단계 중에서 배양 브로쓰의 칼륨과 나트륨 양이온의 농도는 각각 약 120mM와 200mM였다.

플라스미드 안정성은 전술한 바와 같이 결정하였다. 회분 4에서의 플라스미드 안정성 (97.3%)은 회분 3의 플라스미드 안정성 (91.8%)보다 약 6% 정도 높았으 며, 따라서 이는 플라스미드 안정성을 개선시키는 데 나트륨과 칼륨 양이온이 효과적임을 보였다(도 3). 마그네슘과 칼륨 양이온의 존재 하에서 얻어진 플라스미드의 안정성은 회분 1(생산단계에서 고농도의 염 부재)에서보다 116.2% 더 높았다.

G-CSF의 용적 수율은, SDS-PAGE 후, 인증된 표준의 표준 그래프에 대해 G-CSF 밴드의 농도계측적 정량에 의해 결정된 바에 따라, 회분 3에서 5.48g/L 및 회분 4에서 8.35g/L이었다 (도 4). 회분 4에서의 용적 수율은 회분 1에서보다 약 55%정도 더 높았다.

실시예 3: 생산 단계 중 높은 비증식률이 용적 수율에 미치는 영향

실험은 30L 발효기에서 수행하였다. 양 회분(회분 4 및 회분 5)의 생산 단계 배지의 조성은 칼륨 및 마그네슘 양이온의 농도를 포함하여 동일하였다. 회분 5의 생산단계의 평균 비증식률은 회분 4의 생산 단계에서보다 더 높았다. 인간 G-CSF 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 종자 배양물을 하기 조성의 증식 배지에 접종하였다.

성분 접종 이전의 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코스 10.0 g/L

구연산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량 성분 용액 20.0 mL/L

카나마이신 50 mg/L

미량 금속 용액:

FeCl₃.6H₂O 0.162 g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144 g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12 g/L

Na₂MoO₄.2H₂O 0.012 g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006 g/L

CuCl₂ 1.9 g/L

H₃BO₃ 0.5 g/L

성분 농도

글루코스 700 g/L

MgSO₄.7H₂O 20 g/L

미량 성분 용액 20 mL/L

카나마이신 500 mg/L

증식 단계에서 pH를 6.8 내지 7.0의 범위로 유지하기 위해 수산화암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 약 50AU (600nm에서)의 광학 밀도에 도달한 후, 하기 조성으로 이루어지는 전유도 배지를 배양 브로쓰에 첨가하였다:

성분 농도

효모 추출물 84.38 g/L

염화 칼륨 75.44 g/L

염산 티아민 8.38 g/L

황산 마그네슘 187.06 g/L

후속적으로 하기 생산 배지의 공급을 시작하였다:

성분 농도

글루코스 270 g/L

황산 마그네슘 50.3 g/L

효모 추출물 214 g/L

염산 티아민 7 g/L

염화 칼륨 8.94 g/L

여과멸균된 IPTG 용액을 배양 브로쓰에 다수회 첨가함으로써 G-CSF 유전자의 발현을 유도하였다. 생산 단계에서 pH를 6.8로 유지하기 위해 수산화 암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 카나마이신을 배양물에 첨가하여 선택 압력을 가하였다. 생산 단계 중에 동량의 카나마이신 (37.5mg, 1회 첨가)을 사용하였다. 회분 4의 생산 단계에서의 평균 비증식률은 약 0.04 1/h인 한편, 회분 5에서는 약 0.07 1/h였다.

전술한 바와 같이 결정된 G-CSF의 용적 수율은, 회분 4에서 8.35g/L 및 회분 5에서 9.94g/L이었다. 회분 5에서의 용적 수율은 회분 4에서보다 약 19% 더 높았다 (도 5). 회분말단 시료의 두 회분의 플라스미드 안정성은 높았다 (>75%).

실시예 4: 생산 단계에서의 고농도의 티아민을 사용하는 것이 용적 수율에 미치는 영향

실험은 30L 발효기에서 수행하였다. 인간 G-CSF 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 종자 배양물을 하기 조성의 증식 배지에 접종하였다.

성분 접종 이전의 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코스 10.0 g/L

구연산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량 성분 용액 20.0 mL/L

카나마이신 50 mg/L (회분 1에서)

암피실린 100mg/L (회분 6에서)

미량 금속 용액:

FeCl₃.6H₂O 0.162 g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144 g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12 g/L

Na₂MoO₄.2H₂O 0.012 g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006 g/L

CuCl₂ 1.9 g/L

H₃BO₃ 0.5 g/L

하기 '공급 회분식 증식 배지'의 기질 제한적 공급 회분 방식으로의 첨가는 생물체량에 두드러진 증가를 초래하였다:

성분 농도

글루코스 700 g/L

MgSO₄.7H₂O 20 g/L

미량 성분 용액 20 mL/L

카나마이신 500 mg/L (회분 1에서)

암피실린 회분 6에서만 각 첨가에서 50mg/L의 배양 브로쓰.

총 여섯개의 첨가가 회분의 '공급 회분식 증식' 단

계에서 수행되었다.

증식 단계에서 pH를 약 6.8로 유지하기 위해 수산화암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 약 50AU (600nm에서)의 광학 밀도에 도달한 후, 하기 생산 배지의 공급이 시작되었다. 하기 조성으로 이루어지는 전유도 배지를 배양 브로쓰에 첨가하였다:

성분 농도

글루코스 270 g/L

MgSO₄.7H₂O 1 g/L

효모 추출물 214 g/L

염산 티아민 7 g/L

카나마이신 2.925 g (회분 1에서 다수회 첨가)

암피실린 2.689 g (회분 6에서 다수회 첨가)

여과멸균된 IPTG 용액을 배양 브로쓰에 다수 회 첨가함으로써 G-CSF 유전자의 발현을 유도하였다. 생산 단계에서 pH를 6.8로 유지하기 위해 수산화 암모늄을 pH 조절인자로 사용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다.

전술한 바와 같이 G-CSF의 용적 수율을 결정하였다. 회분 1(고량 티아민 회분)의 회분말단 시료에서의 용적 수율은 회분 6에서보다(4.86g/L) 약 10.7% 더 높았으며, 따라서 G-CSF 용적 수율을 향상시키는 데 고농도의 티아민의 효과를 보여준다.

본 방법의 이점:

(1) 높은 용적 수율은 작은 용량에서 큰 수율을 얻게 하며, 그리하여 대용량화 시 자본 지출을 제한한다.

(2) 매우 저렴한 값의 배지 성분 (마그네슘, 칼륨, 및 마그네슘 염)을 이용하여 높은 용적 수율을 달성한다.

(3) 높은 플라스미드 안정성을 갖는 배양은, 높은 비증식률의 조건하에서 G-CSF 유전자의 발현과 같은 대사적 스트레스성 조건에서 더욱 G-CSF의 용적 수율을 생산할 수 있다.

Claims

ⅰ) 발효기에 과립구집락자극인자 (Granulocyte Colony Stimulating Factor: G-CSF)의 유전자를 코딩하는 적절한 발현 벡터로 사전 형질전환된 적절한 재조합 대장균 배양물을 접종하는 단계 및 ⅱ) 재조합 대장균을 발효의 전생산 단계 및 생산 단계를 거쳐서 배양하여 배양 브로쓰(broth)에서 G-CSF의 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 과립구집락자극인자의 높은 용적수율을 얻기 위한 향상된 방법으로서, 상기 배양 브로쓰는 고농도의 Na 또는 Mg로부터 선택되는 무기 양이온과 조합된 60mM 내지 180mM의 최종 농도 범위의 K 이온을 포함하며, 상기 Na 이온의 최종 농도는 60mM 내지 300mM의 범위 내에 있고, 상기 Mg 이온의 최종 농도는 150mM 내지 250mM의 범위 내에 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 Na 이온의 최종 농도는 90mM 내지 300mM의 범위 내에 있고, Mg 이온의 최종 농도는 150mM 내지 250mM의 범위 내에 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 브로쓰는 효소 추출물, 트립톤, 펩톤, 카세인 효소 가수분해물, 및 대두 카세인 가수분해물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 복합 배지 요소를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 기질 제한 공급 회분식 공정(substrate limiting fed batch process)인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 G-CSF의 유전자는 생산 단계 동안 다수회 발현 유도를 통해 유도되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 브로쓰는 글루코스, 글리세롤, 및 프락토스로부터 선택되는 탄소원을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양되는 재조합 대장균은 생산 단계와 전생산 단계에서 동일한 평균 비증식률을 유지하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 K 이온의 최종 농도는 90mM 내지 150mM, Na 이온의 최종 농도는 60mM 내지 120mM, 및 Mg 이온의 최종 농도는 180mM 내지 220mM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 대장균은 75% 이상의 G-CSF의 플라스미드 안정성을 나타내며, 상기 플라스미드 안정성은 i) 상기 재조합 대장균을 기질 제한 공급 회분식 공정에 의해 배양하여 무균적으로 회분말단(end-of-the-batch) 시료를 멸균 튜브에 수집하는 단계, ⅱ) 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 배지 및 포함하지 않는 배지에서 48시간 동안 37℃에서 상기 시료를 배양하는 단계, 및 ⅲ) 카나마이신 함유 플레이트에 수득된 집락 수 및 카나마이신 비함유 플레이트의 집락 수를 계수하여 전자를 후자로 나누는 단계에 의해 결정되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, K 이온을 최종 농도 60mM 내지 180mM의 범위에서 배양 브로쓰에 첨가함으로써 재조합 대장균에서 발현되는 G-CSF의 플라스미드의 분리적 안정성(segregational stability)을 개선하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생산 단계는 전생산 단계에서 사용되는 항생제 농도보다 더 낮은 농도의 항생제를 포함하는 것인 방법.
i) 발효기에 G-CSF를 코딩하는 적절한 발현 벡터로 사전 형질전환된 적절한 대장균 배양물을 접종하는 단계,

ⅱ) 회분식 및 공급 회분식으로 생물체량을 증가시키는 증식 단계,

ⅲ) 적절한 전생산 배지를 첨가하는 단계,

ⅳ) 유전자의 다수회 발현 유도가 수행되는 기질 제한 공급 회분 방식에서 적절한 생산 배지를 첨가하는 단계를 포함하고,

v) 배양 브로쓰에서의 K, Na, 및 Mg 이온의 최종 농도는 제1항에 기재된 바와 같은, G-CSF를 생산하는 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, G-CSF의 용적 수율은 5g/L 내지 9.5g/L의 범위 내에 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효법으로 높은 용적 수율의 G-CSF를 얻는 개선된 방법으로서, 상기 배양 브로쓰는 5g/L 내지 10g/L의 범위 내의 티아민을 포함하는 것인 방법.